ES2892158T3

ES2892158T3 - Membranas artificiales de ácidos micólicos

Info

Publication number: ES2892158T3
Application number: ES11748021T
Authority: ES
Inventors: Jens H Gundlach; Ian M Derrington; Kyle W Langford
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 2010-02-23
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2022-02-02
Anticipated expiration: 2031-02-23
Also published as: FI2539465T3; WO2011106456A2; EP2539465A2; US9588079B2; US20240201134A1; CN102834716A; EP4268944A2; WO2011106456A3; CN102834716B; EP2539707A4; US20170227494A1; CN102834527A; CA3116307C; WO2011106459A3; EP2539707A2; CA2790672A1; US20130146456A1; EP4268944A3; CA2790666C; US20130146457A1

Abstract

Membrana en bicapa artificial que abarca la abertura de un orificio sin soporte de un sustrato sólido en cualquiera de los lados a lo largo de la superficie de la membrana, que comprende ácidos micólicos micobacterianos y que tiene un voltaje de ruptura superior a 0,5 V cuando el voltaje aplicado a través de la membrana aumenta en rampa a aproximadamente 100 mV/s en presencia de una solución de KCl 1,0 M preparada con agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES 10 mM.

Description

DESCRIPCIÓN

Membranas artificiales de ácidos micólicos

ANTECEDENTES

Las micobacterias, incluyendo Mycobacterium tuberculosis, han desarrollado cepas que resisten los regímenes de tratamiento con múltiples fármacos contemporáneos. Con casi dos millones de muertes anuales causadas por infecciones de M. tuberculosis y con más de 200.000 personas debilitadas por infecciones de M. leprae, existe una necesidad concertada de comprender los mecanismos de resiliencia de las micobacterias. Parte de la persistencia y letalidad de estas enfermedades se debe a la pared celular impermeable de las micobacterias. La carcasa celular externa única de ~ 8 nm de grosor de las micobacterias tiene una permeabilidad a los agentes hidrófilos mucho menor que la pared celular de Escherichia coli y es un factor clave en la resistencia a los fármacos y al medio de las micobacterias.

A pesar de que contiene otros constituyentes, la membrana externa micobacteriana contiene 30% -40% de ácidos micólicos. Los ácidos micólicos contienen un grupo de cabeza de ácido carboxílico con dos colas hidrófobas de longitud desigual. Consulte la FIGURA 1 para ejemplos de ácidos micólicos. In vivo, los ácidos micólicos están unidos covalentemente por el grupo carboxilato a peptidoglicanos o azúcares de trehalosa. La impermeabilidad significativa de las membranas micobacterianas da como resultado la necesidad de vías para solutos hidrófilos. Esta vía está mediada por poros de proteínas.

Los estudios in vivo de las proteínas de los poros en la pared celular micobacteriana de M. smegmatis, un pariente cercano de M. tuberculosis, condujeron al descubrimiento de la porina A de M. smegmatis (MspA) de la membrana externa. En M. smegmatis, MspA es la proteína más abundante y forma la vía principal para que los nutrientes hidrófilos atraviesen la membrana externa. Se han aislado OmpATb, otra proteína porosa, y transportadores de iones en especies de micobacterias, pero su comportamiento en su entorno natural permanece sin explorar.

Para investigar varias propiedades de poros, tales poros son a menudo incorporados en membranas. Existe la necesidad de desarrollar membranas adecuadas para estos y otros experimentos que implican membranas de ácidos micólicos.

El documento JP H07 248329 describe un procedimiento para detectar una membrana por inspección de la infectividad tuberculosa y un anticuerpo relacionado con la infectividad tuberculosa con la misma. Schiffler et al (2007) Journal of Bacteriology 189, 21,7709-7719 describen Corynebacterium diphtheriae: Identification and Characterization of a Channel-Forming Protein in the Cell Wall. El documento US 2006/008519 describe composiciones y procedimientos para estabilizar formulaciones adyuvantes basadas en lípidos usando glicolípidos. Butler et al (2008) PNAS 105, 52, 20647-2052 describen la detección de ADN de una sola molécula con un nanoporo de proteína MspA diseñado.

RESUMEN

La invención se define mediante las reivindicaciones. En el presente documento se proporciona una membrana de bicapa artificial que comprende ácidos micólicos micobacterianos, sistemas que comprenden tales membranas y procedimientos para fabricar y usar tales membranas.

Una membrana en bicapa artificial como se reivindica comprende ácidos micólicos micobacterianos. Algunas realizaciones proporcionan una membrana en bicapa artificial que consiste en una pluralidad de ácidos micólicos. Algunas realizaciones proporcionan una membrana en bicapa artificial que consiste en una pluralidad de ácidos micólicos y mezclas de otros lípidos. Otras realizaciones proporcionan una membrana artificial que consiste esencialmente en una pluralidad de ácidos micólicos y un nanoporo. Otras realizaciones proporcionan una membrana artificial que consiste esencialmente en una pluralidad de ácidos micólicos, mezclas de otros lípidos y un nanoporo. Se proporciona además un sistema que comprende una membrana en bicapa artificial, según se reivindica, que comprende ácidos micólicos micobacterianos colocados entre un primer medio conductor líquido y un segundo medio conductor líquido. En el presente documento se describe un procedimiento que comprende aplicar un campo eléctrico al sistema.

También se describen en el presente documento procedimientos para preparar membranas micólicas no soportadas artificiales que comprenden un ácido micólico. En el presente documento se describe un procedimiento para fabricar una membrana no soportada artificial que comprende un ácido micólico, que comprende: (a) pretratar un orificio de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 500 pm de diámetro con una o más capas de una mezcla de ácidos micólicos-hexano y eliminar el hexano para proporcionar ácidos micólicos secos; (b) aplicar un disolvente de hidrocarburo a los ácidos micólicos secos, seguido de calentamiento para promover la incorporación de disolvente de hidrocarburo para proporcionar una composición de disolvente de hidrocarburo-ácidos micólicos; (c) colocar el orificio entre un primer medio conductor de líquido y un segundo medio conductor de líquido; (d) aplicar la composición de disolvente de hidrocarburo-ácidos micólicos al orificio, mientras se controla una corriente iónica a través del orificio hasta que la resistencia del orificio aumente por encima de 1 TQ, seguido de forzar uno de los medios conductores líquidos a través del orificio desde el lado trans para eliminar el bloqueo de la corriente de iones, según sea necesario; y (e) colocar una burbuja de aire sobre el orificio, seguido de la retracción de la burbuja de aire, en el que la formación de la membrana se indica por el aumento de la resistencia del orificio por encima de 1 TQ, y en el que la formación de la membrana en bicapa está indicada si se puede formar un nanoporo dentro de la membrana.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0009] Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas concomitantes de la presente invención se entenderán más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se toma conjuntamente con los dibujos adjuntos. La FIGURA 1 muestra las estructuras químicas de ácidos micólicos de ejemplo presentes en las membranas externas de las micobacterias. Véase Annu Rev Biochem 64:29 (1995).

La FIGURA 2 muestra el cambio en la conductividad a través de las membranas de ácido micólico (MA) con pasos de corriente discretos después de la adición de MspA. Los pasos de corriente observados son indistinguibles de los niveles de corriente observados en las membranas de DPhPC.

La FIGURA 3 muestra los histogramas escalados de los voltajes de ruptura de las membranas de MA (N = 330) y las membranas de DPhPC (N = 205) e incluye datos de varios orificios diferentes de ~ 20 qm. Las membranas de MA se confirmaron mediante la inserción de proteínas MspA.

La FIGURA 4 proporciona una comparación de las curvas de I-V de MspA en membranas de MA y de DPhPC. A voltajes negativos, la compuerta de MspA en ambas membranas oscurece la corriente de estado abierto y se omite. Para MspA en membranas de DPhPC N = 9 poros, para MspA en MA, N = 2.

La FIGURA 5 es una versión estilizada de MspA en una membrana no descriptiva; el ADN de doble cadena no puede pasar a través de la constricción más pequeña del poro. Imagen no a escala.

La FIGURA 6 muestra los niveles de bloqueo de corriente iónica provocados por colas en horquilla de homopolímero de adenina retenidas temporalmente en un poro de MspA incrustado en una membrana de MA (rojo) o de DPhPC (azul). La corriente se expresa como una fracción de la corriente de estado abierto al voltaje dado. A voltajes superiores a 200 mV, las membranas de DPhPC se vuelven demasiado frágiles para una experimentación prolongada, mientras que las membranas de MA permiten mediciones a voltajes mucho más altos. La duración de los eventos registrados por encima de 400 mV fue demasiado corta para extraer con seguridad una corriente iónica característica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En el presente documento se proporcionan membranas artificiales, tal como se reivindica, que comprende ácidos micólicos micobacterianos. Estas membranas son de larga duración y muy resistentes a la electroporación, lo que demuestra su resistencia general. Las membranas de ácidos micólicos son adecuadas, por ejemplo, para estudios controlados de la membrana externa de las micobacterias y pueden usarse para experimentos de traslado de analitos de nanoporos, así como para otras aplicaciones que se describen a continuación.

Por consiguiente, en el presente documento se proporciona una membrana artificial, tal como se reivindica, que comprende ácidos micólicos micobacterianos. La membrana, tal como se reivindica, es no soportada. Un ácido micólico puede definirse además como un ácido micólico modificado. Un ácido micólico modificado puede ser un ácido micólico reticulado. Un ácido micólico puede definirse además como un ácido micólico no modificado. En algunas realizaciones, una membrana tiene un grosor promedio que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 22 nm. En algunas realizaciones, el grosor promedio es de aproximadamente, como máximo aproximadamente, o al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 nm o más, o cualquier intervalo derivable en el mismo. Los procedimientos para medir el grosor de las membranas son bien conocidos en la técnica y se proporciona un ejemplo en los Ejemplos siguientes.

En algunas realizaciones, una membrana tiene un voltaje de ruptura promedio de aproximadamente 2.0 V cuando el voltaje aplicado a través de la membrana aumenta en rampa a aproximadamente 100 mV/s en presencia de una solución de KCl 1.0 M preparada con agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0.05 con HEPES 10 mM. En el presente documento se proporciona un ejemplo de determinación de un voltaje de ruptura promedio. En algunas realizaciones, una membrana tiene la capacidad de soportar voltajes superiores a 1 V durante más de varias horas en presencia de una solución de KCl 1,0 M preparada con agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES 10 mM. En algunas realizaciones, una membrana tiene la capacidad de soportar voltajes mayores de 1 V durante al menos aproximadamente 2, 3, 4 o 5 o más horas, o cualquier intervalo derivable en el mismo, en presencia de una solución de KCl 1,0 M preparada con agua desionizad, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES 10 mM. En algunas realizaciones, una membrana tiene resistencia a la rotura cuando se eliminan los tampones en los lados cis o trans. Una membrana puede formarse y reformarse cuando se expone a un tampón de pH 2 a pH 9 presentado en su lado cis. En algunas realizaciones, una membrana se puede formar y reformar a temperaturas superiores a 55 °C.

Una membrana artificial que comprende ácidos micólicos micobacterianos puede comprender además una variedad de sustancias. En algunas realizaciones, una membrana comprende además un nanoporo. En algunas realizaciones, una membrana comprende además una pluralidad de nanoporos. Opcionalmente, el nanoporo es un poro de proteína. En algunas realizaciones, el poro de la proteína se define además como a-hemolisina o una variante de la misma, una porina de porina de Mycobacterium smegmatis (Msp) u OmpATb. En algunas realizaciones, el poro de la proteína se define además como a-hemolisina o una variante de la misma. En algunas realizaciones, el nanoporo es una porina de MspA mutante. En algunas realizaciones, los aminoácidos en las posiciones 90, 91 y 93 de una porina de MspA mutante está sustituido cada uno por asparagina. Cualquier membrana puede comprender además un fármaco. En algunas realizaciones, el fármaco es un fármaco antibacteriano para el tratamiento de la tuberculosis. En algunas realizaciones, una membrana comprende además una enzima, un motor molecular, una nanopartícula, una microesfera óptica, una microesfera magnética o luz.

La membrana es una membrana en bicapa. También se proporciona una membrana artificial, tal como se reivindica, que consiste en una pluralidad de ácidos micólicos. También se proporciona una membrana artificial, tal como se reivindica, que consiste en una pluralidad de ácidos micólicos y mezclas de otros lípidos.

Algunas realizaciones proporcionan una membrana artificial, tal como se reivindica, que consiste esencialmente en una pluralidad de ácidos micólicos y un nanoporo. Los materiales o etapas que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de tales realizaciones incluyen aquellos que no afectan a la naturaleza lipídica del ácido micólico ni evitan la formación de la membrana.

Algunas realizaciones proporcionan una membrana artificial, tal como se reivindica, que consiste esencialmente en una pluralidad de ácidos micólicos, mezclas de otros lípidos y un nanoporo. Los materiales o etapas que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de tales realizaciones incluyen aquellos que no afectan a la naturaleza lipídica del ácido micólico u otros lípidos ni evitan la formación de la membrana.

