ES2894477T3

ES2894477T3 - Método para producir factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) activo

Info

Publication number: ES2894477T3
Application number: ES17766718T
Authority: ES
Inventors: Masashi Shimizu; Toshitaka Sato; Yoshihisa Arita
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2022-02-14
Anticipated expiration: 2037-03-15
Also published as: IL261066A; SG11201806843UA; RU2018130530A3; US20190062390A1; AU2017232582B2; US11548926B2; LT3431590T; CN109196099A; MX2018010283A; CN109196099B; HUE055414T2; EP3431590A1; JPWO2017159722A1; DK3431590T3; RU2018130530A; RU2747977C2; CA3014567A1; AU2017232582A1; EP3431590A4; CA3014567C

Abstract

Un método para producir activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA) activo, caracterizado por que comprende: Etapa 1: una etapa de obtener un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA, cultivando células de mamífero que expresan activador del factor de crecimiento de hepatocitos (pro-HGFA) inactivo en un medio sin suero, y Etapa 2: una etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA obtenido en la etapa anterior para convertir pro-HGFA en HGFA activo, caracterizado por que dicha etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo es una etapa de ajustar el pH a 4.0 - 6.0.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) activo

Campo Técnico

La presente invención se refiere a un método para producir activador de factor de crecimiento de hepatocitos activo (al que se alude también en la presente como “HGFA activo”) y factor de crecimiento de hepatocitos activo (al que se alude también en la presente como “HGF activo”) sin utilizar suero animal.

Técnica de Antecedentes

HGF es un factor que tiene una actividad de proliferación de células parenquimales hepáticas que se purifica a partir de plasma sanguíneo de pacientes de hepatitis fulminante humana (Bibliografía de Patente 1 y Bibliografía No de Patente 1), y se ha reseñado que tiene diversos efectos farmacológicos tales como un efecto antitumoral, potenciación de la inmunidad mediada por células, efecto terapéutico de heridas, efecto promotor de la regeneración de tejidos (Bibliografía de Patente 2).

Hasta ahora, el gen que codifica el HGF antes mencionado ha sido clonado y producido mediante tecnología de ADN recombinante (Bibliografías de Patente 3-5). Además, es sabido que HGF adopta formas de cadena sencilla y de doble cadena que están compuestas por 2 tipos de subunidades (cadena a de aproximadamente 60 kDa y cadena p de aproximadamente 30 kDa), en que la forma de cadena sencilla no tiene bioactividad y adquiere bioactividad en la forma de doble cadena. Además, es sabido que en la producción mediante tecnología de ADN recombinante, HGF se puede obtener como la forma activa de doble cadena, en el cultivo con suero animal, pero en cultivo sin suero animal, la mayoría del HGF producido se obtiene como la forma de cadena sencilla inactiva (p. ej., Bibliografía de Patente 6). Dado que una proteasa contenida en suero animal está implicada en la conversión de la forma inactiva de factor de crecimiento de hepatocitos de cadena sencilla (al que se alude también en la presente como “pro-HGF”) en la forma activa de HGF de doble cadena, se piensa que es necesario utilizar suero animal con el fin de obtener eficazmente HGF activo.

Por otra parte, en los últimos años, con el fin de evitar el riesgo de la contaminación viral, etc., la corriente principal en la producción de material biológico por tecnología de ADN recombinante es el cultivo sin suero animal. Por consiguiente, con el fin de producir HGF activo con un medio sin suero animal, es necesario convertir por algunos medios el pro-HGF de cadena sencilla en un HGF activo. HGFA que puede convertir pro-HGF en HGF activo (Bibliografía de Patente 7) o serina proteasa tal como activador de plasminógeno del tipo uroquinasa (Bibliografía no de Patente 2) son conocidos como medios de este tipo. Sin embargo, existen problemas de que estas enzimas que pueden convertir pro-HGF en HGF activo se derivan de suero, y cuando se requieren para producir células mediante integración del gen en microorganismos o células animales para la producción, se producen como las formas precursoras en un cultivo exento de suero y, por lo tanto, son difíciles de utilizar tal como son.

Lista de Citas

Bibliografías de Patente

[Bibliografía de Patente 1] Publicación de Solicitud de Patente Japonesa No examinada Publicada N° S63-22526 [Bibliografía de Patente 2] Patente Japonesa N° 2747979

[Bibliografía de Patente 3] Patente Japonesa N° 2577091

[Bibliografía de Patente 4] Patente Japonesa N° 2859577

[Bibliografía de Patente 5] Patente Japonesa N° 3072628

[Bibliografía de Patente 6] Patente Japonesa N° 3213985

[Bibliografía de Patente 7] Publicación de Solicitud de Patente Japonesa No examinada Publicada N° H5-103670 Bibliografías No de Patente

[Bibliografía No de Patente 1] J. Clin. Invest., 81,414(1988)

[Bibliografía No de Patente 2] JGH 26(2011) Supl. 1; 188-202, pág. 192

Sumario de la Invención

Problemas a Resolver por la Invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir HGFA activo y HGF activo sin utilizar suero animal.

El otro objeto de la presente invención es proporcionar HGFA activo, HGF activo y preparaciones de los mismos, producidos por el método de la presente invención.

Medios para Resolver los Problemas

Como resultado de una amplia investigación por parte de los autores de la presente invención para resolver los problemas anteriores, se encontró que cultivando células de mamífero que expresan activador del factor de crecimiento de hepatocitos inactivo (pro-HGFA) en un medio sin suero para obtener el sobrenadante del cultivo del mismo, y someter el sobrenadante del cultivo antes mencionado a un tratamiento particular, pro-HGFA contenido en el sobrenadante del cultivo antes mencionado se puede convertir en HGFA activo. Por consiguiente, dado que pro-HGF producido bajo cultivo sin suero animal se puede convertir en HGF activo mediante HGFA activo producido de manera similar bajo cultivo sin suero animal, se puede producir HGF activo que no contiene componente derivado de suero animal o una preparación que comprende el mismo.

Por consiguiente, la presente invención abarca los siguientes aspectos:

[1] Un método para producir activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA) activo, caracterizado porque comprende:

Etapa 1:

una etapa de obtener un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA, cultivando células de mamífero que expresan activador del factor de crecimiento de hepatocitos (pro-HGFA) inactivo en un medio sin suero, y Etapa 2:

una etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA obtenido en la etapa anterior para convertir pro-HGFA en HGFA activo.

