ES2902835T3

ES2902835T3 - Composiciones celulares mejoradas y métodos para la terapia contra el cáncer

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Publication number: ES2902835T3
Application number: ES15734922T
Authority: ES
Inventors: Abraham Rutenberg; Ronny Uzana; Michal Lotem; Arthur Machlenkin; Galit Eisenberg; Tamar Peretz-Yablonsky; Shoshana Frankenburg; Roni Engelstein
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 2014-01-09
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2022-03-30
Anticipated expiration: 2035-01-08
Also published as: CA2935903A1; US20160333072A1; AU2015205327B2; JP6682438B2; JP2020105219A; EP3091999A1; EP4101461A1; US20230078665A1; US20190330303A1; EP3091999B1; WO2015104711A1; JP7004761B2; IL246607A0; EP3091999A4; US10344073B2; IL246607B; JP2017503810A; AU2015205327A1; US11530251B2

Abstract

Un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite, en donde dicho sujeto padece un tumor caracterizado por la falta de una expresión superficial sustancial de NTB-A, y en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones celulares mejoradas y métodos para la terapia contra el cáncer

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención está dirigida al campo de la inmunoterapia. Específicamente, la invención proporciona composiciones y métodos que proporcionan una modulación mejorada de células T ex vivo e in vivo, útiles en el tratamiento del cáncer y otras patologías.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] El antígeno NK-TB (NTB-A), también conocido como miembro de la familia de moléculas de activación de linfocitos de señalización 6 (SLAMF6), CD352, Ly-108, SF2000 y KALI, es una proteína transmembrana de tipo I que pertenece a la Familia SLAM de receptores de células inmunes. Las proteínas de la familia SLAM son miembros del subgrupo CD2 de la superfamilia Ig. NTB-A se expresa en células asesinas naturales (NK), T y B y exhibe interacciones homotípicas, mediadas por el reclutamiento de proteína asociada a SLAM (SAP) y proteínas adaptadoras adicionales al complejo receptor.

[0003] La NTB-A contiene dos dominios extracelulares similares a inmunoglobulina (Ig) y tres motivos de señalización citoplasmáticos basados en tirosina, uno de los cuales está incluido en un motivo inhibidor de inmunorreceptor clásico basado en tirosina. La participación de NTB-A en células T humanas puede sustituir la vía coestimuladora de CD28 e induce la polarización hacia un fenotipo Th1. Sin embargo, las células T CD4 positivas de ratones knockout para NTB-A (Ly-108) muestran un deterioro en la producción de IL-4, lo que sugiere un papel de NTB-A en la polarización de Th2. La razón de esta discrepancia no está completamente aclarada. La activación de NTB-A en células NK humanas estimula la citotoxicidad y la proliferación, así como la producción de IFN-y y TNF-a.

[0004] Valdez et al, 2004 enseñan que NTB-A activa las células T mediante interacciones homotípicas, y mejora específicamente las propiedades Th1. Se descubrió que una proteína de fusión NTB-A-Fc, producida al fusionar los primeros 226 aminoácidos de NTB-A a la porción Fc de IgG1 murina, inhibe el cambio de isotipo de células B, comúnmente inducido por citocinas de tipo Th1, e inhibe una enfermedad autoinmune dependiente de Th1 (modelo EAE). Por tanto, se encontró que la proteína de fusión NTB-A informada actúa como un antagonista de NTB-A en los sistemas experimentales informados por Valdez et al.

[0005] US 2009/017014 a Valdez et al se dirige al polipéptido PRO20080 (que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de NTB-A), la porción extracelular del mismo, homólogos, agonistas y antagonistas de los mismos, que se sugieren como moduladores putativos de enfermedades inmunes. La publicación '014 sugiere el uso de ciertos compuestos inmunoestimulantes descritos en la misma en terapia inmunoadyuvante para el tratamiento del cáncer.

[0006] Uzana et al., 2012 describen que el bloqueo de NTB-A en células presentadoras de antígeno (APC) por anticuerpos específicos inhibió la secreción de citocinas de los linfocitos CD8+. Si bien la publicación sugiere esta molécula como un objetivo potencial para mejorar la inmunoterapia contra el cáncer, se dice que la exploración experimental de la relevancia de este enfoque está justificada, ya que enfoques similares, dirigidos a otros receptores coestimuladores como CD28 con anticuerpos agonistas, terminaron en un desenlace fatal en ensayos clínicos.

[0007] Al expresarse NTB-A en ciertos tumores hematopoyéticos, se ha propuesto la vacunación utilizando epítopos de péptidos derivados de esta molécula, para inducir una respuesta inmunitaria anti-tumor contra tumores que expresan de forma aberrante este antígeno. Por ejemplo, PCT Pub. N° WO 2006/037421 describe 338 secuencias de péptidos derivadas de moléculas HLA de clase II de líneas de células tumorales humanas, que pueden usarse en composiciones de vacunas para provocar respuestas inmunitarias antitumorales. Entre estas secuencias se encuentra un péptido de 16 aminoácidos correspondiente a las posiciones 103-118 de SLAMF6. Además, se ha sugerido que estos epítopos se dirijan a anticuerpos o conjugados de inmunotoxina de los mismos. Por ejemplo, el documento US2011171204 describe anticuerpos anti-NTB-A y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y métodos para usar los mismos para unirse a NTB-A y tratar enfermedades, tales como neoplasias hematológicas, que se caracterizan por la expresión de NTBA. Se describen anticuerpos adicionales contra NTB-A, por ejemplo, por Krover et al., 2007. Estos anticuerpos ejercieron efectos citotóxicos sobre los linfocitos que expresan NTB-A y no tuvieron ningún efecto sobre la proliferación de células T o la secreción de citocinas.

[0008] El documento EP2083088 describe un método para tratar el cáncer en un paciente que comprende modular el nivel de un producto de expresión de un gen seleccionado del grupo que consiste, entre otros, en SLAMF6, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de estómago o cáncer de piel. La publicación describe que el método es útil para tratar a un paciente caracterizado por la sobreexpresión de dicho gen.

[0009] El documento WO 03/008449 se refiere a polipéptidos NTB-A, moléculas de ácido nucleico que los codifican y usos de los mismos. La publicación también se refiere a métodos para regular la actividad de las células NK regulando la actividad de NTB-A in vitro, ex vivo o in vivo, y a métodos de cribado de compuestos activos usando NTB-A o fragmentos de los mismos, o ácido nucleico que codifica los mismos o células huésped recombinantes que expresan dicho polipéptido. Se describe además el uso de un compuesto que regula la actividad de un polipéptido NTB-A en la preparación de un medicamento para regular una función inmune en un sujeto.

[0010] La enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X (XLP) es una inmunodeficiencia congénita poco común que conduce a un aumento extremo, generalmente fatal, del número de linfocitos tras la infección con el virus de Epstein-Barr (EBV). El XLP suele ser el resultado de la deficiencia de la proteína asociada a SLAM (SAP), también denominada XLP1, causada por mutaciones en el gen SH2D1A en el cromosoma Xq24-25. En consecuencia, se ha implicado a NTB-A en esta patología, ya que contribuye a la incapacidad de las células NK para destruir las células B infectadas con EBV.

[0011] Snow et al. (2009, 2010) examinaron el papel de NTB-A y su efector SAP aguas abajo, en la regulación de la muerte celular inducida por reestimulación (RICD) de células T obtenidas de donantes sanos y pacientes con XLP. Las publicaciones informan que en las células T de donantes normales, NTB-A está implicado positivamente y es necesario para la apoptosis inducida por TCR. Por el contrario, en los pacientes con XLP este fenómeno se invierte, ya que se descubrió que NTB-A contribuye a la resistencia a RICD en las células T XLP.

[0012] Wu et al. (2012) se relaciona con la terapia adoptiva de células T utilizando linfocitos infiltrantes de tumores autólogos para el melanoma metastásico. Los autores revelan que los protocolos de expansión de TIL actuales para el melanoma implican el uso de IL-2, y que en enfoques anteriores (que implicaban la estimulación antigénica múltiple de PBMC autólogas, antes de que se empleara el uso de IL-2), solo se habían obtenido resultados modestos con tasas de respuesta típicamente bajas (<10%), muchas de las cuales son respuestas mixtas, y solo las observaciones anecdóticas de remisiones duraderas en algunos pacientes seleccionados. Se han observado otros inconvenientes en enfoques adicionales. Los autores enseñan que la terapia TIL es un régimen muy poderoso para tratar pacientes con melanoma metastásico, sin embargo, también se informa que el protocolo de expansión y específicamente la exposición continua a citocinas como IL-2, conduce a la regulación a la baja de moléculas coestimuladoras como CD28, reduciendo así la capacidad de respuesta de las células T resultantes y la eficacia antitumoral del tratamiento. Se sugieren diferentes enfoques para resolver este problema, como limitar la población de TIL para expandirla o examinar la eficacia de otras citocinas, en un intento por encontrar el equilibrio adecuado de coestimulación y citocinas.

[0013] La interleucina-2 es un factor de crecimiento crítico para los linfocitos en cultivo. En su ausencia, las células T activadas no pueden mantenerse y están sujetas a muerte celular inducida por activación. Por tanto, la IL-2 se utiliza ampliamente en cultivo celular, tanto para fines experimentales como para aplicaciones clínicas, en la preparación de diversas composiciones celulares, vacunas e inmunoterapias para el cáncer, enfermedades autoinmunes y otras patologías inmunomediadas.

[0014] La IL-2 también se usa como agente terapéutico in vivo. Por ejemplo, la IL-2 está autorizada por la Administración de Drogas y Alimentos (FDA, por sus siglas en inglés) para el tratamiento del cáncer de riñón, y se ha informado en muchos ensayos clínicos de sus efectos terapéuticos significativos en los pacientes. En los ensayos clínicos con pacientes con melanoma, la IL-2 aumentó las tasas de supervivencia de muchas personas, que fueron más altas que las tasas de supervivencia promedio que generalmente se obtienen con los medicamentos de quimioterapia.

[0015] Sin embargo, se ha demostrado repetidamente que el uso de IL-2 mejora la apariencia de las células T reguladoras, que eventualmente puede ejercer un efecto inhibidor. Esta cuestión es de particular relevancia cuando se utilizan células T en el contexto clínico, tanto in vivo para el tratamiento sistémico de pacientes, como ex vivo, para la producción de linfocitos para la terapia celular adoptiva. Aún no se ha encontrado una sustitución satisfactoria para IL-2.

[0016] Además, una dificultad importante en el uso de IL-2 exógena y otras citoquinas exógenas in vivo es su alta toxicidad. Los efectos secundarios son de considerable magnitud, en particular síntomas y disfunciones cardíacas, shock séptico y fiebre. Esto requiere cuidados intensivos para la remediación o el control de los efectos adversos, y también puede conducir a la interrupción del tratamiento.

[0017] Sigue existiendo una necesidad médica no satisfecha de mejores modalidades terapéuticas para el tratamiento del cáncer. Además, se requieren medios adicionales para mejorar la propagación y activación de células T en cultivo y para proporcionar composiciones de vacuna celular mejoradas. Por tanto, se desearían terapias más seguras y eficaces que eludieran los inconvenientes del tratamiento utilizado actualmente.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0018] La presente invención está dirigida al campo de la inmunoterapia.

[0019] La invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que un polipéptido añadido exógenamente correspondiente al dominio extracelular de humano NTB-A (ectodominio de NTB-A) es capaz de proteger a las células T de la muerte celular apoptótica. Inesperadamente, el ectodominio de NTB-A rescató las células T CD8+ de la muerte celular y restauró su vitalidad tras la radiación ionizante y la privación de IL-2. La invención se basa además, en parte, en el descubrimiento inesperado de que cuando se cultivaron conjuntamente con células de melanoma afines, los clones de células T activados por el ectodominio de NTB-A mostraron una citotoxicidad mejorada y una expresión elevada de la producción y superficie de interferón-gamma (IFN-y) de CD137 (4-1BB). Como consecuencia, CD137, un receptor coestimulador fuerte, y NTB-A actuaron en sinergia para la activación triple de células T por células de melanoma. Además, está sorprendentemente demostrado que cuando se suplementa con cultivos de células T, el ectodominio de NTB-A dio preferencia al crecimiento y expansión de linfocitos antitumorales con actividad y capacidad de supervivencia superiores a los logrados con IL-2, el clásico factor de crecimiento de células T. La invención demuestra además una inhibición in vivo inesperadamente eficaz del desarrollo de tumores, en un modelo de ratón de injerto de melanoma humano.

[0020] Así, según un primer aspecto de la invención, se proporciona un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, en donde dicho sujeto está aquejado de un tumor caracterizado por la falta de expresión en la superficie NTB-A sustancial, y en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

[0021] Según otro aspecto, se proporciona un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite, en donde dicho sujeto padece un tumor caracterizado por la falta de expresión sustancial de la superficie de NTB-A y es citopénico o en riesgo de desarrollar citopenia, y, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

[0022] De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona un ectodominio de NTB-A aislado o agonista del mismo para su uso en reducir o inhibir la muerte de células T in vivo después de la inmunoterapia transferencia adoptiva diseñada para aliviar o mejorar el desarrollo de los síntomas del cáncer o una enfermedad infecciosa, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTBA.

[0023] De acuerdo con todavía un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método in vitro para reducir o inhibir la muerte de células T, que comprende poner en contacto células T con una cantidad eficaz del ectodominio de NTB-A aislado o agonista de la misma in vitro, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

[0024] También se proporciona un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para uso en el tratamiento o la prevención de la citopenia en un sujeto en necesidad del mismo, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

[0025] La presente invención proporciona además un método para preparar una composición celular adaptada para la inmunoterapia de la transferencia adoptiva, que comprende: incubación ex vivo de una población celular que contiene células T que contiene que comprende células T CD8+ con una cantidad eficaz de un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo; y que comprende además proporcionar a la población de células una estimulación del receptor de células T (TCR), en donde dicha población de células que contiene células T se incuba con el ectodominio de NTB-A aislado o agonista del mismo en presencia de la estimulación de TCR y las células alimentadoras y sin la adición de IL-2 exógena, y en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

[0026] La capacidad de ampliar células T específicas de antígeno (por ejemplo de tumores) sin dañar su capacidad funcional es crítica para el éxito de la inmunoterapia de la transferencia adoptiva de los pacientes con infección oportunista o cáncer. Las células T específicas de antígeno adecuadas para la transferencia solo se pueden recuperar de sitios de sangre o tejidos en cantidades relativamente pequeñas. En consecuencia, por lo general se expanden de manera específica o inespecífica antes de la transferencia. Sin embargo, dichas manipulaciones ex vivo pueden dañar potencialmente el alojamiento, la proliferación y la supervivencia de las células T después de la infusión.