En algunas realizaciones, se proporciona un sistema que comprende una membrana artificial, tal como se reivindica, que comprende ácidos micólicos micobacterianos colocados entre un primer medio conductor líquido y un segundo medio conductor líquido. Al menos un medio conductor líquido puede comprender un analito, tal como un ácido nucleico o una proteína. En algunas realizaciones, la membrana comprende además un nanoporo. El nanoporo puede definirse además como una proteína que forma un túnel tras la inserción en la membrana. En algunas realizaciones, la proteína es una porina de porina A de M. smegmatis mutante (porina de MspA mutante). En algunas realizaciones, cada uno de los aminoácidos en las posiciones 90, 91 y 93 de la porina de MspA mutante está sustituido por asparagina. En algunas realizaciones, al menos un medio conductor líquido comprende un analito, en el que la membrana comprende además un nanoporo, y en el que el sistema es operativo para detectar una propiedad del analito. Una propiedad de un analito puede ser una propiedad eléctrica, química o física. En algunas realizaciones, al menos un medio conductor líquido comprende un analito, en el que la membrana comprende además un poro de proteína que tiene un túnel, y en el que el sistema es operativo para trasladar electroforéticamente el analito a través del túnel. Un sistema puede comprender además un amplificador de fijación de voltaje (“patch-damp”), un dispositivo de adquisición de datos, uno o más dispositivos de regulación de temperatura en comunicación con el primer medio conductor líquido o el segundo medio conductor líquido, o cualquier combinación de los mismos.

En el presente documento se describen procedimientos que pueden comprender la aplicación de un campo eléctrico a cualquier sistema descrito en el presente documento.

Algunos procedimientos comprenden además detectar un analito en el sistema en un procedimiento que comprende medir una corriente iónica a medido que el analito interactúa con una abertura de un nanoporo para proporcionar un patrón de corriente, en el que la aparición de un bloqueo en el patrón de corriente indica la presencia del analito. La aplicación de un campo eléctrico puede ser suficiente para hacer que el analito se traslade electroforéticamente a través de la abertura. Un procedimiento puede comprender además identificar el analito. La identificación del analito puede comprender comparar el patrón de corriente con un patrón de corriente conocido de un analito conocido. También se describe en el presente documento un procedimiento para fabricar una membrana artificial no soportada que comprende un ácido micólico, que comprende: (a) pretratar un orificio de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 500 pm de diámetro con una o más capas de una mezcla de ácidos micólicos-hexano y eliminar el hexano para proporcionar ácidos micólicos secos; (b) aplicar un disolvente de hidrocarburo a los ácidos micólicos secos, seguido de calentamiento para promover la incorporación del disolvente de hidrocarburo para proporcionar la composición de ácidos micólicos-disolvente de hidrocarburo; (c) colocar el orificio entre un primer medio conductor líquido y un segundo medio conductor líquido; (d) aplicar la composición de ácidos micólicos-disolvente de hidrocarburo al orificio mientras se controla una corriente de iones a través del orificio hasta que la resistencia del orificio aumente por encima de 1 TQ, seguido de forzar uno de los medios conductores líquidos a través del orificio desde el lado trans para eliminar el bloqueo de la corriente iónica, según sea necesario; y (e) colocar una burbuja de aire sobre el orificio, seguido de la retracción de la burbuja de aire, en el que la formación de la membrana se indica por el aumento de la resistencia del orificio por encima de 1 TQ, y en el que se indica la formación de la membrana en bicapa si se puede formar un nanoporo dentro de la membrana. El disolvente de hidrocarburo puede ser hexadecano o hexadeceno o cualquier otro disolvente de hidrocarburo que pueda incorporarse a la membrana. El tipo de disolvente de hidrocarburo empleado depende de la temperatura a la que se desee preparar la membrana.

Los ácidos micólicos son 13-hidroxi ácidos grasos a-ramificados de alto peso molecular que son componentes de las envolturas celulares de todas las micobacterias. Los ácidos micólicos contienen un grupo de cabeza de ácido carboxílico con dos colas hidrófobas de longitud desigual. Los ácidos micólicos tienen la estructura básica R2CH(OH)CHR1COOH, donde R¹es un alcano lineal C²⁰-C²⁴y R2 es una estructura más compleja de 30-60 átomos de carbono que puede contener varios grupos de dobles enlaces carbono-carbono, anillos de ciclopropano, ramificaciones de metilo o funciones de oxígeno, tales como grupos carbonilo, ácido carboxílico y metoxi. La estructura de los ácidos micólicos varía según la familia y la especie.

En la envoltura celular micobacteriana, los ácidos micólicos están presentes como lípidos libres, tales como el dimicolato de trehalosa (TDM) o el factor del cordón y el monomicolato de trehalosa (TMM). También pueden esterificarse a las unidades terminales de penta-arabinofuranosilo de arabinogalactano, un polisacárido unido a peptidoglicano. En el presente documento, un ácido micólico puede definirse además como cualquiera de estas variantes. En algunas realizaciones, un ácido micólico se define además como un ácido micólico modificado con trehalosa que puede ser de origen natural o sintético, que es conocido en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 4.307.229, 4.720.456, 5.006.514 y 5.049.664. La presencia de tales ácidos grasos de cadena larga es en gran parte responsable de la alta hidrofobicidad y muy baja permeabilidad de la envoltura celular micobacteriana. Se han descrito ácidos micólicos en especies bacterianas distintas de Mycobacterium, por ejemplo, Corynebacterium y Nocardia. En consecuencia, se distinguen tres categorías principales de ácidos micólicos (The Merck Index, 1989), a saber:

i) ácidos corinomicólicos (longitud de cadena de acilo C²⁸-C⁴⁰)

ii) ácidos nocardomicólicos (longitud de cadena de acilo C⁴⁰-C⁶⁰) y

iii) ácidos micólicos micobacterianos (longitud de cadena de acilo C⁶⁰-C⁹⁰).

Se proporciona una descripción detallada de las estructuras de MA, motivos y variaciones en Prog Lipid Res 37: 143 (1998). El MA puede adquirirse, por ejemplo, de Sigma Aldrich, o prepararse tal como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE.u U. n° 6.171.830.

La definición de ácidos micólicos también incluye ácidos micólicos modificados. Por consiguiente, las membranas pueden comprender uno o más ácidos micólicos modificados. Por ejemplo, los ácidos micólicos pueden modificarse reticulando ácidos micólicos. Las membranas de ácidos micólicos pueden fabricarse para que sean más similares a un gel y estables mediante polimerización de grupos terminales o mediante reticulación de grupos internos de ácidos micólicos. Pueden emplearse procedimientos de reticulación similares a los procedimientos de reticulación de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPhPC) u otros lípidos, tal como se conoce en la técnica, para preparar ácidos micólicos modificados. Véase, por ejemplo, A. Singh y JM Schnur, Polymerizable Phospholipids in Phospholipids Handbook, C. Cevc, ed., Marcel Dekker Inc., NY, págs. 233-287 (1993).

Una membrana, tal como se describe en el presente documento, comprende ácidos micólicos micobacterianos y pueden comprender además uno o más tipos adicionales de ácidos micólicos (es decir, mezclas de ácidos micólicos). En algunas realizaciones, una membrana comprende aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más ácidos micólicos, o cualquier intervalo derivado en los mismos. En algunas realizaciones, una membrana comprende 100% de ácidos micólicos. En algunas realizaciones, los ácidos micólicos se derivan de M. tuberculosis.

Por "artificial", se entiende que las membranas no son de origen natural, sino que son fabricadas por el hombre.

La capacidad de construir membranas artificiales que comprenden un ácido micólico puede proporcionar una nueva herramienta para examinar la disposición y configuración de los lípidos de ácidos micólicos en una membrana. Además, las membranas pueden permitir el examen controlado de fármacos y productos químicos a través de los poros de la membrana externa en las membranas externas de las micobacterias, tales como MspA y posiblemente Rv1689. Dicho examen puede ayudar a mejorar el tratamiento de las infecciones por micobacterias.

En la investigación más allá en micobacterias, las membranas pueden proporcionar un bloque de construcción para aplicaciones nanotecnológicas (por ejemplo, bionanotecnológicas) que dependen de la estabilidad de las membranas lipídicas. Estas incluyen secuenciación de ácidos nucleicos de próxima generación y espectroscopía de fuerza de nanoporos. A este respecto, véase la solicitud internacional titulada "Analyte Sequencing with Nanopores" de Jens H. Gundlach, lan M. Derrington y Marcus D. Collins presentada en la Oficina Receptora de Estados Unidos el 23 de febrero de 2011, y Solicitud provisional de Estados Unidos de No. de serie 61/098,938 y su solicitud PCT relacionada, WO 2010/034018, titulada "Msp Nanopores and Related Methods".

Los procedimientos descritos en estas solicitudes pueden emplearse con las membranas de ácido micólico descritas en el presente documento.

Además, se están explorando varios tipos de señales observables como mecanismos de lectura en la secuenciación de nanoporos y la detección de analitos. El procedimiento de lectura propuesto originalmente, más sencillo y más explorado se basa en una "corriente de bloqueo" o "corriente cruzada" iónica determinado únicamente por la identidad de un nucleótido u otro analito que ocupa la constricción más estrecha del poro. Este procedimiento se conoce como "secuenciación de nanoporos de corriente de bloqueo" o BCNS. Se ha demostrado la detección de corrientes de bloqueo y la caracterización de ácidos nucleicos en el poro de proteína a-hemolisina, las porinas de MspA mutantes y los nanoporos en estado sólido. Se ha demostrado que la detección y caracterización de la corriente de bloqueo proporciona una gran cantidad de información sobre la estructura del ADN que atraviesa o se mantiene en un nanoporo en varios contextos. Se pueden realizar experimentos similares con dichos nanoporos incrustados en membranas de ácidos micólicos descritos en el presente documento.

En general, un "bloqueo" se evidencia por un cambio en la corriente de iones que se distingue claramente de las fluctuaciones de ruido y por lo general se asocia con la presencia de una molécula de analito en la abertura central del poro. La fuerza de bloqueo dependerá del tipo de analito que está presente. Más particularmente, un "bloqueo" se refiere a un intervalo en el que la corriente iónica cae por debajo de un umbral de aproximadamente 5-100% del nivel de corriente no bloqueado, se mantiene durante al menos 1,0 ps, y vuelve espontaneamente al nivel no bloqueado. Por ejemplo, la corriente iónica puede caer por debajo de un umbral de aproximadamente, al menos aproximadamente, o como maximo alproximadamente de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50 %, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%, o cualquier intervalo derivable en el mismo. Los bloqueos se rechazan si la señal no bloqueada inmediatamente anterior o siguiente tiene una corriente media que se desvía del nivel no bloqueado típico en más de dos veces el ruido rms de la senal no bloqueada. "Bloqueos profundos" son identificados como intervalos en los que la corriente iónica cae <50% del nivel no bloqueado. Los intervalos donde la corriente se mantiene entre 80% y 50% del nivel de no bloqueado se identifican como "bloqueos parciales."

En algunas realizaciones, la amplitud de la corriente de iones a través del poro se puede convertir en un sistema óptico fluorescente como es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, J Amer Chem Soc 13: 1652 (2009).

Las membranas artificiales de ácidos micólicos también se pueden usar para seleccionar fármacos que presentan una permeabilidad mejorada, para entender la impermeabilidad de la membrana a los fármacos y para evaluar bombas de eflujo de fármaco conocido y desconocido en la membrana (véase Trends Microbiol 18: 109 (2010)). Las membranas también podrían usarse para evaluar proteínas de membrana, tales como porinas de Msp (por ejemplo, MspA y MspA mutante) y OmpATb como dianas de fármacos.

También se contempla un procedimiento por el cual se observa formación de poros de una membrana de ácidos micólicos después de que un fármaco se haya presentado en el lado trans o cis de la membrana. La perforación de la membrana puede observarse controlando una corriente de iones o empleando partículas fluorescentes, u observando el fármaco en el otro lado de la membrana. También se contempla un sistema adaptado para ejecutar tal procedimiento.

Tal como se utiliza en el presente documento, una "membrana no sportada" es una membrana que abarca la abertura de un orificio sin soporte en cualquiera de los lados a lo largo de la superficie de la membrana. La membrana tiene líquido, gas o vacío en uno o ambos lados, pero no está en contacto con un sólido (sustrato) en cualquiera de los lados.

Tal como se utiliza en el presente documento, una "membrana ligada" es una membrana en la que están unidos o ligados los grupos de cabeza de los ácidos micólicos a un sustrato (por ejemplo, plástico, vidrio, chips, microesfera). Los procedimientos para unir lípidos a sustratos para formar membranas ligadas son bien conocidos en la técnica mediante la modificación química de grupos de cabeza, y tales procedimientos pueden usarse para modificar y unir de manera similar grupos de cabeza de ácidos micólicos.

Un "nanoporo" se refiere a un poro que tiene una abertura con un diámetro en su punto más estrecho de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. Por ejemplo, un nanoporo puede ser un nanoporo en estado sólido, un nanoporo de grafeno, un nanoporo de elastómero o puede ser una proteína de origen natural o recombinante que forma un túnel tras la inserción en una bicapa, película delgada, membrana u orificio en estado sólido, también denominada aquí poro de proteína o nanoporo de proteína (por ejemplo, un poro transmembrana). Si la proteína se inserta en la membrana, entonces la proteína es una proteína formadora de túneles. Los procedimientos para determinar si una proteína es una proteína formadora de túneles son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar si una porina de Msp forma un túnel determinando si la proteína se inserta en una bicapa, tal como se describe en la Solicitud Provisional de EE. UU. Número de serie 61/098, y Proc Natl Acad Sci 105: 20647 (2008). Normalmente, la formación de túneles se detecta al observar un cambio discreto en la conductividad. Véase, por ejemplo, Mol Microbiol 33: 933 (1999). Una abertura está típicamente en comunicación líquida o gaseosa con los lados cis y trans del nanoporo. Un nanoporo puede comprender un material en estado sólido, tal como nitruro de silicio, nitruro de silicio modificado, silicio, óxido de silicio o grafeno, o una combinación de los mismos (por ejemplo, un nanoporo puede prepararse fabricando primero un orificio de SiN, colocando una lámina de grafeno sobre el mismo, y a continuación fabricar un nanoporo en el grafeno). Los ejemplos no limitantes de nanoporos proteicos (también denominados poros proteicos) incluyen a-hemolisina y variantes de la misma, una porina de porina de Mycobacterium smegmatis (Msp) y OmpATb.