[2] El método de producción de acuerdo con [1], caracterizado porque dicha etapa comprende, además, añadir polisacáridos sulfatados a dicho sobrenadante del cultivo.

[3] El método de producción de acuerdo con [1] o [2], caracterizado porque dicha etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo es una etapa de ajustar el pH a 4.0 - 6.0.

[4] El método de producción de acuerdo con cualquiera de [1] a [3], caracterizado porque dicha etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo se realiza a una temperatura de 15 - 40°C.

[5] El método de producción de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], caracterizado porque dicho sobrenadante del cultivo se obtiene tras una disminución en la tasa de supervivencia de células de mamífero en cultivo.

[6] El método de producción de acuerdo con cualquiera de [1] a [5], caracterizado porque dicha célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

[7] El método de producción de acuerdo con cualquiera de [1] a [6], caracterizado porque dicho pro-HGFA tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2.

[8] El método de producción de acuerdo con cualquiera de [1] a [7], caracterizado porque dicho sobrenadante del cultivo es dicho sobrenadante del cultivo per se, una dilución de dicho sobrenadante del cultivo, un concentrado de dicho sobrenadante del cultivo o un producto parcialmente purificado de dicho sobrenadante del cultivo.

[9] HGFA activo, caracterizado porque se obtiene por el método de producción de acuerdo con cualquiera de [1] a [8].

[10] Un método para la producción de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) activo, caracterizado porque comprende una etapa de dejar que HGFA activo actúe sobre un sobrenadante del cultivo que comprende factor de crecimiento de hepatocitos (pro-HGF) inactivo, para convertir dicho pro-HGF en HGF activo,

en donde

dicho sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF es un sobrenadante del cultivo obtenido al cultivar células que expresan pro-HGF en un medio sin suero, y

dicho HGFA activo se produce por el método de acuerdo con cualquiera de [1] a [8].

[11] El método de producción de acuerdo con [10], caracterizado porque dicho medio para cultivar células que expresan pro-HGF es un medio sin cualesquiera componentes derivados de animales.

[12] El método de producción de acuerdo con [10] u [11], caracterizado porque dicho pro-HGF tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1.

[13] HGF activo, caracterizado porque se obtiene por el método de producción de acuerdo con cualquiera de [10] a [12].

Los expertos en la técnica reconocerán que una invención de cualquier combinación de una o más características de la presente invención arriba descrita está también abarcada por el alcance de la presente invención.

Efectos de la Invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para producir HGFA activo y HGF activo sin utilizar suero animal.

En el método para de producir el HGF activo de la presente invención, dado que no hay necesidad de utilizar suero animal en su procedimiento de producción, una composición que comprende e1HGF activo obtenido por el método de producción antes mencionado no comprende componente derivado de suero animal y puede ser aplicada de manera extremadamente segura al ser humano.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 muestra que un sobrenadante del cultivo de HGFA, preparado por activación de un sobrenadante del cultivo de pro-HGFA, activa pro-HGF en un sobrenadante del cultivo derivado de células CHO que comprenden pro-HGF.

La Figura 2 muestra el resultado de la verificación empleando el diseño de experimentos (DoE) en relación con condiciones bajo las cuales se activa el sobrenadante del cultivo de pro-HGFA.

La Figura 3 muestra la SDS-PAGE después de purificación cromatográfica que emplea un intercambiador de aniones multimodal Capto Adhere como el soporte de cromatografía y tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 0.25 M y arginina 0.7 M como el eluyente.

La Figura 4 muestra la SDS-PAGE después de purificación cromatográfica que emplea un intercambiador de aniones multimodal Capto Adhere como el soporte de cromatografía y tampón T ris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 1 M como el eluyente.

La Figura 5 muestra los resultados de SDS-PAGE no reductiva y reductiva del producto purificado en cada una de las fases de purificación, en que una purificación similar al Ejemplo 5 se realizó con un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF que no es activado por un sobrenadante del cultivo de HGFA.

La Figura 6 muestra el resultado de medir la actividad de proliferación celular en presencia de TGFp para HGF purificado, obtenido en el Ejemplo 5.

Descripción

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

La referencia en la presente a “factor de crecimiento de hepotocitos activo (HGF activo)”, a menos que explícitamente se indique de otro modo, se interpreta como aludiendo a la forma de HGF activado de doble cadena, y se utiliza en la discriminación con factor de crecimiento de hepotocitos inactivo (pro-HGF), que es la forma inactiva de cadena sencilla de la misma.

En el método de la presente invención, HGF puede comprender HGF derivado de seres humanos, ratones, ratas, conejos, u otros animales. En la presente invención, HGF es preferiblemente HGF derivado de seres humanos. En el método de la presente invención, HGF humano (hHGF) incluye un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 o una variante de la misma. Una variante del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 incluye un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una adición, deleción o sustitución de uno o múltiples aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1, así como que tiene una actividad de HGF similar al o mayor que el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 o que puede ser activado para que tenga la actividad. “Múltiple”, tal como se utiliza en la presente, es 2 - 150, más preferiblemente 2 - 80, más preferiblemente 2 - 70, más preferiblemente 2 - 60, más preferiblemente 2 - 50, más preferiblemente 2 - 40, más preferiblemente 2 - 30, más preferiblemente 2 - 20, más preferiblemente 2 - 10 o más preferiblemente 2 - 5.

Una variante del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 incluye también un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, y más preferiblemente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1, así como que tiene una actividad de HGF similar al o mayor que el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 o que puede ser activado para que tenga la actividad.

Una variante del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 incluye también un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1, así como que tiene una actividad de HGF similar al o mayor que el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1 o que puede ser activado para que tenga la actividad.

