ES2907629T3 - Un método para preparar un oligómero de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente, un oligómero de fosforodiamidato preparado mediante dicho método y una composición farmacéutica que comprende dicho oligómero de fosforodiamidato - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente que comprende enlaces fosforosos quirales, que comprende: seleccionar monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente; y sintetizar un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente por acoplamiento estereoespecífico de los monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente seleccionados, en el que dicho acoplamiento estereoespecífico se realiza en un disolvente aprótico, en presencia de una amina terciara no nucleófila o base aromática, a una temperatura de 20 °C a 50 °C; en el que los monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente se obtienen separando una mezcla diastereoisomérica de monómeros de morfolino de fosforamidocloridato en monómeros de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente, y en el que sustancialmente puros estereoquímicamente indica enantiómeros o diastereoisómeros que están en exceso enantiomérico o diastereoisomérico, respectivamente, igual a o mayor de un 87 %, y sustancialmente puros diastereoisoméricamente indica diastereoisómeros que están en exceso diastereoisomérico igual a o mayor de un 87 %.
Description
DESCRIPCIÓN
Un método para preparar un oligómero de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente, un oligómero de fosforodiamidato preparado mediante dicho método y una composición farmacéutica que comprende dicho oligómero de fosforodiamidato
Campo
Realizaciones pueden referirse a la preparación de monómeros activados sustancialmente puros diastereoisoméricamente que son subunidades de morfolino de fosforamidocloridato. Realizaciones también pueden referirse al uso de monómeros de morfolino fosforilados activados sustancialmente puros diastereoisoméricamente para la preparación de moléculas a través de reacciones de acoplamiento estereoespecíficas.
Antecedentes
La síntesis de oligonucleótidos de fosforodiamidato puros diastereoisoméricamente es sustancialmente complicada por la existencia de enlaces fosforosos quirales. Esto contrasta con, por ejemplo, los enlaces fosfodiéster, que no tienen un fósforo quiral. Pueden verse ejemplos en la figura 1, que compara fosfodiéster, fosforotioato (que también incluye un fósforo quiral), y fosforodiamidato
La existencia del fósforo quiral presenta problemas sustanciales para las rutas sintéticas que implican la conexión de una serie de nucleótidos de fosforodiamidato. La ausencia de reactivos puros estereoquímicamente (moldes, subunidades, componentes básicos) que posibilitan la formación estereoespecífica de enlaces fosforodiamidato da lugar a reacción en el estereocentro en que la quiralidad del fósforo del compuesto resultante no puede controlarse.
Como se muestra gráficamente en la figura 2, el uso de mezclas diastereoisoméricas de nucleótidos para acoplamiento no controlado estereoquímicamente para preparar un oligonucleótido de cualquier longitud significativa y secuencia crea una mezcla heterogénea de muchos diastereoisómeros. El número de diastereoisómeros es teóricamente 2(n-1), donde n es el número de nucleótidos que se conectan para formar el oligonucleótido. Como se muestra en la figura 2, incluso un oligonucleótido modesto de cuatro nucleótidos (tetranucleótido) puede provocar la formación de una mezcla de ocho diastereoisómeros separados.
La formación de un número significativo de diastereoisómeros puede crear la necesidad de técnicas de separación sensibles después de la síntesis. El rendimiento de producto deseado puede verse influido adversamente por el uso de materias primas para preparar múltiples diastereoisómeros que no son deseados.
El documento WO2011/150408 describe compuestos oligonucleotídicos útiles como compuestos de antisentido que comprenden enlaces entre subunidades modificados y/o grupos terminales. El documento US2012/289457 describe compuestos oligonucleotídicos útiles como compuestos de antisentido, que se conjugan con péptidos que penetran en las células.
Sería útil poder seleccionar un diastereoisómero específico antes de la síntesis, entonces sintetizar el diastereoisómero seleccionado en una forma pura estereoquímicamente o sustancialmente pura.
Breve sumario
La presente invención proporciona un método para preparar un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente que comprende enlaces fosforosos quirales, que comprende:
seleccionar monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente; y
sintetizar un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente por acoplamiento estereoespecífico de los monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente seleccionados, en el que dicho acoplamiento estereoespecífico se realiza en un disolvente aprótico, en presencia de una amina terciara no nucleófila o base aromática, a una temperatura de 20 °C a 50 °C;
en el que los monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente se obtienen separando una mezcla diastereoisomérica de monómeros de morfolino de fosforamidocloridato en monómeros de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente, y
en el que sustancialmente puros estereoquímicamente indica enantiómeros o diastereoisómeros que están en exceso enantiomérico o diastereoisomérico, respectivamente, igual a o mayor de un 87 %, y sustancialmente puros diastereoisoméricamente indica diastereoisómeros que están en exceso diastereoisomérico igual a o mayor de un 87 %; y
un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente que comprende enlaces fosforosos quirales preparado por el método de la invención, y
una composición farmacéutica que comprende un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende enlaces fosforosos quirales, preparado por el método de la invención.
Realizaciones adicionales de la presente descripción pueden proporcionar uno o más compuestos puros estereoquímicamente o sustancialmente puros estereoquímicamente de la tabla 1. Realizaciones adicionales también pueden proporcionar enantiómeros de los compuestos de la tabla 1. Típicamente, la estereoquímica de esos enantiómeros varía de la de los compuestos de la tabla 1 por la alteración de la estereoquímica del anillo morfolino.
Tabla 1
Ri y R2 pueden ser iguales o diferentes, y pueden ser -H, alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido, fenilo opcionalmente sustituido, naftilo opcionalmente sustituido o, con el nitrógeno al que están fijados, formar un heterociclo opcionalmente sustituido, que puede ser, por ejemplo, pirrolidina, piperazina o morfolina.
Los restos opcionalmente sustituidos pueden estar sustituidos con uno o más de metilo, etilo, halógeno, nitro, metoxi o ciano.
R3 puede ser tritilo (Tr), que puede se tritilo sustituido incluyendo, aunque sin limitación, tal como MMTr (pmetoxifenildifenilmetilo), bencilo opcionalmente sustituido, 4-metoxibencilo (PMB, MPM), 3,4-dimetoxibencilo, difenilmetilo (Dpm) o sulfonilo, que puede ser un sulfonilo escindible. En algunas realizaciones, sulfonilo es 2-nitrobencenosulfonilo, 4-nitrobencenosulfonilo o 2,4-dinitrobencenosulfonilo.
R4 , R5 , R6 pueden ser -H, -C(O)R7 o -C(O)OR7 , donde R7 es alquilo (metilo, etilo, isopropilo u otro alquilo C1-C6), bencilo, 2,2,2-tricloroetilo o arilo (incluyendo, aunque sin limitación, fenilo, 4-metoxifenilo, 4-bromofenilo y 4-nitrofenilo). R9 puede ser alquilo opcionalmente sustituido, cianoetilo, acilo, carbonato, carbamato, bencilo opcionalmente sustituido, 4-pivaloiloxibencilo y sililo.
En realizaciones adicionales, pueden prepararse nucleósidos morfolino además de los mostrados en la tabla 1 en forma pura diastereoisoméricamente o sustancialmente pura diastereoisoméricamente.
Realizaciones también pueden proporcionar métodos para la separación de mezclas diastereoisoméricas de los compuestos divulgados anteriormente en compuestos puros estereoquímicamente o sustancialmente puros estereoquímicamente. Realizaciones adicionales pueden proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos puros estereoquímicamente o sustancialmente puros estereoquímicamente como se presenta en este documento. Realizaciones adicionales pueden proporcionar composiciones farmacéuticas que comprenden sales farmacéuticamente aceptables de compuestos puros estereoquímicamente o sustancialmente puros estereoquímicamente como se presenta en este documento. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse
en cantidades eficaces a pacientes que necesitan tratamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir además vehículos farmacéuticamente aceptables.