[0027] Mientras que las células CD4+ responden muy bien a la estimulación anti-CD3/CD28, las células CD8+ proliferan menos extensamente con una mayor tasa de apoptosis. Un enfoque alternativo comúnmente utilizado para estimular la proliferación es la incubación de células T con anticuerpo anti-CD3 soluble en presencia de células accesorias portadoras de receptor Fc (células alimentadoras), un enfoque denominado "Protocolo de expansión rápida" (REP). El anticuerpo "presentado" a las células T de esta manera genera una señal proliferativa más eficaz que el anti-CD3 soluble solo o el anti-CD3 inmovilizado sobre una superficie de plástico. En el tratamiento del cáncer, la terapia con células adoptivas generalmente implica recolectar células T que se encuentran dentro del tumor del paciente (denominados linfocitos infiltrantes del tumor, TIL), que se estimulan a multiplicarse ex vivo utilizando altas concentraciones de IL-2. células alimentadoras anti-CD3 y alo-reactivas. Luego, estas células T se transfieren de nuevo al paciente junto con la administración exógena de IL-2 para impulsar aún más su actividad anticancerígena. Sin embargo, la generación de un producto de terapia celular adoptiva de TIL autólogo para reinfusión al paciente es técnicamente desafiante y produce una variabilidad no deseada, debido al uso de IL-2 y células alimentadoras. La presente invención proporciona en otras formas de realización métodos mejorados para producir tales composiciones de TIL para terapia celular adoptiva.

[0028] En otra forma de realización, la población comprende células T CD8+ (citotóxicas) (CTL). En otra forma de realización, las células T son células T CD8+. Las células se pueden diseñar o modificar genéticamente (p. ej., para ejercer una especificidad antigénica deseada o cualquier otro rasgo deseado en la erradicación de células malignas). La incubación con el polipéptido o agonista del ectodominio de NTB-A se puede realizar en una cantidad y en condiciones suficientes para inducir o regular al alza los marcadores de activación y/o citocinas asociadas con la activación de células T (p. ej., marcadores de activación de Tc1 tales como IFN-y). De manera ventajosa, la incubación con el polipéptido o agonista del ectodominio de NTB-A se realiza para regular al alza la expresión de CD137 en las células T. La incubación se puede realizar en presencia de estimulación del receptor de células T (TCR). La estimulación de TCR puede ser inespecífica de antígeno (realizada, por ejemplo, usando anticuerpos específicos para CD3 que activan el receptor al unirse, por ejemplo, OKT3) o específica de antígeno (usando células presentadoras de antígeno adecuadas y antígeno). La incubación se puede realizar en presencia de células alimentadoras (p. ej., células mononucleares de sangre periférica de donante normal alogénicas, PBMC). Las composiciones de TIL para terapia celular adoptiva se pueden preparar con PBMC irradiadas (incapaces de proliferar). La incubación se puede realizar sin la adición de IL-2 exógena, o con la adición de IL-2 exógena en un rango de 300-6000 UI/ml. La incubación se realiza en presencia de ligando CD137 exógeno o un agonista del mismo. La incubación también se puede realizar en presencia de estimulación de TCR y células alimentadoras, y sin la adición de IL-2 exógena.

[0029] La composición de células puede ser adecuada para la transferencia adoptiva en un sujeto receptor en necesidad de la misma. Por tanto, la composición puede comprender una población que contiene células T en una cantidad eficaz para la inmunoterapia de transferencia adoptiva, por ejemplo, de 106 a 1012 células.

[0030] El sujeto a tratar por los métodos descritos en este documento puede ser afectado con un tumor caracterizado por la falta de expresión superficial sustancial de NTB-A. Según una forma de realización, el tumor es un tumor sólido. En otra forma de realización, el sujeto padece un tumor caracterizado por la expresión superficial de CD137. En otra forma de realización, dicho sujeto padece un tumor caracterizado por la falta de una expresión superficial sustancial de NTB-A o un tumor caracterizado por la expresión superficial de CD137. El tumor se puede seleccionar del grupo que consiste en: un tumor caracterizado por la falta de una expresión superficial sustancial de NTB-A, un tumor sólido y un tumor caracterizado por la expresión superficial de CD137. El cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en melanoma, cáncer del tracto urinario, cáncer ginecológico, carcinoma de cabeza y cuello, tumor cerebral primario, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon y otros cánceres del tracto intestinal, neoplasias óseas, tumores conectivos y de tejidos blandos y cánceres de piel. En una forma de realización particular, el cáncer es melanoma.

[0031] El sujeto puede ser un sujeto citopénico, o un sujeto en riesgo de desarrollar la citopenia (debido a por ejemplo la irradiación o quimioterapia). El sujeto puede padecer o estar en riesgo de desarrollar linfocitopenia, o no puede padecer una enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X (XLP).

[0032] Los polipéptidos descritos aquí se han demostrado ser inesperadamente superiores a la IL-2, en la producción de la activación de células T más segura y más eficaz. Por tanto, el uso de IL-2 puede reducirse sustancialmente e incluso sustituirse completamente por los polipéptidos de la invención. Por consiguiente, los métodos descritos en este documento pueden verse afectados sin la adición de IL-2 exógena (in vivo y/o ex vivo). Por tanto, la IL-2 puede no administrarse exógenamente a dicho sujeto. El uso de IL-2 puede reducirse en al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% y preferiblemente al menos un 90%.

[0033] La administración o adición de los polipéptidos o agonistas de NTB-A puede realizarse ventajosamente en combinación (concurrente o secuencial) con la administración de un polipéptido ligando CD137 o un agonista del mismo (tal como un anticuerpo anti-CD137). Ejemplos no limitativos de tales anticuerpos anti-CD 137 que están disponibles comercialmente o bajo investigación clínica incluyen, por ejemplo, Bristol Myers Squibb (BMS; Princeton, NJ) Número de catálogo 663513, anticuerpo monoclonal IgG4 completamente humanizado que puede usarse, por ejemplo, a 10-20 ng/ml, y el número de catálogo de R&D Systems AF838 anti-4-1BB de cabra policlonal que puede usarse, por ejemplo, a 20-40 ng/ml.

[0034] La administración o adición de los polipéptidos o agonistas de NTB-A se puede realizar en combinación (concurrente o secuencial) con la administración de otros reactivos dirigidos al receptor de señalización que presentan un efecto modificador sobre la función de las células inmunes. Los ejemplos de tales reactivos incluyen, por ejemplo, antagonistas o inhibidores (tales como anticuerpos) de CTLA-4, PD-1 o PD-L1.

[0035] Los polipéptidos descritos en este documento se demostraron inesperadamente a rescatar las células T de la muerte celular inducida por el estrés y promueven la supervivencia después de la irradiación o privación de IL-2. Esto es particularmente sorprendente a la vista de las enseñanzas de Snow et al., que sugieren un papel proapoptótico para NTB-A en modelos in vitro de apoptosis inducida por reestimulación.

[0036] La citopenia se puede asociar con radiación o quimioterapia. Por ejemplo, la citopenia puede ser citopenia asociada con quimioterapia de dosis alta, citopenia asociada con terapia oncológica convencional, citopenia inducida por fármacos, citopenia inducida por toxinas y citopenia inducida por radiación. La citopenia puede estar asociada con una inmunodeficiencia adquirida o congénita que no está asociada con un deterioro en la vía NTB-A. Por tanto, los pacientes con XLP están explícitamente excluidos de estas formas de realización. Por ejemplo, la citopenia puede ser inducida por esteroides, inducida o exacerbada por una enfermedad infecciosa (hepatitis, enfermedad viral) o autoinmune (p. ej., por lupus eritematoso sistémico).

[0037] En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una combinación terapéutica de 1) un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A; 2) un polipéptido que comprende un ligando de CD137 o un agonista del mismo y opcionalmente 3) un portador farmacéuticamente aceptable.

[0038] En otra forma de realización, la combinación comprende ectodominio de NTB-A humano. En otra forma de realización, la combinación comprende ligando CD137 humano. En otra forma de realización, el agonista es un anticuerpo (p. ej., específico de NTB-A o específico de CD137).

[0039] También se describe un kit que contiene un polipéptido que comprende un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo, e instrucciones para usar el polipéptido.

[0040] Otros objetos, características y ventajas de la presente invención se describen en las reivindicaciones dependientes y/o se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción y dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0041]

Figura 1. seSLAMF6 (ectodominio soluble de SLAMF6) se une a SLAMF6 en linfocitos infiltrantes de tumores. seSLAMF6 inhibe completamente la unión de los anticuerpos anti-SLAMF6 a los linfocitos que infiltran el tumor (A) y no inhibe la unión de los anticuerpos anti-CD8 y anti-2B4 a estos receptores de superficie (B).

Figura 2. El acoplamiento de SLAMF6 por el ectodominio soluble (seSLAMF6) mejora la supervivencia de las células T anti-melanoma activadas humanas (A) y de ratón (B). La participación de SLAMF6 (C) por seSLAMF6 mejora la supervivencia post-REP en TIL humanos 7 días después del punto final del procedimiento REP. Figura 3. El acoplamiento de SLAMF6 por el ectodominio soluble (seSLAMF6) mejora la función de las células T anti-melanoma humanas y de ratón activadas. (A) El acoplamiento de SLAMF6 por seSLAMF6 mejora la producción de IFNy por el esplenocito de ratón; (B-C) La participación de SLAMF6 por seSLAMF6 durante la expansión rápida (B) y la activación de 3 días de TlL humano (C) mejora la citotoxicidad evaluada por la movilización de CD107a; (D) El acoplamiento de SLAMF6 por seSLAMF6 mejora la destrucción de células de melanoma por células T CD8 humanas.

Figura 4. La participación de SLAMF6 por seSLAMF6 regula al alza la expresión de los marcadores de activación GITR, PD-1, 4-1BB (CD137) y SLAMF4 (2B4) en TIL humanos que se sometieron al procedimiento de expansión rápida (REP) complementado con seSLAMF6.

Figura 5. La participación de SLAMF6 por seSLAMF6 expande los TIL con la misma eficiencia de IL-2.

Figura 6. La participación de SLAMF6 por seSLAMF6 durante REP produce un porcentaje más alto de células T CD8 específicas de melanoma.

Figura 7. Los TIL anti-melanoma expandidos con seSLAMF6 inhiben el crecimiento del melanoma in vivo con la misma eficacia que los TIL expandidos con el protocolo estándar de IL-2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0042] La presente invención está dirigida al campo de la inmunoterapia. Específicamente, la invención proporciona composiciones y métodos para mejorar la modulación de células T ex vivo e in vivo y para el tratamiento del cáncer y otras patologías. Más específicamente, se describen polipéptidos de NTB-A solubles o agonistas de los mismos para su uso en el tratamiento de pacientes con cáncer y para prevenir y tratar la citopenia en pacientes susceptibles. Aquí se proporcionan además terapias de combinación ventajosas que tienen efectos antitumorales mejorados. Los polipéptidos o agonistas de NTB-A se pueden usar en cultivos celulares ex vivo, proporcionando preparaciones de linfocitos mejoradas.

[0043] En la presente invención, se puede emplear una etapa que comprende incubar ex vivo una célula T que contiene la población de células con una cantidad terapéuticamente eficaz de un ectodominio de NTB-A aislado (p. ej., producido de forma recombinante) o un agonista del mismo, o una administración que comprende el paso de una cantidad terapéuticamente eficaz de un ectodominio de NTB-A aislado (p. ej., producido de forma recombinante) o un agonista del mismo.

[0044] De acuerdo con todavía otras formas de realización, la invención se refiere a un método para preparar una composición de células, que comprende incubar una célula T que contiene la población de células que comprende células T c D8+ ex vivo con una cantidad eficaz de un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo, y que comprende además proporcionar a la población de células una estimulación del receptor de células T (TCR), en donde dicha población de células que contiene células T se incuba con el ectodominio de NTB-A aislado o agonista del mismo en presencia de la estimulación de TCR y las células alimentadoras y sin la adición de IL-2 exógena, y donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

[0045] En todavía realizaciones adicionales, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una combinación terapéutica de 1) un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A; 2) un polipéptido que comprende el ligando CD137 o un agonista del mismo; y opcionalmente 3) un portador farmacéuticamente aceptable.

[0046] Ciertas formas de realización particulares de estos métodos y composiciones se detallan a continuación en este documento.

Ectodominio de NTB-A y agonistas del mismo

[0047] El término "NTB-A" (o "SLAMF6") se refiere a un polipéptido que tiene las siguientes propiedades estructurales y funcionales: 1) una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido NTB-A de mamífero (forma completa o madura) de la técnica reconocida (p. ej., de origen natural); 2) capacidad para unirse específicamente con una molécula de NTB-A endógena expresada en la superficie celular (unión homotípica); y 3) capacidad para ejercer una actividad agonista de NTB-A como se describe en el presente documento.

[0048] Generalmente, NTB-A se compone de los siguientes dominios en el orden de N' a C':

I. un péptido de señal N-terminal;

II. una porción extracelular (ectodominio), que comprende dos motivos conservados similares a inmunoglobulina (Ig): un dominio de tipo V similar a N' Ig (IgV, que tiene una estructura de hoja p de dos capas, con superficies frontales predominantemente neutras, aunque polares), y un dominio de tipo C2 similar a Ig C' (IgC2, caracterizado por una topología de cadena p general y varios enlaces disulfuro);

III. un dominio transmembrana helicoidal; y

IV. un dominio topológico (citoplasmático), que contiene motivos conmutadores inmunorreceptores basados en tirosina (ITSM), que son sitios de acoplamiento para el dominio SH2 de la proteína asociada a SLAM (SAP) y la transcripción relacionada con el sarcoma de Ewing. Los motivos ITSM llevan la secuencia de consenso TxYxxV/I/L que tiene una especificidad superpuesta para las parejas de unión activantes e inhibidoras.

[0049] Por ejemplo, en NTB-A humanos (p. ej., la adhesión no Q96DU3, isoforma 1.), El péptido señal se ha identificado que se encuentra en las posiciones 1-21, se ha identificado que el ectodominio se encuentra en las posiciones 22-226 (donde IgV era ubicado en las posiciones 35-120 e IgC2 en las posiciones 132-209), el dominio transmembrana estaba ubicado en las posiciones 227-247, y el dominio de citoplasma (intracelular) - en las posiciones 248-331.