En la presente invención, una “condición rigurosa” puede incluir aquellas en las que en el lavado post-hibridación, la hibridación se consigue con lavado a, por ejemplo, una condición de "2 X SSC, SDS al 0.1%, 50°C," una condición de "2 X SSC, SDS al 0.1%, 42°C," o una condición de "1 X SSC, SDS al 0.1%, 37°C", y una condición más rigurosa puede incluir aquellas en las que la hibridación se consigue con lavado a, por ejemplo, condiciones de "2 X SSC, SDS al 0.1%, 65°C," "0.5 X SSC, SDS al 0.1%, 42°C," "0.2 X SSC, SDS al 0.1%, 65°C", o "0.1 X SSC, SDS al 0.1%, 65°C" (1 X SSC es cloruro sódico 150 mM, citrato de sodio 15 mM, pH 7.0). Más particularmente, como un método que emplea tampón Rapid-hyb (Amersham Life Science), se puede concebir realizar la prehibridación a 68°C durante 30 minutos 0 más, después de lo cual se añade una muestra y se mantiene a 68°C durante 1 hora o más para permitir la formación de híbridos, y luego realizar tres lavados en 2 X SSC y SDS al 0.1% a temperatura ambiente durante 20 minutos, tres lavados en 1 X SSC y SDS al 0.1% a 37°C durante 20 minutos y, finalmente, dos lavados en 1 X SSC y SDS al 0.1% a 50°C durante 20 minutos. Más preferiblemente, utilizando una solución, por ejemplo, que comprende SSC 5 X, SDS al 7% (P/V), 100 ^g/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y solución Denhardt 5 X (solución Denhardt 1 X que comprende polivinilpirrolidona al 0.2%, albúmina de suero bovino al 0.2% y Ficoll al 0.2%) como soluciones de prehibridación e hibridación, la prehibridación se realiza a 65°C durante 30 minutos a 1 hora y la hibridación se realiza a la misma temperatura durante la noche (6 - 8 horas). Además, también es posible realizar la prehibridación, por ejemplo, en Solución de Hibridación Expresshyb (CLONTECH) a 55°C durante 30 minutos o más, añadir una sonda marcada e incubar a 37 - 55°C durante 1 hora o más y tres lavados en SSC 2 X y SDS al 0.1% a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego un lavado en SSC 1 X y SDS al 0.1% a 37°C durante 20 minutos. Aquí, una condición más rigurosa se puede conseguir, por ejemplo, elevando la temperatura para la prehibridación, hibridación o segundo lavado. Por ejemplo, la temperatura para la prehibridación e hibridación puede ser 60°C o 65°C o 68°C para una condición rigurosa adicional. Los expertos en la técnica serán capaces de establecer condiciones para obtener isoformas, variantes alélicas y genes correspondientes derivados de otras especies de organismos para el gen de la presente invención al factorizar en diversas condiciones tales como otra concentración de la sonda, longitud de la sonda y tiempo de reacción, además de condiciones tales como la concentración salina de un tampón de este tipo y la temperatura. Para un protocolo detallado del método de hibridación, se puede hacer referencia a "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a ed." (Cold Spring Harbor Press (1989); en particular, Sección 9.47-9.58), "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997); en particular Sección 6.3-6.4), "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2a ed." (Oxford University (1995); en particular, Sección 2.10 para las condiciones), y similares.

La referencia en la presente a “activador del factor de crecimiento de hepotocitos activo (HGFA activo) usado en el método de la invención”, a menos que explícitamente se indique de otro modo, se interpreta como aludiendo a HGFA activado, y se utiliza en la discriminación con activador del factor de crecimiento de hepotocitos inactivo (pro-HGFA), que es la forma inactiva del mismo.

En el método de la presente invención, HGFA puede incluir HGFA derivado de ser humano, ratón, rata, conejo, u otros animales. En la presente invención, HGFA es preferiblemente HGFA derivado de seres humanos.

En el método de la presente invención, HGFA humano incluye un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 o una variante de la misma. La variante del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 incluye un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una adición, deleción o sustitución de uno o múltiples aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2, así como que tiene una actividad de HGF similar al o mayor que el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 o que puede ser activado para que tenga la actividad. “Múltiple”, tal como se utiliza en la presente, es 2 - 150, más preferiblemente 2 - 80, más preferiblemente 2 - 70, más preferiblemente 2 -60, más preferiblemente 2 - 50, más preferiblemente 2 - 40, más preferiblemente 2 - 30, más preferiblemente 2 - 20, más preferiblemente 2 - 10 o más preferiblemente 2 - 5.

La variante del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 incluye también un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, y más preferiblemente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2, así como que tiene una actividad de HGFA similar al o mayor que el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 o que puede ser activado para que tenga la actividad.

La variante del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 incluye también un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2, así como que tiene una actividad de HGF similar al o mayor que el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2 o que puede ser activado para que tenga la actividad.

La presente invención se describe en detalle a continuación.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir y HGFA activo sin utilizar suero animal. Específicamente, el método para producir el HGFA activo de la presente invención es un método para producir HGFA activo al someter a un tratamiento dado a un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA expresado de forma recombinante en células de mamíferos para permitir con ello la conversión en HGFA activo. Dado que el suero animal no se utiliza en la conversión en HGFA activo, de acuerdo con el presente método, el pro-HGFA obtenido o una composición que comprende el mismo tiene significativamente menos posibilidad de invitar al riesgo de ser contaminado con materiales infecciosos tal como virus derivado de células de otras especies animales u otros individuos, y se puede emplear para diversos fines como un material biológico altamente seguro.

Específicamente, en una realización, el método para producir el HGFA activo de la presente invención se caracteriza porque comprende las siguientes etapas:

Etapa 1:

una etapa de obtener un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA, cultivando células de mamífero que expresan pro-HGFA en un medio sin suero, y

Etapa 2:

En otra realización, el método de producción de HGFA de la presente invención se caracteriza porque comprende una etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA para convertir pro-HGFA en HGFA activo, en el que dicho sobrenadante del cultivo es un sobrenadante del cultivo obtenido al cultivar células de mamífero que expresan pro-HGFA en un medio sin suero.

La acidificación débil del sobrenadante del cultivo es un tratamiento para convertir pro-HGFA en HGFA activo. Dado que la conversión de pro-HGFA en HGFA activo se produce por débil acidificación sola sin añadir externamente enzimas, etc. al sobrenadante del cultivo, se piensa que componentes derivados de células de mamífero están implicados en la conversión de pro-HGFA en HGFA activo, y una débil acidificación es un medio para activar dichos componentes derivados de células de mamífero. La débil acidificación se puede realizar por medios bien conocidos por los expertos en la técnica, tal como añadir, por ejemplo, una solución de carácter ácido (ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido succínico y ácido cítrico) a una concentración apropiada. En una realización de la presente invención, “carácter débilmente ácido” es un intervalo de pH 4.0 - 6.0, preferiblemente 5.0 - 6.0 y más preferiblemente 5.3 - 5.6, por ejemplo pH 5.5.