En algunas realizaciones, el siguiente resto en cada uno de los compuestos de la tabla 1 puede sustituirse en las posiciones a, b y e con uno o dos grupos metilo, y puede sustituirse en las posiciones c y d con un grupo metilo. En cada caso, el grupo metilo puede orientarse en cada lado del plano del anillo morfolino. En realizaciones adicionales, puede insertarse un metileno adicional, opcionalmente sustituido con uno o más grupos metilo, adyacente al nitrógeno en el grupo morfolino para permitir la expansión a un anillo de siete miembros.
Realizaciones proporcionan además la preparación de oligonucleótidos puros estereoquímicamente a través de acoplamiento estereoespecífico de monómeros activados. Realizaciones adicionales proporcionan oligómero sustancialmente puro diastereoisoméricamente preparado por acoplamiento estereoespecífico de monómeros activados. Otras realizaciones adicionales proporcionan composiciones sustancialmente puras diastereoisoméricamente que comprenden compuestos sustancialmente puros diastereoisoméricamente como se presenta en este documento.
Descripción de las varias vistas de los dibujos
La figura 1 muestra enlaces oligonucleotídicos fosfodiéster, fosforotioato y fosforodiamidato.
La figura 2 muestra los enlaces fosforosos R y S en un oligómero de morfolino de fosforodiamidato (PMO). La figura 2 también muestra la proliferación de diastereoisómeros que típicamente se produce cuando mezclas diastereoisoméricas de precursores de oligómeros de fosforodiamidato se usan para sintetizar dinucleótidos (2-meros), trinucleótidos (3-meros), tetranucleótidos (4-meros) y N-meros.
La figura 3 muestra la preparación de dinucleótidos puros diastereoisoméricamente tanto usando fosforamidocloridatos puros diastereoisoméricamente como usando mezcla diastereoisomérica de fosforamidocloridatos.
La figura 4A y la figura 4B muestran mezclas diastereoisoméricas generalizadas de fosforamidocloridatos que pueden ser útiles para la preparación de subunidades diastereoisoméricas puras diastereoisoméricamente o sustancialmente puras diastereoisoméricamente.
La figura 5 muestra la preparación de oligonucleótidos puros diastereoisoméricamente (homogéneos) usando fosforamidocloridatos puros diastereoisoméricamente como se presenta en este documento.
La figura 6 muestra un esquema para la síntesis estereoespecífica de PMO 16-meros y la diferenciación de estereoisómeros por ensayo biofísico.
La figura 7 muestra los puntos de fusión para los estereoisómeros 1 y 2 del ejemplo, que muestra la síntesis estereoespecífica de PMO 16-meros y la diferenciación de estereoisómeros por ensayo biofísico, como se presenta a continuación.
La figura 8 muestra un diagrama ORTEP del compuesto 100 cristalino, como se presenta a continuación.
La figura 9A y la figura 9B muestran diagramas ORTEP de dos fragmentos del compuesto 100, como se presenta a continuación.
Descripción detallada
Hemos descubierto que dos diastereoisómeros de subunidades morfolino activadas pueden clasificarse por sus propiedades físicas, permitiendo la preparación de isómeros puros diastereoisoméricamente. Esto permite la preparación de PMO puros estereoquímicamente o sustancialmente puros estereoquímicamente en condiciones de reacción controladas, que entonces pueden usarse para preparar selectivamente oligonucleótidos con una estereoquímica deseada.
Realizaciones también pueden proporcionar métodos para la separación de mezclas diastereoisoméricas de los compuestos divulgados anteriormente en compuestos puros estereoquímicamente o sustancialmente puros estereoquímicamente. Una vez separados, los diastereoisómeros puros de la mezcla anteriormente diastereoisomérica pueden usarse para preparar compuestos puros diastereoisoméricamente a través de reacciones de acoplamiento estereoespecíficas.
Los compuestos puros diastereoisoméricamente y compuestos sustancialmente puros diastereoisoméricamente preparados como se expone en este documento pueden ser oligonucleótidos de fosforodiamidato puros diastereoisoméricamente. Estos oligonucleótidos de fosforodiamidato puros diastereoisoméricamente y sustancialmente puros diastereoisoméricamente pueden tener múltiples usos. Por ejemplo, pueden ser útiles como
productos farmacéuticos. Pueden seleccionarse por propiedades que son potencialmente superiores a las de mezclas heterogéneas (mezclas estereoaleatorias) de diastereoisómeros de oligonucléotidos de fosforodiamidato. Por ejemplo, pueden seleccionarse por diferencias en potencia, eficacia, estabilidad, seguridad y especificidad. Los oligómeros puros diastereoisoméricamente y sustancialmente puros diastereoisoméricamente pueden tener propiedades físicas, químicas y biológicas que difieren de las de mezclas heterogéneas estereoquímicamente de oligómeros.
"Estereoisómeros" se refiere a isómeros que difieren solamente en la disposición de los átomos en el espacio.
"Diastereoisómeros" se refiere a estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí.
"Enantiómeros" se refiere a estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Enantiómeros incluyen isómeros "puros enantioméricamente" que comprenden sustancialmente un solo enantiómero, por ejemplo, más de o igual a un 90 %, 92 %, 95 %, 98 % o 99 % o igual a un 100 % de un solo enantiómero.
"Monómero activado" se refiere a subunidades morfolino 5'-O-fosforiladas que albergan grupos salientes que tienen fósforo reactivo incluyendo, aunque sin limitación, grupos salientes de cloruro y haluro, que experimentan reacción de desplazamiento con nucleófilos incluyendo, aunque sin limitación, aminas y alcoholes.
"R" y "S" como términos que describen isómeros son descriptores de la configuración estereoquímica en átomos sustituidos asimétricamente incluyendo, aunque sin limitación: carbono, azufre, fósforo y nitrógeno de amonio. La designación de átomos sustituidos asimétricamente como "R" o "S" se hace por la aplicación de las normas de prioridad de Cahn-Ingold-Prelog, que son bien conocidas por los expertos en la materia, y se describen en las Normas de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) para la Nomenclatura de Química Orgánica. Sección E, Estereoquímica.
Un enantiómero puede caracterizarse por la dirección en que hace rotar el plano de la luz polarizada en el plano, que es bien conocido por los de las materias químicas. Si hace rotar la luz en la dirección de las agujas del reloj (como observa un observado hacia el que está viajando la luz), ese enantiómero se marca (+), y se indica dextrógiro. Su imagen especular hará rotar la luz polarizada en el plano en una dirección contraria a las agujas del reloj, y se marca (-) o levógiro. La dirección de rotación de la luz polarizada en el plano por un compuesto puro enantioméricamente, denominado el signo de rotación óptica, puede medirse fácilmente en un dispositivo convencional conocido como polarímetro.
"Racémica" se refiere a una mezcla que contiene partes iguales de enantiómeros individuales.
"No racémica" se refiere a una mezcla que contiene partes desiguales de enantiómeros individuales. Una mezcla no racémica puede enriquecerse en la configuración R o S, incluyendo, sin limitación, mezclas aproximadamente 50/50, aproximadamente 60/40 y aproximadamente 70/30 de enantiómero R a S, o enantiómero S a R.
"Sustancialmente puro estereoquímicamente" y "pureza estereoquímica sustancial" se refieren a enantiómeros o diastereoisómeros que están en exceso enantiomérico o exceso diastereoisomérico, respectivamente, igual a o mayor de un 80 %. En algunas realizaciones, "sustancialmente puro estereoquímicamente" y "pureza estereoquímica sustancial" se refieren a enantiómeros o diastereoisómeros que están en exceso enantiomérico o exceso diastereoisomérico, respectivamente, igual a o mayor de un 87 %, igual a o mayor de un 90 %, igual a o mayor de un 95 %, igual a o mayor de un 96 %, igual a o mayor de un 97 %, igual a o mayor de un 98 %, o igual a o mayor de un 99 %. "Sustancialmente puro diastereoisoméricamente" se refiere a diastereoisómeros que están en exceso diastereoisomérico igual a o mayor de un 87 %, igual a o mayor de un 90 %, igual a o mayor de un 95 %, igual a o mayor de un 96 %, igual a o mayor de un 97 %, igual a o mayor de un 98 %, o igual a o mayor de un 99 %.