Un "medio líquido" incluye medios líquidos acuosos, orgánico-acuosos, y orgánicos sólo. Los medios orgánicos incluyen, por ejemplo, metanol, etanol, dimetilsulfóxido y mezclas de los mismos. Los líquidos que se pueden emplear en los procedimientos descritos en el presente documento son bien conocidos en la técnica. Las descripciones y ejemplos de tales medios, incluidos los medios líquidos conductores, se proporcionan en la Patente de Estados Unidos N° 7.189.503, por ejemplo.

Pueden añadirse sales, detergentes, o tampones a tales medios. Tales agentes pueden emplearse para alterar el pH o la fuerza iónica del medio líquido. Se pueden incluir en los medios líquidos sustancias que alteran la viscosidad, tales como glicerol o varios polímeros (por ejemplo, polivinilpirrolidona, polietilenglicol, alcohol polivinílico, polímeros de celulosa) y mezclas de los mismos.

El primer y segundo medios líquidos empleados en cualquier realización pueden ser los mismos o diferentes, y uno o ambos pueden comprender uno o más de una sal, un detergente, o un tampón. Opcionalmente, al menos un medio líquido es conductor. Opcionalmente, al menos un medio líquido no es conductor. El medio líquido puede comprender cualquier analito descrito en el presente documento.

En cualquier realización en el presente documento, un analito puede ser un nucleótido, un ácido nucleico, un aminoácido, un péptido, una proteína, un polímero, un fármaco, un ion, un contaminante, un objeto nanoscópico, o un agente de guerra biológica. Opcionalmente, un analito es un polímero, tal como una proteína, un péptido o un ácido nucleico. Opcionalmente, el polímero es un ácido nucleico. Un ácido nucleico puede ser ssADN, dsADN, ARN o una combinación de los mismos. Cualquier analito descrito en el presente documento puede comprender una microesfera óptica o una microesfera magnética.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "fármaco" se refiere a cualquier sustancia que pueda alterar un proceso biológico de un sujeto. Los medicamentos pueden ser diseñados o utilizados para o en el diagnóstico, tratamiento o prevencion de una enfermedad, trastorno, síndrome u otra afeccion de salud de un sujeto. Los fármacos pueden ser recreativos por naturaleza, es decir, utilizados simplemente para alterar un proceso biológico y no utilizarse para o en el diagnóstico, tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno, síndrome, u otra afeccion de salud de un sujeto. Los productos biológicos, que se refieren a sustancias producidas por mecanismos biológicos que implican la tecnología del ADN recombinante, tambien se incluyen en el término "fármaco". Los fármacos incluyen, por ejemplo, antibacterianos, antiinflamatorios, anticoagulantes, antivirales, antihipertensivos, antidepresivos, antimicrobianos, analgésicos, anestésicos, beta bloqueantes, bisfosfonatos, agentes quimioterapéuticos, agentes de contraste, medicamentos para la fertilidad, alucinógenos, hormonas, narcóticos, opiáceos, sedantes, estatinas, esteroides y vasodilatadores. Ejemplos no limitativos de fármacos también se pueden encontrar en el índice Merck. Los fármacos antibacterianos utilizados en el tratamiento de la tuberculosis, por ejemplo, incluyen isoniazida, rifampicina, pirazinamida y etambutol.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "polímero" se refiere a una molécula que comprende dos o mas unidades lineales (tambien conocidas como "meros"), donde cada unidad puede ser la misma o diferente. Los ejemplos no limitantes de polímeros incluyen ácidos nucleicos, péptidos y proteínas, así como una variedad de polímeros de hidrocarburos (por ejemplo, polietileno, poliestireno) y polímeros de hidrocarburos funcionalizados, en los que la cadena principal del polímero comprende una cadena de carbonos (por ejemplo, cloruro de polivinilo, polimetacrilatos). Los polímeros incluyen copolímeros, copolímeros de bloque y polímeros ramificados, tales como polímeros en estrella y dendrímeros.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "agente de guerra biológica" se refiere a cualquier organismo o cualquier componente de origen natural, bioingeniería, o sintetizado de cualquierde dichos microorganismos capaz de causar la muerte o enfermedad en las plantas o animales (incluyendo seres humanos) o la degradación de los alimentos o suministros de agua o degradación del medio. Los ejemplos no limitantes incluyen virus del Ébola, virus de Marburg, Bacillus anthracis y Clostridium botulinum, Varióla major, Varióla minor, ántrax y ricina.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "contaminante" se refiere a un material que contamina el aire, el agua o el suelo. Los ejemplos no limitantes de contaminantes incluyen fertilizantes, pesticidas, insecticidas, detergentes, hidrocarburos de petróleo, humo y sustancias que contienen metales pesados, tales como las que contienen zinc, cobre o mercurio (por ejemplo, metilmercurio).

Tal como se utiliza en el presente documento, un "aminoácido" se refiere a cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural encontrados en las proteínas, D-estereoisómeros de los aminoácidos de origen natural (por ejemplo, D-treonina), aminoacidos no naturales, y aminoacidos modificados quimicamente. Cada uno de estos tipos de aminoacidos no es mutuamente excluyente. Los a-aminoacidos comprenden un atomo de carbono al que está unido un grupo amino, un grupo carboxilo, un atomo de hidrogeno y un grupo distinto referido como una "cadena lateral". Las cadenas laterales de aminoacidos de origen natural son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, hidrogeno (por ejemplo, como en glicina) , alquilo (por ejemplo, como en alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina), alquilo sustituido (por ejemplo, como en treonina, serina, metionina, cistema, acido aspártico, asparagina, acido glutámico, glutamina, arginina y lisina) , arilalquilo (por ejemplo, como en fenilalanina y triptófano), arilalquilo sustituido (por ejemplo, como en tirosina), y heteroarilalquilo (por ejemplo, como en histidina).

Las siguientes abreviaturas se utilizan para los 20 aminoacidos de origen natural: alanina (Ala; A) , asparagina (Asn; N), acido aspartico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), acido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

Tambien son conocidos aminoacidos no naturales (es decir, aquellos que no se encuentran de forma natural en las proteínas) en la tecnica, tal como se establece en, por ejemplo, Mol. Cell Biol. 9: 2574 (1989); J. Amer. Chem. Soc.

112: 4.011 a 4030 (1990); J. Amer. Chem. Soc. 56: 1280-1283 (1991); J. Amer. Chem. Soc. 113: 9.276-9.286 (1991); y todas las referencias citadas en los mismos. Los p- y y-aminoacidos son conocidos en la tecnica y tambien se contemplan en el presente documento como aminoácidos no naturales. La siguiente tabla muestra ejemplos no limitativos de aminoacidos no naturales que se contemplan en el presente documento.

T l 1. Amin i n n r l m l

Tal como se utiliza en el presente documento, un "aminoácido modificado químicamente" se refiere a un aminoácido cuya cadena lateral se ha modificado químicamente. Por ejemplo, una cadena lateral se puede modificar para que comprenda un resto de señalización, tal como un fluoróforo o un radiomarcador. Se puede modificar una cadena lateral para que comprenda un nuevo grupo funcional, tal como un grupo tiol, ácido carboxílico o amino. Los aminoácidos modificados postraduccionalmente también se incluyen en la definición de aminoácidos modificados químicamente.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "péptido" se refiere a dos o más aminoácidos unidos entre sí por un enlace amida (es decir, un "enlace peptídico"). Los péptidos comprenden hasta o incluyen 50 aminoácidos. Los péptidos pueden ser lineales o cíclicos. Los péptidos pueden ser a, p, y, 8 o superiores, o mixtos. Los péptidos pueden comprender cualquier mezcla de aminoácidos, tal como se definen en el presente documento, tal como, que comprende cualquier combinación de D, L, a, p, y, 8 aminoácidos o aminoácidos superiores.

Tal como se utiliza en el presente documento, una "proteína" se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene 51 o más aminoácidos.

El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma monocatenaria o bicatenaria y, a menos que se limite de otra manera, abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan con ácidos nucleicos de manera similar a los nucleótidos naturales, tales como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y ADN fosforotioato. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular incluye la secuencia complementaria de la misma. Los nucleótidos incluyen, pero sin limitación, ATP, dATP, CTP, dCTP, GTP, dGTP, UTP, TTP, dUTP, 5-metil-CTP, 5-metil-dCTP, ITP, dITP, 2-amino-adenosina-TP, 2-aminodesoxiadenosina-TP, 2-tiotimidina trifosfato, pirrolo-pirimidina trifosfato y 2-tiocitidina, así como los alfa-tiotrifosfatos para todos los anteriores, y 2'-O-metil-ribonucleótido trifosfatos para todas las bases anteriores. Las bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, 5-Br-UTP, 5-Br-dUTP, 5-F-UTP, 5-F-dUTP, 5-propinil dCTP y 5-propinil-dUTP.

Los "motores moleculares" son bien conocidos en la técnica y se refieren a una molécula (por ejemplo, una enzima) que interactúa físicamente con un analito, tal como un polímero (por ejemplo, un polinucleótido), y es capaz de mover físicamente el analito con respecto a una ubicación fija, tal como la abertura de un nanoporo (por ejemplo, un túnel de una porina de Msp). Aunque no pretenden ceñirse a la teoría, los motores moleculares utilizan energía química para generar fuerza mecánica. En algunas realizaciones, un motor molecular puede interactuar con cada unidad (o "mer") de un polímero de manera secuencial. Los ejemplos no limitantes de motores moleculares incluyen ADN polimerasas, ARN polimerasas, helicasas, ribosomas y exonucleasas. También se conocen motores no enzimáticos, tales como motores de virus que empaquetan ADN. Véase Nature 413: 748 (2001). Una variedad de motores moleculares y propiedades deseables de dichos motores se describen en la patente de Estados Unidos No. 7,238,485.

Un motor molecular puede estar dispuesto en el lado cis o el lado trans de una membrana y, opcionalmente, se puede inmovilizar, como se ha descrito por la patente '485. Los procedimientos para incorporar un motor molecular en un nanoporo se pueden realizar usando, por ejemplo, los procedimientos descritos en la patente '485. Los sistemas y aparatos descritos en la patente '485 pueden emplearse con respecto a una membrana que comprende un nanoporo descrito en el presente documento también. Los motores moleculares también se describen en, por ejemplo, J Amer Chem Soc 130: 818 (2008); Nature Nanotech 2: 718 (2007); y ACS Nano 3: 1457 (2009). Los motores moleculares, como se describen en el documento WO 2010/034018, también se pueden emplear en el contexto de los nanoporos y membranas descritos en el presente documento.

Las microesferas que se pueden emplear incluyen microesferas magnéticas y microesferas ópticas. Por ejemplo, se pueden usar microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina para aplicar una fuerza opuesta a las fuerzas electrostáticas que tiran del ADN a través de la abertura de un nanoporo. En esta última técnica, se une una microesfera magnética al ADN biotinilado y se aplicaría una fuerza comparable a la fuerza impulsora electrostática ( 10 pN) utilizando un fuerte gradiente de campo magnético. Véase Biophys J 82: 3314 (2002). De esta manera, la lectura de la corriente de bloqueo no se vería afectada, pero las fuerzas en el ADN podrían controlarse de forma independiente. A continuación, decenas o cientos de lecturas completas e independientes de cada ADN podrían correlacionarse y ensamblarse para reconstruir una secuencia precisa de ADN. En algunas realizaciones, se pueden usar microesferass para visualizar la posición de la membrana o para indicar que la membrana se ha roto. Lo último es útil en casos en los que no es útil o no es posible medir una corriente de iones.

Tal como se utiliza en el presente documento, una "nanopartícula" se refiere a una partícula que tiene una o más dimensiones del orden de 100 nm o menos. Un "objeto nanoscópico", que es un objeto que mide menos de 100 nm en dos de sus dimensiones.

Tal como se utiliza en el presente documento, el "lado cis de una membrana" se refiere al lado de una membrana en el cual se coloca cualquier analito, donde el analito está opcionalmente trasladado. Si no se examina ningún analito, el lado de la membrana que es accesible a través de la perfusión se considera el lado cis de la membrana. Si ambos lados de la membrana son igualmente accesibles mediante perfusión, entonces el operador puede definir el lado cis.

Tal como se utiliza en el presente documento, el "lado trans de una membrana" se refiere al lado de una membrana opuesto al lado cis de la membrana.

Las membranas de ácidos micólicos pueden comprender lípidos distintos de un ácido micólico. Los lípidos son una clase de moléculas conocidas en la técnica y contienen una cola hidrófoba y un grupo de cabeza hidrófilo. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 7.514.267.

