ES2888626T3

ES2888626T3 - Cartografiado espacial de información de secuencia de ácidos nucleicos

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Publication number: ES2888626T3
Application number: ES16750552T
Authority: ES
Inventors: Alex So; Li Liu; Min-Jui Richard Shen; Neeraj Salathia; Kathryn M Stephens; Anne Jager; Timothy Wilson; Justin Fullerton; Sean M Ramirez; Shannon Kaplan; Rigo Pantoja; Bala Murali Venkatesan; Steven Modiano
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2022-01-05
Anticipated expiration: 2036-07-21
Also published as: AU2024201334A1; CA3176469A1; EP3329012A2; CA2993463A1; AU2019206067B2; CN108138225B; AU2021203295B2; US20180245142A1; US20210130885A1; US10913975B2; AU2019206067A1; HK1250170A1; CN116064738A; EP3329012B1; WO2017019456A2; WO2017019456A3; CN108138225A; DK3329012T3; CA3242290A1; AU2021203295A1

Abstract

Una matriz de captura para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende una pluralidad de sitios de captura, en la que cada sitio de captura comprende un par de sondas inmovilizadas sobre una superficie, en la que una primera sonda del par de sondas comprende una primera secuencia de región de unión al cebador y una secuencia de región de dirección espacial exclusiva y no comprende una secuencia de región de captura, y en la que una segunda sonda del par de sondas comprende una segunda secuencia de región de unión al cebador y la secuencia de la región de captura y no comprende la secuencia de la región de la dirección espacial, en la que la secuencia de la región de captura comprende una secuencia de captura de poli-T y la secuencia de captura de poli-T está configurada para hibridarse con un ácido nucleico diana que comprende una cola de poli-A; o la secuencia de la región de captura comprende una secuencia de captura específica de gen y la secuencia de captura específica de gen está configurada para hibridarse con un ácido nucleico diana que comprende una secuencia específica de gen; o la secuencia de la región de captura comprende una secuencia de captura de cebador aleatorio y la secuencia de captura de cebador aleatorio está configurada para hibridarse con un ácido nucleico diana que comprende una secuencia complementaria con la secuencia de captura de cebador aleatorio.

Description

DESCRIPCIÓN

Cartografiado espacial de información de secuencia de ácidos nucleicos

1. Antecedentes

Las técnicas existentes para la detección y análisis de ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNm o ADN genómico) en una muestra de tejido generalmente proporcionan información espacial o localizada para uno o un número limitado de genes a la vez o brindan información para todos los genes en la muestra sin la información posicional deseada. El interés reciente se ha centrado en el desarrollo de técnicas que permitan la caracterización de transcriptomas y/o variaciones genómicas en tejidos preservando la información espacial sobre el tejido. Existe la necesidad de métodos para caracterizar ácidos nucleicos en el contexto de una muestra de tejido.

2. Resumen

La presente descripción proporciona métodos y composiciones que facilitan la caracterización de transcriptomas y/o de variación genómica en tejidos, al tiempo que preservan la información espacial relacionada con el origen de los ácidos nucleicos diana en el tejido. Por ejemplo, los métodos descritos en este documento pueden permitir la identificación de la ubicación de una célula o un grupo de células en una biopsia de tejido que porta una mutación aberrante. Por lo tanto, los métodos proporcionados en el presente documento pueden ser útiles para fines de diagnóstico, por ejemplo, para el diagnóstico del cáncer, y posiblemente ayudar en la selección de terapias dirigidas.

La presente descripción proporciona una matriz de captura para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende un sitio de captura que comprende un par de sondas de captura inmovilizadas sobre una superficie, en la que una primera sonda de captura del par de sondas de captura comprende una primera región de unión al cebador y una región de dirección espacial, y en la que una segunda sonda de captura del par de sondas de captura comprende una segunda región de unión al cebador y una región de captura.

La presente descripción también proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido que incluye (a) proporcionar una matriz de captura, que comprende un sitio de captura que comprende un par de sondas de captura inmovilizadas a una superficie, en el que una primera sonda de captura del par de sondas de captura comprende una primera región de unión al cebador y una región de dirección espacial, y en el que una segunda sonda de captura del par de sondas de captura comprende una segunda región de unión al cebador y una región de captura.

La presente descripción también proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido que incluye proporcionar una nanopartícula magnética que comprende una sonda de captura inmovilizada que comprende una región de captura.

La presente descripción también proporciona una matriz de captura para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende un sitio de captura que comprende una sonda de captura que comprende una región de dirección espacial y una región de extremo de transposón (“transposon end”, TE).

La presente descripción también proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido que incluye proporcionar una matriz de captura que comprende un sitio de captura que comprende una sonda de captura que comprende una región de dirección espacial y una región de extremo de transposón (TE).

3. Breve descripción de los dibujos

La figura 1A ilustra una vista en planta de un ejemplo de realización de una matriz de captura para la captura de un ácido nucleico en una muestra de tejido.

La figura 1B ilustra una vista lateral de un sitio de captura de la matriz de captura, en el que el único sitio de captura comprende al menos una sonda de captura para la captura de un ácido nucleico en una muestra de tejido.

La figura 1C ilustra una vista lateral de un ejemplo de realización de una esfera de captura universal para la captura de un ácido nucleico en una muestra de tejido.

La figura 2 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método de detección espacial y análisis de un ácido nucleico en una muestra de tejido.

La figura 3 ilustra una vista lateral de la matriz de la figura 1A y muestra un ejemplo de realización de un proceso de captura del ARNm total en una muestra de tejido sobre la matriz.

La figura 4 ilustra una vista lateral de la matriz de la figura 1 y muestra un ejemplo de realización de un proceso de captura de ARNm diana en una muestra de tejido sobre la matriz.

La figura 5 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método para generar ADNc mediante transcripción inversa in situ de ARN en una muestra de tejido para capturarlo sobre una matriz.

La figura 6 ilustra un ejemplo de realización de las etapas de un método de la figura 5.

La figura 7 ilustra otro ejemplo de realización ejemplar de las etapas de un método de la figura 5.

La figura 8 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método de captura de amplicones de ADN sobre una matriz, en el que los amplicones de ADN se generan mediante amplificación in situ del ácido nucleico diana. La figura 9 ilustra un ejemplo de realización de las etapas de un método de la figura 8.

La figura 10 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método de captura de amplicones de ADN sobre una matriz, en el que los amplicones de ADN se generan mediante amplificación in situ del ácido nucleico diana. La figura 11 ilustra las etapas de un método de la figura 10.

La figura 12 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método de captura de ADNc sobre una matriz mediante acoplamiento monocatenario, en el que el ADNc se genera mediante transcripción inversa in situ de moléculas de ARN diana.

Las figuras 13A y 13B ilustran las etapas de un método de la figura 12.

La figura 14 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método de captura de amplicones de ADN sobre una matriz, en el que los amplicones de ADN se generan mediante amplificación in situ del ácido nucleico diana. Las figuras 15A, 15B y 15C ilustran las etapas de un método de la figura 14.

La figura 16 ilustra una vista lateral de una parte de un sistema de transferencia electroforética que está configurado para la detección espacial y el análisis de un ácido nucleico en una muestra de tejido.