"Exceso enantiomérico" (ee) de un enantiómero es [(la fracción molar del enantiómero principal) menos la (fracción molar del enantiómero minoritario)]x100. Exceso diastereoisomérico (de) de un diastereoisómero en una mezcla de dos diastereoisómeros se define de forma análoga.
"Sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, se refiere a sales por adición de ácidos o sales por adición de bases de los compuestos de la presente divulgación. Una sal farmacéuticamente aceptable es cualquier sal que retiene la actividad del compuesto precursor y no imparte efecto indebidamente perjudicial o indeseable alguno en un sujeto al que se administra y en el contexto en el que se administra. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, complejos metálicos y sales de ácidos tanto inorgánicos como carboxílicos. Sales farmacéuticamente aceptables también incluyen sales metálicas tales como sales de aluminio, calcio, hierro, magnesio, manganeso y complejas. Además, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, sales ácidas tales como acética, aspártica, alquilsulfónica, arilsulfónica, de axetilo, bencenosulfónica, benzoica, bicarbónica, bisulfúrica, bitartárica, butírica, de edetato de calcio, camsílica, carbónica, clorobenzoica, cítrica, edética, edisílica, estólica, de esilo, esílica, fórmica, fumárica, glucéptica, glucónica, glutámica, glicólica, glicolilarsanílica, hexámica, hexilresorcinoica, hidrabámica, hidrobrómica, clorhídrica, yodhídrica, hidroxinaftoica, isetiónica, láctica, lactobiónica, maleica, málica, malónica, mandélica, metanosulfónica, metilnítrica, metilsulfúrica, múcica, mucónica, napsílica, nítrica, oxálica, p-nitrometanosulfónica, pamoica, pantoténica, fosfórica, monohidrogenofosfórica, dihidrogenofosfórica, ftálica,
poligalacturónica, propiónica, salicílica, esteárica, succínica, sulfámica, sulfanílica, sulfónica, sulfúrica, tánica, tartárica, teoclica, toluenosulfónica y similares.
Una "cantidad eficaz" de una combinación de agentes terapéuticos (por ejemplo, compuesto 1 y un inhibidor de CDK 4/6) es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico observable en comparación con HCC o IHCC que se ha dejado sin tratar en un sujeto o paciente.
Pueden combinarse agentes activos como se presenta en este documento con un vehículo farmacéuticamente aceptable para proporcionar formulaciones farmacéuticas de los mismos. La elección particular del vehículo y la formulación dependerá de la vía de administración particular a la que se destina la composición.
"Vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en este documento, se refiere a un vehículo, adyuvante o excipiente atóxico que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el que se formula. Vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones de esta invención incluyen, aunque sin limitación, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polietilenglicol y lanolina.
Las composiciones de la presente invención pueden ser adecuadas para administración por vía parenteral, oral, inhalatoria, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o de depósito implantado, etc. En algunas realizaciones, la formulación comprende ingredientes procedentes de fuentes naturales o no naturales. En algunas realizaciones, la formulación o el vehículo puede proporcionarse en una forma estéril. Ejemplos no limitantes de un vehículo estéril incluyen agua libre de endotoxinas o agua apirógena.
El término "parenteral", como se usa en este documento, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. En realizaciones particulares, los compuestos se administran por vía intravenosa, oral, subcutánea o por vía intramuscular. Formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable atóxico. Entre los excipientes y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentra el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión.
Realizaciones de la invención proporcionan la preparación de isómeros puros estereoquímicamente o isómeros sustancialmente puros estereoquímicamente, seguida del uso de isómeros puros para preparar estereoespecíficamente oligómeros de morfolino de fosforodiamidato (PMO) puros diastereoisoméricamente. La preparación puede ser mediante separación de la mezcla diastereoisomérica de nucleótidos de fosforamidocloridato. La separación puede hacerse, por ejemplo, por cromatografía; por ejemplo, cromatografía de líquidos de alto rendimiento o "HPLC." La separación también puede conseguirse a través de cristalización.
Los monómeros separados pueden denominarse monómeros "activos". Por "activo" se entiende que los monómeros incluyen resto de fosforamidocloridato que es reactivo hacia una diversidad de nucleófilos, lo que incluye, aunque sin limitación: aminas, alcoholes/alcóxidos, tiol/tiolato, alquil-litio y reactivos de Grignard.
I. Preparación de isómeros diastereoisoméricos
En una realización, los monómeros activados puros estereoquímicamente o sustancialmente puros estereoquímicamente pueden prepararse por separación de una mezcla diastereoisomérica de monómeros. La separación puede conseguirse por métodos que permite la distinción de estereoisómeros usando propiedades físicas. Por ejemplo, la separación puede conseguirse a través de cromatografía o cristalización. Los tipos adecuados de cromatografía incluyen, por ejemplo, aunque sin limitación, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), cromatografía de lecho móvil simulado, cromatografía a contracorriente, y otros tipos de cromatografía de separación. Por ejemplo, una mezcla diastereoisomérica puede someterse a HPLC, eluyendo una fracción de movilidad rápida y una fracción de movilidad lenta. Cada una de estas fracciones es una cantidad pura estereoquímicamente o sustancialmente pura estereoquímicamente diferente de un monómero. Como se describe a continuación, estos monómeros pueden usarse para preparar oligómeros con estereoquímica deseada a través de acoplamiento estereoespecífico usando condiciones de reacción controladas.
Hemos determinados además que, una vez separados, los monómeros activados puros estereoquímicamente tienen suficiente estabilidad para su uso en reacciones químicas adicionales. Además, hemos determinado que los monómeros activados puros estereoquímicamente pueden experimentar reacciones químicas estereoespecíficas. Por tanto, como se analiza en más detalle a continuación, estos monómeros activados puros estereoquímicamente pueden usarse para reacciones de acoplamiento estereoespecíficas para preparar productos puros estereoquímicamente.
Como se indica anteriormente, realizaciones pueden proporcionar uno o más compuestos puros estereoquímicamente o sustancialmente puros estereoquímicamente de la tabla 1, que pueden prepararse aprovechando las diferentes propiedades físicas en los estereoisómeros. Realizaciones adicionales también pueden proporcionar enantiómeros de los compuestos de la tabla 1. Típicamente, la estereoquímica de esos enantiómeros varía de la de los compuestos de la tabla 1 por la alteración de la estereoquímica del anillo morfolino.
Tabla 1
en la que R3 es trifenilmetilo opcionalmente sustituido (también denominado "tritilo"), bencilo opcionalmente sustituido o sulfonilo. R4, R5 y R6 pueden ser -C(O)R7 o -C(O)OR8, donde R7 es metilo, etilo o fenilo, y R8 es bencilo o 2,2,2 tricloroetilo. R9 puede ser alquilo opcionalmente sustituido, cianoetilo (para su uso como grupo protector véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2013/0197220), acilo, sulfonilo, acetal/cetal, carbonato, carbamato, bencilo opcionalmente sustituido, 4-pivaloiloxibencilo y sililo.
En algunas realizaciones, el bencilo opcionalmente sustituido es 4-metoxibencilo (PMB, MPM). En algunas realizaciones, sulfonilo es un sulfonilo escindible. En algunas realizaciones, sulfonilo es 2-nitrobencenosulfonilo, 4-nitrobencenosulfonilo o 2,4-dinitrobencenosulfonilo.
R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes, y pueden ser -H, alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido, fenilo opcionalmente sustituido, naftilo opcionalmente sustituido o, con el nitrógeno al que están fijados, formar un heterociclo opcionalmente sustituido, que puede ser, por ejemplo, pirrolidina, piperazina o morfolina.