En el método de la presente invención, un “sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA” (al que también se alude en la presente como un “sobrenadante del cultivo de pro-HGFA”) es una fracción que comprende pro-HGFA que se obtiene cultivando células de mamífero que expresan pro-HGFA, que se puede obtener de un cultivo celular de dichas células de mamífero por parte de los expertos en la técnica de acuerdo con medios convencionales. Por ejemplo, el sobrenadante del cultivo de pro-HGFA puede ser una fracción en que se separan residuos de un cultivo celular de dichas células de mamífero por medios tales como centrifugación.

En el método de la presente invención, el sobrenadante del cultivo puede ser cualquier fracción preparada al aplicar cualquier tratamiento al sobrenadante del cultivo en una medida que no se pierda la actividad biológica de pro-HGFA. Por consiguiente, en la presente invención el sobrenadante del cultivo incluye, pero no se limita al sobrenadante del cultivo per se, y una dilución, un concentrado o un producto parcialmente purificado del sobrenadante del cultivo.

En una realización preferida de la presente invención, la “etapa de convertir pro-HGFA en HGFA activo” comprende, además, añadir polisacáridos sulfatados a dicho sobrenadante del cultivo. Al añadir polisacáridos sulfatados, la conversión de pro-HGFA en HGFA activo se puede realizar de manera más eficaz. El momento para añadir polisacáridos sulfatados puede ser en cualquier instante de antes de la débil acidificación de dicho sobrenadante del cultivo, simultáneamente con la débil acidificación o después de la débil acidificación. Además de ello, la cantidad de polisacáridos sulfatados añadida puede variar dependiendo, p. ej., del tipo de polisacáridos sulfatados utilizados, y estos se pueden añadir en una cantidad de 0.01 - 50 mg, más preferiblemente 0.1 - 20 mg, por ejemplo 1 mg por cada 1 mL de dicho sobrenadante del cultivo de pro-HGFA.

Polisacáridos sulfatados que se pueden utilizar para el método para producir e1HGFA activo de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a peparina, sulfato de dextrano, sulfato de condroitina, fucoidano, y sales de los mismos. En una realización preferida de la presente invención se utiliza sulfato de dextrano.

En una realización preferida de la presente invención, la “etapa de convertir pro-HGFA en HGFA activo” se realiza a una temperatura de 15 - 40°C, preferiblemente 20 - 37°C, por ejemplo 25°C. Al emplear dicho intervalo de temperaturas, la conversión de pro-HGFA en HGFA activo se puede realizar de manera más eficaz.

En el método para producir el HGFA activo de la presente invención, la “etapa de convertir pro-HGFA en HGFA activo” se realiza durante un periodo de tiempo suficiente para reconocer la actividad de HGFA deseada tras la débil acidificación. Dicho periodo de tiempo puede variar dependiendo del pH, de la presencia o ausencia de polisacárido sulfatado utilizado en combinación y de la condición de temperatura, etc., y puede ser de 1 - 15 horas, por ejemplo 6 - 8 horas después de la débil acidificación.

En una realización de la presente invención, el sobrenadante del cultivo de pro-HGFA es un sobrenadante del cultivo que se obtiene tras una disminución en la tasa de supervivencia de células de mamífero en cultivo. Junto con la disminución en la tasa de supervivencia de las células de mamífero, los componentes derivados de células animales, implicados en la conversión de pro-HGFA en HGFA activo, se eluyen de las células muertas y se pueden recoger suficientemente en el sobrenadante del cultivo de pro-HGFA. La “disminución en la tasa de supervivencia de células de mamífero en cultivo” en la presente se refiere a la disminución en la tasa de supervivencia de las células de mamífero tras la proliferación a una densidad celular máxima. En la presente invención, la tasa de supervivencia de células de mamífero en el sobrenadante del cultivo de pro-HGFA es preferiblemente 95% o menor, más preferiblemente 80% o menor, por ejemplo 70%.

Dado que se piensa que una enzima derivada del lisosoma de la célula huésped está implicada en la activación de pro-HGFA a HGFA activo, se puede añadir una enzima derivada de lisosoma para aplicar el tratamiento.

Células de mamífero que se pueden utilizar en el método para producir el HGFA activo de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a células del ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células HEK (incluyendo células HEK 293), células COS, células de mieloma de ratón NS0, células de mieloma de ratón Sp2/0, y similares. En una realización preferida de la presente invención, como células de mamífero que expresan pro-HGFA se utilizan células CHO.

La presente invención se refiere también a una composición que comprende HGFA activo o HGFA activo producido por el método para producir el HGFA activo de la presente invención. Dado que la composición que comprende HGFA activo o HGFA activo de la presente invención se puede producir sin utilizar suero animal de pro-HGFA expresado de forma recombinante sin utilizar suero animal, se puede utilizar como un material biológico altamente seguro, p. ej., para el método para producir el HGF activo descrito más adelante.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir HGF activo. El método para producir el HGF activo de la presente invención comprende dejar que HGFA activo, obtenido por el método para producir e1HGFA activo de la presente invención, actúe sobre un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF expresado de forma recombinante en un medio similarmente sin suero para convertir pro-HGF en HGF activo. De acuerdo con este método, dado que HGF activo se puede producir sin emplear suero animal en todas las etapas que incluyen obtener HGFA activo empleado para la conversión en HGF activo, el HGF activo obtenido o una composición que comprende el mismo se puede utilizar como un material farmacéutico altamente seguro que elimina el riesgo de ser contaminado con materiales infecciosos tales como virus.

Específicamente, en una realización, el método para producir el HGF activo de la presente invención se caracteriza porque comprende una etapa de dejar que HGFA activo actúe sobre un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF, para convertir dicho pro-HGF en HGF activo,

en donde

dicho HGFA activo se produce por el método anterior para producir el HGFA activo de la presente invención.

Además de ello, en otra realización, el método para producir el HGF activo de la presente invención se caracteriza porque comprende las siguientes etapas:

Etapa A:

una etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA para convertir pro-HGFA en HGFA activo, en donde dicho sobrenadante del cultivo es un sobrenadante del cultivo obtenido al cultivar células de mamífero que expresan pro-HGFA en un medio sin suero,

Etapa B:

una etapa de obtener un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF, cultivando células que expresan pro-HGF en un medio sin suero,

Etapa C:

una etapa de dejar que el HGFA activo obtenido en dicha etapa A actúe sobre el sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF obtenido en dicha etapa B, para convertir dicho pro-HGF en HGF activo.