En algunas realizaciones, un lípido es un ácido graso saturado o insaturado que varía de 3 a 28 átomos de carbono en longitud de cadena y con de 0 a 6 enlaces insaturados. Los lípidos pueden tener dos cadenas de hidrocarburos, típicamente cadenas de acilo, y un grupo de cabeza, polar o apolar. Existe una variedad de lípidos sintéticos y de origen natural, incluidos los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol y esfingomielina, donde las dos cadenas de hidrocarburos tienen típicamente entre 14 y 22 átomos de carbono de longitud y grados variables de insaturación.

Los fosfolípidos que pueden estar comprendidos en una membrana de ácido micólico incluyen fosfolípidos naturales o sintéticos. Los ejemplos no limitantes incluyen fosfatidilcolina (PC), fosfatidil etanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), fosfatidil glicerol (PG), ácido fosfatídico (PA), fosfatidil serina (PS) y esfingomielina (SM). Las cadenas de acilo graso en los fosfolípidos son generalmente de al menos aproximadamente 7 átomos de carbono de longitud, típicamente de 12 a 20 carbonos de longitud, y pueden estar completamente saturadas o parcialmente insaturadas. Otros ejemplos de fosfolípidos incluyen fosfatidilcolinas, tales como dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC o DPhPC), dilauril fosfatidilcolina (DLPC) C12:0, dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) C14:0, diestearoil fosfatidilfosfatidolina (DSPC), difitanoil fosfatidilcolina, nonadecanoil fosfatidilcolina, araquidoil fosfatidilcolina, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) (C18:1), dipalmitoleoil fosfatidilcolina (C16:1), linoleoil fosfatidilcolina (C18:2), dipalmitoil fosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), dioleoil fosfatidilglicerol (DOPG), palmitoiloleoil fosfatidilglicerol (POPG), diestearoil fosfatidilserina (DSPS), lecitina de soja, lecitina de yema de huevo, esfingomielina, fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, fosfatidil inositoles, difosfatidil glicerol, fosfatidil etanolamina y ácidos fosfatidicos.

Otros lípidos que se pueden utilizar incluyen 1,2-diacil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)], 1,2-diacil-sn-glicero-3-[fosfo-L-serina], 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfato y 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina donde los grupos diacilo pueden ser simétricos o asimétricos y contener ácidos grasos saturados o insaturados de varios tipos que varían de 3 a 28 carbonos en longitud de cadena y con hasta 6 enlaces insaturados. Otros lípidos incluyen fosfatidilcolina de huevo (EPC), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) y 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)].

En algunas realizaciones, pueden incluirse en las membranas no fosfolípidos, lípidos neutros, glicolípidos, colesterol, esteroles, esteroides y similares. En algunas realizaciones, se utilizan lípidos aniónicos. Ejemplos de lípidos aniónicos incluyen ácido fosfatídico (PA), fosfatidilserina (PS) y fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilcolina (PC), 1,2-dimiristoil-snglicero-3-[fosfo-rac-(1-glicerol)] (DMPG). También se pueden usar lípidos catiónicos, en algunas realizaciones. Dichos lípidos catiónicos tienen típicamente un resto lipófilo, tal como un esterol, una cadena de acilo o diacilo, y donde el lípido tiene una carga neta positiva global. El grupo de cabeza del lípido puede tener una carga positiva. Los lípidos catiónicos de ejemplo incluyen 1,2-dioleiloxi-3-(trimetilamino)propano (DOTAP); bromuro de N-[1-(2,3,-ditetradeciloxi) propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE); bromuro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DORIE); cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (d Ot Ma ); 3 [N-(N',N'dimetilaminoetano) carbamoli] colesterol (DC-Chol); y dimetildioctadecilamonio (DDAB). Un lípido también puede ser un lípido neutro, tal como dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE) o un lípido anfipático, tal como un fosfolípido, derivatizado con un lípido catiónico, tal como polilisina u otros lípidos de poliamina.

En algunas realizaciones, se selecciona un lípido para lograr un grado especificado de fluidez o rigidez de una membrana, para controlar la estabilidad de la membrana, o para controlar la tasa de liberación del agente atrapado (por ejemplo, analito) dentro de la membrana. Por ejemplo, los lípidos saturados pueden contribuir a una mayor rigidez de membrana en la bicapa lipídica. También se sabe que otros componentes lipídicos, tales como el colesterol, contribuyen a la rigidez de la membrana en las estructuras de la bicapa lipídica.

Tal como se utiliza en el presente documento, "traslado" y variantes gramaticales significan entrar por un lado de una abertura de un nanoporo y moverse hacia dentro y hacia fuera del otro lado de la abertura. Se contempla específicamente que cualquier realización en el presente documento que comprenda traslado puede referirse a traslado electroforéticp o traslado no electroforético, a menos que se indique específicamente. Un campo eléctrico puede mover un analito de manera que interactúe con la abertura. Por "interactúa" se entiende que el analito entra y, opcionalmente, a través de la abertura, donde "a través de la abertura" (o "traslada") significa entrar por un lado de la abertura y moverse hacia dentro y hacia fuera del otro lado de la apertura. Opcionalmente, se contemplan procedimientos que no emplean traslado electroforético, tal como presión física o presión magnética cuando se utilizan microesferas magnéticas.

Una "porina de Mycobacterium smegmatis (Msp)" o "porina de Msp" se refiere a un complejo multimérico que comprende dos o más monómeros de Msp. Un monómero de Msp esta codificado por un gen en M. smegmatis. M. smegmatis tiene cuatro genes de Msp identificados, denominados MspA, MspB, MspC y MspD. Una porina de Msp puede, por ejemplo, estar constituido por monómeros de MspA de tipo salvaje, monómeros de MspA mutantes, monómeros parálogos u homólogos de MspA de tipo salvaje, o monómeros parálogos u homólogos de MspA mutante. Opcionalmente, una porina de Msp es una de porina de Msp de una cadena o es un multímero de varias porinas de Msp de una cadena. Una porina de Msp de una cadena puede, por ejemplo comprender un multímero formado por dos o más monómeros de Msp (por ejemplo, ocho monómeros) conectados por uno o más péptidos de aminoácidos enlazadores. Una porina parcial de Msp de una cadena se refiere a un complejo multimerico de una cadena que debe dimerizar, trimerizar, o similar para formar una porina. Una porina completa de Msp de una cadena se refiere a un complejo multimérico de una cadena que forma una porina sin la necesidad de dimerizar, trimerizar o similares para formar una porina. Las porinas de Msp son conocidas en la técnica, así como los procedimientos de fabricación de porinas de Msp mutantes. La solicitud internacional WO 2010/034018 describe muchas de estas porinas y procedimientos para fabricar estas porinas.

Un "vestíbulo" se refiere a la porción en forma de cono del interior de una porina de Msp cuyo diámetro disminuye generalmente desde un extremo al otro a lo largo de un eje central, donde la porción más estrecha del vestíbulo está conectada a la zona de constricción. Un vestíbulo también puede denominarse "copa". Véase la FIGURA 1 del documento WO 2010/034018 para ver un ejemplo del vestíbulo de una porina de MspA de tipo salvaje. El vestíbulo y la zona de constricción juntos definen el túnel de una porina de Msp.

Cuando se hace referencia a un diametro del vestíbulo de una porina de Msp, se entiende que debido a que el vestíbulo tiene forma de cono, el diametro cambia a lo largo de la trayectoria de un eje central, en el que el diametro es mayor en un extremo que el extremo opuesto. El diametro puede variar de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 6 nm. Opcionalmente, el diametro es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o como maximo de aproximadamente 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4.3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, o 6,0 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo. La longitud del eje central puede variar de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 6 nm. Opcionalmente, la longitud es de aproximadamente, al menos aproximadamente, o como maximo de aproximadamente 2, 2, 1, 2,2, 2.3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5.0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6, 0 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo. Cuando se hace referencia a "diametro" en el presente documento, se puede determinar un diametro mediante la medicion de distancias de centro a centro o distancias de superficie a superficie atomica.

Una "zona de constriccion" se refiere a la porcion mas estrecha del tunel de una porina de Msp, en terminos de diametro, que se conecta a los vestfbulos. La zona de constriccion de una porina de MspA de tipo salvaje se muestra en la FIGURA 1 de WO 2010/034018 (marcada como "constriccion interior"). La longitud de la zona de constriccion puede variar de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. Opcionalmente, la longitud es de aproximadamente, como maximo, aproximadamente, o al menos aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1.1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o 3 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo. El diametro de la zona de constriccion puede variar de aproximadamente 0,3 nm a aproximadamente 2 nm. Opcionalmente, el diametro es de aproximadamente, como maximo, aproximadamente, o al menos aproximadamente 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o 3 nm, o cualquier intervalo derivable en el mismo.

Una "zona de constriccion neutra" se refiere a una zona de constriccion que comprende cadenas laterales de aminoacidos que acumulativamente exhiben una carga electrica no neta cuando se sumerge en una solucion acuosa.

El pH del medio Ifquido (por ejemplo, una solución acuosa tamponada) en contacto con la zona de constricción puede afectar si la zona de constriccion se caracteriza como neutra o no.

Un "túnel" se refiere a la parte central, vacía de una porina de Msp que se define por el vestíbulo y la zona de constriccion, a traves del cual puede pasar un gas, un líquido, un ion o un analito. Un túnel es un ejemplo de abertura de un nanoporo.

Una "porina de MspA mutante" es un complejo multimerico que tiene al menos o como maximo 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99 por ciento o mas de identidad, o cualquier intervalo derivable en el mismo, pero menos del 100%, a su correspondiente porina de MspA de tipo salvaje y retiene la capacidad de formacion de tunel. Una porina de MspA mutante puede ser una protema recombinante. Opcionalmente, una porina de MspA mutante es una que tiene una mutacion en la zona de constriccion o en el vestibulo de una porina de MspA de tipo salvaje. Opcionalmente, puede aparecer una mutacion en el borde o en el exterior de los bucles periplásmicos de una porina de MspA de tipo salvaje. Una porina de MspA mutante se puede emplear en cualquier realizacion descrita en el presente documento.

En cuanto a la porina de Mspa en particular, opcionalmente, la porina de MspA es un octámero que consiste en ocho monómeros de MspA de 184 aminoácidos. Pueden tener lugar una o más mutaciones en uno o más en los aminoácidos de los monómeros de MspA de una porina de MspA de tipo salvaje para producir una porina de MspA mutante. Además, una porina de MspA puede tener menos o más de ocho monómeros, cualquiera de los cuales puede comprender una mutación.

La porina de MspA de tipo salvaje comprende un bucle periplásmico que consiste en trece amin ácidos y está directamente adyacente a la zona de constricción. Véase J Biol Chem 284: 10223 (2009). Las porinas de MspB, C y D de tipo salvaje también contienen un bucle periplásmico. Pueden producirse una o más mutaciones en el bucle periplásmico de una porina de Msp de tipo salvaje para generar una porina de Msp mutante. Por ejemplo, pueden producirse deleciones de hasta los trece aminoácidos en el bucle periplásmico de la porina de MspA de tipo salvaje. Normalmente, las deleciones en el bucle periplásmico no afectan a la capacidad de formación de túneles de una porina de Msp.

Una porina de Msp o monómero de Msp también se pueden modificar química o biológicamente. Por ejemplo, se puede modificar una porina de Msp o un monómero de Msp con productos químicos para producir puentes disulfuro, tal como conocen los expertos en la técnica.

Una porina de Msp puede comprender un sitio de unión a nucleótidos. Tal como se utiliza en el presente documento, un "sitio de unión de nucleótidos" se refiere a un sitio en una porina de Msp donde un nucleótido permanece en contacto con, o reside en, un aminoácido durante un período de tiempo que es más largo que el atribuible al movimiento de difusión, tal como mayor de un picosegundo o un nanosegundo. Pueden emplearse cálculos de dinámica molecular para evaluar estos tiempos de reposo temporales.

Una o más mutaciones en una porina de Msp pueden aparecer en el vestíbulo o la zona de constricción de la proteína. Opcionalmente, una porina de Msp mutante tiene al menos una diferencia en su secuencia de aminoácidos del bucle periplásmico, vestíbulo o zona de constricción (por ejemplo, deleción, sustitución, adición) en comparación con la porina de Msp de tipo salvaje. En el presente documento se describen otras mutaciones opcionales.

La porina de Msp de cualquier realización en el presente documento puede ser cualquier porina de Msp descrita en el presente documento, tal como una porina de MspA de tipo salvaje, una porina de Mspa mutante, una porina paráloga u homólogo de MspA de tipo salvaje, o una porina paráloga u homólogo de MspA mutante. La porina de Msp puede estar codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica una porina de Msp de una cadena. Cualquier porina de Msp aquí puede comprender cualquier monómero de Msp descrito en el presente documento, tal como un monómero de Msp mutante.

Los nutrientes pasan a través de las porinas de tipo salvaje en micobacterias. Las porinas de MspA de tipo salvaje, las porinas de MspB de tipo salvaje, las porinas de MspC de tipo salvaje y las porinas de MspD de tipo salvaje son ejemplos de porinas formadoras de túneles de tipo salvaje. Una porina de Msp puede definirse además como cualquier porina de Msp descrita en el presente documento, incluidos parálogos, homólogos, mutantes y porinas de una cadena.