Los restos opcionalmente sustituidos pueden estar sustituidos con uno o más de metilo, etilo, halógeno, nitro o ciano. R3 puede ser tritilo (Tr), que puede ser tritilo sustituido incluyendo, aunque sin limitación, tal como MMTr (pmetoxifenildifenilmetilo), bencilo, 4-metoxibencilo (PMB, MPM) y 3,4-dimetoxibencilo, difenilmetilo (Dpm),
R4, R5, R6 pueden ser -H, -C(O)R7 o -C(O)OR7, donde R7 es alquilo (metilo, etilo, isopropilo u otro alquilo C1-C6) o arilo (incluyendo, aunque sin limitación, fenilo, 4-metoxifenilo, 4-bromofenilo y 4-nitrofenilo).
II. Acoplamiento estereoespecífico
Además de determinar que la tecnología de separación podría usarse para preparar cantidades sustancialmente puras estereoquímicamente de monómero activado, hemos determinado que estos monómeros activados pueden usarse, en algunas condiciones de reacción, para conseguir acoplamiento estereoespecífico para la preparación de
dinucleótidos puros estereoquímicamente, trinucleótidos puros estereoquímicamente y oligómeros más grandes puros estereoquímicamente. A través del uso de métodos presentados en este documento, puede codificarse específicamente la quiralidad de enlace PMO recién formado por la quiralidad de los monómeros activos puros estereoquímicamente usados para formar el oligómero.
Las condiciones de reacción típicas para acoplamiento estereoespecífico incluyen reacción en disolventes apróticos. Estos disolventes pueden ser, por ejemplo, aunque sin limitación, acetonitrilo, tetrahidrofurano (THF), 1,3-dimetilimidazolidinona (DMI), dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidinona (NMP), dimetilacetamida (DMAc), diclorometano (DCM), 1,2-dicloroetano (DCE), cloroformo, 1,4-dioxano, acetato de etilo, 2-metiltetrahidrofurano y acetato de isopropilo. Las reacciones de acoplamiento pueden realizarse en presencia de bases de amina terciaria no nucleófilas y bases aromáticas. Bases adecuadas incluyen, aunque sin limitación, diisopropiletilamina, trietilamina, 2,6-lutidina, trimetilpiridinas (colidinas) y N-etilmorfolina. Las temperaturas de reacción pueden variar de temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) a 50 °C. Puede aplicarse sonicación en algunos casos para ayudar en la disolución de uno o más sustratos.
Para demostrar la viabilidad del acoplamiento estereoespecífico, se prepararon múltiples dinucleótidos PMO sustancialmente puros estereoquímicamente por acoplamiento de PMO estereoespecífico de los monómeros activos sustancialmente puros estereoquímicamente (fosforamidocloridatos) de elución rápida y lenta. La tabla 2, a continuación, resume los perfiles de retención de HPLC de estos dinucleótidos PMO sustancialmente puros estereoquímicamente. La tabla compara los tiempos de retención para los dinucleótidos que se prepararon a partir de combinaciones de los monómeros del extremo 5' enumerados en la izquierda de la tabla con isómeros de elución más rápida y elución más lenta de monómeros del extremo 3' enumerados en la parte superior. La tabla demuestra que el acoplamiento estereoespecífico de monómeros activos sustancialmente puros estereoquímicamente produce diferentes dinucleótidos puros diastereoisoméricamente que tienen diferentes propiedades físicas.
Las condiciones de HPLC analítica para realizar el perfil de los dinucleótidos PMO sustancialmente puros estereoquímicamente de la tabla 2 se presentan a continuación:
Ejemplos
III. Ejemplos de separación diastereoisomérica de monómeros activados
Los siguientes ejemplos muestran la separación diastereoisomérica de monómeros activados de acuerdo con determinadas realizaciones como se presenta en este documento.
A. Monómeros de U
mezcla diastereoisomérica isómero de elución rápidar: A
isómero de elución tardía-: A
Condiciones de HPLC analítica para monómeros de U activados:
Condiciones de HPLC preparativa para monómeros de U activados:
Chiralpak IC, 21 x 250 mm, 5p; la columna se eluye a 11 ml/minuto con acetato de etilo, temperatura ambiente, detección a 260 nm.
[Datos de RMN de 1H para U1]
1H RMN (400 MHz, CDCls) 58,18 (a, 1H), 7,45 (m, 6H), 7,15-7,32 (m, 10H), 6,12 (dd, 1H, J= 2,0 & 9,6 Hz), 5,62 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 4,39 (m, 1H), 4,11 (m, 2H), 3,39 (d, 1H, J= 11 Hz), 3,15 (d, 1H, J= 11 Hz), 2,65 (s, 3H), 2,62 (s, 3H), 1,49 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,39 (t, 1H, J= 11 Hz)
[Datos de RMN de 1H para U2]
1H RMN (400 MHz, CDCls) 58,07 (a, 1H), 7,44 (m, 6H), 7,14-7,34 (m, 10 H), 6,12 (dd, 1H, J= 2 & 9 Hz), 5,61 (d, 1H, 8,0 Hz), 4,39 (m, 1H), 4,08 (m, 2H), 3,39 (d, 1H, J= 12 Hz), 3,15 (d, 1H, J= 12 Hz), 2,66 (s, 3H), 2,62 (s, 3H), 1,46 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,38 (t, 1H, J= 11 Hz),
B. Monómeros de A
Condiciones de HPLC preparativa para monómeros de A activados:
Chiralpak IC, 21 x 250 mm, 5 u; se eluye con 100 % de acetato de etilo a 15 ml/minuto, temperatura ambiente, detección de uv 260 nm.
[Datos de RMN de 1H para A1]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 59,01 (a, 1H), 8,79 (s, 1H), 8,00 (m, 3H), 7,58 (m, 1H), 7,4-7,6 (m, 8 H), 7,2-7,4 (m, 10H), 6,42 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 4,51 (m, 1H), 4,12 (m, 3H), 3,54 (d, 1H, J= 12 Hz), 3,25 (d, 1H, J= 12 Hz), 2,62 (s, 3H), 2,59 (s, 3H), 1,81 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,62 (t, 1H, J= 11 Hz)
[Datos de RMN de 1H para A2]
1H RMN (400 MHz, CDCl3) 59,04 (a, 1H), 8,79 (s, 1H), 8,00 (m, 3H), 7,56 (m, 1H), 7,4-7,6 (m, 8H), 7,2-7,4 (m, 10H), 6,41 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 4,51 (m, 1H), 4,12 (m, 3H), 3,54 (d, 1H, J= 12 Hz), 3,25 (d, 1H, J= 12 Hz), 2,64 (s, 3H), 2,61 (s, 3H), 1,82 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,63 (t, 1H, J= 11 Hz)
C. Monómeros de C
Condiciones de HPLC preparativa para monómeros de C activados:
Chiralpak IC eluida a 15 ml/minuto con 75 % de acetato de etilo y 25 % de n-heptano. Temperatura ambiente y detección de uv 260 nm.
[Datos de RMN de 1H para C1]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,66 (d, 1H, J= 7,8 Hz), 7,43 (m, 6H), 7,33 (d, 1H, J= 7,4 Hz), 7,15-7,32 (m, 9H), 6.18 (dd, 1H, J= 2,2 & 9,2 Hz), 4,42 (m, 1H), 4,08-4,16 (m, 2H), 3,54 (d, 1H, J= 11 Hz), 3,14 (d, 1H, J= 12 Hz), 2,64 (s, 3H), 2,60 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 1,51 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,25 (m, 1H).
[Datos de RMN de 1H para C2]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,64 (d, 1H, J= 7,8 Hz), 7,43 (m, 6H), 7,32 (d, 1H, J= 7,4 Hz), 7,15-7,32 (m, 9H), 6.19 (dd, 1H, J= 2,1 & 9,2 Hz), 4,41 (m, 1H), 4,06-4,15 (m, 2H), 3,54 (d, 1H, J= 11 Hz), 3,15 (d, 1H, J= 12 Hz), 2,64 (s, 3H), 2,61 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 1,49 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,25 (m, 1H)
D. Monómeros de G (guanina monoprotegida)
Condiciones de HPLC analítica para monómeros de G activados:
Condiciones de HPLC preparativa para monómeros de G activados:
Chiralpak IC eluida a 15 ml/minuto con 100 % de acetato de etilo. Temperatura ambiente y detección de uv 260 nm.
