CN102702265A - 一种固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法。采用了一种便宜易得的树脂：王树脂作为固相载体，末端羟基用叔丁基二甲基硅保护的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)结构；其中碱基B的结构为：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)四种碱基的任意一种。本发明与现有固相合成技术相比大大降低了合成成本，适合磷酰二胺吗啉代寡核苷酸产品的大量生产。
Description
技术领域
本发明涉及有机生物医药技术领域，自主研发了一种新型的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)及方法。
背景技术
美国专利US5185444主要介绍了人工合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法。其最大贡献是首先完整地提出了人工合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法。不足之处在于，这种方法已经沿用了二十年，对于固相合成，使用了树脂LCAA-CPG作为固相载体，这种树脂极其昂贵，国内没有生产，只有进口，价格在15000元/10克（西格玛奥德里奇公司价格），因此合成成本巨大。现阶段，由于磷酰二胺吗啉代寡核苷酸在医学应用上有了突破性进展，已经到了临床试验阶段，需要合成量较大，所以需要从合成成本上考虑，尽量降低成本。
LCAA-CPG结构:
发明内容
本发明要解决的问题是，采用了一种便宜易得的树脂：王树脂作为固相载体，开发出一种新的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)的方法。这种合成方法不仅在总收率上达到原有技术类似反应的水平，而且因为采用的固相载体王树脂的价格只有3000元/公斤（吉尔生化（上海）价格），所以能够大大降低成本，适合公斤级大量合成规模。对于在国内的医学应用上作出了突出的贡献。
本发明的技术方案如下：
一种固相合成的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，采用了王树脂作为固相载体，末端羟基用叔丁基二甲基硅保护的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)结构：
所述PMO-王树脂的结构：
其中碱基B的结构为：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)四种碱基的任意一种。
所述PMO-王树脂结构中，上下两端的碱基B为相同的或是不同的一种碱基；复单元中的碱基B是这四种碱基的其中一种或者任意的排列组合。
说明几个典型PMO(n)-王树脂的结构：
n=1，碱基B分别为腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的PMO(A-T)-王树脂的结构：
n=2,碱基B分别为腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的PMO(A-T)-王树脂的结构：
n=3,PMO(G-C-A-T)-王树脂的结构：
本发明的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法，具体反应步骤如下：
1）含有一种碱基基团B的吗啉代衍生物和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔投料比为1/1.3，溶于二氯甲烷中，二氯甲烷用量足够将吗啉代衍生物和叔丁基二甲基氯硅烷溶解即可；在室温搅拌下加入咪唑，咪唑的加入量和吗啉代衍生物的摩尔比为3/1；反应5个小时后反应物用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，去除溶剂后得到粗品产物为无色的油；
2）第一步反应产物无色的油溶于含有乙酸的三氟乙酸中，乙酸和三氟乙酸的体积比为1/50，搅拌4个小时，之后去除溶剂得到白色固体；
3）第二步反应产物白色固体溶于体积比为1:1的水和二氧六环中，在室温加入碳酸钠；反应物搅拌过夜后用水和二氯甲烷洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，去除溶剂，粗品经过柱层析法纯化后得到白色固体；
4）王树脂放入一个固相合成管里，然后加入第三步反应产物白色固体，王树脂和第三步反应产物白色固体的摩尔投料比为1/1，二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）与第三步反应产物的摩尔投料比分别为1.3/1和0.35/1；固相合成管放置在摇床上反应12个小时，然后固相树脂用大量二氯甲烷洗涤，得到产物；
5）向装有第四步反应产物的固相合成管里加入四丁基氟化铵四氢呋喃溶液，溶液浓度为100毫克/毫升；然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到产物；
6）含有一种碱基基团B并且用磷酰二胺活化后的吗啉代衍生物和第五步反应产物反应，摩尔投料比范围为2-9/1，溶于浓度为50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中，放入固相合成管里；过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到产物；