Los ejemplos de parálogos y homólogos MspA de tipo salvaje se proporcionan en la Tabla 2. Se proporcionan parálogos de MspA de tipo salvaje, que incluyen MspB de tipo salvaje, MspC de tipo salvaje y MspD de tipo salvaje. Un "parálogo", tal como se define en el presente documento, es un gen de la misma especie bacteriana que tiene una estructura y función similares. Un "homólogo", tal como se define en el presente documento, es un gen de otra especie bacteriana que tiene una estructura y un origen evolutivo similares. A modo de ejemplo, se proporcionan homólogos de MspA de tipo salvaje, que incluyen MppA, PorM1, PorM2, PorM1 y Mmcs4296.

T l 2. M n m r M A i lv r l h m l M A i lv

Solo se incluyeron proteínas con similitudes significativas de aminoácidos en toda la longitud de la proteína. Los datos se obtuvieron mediante el algoritmo PSI-Blast (matriz BLOSUM62) utilizando la base de datos NIH GenBank en la red mundial en ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi. n.d.: "no determinado"

* Mol Microbiol 40: 451 (2001)

** Biochim Biophys Acta 1667: 47-55 (2004)

Una "porina paráloga u homóloga de MspA mutante” es un complejo multímero que tiene al menos o como máximo 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99 por ciento o más de identidad, o cualquier intervalo derivable en el mismo, pero menos del 100%, a su correspondiente porina paráloga u homóloga de MspA de tipo salvaje y conserva la capacidad de formación de túneles. Una porina paráloga u homóloga de MspA mutante puede ser una proteína recombinante. Opcionalmente, una porina paráloga u homóloga de MspA mutante es una que tiene una mutación en la zona de constricción o el vestíbulo de la porina paráloga u homóloga de MspA de tipo salvaje. Opcionalmente, puede producirse una mutación en el borde o el exterior de los bucles periplásmicos de una porina paráloga u homóloga de MspA de tipo salvaje. Se puede emplear cualquier porina paráloga u homóloga de MspA mutante en cualquier realización descrita en el presente documento, y puede comprender cualquier mutación descrita en el presente documento.

Una porina de Msp puede comprender dos o más monómeros de Msp. Un "monómero de Msp" es un monómero de proteína que es un monómero de MspA de tipo salvaje, un monómero de MspA mutante, un monómero parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje, o un monómero parálogo u homólogo de MspA mutante, y retiene la capacidad de formacion de tunel cuando está asociado con uno o mas de otros monómeros de Msp. Cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede comprender una o más de cualquier monómero de Msp, tal como se describe en el presente documento. Cualquier porina de Msp puede comprender, por ejemplo, 2-15 monómeros de Msp, en la que cada monómero puede ser el mismo o diferente.

Un "monómero de MspA mutante" se refiere a un monómero de Msp que tiene al menos o como máximo 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99 por ciento o más de identidad, o cualquier intervalo derivable en el mismo, pero menos de 100%, a un monómero de MspA de tipo salvaje, y retiene la capacidad de formación de túnel cuando está asociado con uno o más de otros monómeros de Msp. Opcionalmente, un monómero de MspA mutante se define además como que comprende una mutación en la parte de la secuencia que contribuye a la formación del vestíbulo o la zona de la constricción de una porina formadora de túnel totalmente formada. El monómero de Msp mutante puede ser una proteína recombinante, por ejemplo. Un monómero de MspA mutante puede comprender cualquier mutación descrita en el presente documento.

En cualquier realización en el presente documento, un monómero de Msp puede ser un parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje, tal como MspA/Msmeg0965, MspB/Msmeg0520, MspC/Msmeg5483, MspD/Msmeg6057, MppA, PorM1, PorM2, PorM1, Mmcs4296, Mmcs4297, Mmcs3857, Mmcs4382, Mmcs4383, Mjls3843, Mjls3857, Mjls3931 Mjls4674, Mjls4675, Mjls4677, Map3123c, Mav3943, Mvan1836, Mvan4117, Mvan4839, Mvan4840, Mvan5016, Mvan5017, Mvan5768, MUL_2391, Mflv1734, Mflv1735, Mflv2295, Mflv1891, MCH4691c, MCH4689c, MCH4690c, MAB1080, MAB1081, MAB2800, RHA1 ro08561, RHA1 ro04074 y RHA1 ro03127.

Un "monómero parálogo u homólogo de MspA mutante" se refiere a monómero parálogo u homólogo de MspA que tiene al menos o como máximo 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, o 99 por ciento o más de identidad, o cualquier intervalo derivable en el mismo, pero menos del 100%, con respecto a un monómero parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje, y conserva la capacidad de formación de túneles. Opcionalmente, un monómero parálogo u homólogo de MspA mutante se define además como que comprende una mutación en la parte de la secuencia que contribuye a la formación del vestíbulo y/o la zona de constricción de una porina formadora de túneles completamente formada. El monómero homólogo o parálogo de MspA mutante puede ser una proteína recombinante, por ejemplo. Cualquier monómero parálogo u homólogo de MspA mutante se puede emplear opcionalmente en cualquier realización del presente documento.

Una porina de Msp puede expresarse como una combinación de dos o más monómeros de MspA de tipo salvaje, monómeros de MspA mutantes, monómeros parálogos u homólogos de MspA de tipo salvaje, o monómeros parálogos u homólogos de MspA mutante. Como tal, una porina de Msp puede ser o comprender un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero, un nonámero, etc. Por ejemplo, una porina de Msp puede comprender una combinación de monómeros de MspA de tipo salvaje y monómeros de MspB de tipo salvaje. Una porina de Msp puede comprender de 1 a 15 monómeros, donde cada monómero es igual o diferente. De hecho, cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede comprender al menos o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 monómeros, o cualquier intervalo derivable en el mismo, donde cada monómero es el mismo o diferente. Por ejemplo, una porina de Msp puede comprender uno o más monómeros de MspA mutantes que son iguales o diferentes. Como otro ejemplo, una porina de Msp puede comprender al menos un monómero de MspA mutante y al menos un monómeros parálogo u homólogo de MspA.

Tal como se definió anteriormente, una porina de Msp de una cadena (monocatenaria) comprende dos o más monómeros de Msp conectados por uno o más péptidos enlazadores de aminoácidos. Una porina de Msp monocatenaria que comprende dos monómeros Msp, en la que los monómeros de Msp están unidos por una secuencia enlazadora de aminoácidos, puede denominarse dímero de porina de Msp monocatenaria. Una porina de Msp monocatenaria que comprende ocho monómeros de Msp, en la que los monómeros de Msp están unidos por una secuencia enlazadora de aminoácidos, puede denominarse octámero de porina de Msp monocatenaria. Una porina de Msp monocatenaria puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más monómeros de Msp, o cualquier intervalo derivado de los mismos, unidos por secuencias enlazadoras de aminoácidos. Opcionalmente, una porina de Msp monocatenaria puede comprender, por ejemplo, dos o más dímeros de porina de Msp monocatenaria, dos o más trímeros de porina de Msp monocatenaria, dos o más cuadrímeros de porina de Msp monocatenaria, dos o más pentímeros de porina de Msp monocatenaria, uno o más hexímeros de porina de Msp monocatenaria, uno o más septímeros de porina de Msp monocatenaria, uno o más octámeros de porina de Msp monocatenaria, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, una porina de Msp monocatenaria puede comprender un dímero de porina de Msp monocatenaria y dos trímeros de porina de Msp monocatenaria. A modo de otro ejemplo, una porina de Msp monocatenaria puede comprender un cuadrímero de porina de Msp monocatenaria y dos dímeros de porina de Msp monocatenaria.

Una porina de Msp monocatenaria de tipo salvaje se compone de monómeros de Msp de tipo salvaje. Opcionalmente, están presentes una o más mutaciones en una porina de Msp monocatenaria en el vestíbulo o la zona de constricción de la porina de Msp monocatenaria. La porina de Msp monocatenaria mutante, por ejemplo, tiene al menos una mutación en la secuencia de aminoácidos para el bucle periplásmico, vestíbulo o zona de constricción (por ejemplo, deleción, sustitución o adición) en comparación con una Msp monocatenaria de tipo salvaje. Un multímero de cadenas simples también puede formar una porina, en el que cada cadena simple incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más monómeros de Msp.

En la Tabla 3 se proporcionan ejemplos no limitantes de secuencias de MspA mutante. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitución de A por P en el aminoácido 138, una sustitución de E por A en el aminoácido 139 o una combinación de las mismas. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitución de D por K o R en el aminoácido 90, una sustitución de D por N en el aminoácido 91, una sustitución de D por N en el aminoácido 93 o cualquier combinación de los mismos. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitución de D por Q en el aminoácido 90, una sustitución de D por Q en el aminoácido 91, una sustitución de D por N en el aminoácido 93 o cualquier combinación de las mismas. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitución de L por W en el aminoácido 88, una sustitución de I por W en el aminoácido 105, una sustitución de D por Q en el aminoácido 91, una sustitución de D por N en el aminoácido 93 o cualquier combinación de los mismos. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitución de I por W en el aminoácido 105, una sustitución de N por W en el aminoácido 108 o una combinación de las mismas. Opcionalmente, la MspA mutante comprende una sustitución de D por R en el aminoácido 118, una sustitución de E por K en el aminoácido 139, una sustitución de D por R en el aminoácido 134 o cualquier combinación de las mismas. Para las secuencias de monómero de MspB mutante enumeradas a continuación, la secuencia de MspB de referencia es la secuencia de monómero de MspB de tipo salvaje maduro, que se conoce en la técnica. Opcionalmente, la MspB mutante comprende una sustitución de D por K o R en el aminoácido 90, una sustitución de D por N en el aminoácido 91, una sustitución de D por N en el aminoácido 93 o cualquier combinación de los mismos.

Tabla 3: Mutantes de Ms a

Un monómero de MspA puede comprender una o más mutaciones en cualquiera de las siguientes posiciones de aminoácidos: 88, 105, 108, 118, 134 o 139. Un monómero de MspA puede comprender una o más de las siguientes mutaciones: L88W, D90K/N/Q/R, D91N/Q, D93N, I105W, N108W, D118R, D134R o E139K. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90N/D91N/D93N. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90Q/D91Q/D93N. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90Q/D91Q/D93N/D118R/D134R/E139K. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: D90 (K,R)/D91N/D93N. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: (L88, I105) W/D91Q/D93N. Un monómero de MspA puede comprender las siguientes mutaciones: I105W/N108W. Además, un monómero de MspA puede comprender cualquiera de otras mutaciones descritas en el presente documento.

En cualquier realización en el presente documento, una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o un parálogo u homólogo de Mspa mutante, puede comprender al menos un aminoácido adicional cargado positivamente en comparación con el vestíbulo o la zona de la constricción de una porina de Msp de tipo salvaje, respectivamente; al menos un aminoácido adicional cargado negativamente en comparación con el vestíbulo o la zona de constricción de una porina de MspA de tipo salvaje, respectivamente; al menos un aminoácido cargado menos positivamente en comparación con el vestíbulo o la zona de constricción de una porina de MspA de tipo salvaje, respectivamente; o al menos un aminoácido cargado menos negativamente en comparación con el vestíbulo o la zona de constricción de una porina de MspA de tipo salvaje, respectivamente.

Opcionalmente, cada aminoácido cargado positivamente en el vestíbulo y la zona de la constricción de una porina de Msp de tipo salvaje se sustituye por un aminoácido cargado negativamente, y cada aminoácido cargado negativamente es el mismo o diferente; o cada aminoácido cargado negativamente en el vestíbulo y la zona de constricción de una porina de Msp de tipo salvaje se sustituye por un aminoácido cargado positivamente, y cada aminoácido cargado positivamente es igual o diferente.

Opcionalmente, el vestíbulo o la zona de constricción de una porina de Msp mutante comprende un número mayor de residuos cargados positivamente que el del vestíbulo o la zona de constricción de una porina de Msp de tipo salvaje, respectivamente; o el vestíbulo o la zona de constricción comprende un número mayor de residuos cargados negativamente que el del vestíbulo o la zona de constricción de una porina de Msp de tipo salvaje, respectivamente; o al menos un aminoácido cargado positivamente en el vestíbulo o la zona de constricción de una porina de Msp de tipo salvaje, tal como una porina de MspA de tipo salvaje o una porina homóloga o paráloga de MspA de tipo salvaje, se elimina o sustituye por un aminoácido cargado negativamente; o al menos un aminoácido cargado negativamente en el vestíbulo o la zona de constricción de una porina de Msp de tipo salvaje se elimina o se reemplaza por un aminoácido cargado positivamente.

Al menos un aminoácido en el vestíbulo o la zona de la constricción de una porina de Msp de tipo salvaje, tal como una porina de MspA de tipo salvaje o una porina paráloga u homóloga de MspA de tipo salvaje, puede estar sustituido por un aminoácido que tiene una cadena lateral estéricamente más grande; un aminoácido que tiene una cadena lateral estéricamente más pequeña; un aminoácido que tiene una cadena lateral más polar; un aminoácido que tiene una cadena lateral menos polar; o un aminoácido que tiene una cadena lateral más hidrófoba; un aminoácido que tiene una cadena lateral menos hidrófoba.

En cualquier realización en el presente documento, al menos un aminoácido en el vestíbulo o en la zona de constricción de una porina de Msp mutante puede comprender un aminoácido no natural o un aminoácido modificado químicamente.