E. Monómeros de T
Condiciones de HPLC analítica para monómeros de T activados:
Condiciones de HPLC preparativa para monómeros de T activados:
Chiralpak IC, 50 x 500 mm, 20 u. La columna se eluye a 60 ml/minuto con acetato de etilo, temperatura ambiente, detección a 260 nm. Los tiempos de retención son 25 y 40 minutos.
[Datos de RMN de 1H para T1]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 7,4-7,5 (m, 5H), 7,26-7,33 (m, 6H), 7,16-7,22 (m, 3H), 7,04 (d, 1H, J= 1 Hz), 6,12 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 4,39 (m, 1H), 4,12 (m, 2H), 3,37 (d, 1H, J= 12 Hz), 3,15 (d, 1H, J= 12 Hz), 2,66 (s, 3H), 2,63 (s, 3H), 1,83 (d, 1H, J= 1 Hz), 1,49 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,41 (t, 1H, J= 11 Hz))
[Datos de RMN de 1H para T2]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,4-7,5 (m, 6H), 7,24-7,35 (m, 6H), 7,14-7,22 (m, 3H), 7,03 (s, 1H), 6,12 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 4,39 (m, 1H), 4,09 (m, 2H), 3,37 (d, 1H, J= 11 Hz), 3,15 (d, 1H, J= 11 Hz), 2,66 (s, 3H), 2,62 (s, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,48 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,40 (t, 1H, J= 11 Hz)
F. Monómeros de C (NBz)
Condiciones de HPLC analítica para monómeros de C activados (NBz):
Condiciones de HPLC preparativa para monómeros de C activados (NBz):
Chiralpak IB, 20 x 250 mm 5 u, eluida a 9 ml/minuto con 100 % de acetonitrilo. Temperatura ambiente y detección de uv 260 nm. Los tiempos de retención son 13 y 16 minutos.
G. Monómeros de G (guanina biprotegida)
Condiciones de HPLC analítica para monómeros de G activados (guanina biprotegida):
Condiciones de HPLC preparativa para monómeros de G activados (guanina biprotegida):
Chiralpak IA 50 x 500 mm, eluida a 60 ml/minuto con 100 % de acetato de etilo. Temperatura ambiente y detección de uv 260 nm. Los tiempos de retención son 20 y 24 minutos.
[Datos de RMN de 1H para G1 (guanina biprotegida)]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,76 (s, 2H), 7,50 (d, 2H, J= 9 Hz), 7,4-7,5 (m, 6 H), 7,26-7,32 (m, 6H), 7,16 7,22 (m, 3H), 7,02 (d, 2H, J= 9 Hz), 6,24 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 5,61 (d, 1H, J= 12 Hz), 5,56 (d, 1H, J= 12 Hz), 4,48 (m, 1H), 4,1 (m, 2H), 3,47 (d, 1H, J= 11 Hz), 3,23 (d, 1H, J=12 Hz), 3,2 (m, 1H), 2,62 (s, 3H), 2,59 (s, 3H), 1,75 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,57 (t, 1H, J= 12 Hz), 1,33 (s, 9H), 1,33 (t, 6H, J= 7 Hz)
[Datos de RMN de 1H para G2 (guanina biprotegida)]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,78 (s, 1H), 7,77 (s, 1H), 7,50 (d, 2H, J= 9 Hz), 7,4-7,5 (m, 6H), 7,26-7,33 (m, 6H), 7,15-7,22 (m, 3H), 7,02 (d, 2H, J= 9 Hz), 6,23 (dd, 1H, J= 2 & 10 Hz), 5,61 (d, 1H, J= 12 Hz), 5,56 (d, 1H, J= 12 Hz), 4,47 (m, 1H), 4,1 (m, 2H), 3,47 (d, 1H, J= 11 Hz), 3,22 (d, 1H, J= 12 Hz), 3,2 (m, 1H), 2,64 (s, 3H), 2,60 (s, 3H), 1,75 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,58 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,33 (s, 9H), 1,33 (t, 6H, J= 7 Hz)
IV. Ejemplos de acoplamiento de PMO estereoespecífico con monómeros activados puros diastereoisoméricamente
Los siguientes ejemplos presentan el uso de acoplamiento estereoespecífico para preparar productos homogéneos estereoquímicamente.
A. Monómeros de U activados (Ui y U2) U-morfolina-NH (1)
Ui (11 mg, 0,018 mmol, 1 equiv., 99,0 % de) se disolvió en acetonitrilo (0,11 ml) y se mezcló con diisopropiletilamina (8 gl, 0,05 mmol, 2,5 equiv.). Se añadió U-morfolina-NH (1 ; 14 mg, 0,030 mmol, 1,6 equiv.) y se aplicó sonicación para ayudar en la disolución. Después de agitar 0,5 h, se diluyó una pequeña alícuota de mezcla de reacción con CDCh y se analizó por RMN de 1H. Todo el resto de la mezcla de reacción se diluyó con acetonitrilo (8 ml) para análisis de HPLC y se mantuvo en congelador. La formación estereoespecífica de 2 se confirmó por análisis de HPLC (99,4 % de). El protocolo anterior se empleó también para el acoplamiento de U2 (95,6 % de) para dar estereoespecíficamente 3 (96,0 % de).
Condiciones de HPLC analítica para acoplamiento de U/U:
[Datos de RMN de 1H para 2]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,6 (m, 4H), 7,2-7,5 (m, 20H), 7,1-7,2 (m, 3H), 6,15 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 5,73 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 5,66 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 5,54 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 4,40 (m, 1H), 3,93 (m, 2H), 3,81 (m, 1H), 3,70 (m, 2H), 3,41 (m, 2H), 3,40 (m, 3H), 3,11 (d, 1H, J= 12 Hz), 2,78 (m, 1H), 2,56 (s, 3H; NMe), 2,54 (s, 3H; NMe), 2,48 (m, 1H), 1,47 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,35 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,04 (s, 9H)
[Datos de RMN de 1H para 3]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 57,6 (m, 4H), 7,3-7,5 (m, 11H), 7,2-7,3 (m, 9H), 7,1 (m, 3H), 6,12 (dd, 1H, J= 2,0 & 9,6 Hz), 5,71 (d, 1H, J= 8,4 Hz), 5,70 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 5,47 (dd, 1H, J= 2,0 & 10,4 Hz), 4,31 (m, 1H), 3,97 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,73 (m, 2H), 3,65 (m, 1H), 3,31 (m, 2H), 3,24 (m, 1H), 3,07 (d, 1H, J= 12 Hz), 2,68 (m, 1H), 2,65 (s, 3H; NMe), 2,62 (s, 3H; NMe), 2,26 (m, 1H), 1,45 (t, 1H, J= 12 Hz), 1,29 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,04 (s, 9H)
B. Monómeros de C activados (Ci y C2) C-morfolina-NH (4)
isóm ero de elución rápida: C.| isóm ero de elución rápida: 6
isóm ero de elución ta rd ía : C 2 isóm ero de elución ta rd ía : 5
C1 (20 mg, 0,031 mmol, 1 equiv., 93,5 % de) se disolvió/suspendió en THF (0,40 ml) y se mezcló con diisopropiletilamina (12 gl, 0,069 mmol, 2,3 equiv.). Se añadió la morfolinocitosina (4 ; 16 mg, 0,035 mmol, 1,1 equiv.) disuelta en THF (0,20 ml). Después de agitar 1,0-2,0 h, se diluyó una pequeña alícuota de mezcla de reacción con acetonitrilo y se analizó por CL/EM. Se diluyó una alícuota (30-50 gl) de mezcla de reacción con diclorometano (0,6 ml) para análisis de HPLC. La formación estereoespecífica de 6 se confirmó por análisis de HPLC (94,3% de). La mezcla de reacción se cargó directamente en una columna de gel de sílice y se eluyó con una fase móvil en gradiente de 0-15 % de metanol en acetato de etilo. El protocolo anterior se empleó también para el acoplamiento de C/C de C2 (90,2 % de) para dar estereoespecíficamente 5 (90,0 % de).