En la presente invención, un “sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF” es una fracción que comprende pro-HGF que se obtiene cultivando células que expresan pro-HGF, y los expertos en la técnica pueden obtener los mismos de un cultivo de dichas células de acuerdo con medios convencionales. Por ejemplo, un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF puede ser una fracción en la que se separan residuos de un cultivo de dichas células por medios tales como centrifugación.

En el método para producir el HGF activo de la presente invención, un sobrenadante del cultivo obtenido al cultivar células de mamífero que expresan pro-HGFA en un medio sin suero se puede emplear tal como es, o una dilución, un concentrado, o un producto parcial o completamente purificado del sobrenadante del cultivo antes mencionado se puede emplear como el HGFA activo que se deja que actúe sobre el “sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF”.

En la presente invención, una célula de mamífero que expresa pro-HGFA se puede obtener, pero no se limita a crear un vector que comprende un ácido nucleico que codifica pro-HGFA, e introducir esto en una célula de mamífero huésped para permitir la transformación. De manera similar, una célula que expresa pro-HGF se puede obtener creando un vector que comprende un ácido nucleico que codifica pro-HGF, e introducir esto en una célula huésped para permitir la transformación.

Como el vector arriba descrito se puede utilizar un vector de expresión génica, etc. Un “vector de expresión génica” es un vector que tiene la función de expresar la secuencia base que tiene el ácido nucleico de interés, y puede incluir una secuencia promotora, una secuencia potenciadora, una secuencia represora, una secuencia aisladora y similares para controlar la expresión de dicha secuencia base. Estas secuencias no están particularmente limitadas en tanto funcionen en la célula huésped.

Los medios para crear el vector que comprenden el ácido nucleico de interés son bien conocidos por los expertos en la técnica, y aquellos expertos en la técnica pueden seleccionar adecuadamente un método apropiado. Por ejemplo, estos medios pueden incluir, pero no se limitan a reacción de ligasa que utiliza un sitio de una enzima de restricción y similar (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Sección 11.4-11.11; Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1989) Sección 5.61-5.63).

Las células que expresan pro-HGF no están particularmente limitadas en tanto que puedan expresar pro-HGF, e incluyen, por ejemplo, células de insectos, células eucarióticas, células de mamífero. Preferiblemente, en términos de expresar eficazmente un ácido nucleico que codifica pro-HGF derivado de seres humanos, se utilizan células de mamífero, p. ej., células CHO, células HEK (incluyendo células HEK 293), células HeLa, células NS0 o células de mieloma de ratón SP2/0. En una realización preferida de la invención, como células de mamífero que expresan pro-HGFA se utilizan células CHO.

Los medios para introducir el vector anterior en una célula huésped son bien conocidos, y los expertos en la técnica pueden seleccionar adecuadamente un método apropiado. Ejemplos pueden incluir, pero no se limitan a, para la introducción de un vector en una célula huésped, método de electroporación (Chu et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 1311-26), método de liposoma catiónico, método de perforación de pulsos eléctricos (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Sección 9.1-9.9), método de inyección directa utilizando un tubo de vidrio capilar, método de microinyección, lipofección (Derijard (1994) Cell 7: 1025-37; Lamb (1993) Nature Genetics 5: 22-30; Rabindran et al. (1993) Science 259: 230-4), método de la lipofectamina (Thermo Fisher Scientific), método del fosfato de calcio (Chen y Okayama (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 2745-52), método de DEAE dextrano (Lopata et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 5707-17; Sussman y Milman (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 1642-3), FreeStyle m Ax Reagent (Thermo Fisher Scientific), y similares.

En relación con el medio exento de suero utilizado para cultivar células que expresan pro-HGFA y células que expresan pro-HGF, los expertos en la técnica pueden seleccionar adecuadamente una composición apropiada dependiendo del tipo de célula huésped, etc. utilizada. Además de ello, otras condiciones de cultivo también se pueden seleccionar adecuadamente por parte de los expertos en la técnica y, por ejemplo, pero sin limitación, la temperatura del cultivo se puede seleccionar adecuadamente de entre 35.5 - 37.5°C, y el periodo de cultivo se puede seleccionar de entre 5 - 20 días Para pro-HGFA, el periodo de cultivo se puede establecer de acuerdo con la tasa de supervivencia objetivo. La concentración de dióxido de carbono durante el cultivo puede ser 5% de CO2 de acuerdo con el protocolo general.

En una realización, el método para producir el HGF activo de la presente invención se caracteriza porque seguido de dicha etapa, comprende, además, una etapa de purificar HGF activo. Esta etapa puede incluir la purificación de pro-HGF que puede permanecer en la preparación que comprende HGF activo.

El método de purificación que se puede utilizar en la presente invención no está particularmente limitado, en tanto que permita la purificación sin perder la actividad fisiológica de la proteína. En particular, se prefiere utilizar una purificación cromatográfica empleando un soporte de modo mixto en la presente invención.

A un soporte de modo mixto también se alude como un soporte de modo de mezcla, y es un soporte de cromatografía en el que ligandos de modos con dos o más tipos de propiedades están unidos en un soporte. En particular, en la presente invención, para la purificación de HGF activo, HGF activo se puede purificar eficazmente por purificación cromatográfica empleando un soporte de modo mixto que tiene características de hidrofobicidad y soporte de intercambio iónico.

Ejemplos de un "soporte de modo mixto que tiene características de hidrofobicidad y soporte de intercambio iónico” que se pueden utilizar en el método de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a Capto adhere, Capto MMC, HEA HyperCel, PPA HyperCel, MEP HyperCel, TOYOPEARL MX-Trp-650M, y similares.

La purificación cromatográfica empleando dicho soporte de modo mixto se puede realizar adsorbiendo HGF activo en la solución de carga de la columna a dicho soporte de modo mixto, y después lavando con un tampón para separar las impurezas, seguido de elución. El tampón para separar impurezas se puede establecer en base al pH, la conductividad eléctrica, el componente del tampón, la concentración salina o aditivos que mantienen la adsorción entre la proteína que es el objetivo para la purificación y el soporte, al tiempo que se reduce la afinidad entre impurezas y el soporte.

Ejemplos de la solución de carga de la columna y tampón utilizado incluyen, pero no se limitan a sales fosfato, sales citrato, sales acetato, sales succinato, sales maleato, sales borato, Tris (base), HEPES, MES, PIPES, MOPS, TES o Tricine, y similares.