La figura 17 ilustra una vista lateral de un sitio de captura sobre una matriz de captura (por ejemplo, la matriz de captura de la figura 1A), en la que un sitio de captura comprende dos conjuntos separados de sondas de captura inmovilizadas.

La figura 18 ilustra un diagrama de flujo de una realización de un método de transferencia de ácidos nucleicos desde una muestra de tejido a una matriz de captura para la generación de un banco de secuenciación con direcciones espaciales, en la que la matriz de captura comprende sitios de captura que incluyen pares separados de sondas de captura inmovilizadas, por ejemplo , como se muestra en la figura 17.

Las figuras 19A, 19B, 19C y 19D ilustran las etapas del método de la figura 18.

La figura 20 muestra un ejemplo de realización de un proceso de captura de un ácido nucleico en una muestra de tejido para su posterior anclaje sobre una matriz.

Las figuras 21A y 21B ilustran una matriz de rejilla de un esquema de indexación unidimensional y una matriz de rejilla de un esquema de indexación bidimensional, respectivamente, para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido.

La figura 22 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método de uso de un sistema de indexación combinatoria para la generación de una biblioteca de secuenciación de ADNc con direcciones espaciales.

Las figuras 23A y 23B ilustran las etapas de un método de la figura 21.

La figura 24 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método alternativo de uso de un sistema de indexación combinatoria para la generación de una biblioteca de secuenciación de ADNc con direcciones espaciales.

Las figuras 25A, 25B y 25C ilustran las etapas de un método de la figura 24.

La figura 26A ilustra una vista en planta de un ejemplo de realización de una matriz para el transporte de cebadores de transcripción inversa (“reverse transcription”, RT) a una muestra de tejido para la síntesis in situ de ADNc.

La figura 26B ilustra una vista lateral de una porción de un sitio de administración de la matriz de la figura 26A, en la que la porción del sitio de administración comprende al menos un cebador de RT para la síntesis de ADNc a partir de ARNm en una muestra de tejido.

La figura 27A ilustra una vista en planta de un ejemplo de realización de una matriz de captura para la captura de ADNc sintetizado in situ usando los cebadores RT de la figura 26B.

La figura 27B ilustra una vista lateral de una parte de un sitio de captura de la matriz de captura de la figura 27A, en la que la parte del sitio de captura comprende al menos una sonda de captura para la captura de ADNc sintetizado.

La figura 28 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método para generar una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales, en el que se usa una primera matriz para la síntesis in situ de ADNc de primera hebra y se usa una segunda matriz para capturar el ADNc para la posterior generación de la biblioteca.

Las figuras 29A y 29B ilustran las etapas de un método de la figura 28.

La figura 30 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método para generar una biblioteca de ADNc con direcciones espaciales usando sondas de captura liberables.

Las figuras 31A y 31B ilustran diagramas esquemáticos ejemplares de una sonda de captura con dirección espacial que comprende una modificación de disulfuro 5' y una sonda de captura con dirección espacial que comprende un conector fotoescindible 5', respectivamente.

Las figuras 32A, 32B y 32C ilustran un ejemplo de realización de un proceso de anclar reversiblemente la sonda de captura con dirección espacial de la figura 31A sobre la superficie de un cubreobjetos de vidrio.

Las figuras 33A, 33B y 33C ilustran un ejemplo de realización de un proceso de anclar reversiblemente las sondas de captura con direcciones espaciales de la figura 31B sobre la superficie de un cubreobjetos de vidrio.

Las figuras 34A y 34B ilustran las etapas del método de la figura 30.

La figura 35 ilustra un diagrama esquemático de un ejemplo de realización de un par de sondas de captura para capturar una región de ADN genómico de interés.

La figura 36 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método para generar una biblioteca de amplicones genómicos con direcciones espaciales usando sondas de captura liberables.

La figura 37 ilustra las etapas de un método de la figura 36.

La figura 38 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de realización de un método para generar una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales utilizando nanopartículas magnéticas para capturar un ácido nucleico de una muestra de tejido.

La figura 39 ilustra las etapas de un método de la figura 38.

Las figuras 40A y 40B ilustran un ejemplo de un proceso de uso de una sonda de captura para formar un ácido nucleico complementario en una muestra de tejido y posteriormente inmovilizar el ácido nucleico complementario sobre una nanopartícula.

Las figuras 41A y 41B ilustran diagramas esquemáticos de un ejemplo de una sonda de captura asociada a una partícula que comprende una primera región de dirección espacial parcial y una segunda sonda de captura de matriz que comprende una segunda región de dirección parcial, respectivamente, para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido.

Las figuras 42A y 42B ilustran diagramas esquemáticos de un ejemplo de una sonda de captura asociada a una partícula y una segunda sonda de captura de matriz que comprende una región de dirección espacial, respectivamente, para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido.

Las figuras 43A y 43B ilustran diagramas esquemáticos de un ejemplo de una sonda de captura asociada a una partícula y una segunda sonda de captura de matriz, respectivamente, para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos de una muestra de tejido.

La figura 44 ilustra una vista en perspectiva de un sistema de transferencia basado en el magnetismo que está configurado para la detección espacial y el análisis de un ácido nucleico en una muestra de tejido.

La figura 45 ilustra una vista lateral de un sitio de captura sobre la matriz de captura de la figura 44, en la que un sitio de captura incluye una pluralidad de sondas de captura.

La figura 46 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método de transferencia de ADNc desde una muestra de tejido a una matriz de captura para la generación de una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales utilizando el sistema de transferencia basado en el magnetismo de la figura 44 y la figura 45.

Las figuras 47A, 47B y 47C muestran gráficamente las etapas del método de la figura 46.

La figura 48 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método de transferencia de ARN desde una muestra de tejido a una matriz de captura para la generación de una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales utilizando el sistema de transferencia basado en el magnetismo de la figura 44.

Las figuras 49A, 49B y 49C muestran gráficamente las etapas del método de la figura 48.

La figura 50 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método para obtener el perfil del ADN genómico en una muestra de tejido.

La figura 51 ilustra un diagrama de un cebador de PCR con dirección espacial para la preamplificación y la indexación espacial de ADN genómico completo.

Las figuras 52A y 52B muestran gráficamente las etapas del método de la figura 50.

La figura 53 ilustra una vista en perspectiva de un ejemplo de una superposición de reactor de micropocillos.

La figura 54 ilustra una vista en perspectiva de un solo micropocillo de la figura 53.

Las figuras 55A y 55B ilustran un ejemplo de un proceso de fabricación del sustrato de micropocillos de la figura 53. La figura 56 ilustra una vista lateral de un ejemplo de una estructura de micropocillos para la captura y la compartimentación espacial de ácidos nucleicos procedentes de una muestra de tejido.

La figura 57 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método de captura de ácidos nucleicos a partir de una sección de tejido utilizando la estructura de micropocillos de la figura 56 para la preparación de una biblioteca de secuenciación.

La figura 58A ilustra una vista lateral de un ejemplo de un sistema de clavijas para la escisión de tejido y la preparación de una biblioteca de ácidos nucleicos con direcciones espaciales.

La figura 58B ilustra ejemplos de diferentes superficies de escisión para las clavijas sobre la estructura de clavijas de la figura 58A.

La figura 59 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método de captura de ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido usando el sistema de clavijas de la figura 58 para la preparación de una biblioteca de secuenciación.