[0050] Los términos "ectodominio de NTB-A" "sNTB-A" y "seSLAMF6", usados indistintamente en el presente documento, se refieren a la porción extracelular expuesta a la superficie de NTB-A, que comprende al menos los dominios IgV e IgC2. De forma típica y ventajosa, un ectodominio de NTB-A usado en el presente contexto excluye sustancialmente otros dominios de NTB-A como se describe en el presente documento, tales como el péptido señal, el dominio transmembrana y el dominio topológico. Tal polipéptido de ectodominio de NTBA ventajoso se denomina en el presente documento "ectodominio de NTB-A aislado". Un ectodominio de NTB-A aislado se produce típica y convenientemente de forma sintética, por ejemplo, mediante métodos recombinantes como se describe en el presente documento. En otras palabras, mientras que los polipéptidos del ectodominio de NTB-A aislados pueden contener secuencias de NTB-A residuales (p. ej., 1-10 y preferiblemente 5 o menos aminoácidos), carecen de estructuras de NTB-A adicionales que funcionen como lo harían en el polipéptido de NTB-A intacto.

[0051] En particular, se excluye ventajosamente el péptido señal. A diferencia de la divulgación anterior de Valdez y otros, que informa que un polipéptido que comprende el dominio extracelular de NTB-A que incluye el péptido señal anterior se caracteriza por una actividad antagonista de NTB-A (Valdez et al., 2004), la presente divulgación demuestra que un ectodominio de NTB-A aislado que carece del péptido señal o secuencias adicionales exhibe una potente actividad agonista de NTB-A, así como propiedades terapéuticamente ventajosas inesperadas como se describe en el presente documento.

[0052] Como se detalla en el presente documento, el acoplamiento homotípico de NTB-A inicia cascadas de transducción de señal, en donde se induce o se incrementa la asociación SAP y se reclutan Fyn y Lck. Estos eventos contribuyen a la producción de una sinapsis inmune estrecha y la activación específica de las células T, y orientan la formación de mTOC para una desgranulación lítica precisa. El compromiso de NTBA por el ectodominio de NTB-A se describe en este documento para rescatar a las células T antitumorales de la muerte celular inducida por activación (AICD) y de la radiación ionizante, mejorar la producción de interferón gamma (IFN-y), mejorar la expresión superficial CD137 (4-1BB), revertir la apoptosis de las células T y mejorar la destrucción de las células tumorales por las células T. En los Ejemplos siguientes se presentan ejemplos no limitativos de métodos para determinar estas actividades. Por tanto, una "actividad agonista de NTB-A" como se usa en este documento se refiere a la capacidad de ejercer una actividad biológica de una NTB-A nativa, como se describe en este documento.

[0053] La frase "ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo, como se usa en el presente documento por lo tanto se refiere a una molécula tal como se describe en la presente memoria que se une específicamente con una molécula NTB-A endógena expresada por superficie celular (unión homotípica) para inducir una vía de transducción de señales característica de acoplamiento homotípico de NTB-A como se describe en este documento, ejerciendo así una actividad agonista de NTB-A. El ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo puede retener al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o 100% de la actividad de NTB-A endógena. Dicho ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo puede ejercer una actividad agonista mejorada, por ejemplo, 110%, 120%, 130%, 140% o 150% de NTB-A nativa. Un agonista de ectodominio puede ejercer una actividad biológica mejorada de una NTB-A nativa, por ejemplo, hasta el 200% de la actividad ejercida por el ectodominio de NTB-A nativo. El agonista de ectodominio de n TB-A puede comprender además una etiqueta de epítopo (p. ej., etiqueta de polihistidina) y/o un resto que alarga la vida media en plasma. Por ejemplo, el polipéptido sNTB-A puede estar fusionado o conjugado con una inmunoglobulina o una porción de la misma. Otras sustancias que alargan la vida media incluyen polímeros o copolímeros biológicamente adecuados, por ejemplo, un compuesto de polialquilenglicol, tal como un polietilenglicol o un polipropilenglicol. Otros compuestos de polialquilenglicol apropiados incluyen, pero no se limitan a polímeros cargados o neutros de los siguientes tipos: dextrano, polilisina, ácidos colomínicos u otros polímeros basados en carbohidratos, polímeros de aminoácidos y derivados de biotina.

[0054] Otros ejemplos del resto de extensión de la vida media incluyen un copolímero de etilenglicol, un copolímero de propilenglicol, una carboximetilcelulosa, una polivinilpirrolidona, un poli-1,3-dioxolano, un poli-1,3,6-trioxano, un copolímero de etileno/anhídrido maleico, un poliaminoácido (p. ej., polilisina), una dextrano n-vinilpirrolidona, una polinvinilpirrolidona, un homopolímero de propilenglicol, un polímero de óxido de propileno, un polímero de óxido de etileno, un poliol polioxietilado, un alcohol polivinílico, una cadena glicosilada lineal o ramificada, un poliacetal, un ácido graso de cadena larga, un grupo alifático hidrófobo de cadena larga, una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina, un dominio Fc de inmunoglobulina o una porción del mismo (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 6.660.843), un dominio CH2 de Fc, una albúmina (p. ej., albúmina de suero humano (HSA)); véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 6.926.898 y US 2005/0054051; Patente de EE. UU. N° 6.887.470), una transtiretina (TTR; ver, por ejemplo, US 2003/0195154 A1; 2003/0191056 A1), o una globulina de unión a tiroxina (TBG).

[0055] Se debe entender, que el polipéptido o conjugado resultante se selecciona de tal manera que la actividad agonista de NTB-A se mantiene sustancialmente, como se describe en el presente documento.

[0056] El agonista de ectodominio de NTB-A puede ser un anticuerpo. Los términos "anticuerpo" o "anticuerpos" como se usan en este documento se refieren a un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o fragmentos del mismo, que incluyen, pero no se limitan a un anticuerpo de longitud completa que tiene una región constante de inmunoglobulina humana, una IgG monoclonal, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo monoclonal humanizado, un fragmento F(ab')2, un fragmento F(ab), un fragmento Fv, un anticuerpo marcado, un anticuerpo inmovilizado y un anticuerpo conjugado con un compuesto heterólogo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal, o un anticuerpo humanizado.

[0057] Los métodos para generar anticuerpos monoclonales y policlonales son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos pueden generarse mediante cualquiera de varios métodos conocidos, que pueden emplear la inducción de la producción in vivo de moléculas de anticuerpos, el cribado de bibliotecas de inmunoglobulinas o la generación de moléculas de anticuerpos monoclonales mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estos incluyen, pero no se limitan a la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma del virus EpsteinBarr (EBV). Además del método convencional de producir anticuerpos in vivo, los anticuerpos pueden ser generados in vitro utilizando la tecnología de presentación en fagos, por métodos bien conocidos en la técnica (p. ej., Current Protocols in Immunology, Colligan y col. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), Capítulo 17, Sección 17.1).

[0058] Un complejo de antígeno (por ejemplo, ectodominio de NTB-A) o inmunogénico (p. ej., un epítopo de ectodominio de NTB-A conjugado con una proteína portadora tal como albúmina de suero bovino (BSA)) puede ser inyectado en sujetos mamíferos adecuados tales como ratones, conejos, y otros. Los protocolos adecuados implican la inyección repetida del inmunógeno en presencia de adyuvantes de acuerdo con un programa diseñado para estimular la producción de anticuerpos en el suero. Los títulos del suero inmune se pueden medir fácilmente usando procedimientos de inmunoensayo que son bien conocidos en la técnica. Los antisueros obtenidos pueden usarse directamente (p. ej., como sueros diluidos o como anticuerpos policlonales purificados), o pueden obtenerse anticuerpos monoclonales, como se describe en el presente documento.

[0059] Un anticuerpo monoclonal (mAb) es una población sustancialmente homogénea de anticuerpos para un antígeno específico. Los mAb se pueden obtener mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. 4.376.110; Ausubel y col. ("Current Protocols in Molecular Biology", volúmenes I-III, John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland, 1994).

[0060] Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse usando métodos bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Harlow, E. y Lane, D. (1988). Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo o mediante expresión en E. coli o células de mamífero (p. ej., cultivo de células de ovario de hámster chino (CHO) u otros sistemas de expresión de proteínas) del ADN que codifica el fragmento.

[0061] Un Fv se compone de variable de cadena pesada emparejada y los dominios variables de cadena ligera. Esta asociación puede ser no covalente. Alternativamente, como se describió anteriormente, los dominios variables pueden unirse para generar un Fv de cadena sencilla mediante un enlace disulfuro intermolecular, o alternativamente, dichas cadenas pueden reticularse mediante productos químicos tales como glutaraldehído.

[0062] Preferiblemente, el Fv es un Fv de cadena sencilla. Los Fv monocatenarios se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios variables de cadena pesada y variable de cadena ligera conectados por un oligonucleótido que codifica un enlazador peptídico. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que posteriormente se introduce en una célula huésped como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una única cadena polipeptídica con un péptido enlazador que une los dos dominios variables. En la bibliografía de la técnica se proporciona una amplia guía para producir Fv monocatenarios.

[0063] El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes correspondientes esencialmente a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos usados en el contexto de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR, y en particular, CDR3. Los anticuerpos humanos también se pueden producir usando diversas técnicas adicionales conocidas en la técnica, que incluyen bibliotecas de presentación de fagos u otros métodos bien conocidos (p. ej., patente de EE. UU. N° 5.545.807).

[0064] Los anticuerpos quiméricos son moléculas, las diferentes porciones de las cuales se derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos que tienen residuos de estructura de región variable sustancialmente de un anticuerpo humano (denominado anticuerpo aceptor) y regiones determinantes de complementariedad sustancialmente de un anticuerpo de ratón (denominado anticuerpo donante) también se denominan anticuerpos humanizados. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para aumentar los rendimientos en la producción, por ejemplo, cuando los mAb murinos tienen rendimientos más altos de hibridomas pero una mayor inmunogenicidad en humanos, de modo que se usan mAb quiméricos humanos/murinos. Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (p. ej., las solicitudes de patente PCT WO 86/01533, WO 97/02671 y WO 90/07861, y las patentes de EE. UU. 5.693.762, 5.693.761 y 5.225.539). Además, se puede realizar un injerto de CDR para alterar ciertas propiedades de la molécula de anticuerpo, incluida la afinidad o especificidad. Un ejemplo no limitante de injerto de CDR se describe en la patente de EE. UU. 5.225.539.

[0065] Se apreciará que, para la terapia humana, los anticuerpos humanizados se utilizan preferiblemente. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son anticuerpos quiméricos modificados genéticamente o fragmentos de anticuerpos que tienen porciones (preferiblemente mínimas) derivadas de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos en los que las CDR de un anticuerpo humano (anticuerpo receptor) se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), como ratón, rata o conejo, que tienen la funcionalidad deseada. En algunos casos, los residuos del marco de Fv del anticuerpo humano se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de marco o CDR importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las CDR corresponden a las de un anticuerpo no humano y todas o sustancialmente todas las regiones marco corresponden a las de una secuencia de consenso humana relevante. Los anticuerpos humanizados de manera óptima también incluyen al menos una porción de una región constante de anticuerpo, tal como una región Fc, típicamente derivada de un anticuerpo humano.

[0066] Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan residuos importados, que normalmente se toman de un dominio variable importado. La humanización se puede realizar como se conoce en la técnica (ver, por ejemplo: Patente de Estados Unidos N° 4.816.567), sustituyendo las CDR humanas con las correspondientes CDR de roedor. Por consiguiente, los anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana.

[0067] Después de que se han obtenido los anticuerpos, que se pueden ensayar para la actividad, por ejemplo a través del ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

[0068] Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser anticuerpos anti-sNTB-A, es decir Abs que se unen específicamente a un ectodominio de NTB-A. Los términos "unión específica" o "se une específicamente" se refieren a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad baja a moderada, a diferencia de la unión no específica, que normalmente tiene una baja afinidad con una capacidad moderada a alta. Normalmente, la unión se considera específica cuando la constante de asociación KA es superior a 106M-1. Si es necesario, la unión no específica se puede reducir sin afectar sustancialmente a la unión específica variando las condiciones de unión. Las condiciones de unión apropiadas, como la concentración de anticuerpos, la fuerza iónica de la solución, la temperatura, el tiempo permitido para la unión, la concentración de un agente bloqueante (p. ej., albúmina sérica, caseína de leche), etc., pueden ser optimizados por un experto en la materia utilizando técnicas de rutina. El término "unirse específicamente" como se usa en el presente documento puede indicar además que la unión de un anticuerpo a un antígeno no se inhibe competitivamente por la presencia de moléculas no relacionadas. Convenientemente, la detección de la capacidad de un anticuerpo para unirse específicamente a un antígeno, por ejemplo, un ectodominio de NTB-A, puede realizarse cuantificando la formación de un complejo antígeno-anticuerpo específico (p. ej., mediante ELISA).

[0069] El agonista de ectodominio de NTB-A puede ser una molécula pequeña. Una "molécula pequeña" se define en este documento por tener un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Dalton. Dichos compuestos pueden incluir compuestos sintéticos orgánicos o inorgánicos, péptidos y similares. Se conocen en la técnica métodos de cribado de compuestos para una actividad deseada, así como métodos para diseñar racionalmente moléculas que interactúan con una estructura deseada.

Métodos sintéticos y recombinantes

[0070] Los polipéptidos y péptidos descritos en este documento (p. ej., polipéptidos y derivados del ectodominio de NTB-A) pueden aislarse o sintetizarse usando cualquier método recombinante o sintético conocido en la técnica. Por ejemplo, los péptidos o fragmentos de polipéptidos se pueden sintetizar mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a métodos de síntesis en fase sólida (p. ej., química de Boc o f-Moc) y en fase de solución. Por ejemplo, los péptidos se pueden sintetizar mediante un método de síntesis de péptidos en fase sólida de Merrifield (1963, J Am Chem Soc 85, 2149). Alternativamente, se puede sintetizar un péptido usando métodos de solución estándar bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Bodanszky, 1984) o por cualquier otro método conocido en la técnica para la síntesis de péptidos.

[0071] Los polipéptidos y péptidos se pueden producir convenientemente mediante tecnología recombinante. Se conocen en la técnica métodos recombinantes para diseñar, expresar y purificar proteínas y péptidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, 1992, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York). Las moléculas de ácido nucleico pueden incluir ADN, ARN o derivados de ADN o ARN. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido o péptido puede obtenerse de su fuente natural, ya sea como un gen completo (es decir, completo) o como una porción del mismo. También se puede producir una molécula de ácido nucleico usando tecnología de ADN recombinante (p. ej., amplificación, clonación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) o síntesis química. Las secuencias de ácidos nucleicos incluyen secuencias de ácidos nucleicos naturales y homólogos de las mismas, incluidas, entre otras, variantes alélicas naturales y secuencias de ácidos nucleicos modificadas en las que se han insertado, eliminado, sustituido y/o invertido nucleótidos de tal manera que tales modificaciones no interfieren sustancialmente con la capacidad de la molécula de ácido nucleico para codificar un péptido funcional. Una secuencia de polinucleótidos u oligonucleótidos se puede deducir del código genético de una proteína, sin embargo, se debe tener en cuenta la degeneración del código, así como la tolerancia de excepciones al apareamiento de bases clásico en la tercera posición del codón, como se indica. por las llamadas "reglas de Wobble". Los polinucleótidos que incluyen más o menos nucleótidos pueden dar como resultado proteínas iguales o equivalentes. Usando métodos de producción recombinante, las células hospedadoras seleccionadas, por ejemplo, de un microorganismo como E. coli o levadura, se transforman con un vector híbrido de ADN plasmídico o viral que incluye una secuencia de ADN específica que codifica el polipéptido o análogo de polipéptido y el polipéptido se sintetiza en la huesped tras la transcripción y traducción de la secuencia de ADN.