7）向装有第六步反应产物的固相合成管里加入浓度为100毫克/毫升的四丁基氟化铵四氢呋喃溶液；然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到产物。
根据不同碱基B的吗啉代单体个数（n+1），重复n次第六步、第七步反应，将（n+1）个不同碱基B（1,2,3,4）的吗啉代单体通过磷酰二胺进行连接，最后在氨水条件下将产物从王树脂这一固相载体上切下来，得到磷酰二胺吗啉代寡核苷酸。
当n=1，第一步反应中碱基基团B为腺嘌呤(A)，第六步反应中碱基基团B为胸腺嘧啶(T)，在氨水条件下将第七步反应产物从王树脂这一固相载体上切下来，得到磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(A-T)。
当n=2，第一步反应中碱基基团B为腺嘌呤(A)，第六步反应中碱基基团B为胸腺嘧啶(T)，含有碱基基团B为胞嘧啶(C)并且用磷酰二胺活化后的吗啉代衍生物和第七步反应产物，摩尔投料比为9/1，溶于浓度为50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中放入固相合成管里；过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到产物；向装有该产物的固相合成管里加入浓度为100毫克/毫升的四丁基氟化铵四氢呋喃溶液；然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后，在氨水条件下将该产物从王树脂这一固相载体上切下来，得到磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(C-A-T)。
当n=3,第一步反应中碱基基团B为腺嘌呤(A)，第六步反应中碱基基团B为胸腺嘧啶(T)；含有碱基基团B为鸟嘌呤(G)并且用磷酰二胺活化后的吗啉代衍生物和第七步反应产物，该产物仍在固相载体上未被切下，摩尔投料比为2/1，溶于浓度为50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中放入固相合成管里；过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到产物；向装有该产物的固相合成管里加入浓度为100毫克/毫升的四丁基氟化铵四氢呋喃溶液；然后固相 合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后，在氨水条件下将该产物从王树脂这一固相载体上切下来，磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(G-C-A-T)。
详细说明具体合成路线如下：
(1)一般合成路线：
一般合成步骤：
第一步反应：
吗啉代衍生物1和叔丁基二甲基氯硅烷的投料比（摩尔比）为1/1.3，溶于二氯甲烷中，二氯甲烷用量足够将吗啉代衍生物和叔丁基二甲基氯硅烷溶解即可。在室温搅拌下加入咪唑，咪唑的加入量和吗啉代衍生物的摩尔比为3/1。反应5个小时后反应物用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，去除溶剂后得到粗品产物2为无色的油。
第二步反应：
化合物2溶于含有乙酸的三氟乙酸中，乙酸和三氟乙酸的体积比为1/50，搅拌4个小时，之后去除溶剂得到白色固体3。
第三步反应：
化合物3溶于水和二氧六环（体积比：1/1）中，在室温加入碳酸钠。反应物搅拌过夜后用水和二氯甲烷洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，去除溶剂，粗品经过柱层析法纯化后得到化合物4为白色固体。
第四步反应：
王树脂放入一个固相合成管里，然后加入化合物4，王树脂和化合物4的摩尔投料比为1/1，二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）与第三步反应产物的摩尔投料比分别为1.3/1和0.35/1。固相合成管放置在摇床上反应12个小时，然后固相树脂用大量二氯甲烷洗涤，得到5。
第五步反应：
向装有5的固相合成管里加入四丁基氟化铵四氢呋喃溶液（溶液浓度：100毫克/毫升）。然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到6。
第六步反应：
含有碱基基团B并且用磷酰二胺活化后的吗啉代衍生物1-B和化合物6（摩尔投料比2-9/1）溶于三乙胺二氯甲烷溶液（浓度：50毫克/毫升）中放入固相合成管里。过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到7。
第七步反应：
向装有7的固相合成管里加入四丁基氟化铵四氢呋喃溶液（溶液浓度：100毫克/毫升）。然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到8。
第八步反应：
根据不同碱基B的吗啉代单体个数，重复第六步、第七步反应，将8与多个不同碱基B的吗啉代单体进行连接，得到9。
第九步反应：
在氨水条件下将9从王树脂这一固相载体上切下来，得到PMO(polymer)，末端吗啉环上的氨基可以用保护基再加以保护。
本发明的核心是采用了一种便宜易得的树脂：王树脂作为固相载体，来合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸。