La figura 60 ilustra vistas laterales del sistema de clavijas de la figura 58 y muestra gráficamente las etapas 5910 y 5915 del método de la figura 59.

La figura 61 ilustra un diagrama de flujo de otro ejemplo de un método para capturar ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido utilizando el sistema de clavijas de la figura 58 para la preparación de una biblioteca de secuenciación.

La figura 62 ilustra vistas laterales del sistema de clavijas de la figura 58 y muestra gráficamente las etapas 6110 y 6115 del método de la figura 61.

La figura 63 ilustra una vista en perspectiva de un sistema de "microrreactor" capilar para la captura de ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido para la preparación de una biblioteca de ácidos nucleicos con direcciones espaciales.

La figura 64 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método de captura de ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido usando el sistema de microrreactor capilar de la figura 63 para la preparación de una biblioteca de secuenciación.

La figura 65 ilustra una vista lateral de una parte de un accionador de gotitas que está configurado para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido.

La figura 66 ilustra una vista lateral de la lámina de poros de la figura 65.

Las figuras 67A y 67B ilustran vistas laterales del accionador de gotitas de la figura 65 y muestran un proceso de aislamiento de un ácido nucleico en una muestra de tejido para la detección y el análisis espacial.

La figura 68 ilustra ejemplos de realizaciones de un método para generar una biblioteca de amplicones genómicos con direcciones espaciales usando el marcaje de ADN genómico completo.

Las figuras 69A, 69B y 69C ilustran las etapas de un método de la figura 68.

La figura 70 ilustra una vista en planta de una superposición de direcciones espaciales.

La figura 71 ilustra una vista en planta de una única característica espacial sobre el sustrato de la figura 70.

4. Descripción detallada

En el presente documento se describen una variedad de métodos y composiciones que permiten la caracterización de analitos en tejidos, al tiempo que preservan la información espacial relacionada con el origen del analito diana en el tejido. La descripción comprende las siguientes realizaciones y ejemplos. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas. En varias realizaciones, una matriz incluye un sustrato sobre el que se inmovilizan una pluralidad de sondas de captura, de modo que cada sonda de captura ocupa una posición diferenciada en la matriz. Cada sonda de captura incluye, entre otras secuencias y/o moléculas, un marcador de ácido nucleico posicional exclusivo (es decir, una dirección espacial o secuencia de indexación). Cada dirección espacial corresponde a la posición de la sonda de captura sobre la matriz. La posición de la sonda de captura sobre la matriz puede correlacionarse con una posición en la muestra de tejido.

Los ejemplos de analitos en una muestra de tejido incluyen ADN genómico, ADN metilado, secuencias de ADN metilado específicas, ARN mensajero (ARNm), ARNm poliA, ARNm fragmentado, ADN fragmentado, ADN mitocondrial, ARN viral, microARN, productos de PCR sintetizados in situ, híbridos de ARN/ADN, lípidos, carbohidratos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, fosfoproteínas, un variante fosforilado o acetilado específico de una proteína o proteínas de la cubierta viral.

Se puede acoplar una ubicación que codifica un marcador de ácido nucleico (es decir, una dirección espacial o secuencia de indexación) a una región de captura de un ácido nucleico o cualquier otra molécula que se una a un analito diana. Los ejemplos de otras moléculas que pueden acoplarse a un marcador de ácido nucleico incluyen anticuerpos, dominios de unión a antígenos, proteínas, péptidos, receptores, haptenos, etc.

En el presente documento se describen una variedad de métodos y composiciones que permiten la caracterización de transcriptomas y/o de variación genómica en tejidos, al tiempo que preservan la información espacial relacionada con el origen de los ácidos nucleicos diana en el tejido. Por ejemplo, los métodos descritos en este documento pueden permitir la identificación de la ubicación de una célula o un grupo de células en una biopsia de tejido que porta una mutación aberrante. Por lo tanto, los métodos proporcionados en el presente documento pueden ser útiles para fines de diagnóstico, por ejemplo, para el diagnóstico de cáncer, y posiblemente ayudar en la selección de terapias dirigidas.

La presente descripción se basa, en parte, en la constatación de que la información relacionada con el origen espacial de un ácido nucleico en una muestra de tejido puede codificarse en el ácido nucleico en el proceso de preparación del ácido nucleico para la secuenciación. Por ejemplo, los ácidos nucleicos procedentes de una muestra de tejido se pueden marcar mediante sondas que incluyen información de secuencia específica de la ubicación (una "dirección espacial"). Las moléculas de ácido nucleico con direcciones espaciales procedentes de una muestra de tejido se pueden secuenciar luego de modo masivo. Las moléculas de ácido nucleico de secuencia idéntica que se originan de diferentes regiones de una muestra de tejido pueden distinguirse basándose en su dirección espacial y pueden cartografiarse en sus regiones de origen en la muestra de tejido.

La presente descripción se basa además, en parte, en la constatación de que distinguir los ácidos nucleicos relacionados basándose en su origen espacial en una muestra de tejido puede aumentar la sensibilidad de detección de mutaciones poco frecuentes en un tejido complejo. Por ejemplo, se descubrió que el direccionamiento espacial de ácidos nucleicos podría aumentar la sensibilidad de detección de variaciones de un solo nucleótido (“single nucleotide variations”, SNV) en una muestra de tejido.

En algunos métodos descritos en el presente documento, las sondas para el marcaje espacial pueden incluir, por ejemplo, combinaciones de regiones de direcciones espaciales y regiones de captura específicas de genes. Las sondas con direcciones espaciales y específicas de genes pueden ponerse en contacto con la muestra de tejido como sondas inmovilizadas sobre una matriz de captura. Como alternativa, las sondas con direcciones espaciales se pueden liberar desde la matriz de captura e interactuar con los ácidos nucleicos en disolución en la muestra de tejido, por ejemplo, in situ.

La presente descripción se basa además, en parte, en la constatación de que el marcaje espacial se puede realizar usando sondas que separan las regiones de direcciones espaciales de las regiones de captura específicas de genes. La capacidad de separar las regiones de captura de las regiones de direcciones espaciales en dos o más sondas puede aumentar la flexibilidad de los diseños de bibliotecas de secuenciación y de los protocolos de preparación de bibliotecas.

La presente descripción se basa además, en parte, en la constatación de que la robustez y la calidad de los datos de los experimentos de transcriptómica espacial pueden mejorarse facilitando la transferencia de ácidos nucleicos desde una muestra de tejido a una matriz de captura, por ejemplo, una matriz de captura de sondas de captura con direcciones espaciales. Por ejemplo, la transferencia electroforética de ácidos nucleicos puede usarse para mejorar los rendimientos de transferencia y la cinética de transferencia de ácidos nucleicos. La transferencia de ácido nucleico de alto rendimiento desde muestras de tejido a matrices de captura puede facilitar la detección de SNV poco frecuentes. La cinética de transferencia rápida se puede utilizar para limitar la difusión de los ácidos nucleicos durante el proceso de transferencia y ayudar a aumentar la resolución del direccionamiento espacial. Otros métodos descritos en este documento implican el uso de sustratos de ácidos nucleicos intermedios, tales como partículas (por ejemplo, nanopartículas electromagnéticas), membranas (por ejemplo, membranas de nailon) o placas de micropocillos para facilitar la captura del ácido nucleico en la muestra de tejido, para facilitar la transferencia del ácido nucleico sobre matrices de captura, y para limitar la difusión y mejorar la resolución espacial. Se describen métodos adicionales que implican, por ejemplo, marcaje de ADN genómico, que se pueden usar para añadir direcciones espaciales de manera eficaz a los ácidos nucleicos, por ejemplo, sobre la superficie de una matriz de captura.