Condiciones de HPLC analítica para acoplamiento de C/C:
[Datos de RMN de 1H para 5]
1H RMN (400 MHz, CDCI3) 5 10,9 (a, 1H), 7,69 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 7,62 (m, 5H), 7,35-7,44 (m, 13H), 7,21 7,35 (m, 6H), 7,15 (m, 4H), 6,14 (a d, 1H, J= 7,8 Hz), 5,58 (dd, 1H, J= 2,4 & 9,4 Hz), 5,53 (a, 1H), 4,51 (dd, 1H, J= 8,6 & 10 Hz), 4,09 (m, 1H), 3,70-3,80 (m, 4H), 3,60 (dd, 1H, J= 6,3 & 10 Hz), 3,56 (d, 1H, J= 11 Hz), 3,28 (m, 1H), 2,96 (d, 1H, J= 11 Hz), 2,69 (s, 3H; NMe), 2,67 (s, 3H; NMe), 2,65 (m, 1H), 2,25 (m, 1H), 2,07 (s, 3H), 1,31 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,13 (t, 1H, J= 11 Hz), 1,04 (s, 9H).
[Datos de RMN de 1H para 6]
1H RMN (400 MHz, CDCla) 59,57 (a, 1H), 7,62-7,70 (m, 7H), 7,35-7,50 (m, 14H), 7,23-7,35 (m, 4H), 7,12 (m, 4H), 6,31 (m, 1H), 5,79 (m, 1H), 5,70 (m, 1H), 4,61 (m, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,80-3,90 (m, 2H), 3,72 (m, 2H), 3,58 (m, 1H), 3,48 (m, 1H), 3,09 (m, 1H), 2,75 (m, 1H), 2,58 (s, 3H; NMe), 2,55 (s, 3H; NMe), 2,53 (m, 1H), 2,38 (m, 1H), 2,21 (s, 3H), 1,47 (t, 1H, J= 10 Hz), 1,22 (t, 1H, J= 10 Hz), 1,06 (s, 9H).
C. Monómeros de A activados (Ai y A2)+ U-morfolina-NH (1)
Ai (5,9 mg, 0,008 mmol) se suspendió en acetonitrilo (118 gl). Se añadió diisopropiletilamina (5 gl, 0,03 mmol) seguido de morfolinouracilo (1 ; 4,6 mg, 0,01 mmol). Se aplicó sonicación durante 1 min y la mezcla homogénea resultante se agitó a temperatura ambiente. Después de agitar durante la noche, la mezcla (pasta blanca espesa) se diluyó con una mezcla de acetonitrilo (5,0 ml) y metanol (0,30 ml) para dar solución transparente homogénea. Se analizó directamente una pequeña alícuota por HPLC sin dilución adicional.
A2 (F2; 5,0 mg, 0,007 mmol) se suspendió en acetonitrilo (100 gl). Se añadió diisopropiletilamina (4 gl, 0,02 mmol) seguido de morfolinouracilo (4,1 mg, 0,009 mmol). Se aplicó sonicación durante 1 min y la suspensión espesa resultante se agitó a temperatura ambiente. Después de agitar durante la noche, se añadió acetonitrilo (5,0 ml) y se aplicó sonicación para dar solución transparente homogénea. Se analizó directamente una pequeña alícuota por HPLC sin dilución adicional.
Condiciones de HPLC analítica para acoplamiento de U/A:
D. Monómeros de G activados (Gi y G2) U-morfolina-NH (1)
Gi (6,5 mg, 0,009 mmol, 1 equiv., 99,9 % de) se disolvió/suspendió en THF (0,13 ml) y se mezcló con diisopropiletilamina (3,6 pl, 0,02 mmol, 2,2 equiv.). Se añadió el morfolinouracilo (1; 4,7 mg, 0,010 mmol, 1,1 equiv.) disuelto en THF (0,07 ml). Después de agitar 1,0-2,0 h, se diluyó una pequeña alícuota de mezcla de reacción con acetonitrilo y se analizó por CL/EM. Se diluyó una alícuota (100 pl) de mezcla de reacción con diclorometano (0,4 ml) para análisis de HPLC. La formación estereoespecífica de 9 se confirmó por análisis de HPLC (99,9 % de).
Condiciones de HPLC analítica para acoplamiento de U/G:
Los compuestos sustancialmente puros diastereoisoméricamente presentados anteriormente pueden usarse para preparar oligonucleótidos puros estereoquímicamente y otros compuestos. Se muestran ejemplos de oligonucleótidos potenciales, por ejemplo, en Summerton, J (1999). "Morpholino Antisense Oligomers: The Case for an RNase-H Independent Structural Type.". Biochimica et Biophysica Acta 1489 (1): 141-58; y en Summerton, J; Weller D. (1997). "Morpholino Antisense Oligomers: Design, Preparation and Properties". Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7 (3): 187-95. Estos dos documentos se incorporan por referencia en este documento.
V. Ejemplo de síntesis estereoespecífica de PMO 16-meros y diferenciación de estereoisómeros por ensayo biofísico
Este ejemplo presenta una síntesis que aborda un par de PMO 16-meros estereopuros a través de acoplamiento estereoespecífico usando monómeros activados. Estos PMO tienen series estereoquímicas opuestas para sus enlaces fosforosos.
Secuencia diana:
(SEQ ID NO: 2)
Monómeros activos estereopuros (componentes básicos):
Se muestra un esquema para la síntesis estereoespecífica de PMO 16-meros y la diferenciación de estereoisómeros por ensayo biofísico en la figura 6. Se prepararon los estereoisómeros 1 y 2 de PMO 16-mero manualmente por síntesis en fase sólida en resina de aminometilpoliestireno-disulfuro (~300 pmol/g de carga, véase la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20090131624A1, que se incorpora por referencia en este documento) a escala de 50 mg (peso de resina de partida).
Soluciones madre para síntesis en fase sólida:
Ciclo operativo para cada acoplamiento de PMO:
Etapa Volumen (ml) Tiempo (min)
DCM 1-2 2-5
Destritilación 1-2 5
Destritilación 1-2 5
Destritilación 1-2 5
Destritilación 1-2 5
Destritilación 1-2 5
DCM 1-2 2-5
Neutralización 1-2 2-5
Neutralización 1-2 2-5
Neutralización 1-2 2-5
Neutralización 1-2 2-5
DCM 1-2 2-5
DCM 1-2 2-5
DCM 1-2 2-5
Etapa Volumen (ml) Tiempo (min)
Acoplamiento 1 >180*
DCM 1-2 2-5
Neutralización 1-2 2-5
Neutralización 1-2 2-5
DCM 1-2 2-5
DCM 1-2 2-5
DCM 1-2 2-5
DCM 1-2 2-5
* 40 °C durante 3 horas o temperatura ambiente durante 12 horas.
Liberación de la resina y desprotección:
Al 16-mero unido a la resina (después de destritilación) se le añadió 1:3 (v/v) de amoniaco acuoso/etanol al 28 % (~5 ml). La mezcla se selló y se calentó a 45 °C durante 20 horas. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se filtró y se lavó con metanol. El filtrado se concentró y se diafiltró frente a tampón de trietilamonio (TEAA) 15 mM pH 7,0. El aparato usado fue un Amicon Stirred Cell (50 ml) con una membrana UF Ultracel de 1 kDa. Las muestras se diafiltraron por dilución/concentración hasta que el disolvente original se redujo hasta un 1 % de la concentración original (aproximadamente 5 ciclos) y después se sometieron a purificación por HPLC preparativa en fase inversa.