与背景专利（US5185444）固相合成技术相比，合成总收率相差不大，但本发明中采用了一种极其便宜易得的树脂：王树脂作为固相载体，这种树脂的价格只有3000元/公斤，远远低于背景专利中所使用的LCAA-CPG树脂（15000元/10克），从而大大降低了合成成本，适合磷酰二胺吗啉代寡核苷酸产品的大量生产。
具体实施方式
实施例1：化合物PMO(A-T)的合成：
以碱基A和T为例，PMO(A-T)的合成路线为：
T-5和叔丁基二甲基氯硅烷的投料比（摩尔比）为1/1.3，溶于二氯甲烷中。在室温搅拌下加入咪唑，咪唑的加入量和吗啉代衍生物的摩尔比为3/1。反应5个小时后反应物用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，去除溶剂后得到粗品产物T-6为无色的油。
第二步反应：
T-6溶于含有乙酸的三氟乙酸中，乙酸和三氟乙酸的体积比为1/50，搅拌4个小时，之后去除溶剂得到T-7。
第三步反应：
T-7溶于水和二氧六环（体积比：1/1）中，在室温加入碳酸钠。反应物搅拌过夜后用水和二氯甲烷洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，去除溶剂，粗品经过柱层析法纯化后得到T-8。
第四步反应：
王树脂放入一个固相合成管里，然后加入化合物T-8（王树脂和化合物4的摩尔投料比为1/1），二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）与第三步反应产物的摩尔投料比分别为1.3/1和0.35/1。固相合成管放置在摇床上反应12个小时，然后固相树脂用大量二氯甲烷洗涤，得到R-1。
第五步反应：
向装有R-1的固相合成管里加入四丁基氟化铵四氢呋喃溶液（溶液浓度：100毫克/毫升）。 然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到R-2。
第六步反应：
化合物A-8和R-2（摩尔投料比：7/1）溶于三乙胺二氯甲烷溶液（浓度：50毫克/毫升）中放入固相合成管里。过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到R-3。
第七步反应：
步骤同第五步反应，得到R-4。
第八步反应：
在氨水条件下将R-4从王树脂这一固相载体上切下来，得到PMO(A-T)。末端吗啉环上的氨基可以用保护基再加以保护。
实施例2：化合物PMO(C-A-T)的合成：
合成路线：
第一步反应：
化合物C-8和R-4（摩尔投料比：9/1）溶于三乙胺二氯甲烷溶液（浓度：50毫克/毫升）中放入固相合成管里。过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到R-5。
第二步反应：
向装有R-5的固相合成管里加入四丁基氟化铵四氢呋喃溶液（溶液浓度：100毫克/毫升）。然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到R-6。
第十步反应：
在氨水条件下将R-4从王树脂这一固相载体上切下来，得到PMO(C-A-T)。末端吗啉环上的氨基可以用保护基再加以保护。
实施例3：化合物PMO(G-C-A-T)的合成：
第一步反应：
化合物G-8和R-6（摩尔投料比：2/1）溶于三乙胺二氯甲烷溶液（浓度：50毫克/毫升）中放入固相合成管里。过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到R-7。
第二步反应：
向装有R-7的固相合成管里加入四丁基氟化铵四氢呋喃溶液（溶液浓度：100毫克/毫升）。然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到R-8。
第三步反应：
在氨水条件下将R-8从王树脂这一固相载体上切下来，得到PMO(G-C-A-T)。末端吗啉环上的氨基可以用保护基再加以保护。
Claims (10)
1.一种固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是采用了王树脂作为固相载体，末端羟基用叔丁基二甲基硅保护的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)结构：
所述PMO-王树脂的结构：
其中碱基B的结构为：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)四种碱基的任意一种。
2.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是所述PMO-王树脂结构中，上下两端的碱基B为相同的或是不同的一种碱基；复单元中的碱基B是这四种碱基的其中一种或者任意的排列组合。
3.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是所述的PMO-王树脂的结构为：
n=1，碱基B分别为腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的PMO(A-T)-王树脂的结构：
4.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是所述的PMO-王树脂的结构为：
n=2,碱基B分别为腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的PMO(A-T)-王树脂的结构：
5.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，其特征是所述的PMO-王树脂的结构为：