[0072] Las secuencias se pueden derivar directamente de la secuencia correspondiente del receptor (p. ej., que pueden ser idénticas a una porción de una secuencia del receptor) o pueden contener ciertas derivatizaciones y sustituciones. Por tanto, en algunos casos se contempla el uso de sales y derivados funcionales de estas secuencias, siempre que retengan las funciones biológicas respectivas, como se detalla en el presente documento. Por consiguiente, se describen homólogos de péptidos que contienen derivados de aminoácidos no naturales o cadenas laterales no proteicas. Los homólogos de péptidos se pueden usar que tienen un carboxiácido terminal, como una carboxiamida, como un alcohol terminal reducido o como cualquier sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como sal metálica, que incluye sal de sodio, potasio, litio o calcio, o como una sal con una base orgánica, o como una sal con un ácido mineral, incluyendo ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o ácido fosfórico, o con un ácido orgánico, por ejemplo, ácido acético o ácido maleico. Generalmente, se puede usar cualquier sal de péptidos farmacéuticamente aceptable, siempre que se mantengan sus actividades biológicas.

[0073] Los residuos de aminoácidos descritos en este documento se prefieren estar en la forma isomérica "L". Sin embargo, los residuos en la forma isomérica "D" pueden sustituirse por cualquier residuo de L-aminoácido, siempre que el péptido conserve sustancialmente la propiedad funcional deseada.

[0074] Los derivados químicos pueden tener uno o más residuos químicamente derivatizados mediante reacción de cadenas laterales o grupos funcionales. Tales moléculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, aquellas moléculas en las que se han derivatizado grupos amino libres para formar hidrocloruros de amina, grupos p-toluenosulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno imidazol de la histidina puede derivatizarse para formar N-imbencilhistidina. También se incluyen como derivados químicos aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte residuos de aminoácidos estándar. Por ejemplo: 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; 3-metilhistidina se puede sustituir por histidina; la homoserina puede estar sustituida o serina; y la ornitina puede sustituirse por lisina.

[0075] Además, un derivado puede diferir de la secuencia natural de los polipéptidos o péptidos por modificaciones químicas que incluyen, pero no se limitan a acilación de terminal-NH², acetilación, o amidación de ácido tioglicólico, y por terminal-carboxilamidación, por ejemplo, con amoniaco, metilamina y similares.

[0076] En otro aspecto, los métodos pueden verse afectados mediante la expresión en una población de células obtenida de un sujeto de un polipéptido aislado que comprende un ectodominio de NTB-A (p. ej., mediante el aislamiento de las células T de un sujeto, la introducción de un vector capaz de expresar un ectodominio NTB aislado y reintroducción de las células en el sujeto, de modo que el polipéptido se secrete en el sujeto y sea capaz de contactar con las células T del sujeto). Así, por ejemplo, un método para reducir o inhibir la muerte de las células T, puede verse afectado al poner en contacto las células T con una cantidad terapéuticamente eficaz de un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo, en donde dicho ectodominio de NTB-A se produce in vivo por métodos de terapia génica.

[0077] La preparación de constructos de expresión o vectores utilizados para suministrar y expresar un producto génico deseado son conocidos en la técnica. Tal construcción típicamente comprende secuencias reguladoras o marcadores seleccionables, como se conoce en la técnica. La construcción de ácido nucleico (también denominada aquí como un "vector de expresión") puede incluir secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas, eucariotas u opcionalmente ambos (p. ej., vectores de lanzadera). Además, un vector de clonación típico también puede contener secuencias de inicio de la transcripción y traducción, terminadores de la transcripción y traducción y una señal de poliadenilación.

[0078] Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen, pero no se limitan a pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41 y pNMT81, que están disponibles en Invitrogen, pCI que está disponible en Promega, pMbac, pPbac, pBKRSV y pBK-CMV, que están disponibles en Strategene, pTRES que está disponible en Clontech y sus derivados. Estos pueden servir como columna vertebral del vector para las construcciones útiles en el presente contexto.

[0079] Los vectores virales recombinantes son útiles para la expresión in vivo de los genes, ya que ofrecen ventajas como infección lateral y especificidad de orientación. La infección lateral es inherente al ciclo de vida de los retrovirus, por ejemplo, y es el proceso mediante el cual una sola célula infectada produce muchos viriones descendientes que brotan e infectan las células vecinas. El resultado es la infección rápida de una gran área de células, la mayoría de las cuales no fueron infectadas inicialmente por las partículas virales originales. Esto contrasta con la infección de tipo vertical en donde el agente infeccioso se propaga solo a través de la progenie. También se pueden producir vectores virales que no pueden diseminarse lateralmente. Esta característica puede ser útil si el propósito deseado es introducir un gen específico en solo un número localizado de células diana.

Expansión ex vivo y preparaciones de células

[0080] Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método mejorado para preparar una composición celular, que comprende la etapa de incubar ex vivo una población de células que contiene células T que comprende células T CD8⁺con una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido aislado (p. ej., producido de forma recombinante) que comprende un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo, y que comprende además proporcionar a la población celular una estimulación del receptor de células T (TCR). La población de células que contiene linfocitos T se incuba con el ectodominio de NTB-A aislado o agonista del mismo en presencia de la estimulación de TCR y las células alimentadoras y sin la adición de IL-2 exógena, y donde el agonista es un anticuerpo específico de un ectodominio NTB-A.

[0081] Los linfocitos T (células T) son uno de una variedad de distintos tipos de células implicadas en una respuesta inmunitaria. La actividad de las células T está regulada por un antígeno, presentado a una célula T en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). El receptor de células T (TCR) luego se une al complejo MHC-antígeno. Una vez que el antígeno forma un complejo con el m Hc , el complejo MHC-antígeno se une mediante un TCR específico en una célula T, alterando así la actividad de esa célula T. La activación adecuada de los linfocitos T por las células presentadoras de antígeno requiere la estimulación no solo del TCR, sino también de la participación combinada y coordinada de sus correceptores.

[0082] Las células T auxiliares (células TH) ayudan a otras células blancas de la sangre en los procesos inmunológicos, incluyendo la maduración de las células B en células plasmáticas y células B de memoria, y la activación de las células T citotóxicas y macrófagos. Estas células también se conocen como células T CD4⁺porque expresan la glicoproteína CD4 en sus superficies. Las células T colaboradoras se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos mediante moléculas del MHC de clase II, que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Una vez activados, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmunitaria activa.

[0083] Las células T citotóxicas (células T^c, o CTL) destruyen las células infectadas con virus y células tumorales, y también están implicadas en el rechazo del trasplante. Estas células también se conocen como células T CD8⁺ya que expresan la glicoproteína CD8 en sus superficies. Estas células reconocen sus objetivos al unirse al antígeno asociado con las moléculas del MHC de clase I, que están presentes en la superficie de todas las células nucleadas.

[0084] Las células T reguladoras (células Tre^g), anteriormente conocidas como células T supresoras, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. Su función principal es apagar la inmunidad mediada por células T hacia el final de una reacción inmune y suprimir las células T autorreactivas que escaparon del proceso de selección negativa en el timo.

[0085] El TCR es un complejo de proteínas integrales de membrana, en donde la estimulación por el reconocimiento del antígeno presentado por MHC específica y la unión por el heterodímero a/p específico a clonotipo conduce a la activación de la transcripción y posteriores funciones de proliferación y efectoras (tales como la actividad citotóxica in células T CD8⁺y secreción de citocinas en células T CD4⁺). Esta activación implica otras subunidades del complejo receptor, como se detalla a continuación, que acoplan el evento de ligando extracelular a las vías de señalización aguas abajo como la fosforilación de proteínas, la liberación de fosfatos de inositol y la elevación de los niveles de calcio intracelular.

[0086] Las porciones intracelulares de las subunidades de CD3 y, 6, £, y Z contienen copias de un motivo de secuencia denominado ITAM (motivos de activación inmunoreceptores basados en tirosina). Los ITAM pueden servir como sustratos de proteína de tirosina quinasa y, después de la fosforilación, como sitios de unión para dominios SH2 de otras quinasas. La regulación y el mecanismo del reclutamiento de proteína quinasas al receptor de células T activado involucra a miembros tanto de la familia Syk (ZAP-70) como de la familia Src (Lck) de quinasas.

[0087] La estimulación con TCR como se detalla anteriormente puede ser específica de antígeno o no específica de antígeno (policlonal). Los activadores de TCR específicos de antígeno adecuados incluyen antígenos unidos a moléculas de MHC, típicamente en el contexto de células presentadoras de antígeno (APC). Los activadores policlonales de TCR son capaces de iniciar la transducción de señales y las rutas de activación de la transcripción asociadas con la participación específica de TCR en ausencia de antígenos específicos. Los activadores de linfocitos T policlonales adecuados incluyen anticuerpos que se unen y reticulan el complejo receptor de linfocitos T/CD3, por ejemplo, subunidades como se describe en el presente documento. Los anticuerpos ejemplares que reticulan el receptor de células T incluyen los anticuerpos monoclonales HIT3a, UCHT1 y OKT3. La estimulación se proporciona en una cantidad y en condiciones conocidas en la técnica para inducir los efectos funcionales mencionados anteriormente. En los Ejemplos siguientes se proporcionan varios ejemplos no limitativos para la estimulación de TCR (tanto específicos de antígeno como policlonales).

[0088] En otra forma de realización, la población comprende células T CD8⁺. En otra forma de realización, las células T son células T CD8⁺. Las células se pueden diseñar o modificar genéticamente (p. ej., para ejercer una especificidad antigénica deseada). Por ejemplo, las células pueden ser linfocitos (p. ej., células T purificadas como CTL) modificadas genéticamente para expresar un TCR prediseñado para redirigirlas contra células cancerosas o contra patógenos (p. ej., virus). Por medio de un ejemplo no limitativo, células T diseñadas para expresar un TCR dirigido contra NY-ESO-1, un antígeno expresado en muchos tumores sólidos, por ejemplo, sarcoma sinovial. Las células también pueden ser células mononucleares de sangre periférica diseñadas genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) para redirigirlas contra células cancerosas o patógenos. Por ejemplo, sin limitación, las células CAR-T dirigidas a CD19 pueden usarse para el tratamiento de neoplasias malignas de células B tales como leucemia linfoblástica aguda. Las células pueden ser células mononucleares de sangre periférica diseñadas genéticamente para expresar genes que mejoran su función biológica. Por ejemplo, sin limitación, tales genes pueden incluir citocinas y receptores de citocinas unidos a la membrana (p. ej., IL-2 e IL-2R). En los ejemplos siguientes se describen ciertos ejemplos no limitativos adicionales para el uso de células modificadas genéticamente, que expresan un TCR dirigido contra el antígeno gp10025-33 asociado al tumor o moléculas coestimuladoras tales como 4-1BBL.

[0089] La población puede comprender células T CD4⁺o células mieloides. Alternativamente, la población puede comprender una combinación de células T CD8⁺, células T CD4⁺y células mieloides.

[0090] La incubación con el polipéptido o agonista del ectodominio de NTB-A se puede realizar en una cantidad y en condiciones suficientes para inducir o regular al alza los marcadores de activación y/o citocinas asociadas con la activación de células T (p. ej., marcadores de activación de Tc1 tales como IFN-y). De manera ventajosa, la incubación con el polipéptido o agonista del ectodominio de NTB-A se realiza para regular al alza la expresión de CD137 en las células T. Tales condiciones ventajosas ejemplares se especifican a continuación.

[0091] Por lo tanto, la incubación se puede realizar en presencia de la estimulación del receptor de células T (TCR). La estimulación de TCR puede ser no específica de antígeno (realizada, por ejemplo, usando anticuerpos específicos para CD3 que activan el receptor al unirse, por ejemplo, OKT3) o específica de antígeno (usando células presentadoras de antígeno adecuados y antígeno).

[0092] En el contexto del tratamiento del cáncer, la estimulación específica de antígeno típicamente emplea la estimulación de antígenos asociados a tumores. El término "antígeno asociado a tumor" (TAA) se refiere a cualquier proteína, péptido o antígeno asociado con (transportado por, expresado por, producido por, secretado por, etc.) un tumor o células tumorales. Los antígenos asociados a tumores pueden estar (casi) exclusivamente asociados con un tumor o células tumorales y no con células normales sanas o pueden estar sobreexpresados (p. ej., 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces, 1.000 veces o más) en un tejido tumoral o células tumorales en comparación con tejido o células sanas normales. Más particularmente, un TAA es un antígeno que puede ser presentado (en forma procesada) por determinantes MHC de la célula tumoral. Por lo tanto, es probable que los antígenos asociados a tumores estén asociados solo con tumores o células tumorales que expresan moléculas de MHC. Ejemplos no limitativos de TAA bien conocidos son MART-1, gp100209-217, gpOO154-163, CSPG4, NY-ESO, MAGE-A1, tirosinasa.

[0093] La incubación también se puede realizar en presencia de células alimentadoras (p. ej.).

[0094] El término "células alimentadoras" se refiere generalmente a las células de un tipo que son co-cultivadas con células de un segundo tipo, para proporcionar un entorno en donde las células del segundo tipo se pueden mantener y proliferar. Las células alimentadoras pueden ser de una especie diferente a las células que sustentan. Para el propósito de la presente invención, este término se refiere específicamente a células accesorias que llevan el receptor Fc, que típicamente son alorreactivas con la población que contiene células T que se va a propagar. En otras palabras, las células alimentadoras no necesitan ser histocompatibles con la población que contiene células T para propagarse y, en ciertos casos, las dos poblaciones normalmente no coinciden con HLA. Un ejemplo típico de células alimentadoras utilizadas en el contexto de la invención son las células mononucleares de sangre periférica de donante normal alogénicas, PBMC. De forma típica y ventajosa, el uso de tales células alimentadoras se realiza junto con la estimulación de TCR no específica de antígeno, por ejemplo, mediante incubación con anticuerpos estimulantes no específicos de antígeno, como se detalla en el presente documento.

[0095] Las composiciones de TIL para terapia celular adoptiva se pueden preparar con PBMC irradiadas (incapaces de proliferar). Por ejemplo, las PBMC pueden atenuarse convenientemente mediante irradiación exponiendo las células a 6000RAD. En otros casos, las composiciones de TIL para terapia celular adoptiva se pueden preparar con entidades presentadoras de antígenos artificiales que incluyen células presentadoras de antígenos y partículas inertes que portan antígenos, para proporcionar estimulación específica de antígenos.