Método de HPLC preparativa en fase inversa para purificación de PMO:
Método de CL/EM para evaluación de la calidad de PMO:
Materiales y condiciones para medición de temperatura de fusión (Tm)
Sumario para la caracterización de la fusión térmica de complejos de PMO distintos estereoquímicamente con ARN complementarios:
Los puntos de fusión para los estereoisómeros 1 y 2 se muestran en la figura 7. Basándose en los diferentes puntos de fusión, se puede concluir que se han preparado cantidad separadas de estereoisómeros sustancialmente puros.
VI. Ejemplo de síntesis estereoespecífica y asignación estereoquímica absoluta para el compuesto dinucleotídico de PMO estereopuro 100 (5'-TA2-3')
El monómero de A activo de elución tardía (A2; 200 mg, 0,277 mmol, 1 equiv.) se disolvió en una mezcla de acetonitrilo (2,0 ml) y DIPEA (0,12 ml, 0,69 mmol, 2,5 equiv.). Después se añadió T-morfolina-NH (1 ; 146 mg, 0,305 mmol, 1,1 equiv.) y la suspensión resultante se sonicó durante unos pocos minutos hasta que se obtuvo una solución transparente. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Tras la reacción completa controlada por CL/EM, la mezcla se concentró y se sometió a cromatografía en columna (3 % de metanol en DCM, Biotage SnapUltra 10 g de SiO2). Las fracciones de producto limpias se combinaron y concentraron al vacío para dar el dinucleótido 5'-TA-3' estereopuro completamente protegido 2 como un sólido blanco (240 mg, 0,206 mmol, 74 % de rendimiento).
Al dinucleótido completamente protegido 2 (500 mg, 0,429 mmol) en matraz de 25 ml se le añadió 2,2,2-trifluoroetanol (TFE; 4,0 ml) y ácido acético (1,0 ml) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente y se controló por CL/EM. Después de 30 minutos, la reacción se interrumpió con NaHCO3 acuoso saturado y DCM. Las dos capas se separaron y la capa acuosa se extrajo de nuevo. Todas las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera semisaturada, se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron para dar el producto en bruto como una espuma blanca. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna (20 % de MeOH en acetona, cartucho Biotage Snap Ultra 25 g de SiO2) para dar el dinucleótido parcialmente protegido 3 como un sólido vítreo (300 mg, 0,325 mmol, 76 % de rendimiento).
El dinucleótido parcialmente protegido 3 (250 mg, 0,271 mmol) se disolvió en una mezcla de metanol (12,5 ml) y THF (12,5 ml) y se trató con NaOH 1 M (10,8 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 22 h (progreso controlado por CL/EM), la mezcla se neutralizó con HCl 1 M (10,8 ml) para ajustar el pH a 8 y después se concentró al vacío hasta sequedad. El residuo se disolvió en agua (5 ml) y se lavó con EtOAc (5 ml). La capa acuosa se concentró al vacío hasta sequedad para dar el producto en bruto como un sólido blanco (480 mg). El
producto en bruto se purificó por cromatografía de exclusión por tamaño (Sephadex® LH-20, MeOH/agua 4:1) para dar el dinucleótido completamente desprotegido compuesto 100 como un sólido blanco (137 mg, 0,236 mmol, 87 % de rendimiento).
Una gota de solución acuosa de compuesto 100 (200 mg/ml) se selló en un pocillo con agua pura durante un día para que crecieran cristales individuales. La estructura por rayos X del cristal individual confirmó la configuración absoluta del enlace fosforoso como S. Esta estructura por rayos X se muestra en un diagrama ORTEP en la figura 8. Se muestran diagramas ORTEP de fragmentos separados en la figura 9A y la figura 9B. Se recogieron datos de rayos X como se presenta a continuación.
Recogida de datos
Se montó un cristal individual de compuesto 100 (C22H33N10O7 P) en una fibra de vidrio. Todas las mediciones se hicieron en un difractómetro usando grafito monocromado de radiación Cu-Ka.
Las constantes de celda y una matriz de orientación para la recogida de datos, obtenidos de refinado por mínimos cuadrados usando los ángulos de ajuste de 36473 reflejos centrados cuidadosamente en el intervalo de 7,75 < 20 < 147,10° correspondían a una celda monoclínica centrada en C con las dimensiones:
a = 33,3523(2) Á
b = 13,80020(11) Á p = 96,8075(6)°
c = 14,19956(10) Á
V = 6489,53(8) Á3
Para Z = 4 y F.W. = 580,54, la densidad calculada es 0,594 g/cm3. Basándose en las condiciones de reflejo de: hkl: h+k = 2n para consideraciones de compactación, una análisis estadístico de la distribución de la intensidad, y la resolución satisfactoria y refinado de la estructura, el grupo espacial se determinó en:
C2 (#5)
Los datos se recogieron a una temperatura de 23 1 °C usando la técnica de exploración w-20 hasta un valor 20 máximo de 147.7°. Las exploraciones omega de varios reflejos intensos, hechas antes de la recogida de datos, tuvieron un promedio de anchura a la mitad de la altura de 0,00° con un ángulo extracción de 6,0°. Se hicieron exploraciones de (0,00 0,00 tan 0)° a una velocidad de 0,0°/min (en w)).
Reducción de datos
Se recogieron 50795 reflejos, donde 12008 fueron únicos (Rint = 0,0453). Los datos se recogieron y procesaron usando CrysAlisPro (Rigaku Oxford Diffraction). (CrysAlisPro: programa informático de recogida y procesamiento de datos, Rigaku Corporation (2015). Tokio 196-8666, Japón). No se aplicó corrección de desintegración.
El coeficiente de absorción lineal, p, para radiación Cu-Ka es 6,011 cm-1. Se aplicó una corrección de absorción empírica que produjo factores de transmisión que varían de 0,341 a 1,000. Los datos se corrigieron para efectos de Lorentz y polarización.
Resolución y refinado de la estructura
La estructura se resolvió por métodos directos (SHELXT Versión 2014/5: Sheldrick, G. M. (2014). Acta Cryst. A70, C1437) y se expandió usando técnicas de Fourier. Los átomos que no eran hidrógeno se refinaron anisotrópicamente. Los átomos de hidrógeno se refinaron usando el modelo de desplazamiento (riding). El ciclo final de refinado de mínimos cuadrados de matriz completa (usando la función de mínimos cuadrados minimizada: (SHELXL Versión 2014/7); £w(Fo2-Fc2)2 donde w = mínimos cuadrados de los pesos) sobre F2 se basó en 12008 reflejos observados y 849 parámetros variables y convergieron (el desplazamiento de parámetro más grande fue 0,00 veces su esd) con factores de concordancia no ponderados y ponderados de:
R1 = 2 ||Fo| - |Fc|| / S |Fo| = 0,0522
wR2 = [ E ( w (Fo2 - Fe2)2 )/ E w{Fo2)2]1/2 = 0,1632
La adecuación de ajuste fue 1,45. La adecuación de ajuste se define como: [£w(Fo2-Fc2)2/(No-Nv)]1/2, donde: No = número de observaciones y Nv = número de variables.
Se usaron pesos unitarios. Los picos máximo y mínimo en el mapa de Fourier de diferencias final correspondieron a 1,79 y -0,69 e-/Á3 , respectivamente. El parámetro de Flack final fue 0,029(7), lo que indica que la estructura es de doble inversión. (Parsons, S. y Flack, H. (2004), Acta Cryst. A60, s61; Flack, H.D. y Bernardinelli (2000), J. Appl. Cryst.
33, 114-1148).