Una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o una porina homóloga o paráloga de MspA mutante, puede comprender una zona de constricción neutral. Una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o una porina homóloga o paráloga de MspA mutante, puede comprender una conductancia a través del túnel que es superior, por ejemplo, dos veces mayor, que la conductancia a través del túnel de su correspondiente porina de Msp de tipo salvaje. Una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o una porina homóloga o paráloga de MspA mutante, puede comprender una conductancia a través del túnel que es menor que la conductancia a través del túnel de su correspondiente porina de Msp de tipo salvaje.

Cualquier porina de Msp descrita en el presente documento puede comprender un vestíbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diámetro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constricción que tiene una longitud de aproximadamente 0, 3 a aproximadamente 3 nm y un diámetro de aproximadamente 0, 3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestíbulo y la zona de constricción juntos definen un túnel. También se proporciona en el presente documento una porina de MspA mutante que comprende un vestíbulo que tiene una longitud de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm y un diámetro de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 nm, y una zona de constricción que tiene una longitud de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm y un diámetro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3 nm, en el que el vestíbulo y la zona de constricción juntos definen un túnel, y que comprende además al menos un parálogo u homólogo del primer monómero de MspA mutante.

El diámetro de la zona de constricción de una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante u homólogo o parálogo de MspA mutante, puede ser menor que el diámetro de la zona de restricción de su correspondiente porina de Msp de tipo salvaje, tal como una porina de MspA de tipo salvaje o un parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje. Una porina de Msp mutante, tal como una porina de MspA mutante o un parálogo u homólogo de MspA mutante, puede comprender una mutación en el vestíbulo o en la zona de constricción que permite que un analito tenga una velocidad o una velocidad promedio a medida que interactúa con el túnel que es menor que la velocidad o velocidad promedio a la que interactúa el analito con el túnel de su correspondiente porina de Msp de tipo salvaje (por ejemplo, porina de MspA de tipo salvaje, parálogo u homologo de MspA de tipo salvaje).

Las secuencias de monómeros de Msp de tipo salvaje discutidas en el presente documento se describen en GenBank, ubicado en la red mundial en pubmed.gov.

Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de un monómero de MspA de tipo salvaje se pueden encontrar en GenBank Accession Nos. AJ001442 y CAB56052, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de un monómero de MspB de tipo salvaje se pueden encontrar, por ejemplo, en GenBank Accession Nos. NC_008596.1 (desde el nucleótido 600.086 a 600.730) y YP_884932.1, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de un monómero de MspC de tipo salvaje se pueden encontrar, por ejemplo, en GenBank Accession Nos. AJ299735 y CAC82509, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de un monómero de MspD de tipo salvaje se pueden encontrar, por ejemplo, en GenBank Accession Nos. AJ300774 y CAC83628, respectivamente. De este modo, se proporcionan las secuencias de nucleótidos de los monómeros MspA, MspB, MspC y MspD que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 por ciento o más, o cualquier intervalo derivable en el mismo, idéntica a la secuencia de nucleótidos de los números de acceso de GenBank de nucleótidos mencionados anteriormente. También se proporcionan secuencias de aminoácidos de los monómeros MspA, MspB, MspC y MspD en la FIGURA 18 de WO 2010/034018 que comprenden una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 por ciento o más, o cualquier intervalo derivable en el mismo, idéntica a las secuencias de los números de acceso de GenBank de aminoácidos mencionados anteriormente.

También se proporcionan secuencias de aminoácidos de monómeros parálogos y homólogos de MspA que comprenden una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 por ciento o más, o cualquier intervalo derivable en el mismo, con respecto a un monómero parálogo u homólogo de MspA de tipo salvaje. Los monómeros parálogo y homólogo de MspA de tipo salvaje son bien conocidos en la técnica. Ver tabla 2.

El poro de a-hemolisina está formado de siete subunidades idénticas (heptamérico). La secuencia de polinucleótidos que codifica una subunidad de a-hemolisina se muestra en SEQ ID NO: 1 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Número de serie 2010/0196203.

La secuencia de aminoácidos de longitud completa de una subunidad de a-hemolisina se muestra en SEQ ID NO: 2 de la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos Número de serie 2010/0196203. Los primeros 26 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 corresponden al péptido señal. La secuencia de aminoácidos de una subunidad madura de a-hemolisina sin el péptido señal se muestra en la SEQ ID NO: 3 de la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Número de serie 2010/0196203. SEQ ID NO: 3 tiene un residuo de metionina en la posición 1 en lugar del péptido señal de 26 aminoácidos que está presente en SEQ ID NO: 2.

Una variante es un poro heptamérico en el que una o más de las siete subunidades tiene una secuencia de aminoácidos que varía de la de la SEQ ID NO: 2 o 3 y que retiene la actividad de los poros. 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de las subunidades en una a-hemolisina mutante pueden tener una secuencia de aminoácidos que varía de la de la SEQ ID NO: 2 o 3. Las siete subunidades dentro de un poro mutante son típicamente idénticas, pero pueden ser diferentes.

El mutante puede ser una variante de origen natural que es expresado por un organismo, por ejemplo por una bacteria Staphylococcus. Las variantes también incluyen variantes no naturales producidas por tecnología recombinante. En toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 3, una variante puede ser al menos 50% homóloga a esa secuencia en base a la identidad de aminoácidos. El polipéptido de la subunidad puede ser al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99% homólogo basado en la identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 3 sobre la secuencia completa.

Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 3, por ejemplo puede realizarse una única sustitución de aminoácidos o pueden realizarse dos o más sustituciones. En algunas realizaciones, la sustitución de la lisina en la posición 34 en SEQ ID NO: 2 y la posición 9 en SEQ ID NO: 3 por cisteína (es decir, K34C o K9C). Otro ejemplo de sustitución no conservadora que puede realizarse es la sustitución del residuo de asparagina en la posición 43 de SEQ ID NO: 2 o la posición 18 de SEQ ID NO: 3 por cisteína (es decir, N43C o N17C). La inclusión de estos residuos de cisteína en SEQ ID NO: 2 o 3 proporciona puntos de unión de tiol en las posiciones relevantes. Se pueden realizar cambios similares en todas las demás posiciones y en varias posiciones de la misma subunidad.

En algunas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 3 pueden, alternativa o adicionalmente, ser eliminados. Se pueden eliminar hasta el 50% de los residuos, ya sea como una región contigua o como múltiples regiones más pequeñas distribuidas a lo largo de la cadena de aminoácidos.

Las variantes pueden incluir subunidades hechas de fragmentos de la SEQ ID NO: 2 o 3. Tales fragmentos retienen su capacidad para insertar en una bicapa. Los fragmentos pueden tener al menos 100, tales como 150, 200 o 250, aminoácidos de longitud. Estos fragmentos pueden usarse para producir poros quiméricos. Un fragmento puede comprender el dominio de barril p de SEQ ID NO: 2 o 3.

Las variantes incluyen proteínas quiméricas que comprenden fragmentos o porciones de la SEQ ID NO: 2 o 3. Las proteínas quiméricas se forman a partir de subunidades que comprenden cada una fragmentos o porciones de la SEQ ID NO: 2 o 3. La parte p-barril de proteínas quiméricas está típicamente formada por los fragmentos o porciones de SEQ ID NO: 2 o 3.

Se pueden insertar, alternativa o adicionalmente, uno o más residuos de aminoácidos en, o en uno u otro o ambos extremos de, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 o 3. La inserción de uno, dos o más aminoácidos adicionales en el extremo C terminal de la secuencia peptídica es menso probable que perturbe la estructura y/o función de la proteína, y estas adiciones podrían ser sustanciales, pero se pueden usar secuencias de péptidos de hasta 10, 20, 50, 100 o 500 aminoácidos o más. Las adiciones en el extremo N terminal del monómero también podrían ser sustanciales, con uno, dos o más residuos adicionales añadidos, pero también añadiendo 10, 20, 50, 500 o más residuos. También se pueden añadir secuencias adicionales a la proteína en la región transmembrana, entre los residuos de aminoácidos 119 y 139 de SEQ ID NO: 3. De manera más precisa, se pueden añadir secuencias adicionales entre los residuos 127 y 130 de SEQ ID NO: 3, después de la eliminación de los residuos 128 y 129. Las adiciones se pueden realizar en las posiciones equivalentes en SEQ ID NO: 2. Se puede fusionar una proteína portadora a una secuencia de aminoácidos según la presente invención.

En el presente documento se describen otras mutaciones opcionales.

La OmpATb es una proteína de membrana externa presente en, por ejemplo, M. tuberculosis y M. bovis | [isc¹]. La actividad formadora de poros de OmpATb depende del pH, lo que permite que las micobacterias sobrevivan en condiciones ambientales ácidas. Las secuencias de OmpATb tanto en M. tuberculosis y M. bovis son idénticas. Consulte la FIGURA 1 de la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos Número de serie 2010/0150966.

El término "OmpATb" comprende la forma nativa de la proteína en las micobacterias, así como proteínas recombinantes producidas en cualquier tipo de vectores de expresión que transforman cualquier clase de huésped, o también proteínas o péptidos sintetizados químicamente. También incluye proteínas análogas, es decir, proteínas con variaciones menores que no afectan a la antigenicidad de OmpATb, por ejemplo, proteínas que tienen al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia de OmpATb. En el presente documento se describen otras mutaciones opcionales.

A continuación se describen descripciones de sustituciones opcionales adicionales que pueden realizarse con respecto a porinas de Msp, monómeros de Msp, a-hemolisina y variantes de la misma, y OmpATb y otras proteínas proporcionadas en el presente documento.

Las modificaciones de proteínas descritas en el presente documento incluyen modificaciones de la secuencia de aminoácidos. Las modificaciones en la secuencia de aminoácidos pueden surgir de forma natural como variaciones alélicas (por ejemplo, debido a polimorfismo genético), pueden surgir debido a la influencia ambiental (por ejemplo, debido a la exposición a radiación ultravioleta), o pueden producirse por intervención humana (por ejemplo, por mutagénesis de secuencias de ADN clonado), tales como mutantes inducidos puntuales, por deleción, inserción y sustitución. Estas modificaciones pueden resultar en cambios en la secuencia de aminoácidos, proporcionar mutaciones silenciosas, modificar un sitio de restricción o proporcionar otras mutaciones específicas. Las modificaciones en la secuencia de aminoácidos se encuentran típicamente en una o más de tres clases: modificaciones de sustitución, inserción o deleción. Las inserciones incluyen fusiones de amino y/o terminales, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Normalmente, las inserciones serán inserciones más pequeñas que las de las fusiones amino o carboxilo terminales, por ejemplo, del orden de uno a cuatro residuos. Las deleciones se caracterizan por la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de proteínas. Normalmente, no se eliminan más de aproximadamente 2 a 6 residuos en cualquier sitio dentro de la molécula de proteína. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden producirse en varios lugares diferentes a la vez; las inserciones serán normalmente del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos; y las deleciones variarán de aproximadamente 1 a 30 residuos. Pueden realizarse deleciones o inserciones en pares adyacentes, es decir, una deleción de 2 residuos o una inserción de 2 residuos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se pueden combinar para llegar a una construcción final. Las mutaciones pueden colocar o no la secuencia fuera del marco de lectura y pueden o no pueden crear regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm secundaria. Las modificaciones sustitutivas son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo y se han insertado residuos diferentes en su lugar.

Las modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos específicas, se realizan mediante procedimientos conocidos. A modo de ejemplo, las modificaciones se realizan mediante mutagénesis específica de sitio de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína, produciendo así el ADN que codifica la modificación y a continuación expresando el ADN en cultivo de células recombinantes. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis por PCR.

Los péptidos, polipéptidos, monómeros, multímeros, proteínas, etc. descritos en el presente documento pueden modificarse y variarse adicionalmente siempre que se mantenga o mejore la función deseada. Se entiende que una forma de definir cualquier modificación y derivado conocidos o aquellos que puedan surgir de los genes y proteínas descritos en el presente documento es definiendo las modificaciones y derivados en términos de identidad con secuencias conocidas específicas. Se describen específicamente polipéptidos que tienen al menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por ciento de identidad con una MspA de tipo salvaje y parálogos u homólogos de MspA de tipo salvaje (por ejemplo, MspB de tipo salvaje, MspC de tipo salvaje, MspD de tipo salvaje, MppA, PorM1, Mmcs4296) y mutantes proporcionados en el presente documento, así como a-hemolisina y variantes de la misma y OmpATb.

Los expertos en la técnica entienden fácilmente como determinar la identidad de dos polipéptidos. Por ejemplo, la identidad puede calcularse después de alinear las dos secuencias, de manera que la identidad se encuentra en su nivel más alto. Por ejemplo, para determinar el "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para una óptima alineación con una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico). A continuación, se comparan residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud.

Existen varios procedimientos para determinar el porcentaje de identidad. Se puede determinar el porcentaje de identidad de la siguiente manera. Se compara una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos diana con la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos identificada utilizando el programa de BLAST 2 Sequences (B12seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN versión 2.0.14 y BLASTP versión 2.0.14. Esta versión independiente de BLASTZ se puede obtener del sitio web del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología del gobierno de Estados Unidos (World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov). Las instrucciones que explican cómo utilizar el programa B12seq se pueden encontrar en el archivo "readme" que acompaña a BLASTZ.

B12seq lleva a cabo una comparación entre dos secuencias utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácidos nucleicos, las opciones se pueden establecer de la siguiente manera: -i se ajusta a un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico que se compara (por ejemplo, C:\seq1.txt) ; -j se ajusta a un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt) ; -p se ajusta a blastn; -o se ajusta a cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se ajusta a -1; -r se ajusta a 2; y todas las demás opciones se dejan en su configuración por defecto. El siguiente comando generará un archivo de salida que contiene una comparación entre dos secuencias: C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1-r 2. Si la secuencia diana comparte homología de secuencia con cualquier porción de la secuencia identificada, entonces el archivo de salida designado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si la secuencia diana no comparte homología con ninguna porción de la secuencia identificada, entonces el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas.