[0096] Los polipéptidos descritos aquí se han demostrado ser inesperadamente superiores a la IL-2, en la producción de la activación de células T más segura y más eficaz. Por tanto, el uso de IL-2 puede reducirse sustancialmente e incluso sustituirse completamente por los polipéptidos. Por consiguiente, la incubación se puede realizar ventajosamente sin la adición de IL-2 exógena. Sin desear estar ligado a una teoría o mecanismo de acción específico, las formas de realización de la invención están dirigidas a tales composiciones celulares mejoradas, en las que la actividad de las células T efectoras (p. ej., la actividad CTL) se expande mientras que la actividad de las células T reguladoras se minimiza.

[0097] La incubación se puede realizar con la adición de IL-2 exógena en el intervalo de 300-6000 UI/ml, o en presencia de ligando CD137 exógeno o un agonista del mismo.

[0098] Como se usa aquí, el término "endógeno" significa que la molécula ha sido producida o sintetizada a partir de dentro de un organismo o un tejido o una célula. El término "exógeno" significa que este antígeno o molécula potenciadora se ha introducido desde fuera de la célula o tejido.

[0099] Por ejemplo, sin limitación, composiciones de TIL se pueden obtener mediante la incubación de TIL (o células T como se describe en el presente documento) con PBMC en una relación de TIL a PBMCs de 200:1 a 1:300, por ejemplo 1:200 a 1:100, en presencia de anticuerpos anti-CD3 a 1 ng/ml-1 pg/ml, preferiblemente 10-100 ng/ml (p. ej., 30 ng/ml del anticuerpo OKT3), y 1-200 pg/ml, preferiblemente 10-50 pg/ml, polipéptido del ectodominio de NTB-A. La incubación se puede realizar durante 3-15 días, preferiblemente 8-12 días. En la sección de Ejemplos de este documento se ejemplifican métodos y protocolos adicionales para producir composiciones celulares.

[0100] De acuerdo con ciertos protocolos, TIL obtenidos a partir de tumor de un paciente pueden cultivarse ex vivo antes de la etapa de expansión REP como se describe anteriormente. Por ejemplo, TIL puede precultivarse durante hasta 28 días en presencia de IL-2 (p. ej., 300-6.000 UI/ml), antes de la adición de anticuerpos anti-CD3 y células alimentadoras. Los polipéptidos del ectodominio de NTB-A se pueden complementar adicionalmente en esta etapa de cultivo preliminar, por ejemplo, a 10-50 pg/ml (con o sin IL-2) y se puede controlar la respuesta de las células T.

[0101] La composición TIL resultante puede administrarse a un sujeto en necesidad del mismo en 108 a 1012 o al 106 a 1012 células por paciente, por ejemplo 1010 o 106 células/paciente.

[0102] Algunos de los métodos descritos en este documento permiten la propagación de células T y la expansión. La incubación con el ectodominio o agonista de NTBA se puede realizar para mejorar el número de células T en al menos dos veces, al menos 4 veces, al menos 8 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces. Cuando, por ejemplo, se emplea un protocolo REP mejorado, la incubación con el ectodominio o agonista de NTB-A puede resultar típicamente con un aumento del número de células T en al menos 200 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces, al menos 2000 veces., al menos 5000 veces, al menos 7000 veces o al menos 10.000 veces. En otro aspecto, se proporciona una composición celular preparada mediante los métodos de la invención. La composición celular puede ser adecuada para la transferencia adoptiva a un sujeto receptor que la necesite. Como se usa en este documento, y a menos que se especifique lo contrario, el término "transferencia adoptiva" se refiere a una forma de inmunoterapia pasiva en donde se transfieren a los receptores agentes inmunológicos previamente sensibilizados (p. ej., células o suero).

[0103] Las frases "inmunoterapia adoptiva de transferencia", "terapia celular adoptiva" y "inmunoterapia celular adoptiva" se usan indistintamente en este documento para denotar un régimen terapéutico o profiláctico o modalidad, en donde las células efectoras inmunocompetentes, tales como las composiciones celulares de la invención, se administran (transfieren adoptivamente) a un sujeto que lo necesita, para aliviar o mejorar el desarrollo o los síntomas del cáncer o enfermedades infecciosas.

[0104] La composición de células puede comprender una población que contiene células T en una cantidad eficaz. Por ejemplo, una cantidad eficaz para la inmunoterapia de transferencia adoptiva es una cantidad suficiente para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria beneficiosa tal como una respuesta antitumoral, por ejemplo, de 106 a 1012 células. Debe entenderse que, si bien las preparaciones de células adecuadas para la administración in vivo, particularmente para sujetos humanos, pueden contener excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables, tales preparaciones son suficientemente exentas de contaminación por patógenos, toxinas, pirógenos y cualquier otro agente biológico y no biológico que no se reconozca como farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, sin limitación, las células T para inmunoterapia de transferencia adoptiva se pueden suspender convenientemente en un tampón adecuado para inyección que contenga solución salina estéril con albúmina humana al 2% y opcionalmente IL-2 (p. ej., 300 UI/ml).

[0105] La composición de células puede ser histocompatible con el sujeto a tratar (p. ej., células autólogas o células alogénicas ajustadas a MHC II).

[0106] El término "histocompatibilidad" se refiere a la similitud de tejido entre diferentes individuos. El nivel de histocompatibilidad describe la compatibilidad del paciente y del donante. Los principales determinantes de histocompatibilidad son los antígenos leucocitarios humanos (HLA). La tipificación de HLA se realiza entre el donante potencial y el receptor potencial para determinar el grado de coincidencia de HLA de los dos. El término "histocompatible" como se usa en este documento se refiere a casos en los que los seis antígenos HLA (2 antígenos A, 2 antígenos B y 2 antígenos DR) son los mismos entre el donante y el receptor.

[0107] Sin embargo, los donantes y receptores que están "no coincidentes" en dos o más antígenos, por ejemplo 5 de 6, o en otras formas de realización, 4 de 6 o 3 de 6 coincidentes, también pueden desempeñar parte en un caso correspondiente a pesar de no tener el donante y el destinatario una coincidencia completa. El término "sustancialmente histocompatible", como se usa en el presente documento, se refiere a casos en los que cinco de los seis antígenos HLA son iguales entre el donante y el receptor.

Composiciones farmacéuticas, kits y combinaciones terapéuticas

[0108] El ectodominio de NTB-A y los agonistas del mismo usados en la invención se pueden proporcionar en forma de una composición farmacéutica, que opcionalmente comprende además un vehículo, excipiente o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

[0109] Dichas composiciones pueden ser en una forma farmacéutica adecuada para la administración a un paciente, incluyendo pero no limitado a soluciones, suspensiones, polvos liofilizados para la reconstitución con un vehículo adecuado o dilución antes de su uso, cápsulas, comprimidos, y similares. Las composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente descrito en este documento, preferiblemente en forma purificada, y un excipiente farmacéutico. Como se usa en este documento, "excipiente farmacéutico" incluye disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, etc. y combinaciones de los mismos, que son compatibles con la administración farmacéutica. De aquí en adelante, las frases "portador terapéuticamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable", que pueden usarse indistintamente, se refieren a un portador o diluyente que no causa una irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionen funciones terapéuticas suplementarias, adicionales o mejoradas. La composición puede consistir esencialmente en un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo y uno o más excipientes farmacéuticos. En otra forma de realización, la composición consiste en un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo y uno o más excipientes farmacéuticos.

[0110] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse por procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, molienda, pulverización, procesos de fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con la vía de administración prevista. Los expertos en la técnica conocen métodos para realizar la administración. En la última edición de "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin se describen ejemplos de excipientes y modos adecuados para formular las composiciones.

[0111] Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención (por ejemplo que contienen ectodominio de NTB-A o agonista del mismo) son típicamente formulaciones líquidas adecuadas para inyección o infusión. Los ejemplos de administración de una composición farmacéutica incluyen ingestión oral, inhalación, infusión intravenosa y continua, administración intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria, subcutánea, cutánea o transdérmica. Las composiciones pueden ser adecuadas para administración intralesional (p. ej., intratumoral) o para administración intravenosa.

[0112] Por ejemplo, soluciones salinas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas se pueden emplear como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares.

[0113] Las soluciones o suspensiones utilizadas para la administración intravenosa incluyen típicamente un vehículo tal como solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ), etanol o poliol. En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida para facilitar la inyección. A menudo se puede obtener la fluidez adecuada utilizando lecitina o tensioactivos. La composición también debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La prevención de microorganismos se puede lograr con agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, etc. En muchos casos, se pueden incluir agentes isotónicos (azúcar), polialcoholes (manitol y sorbitol) o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de la composición se puede lograr añadiendo un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un anestésico local como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o bolsita que indique la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contenga agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

[0114] Las composiciones orales incluyen un diluyente inerte o vehículo comestible. La composición puede encerrarse en gelatina o comprimirse en tabletas. Para la administración oral, el agente activo puede incorporarse con excipientes y colocarse en tabletas, grageas o cápsulas. Se pueden incluir en la composición agentes aglutinantes o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, trociscos y cápsulas pueden contener opcionalmente un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente como almidón o lactosa, un agente desintegrante como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante como estearato de magnesio; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; o un agente edulcorante o aromatizante.

[0115] La composición también se puede administrar por una vía transmucosa o transdérmica. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden una porción Fc pueden ser capaces de atravesar las membranas mucosas del intestino, la boca o los pulmones (a través de los receptores Fc). La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de pastillas, aerosoles nasales, inhaladores o supositorios. La administración transdérmica también se puede lograr mediante el uso de una composición que contenga ungüentos, pomadas, geles o cremas conocidas en la técnica. Para la administración transmucosa o transdérmica se utilizan penetrantes adecuados a la barrera a permear. Para la administración por inhalación, los anticuerpos se administran en un aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado, que contiene un propelente (p. ej., líquido o gas) o un nebulizador. La composición se puede formular como supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales como los triglicéridos.

[0116] Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación intradérmica o subcutánea incluyen típicamente al menos uno de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua, solución salina, aceites fijos, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol u otro solvente sintético; agentes antibacterianos como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones como acetato, citrato o fosfato; y agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases. Tales preparaciones pueden incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples.

[0117] Los agentes activos polipeptídicos (p. ej., ectodominio de NTB-A o agonista del mismo) se pueden preparar con vehículos para proteger el polipéptido contra la eliminación rápida del cuerpo. A menudo se utilizan polímeros biodegradables (p. ej., etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico). Los expertos en la técnica conocen métodos para la preparación de tales formulaciones. Las suspensiones liposomales también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Los liposomas se pueden preparar de acuerdo con métodos establecidos conocidos en la técnica (Patente de Estados Unidos N° 4.522.811). Además, los liposomas que contienen restos de PEG o glicolípidos pueden usarse ventajosamente para mejorar la retención del plasma sanguíneo y/o para reducir la captación por el hígado.

[0118] Liposomas más grandes (p. ej., 300 nm o más) se pueden utilizar también, los cuales median la absorción y la depuración preferentemente por el bazo y habiendo reducido la limpieza del hígado. También se pueden usar liposomas más pequeños (p. ej., 40 nm o menos), que preferentemente median la absorción y el aclaramiento del hígado. Se pueden usar liposomas de 40-300 nm, que pueden tener una mayor retención de plasma sanguíneo. Los liposomas pueden contener además polímeros tales como PEG (véase, por ejemplo, Litzinger et al., Biochim Biophys Acta. 23 de febrero de 1994; 1190 (1): 99-107). El documento US 2011160642 describe formulaciones liposomales pegiladas que tienen una acumulación reducida en el hígado y el bazo. En la patente de EE. UU. N° 6.284.267.

[0119] Además, el ectodominio de NTB-A o agonista se puede administrar con diversas moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos o toxinas. Por tanto, el ectodominio o agonista de NTB-A puede administrarse en combinación (simultánea o secuencial) con un tratamiento contra el cáncer, por ejemplo, radiación o quimioterapia.

[0120] La administración continua así como intravenosa intermitente también se puede lograr usando una bomba implantable o externa (p. ej., bomba INFUSAID). El uso de tales bombas y el ajuste de los protocolos de dosificación a los parámetros requeridos están dentro de las capacidades del experto en la materia.

[0121] La administración o adición de los polipéptidos o agonistas de NTB-A puede realizarse ventajosamente en combinación (concurrente o secuencial) con la administración de un ligando CD 137 (p. ej., ligando CD137 humano o la porción extracelular del mismo) o un agonista del mismo (tal como un anticuerpo anti-CD137 que induce una función biológica asociada con la activación de CD137 con su ligando afín). Ejemplos no limitativos de tales anticuerpos anti-CD137 que están disponibles comercialmente o bajo investigación clínica incluyen, por ejemplo, Bristol Myers Squibb (BMS; Princeton, NJ) Número de catálogo 663513, anticuerpo monoclonal IgG4 completamente humanizado que puede usarse, por ejemplo, a 10-20 ng/ml, y el número de catálogo de R&D Systems AF838 anti-4-1BB de cabra policlonal que puede usarse, por ejemplo, a 20-40 ng/ml. Puede encontrarse una secuencia de aminoácidos de CD137 humano en el número de acceso Q07011. Por ejemplo, CD137 humano de longitud completa puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos: MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDWCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SWKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE GGCEL (SEQ ID NO: 4). Se puede encontrar una secuencia de aminoácidos del ligando CD137 humano en el número de acceso NP_003802,1. Por ejemplo, el ligando de CD137 humano (porción extracelular) puede tener la siguiente secuencia de aminoácidos: MREGPELSPD DPAGLLDLRQ GMFAQLVAQN VLLIDGPLSW YSDPGLAGVS LTGGLSYKED TKELWAKAG VYYVFFQLEL RRWAGEGSG SVSLALHLQP LRSAAGAAAL ALTVDLPPAS SEARNSAFGF QGRLLHLSAG QRLGVHLHTE ARARHAWQLT QGATVLGLFR VTPEIPAGLP SPRSE (SEQ ID NO: 5).