La presente descripción se basa además en la constatación de que el direccionamiento espacial de los ácidos nucleicos procedentes de una muestra de tejido puede implicar el direccionamiento espacial bidimensional, por ejemplo, para correlacionar la posición de un ácido nucleico en una matriz de captura bidimensional con la posición del ácido nucleico en una sección de tejido bidimensional. El direccionamiento espacial se puede realizar también en dimensiones adicionales. Por ejemplo, se pueden agregar secuencias de dirección espacial a los ácidos nucleicos para describir la posición espacial relativa de un ácido nucleico en una tercera o cuarta dimensión, por ejemplo, describiendo la posición de una sección de tejido en una biopsia de tejido, o la posición de un biopsia de tejido en el órgano de un sujeto. Se podrían agregar secuencias de direcciones temporales a los ácidos nucleicos procedentes de una muestra de tejido para indicar un momento del tiempo en un experimento de desarrollo temporal, por ejemplo, investigar cambios en la expresión génica en una célula en respuesta a un estímulo físico o químico, como un tratamiento con fármacos durante un ensayo clínico.

Debe observarse que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y “la” incluyen los referentes en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una sonda de captura" incluye una mezcla de dos o más sondas de captura y similares.

El término "aproximadamente", en particular en referencia a una cantidad dada, pretende abarcar desviaciones de más o menos cinco por ciento.

Tal como se usan en este documento, los términos "incluye", "incluyendo", "inclusive", "contiene", "conteniendo" y cualquier variación de los mismos, están destinados a cubrir una inclusión no exclusiva, de modo que un proceso, método, producto por proceso o composición de materia que incluye o contiene un elemento o lista de elementos no incluye solo esos elementos, sino que puede incluir otros elementos que no se enumeran expresamente o son inherentes a dicho proceso, método, producto por proceso o composición de la materia.

Tal como se usan en este documento, los términos "dirección", “marcador” o "índice", cuando se usan en referencia a una secuencia de nucleótidos, significan una secuencia de nucleótidos exclusiva que se distingue de otros índices, así como de otras secuencias de nucleótidos dentro de los polinucleótidos contenidos dentro de una muestra. Una "dirección", “marcador” o "índice" de nucleótidos puede ser una secuencia de nucleótidos aleatoria o diseñada específicamente. Una "dirección", “marcador” o "índice" puede tener cualquier longitud de secuencia deseada, siempre que tenga la longitud suficiente para ser una secuencia de nucleótidos exclusiva dentro de una pluralidad de índices en una población y/o dentro de una pluralidad de polinucleótidos que están siendo analizados o interrogados. Una "dirección", “marcador” o "índice" de nucleótidos de la descripción es útil, por ejemplo, para unirse a un polinucleótido diana para marcar una especie particular para identificar todos los miembros de la especie marcados dentro de una población. Por consiguiente, un índice es útil como código de barras en el que diferentes miembros de la misma especie molecular pueden contener el mismo índice y en el que diferentes especies dentro de una población de diferentes polinucleótidos pueden tener diferentes índices.

Tal como se usa en este documento, una "dirección espacial", "marcador espacial" o "índice espacial", cuando se usa en referencia a una secuencia de nucleótidos, significa una dirección, marcador o índice que codifica información espacial relacionada con la región o ubicación de origen de un ácido nucleico con dirección, marcado o indexado en una muestra de tejido.

Tal como se usa en este documento, el término "sustrato" pretende significar un soporte sólido. El término incluye cualquier material que pueda servir como base sólida o semisólida para la creación de características, tales como pocillos para el depósito de biopolímeros, incluidos ácidos nucleicos, polipéptidos y/u otros polímeros. Un sustrato como se proporciona en el presente documento está modificado, por ejemplo, o puede modificarse para adaptarse a la unión de biopolímeros mediante una variedad de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de tipos de materiales de sustrato incluyen vidrio, vidrio modificado, vidrio funcionalizado, vidrios inorgánicos, microesferas, incluidas partículas inertes y/o magnéticas, plásticos, polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, cerámica, resinas, sílice, materiales a base de sílice, carbono, metales, una fibra óptica o haces de fibras ópticas, una variedad de polímeros distintos de los ejemplificados anteriormente y placas de microtitulación de múltiples pocillos. Los tipos específicos de ejemplos de plásticos incluyen acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos y Teflon™. Los tipos específicos de ejemplos de materiales basados en sílice incluyen silicio y diversas formas de silicio modificado.

Los expertos en la técnica sabrán o comprenderán que la composición y la geometría de un sustrato, tal como se proporciona en el presente documento, pueden variar dependiendo del uso previsto y las preferencias del usuario. Por lo tanto, aunque los sustratos planos, tales como portaobjetos, chips u obleas, se proporcionan como ejemplo en este documento con referencia a las micromatrices para su ilustración, dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en este documento, los expertos en la técnica entenderán que se también puede usar una amplia variedad de otros sustratos proporcionados como ejemplos en la presente o bien conocidos en la técnica en los métodos y/o composiciones de la presente.

En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende una o más superficies de una celda de flujo. La expresión "celda de flujo", como se usa en el presente documento, se refiere a una cámara que comprende una superficie sólida a través de la cual pueden fluir uno o más reactivos fluidos. Los ejemplos de células de flujo y sistemas fluídicos relacionados y plataformas de detección que pueden usarse fácilmente en los métodos de la presente descripción se describen, por ejemplo, en Bentley et al., Nature, 456:53-59 (2008), documento WO 04/018497; documento US 7.057.026; documento WO 91/06678; WO 07/123744; documento US 7.329.492; documento US 7.211.414; documento US 7.315.019; documento US 7.405.281, y documento US 2008/0108082.

En algunas realizaciones, el soporte sólido incluye una superficie con patrón. Una "superficie con patrón" se refiere a una disposición de diferentes regiones en una capa expuesta de un soporte sólido o sobre esta. Por ejemplo, una o más de las regiones pueden ser características en las que están presentes uno o más cebadores de amplificación. Las características pueden estar separadas por regiones intersticiales en las que no están presentes cebadores de amplificación. En algunas realizaciones, el patrón puede tener un formato x-y de características que están en filas y columnas. En algunas realizaciones, el patrón puede ser una disposición repetida de características y/o regiones intersticiales. En algunas realizaciones, el patrón puede ser una disposición aleatoria de características y/o regiones intersticiales. Se describen ejemplos de superficies con patrón que se pueden usar en los métodos y composiciones establecidos en este documento en el documento de EE. UU. n.° de serie 13/661.524 o la solicitud de patente de EE. UU. n.° de publicación 2012/0316086 A1.