Una vez alineado, se determina la longitud contando el número de nucleótidos consecutivos de la secuencia diana presentada en alineación con la secuencia de la secuencia identificada empezando con cualquier posición coincidente y terminando con cualquier otra posición coincidente. Una posición coincidente es cualquier posición en la que un nucleótido idéntico se presenta tanto en la secuencia diana como en la secuencia identificada. Los huecos que se presentan en la secuencia diana no se cuentan, ya que los huecos no son nucleótidos. Del mismo modo, los huecos presentados en la secuencia identificada no se cuentan, ya que los nucleótidos de la secuencia diana se cuentan, ni los nucleótidos de la secuencia identificada.

El porcentaje de identidad sobre una longitud particular se puede determinar contando el número de posiciones coincidentes sobre esa longitud y dividiendo ese número por la longitud seguido por la multiplicación del valor resultante por 100. Por ejemplo, si (1) una secuencia diana de 50 nucleótidos se compara con la secuencia de codificación de MspA de tipo salvaje (2) el programa B12seq presenta 45 nucleótidos de la secuencia diana alineados con una región de la secuencia de codificación de MspA de tipo salvaje donde el primer y último nucleótidos de esa región de 45 nucleótidos son coincidencias, y (3) el número de coincidencias sobre esos 45 nucleótidos alineados es 40, entonces la secuencia diana de 50 nucleótidos contiene una longitud de 45 y un porcentaje de identidad sobre esa longitud de 89 (es decir, 40/45 x 100 = 89).

Otra forma de calcular la identidad se puede realizar mediante algoritmos publicados. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de identidad de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

85: 2444 (1988), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.

Los mismos tipos de identidad pueden obtenerse para ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos descritos en Science 244: 48-52 (1989); roc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706-10 (1989); y Methods Enzymol. 183: 281-306 (1989).

Se entiende que cualquiera de los procedimientos se puede utilizar normalmente y que en ciertos casos los resultados de estos diversos procedimientos pueden ser diferentes, pero el experto en la materia entiende si la identidad se encontrara con al menos uno de estos procedimientos, se diría que las secuencias tienen la identidad indicada y estaráin descritas en el presente documento.

Los ácidos nucleicos que codifican secuencias de proteínas descritos en el presente documento, así como variantes y fragmentos de los mismos, están también descritos. Estas secuencias incluyen todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia de proteína específica, es decir, todos los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia de proteína particular, así como todos los ácidos nucleicos, incluyendo los ácidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes descritas y derivados de las secuencias de proteínas. Por lo tanto, mientras que cada secuencia de ácido nucleico en particular puede no estar descrita en el presente documento, se entiende que todas y cada una de las secuencias está de hecho descrita y dada conocer en el presente documento a través de las secuencias de proteínas descritas.

Los fragmentos y secuencias parciales de proteínas pueden ser útiles en los procedimientos descritos en el presente documento. Al igual que con todos los péptidos y proteínas, incluyendo fragmentos de los mismos, se entiende que las modificaciones adicionales en la secuencia de aminoácidos de las proteínas descritss en el presente documento pueden aparecer sin alterar la naturaleza o función de los péptidos y proteínas. Se entenderá que la única limitación en estas es práctica, deben comprender los elementos funcionales necesarios (por ejemplo, capacidad de formación de túnel) para usar en la realización pertinente. Tales modificaciones incluyen sustituciones de aminoácidos conservadoras y se discuten en mayor detalle a continuación.

38 (12La siguiente tabla proporciona ejemplos no limitativos de propiedades de los aminoácidos que pueden ayudar a un experto en la técnica en la determinación de cómo seleccionar los aminoácidos para las modificaciones de proteínas (por ejemplo, poros de proteína), tal como se describen en el presente documento.

Tabla 4. Propiedades de los aminoácidos

Alternativamente, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en función de sus características de hidrofobicidad y/o carga, estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina ( 3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y/o arginina (-4,5). La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica. Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice y/o puntuación hidropáticos similares y/o aún conservan una actividad biológica similar. Al realizar cambios basados en el índice hidropático, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos pueden estar dentro de ± 2; dentro de ± 1, o dentro de ± 0,5.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente en base a la hidrofilicidad. Tal como se detalla en la patente de Estados Unidos 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina ( 0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina ( 2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Al realizar cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, se contempla la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad pueden estar dentro de ± 2, dentro de ± 1 o aquellos dentro de ± 0,5.

Cualquier proteína mutante puede comprender una sustitución de aminoácidos conservadora en comparación con una porina o monómero de Msp de tipo salvaje. Cualquier mutación de sustitución es conservadora porque altera mínimamente las propiedades bioquímicas de la proteína. Los ejemplos no limitantes de mutaciones que se introducen para sustituir residuos de aminoácidos conservadores incluyen: residuos cargados positivamente (por ejemplo, H, K y R) sustituidos por residuos cargados positivamente; residuos cargados negativamente (por ejemplo, D y E) sustituidos por residuos cargados negativamente; residuos polares neutros (por ejemplo, C, G, N, Q, S, T e Y) sustituidos con residuos polares neutros; y residuos no polares neutros (por ejemplo, A, F, I, L, M, P, V y W) sustituidos por residuos no polares neutros. Se pueden realizar sustituciones conservadoras de acuerdo con la siguiente Tabla 5.

T l : i i n min i m l

Normalmente, un nanoporo podrá insertarse en una bicapa lipídica u otra película delgada, y estas técnicas son bien conocidas en la técnica, tal como se explica en el presente documento. Además, la Patente de Estados Unidos N° 6.746.594 describe una variedad de bicapas lipídicas y películas delgadas, que incluyen materiales inorgánicos, que pueden emplearse con respecto a los nanoporos discutidos en el presente documento. Los procedimientos, aparatos y técnicas descritos en la Patente de Estados Unidos N° 6.267.872 también se pueden emplear con respecto a los nanoporos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, una pluralidad de nanoporos están comprendidos en una membrana artificial que comprende ácidos micólicos micobacterianos. Por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 200, 2000 o más pueden estar comprendidos en una membrana.

Opcionalmente, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 200, 2000, o más nanoporos están comprendidos en una membrana, bicapa o película delgada. De hecho, se pueden emplear de 2 a 1010 nanoporos en las realizaciones descritas en el presente documento. Dicha pluralidad de nanoporos puede estar en forma de grupos de nanoporos. Los grupos pueden ensamblarse al azar o pueden adoptar un patrón. Tal como se utiliza en el presente documento, un "grupo" se refiere a moléculas que se agrupan juntas y se mueven como una unidad, pero que no están unidas covalentemente entre sí.

Como alternativa a o además de "que comprende", cualquier realización en el presente documento puede indicar "consiste en". La frase de transición "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicación.

Cualquier realización en el presente documento puede excluir opcionalmente cualquier otra realización del presente documento.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a menos que se indique expresamente para referirse a alternativas solamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere solo a alternativas y "y/o".

A lo largo de esta solicitud, el termino "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la desviación estándar del error para el dispositivo o procedimiento que se emplea para determinar el valor. En cualquier realización descrita en el contexto de un valor numérico que se utiliza en conjunción con el término "aproximadamente", se contempla específicamente que el término aproximadamente puede omitirse.

Siguiendo la antigua ley de patentes, las palabras "un" y "una", cuando se utiliza junto con la palabra "que comprende" en las reivindicaciones o la memoria, se refiere a uno o más, a menos que se indique espedficamente.

Se dan a conocer materiales, composiciones, y componentes que se pueden utilizar para, se pueden utilizar en conjunción con, se pueden utilizar en la preparación de, o son productos de los procedimientos y composiciones descritos. Estos y otros materiales se describen en el presente documento, y se entiende que cuando se dan a conocer combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc., de estos materiales, que aunque la referencia específica de cada una de varias combinaciones individuales y colectivas y permutaciones de estos compuestos puede no estar descrita de forma explícita, cada uno se contempla específicamente y descrita en el presente documento. Por ejemplo, si se da a conocer y se describe un procedimiento y se dan a conocer una serie de modificaciones que se pueden realizar a una serie de moléculas que incluye el procedimiento, todas y cada combinación y permutación del procedimiento, y las modificaciones que son posibles se contemplan específicamente a menos que se indique específicamente lo contrario. Del mismo modo, cualquier subconjunto o combinación de estas también se contemplan y se describen específicamente. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta descripción incluyendo, pero no limitado a, los pasos en los procedimientos que utilizan las composiciones descritas. Por lo tanto, si hay una gran variedad de pasos adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada uno de estas etapas adicionales se puede realizar con cualquier etapa de procedimiento específicas o combinación de etapas de procedimiento de los procedimientos descritos, y que cada una de tales combinaciones o subconjuntos de combinaciones se contemplan específicamente y deben considerarse como descritas. Por tanto, se contempla que cualquier realización descrita en esta memoria se puede implementar en relación con cualquier procedimiento, sistema, o composición, etc.., que se describen en el presente documento, y viceversa. Por ejemplo, cualquier nanoporo descrito en el presente documento se puede emplear en cualquier procedimiento descrito en el presente documento.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales y procedimientos utilizados en los ejemplos 1-5

La configuración experimental utilizada en los siguientes ejemplos se ha descrito previamente (Biophys J 77, 3227 (1999) y Biophys J 90: 190 (2006)). Brevemente, se forma un orificio de Teflon® de 20-90 pm fundiendo un tubo termorretráctil de Teflon® (Small Parts, Inc.) alrededor de una aguja o alambre finamente afilado. Después de retirar la aguja o el alambre, el tubo se corta para formar un orificio del ancho deseado. A continuación, el tubo se dobla para conectar dos pocillos de ~ 200 pL en un soporte de Teflon®. Se utilizan electrodos Ag-AgCl para conectar a tierra el pocillo cis resultante y conectar el pocillo trans a un amplificador de fijación de voltaje Axopatch™ 200B, 1B o 1C operado en modo de fijación de voltaje. Para encontrar el voltaje de ruptura de la membrana de las membranas MA, que excedió el voltaje de salida máximo de 1,2 V de los amplificadores de fijación de voltaje, se utilizó una fuente de alimentación variable en serie con un picoamperímetro Keithley® 485. A 1. Una solución de KCl 1,0 M en agua DI, tamponada a pH 8,0 /- 0,05 con HEPEs 10 mM se conecta eléctricamente a los dos pocillos.

Las corrientes de canales de iones se muestrean a 250 kHz o 500 kHz y se filtra a paso bajo con un filtro Bessel de 4 polos a un 1/5 de frecuencia de muestreo. La adquisición de datos fue controlada por software personalizado escrito en LabWindows® y LabVIEW®. Para las mediciones de vida útil, los datos se muestrearon a 10 Hz.

Ejemplo 2: Formación de membranas artificiales de ácidos micólicos

Se compraron ácidos micólicos (> 98%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) que se extraen de M. tuberculosis y se disuelven en cloroformo hasta 50 g/l y se almacenan a - 20°C hasta su uso. Las membranas de ácidos micólicos se forman utilizando la técnica de pintura, ampliamente utilizada en experimentos similares con dipalmitoilfosfatidilcolina (DPhPC) (Biophys J 77: 3227 (1999)). El proceso comenzó con dos pasos preparatorios. En el primer paso, se pretrató la abertura de Teflon® con una capa de una mezcla de lípido-hexano. Se secó al aire 1 pl de la solución de MA/cloroformo en un tubo de ensayo de vidrio, a continuación, se resuspendió en 0,01 g de hexano. Se aplicó 1 pl de la solución de pretratamiento de Ma resuspendida al lado cis de la abertura de Teflon® y a continuación se aplicó una presión de aire suave con una jeringa desde el lado trans para despejar la abertura a medida que se evaporaba el hexano. Después de limpiar la solución de la abertura una vez, se aplicó y se aclaró otro 1 pl de solución de pretratamiento. Después de dejar que el sistema se seque al aire durante 15 minutos, se estableció una conexión eléctrica entre los dos electrodos colocando el tampón de KCl en la abertura, el tubo y los pocillos.

En el segundo paso preparatorio, se pintó el lípido sobre el orificio. Se secaron al aire 10 pl de la solución de MA/cloroformo sobre un portaobjetos de vidrio limpiado con cloroformo. A continuación, se aplicaron ~ 0,1 pl de hexadecano sobre el MA y la solución se calentó hasta 35°C durante aproximadamente 5 min para promover la incorporación del hexadecano en el lípido. Cuando la mezcla de MA-hexadecano alcanzó una consistencia similar a un gel, se aplicó una gota de la mezcla de ~ 1 mm de diámetro a un cepillo de una sola cerda. Mientras se monitoreaba la corriente de iones a través de la abertura, la mezcla de lípido-disolvente se aplicó suavemente sobre la abertura de Teflon® hasta que la corriente cayó a cero. Forzar manualmente el tampón a través del orificio desde el lado trans eliminó el bloqueo físico. Para aberturas de más de 40 pm de diámetro, el lípido se aplicó al borde externo de la abertura, en lugar de la parte superior de la abertura.