[0122] En otro aspecto, se proporciona una combinación terapéutica que comprende 1) un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo, 2) un polipéptido aislado que comprende el ligando CD137 o un agonista del mismo y, opcionalmente, 3) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La combinación puede comprender ectodominio de NTB-A humano o ligando CD137 humano. En otros casos, el agonista puede ser un anticuerpo (p. ej., específico de NTB-A o específico de CD137). Por tanto, en otra forma de realización se proporciona una composición farmacéutica que comprende una combinación terapéutica de: 1) un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A, 2) un polipéptido que comprende CD137 ligando o un agonista del mismo y opcionalmente 3) un portador farmacéuticamente aceptable. La administración o adición de los polipéptidos o agonistas de NTB-A se puede realizar en combinación (concurrente o secuencial) con la administración de otros inmunomoduladores, por ejemplo, reactivos de direccionamiento de receptores de señalización que exhiben un efecto modificador de la función de las células inmunes. Los ejemplos de tales reactivos incluyen, por ejemplo, antagonistas o inhibidores (tales como anticuerpos) de CTLA-4, PD-1 o PDL1. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos que están disponibles comercialmente o en investigación clínica incluyen el anticuerpo bloqueador CTLA-4 (YERVOY™, BMS, aprobado para su uso en la clínica a 1-3 mg/kg), anticuerpos bloqueadores PD-1 (KEYTRUDA™, Merck, 0,5-2 mg/kg; OPDIVO™, BMS, 1-3 mg/kg) y anticuerpos dirigidos contra PD-L1 (ROCHE, en investigación clínica).

[0123] En otro aspecto, se proporciona una combinación terapéutica que comprende 1) un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo, 2) un modulador inmune y, opcionalmente, 3) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0124] La combinación puede comprender ectodominio de NTB-A humano, o antagonistas o inhibidores de CTLA-4, PD-1 o PD-L1. El agonista puede ser un anticuerpo (p. ej., específico de NTB-A, específico de CTLA-4, específico de PD-1 o específico de PD-L1).

[0125] También se describe, pero que no forma parte de la invención es un kit que contiene un polipéptido que comprende un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo, e instrucciones para usar el polipéptido.

[0126] La composición no se administra típicamente en forma de una vacuna que comprende además un antígeno adicional. La composición no se administra típicamente mediante un régimen terapéutico adaptado para la vacunación.

Las vacunas y los protocolos de vacunación son bien conocidos en la técnica. Las vacunas contienen típicamente uno o más antígenos a los que se debe provocar una respuesta inmunitaria deseada (p. ej., células cancerosas atenuadas o antígenos asociados a tumores) y, a menudo, contienen adyuvantes adicionales, que se utilizan para estimular o mejorar la respuesta inmunitaria (p. ej., alumbre o aceite mineral).

[0127] Por ejemplo, sin limitación, un intervalo de dosis adecuada para un NTB-A que contiene el polipéptido o agonista puede ser de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg administrado cada 7 a 90 días entre dosis. Debe entenderse que el médico tratante puede mantener o ajustar el tratamiento para mantener el beneficio clínico y evitar las toxicidades limitantes del programa de tratamiento global.

Sujetos y uso terapéutico

[0128] Según algunas otras formas de realización de la invención, el ectodominio de NTB-A aislado y el anticuerpo agonista específico de un ectodominio de NTB-A, se utilizan, opcionalmente, en forma de una composición farmacéutica como se describe en el presente documento, en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita, en donde dicho sujeto padece un tumor caracterizado por la falta de expresión sustancial de la superficie de NTB-A y es citopénico o tiene riesgo de desarrollar citopenia; para reducir o inhibir la muerte de células T in vivo después de inmunoterapia de transferencia adoptiva diseñada para aliviar o mejorar el desarrollo de síntomas de cáncer o una enfermedad infecciosa; y en el tratamiento o prevención de la citopenia en un sujeto que lo necesite.

[0129] Se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo, para uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto en necesidad del mismo.

[0130] De acuerdo con ciertas formas de realización adicionales de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo, para uso en reducir o inhibir la muerte celular T.

[0131] De acuerdo con ciertas formas de realización adicionales de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un ectodominio de n TB-A aislado o un agonista del mismo, para uso en el tratamiento o la prevención de la citopenia en un sujeto en necesidad del mismo.

[0132] Las composiciones celulares de la invención pueden usarse para el tratamiento de diversas otras patologías y condiciones dependientes de células T, es decir, condiciones que pueden ser aliviadas por una respuesta de células T beneficiosas. Por ejemplo, sin limitación, varios tumores e infecciones (p. ej., virales) se manifiestan por epítopos de células T característicos, tales como epítopos de CTL. La activación y propagación específicas de células T dirigidas a estos epítopos de acuerdo con los métodos de la invención pueden ser beneficiosas para tratar tales afecciones.

[0133] Las composiciones de la presente invención están destinadas en diversas formas de realización para el tratamiento de un trastorno proliferativo, específicamente, un trastorno maligno. Como se usa en el presente documento para describir la presente invención, "trastorno proliferativo", "cáncer", "tumor" y "malignidad" se refieren todos de manera equivalente a una hiperplasia de un tejido u órgano. Si el tejido es parte de los sistemas linfático o inmunológico, las células malignas pueden incluir tumores no sólidos de las células circulantes. Las neoplasias malignas de otros tejidos u órganos pueden producir tumores sólidos. En general, las composiciones y métodos de la presente invención pueden usarse en el tratamiento de tumores sólidos y no sólidos. El término "cáncer" o "célula cancerosa" se usa en el presente documento para indicar un tejido o célula que se encuentra en un neoplasma que posee características que lo diferencian del tejido normal o de las células tisulares.

[0134] En algunos casos, la composición de células es histocompatible con el sujeto (p. ej., células autólogas o células alogénicas emparejadas a MHC-II).

[0135] Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para ejercer un resultado beneficioso en un método de la invención. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de ingredientes activos (p. ej., ectodominio o células efectoras de NTB-A) eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de un trastorno (p. ej., cáncer) o prolongar la supervivencia del sujeto que está siendo tratado. En el contexto de los métodos de cultivo celular in vitro, una cantidad eficaz de un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo es una cantidad suficiente para ejercer una actividad agonista de NTB-A, que incluye, entre otros, la expansión de células T, la regulación positiva de marcadores de activación (p. ej., CD137) y reducción de la muerte de células T inducida por activación.

[0136] La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en este documento. Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la dosis o la cantidad terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro y de cultivo celular. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr una concentración o título deseado. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.

[0137] La toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en el presente documento se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o en animales de experimentación. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un rango de dosis para uso en humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. El médico individual puede elegir la formulación exacta, la vía de administración y la dosificación en vista del estado del paciente (ver, por ejemplo, Fingl, E. et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1, p,1.).

[0138] El sujeto que se va a tratar mediante los métodos descritos en el presente documento padece típicamente un tumor caracterizado por la falta de expresión sustancial de NTB-A en la superficie. El tumor no debe caracterizarse por una sobreexpresión de NTB-A. El tumor puede ser un tumor sólido. El sujeto puede padecer un tumor caracterizado por la expresión superficial de CD137. El cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en melanoma, cáncer del tracto urinario, cáncer ginecológico, carcinoma de cabeza y cuello, tumor cerebral primario, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon y otros cánceres del tracto intestinal, neoplasias óseas, tumores conectivos y de tejidos blandos y cánceres de piel. En otra forma de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino y cáncer de colon. En otra forma de realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de cuello uterino y cáncer de colon. Particularmente, el cáncer puede ser melanoma u otro diferente al melanoma. Por ejemplo, el cáncer puede ser distinto de un tumor hematopoyético.

[0139] Los términos "sustancial" y "sustancialmente" tal como se utiliza con respecto a la expresión en superficie de los receptores y los marcadores de polipéptidos, representa la expresión en una cantidad detectable por métodos convencionales tales como inmunoensayos. Un tumor caracterizado por la falta de una expresión sustancial de NTB-A en la superficie significa un tumor en donde la cantidad de NTB-A detectada en la superficie de la célula tumoral no excede el 10%, y preferiblemente está por debajo del 5%, más preferiblemente por debajo del 1%, lo más preferiblemente por debajo del 0,5% de la cantidad característica de NTB-A que expresa endógenamente, como los linfocitos.

[0140] El sujeto puede haber recibido o está recibiendo una inmunoterapia adoptiva, por ejemplo, una célula T que contiene la composición de la invención.

[0141] El sujeto puede ser un sujeto citopénico, o un sujeto en riesgo de desarrollar la citopenia (debido a por ejemplo la irradiación o quimioterapia). El sujeto puede padecer o tener riesgo de desarrollar linfocitopenia o no puede padecer una enfermedad infecciosa activa o una inflamación aguda o patológica. En otra forma de realización, el sujeto no padece enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X (XLP). En otra forma de realización, el sujeto no padece una enfermedad autoinmune.

[0142] Los polipéptidos descritos aquí se han demostrado ser inesperadamente superiores a la IL-2, en la producción de la activación de células T más segura y más eficaz. Por tanto, el uso de IL-2 puede reducirse sustancialmente e incluso sustituirse por completo por los polipéptidos descritos en el presente documento. Por consiguiente, los métodos descritos en este documento se ven afectados sin la adición de IL-2 exógena (in vivo y/o ex vivo). El uso de IL-2 puede reducirse en al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% y preferiblemente al menos un 90%.

[0143] Por ejemplo, IL-2 (Proleukin®) está actualmente indicado para la inmunoterapia contra el cáncer, por ejemplo, a una dosis de 600.000 unidades internacionales/kg (0,037 mg/kg) administrada cada 8 horas mediante una infusión intravenosa de 15 minutos durante un máximo de 14 dosis; una dosis estándar para expandir las células T in vitro es, por ejemplo, 6000 U/ml. Pueden usarse niveles reducidos de IL-2 como se detalla en el presente documento. Por ejemplo, sin limitación, los ejemplos siguientes demuestran la reducción satisfactoria de IL-2 utilizada en cultivo celular de 6000 U/ml a 300 U/ml, es decir, al 20% de la dosis estándar. Los métodos descritos en este documento pueden emplearse usando no más de 1.000 U/ml de IL-2, o en otros casos no más de 800, 600, 400, 300 o 200 U/ml de IL-2 añadida exógenamente in vitro.

[0144] En otro aspecto, la invención proporciona un método in vitro para reducir o inhibir la muerte de células T, que comprende las células T en contacto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido aislado que comprende un ectodominio de NTB-A o un agonista del mismo.

[0145] En otro aspecto, se proporciona un ectodominio de NTB-A aislado o anticuerpo agonista del mismo para su uso en reducir o inhibir la muerte de células T in vivo después de la inmunoterapia de transferencia adoptiva diseñada para aliviar o mejorar el desarrollo de los síntomas del cáncer o una enfermedad infecciosa. En otra forma de realización, el ectodominio o agonista puede usarse para reducir o inhibir la muerte de células T en un sujeto que padece o corre el riesgo de desarrollar citopenia. En otra forma de realización, el ectodominio o agonista se usa para reducir o inhibir la muerte de células T después de la administración de células T a un sujeto receptor que lo necesita.

[0146] El sujeto puede ser un sujeto citopénico, o un sujeto en riesgo de desarrollar la citopenia (debido a por ejemplo la irradiación o quimioterapia). En otros casos, el sujeto padece o tiene riesgo de desarrollar linfocitopenia. En otros casos, el sujeto no padece una enfermedad infecciosa activa o una inflamación aguda o patológica. En otra forma de realización, el sujeto no padece enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X (XLP).

[0147] En otro aspecto, se proporciona un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para uso en el tratamiento o la prevención de la citopenia en un sujeto en necesidad del mismo.

[0148] El término "citopenia" como se usa en el presente documento se refiere a una reducción de los elementos celulares en la sangre circulante. La citopenia puede resultar de una variedad de causas, e incluye tanto una reducción general del número de células en la sangre como una reducción específica de un tipo celular particular, como la reducción de leucocitos en la leucopenia. La leucopenia es una reducción en el recuento de glóbulos blancos circulantes (WBC) a <4000/ml. Suele caracterizarse por un número reducido de neutrófilos circulantes, aunque también puede contribuir un número reducido de linfocitos, monocitos, eosinófilos o basófilos. Por lo tanto, la función inmunológica generalmente está muy disminuida. La neutropenia es una reducción del recuento de neutrófilos en sangre. La neutropenia grave generalmente se define por un recuento absoluto de neutrófilos <500/ml. Es más grave cuando se acompaña de monocitopenia y linfocitopenia. La linfocitopenia, en donde el número total de linfocitos es <1000/ml en adultos, no siempre se refleja en el recuento total de leucocitos, porque los linfocitos representan sólo del 20 al 40% del recuento.

[0149] En algunas formas de realización, la citopenia está asociada con radiación o quimioterapia. Por ejemplo, la citopenia puede ser citopenia asociada con quimioterapia de dosis alta, citopenia asociada con terapia oncológica convencional, citopenia inducida por fármacos, citopenia inducida por toxinas y citopenia inducida por radiación. En otros casos, la citopenia puede estar asociada con una inmunodeficiencia adquirida o congénita que no está asociada con un deterioro en la vía NTB-A. Por tanto, los pacientes con XLP están explícitamente excluidos de estas formas de realización. Por ejemplo, la citopenia puede ser inducida por esteroides, inducida o exacerbada por una enfermedad infecciosa (hepatitis, enfermedad viral) o autoinmune (p. ej., por lupus eritematoso sistémico). En una forma de realización particular, el método se usa para el tratamiento o prevención de linfocitopenia.

[0150] La duración de la citopenia puede reducirse. Por ejemplo, la duración de la citopenia se puede reducir a menos de 12 días, preferiblemente a menos de 10 días, más preferiblemente a menos de 8 días y lo más preferiblemente a menos de 7 días desde el inicio del tratamiento. La duración de la citopenia se puede reducir a menos de 5 días, menos de 4 días, menos de 3 días, menos de 2 días o menos de un día desde el inicio del tratamiento. Los métodos pueden ser útiles para reducir la incidencia de infección y para aumentar la supervivencia después de la quimioterapia o la radioterapia en pacientes con cáncer.

Formas de realización adicionales

[0151] Ciertas formas de realización ejemplares de la invención se describen en las reivindicaciones pendientes.

[0152] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más plenamente algunas formas de realización de la invención. Sin embargo, de ninguna manera deben interpretarse como limitantes del amplio alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Ectodominio de NTB-A humano

[0153] Un NTB-A humano que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica a continuación, corresponde al n° de acceso Q96DU3, como sigue;

MLWLFQSLLF VFCFGPGNW SQSSLTPLMV NGILGESVTL PLEFPAGEKV

NFITWLFNET SLAFIVPHET KSPEIHVTNP KQGKRLNFTQ SYSLQLSNLK

MEDTGSYRAQ ISTKTSAKLS SYTLRILRQL RNIQVTNHSQ LFQNMTCELH

LTCSVEDADD NVSFRWEALG NTLSSQPNLT VSWDPRISSE QDYTCIAENA

VSNLSFSVSA QKLCEDVKIQ YTDTKMILFM VSGICIVFGF IILLLLVLRK

RRDSLSLSTQ RTQGPAESAR NLEYVSVSPT NNTVYASVTH SNRETEIWTP

RENDTITIYS TINHSKESKP TFSRATALDN W (SEQ ID NO: 1).