Tal como se usa en este documento, la expresión "región intersticial" se refiere a un área en un sustrato o en una superficie que separa otras áreas del sustrato o superficie. Por ejemplo, una región intersticial puede separar una característica de una matriz de otra característica de la matriz. Las dos regiones que están separadas entre sí pueden ser discretas, sin contacto entre sí. En otro ejemplo, una región intersticial puede separar una primera parte de una característica de una segunda parte de una característica. La separación proporcionada por una región intersticial puede ser una separación parcial o total. Las regiones intersticiales suelen tener un material de superficie que difiere del material de superficie de las características de la superficie. Por ejemplo, las características de una matriz pueden tener una cantidad o concentración de agentes de captura o cebadores que exceda la cantidad o concentración presente en las regiones intersticiales. En algunas realizaciones, los agentes de captura o cebadores pueden no estar presentes en las regiones intersticiales.

En algunas realizaciones, el soporte sólido incluye una matriz de pocillos o depresiones en una superficie. Esto se puede fabricar como se conoce generalmente en la técnica usando una variedad de técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, fotolitografía, técnicas de estampación, técnicas de moldeo y técnicas de micrograbado. Como apreciarán los expertos en la técnica, la técnica utilizada dependerá de la composición y forma del sustrato de la matriz.

Las características en una superficie con patrón pueden ser pocillos en una matriz de pocillos (por ejemplo, micropocillos o nanopocillos) sobre vidrio, silicio, plástico u otros soportes sólidos adecuados con un patrón de gel enlazado covalentemente, como poli (N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-coacrilamida) (PAZAM). El proceso crea lechos cortos de gel que se utilizan para la secuenciación que pueden ser estables durante las ejecuciones de la secuenciación con una gran cantidad de ciclos. La unión covalente del polímero a los pocillos es útil para mantener el gel en las características estructuradas a lo largo de la vida útil del sustrato estructurado durante una variedad de usos. Sin embargo, en muchas realizaciones, no es necesario que el gel esté unido covalentemente a los pocillos. Por ejemplo, en algunas condiciones, puede usarse acrilamida sin silano (SFA, ver, por ejemplo, solicitud de patente de EE. UU. n.° de publicación 2011/0059865 A1), que no está unido covalentemente a ninguna parte del sustrato estructurado, como material de gel.

En realizaciones particulares, se puede fabricar un sustrato estructurado formando un patrón con pocillos (por ejemplo, micropocillos o nanopocillos) sobre un material de soporte sólido, recubriendo el soporte con patrón con un material de gel (por ejemplo, PAZAM, SFA o variantes modificadas químicamente de los mismos, como la versión azidolizada de SFA (azido-SFA)) y puliendo el soporte recubierto de gel, por ejemplo mediante pulido químico o mecánico, reteniendo así el gel en los pocillos pero eliminando o inactivando sustancialmente el resto del gel de las regiones intersticiales en la superficie del sustrato estructurado entre los pocillos. Los ácidos nucleicos cebadores se pueden unir al material de gel. Una disolución de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, un genoma humano fragmentado) se puede poner en contacto con el sustrato pulido de modo que los ácidos nucleicos diana individuales sembrarán pocillos individuales mediante interacciones con cebadores unidos al material de gel; sin embargo, los ácidos nucleicos diana no ocuparán las regiones intersticiales debido a la ausencia o inactividad del material de gel. La amplificación de los ácidos nucleicos diana se limitará a los pocillos ya que la ausencia o inactividad de gel en las regiones intersticiales evita la migración hacia el exterior de la colonia de ácidos nucleicos en crecimiento. El proceso se puede fabricar convenientemente, es escalable y utiliza métodos convencionales de micro- o nanofabricación.

Un sustrato con patrón puede incluir, por ejemplo, pocillos grabados en un portaobjetos o chip. El patrón de los grabados y la geometría de los pocillos puede adoptar una variedad de formas y tamaños diferentes siempre que dichas características sean física o funcionalmente separables entre sí. Los sustratos particularmente útiles que tienen tales características estructurales son sustratos con patrón que pueden seleccionar el tamaño de las partículas de soporte sólido, tales como microesferas. Un ejemplo de sustrato con patrón que tiene estas características es el sustrato grabado usado en conexión con la tecnología BeadArray (Illumina, Inc., San Diego, CA). Se describen más ejemplos en la patente de EE. UU. n.° 6.770.441.

Como se usa en este documento, el término "inmovilizado", cuando se usa en referencia a un ácido nucleico, pretende significar la unión directa o indirecta a un soporte sólido mediante uno o más enlaces covalentes o no covalentes. En ciertas realizaciones, se puede usar la unión covalente, pero todo lo que se requiere es que los ácidos nucleicos permanezcan estacionarios o unidos a un soporte en condiciones en las que se pretende usar el soporte, por ejemplo, en aplicaciones que requieren la amplificación y/o secuenciación de ácidos nucleicos. Los oligonucleótidos que se utilizarán como cebadores de captura o cebadores de amplificación pueden inmovilizarse de manera que esté disponible un extremo 3' para la extensión enzimática y al menos una parte de la secuencia sea capaz de hibridarse con una secuencia complementaria. La inmovilización puede producirse mediante hibridación con un oligonucleótido unido a la superficie, en cuyo caso el oligonucleótido o polinucleótido inmovilizado puede estar en la orientación 3 '-5'. Como alternativa, la inmovilización puede producirse por medios distintos de la hibridación por apareamiento de bases, como la unión covalente expuesta anteriormente.

Ciertas realizaciones pueden hacer uso de soportes sólidos compuestos por un sustrato o matriz inerte (por ejemplo, portaobjetos de vidrio, esferas de polímero, etc.) que se ha funcionalizado, por ejemplo, mediante la aplicación de una capa o revestimiento de un material intermedio que comprende grupos reactivos que permiten la unión covalente a biomoléculas, como polinucleótidos. Los ejemplos de tales soportes incluyen, pero no se limitan a hidrogeles de poliacrilamida soportados sobre un sustrato inerte tal como vidrio, particularmente hidrogeles de poliacrilamida como se describe en los documentos WO 2005/065814 y US 2008/0280773. En tales realizaciones, las biomoléculas (por ejemplo, polinucleótidos) se pueden unir de modo covalente directamente al material intermedio (por ejemplo, el hidrogel), pero el material intermedio puede en sí mismo estar unido de forma no covalente al sustrato o matriz (por ejemplo, el sustrato de vidrio). La expresión "unión covalente a un soporte sólido" debe interpretarse en consecuencia como que abarca este tipo de disposición.

Los enlaces covalentes ejemplares incluyen, por ejemplo, los que resultan del uso de técnicas de química de clic. Los ejemplos de enlaces no covalentes incluyen, pero no se limitan a interacciones no específicas (por ejemplo, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones de van der Waals, etc.) o interacciones específicas (por ejemplo, interacciones de afinidad, interacciones receptor-ligando, interacciones anticuerpo-epítopo, interacciones avidinabiotina, interacciones estreptavidina-biotina, interacciones lectina-carbohidrato, etc.). Se indican ejemplos de enlaces en las patentes de EE. UU. n.os 6.737.236; 7.259.258; 7.375.234 y 7.427.678; y la publicación de patente de EE. UU. n.22011/0059865 A1.