La solución de carga de la columna y el tampón utilizados pueden comprender aminoácidos. Ejemplos de tales aminoácidos pueden incluir, pero no se limitan a glicina, alanina, arginina, serina, treonina, ácido glutámico, ácido aspártico, histidina, derivados de los mismos, y similares.

En la presente invención, se puede utilizar una solución de carga de la columna que tiene un pH y una concentración salina adecuados para adsorber HGF activo sobre dicho soporte de modo mixto. Un intervalo de pH de este tipo es pH 6.0 - 10.0, más preferiblemente pH 7.0 - 9.0, por ejemplo pH 8.0. Además de ello, una concentración salina de este tipo es 0.01 - 5 M, preferiblemente 0.1 - 2 M, por ejemplo 1 M. La concentración salina anterior se puede preparar empleando, por ejemplo, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro de calcio, citrato sódico, sulfato de sodio, sulfato de amonio 0.001 M - 4 M, o una combinación de los mismos.

En la presente invención, la elución de HGF activo se puede realizar empleando un tampón que reducirá la afinidad entre dicho soporte de modo mixto y HGF activo. Un tampón de este tipo incluye un tampón que comprende arginina al menos 0.1 M, más preferiblemente arginina al menos 0.3 M, más preferiblemente arginina al menos 0.4 M, por ejemplo, arginina 0.7 M. Además de ello, en combinación con o en lugar de arginina también se puede emplear un tampón que comprenda ion magnesio (Mg2+). Alternativamente, la elución de HGF activo también se puede realizar mediante un método escalonado que reduce escalonadamente el pH para eluir HGF activo.

En una realización de la presente invención, dicha purificación puede comprender, además, después de la purificación mediante un soporte de modo mixto, que comprende un grupo de intercambio iónico y un grupo de interacción hidrofóbico, la purificación mediante cromatografías adicionales sencillas o múltiples. Esto permitirá obtener e1HGF activo a una mayor pureza. Una purificación cromatográfica de este tipo incluye, pero no se limita a, por ejemplo, purificación cromatográfica que emplea un soporte de modo mixto, un soporte de intercambio aniónico, un soporte de intercambio catiónico, un soporte de interacción hidrofóbico, un soporte de exclusión por tamaño, un soporte de filtración en gel, un soporte de fase inversa, un soporte de hidroxiapatito, un soporte de fluoroapatito, un soporte de celulosa sulfatado o un soporte de agarosa sulfatado, y similares.

Obsérvese que los términos utilizados en la presente se han de emplear para describir realizaciones particulares y no pretenden limitar la invención.

Además de ello, la expresión “que comprende”, tal como se utiliza en la presente, a menos que el contenido indique claramente que se entienda de otro modo, pretende la presencia de los elementos descritos (tales como componentes, etapas, elementos y números) y no excluye la presencia de otros elementos (tales como componentes, etapas, elementos y números).

A menos que se definan de otra manera, todos los términos utilizados en la presente (incluidos términos científicos y técnicos) tienen el mismo significado reconocido ampliamente por los expertos en la técnica de la tecnología a la cual pertenece la presente invención. Los términos utilizados en la presente, a menos que se definan explícitamente de otro modo, han de interpretarse como que tienen significados consistentes con los significados en la presente y en campos técnicos relacionados, y no deben interpretarse como que tienen significados idealizados o excesivamente formales.

Términos tales como primero y segundo se emplean a veces para expresar diversos elementos, y debe reconocerse que estos elementos no se han de limitar por estos términos. Estos términos se emplean únicamente con el propósito de discriminar un elemento de otro y, por ejemplo, es posible describir un primer elemento como un segundo elemento y, de manera similar, describir un segundo elemento como un primer elemento sin apartarse del alcance de la presente invención.

La presente invención se describirá ahora más específicamente mediante Ejemplos.

Ejemplos

La presente invención se describirá específicamente a continuación mostrando Ejemplos.

[Ejemplo 1]

Células CHO que expresan de forma recombinante pro-HGFA de longitud completa se descongelaron en medio diseñado según las necesidades EX-CELL (de SAFC) en un matraz T75 (de Corning, 430421), el cultivo en expansión se realizó en un matraz agitado de 250 mL (de Corning, 431144), y luego se cultivaron durante 10 días en un tanque de cultivo de 7 L (de ABLE/Biott, BCP-07) a 121 rpm ajustado a 36.5°C. La tasa de supervivencia de las células el Día 10 del cultivo era 47.1%. Después de completarse el cultivo, las células se separaron mediante centrifugación y se microfiltraron a través de un filtro de 0.2 im (de Sartorius, 5445307H7--00), y el sobrenadante de pro-HGFA recogido se almacenó bajo refrigeración hasta el uso.

50 mL de sobrenadante del cultivo de pro-HGFA, obtenido de una manera similar a antes, se colocó en un vaso de precipitados de vidrio de 100 mL, se añadieron 5 mL, que es 1/10 del volumen del sobrenadante, de 10 g/L de solución acuosa de sulfato de dextrano sódico (Mw. 500,000) y luego el pH se ajustó a 5.3 con ácido clorhídrico 2 M. Después del ajuste del pH, se sometió a filtración con un filtro de 0.2 im y después se colocó en un matraz agitado de 250 mL. Se introdujo por soplado cinco por ciento de dióxido de carbono durante 60 segundos, y luego la reacción se realizó a la temperatura ambiente con una velocidad de agitación establecida en 80 rpm durante 6 horas. La reacción de activación progresó en torno a pH 5.5. La toma de muestras se realizó tras 6 horas de reacción, y la actividad del HGFA se midió con péptido sintético como el sustrato. El sustrato sintético H-D-Val-Leu-Arg-pNA2AcOH (de Bachem, L-1885) se disolvió en tampón Tris-HCl 50 mM - cloruro de sodio 0.15 M - cloruro de calcio 10 mM (pH 7.5) que comprende BSA al 0.25%, y se ajustó a 2 mM. Esto se aplicó a razón de 100 iL/pocillo en el número necesario de pocillos en una placa de 96 pocillos, y se añadieron 10 ¡iL de cada uno de los sobrenadantes del cultivo de HGFA que habían sido sometidos a un tratamiento de activación, control positivo y sobrenadante del cultivo de pro-HGFA no tratado. Como control positivo se empleó sobrenadante del cultivo de HGFA que había sido activado de antemano y se confirmó que era capaz de activar suficientemente pro-HGF. La placa se protegió de la luz con un papel de aluminio y se incubó a 37°C durante 1 hora. La absorbancia se leyó con un lector de placas de TECAN (405 nm) y el valor de la actividad de HGFA se calculó restando de la absorbancia original una absorbancia de sobrenadante del cultivo de pro-HGFA no tratado. Como resultado, se confirmó que el valor de la actividad de la muestra de HGFA después de la activación mostró ser 0.577, que es equiparable al valor de actividad del control positivo. Se piensa que pro-HGFA es activado por la acción de una enzima derivada de la célula CHO huésped, ya que a esta solución de reacción no se añadieron externamente enzimas y similares. Además de ello, cuando se añadió Tris 1 M a la solución después de 7.6 horas para ajustar el pH a 7.0 y después se almacenó la solución bajo refrigeración durante 2 días para examinar el cambio en el valor de la actividad de HGFA, no se observó una gran disminución en el valor de la actividad con el valor de actividad inmediatamente después de la neutralización en 0.653, Día 1 de refrigeración en 0.667 y Día 2 de refrigeración en 0.679, mostrando estabilidad durante 2 días después de la activación (Tabla 1).