[0154] Se ha identificado que el ectodominio de esta proteína se encuentra en las posiciones 22-226. Por tanto, un ectodominio de NTB-A puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 22-226 en la secuencia humana anterior, o a las posiciones correspondientes en una secuencia de NTB-A conocida en la técnica. Se contempla el uso de variantes, homólogos y derivados de los mismos, que son reconocidos por un experto en la técnica como equivalentes estructurales y funcionales de los mismos (p. ej., sustituciones conservadoras de aminoácidos). Además, se pueden permitir extensiones y/o truncamientos de aminoácidos en cualquiera de los extremos (p. ej., 1-5 aminoácidos o hasta un 5%). Según determinadas realizaciones ventajosas, se excluyen los aminoácidos 1 21. Según algunas otras formas de realización ventajosas, se excluyen los aminoácidos 1-27.

[0155] Por ejemplo, sin limitación, un ectodominio de NTB-A puede comprender las posiciones 22-226 de SEQ ID NO: 1. El ectodominio de NTB-A puede consistir esencialmente en las posiciones 22-226 de SEQ ID NO: 1, o el ectodominio NTB-A puede consistir en las posiciones 22-226 de SEQ ID NO: 1, o el ectodominio de NTB-A puede comprender las posiciones 22-225 de SEQ ID NO: 1, o el ectodominio de NTB-A puede consistir esencialmente en las posiciones 22-225 de SEQ ID NO: 1, o el ectodominio de NTB-A puede consistir en las posiciones 22-225 de SEQ ID NO: 1, o el ectodominio de NTB-A puede comprender las posiciones 28-225 de SEQ ID NO: 1, o el ectodominio NTB-A puede consistir esencialmente en las posiciones 28-225 de SEQ ID NO: 1, o el ectodominio de NTB-A puede consistir en las posiciones 28-225 de SEQ ID n O: 1, o el ectodominio de NTB-A puede comprender las posiciones 28-226 de SEQ ID No : 1, o el ectodominio de NTB-A puede consistir esencialmente en las posiciones 28-226 de SEQ ID NO: 1, o el ectodominio de NTB-A puede consistir en las posiciones 28-226 de SEQ ID NO: 1. Dicho ectodominio NTB-A puede comprender además una etiqueta de epitopo como una etiqueta de polihistidina.

[0156] En los experimentos descritos en los Ejemplos siguientes, se utilizó NTB-A humano recombinante, adquirido de Novoprotein (cat. N° C387). La secuencia de esta proteína corresponde en algunos casos al dominio extracelular de NTB-A humano (posiciones Gln 22 - Met 226 del número de acceso Q96DU3, como se establece en SEQ ID NO: 2), fusionado con una etiqueta de polihistidina en el término C. A menos que se indique lo contrario, a lo largo de los Ejemplos y Figuras, "seSLAMF6" y "sNTB-A" se refieren a esta proteína de fusión recombinante.

[0157] La secuencia utilizada en algunos otros ejemplos como se indica a continuación corresponde a las posiciones Leu 28 - Lys 225 de la adhesión N° Q96DU3 fusionadas con una etiqueta de polihistidina en el extremo C-terminal (SEQ ID NO: 3, como sigue: LMVNGILGES VTLPLEFPAG EKVNFITWLF NETSLAFIVP HETKSPEIHV TNPKQGKRLN FTQSYSLQLS NLKMEDTGSY RAQISTKTSA KLSSYTLRIL RQLRNIQVTN HSQLFQNMTC ELHLTCSVED ADDNVSFRWE ALGNTLSSQP NLTVSWDPRI SSEQDYTCIA ENAVSNLSFS VSAQKLCEDV KIQYTDTKVD HHHHHH).

Ejemplo 2. Unión específica de seSLAMF6

[0158] Para demostrar la unión de seSLAMF6 a su receptor homotípico, se incubaron linfocitos infiltrantes de tumores humanos (TIL) con concentraciones crecientes de seSLAMF6 o con albúmina de suero bovino (BSA, control de proteína irrelevante). Para estos experimentos, se añadieron 200.000 TIL (209) en 100 pl de tampón FACS a cada tubo fAc S. Se agregaron a cada tubo varias concentraciones de sNTB-A (seSLAMF6) o BSA, que variaban de 0 a 30 mg/ml y se incubaron a 4°C durante 45 min. Las muestras se lavaron una vez y se añadieron a cada tubo 10 pl de anticuerpo antiseSLAMF6 conjugado con PE (clon NT-7, Biolegend) o control de isotipo (FIG. 1A). Como control negativo adicional, las muestras también se tiñeron para los receptores CD8 y 2B4 (FIG. 1B). Después de 45 min de incubación a 4°C, las células se lavaron y analizaron mediante citometría de flujo. Como puede verse en las FIGS. 1A-B, seSLAMF6 inhibió completamente la unión de los anticuerpos anti-SLAMF6 a los linfocitos infiltrantes del tumor (A) y no inhibió la unión de los anticuerpos anti-CD8 y anti-2B4 a estos receptores de superficie. Los resultados de estos experimentos demuestran claramente que la actividad de seSLAMF6 está mediada por su unión a SLAMF6.

Ejemplo 3. El acoplamiento de SLAMF6 por seSLAMF6 mejora la supervivencia de las células T anti-melanoma activadas

[0159] Se cocultivaron TILs humanos (209) con células de melanoma afines (624mel) durante 3 días (en una proporción de 1:4, en medio completo con IL-26.000 UI/ml, 37°C, 5% de CO²), y luego se deja proliferar en medio completo (CM) que contiene IL-2 (6000 UI/ml) durante 7 días. Después de la proliferación, IL-2 (6000 UI/ml) se complementó o retiró adicionalmente, y las células se trataron con seSLAMF6 (Se Q ID NO: 3, 10 mg/ml) o BsA (10 pg/ml; ("control"), o permanecieron sin tratar. Las células se marcaron con yoduro de propidio (PI), un marcador de muerte celular, y anexina-V, un marcador de apoptosis, y se analizaron mediante citometría de flujo. La FIG. 2A muestra que la adición de seSLAMF6 redujo la proporción de la muerte celular y apoptosis del 23% al 4%. El efecto de seSLAMF6 era idéntico al de IL-2, que muestra que el compromiso SLAMF6 puede sustituir a IL-2 y prevenir la muerte celular inducida por activación (AICD).

[0160] En un experimento diferente, se cocultivaron TILs humanos (209), reactivos contra 624mel, con el tumor durante 72 horas. Durante los siguientes 7 días, los cultivos se suplementaron con IL-2, 6000 UI/ml (IL-2⁺). A continuación se eliminó IL-2 de los cultivos, las células se lavaron tres veces para eliminar cualquier IL-2 restante y se cultivaron con o sin seSLAMF6 (SEQ ID NO: 2 con una etiqueta de polihistidina) y se compararon con un control de proteínas irrelevante. En otras palabras, seSLAMF6 estaba presente en los cultivos celulares solo durante el estrés, cuando las células estaban privadas de IL-2 durante 4 días. La apoptosis y la muerte celular se evaluaron mediante citometría de flujo. Los resultados se resumen en la Tabla 1 a continuación (los valores representan el % de células Anexina⁺PI⁺de la población total). Los resultados han demostrado que la adición del ectodominio seSLAMF6 compensó completamente la ausencia de IL-2. Este experimento se repitió, con resultados muy similares, 3 veces para TIL 209 y una vez para TIL 431 (TIL de 2 donantes humanos).

Tabla 1 - seSLAMF6 restaura la viabilidad de las células T después de la privación de IL-2. Análisis de citometría de flujo de TIL activados por melanoma suplementados con IL-2 (IL-2+) o privados de la citocina (los valores representan % de células anexina+ PI+ de la población total).

[0161] En un experimento separado los esplenocitos PmeI-1 de ratón (que expresan TCR transgénico contra el melanoma-antígeno gp10025-33) se estimularon con 1 pg/ml péptido afín (gpl0025-33) en CM suplementado con IL-2 (300 UI/ml). Después de 5 días, las células se lavaron y se incubaron durante hasta 96 horas en CM con 0, 300, 3000 UI/ml de IL-2 o con seSLAMF6 (SEQ ID NO: 3) (50 pg/ml). Las células se recolectaron en diferentes momentos y se marcaron con yoduro de propidio (PI) y anexina-V. La muerte se determinó mediante citometría de flujo y se midió la proporción de células vivas (porcentaje de células negativas a PI/anexina-V de toda la población). Los resultados se muestran en la FIG.

2B. Como se puede ver en la figura, seSLAMF6 fue tan eficaz como la concentración más alta de IL-2 (3000 UI/ml) en la prevención de la AICD.

[0162] El REP es un procedimiento de rutina para lograr el número requerido de linfocitos afines al tumor para inmunoterapia mediante transferencia de células adoptivas. En todos los ejemplos, donde se menciona "REP" o "expansión rápida", esto indica la presencia de una etapa de incubación durante 12-14 días en presencia de, entre otros, 30 ng/ml del anticuerpo OKT3 y PBMC irradiadas como células alimentadoras, en una proporción de TIL a PBMC de 1:200 a 1:100.

[0163] En un experimento adicional una población TIL mayor humana (209) se amplió por REP utilizando ya sea CM suplementado con IL-2 (3000 UI/ml) o seSLAMF6 (SEQ ID No : 3) (50 pg/ml). Al final del Re P, las células se lavaron y se incubaron en las siguientes condiciones: sin IL-2 (sin tratamiento), con IL-2 (300 UI/ml) o con seSLAMF6 (50 pg/ml). Las células se recolectaron a los 2, 3 y 7 días, se marcaron con yoduro de propidio (PI) y anexina-V, y se midió la muerte celular mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la FIG. 2C. Como se puede ver en la figura, la adición de seSLAMF6 a las células expandidas por REP-IL-2 (panel izquierdo) redujo la proporción de muerte celular en el día 7 al 11%, en comparación con el 71% en CM y el 45% en IL-2. De manera similar, la adición de seSLAMF6 a las células expandidas por REPseSLAMF6 (panel derecho) redujo la proporción de muerte celular en el día 7 al 11%, en comparación con el 78% en CM y el 52% en IL-2.

Ejemplo 4. Acoplamiento de SLAMF6 por seSLAMF6 mejora la función de las células T anti-melanoma activadas

Producción IFNv:

[0164] Esplenocitos de ratón PmeI-1 se activaron con 1 pg/ml de péptido afín (gp10025-33) en CM suplementado con IL-2 (30 UI/ml). Después de 5 días, las células se dividieron en tres grupos, cada uno de los cuales se cocultivó durante 6 horas con uno de los siguientes objetivos celulares: 1. EL4-OVA, que son células presentadoras de antígeno transfectadas de manera estable con ovoalbúmina (control negativo); 2. Melanoma B16-H2Db (células de melanoma que contienen gp10025-33 con expresión mejorada de MHC de clase I); o 3. EL4 cargado con gp100, que son células presentadoras de antígeno pulsadas con péptido gp10025-33 (control positivo). Cada grupo se dividió además en tres subgrupos: tratamiento con seSI_AMF6 (sNTBA, Se Q ID NO: 3, 50 pg/ml), tratamiento con BSA (50 pg/ml) y células no tratadas.

[0165] Después del co-cultivo de 6 horas se recogieron las células en cada grupo, marcadas con tinción intracelular anti CD8/anti IFNy y sometidas a adquisición y análisis de citometría de flujo. Los resultados se muestran en la FIG. 3A (los datos presentados son un resumen de 3 experimentos independientes). Como se puede ver en la figura, seSLAMF6 (SEQ ID NO: 3) mejoró la producción específica de IFNy por clones de células T: la adición de seSLAMF6 al cocultivo de los esplenocitos de ratón Pmel-1 activados con células diana (melanoma afín o APC pulsadas por péptidos) condujeron a un aumento significativo en el porcentaje de células que producen IFNy (p <0,0001 yp <0,0002, respectivamente).

[0166] En un experimento diferente, la incubación de TIL con sus líneas de células tumorales afines en presencia de seSLAMF6 (Se Q ID NO: 2 con una etiqueta His C') aumentó la producción de IFNy. El 888mel no afín A2 negativo sirvió como control negativo. La adición de seSLAMF6 al cocultivo aumentó la secreción de IFNy entre un 27% y un 133% por encima de la línea de base. No se detectó activación de fondo en ausencia de reconocimiento de melanoma.

Producción de IFNv después de REP:

[0167] En un experimento adicional, se evaluó la producción de IFNy por TIL a granel después de un procedimiento de 12 días de rápida expansión (REP) con seSLAMF6 (SEQ ID NO: 2 con una etiqueta de polihistidina añadida). El procedimiento estándar de suplementación con IL-2 (6000 UI/ml) se comparó con el suministro exclusivo del ectodominio soluble de SLAMF6, 50 pg/ml.

[0168] Después de REP, las células T fueron co-cultivadas durante la noche (o/n) con líneas afines de melanoma (624mel y 526mel) y se midió la secreción de IFN-y. Los resultados se resumen en la Tabla 2 a continuación. Los resultados han demostrado que las células T CD8+ expandidas con seSLAMF6 produjeron niveles notablemente más altos de IFNy después de una incubación o/n con los dos melanomas afines (526mel y 624mel).

Tabla 2 - Los linfocitos que se sometieron al procedimiento de expansión suplementado con seSLAMF6 fueron dotados de una secreción superior de IFN-y (los valores representan pg/ml de IFNy).

Expresión de CD107a (desgranulación lítica):

[0169] Se dividieron los TIL humanos (209) en tres grupos, cada uno expandido rápidamente en una de las siguientes condiciones: medio completo sin IL-2, con IL-2 3.000 Ul/ml o con seSLAMF6 (SEQ ID NO: 3) 50 pg/ml. Después de la expansión, las células se recolectaron y lavaron. Luego, cada grupo se dividió en tres subgrupos: dos cocultivados durante 1,5 horas con uno de los siguientes objetivos de células de melanoma afines: 526mel o 624mel, y uno cocultivado con 888mel, un desajuste de HLA, para evaluar la actividad de fondo.

[0170] Después del co-cultivo, las células se tiñeron con anti-CD8 y anti-CD107a. CD107a (LAMP-1) es una proteína de membrana lisosomal. Su expresión superficial se evaluó aquí como un marcador de desgranulación lítica. Los resultados se muestran en la FIG.3B para células 526mel. Como puede verse en la figura, REP con seSLAMF6 produjo TIL humanos con un aumento de aproximadamente 2 veces en la capacidad de desgranulación. Se obtuvieron resultados similares para células 624mel.