Como se usa en el presente documento, el término "matriz" se refiere a una población de sitios que se pueden diferenciar entre sí según la ubicación relativa. Las diferentes moléculas que se encuentran en diferentes sitios de una matriz se pueden diferenciar entre sí según las ubicaciones de los sitios en la matriz. Un sitio individual de una matriz puede incluir una o más moléculas de un tipo particular. Por ejemplo, un sitio puede incluir una única molécula de ácido nucleico diana que tiene una secuencia particular o un sitio puede incluir varias moléculas de ácido nucleico que tienen la misma secuencia (y/o una secuencia complementaria de la misma). Los sitios de una matriz pueden ser características diferentes ubicadas sobre el mismo sustrato. Los ejemplos de características incluyen, sin limitación, pocillos en un sustrato, esferas (u otras partículas) en un sustrato o sobre este, proyecciones desde un sustrato, crestas sobre un sustrato o canales en un sustrato. Los sitios de una matriz pueden ser sustratos separados, cada uno con una molécula diferente. Se pueden identificar diferentes moléculas unidas a sustratos separados según las ubicaciones de los sustratos sobre una superficie a la que están asociados los sustratos o según las ubicaciones de los sustratos en un líquido o gel. Los ejemplos de matrices en las que se ubican sustratos separados sobre una superficie incluyen, sin limitación, aquellas que tienen esferas en los pocillos.

Como se usa en este documento, el término "pluralidad" pretende significar una población de dos o más miembros diferentes. Las pluralidades pueden variar en tamaño desde pequeñas, medianas, grandes o muy grandes. El tamaño de una pequeña pluralidad puede variar, por ejemplo, desde unos pocos miembros hasta decenas de miembros. Las pluralidades de tamaño medio pueden variar, por ejemplo, desde decenas de miembros hasta aproximadamente 100 miembros o cientos de miembros. Las grandes pluralidades pueden variar, por ejemplo, desde unos cientos de miembros hasta unos 1000 miembros, miles de miembros y hasta decenas de miles de miembros. Las pluralidades muy grandes pueden variar, por ejemplo, desde decenas de miles de miembros hasta alrededor de cientos de miles, un millón, millones, decenas de millones y hasta o más de cientos de millones de miembros. Por lo tanto, una pluralidad puede variar en tamaño de dos a más de cien millones de miembros, así como todos los tamaños, medidos por el número de miembros, entre los ejemplos de los anteriores intervalos y mayores que estos. Un ejemplo de un número de características dentro de una micromatriz incluye una pluralidad de aproximadamente 500.000 o más características discretas dentro de 1,28 cm2. Los ejemplos de pluralidades de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, poblaciones de aproximadamente 1x105, 5x105 y 1x106 o más especies de ácido nucleico diferentes. Por consiguiente, se pretende que la definición del término incluya todos los valores enteros mayores de dos. Puede establecerse un límite superior de una pluralidad, por ejemplo, mediante la diversidad teórica de las secuencias de nucleótidos en una muestra de ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico" pretende ser coherente con su uso en la técnica e incluye ácidos nucleicos de origen natural o análogos funcionales de los mismos. Los análogos funcionales particularmente útiles son capaces de hibridarse con un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o pueden usarse como molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen un esqueleto que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener unos enlaces del esqueleto alternativos, que incluyen cualquiera de los conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen un azúcar desoxirribosa (por ejemplo, que se encuentra en el ácido desoxirribonucleico (ADN)) o un azúcar ribosa (por ejemplo, que se encuentra en el ácido ribonucleico (ARN)). Un ácido nucleico puede contener cualquiera de una variedad de análogos de estos restos azúcar que se conocen en la técnica. Un ácido nucleico puede incluir bases nativas o no nativas. A este respecto, un ácido desoxirribonucleico nativo puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, timina, citosina o guanina y un ácido ribonucleico puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en uracilo, adenina, citosina o guanina. Las bases no nativas útiles que se pueden incluir en un ácido nucleico se conocen en la técnica. El término "diana", cuando se usa en referencia a un ácido nucleico, pretende ser un identificador semántico para el ácido nucleico en el contexto de un método o composición establecidos en este documento y no necesariamente limita la estructura o función del ácido nucleico más allá de lo que se indique explícitamente de otro modo. Las formas particulares de ácidos nucleicos pueden incluir todos los tipos de ácidos nucleicos que se encuentran en un organismo, así como ácidos nucleicos sintéticos tales como polinucleótidos producidos por síntesis química. Los ejemplos particulares de ácidos nucleicos que son aplicables para el análisis a través de la incorporación en micromatrices producidas por métodos como los que se proporcionan en este documento incluyen ADN genómico (ADNg), marcadores de secuencia expresada (“expressed sequence tags”, EST), ARN mensajero copiado de ADN (ADNc), ARN mensajero copiado de a Rn (ARNc), ADN o genoma mitocondrial, ARN, ARN mensajero (ARNm) y/u otras poblaciones de ARN. Los fragmentos y/o porciones de estos ejemplos de ácidos nucleicos también se incluyen dentro del significado de la expresión como se usa en este documento.

Como se usa en este documento, el término "bicatenario", cuando se usa en referencia a una molécula de ácido nucleico, significa que sustancialmente todos los nucleótidos en la molécula de ácido nucleico están unidos mediante hidrógeno a un nucleótido complementario. Un ácido nucleico parcialmente bicatenario puede tener al menos 10 %, 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de sus nucleótidos unidos por hidrógeno a un nucleótido complementario.

Como se usa en este documento, el término "monocatenario", cuando se usa en referencia a una molécula de ácido nucleico, significa que esencialmente ninguno de los nucleótidos en la molécula de ácido nucleico está unido mediante hidrógeno a un nucleótido complementario.

Como se usa en este documento, la expresión "cebadores de captura" pretende significar un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es capaz de asociarse específicamente con una secuencia de polinucleótidos monocatenaria para ser analizada o sometida a una interrogación de ácido nucleico en las condiciones encontradas en una etapa de hibridación de cebadores, por ejemplo, de una reacción de amplificación o secuenciación. La expresión y los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente en el presente documento. Los diferentes términos y expresiones no pretenden indicar ninguna diferencia particular de tamaño, secuencia u otra propiedad a menos que se indique específicamente lo contrario. Para mayor claridad en la descripción, los términos y expresiones se pueden usar para distinguir una especie de ácido nucleico de otra cuando se describe un método o composición particular que incluye varias especies de ácido nucleico.

Como se usa en este documento, la expresión "específico de gen" o "específico de diana" cuando se usa en referencia a una sonda de captura u otro ácido nucleico pretende significar una sonda de captura u otro ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos específica para un ácido nucleico diana, por ejemplo, un ácido nucleico procedente de una muestra de tejido, a saber, una secuencia de nucleótidos capaz de asociarse selectivamente con una región de identificación de un ácido nucleico diana. Las sondas de captura específicas de genes pueden tener una única especie de oligonucleótido o pueden incluir dos o más especies con diferentes secuencias. Por tanto, las sondas de captura específicas de genes pueden ser dos o más secuencias, que incluyen 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más secuencias diferentes. Las sondas de captura específicas de gen pueden comprender una secuencia de cebador de captura específica de gen y una secuencia de sonda de captura universal. Otras secuencias, tales como secuencias de cebadores de secuenciación y similares, también pueden incluirse en un cebador de captura específico de gen.