Los factores de dispersión de átomos neutros se adoptaron de las International Tables for Crystallography (IT), Vol. C, Tabla 6.1.1.4. (International Tables for Crystallography, Vol.C (1992). Ed. A.J.C. Wilson, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Países Bajos, Tabla 6.1.1.4, pág. 572). Se incluyeron los efectos de dispersión anómalos en Fcalc (Ibers, J. A. y Hamilton, W. C.; Acta Crystallogr., 17, 781 (1964)); los valores para Af' y Af" fueron los de Creagh y McAuley. (Creagh, D. C. y McAuley, W.J .; "International Tables for Crystallography", Vol C, (A.J.C. Wilson, ed.), Kluwer Academic Publishers, Boston, Tabla 4.2.6.8, páginas 219-222 (1992)). Los valores para los coeficientes de atenuación de masas son los de Creagh y Hubbell. (Creagh, D. C. y Hubbell, J.H..; "International Tables for Crystallography", Vol C, (A.J.C. Wilson, ed.), Kluwer Academic Publishers, Boston, Tabla 4.2.4.3, páginas 200-206 (1992)). Todos los cálculos se realizaron usando el paquete de programas informáticos cristalográficos Crystal Structure excepto para el refinado, que se realizó usando SHELXL Versión 2014/7. (CrystalStructure 4.2: Crystal Structure Analysis Package, Rigaku Corporation (2000-2015). Tokio 196-8666, Japón; SHELXL Versión2014/7: Sheldrick, G. M. (2008). Acta Cryst. A64, 112-122).
Los datos cristalinos, las mediciones de intensidad y la resolución y refinado de la estructura fueron como se muestra a continuación:
A. Datos cristalinos
Fórmula empírica C22H33N10O7 P
Peso de la fórmula 580,54
Color del cristal, hábito nONE, nONE
Dimensiones del cristal no descritas
Sistema cristalino monoclínico
Tipo de red centrada en C
N.° de reflejos usados para la
determinación de la celda unitaria (intervalo 20) 36473 (7,7 - 147,1°)
Anchura de pico de exploración omega
a la mitad de la altura 0,00°
Parámetros de red a = 33,3523(2) Á
b = 13,80020(11) Á
c = 14,19956(10) Á
P = 96,8075(6) O
V = 6489,53(8) Á3
Grupo espacial C2 (#5)
Valor Z 4
Dcalc 0,594 g/cm3
F000 1224,00
M(CuKa) 6,011 cm-1
B. Mediciones de intensidad
Difractómetro
Radiación CuKa (A = 1,54187 Á)
grafito monocromado
Ángulo de extracción 2,8°
Apertura de detector 2,0 - 2,5 mm horizontal
2.0 mm vertical
Distancia del cristal al detector 21 mm
Temperatura 23.0 °C
Tipo de exploración w-20
Tasa de exploración 0,0°/min (en w) (hasta 0 exploraciones)
Anchura de exploración (0,00 0,00 tan 0)°
20máx 147,7°
N.° de reflejos medidos Total: 50795
Únicos: 12008 (Rint = 0,0453)
Cocientes de Parsons (parámetro x de Flack):
4813
Correcciones Polarización de Lorentz
Absorción
(factores trans.: 0,341 - 1,000)
C. Resolución y refinado de la estructura
Resolución de la estructura Métodos directos (SHELXT Versión 2014/5) Refinado Mínimos cuadrados de matriz completa sobre
F2
Función minimizada Z w (Fo2 - Fc2)2
Mínimos cuadrados de los pesos w = 1/ [ a2(Fo2) (0.1000 ■ P)2
0,0000 ■ P ]
donde P = (Máx(Fo2,0) 2Fc2)/3
Valor límite de 20máx 147,7°
Dispersión anómala Todos los átomos que no son hidrógeno
N.° de observaciones (todos los reflejos) 12008
N.° de variables 849
Relación de reflejo/parámetro 14,14
Residuos: R1 (I>2,00a(I)) 0,0522
Residuos: R (todos los reflejos) 0,0534
Residuos: wR2 (todos los reflejos) 0,1632
Indicador de adecuación de ajuste 1,450
Parámetro de Flack (cocientes de
= 0,029(7)
4813)
Desplazamiento máx/error en ciclo final 0,001
Pico máximo en mapa dif. final 1,79 e-/Á3
Pico mínimo en mapa dif. final -0,69 e-/Á3
[Datos de RMN de 1H para compuesto 100]
1H RMN (400 MHz, D2O) 58,25 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 5,85 (d, 1H), 5,45 (d, 1H), 4,25 (m, 2H), 4,05 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,6 (m, 2H), 3,4 (m, 4H), 2,90 (m, 4H), 2,60 (d, 6H), 1,8 (s, 3H).
Claims (7)
1. Un método para preparar un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente que comprende enlaces fosforosos quirales, que comprende:
seleccionar monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente; y sintetizar un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente por acoplamiento estereoespecífico de los monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente seleccionados, en el que dicho acoplamiento estereoespecífico se realiza en un disolvente aprótico, en presencia de una amina terciara no nucleófila o base aromática, a una temperatura de 20 °C a 50 °C; en el que los monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente se obtienen separando una mezcla diastereoisomérica de monómeros de morfolino de fosforamidocloridato en monómeros de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente, y
en el que sustancialmente puros estereoquímicamente indica enantiómeros o diastereoisómeros que están en exceso enantiomérico o diastereoisomérico, respectivamente, igual a o mayor de un 87 %, y sustancialmente puros diastereoisoméricamente indica diastereoisómeros que están en exceso diastereoisomérico igual a o mayor de un 87 %.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la separación de la mezcla diastereoisomérica se produce por al menos un miembro del grupo que consiste en cromatografía y cristalización.
3. El método de la reivindicación 2, en el que la cromatografía se selecciona del grupo que consiste en cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), cromatografía de lecho móvil simulado y cromatografía a contracorriente. 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que los monómeros de morfolino de fosforamidocloridato sustancialmente puros estereoquímicamente se seleccionan del grupo que consiste en el compuesto de fórmula 20, el compuesto de fórmula 21, el compuesto de fórmula 22, el compuesto de fórmula 23, el compuesto de fórmula 24, el compuesto de fórmula 25, el compuesto de fórmula 26, el compuesto de fórmula 27, el compuesto de fórmula 28, el compuesto de fórmula 29, el compuesto de fórmula 30 y el compuesto de fórmula 31
en la que Ri y R2 pueden ser iguales o diferentes, y se seleccionan del grupo que consiste en -H, alquilo C1-C3 opcionalmente sustituido, fenilo opcionalmente sustituido, naftilo opcionalmente sustituido o, con el nitrógeno al que están fijados, formar un heterociclo opcionalmente sustituido, que puede ser, por ejemplo, pirrolidina, piperazina y morfolina;
en la que R3 se selecciona del grupo que consiste en tritilo (Tr), que puede se tritilo sustituido incluyendo, aunque sin limitación, tal como MMTr (p-metoxifenildifenilmetilo), bencilo opcionalmente sustituido, 4-metoxibencilo (PMB, MPM), 3,4-dimetoxibencilo, difenilmetilo (Dpm), 4-metoxibencilo y sulfonilo;
R4, R5 y R6 se seleccionan del grupo que consiste en -H, -C(O)R7 y -C(O)OR7, donde R7 es alquilo C1-C6, bencilo, 2,2,2-tricloroetilo y un grupo arilo seleccionado de fenilo, 4-metoxifenilo, 4-bromofenilo y 4-nitrofenilo;
R9 se selecciona del grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido, cianoetilo, acilo, carbonato, carbamato, bencilo opcionalmente sustituido,
4-pivaloiloxibencilo y sililo,
y enantiómeros de los mismos.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el sulfonilo es un sulfonilo escindible seleccionado del grupo que consiste en 2-nitrobencenosulfonilo, 4-nitrobencenosulfonilo y 2,4-dinitrobencenosulfonilo.
6. Un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente que comprende enlaces fosforosos quirales preparado por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Una composición farmacéutica que comprende un oligómero de morfolino de fosforodiamidato sustancialmente puro diastereoisoméricamente que comprende enlaces fosforosos quirales de la reivindicación 6 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
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