[0171] En un experimento adicional un reactivo de clon de células T CD8+ humanas contra epítopo gp100209-217 se activó mediante unido a la placa anti-CD3 durante 3 días en medio completo suplementado con 300 U/ml de IL-2, 50 pg/ml seSLAMF6 (SEQ ID NO: 3), o ambos. Al final del período de activación, las células se cultivaron conjuntamente con dianas de melanoma compatibles con HLA-A2 (624mel, 526mel) o irrelevantes (888mel) durante 1,5 horas. El nivel de CD107a, un marcador para la liberación de gránulos citotóxicos, se midió mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la FIG. 3C. Como puede verse en la figura, seSLAMF6 solo o en combinación con IL-2 fue superior a IL-2 solo en el aumento de la capacidad de desgranulación de las células T.

Muerte celular:

[0172] Un reactivo de clon de células T CD8+ humano contra epítopo gp100209-217 se activó con unido a la placa anti-CD3 durante 5 días en CM con 1 pg/ml de OKT3 solo (sin tratamiento) o complementado con 300 U/ml de IL-2, 50 pg/ml de seSLAMF6 (SEQ ID NO: 3) o ambos. Al final del período de activación, las células se cultivaron conjuntamente con dianas de melanoma con compatibilidad HLA-A2 (624mel, 526mel) o irrelevante (888mel) marcadas con DDAO-SE durante 1,5 horas. El nivel de caspasa-3 escindida intracelular, un marcador temprano de apoptosis, se midió en células de melanoma mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la FIG. 3D. Como puede verse en la figura, seSLAMF6 solo o en combinación con IL-2 fue superior a IL-2 solo para mejorar la destrucción de células de melanoma.

Ejemplo 5. El acoplamiento de SLAMF6 por seSLAMF6 regula positivamente la expresión de marcadores de activación

[0173] Los TIL humanos se expandieron rápidamente en las siguientes condiciones: medio completo sin IL-2, IL-23.000 UI/ml o seSLAMF6 (SEQ ID NO: 3) 50 pg/ml. Después de la expansión, las células se recolectaron, lavaron y cocultivaron durante la noche con dianas de melanoma 526mel y 624mel (melanoma afín) y 888mel (desajuste de HLA, para evaluar la actividad de fondo). Después de la incubación durante la noche, las células se recolectaron, se tiñeron con el siguiente panel de anticuerpos: anti-CD8/anti-GITR/anti-PD-1/anti-41BB/anti-2B4 y se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la FIG. 4 (los datos presentados son para células cocultivadas con la diana 526mel). Como puede verse en la figura, seSLAMF6 REP produjo el porcentaje más alto de linfocitos que expresaban los marcadores inducidos por activación probados.

[0174] En un experimento diferente con la misma configuración que el anterior, se midió el efecto de la expansión rápida usando seSLAMF6 (SEQ ID NO 2 con una etiqueta de polihistidina añadida) sobre la expresión del marcador de activación de 4-1BB (CD137). Los resultados se resumen en la Tabla 3 a continuación (los valores representan el % de células CD8+ 4-1BB+ de la población total). Los resultados han demostrado que la incubación o/n con dos melanomas afines (526mel y 624mel) duplicó el número de células que expresan 4-1BB en respuesta al tumor usando seSLAMF6 para REP, en comparación con el uso estándar de IL-2.

Tabla 3 - El procedimiento de expansión rápida complementado con seSLAMF6 duplicó el porcentaje de linfocitos capaces de ser activados por células de melanoma afines. Análisis de citometría de flujo de linfocitos expandidos (los valores representan el % de células CD8+ 4-1BB+ de la población total).

Ejemplo 6. La participación de SLAMF6 por seSLAMF6 se puede utilizar para expandir TIL con la misma eficiencia de IL-2.

[0175] Siete (7) poblaciones de TIL diferentes (TIL 431 f (3), TIL 209 nuevo, TIL 412 (11.09,12), Clon # 4 (209) 13,4,14, Bulk 412, Clon # 1 (209), Clon # 4 (209) 10,6,14) fueron expandidos por REP en medio completo usando IL-2 (3,0oOIU/ml) o seSLAMF6 (SEQ ID NO: 3, 10 |jg/ml). Se contaron las siguientes células de expansión y se comparó el número final de células con el número de células inicial. Los resultados se muestran en la FIG. 5 (presentados como un aumento de veces en el número de células). Como puede verse en la figura, seSLAMF6 expandió las células sustancialmente con la misma eficacia que IL-2.

Ejemplo 7. El acoplamiento de SLAMF6 por seSLAMF6 durante REP produce un porcentaje más alto de células T CD8 específicas de melanoma.

[0176] La población de TIL en masa descrita en el Ejemplo 6 se analizó adicionalmente para el porcentaje de subconjunto reactivo de gp100154-162 entre los linfocitos CD8⁺totales. Después de REP, las células se recolectaron, se marcaron con anti-CD8 y tetrámero de gp100154 (Immudex) y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la FIG. 6. Como puede verse en la figura, seSLAMF6 produjo un mayor porcentaje de linfocitos reactivos a gp100154-162 en comparación con IL-2.

Ejemplo 8. Inhibición del crecim iento de melanoma por TIL anti-melanoma expandidos con seSLAMF6

[0177] Se activó un clon de células T CD8⁺anti gp100^209-217humano con anti-CD3 unido a placa durante 5 días en CM suplementado con 300 U/ml de IL-2 o 50 jg/m l de seSLAMF6. La población de células activadas se usó en un ensayo de Winn: se inyectaron ratones atímicos FoxnT^/_(desnudos) por vía subcutánea (SC) con 1 x 10⁶células de melanoma humano 526mel. Antes de la inyección, las células de melanoma se mezclaron con CM (control), TIL humanas anti-gplOO cultivadas con IL-2, o TIL humanas anti-gplOO cultivadas con seSLAMF6. El crecimiento del tumor se controló 3 veces por semana durante 20 días. (n = 5 por grupo). Los resultados se muestran en la FIG. 7. Como puede verse en la figura, los TIL expandidos con seSLAMF6 inhibieron completamente el crecimiento del melanoma durante el período de seguimiento. Se observaron resultados similares para los TIL expandidos con IL-2.

Ejemplo 9. seSLAMF6 se sinergiza con la ligación 4-1BB (CD137) en la producción de IFN- y por clones de células T.

[0178] En los experimentos descritos a continuación, el melanoma 624mel fue transfectado para expresar 4-1BBL o moctransfectados se co-cultivaron con clones de células T de reactivos MART-1^27-35. Como control, los clones de células T reactivas a MART-1^27-35se cocultivaron con un melanoma irrelevante (mel888). Se midió la secreción de IFNy de las células T y los resultados se resumen en la Tabla 4 a continuación. La Tabla 4 presenta datos que demuestran que este efecto (secreción de IFNy) aumenta notablemente cuando el melanoma expresa 4-1BBL.

Tabla 4 - Secreción de IFNy de linfocitos infiltrantes de tumores reactivos a MART-1^27-35co-cultivados con células de melanoma que expresan 4-1BBL (mel624/4-1BBL), melanoma moc transfectado (mel624/moc) y melanoma irrelevante (mel888), después de la incubación en CM (medio completo), BSA (albúmina de suero bovino, utilizada como control) y seSLAMF6 (los valores representan pg/ml de IFNy).

Ejemplo 10. El acoplamiento de SLAMF6 por el ectodominio soluble aumenta los marcadores de activación en las células T CD8 dependiendo del reconocimiento específico de TCR de las células de melanoma.

[0179] La Tabla 5 a continuación demuestra que el ectodominio SLAMF6 aumenta la expresión de 4-1BB en linfocitos CD8+ activados de tres donantes después de un cocultivo durante la noche después de 6, 16 y 24 horas de cocultivo con dos líneas celulares de melanoma de una manera dependiente de TCR.

Tabla 5: seSLAMF6 aumenta significativamente la expresión de 4-1BB en TIL: Análisis de citometría de flujo de la expresión de 4-1BB (CD137) en TIL después de la incubación con líneas de melanoma (los valores representan el % positivo del total de células CD8+).

[0180] Dos líneas celulares de melanoma HLA-A2+ (526 y 624) y una línea de contro1HLA-A2-(888) se incubaron con tres reactivos TIL de A2+ MART-1 (209, 412, 431) o con un control de TIL (470) en CM (medio completo), BSA (albúmina de suero bovino, utilizada como control) y ectodominio soluble de SLAMF6. En la mayoría de los casos, seSLAMF6 aumentó significativamente la expresión de 4-1BB en TIL (valores subrayados).

Ejemplo 11. El ectodominio soluble de SLAMF6 protege contra la muerte celular inducida por activación de células T CD8+ después de la irradiación.

[0181] El ensayo utilizado para medir la protección contra la activación inducida por la muerte celular (la supervivencia de células T) se realizó como sigue. Un millón de TIL se activaron por cocultivo con 250.000 melanomas emparejados con 624mel HLA en placas de 24 pocillos con 2 ml de medio de cultivo (CM) durante 3 días. En este momento, todas las células de melanoma murieron, por lo tanto, solo quedaron TIL en los cultivos. No se añadió IL-2 durante la fase de activación. Los TIL se expandieron en presencia de 6000 unidades/ml de IL-2 durante 7-9 días. Se reemplazó un medio de ml por CM reciente cada 1-2 días. Las células se transfirieron a placas de 12 y 6 pocillos según la expansión de la población. Las células se lavaron tres veces con PBS para eliminar cualquier IL-2 restante y se expusieron a choque: irradiación a varias dosis y análisis después de 24 h. A continuación, las células se tiñeron con PI y anexina V y se analizaron mediante citometría de flujo. seSLAMF6 se agregó en diferentes puntos de tiempo de acuerdo con las tres etapas experimentales (activación, expansión, choque) para evaluar su influencia general en la supervivencia de las células T y para determinar la etapa. 6IL-2 se refiere a la presencia de IL-2 durante la fase de choque. Para medir la apopotosis, se usó el kit de detección de apoptosis anexina V (eBioscience n° 88-8007) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se lavaron con PBS y con tampón de unión. Se añadieron 5 pl de tinte de Anexina V 100 pl de tampón de unión a cada tubo seguido de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de un lavado adicional, se añadieron a cada tubo 5 pl de colorante PI 200 ul de tampón de unión, y las células se analizaron mediante citometría de flujo en 4 horas.

El ectodominio soluble de SLAMF6 protege contra la muerte inducida por irradiación de las células PBMC.

[0182] En estos experimentos, se recubrieron placas de cultivo de 6 pocillos con 1 pg de anti-CD3 (OKT3) y 1 pg de anti-CD28 en 1 ml de PBS por pocillo a 4°C durante la noche. Se eliminó el PBS y se bloquearon los pocillos con 2 ml de CM durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron por pocillo 107 PBMC en 5 ml de CM con 300 unidades de IL-2/ml. Se permitió que las células se activaran durante 3 días y luego se añadió IL-2 cada dos días durante 7 días adicionales. Se reemplazó CM y las células se dividieron según fue necesario. Las células se lavaron 3 veces para eliminar la IL-2 restante y se suspendieron en CM fría. Los tubos se mantuvieron en hielo, se irradiaron a dosis de irradiación crecientes y se lavaron inmediatamente después de la irradiación con CM reciente. Al medio reciente se le añadieron 10 pg/ml de seSLAMF6 o BSA (control). 24 horas después, las células se tiñeron con Anexina V & PI. Se evaluaron PBMC de dos donantes humanos. La apoptosis y la muerte celular se evaluaron mediante citometría de flujo. Los resultados se resumen en la Tabla 6 a continuación (los valores representan el % de células Anexina+ PI+ de la población total). Los resultados han demostrado que la adición del ectodominio SLAMF6 compensó los efectos dañinos de la irradiación a la misma intensidad que la IL-2. SeSLAMF6 protege las PBMC humanas contra el daño causado por dosis crecientes de irradiación. El efecto de supervivencia ejercido por seSLAMF6 se asemeja al efecto ejercido por IL-2. Este experimento se repitió con PBMC de dos donantes humanos, con resultados muy similares.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite, en donde dicho sujeto padece un tumor caracterizado por la falta de una expresión superficial sustancial de NTB-A, y en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

2. El ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para su uso según la reivindicación 1, en donde el ectodominio de NTB-A es el ectodominio de NTB-A humano.

3. El ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para su uso según la reivindicación 1, en donde dicho tumor es un tumor sólido.

4. El ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para uso según la reivindicación 1, en donde IL-2 no se administra exógenamente a dicho sujeto.

5. Un ectodominio de NTB-A aislado o agonista del mismo para su uso en la reducción o inhibición de la muerte de células T in vivo después de inmunoterapia de transferencia adoptiva diseñada para aliviar o mejorar el desarrollo de síntomas de cáncer o una enfermedad infecciosa, donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

6. Un método in vitro para reducir o inhibir la muerte de células T, que comprende poner en contacto células T con una cantidad eficaz del ectodominio de NTB-A aislado o agonista del mismo in vitro, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

7. Un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para su uso en el tratamiento o prevención de la citopenia en un sujeto que lo necesite, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

8. El ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para su uso según la reivindicación 7,

en donde la citopenia está asociada con radiación o quimioterapia; o

en donde dicho sujeto no padece enfermedad linfoproliferativa ligada a X (XLP); o en donde el ectodominio de NTB-A es el ectodominio de NTB-A humano.

9. El ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para uso según la reivindicación 7, para el tratamiento o prevención de linfocitopenia.

10. El ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo para su uso según la reivindicación 7, en donde dicho sujeto no padece cáncer.

11. Un método para preparar una composición celular adaptada para inmunoterapia de transferencia adoptiva, que comprende:

incubar ex vivo una población de células que contiene linfocitos T que comprenden linfocitos T CD8+ con una cantidad eficaz de un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo, y

además comprende proporcionar la población de células con una estimulación del receptor de células T (TCR), en donde dicha población de células que contiene células T se incuba con el ectodominio de NTB-A aislado o agonista del mismo en presencia de la estimulación de TCR y células alimentadoras y sin la adición de IL-exógena 2, y en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTB-A.

12. El método de la reivindicación 11,

en donde la incubación con el ectodominio o agonista de NTB-A se realiza para regular al alza la expresión de CD137 en células T; o

en donde la incubación se realiza en presencia de ligando CD137 exógeno o un agonista del mismo.

13. Una composición farmacéutica que comprende una combinación terapéutica de

1) un ectodominio de NTB-A aislado o un agonista del mismo, en donde el agonista es un anticuerpo específico para un ectodominio de NTBA,

2) un polipéptido que comprende el ligando de CD137 o un agonista del mismo y opcionalmente

3) un portador farmacéuticamente aceptable.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, que comprende ectodominio de NTB-A humano, ligando de CD137 humano y/o un anticuerpo agonista dirigido contra ectodominio de NTB-A humano o CD137 humano.