En comparación, el término "universal" cuando se usa en referencia a una sonda de captura u otro ácido nucleico pretende significar una sonda de captura o ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos común entre una pluralidad de sondas de captura. Una secuencia común puede ser, por ejemplo, una secuencia complementaria con la misma secuencia adaptadora. Las sondas de captura universales son aplicables para interrogar una pluralidad de polinucleótidos diferentes sin distinguir necesariamente las diferentes especies, mientras que los cebadores de captura específicos de genes son aplicables para distinguir las diferentes especies.

En diversas realizaciones, los elementos de captura (por ejemplo, cebadores de captura o sondas de captura u otras secuencias de ácido nucleico) pueden espaciarse para A) resolver espacialmente los ácidos nucleicos dentro de la geometría de una sola célula, es decir, múltiples sitios de captura por célula; B) resolver espacialmente los ácidos nucleicos aproximadamente al nivel de una sola célula, es decir, aproximadamente 1 sitio de captura por célula. Además, los elementos de captura pueden estar espaciados como en A o B arriba, y estar: I) espaciados para muestrear ácidos nucleicos de una muestra a intervalos regulares, por ejemplo, espaciados en una cuadrícula o patrón de tal manera que aproximadamente cada célula alterna o cada 5a o cada 10a célula se muestrea, o aproximadamente cada uno o cada 5° o cada 10° grupo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más células se muestrean; II) espaciados para capturar muestras de sustancialmente todas las células disponibles en una o más regiones de una muestra, o III) espaciados para capturar muestras de sustancialmente todas las células disponibles en la muestra.

Como se usa en este documento, el término "amplicón", cuando se usa en referencia a un ácido nucleico, significa el producto de copiar el ácido nucleico, en el que el producto tiene una secuencia de nucleótidos que es igual o complementaria al menos a una porción de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico. Un amplicón se puede producir mediante cualquiera de una variedad de métodos de amplificación que usan el ácido nucleico, o un amplicón del mismo, como molde, incluyendo, por ejemplo, extensión con polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), extensión por acoplamiento o reacción en cadena por acoplamiento. Un amplicón puede ser una molécula de ácido nucleico que tiene una sola copia de una secuencia de nucleótidos particular (por ejemplo, un producto de PCR) o múltiples copias de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un producto concatemérico de RCA). Un primer amplicón de un ácido nucleico diana puede ser una copia complementaria. Los amplicones posteriores son copias que se crean, después de la generación del primer amplicón, a partir del ácido nucleico diana o del primer amplicón. Un amplicón posterior puede tener una secuencia que sea sustancialmente complementaria con el ácido nucleico diana o sustancialmente idéntica al ácido nucleico diana.

El número de copias del molde o amplicones que se pueden producir puede modularse mediante la modificación apropiada de la reacción de amplificación que incluye, por ejemplo, variar el número de ciclos de amplificación ejecutados, usar polimerasas de procesividad variable en la reacción de amplificación y/o variar la duración de tiempo en el que se realiza la reacción de amplificación, así como la modificación de otras condiciones conocidas en la técnica que influyen en el rendimiento de la amplificación. El número de copias de un molde de ácido nucleico puede ser de al menos 1, 10, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 y 10.000 copias, y se puede variar en función de la aplicación particular.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cada uno", cuando se usa en referencia a una colección de artículos, está destinado a identificar un artículo individual en la colección, pero no necesariamente se refiere a cada artículo de la colección a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

En el presente documento se proporcionan matrices y métodos de detección y análisis espacial (por ejemplo, análisis mutacional o detección de variación de un solo nucleótido (SNV)) de un ácido nucleico en una muestra de tejido. Las matrices descritas en el presente documento pueden comprender un sustrato sobre el que se inmovilizan una pluralidad de sondas de captura de modo que cada sonda de captura ocupe una posición diferenciada en la matriz. Algunas o todas las sondas de captura pueden comprender un marcador posicional exclusivo (es decir, una dirección espacial o secuencia de indexación). Una dirección espacial puede describir la posición de la sonda de captura en la matriz. La posición de la sonda de captura sobre la matriz puede correlacionarse con una posición en la muestra de tejido.

Como se usa en este documento, la expresión "muestra de tejido" se refiere a un trozo de tejido que se ha obtenido de un sujeto, se ha fijado, seccionado y montado en una superficie plana, por ejemplo, un portaobjetos de microscopio. La muestra de tejido puede ser una muestra de tejido sumergida en parafina fijada con formalina (“formalin-fixed paraffin-embedded”, FFPE) o una muestra de tejido fresco o una muestra de tejido congelada, etc. Los métodos descritos en este documento pueden realizarse antes o después de teñir la muestra de tejido. Por ejemplo, después de la tinción con hematoxilina y eosina, se puede analizar espacialmente una muestra de tejido de acuerdo con los métodos que se proporcionan en el presente documento. Un método puede incluir analizar la histología de la muestra (por ejemplo, usando tinción con hematoxilina y eosina) y luego analizar espacialmente el tejido.

Como se usa en este documento, la expresión "sección de tejido sumergida en parafina fijada con formalina (FFPE)" se refiere a un trozo de tejido, por ejemplo, una biopsia que se ha obtenido de un sujeto, fijado en formaldehído (por ejemplo, formaldehído al 3 % -5 % en disolución salina tamponada con fosfato) o disolución de Bouin, sumergida en cera, cortada en secciones delgadas y luego montada sobre una superficie plana, por ejemplo, un portaobjetos de microscopio.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de una muestra de tejido se transfieren y capturan sobre una matriz. Por ejemplo, una sección de tejido se pone en contacto con una matriz y el ácido nucleico se captura sobre la matriz y se marca con una dirección espacial. Las moléculas de ADN marcadas espacialmente se liberan desde la matriz y se analizan, por ejemplo, mediante secuenciación de próxima generación (“next generation sequencing”, NGS) de alto rendimiento, tal como secuenciación por síntesis (“sequencing-by-synthesis”, SBS). En algunas realizaciones, un ácido nucleico en una sección de tejido (por ejemplo, una sección de tejido sumergida en parafina fijada con formalina (FFPE)) se transfiere a una matriz y se captura sobre la matriz mediante hibridación con una sonda de captura. En algunas realizaciones, una sonda de captura puede ser una sonda de captura universal que se hibrida, por ejemplo, con una región adaptadora en una biblioteca de secuenciación de ácidos nucleicos, o con la cola poli-A de un ARNm. En algunas realizaciones, la sonda de captura puede ser una sonda de captura específica de gen que se hibrida, por ejemplo, con un ARNm o ADNc específicamente buscado en una muestra, tal como una sonda oligonucleótídica de TruSeq™ Custom Amplicon (TSCA) (Illumina, Inc.). Una sonda de captura puede ser una pluralidad de sondas de captura, por ejemplo, una pluralidad de sondas de captura iguales o diferentes.

En algunas realizaciones, un ácido nucleico en una sección de tejido (por ejemplo, una sección de FFPE) se transfiere a una matriz y se captura sobre la matriz mediante acoplamiento monocatenario con un oligonucleótido adaptador universal. Por ejemplo, los oligonucleótidos adaptadores universales que incluyen direcciones espaciales pueden inmovilizarse sobre una matriz de esferas. Pueden acoplarse dianas de ácido nucleico monocatenario a los adaptadores para su captura. El ácido nucleico puede comprender ADNc o amplicones de ADN genómico. Los adaptadores universales se pueden utilizar para capturar de ADNc o amplicones de ADN específico de gen. La orientación de los adaptadores universales sobre la matriz (por ejemplo, matriz de esferas) se puede controlar para capturar las regiones 3' y 5' de los ácidos nucleicos diana.