n=3,PMO(G-C-A-T)-王树脂的结构：
6.如权利要求1所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法，其特征是具体反应步骤如下：
1）含有一种碱基基团B的吗啉代衍生物和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔投料比为1/1.3，溶于二氯甲烷中，二氯甲烷用量足够将吗啉代衍生物和叔丁基二甲基氯硅烷溶解即可；在室温搅拌下加入咪唑，咪唑的加入量和吗啉代衍生物的摩尔比为3/1；反应5个小时后反应物用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，去除溶剂后得到粗品产物为无色的油；
2）第一步反应产物无色的油溶于含有乙酸的三氟乙酸中，乙酸和三氟乙酸的体积比为1/50，搅拌4个小时，之后去除溶剂得到白色固体；
3）第二步反应产物白色固体溶于体积比为1∶1的水和二氧六环中，在室温加入碳酸钠；反应物搅拌过夜后用水和二氯甲烷洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，去除溶剂，粗品经过柱层析法纯化后得到白色固体；
4）王树脂放入一个固相合成管里，然后加入第三步反应产物白色固体，王树脂和第三步反应产物白色固体的摩尔投料比为1/1，二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶与第三步反应产物的摩尔投料比分别为1.3/1和0.35/1；固相合成管放置在摇床上反应12个小时，然后固相树脂用大量二氯甲烷洗涤，得到产物；
5）向装有第四步反应产物的固相合成管里加入四丁基氟化铵四氢呋喃溶液，溶液浓度为100毫克/毫升；然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到产物；
6）含有一种碱基基团B并且用磷酰二胺活化后的吗啉代衍生物和第五步反应产物反应，摩尔投料比范围为2-9/1，溶于浓度为50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中，放入固相合成管里；过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到产物；
7）向装有第六步反应产物的固相合成管里加入浓度为100毫克/毫升的四丁基氟化铵四氢呋喃溶液；然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后得到产物。
7.如权利要求6所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法，其特征是根据不同碱基B的吗啉代单体个数（n+1），重复n次第六步、第七步反应，将（n+1）个不同碱基B（1,2,3,4）的吗啉代单体通过磷酰二胺进行连接，最后在氨水条件下将产物从王树脂这一固相载体上切下来，得到磷酰二胺吗啉代寡核苷酸。
8.如权利要求6或7所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法，其特征是n=1，第一步反应中碱基基团B为腺嘌呤(A)，第六步反应中碱基基团B为胸腺嘧啶(T)，在氨水条件下将第七步反应产物从王树脂这一固相载体上切下来，得到磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(A-T)。
9.如权利要求6或7所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法，其特征是n=2，第一步反应中碱基基团B为腺嘌呤(A)，第六步反应中碱基基团B为胸腺嘧啶(T)，含有碱基基团B为胞嘧啶(C)并且用磷酰二胺活化后的吗啉代衍生物和第七步反应产物，摩尔投料比为9/1，溶于浓度为50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中放入固相合成管里；过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到产物；向装有该产物的固相合成管里加入浓度为100毫克/毫升的四丁基氟化铵四氢呋喃溶液；然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后，在氨水条件下将该产物从王树脂这一固相载体上切下来，得到磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(C-A-T)。
10.如权利要求6或7所述的固相合成磷酰二胺吗啉代寡核苷酸的方法，其特征是n=3,第一步反应中碱基基团B为腺嘌呤(A)，第六步反应中碱基基团B为胸腺嘧啶(T)；含有碱基基团B为鸟嘌呤(G)并且用磷酰二胺活化后的吗啉代衍生物和第七步反应产物，该产物仍在固相载体上未被切下，摩尔投料比为2/1，溶于浓度为50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中放入固相合成管里；过夜反应后用大量二氯甲烷洗涤得到产物；向装有该产物的固相合成管里加入浓度为100毫克/毫升的四丁基氟化铵四氢呋喃溶液；然后固相合成管放置在摇床上反应4个小时，固相树脂用四氢呋喃和二氯甲烷洗涤后，在氨水条件下将该产物从王树脂这一固相载体上切下来，磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(G-C-A-T)。
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