T l 1

Tabla 1 Valor de Actividad de HGFA Después de Tratamiento de Activación

Células CHO que expresan de forma recombinante pro-HGF se descongelaron en medio diseñado según las necesidades EX-CELL en un matraz T75, el cultivo en expansión se realizó en un matraz agitado de 250 mL y un tanque de cultivo de 7 L, y esto se cultivó luego durante 9 días en un tanque de cultivo de 20 L a 144 rpm ajustado a 36.5°C. La tasa de supervivencia el Día 9 del cultivo era 90.6%. Después de la filtración para separar células, se cargaron en un tanque de cultivo de 30 L 19.14 kg de sobrenadante del cultivo de pro-HGF que había sido microfiltrado a través de un filtro de 0.2 ^m (de Sartorius, 5445307H9--00). A esto se añadieron 0.96 kg, que es 1/20 de volumen del sobrenadante de HGF, del sobrenadante del cultivo de HGFA que había sido activado y devuelto a pH 7.0 y almacenado bajo refrigeración durante 2 días y se hizo reaccionar con agitación a 30 rpm a 25°C. Obsérvese que el sobrenadante del cultivo de HGFA activado cargado era el que tenía un valor de actividad equiparable al control positivo en la medición de la actividad de HGFA. La toma de muestras se realizó después de aproximadamente 20 horas de reacción, y el estado de activación de pro-HGF se confirmó con SDS-PAGE empleando 5 - 20% de gel de poliacrilamida (de DRC, NXV-271HP). Bajo una condición no reductiva se observó una banda de cadena sencilla, y bajo una condición reductiva después de la activación la sustancia de cadena sencilla había desparecido y se había separado en cadenas a y p y, por lo tanto, se confirmó una activación suficiente de pro-HGF (Figura 1).

[Ejemplo 2]

Utilizando el diseño de experimentos (DoE), se testó la validez de los parámetros de activación de pro-HGFA descritos en el Ejemplo 1, que son pH (5.3 - 5.5) y temperatura de reacción (temperatura ambiente). Las condiciones del experimento se establecieron con un diseño compuesto central utilizando el software JMP (de SAS Institute) y una solución para el tratamiento de activación de pro-HGFA se preparó de manera similar al método descrito en el Ejemplo 1. Obsérvese que el pH se ajustó a tres condiciones de pH 5.0, 5.5 y 6.0 con ácido clorhídrico 2 M. 100 ^l de cada uno se colocaron en tubos de 1.5 mL y se hicieron reaccionar manteniéndose todavía a 20°C, 28.5°C y 37°C. La toma de muestras se realizó tras 3, 6, 9 y 15 horas de reacción, y la actividad de1HGFA se midió con péptido sintético como el sustrato. El valor de la actividad del HGFA se obtiene restando el valor (A405) de sobrenadante del cultivo de pro-HGFA no tratado. Se creó una gráfica de superficie de respuesta mediante análisis estadístico a partir de los valores de la actividad de HGFA obtenidos de un total de 27 condiciones, y el intervalo que tiene un valor de actividad de 0.4 o más se mostró en blanco. A partir de este resultado se encontró que la condición que da el valor de actividad del HGFA más alto es pH 5.4 y una temperatura de reacción de 26.1 °C, y que el valor de actividad de1HGFA se puede obtener en un amplio intervalo (Figura 2).

[Ejemplo 3]

2 mL de intercambiador aniónico multimodal Capto Adhere (de GE Healthcare, 28-4058-44) se equilibró de antemano con tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende cloruro sódico 2 M. A 32 mL de sobrenadante del cultivo que comprende HGF activo se añadió cloruro sódico para obtener 1 M. Este sobrenadante del cultivo se cargó en una columna a un caudal de 2 mL/min y se recogió la solución fluyente. Después de completarse la carga, tampón Trishidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende cloruro sódico 2 M fluía en una cantidad correspondiente a 3 veces el volumen de la columna para lavar y se recogió el material eluido. Después de completarse el lavado, tampón Trishidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 0.25 M se hizo fluir en una cantidad correspondiente a 3 veces el volumen de la columna para lavar y se recogió el material eluido. Seguidamente, se repitió 5 veces una operación para fluir tampón T ris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 0.7 M en una cantidad correspondiente a 1 volumen de columna para recoger el material eluido. Finalmente, tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 1.0 M se hizo fluir en una cantidad correspondiente a 3 veces el volumen de la columna para recoger el material eluido. La Figura 3 muestra los resultados de realizar una SDS-PAGE bajo una condición no reductiva con las soluciones recogidas en este proceso. El gel para SDS-PAGE empleado era XV-PANTERA (NXV-271HP) de DRC, y el marcador del peso molecular empleado era Precision Plus Protein All Blue Standards (161-0373) de BIORAD. Las muestras se sometieron a análisis por SDS-PAGE después de realizar durante 10 minutos un tratamiento de calor en tampón de muestra Laemmli a 60°C. La electroforesis se realizó bajo una tensión constante de 150 V y el gel se tiñó cuando se completó la electroforesis con PAGE Blue83 de COSMO BIO para confirmar las proteínas separadas. Cuando se compara la solución de carga de la columna y la solución fluyente, la banda de HGF de peso molecular de alrededor de 75,000 disminuyó en la solución fluyente, demostrando que se había adsorbido sobre el soporte. HGF no se eluyó fluyendo a través de tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende cloruro sódico 2 M. Un componente que comprende más impureza se eluyó en un lavado posterior con tampón Trishidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 0.25 M. HGF activo se eluyó después al fluir a través de tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 0.7 M.