Las membranas se formaron mediante la colocación de una burbuja de aire de 3-6 pl sobre la abertura preparada utilizando una micropipeta y a continuación la burbuja de aire se retrajo suavemente. La formación de membranas fue indicada por la caída brusca de la corriente a cero a través de la abertura. Si se pueden formar nanoporos dentro del sistema lipídico, se supone la presencia de una membrana en bicapa y no una estructura lipídica multilaminar o una obstrucción lipídica física. La observación de estos poros se describe a continuación.

Ejemplo 3: Determinación de las propiedades de las membranas artificiales de ácidos micólicos

Formación. Las membranas de MA se formaron con una fiabilidad similar a las membranas de DPhPC. Además, MspA se incorporó de manera similar en las membranas de MA (Figura 2) y de DPhPC a ~ 0,2 poros/segundo con una concentración de ~ 10 nM de MspA. Los poros de MspA en las membranas de MA duraron varias horas antes de abandonar espontáneamente la membrana, similar al comportamiento de los poros de MspA en las membranas de DPhPC.

La MspA tiene una altura de aproximadamente 9 nm y una longitud hidrófoba de sólo -5 nm que limitan el tamaño de la barrera hidrófoba que el nanoporo puede penetrar. In vivo, las membranas externas de Micobacterias son de -8 nm. Si la membrana consiste en dos o más capas de MA (con una capa de aceite que separa las dos), MspA no podría atravesar la membrana. Por lo tanto, la inserción del poro de MspA transmembrana dentro del sistema de MA sugiere fuertemente la formación de membranas bicapa en lugar de otras configuraciones lipídicas.

Resistencia, ruptura, capacitancia y longevidad de la membrana. Las membranas de MA se examinaron utilizando el amplificador Axopatch® para determinar un límite inferior de su resistencia. En los orificios de 20-40 pm, la corriente iónica medida fue < 1 pA cuando se aplicaron ± 1,2 V a través de la membrana, lo que corresponde a una resistencia > 1 TQ. Las membranas de DPhPC formadas en los mismos orificios también exhibieron valores de resistencia > 1 TQ.

Para determinar la tensión de ruptura de las membranas de MA y de DPhPC, la tensión aplicada se elevó en rampa a aproximadamente 100 mV/s hasta que la corriente a través de la membrana aumentó abruptamente en el voltaje de ruptura, Vrup. A continuación, se reformó la membrana mediante la aplicación de otra burbuja de aire y se repitió el procedimiento. El histograma del voltaje de ruptura se presenta en la FIGURA 3. Para las membranas de MA, se determinó un voltaje de ruptura promedio de V rup_MA = 2,0 V con una desviación estándar de 0,7 V (N = 330). A modo de comparación, se formaron membranas lipídicas de DPhPC en los mismos orificios y con las mismas condiciones de funcionamiento y se encontró V rup_DPhPc = 0,50 V con una desviación estándar de 0,09 V (N = 209). Debido a que las membranas de MA resistieron voltajes aplicados relativamente altos, se podría usar un medidor de capacitancia B&K Precision® 875b para medir su capacitancia. Para los orificios de Teflon® con diámetros entre 56 pm y 85 pm, el mayor en el que aún se podían formar membranas, se encontraron valores de capacitancia que iban de 0,9 a 2,8 x10-3 F/m2, lo que indica grosores promedio entre 7 y 22 nm (constante dieléctrica £r= 2,3). Estos grosores son consistentes con el grosor de la membrana encontrado in vivo de ~ 8 nm. Sin pretender imponer ninguna teoría, los inventores atribuyen la gran variedad de grosores a varios factores que incluyen la incertidumbre del área real de la membrana y el grado desconocido de incorporación del disolvente en la membrana. Inmediatamente después de la formación de la membrana, la capacitancia se elevó hacia un valor asintótico con una constante de tiempo de ~ 5 minutos. Tal aumento en la capacitancia es consistente con la formación de bicapa observada con lípidos DPhPC (Biophys J 10: 1127 (1970).

Los tiempos de vida de las membranas de MA se examinaron mediante el control de la conductancia de membranas formadas con nanoporos de MspA. Las membranas se dejaron con 200 mV aplicados hasta que los experimentos terminaron después de más de 3 días (N=4). Esto pone un límite inferior en la vida útil de la membrana de MA a los 3 días, significativamente mayor que la vida útil más larga de 1 día observada con las membranas de DPhPC.

Influencia del pH sobre la estabilidad de la membrana. La estabilidad de las membranas en presencia de condiciones alcalinas y ácidas de pH 2 a pH 12 se determinó reemplazando el tampón de KCl 1M pH 8,0 en el lado cis con diferentes soluciones de KCl 1M tamponadas entre pH 2 a pH 12. La solución a pH 8 se tamponó con HEPES 10 mM, mientras que las otras soluciones se tamponaron con una mezcla apropiada de CH³COOH 40 mM, ácido bórico y K²HPO⁴. El pH de los diversos tampones se midió usando un medidor Orion perpHecT® logR con un electrodo Beckman® calibrado en el intervalo de pH apropiado.

Las membranas de MA podrían formarse y reformarse con tampón de pH 2 a pH 9 presentado en su lado cis. Las membranas sobrevivieron a cada pH durante al menos 20 min. A un pH tan bajo como 2, la membrana se pudo reformar fácilmente e insertar los poros con éxito. La formación de membranas por encima de pH 9 se vio comprometida, pero llevar el tampón a un pH <7 restauró la formación y estabilidad de la membrana. La estabilidad de la membrana se controló midiendo la corriente iónica. La presencia de una corriente medible con 200 mV aplicados indicó la formación de fugas y una disminución significativa en la estabilidad de la bicapa.

Ejemplo 4: Experimentos de un solo canal de MspA

La preparación del nanoporo M1-NNN-MspA se describe en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° de Serie 61/098.938 y su solicitud PCT relacionada, WO 2010/034018. Véase también Proc Natl Acad Sci 105: 20647 (2008).

La concentración de M1-NNN-MspA en los experimentos de un solo canal fue de 0,04 pg/ml en Genapol® al 0,01% p/v y agua DI; la concentración para los experimentos multicanal fue de 0,4 pg/ml en 0,1% p/v. De esta solución, se añadió ~ 1 pl a los 100-200 pl del volumen cis por encima de una membrana MA y a continuación se mezcló a fondo. La membrana de MA se reformó con la técnica de burbujas de aire, descrita anteriormente, después de lo cual se observaron cambios de conductancia escalonados. Si se midiera una conductancia apropiada para un solo canal, la solución de proteína se perfundiría rápidamente en el pocillo cis con el tampón de trabajo para evitar la inserción de canales adicionales.

Para demostrar que la MspA incorporada en MA eran canales transmembrana adecuadas, se midieron sus curvas I V y se llevaron a cabo experimentos de traslado de ADN. Las curvas I-V de MspA exhiben las mismas características cuantitativas que las de MspA en membranas DPhPC (FIGURA 4), lo que indica que MspA es capaz de atravesar la membrana y que el canal interno de MspA no se vio afectado de manera apreciable por su entorno de membrana. Para asegurar adicionalmente la integridad del canal y la utilidad de la combinación MA-MspA para la secuenciación de nanoporos, se llevaron a cabo experimentos de traslado de ADN. Se repitieron los experimentos que se habían realizado previamente con canales de MspA únicos en membranas DPhPC (Proc Natl Acad Sci 107: 16060 (2010)). Dado que el ADN monocatenario se traslada demasiado rápido (> 1 nt/ps) para observar firmas de corriente bien caracterizadas, se utilizó una horquilla de ADN que no pudo completar el traslado hasta que la sección bicatenaria se disociara. Durante esta breve pausa, la sección monocatenaria del ADN en horquilla sostenida en la constricción de MspA produjo niveles de corriente iónica bien resueltos. Estos niveles de corriente eran característicos de los nucleótidos que residen en la constricción (FIGURA 5). Se llevaron a cabo experimentos con varias secuencias de cola de horquilla de ADN y se determinó que los niveles de corriente iónica eran indistinguibles de los experimentos análogos con MspA en membranas DPhPC (FIGURA 6).

Ejemplo 5: Resumen y comentario de los resultados de los experimentos 1-4

Las membranas de MA exhiben más estabilidad que las membranas de DPhPC comparables. Los experimentos anteriores demuestran la primera membrana no soportada establecida in vitro fabricada a partir de MA. En comparación con las membranas de DPhPC, las membranas de MA soportan voltajes considerablemente mayores antes de romperse. Experimentalmente, se sabe que varios factores influyen en la estabilidad de las membranas. Las membranas de MA y DPhPC tienen temperaturas de fusión significativamente diferentes; se ha encontrado que los extractos de pared celular de M. tuberculosis cambian de fase hasta 63 °C, mientras que DPhPC no tiene ningún cambio de fase conocido. Se concluyó que la notable robustez de las membranas de MA se atribuye a la estructura y las interacciones de las cadenas lipídicas constituyentes de MA.

Las diferencias significativas entre las moléculas de MA y DPhPC son las estructuras químicas de los grupos de cabeza y colas de lípidos. Por ejemplo, se han realizado estudios sobre la importancia de la longitud de la cadena lipídica. Si bien el grupo de cabeza de MA cargado negativamente es sustancialmente diferente del grupo de cabeza zwiteriónico de DPhPC, ninguno forma enlaces de hidrógeno a pH 8, lo que sugiere que es poco probable que el grupo de cabeza tenga en cuenta las diferencias de voltaje de ruptura. Por tanto, sin pretender imponer ninguna teoría, los inventores postulan que el tamaño y la configuración de las colas de MA y el grosor asociado de las membranas resultantes parecen ser la causa determinante de la estabilidad de las membranas de MA. En particular, se ha sugerido que el ensamblaje de las colas de lípidos de MA dentro de las membranas puede desempeñar un papel importante en la función de la membrana in vivo (Trends Microbio 18: 109 (2010)). Las membranas de MA artificiales son útiles para un examen más detallado de la membrana externa de las micobacterias.

Poros trans-membrana en las membranas de MA. La influencia de la membrana en la formación, conformación y función de los poros es una cuestión de interés sin respuesta en el desarrollo de fármacos y en la comprensión de la mecánica del plegado de las porinas. Para el canal de MspA en membranas de MA y en membranas de DPhPC se observó que la corriente de canal abierto exhibe una conductancia y rectificación idénticas. Además, se observaron propiedades de traslado de ADN idénticas a través de MspA en las dos membranas. Estas propiedades de conductancia y traslado del ADN son muy sensibles a la estructura de MspA (Proc Natl Acad Sci 107: 16060 (2010)). Por tanto, estas observaciones sugieren que la diferencia sustancial entre las membranas compuestas de MA y DPhPC no alteran de manera apreciable la conformación y función transmembrana de los canales de MspA.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Membrana en bicapa artificial que abarca la abertura de un orificio sin soporte de un sustrato sólido en cualquiera de los lados a lo largo de la superficie de la membrana, que comprende ácidos micólicos micobacterianos y que tiene un voltaje de ruptura superior a 0,5 V cuando el voltaje aplicado a través de la membrana aumenta en rampa a aproximadamente 100 mV/s en presencia de una solución de KCl 1,0 M preparada con agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES 10 mM.

2. Membrana, según la reivindicación 1, en la que el ácido micólico es un ácido micólico reticulado.

3. Membrana, según la reivindicación 1, que comprende además un nanoporo.

4. Membrana, según la reivindicación 3, en la que el nanoporo es a-hemolisina o una variante de la misma, una porina de Mycobacterium smegmatis (Msp) o una variante de la misma, u OmpATb.

5. Membrana, según la reivindicación 3, en la que el nanoporo es una porina de MspA mutante.

6. Membrana, según la reivindicación 5, en la que los aminoácidos en las posiciones 90, 91 y 93 de la porina de MspA mutante están cada uno sustituido por asparagina.

7. Membrana, según la reivindicación 1, en la que la membrana en bicapa tiene un voltaje de ruptura promedio de aproximadamente 2,0 V cuando el voltaje aplicado a través de la membrana aumenta en rampa a aproximadamente 100 m V/s preparada con la presencia de una solución de KCl 1,0 M en agua desionizada, tamponada a pH 8,0 ± 0,05 con HEPES 10 mM.

8. Sistema que comprende una membrana en bicapa artificial, según cualquiera de las reivindicaciones 3-7, colocada entre un primer medio conductor líquido y un segundo medio conductor líquido.

9. Sistema, según la reivindicación 8, en el que al menos un medio conductor líquido comprende un analito.

10. Sistema, según la reivindicación 9, en el que el analito es un ácido nucleico o una proteína.

11. Sistema, según la reivindicación 8, en el que el nanoporo es a-hemolisina o una variante de la misma, una porina de Mycobacterium smegmatis (Msp) o una variante de la misma, u OmpATb.

12. Sistema, según la reivindicación 8, en el que el nanoporo es una MspA mutante.

13. Procedimiento para detectar un analito que comprende:

(a) aplicar un campo eléctrico a un sistema, según cualquiera de las reivindicaciones 8-12, suficiente para trasladar electroforéticamente el analito a través del nanoporo; y

(b) medir una corriente iónica a medidad que el analito interactúa con el nanoporo para proporcionar un patrón de corriente, en el que la aparición de un bloqueo en el patrón de corriente indica la presencia del analito.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, que comprende además identificar el analito.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, en el que identificar el analito comprende comparar el patrón de corriente con un patrón de corriente conocido de un analito conocido.