[Ejemplo 4]

1 mL de intercambiador aniónico multimodal Capto Adhere (de GE Healthcare, 28-4058-44) se equilibró de antemano con tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende cloruro sódico 2 M. A 8 mL de sobrenadante del cultivo que comprende HGF activo se añadió una cantidad igual de tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende cloruro sódico 2 M para obtener 1 M. Este sobrenadante del cultivo se cargó en la columna y se recogió la solución fluyente. Después de completarse la carga, tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende cloruro sódico 2 M fluía en una cantidad correspondiente a 3 veces el volumen de la columna para lavar y se recogió el material eluido. Fluyó una cantidad correspondiente a 5 veces el volumen de la columna de tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 1 M y se recogió el material eluido. La Figura 4 muestra los resultados de realizar una SDS-PAGE bajo una condición no reductiva con las soluciones recogidas en este proceso. El gel para SDS-PAGE empleado era XV-PANTERA (NXV-271 HP) de DRC, y el marcador del peso molecular empleado era Precision Plus Protein All Blue Standards (161-0373) de BIORAD. Las muestras se sometieron a análisis por SDS-PAGE después de realizar durante 10 minutos un tratamiento de calor en tampón de muestra Laemmli a 60°C. La electroforesis se realizó bajo una tensión constante de 150 V y el gel se tiñió cuando se completó la electroforesis con PAGE Blue83 de COSMO BIO para confirmar las proteínas separadas. Cuando se compara la solución de carga de la columna y la solución fluyente, la banda de HGF disminuyó en la solución fluyente, demostrando que se había adsorbido sobre el soporte. HGF no se eluyó fluyendo a través de tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende cloruro sódico 2 M. HGF activo se eluyó con la subsiguiente elución con tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 1 M.

[Ejemplo 5]

Al sobrenadante del cultivo que comprende HGF activo, obtenido en el método del Ejemplo 1, se añadió una cantidad igual de tampón Tris-hidrocloruro 40 mM (pH 8.0) que comprende cloruro sódico 2 M, y luego el pH se ajustó a 8.0. La solución anterior se cargó en una columna de Capto adhere (GE Healthcare, 17-5444-05), equilibrada con tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende cloruro sódico 2 M, y después de completar la carga, se realizó el lavado con el tampón empleado para el equilibrado. La columna se lavó con tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 0.25 M ácido clorhídrico, después de lo cual se eluyó con tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 8.0) que comprende arginina 0.7 M ácido clorhídrico y se recogió la fracción que comprende HGF.

La fracción de purificación de Capto adhere se agrupó, la solución se diluyó 7 veces con tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 7.5) que comprende polisorbato 80 al 0.012% sobre una columna Capto Q (GE Healthcare, 17-5316-05) equilibrada con tampón Tris-hidrocloruro 20 mM (pH 7.5) que comprende polisorbato 80 al 0.012%, y después de completar la carga, se realizó un lavado con el tampón empleado para el equilibrado. La solución fluyente de la columna y la solución de lavado se agruparon como la fracción de purificación Capto Q.

La fracción de purificación Capto Q se cargó en una columna UNOsphere S (Bio-Rad 156-0117), equilibrada con tampón fosfato 20 mM (pH 7.5), y después de completarse la carga, esto se lavó con el tampón empleado para el equilibrado. Después de completarse el lavado con la misma solución, esto se lavó con tampón fosfato 20 mM (pH 7.5) que comprendía cloruro sódico 0.4 M, y luego el HGF adsorbido se eluyó con tampón fosfato 20 mM (pH 7.5) que comprendía cloruro sódico 0.6 M como la fracción de purificación UNOsphere S.

A la fracción de purificación UNOsphere S se añadió tampón fosfato 20 mM (pH 7.5) que comprendía cloruro sódico 5 M para ajustar la concentración de cloruro sódico de la solución a 3.3 M y el pH a 7.5. Columna Phenyl Sepharose

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir activador del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFA) activo, caracterizado por que comprende:

Etapa 1:

una etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA obtenido en la etapa anterior para convertir pro-HGFA en HGFA activo, caracterizado por que dicha etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo es una etapa de ajustar el pH a 4.0 - 6.0.

2. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que dicha etapa comprende, además, añadir polisacáridos sulfatados a dicho sobrenadante del cultivo.

3. El método de producción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que dicha etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo se realiza a una temperatura de 15 - 40°C.

4. El método de producción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicho sobrenadante del cultivo se obtiene tras una disminución en la tasa de supervivencia de células de mamífero en cultivo.

5. El método de producción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha célula de mamífero es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

6. El método de producción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho pro-HGFA tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2.

7. El método de producción de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que dicho sobrenadante del cultivo es dicho sobrenadante del cultivo per se, una dilución de dicho sobrenadante del cultivo, un concentrado de dicho sobrenadante del cultivo o un producto parcialmente purificado de dicho sobrenadante del cultivo.

8. Un método para la producción de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) activo, caracterizado por que comprende una etapa de:

Etapa 1:

obtener un sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA, cultivando células de mamífero que expresan activador del factor de crecimiento de hepatocitos inactivo (pro-HGFA) en un medio sin suero,

Etapa 2:

ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGFA obtenido en la etapa anterior para convertir pro-HGFA en HGFA activo,

caracterizado por que dicha etapa de ajustar a débilmente ácido el sobrenadante del cultivo es una etapa de ajustar el pH a 4.0 - 6.0, y

Etapa 3:

dejar que HGFA activo actúe sobre un sobrenadante del cultivo que comprende factor de crecimiento de hepatocitos (pro-HGF) inactivo, para convertir dicho pro-HGF en HGF activo,

en el que

dicho sobrenadante del cultivo que comprende pro-HGF es un sobrenadante del cultivo obtenido al cultivar células que expresan pro-HGF en un medio sin suero.

9. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado por que dicho medio para cultivar células que expresan pro-HGF es un medio sin cualesquiera componentes derivados de animales.

10. El método de producción de acuerdo con la reivindicación 8 u 9, caracterizado por que dicho pro-HGF tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 1.