En algunas realizaciones, se puede integrar una matriz de captura (es decir, una matriz de sitios de captura) con un sistema electroforéti

sitio de captura sobre la matriz. La transferencia electroforética de los ácidos nucleicos puede mantener la resolución espacial sobre el contexto del tejido limitando la difusión de moléculas de ácido nucleico lejos de su ubicación de origen durante la transferencia y reduciendo así la pérdida de ácidos nucleicos entre los sitios de captura.

En algunas realizaciones, se usa un sistema de indexación (direccionamiento) combinatorio para proporcionar información espacial para el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido. El sistema de indexación combinatoria puede implicar el uso de dos o más secuencias de direcciones espaciales (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más secuencias de dirección espacial).

En algunas realizaciones, se incorporan dos secuencias de dirección espacial en un ácido nucleico durante la preparación de una biblioteca de secuenciación. Se puede usar una primera dirección espacial para definir una cierta posición (es decir, un sitio de captura) en la dimensión X sobre una matriz de captura y se puede usar una segunda secuencia de dirección espacial para definir una posición (es decir, un sitio de captura) en la dimensión Y sobre la matriz de captura. Durante la secuenciación de la biblioteca, se pueden determinar las secuencias de direcciones espaciales X e Y y se puede analizar la información de la secuencia para definir la posición específica sobre la matriz de captura.

En algunas realizaciones, se incorporan tres secuencias de dirección espacial en un ácido nucleico durante la preparación de una biblioteca de secuenciación. Se puede usar una primera dirección espacial para definir una cierta posición (es decir, un sitio de captura) en la dimensión X sobre una matriz de captura, se puede usar una segunda secuencia de dirección espacial para definir una posición (es decir, un sitio de captura) en la dimensión Y sobre la matriz de captura, y se puede usar una tercera secuencia de dirección espacial para definir una posición de una sección de muestra bidimensional (por ejemplo, la posición de un corte de una muestra de tejido) en una muestra (por ejemplo, una biopsia de tejido) para proporcionar posición información espacial en la tercera dimensión (dimensión Z) de una muestra. Durante la secuenciación de la biblioteca, se pueden determinar las secuencias de direcciones espaciales X, Y y Z y se puede analizar la información de la secuencia para definir la posición específica en la matriz de captura.

En algunas realizaciones, una secuencia de dirección temporal (T) se incorpora opcionalmente en un ácido nucleico durante la preparación de una biblioteca de secuenciación. En algunas realizaciones, la secuencia de dirección temporal se puede combinar con dos o tres secuencias de dirección espacial. La secuencia de dirección temporal se puede utilizar, por ejemplo, en el contexto de un experimento de desarrollo en el tiempo para determinar cambios dependientes del tiempo en la expresión génica en una muestra de tejido. Los cambios dependientes del tiempo en la expresión génica pueden aparecer en una muestra de tejido, por ejemplo, en respuesta a un estímulo químico, biológico o físico (por ejemplo, una toxina, un fármaco o calor). Las muestras de ácido nucleico obtenidas en diferentes momentos de muestras de tejido comparables (por ejemplo, cortes proximales de una muestra de tejido) pueden agruparse y secuenciarse de modo masivo. Se puede usar una primera dirección espacial opcional para definir una cierta posición (es decir, un sitio de captura) en la dimensión X en una matriz de captura, se puede usar una segunda secuencia de dirección espacial opcional para definir una posición (es decir, un sitio de captura) en la dimensión Y en la matriz de captura y se puede usar una tercera secuencia de dirección espacial opcional para definir una posición de una sección de muestra bidimensional (por ejemplo, la posición de un corte de una muestra de tejido) en una muestra (por ejemplo, una biopsia de tejido) para proporcionar información espacial posicional en la tercera dimensión (dimensión Z) de la muestra. Durante la secuenciación de la biblioteca, se determinan las secuencias de direcciones T, X, Y y Z y la información de la secuencia se analiza para definir la posición X, Y (y opcionalmente Z) específica sobre la matriz de captura para cada momento (T).

Las secuencias de direcciones X, Y y, opcionalmente, Z y/o T pueden ser secuencias de ácido nucleico consecutivas o las secuencias de direcciones pueden estar separadas por uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 10 o más , 30 o más, 100 o más, 300 o más, o 1.000 o más). En algunas realizaciones, las secuencias de direcciones X, Y y, opcionalmente, Z y/o T pueden ser cada una individual e independientemente secuencias de ácido nucleico combinatorias.

En algunas realizaciones, la longitud de las secuencias de dirección (por ejemplo, X, Y, Z o T) puede ser individual e independientemente 100 ácidos nucleicos o menos, 90 ácidos nucleicos o menos, 80 ácidos nucleicos o menos, 70 ácidos nucleicos o menos, 60 ácidos nucleicos o menos, 50 ácidos nucleicos o menos, 40 ácidos nucleicos o menos, 30 ácidos nucleicos o menos, 20 ácidos nucleicos o menos, 15 ácidos nucleicos o menos, 10 ácidos nucleicos o menos, 8 ácidos nucleicos o menos, 6 ácidos nucleicos o menos, o 4 ácidos nucleicos o menos. La longitud de dos o más secuencias de direcciones en un ácido nucleico puede ser igual o diferente. Por ejemplo, si la longitud de la secuencia de dirección X es de 10 ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de dirección Y puede ser, por ejemplo, 8 ácidos nucleicos, 10 ácidos nucleicos o 12 ácidos nucleicos.

Las secuencias de direcciones, por ejemplo, secuencias de dirección espacial tales como X o Y, pueden ser secuencias degeneradas parcial o totalmente.

En algunas realizaciones, las sondas de captura con direcciones espaciales sobre una matriz se pueden liberar de la matriz a una sección de tejido para la generación de una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales. En algunas realizaciones, una sonda de captura comprende una secuencia de cebador aleatorio para la síntesis in situ de ADNc marcado espacialmente a partir de ARN en la sección de tejido. En algunas realizaciones, una sonda de captura es una sonda oligonucleotídica de TruSeq™ Custom Amplicon (TSCA) (Illumina, Inc.) para capturar y marcar espacialmente el ADN genómico en la sección de tejido. Las moléculas de ácido nucleico marcadas espacialmente (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) se recuperan de la sección de tejido y se procesan en reacciones de un solo tubo para generar una biblioteca de amplicones marcada espacialmente.

En algunas realizaciones, se pueden usar nanopartículas magnéticas para capturar ácido nucleico (por ejemplo, ADNc sintetizado in situ) en una muestra de tejido para la generación de una biblioteca con direcciones espaciales.

En algunas realizaciones, la detección espacial y el análisis del ácido nucleico en una muestra de tejido se pueden realizar con un accionador de gotitas.

4.1 Generación de matrices

En un aspecto, en la presente se proporcionan matrices de captura que comprenden sondas de captura codificadas espacialmente. Las sondas de captura codificadas espacialmente sobre las sondas de captura se pueden inmovilizar, por ejemplo, sobre un sustrato de vidrio plano o sobre una pluralidad de esferas.

La figura 1A ilustra una vista en planta de un ejemplo de realización de una matriz de captura 100 para la captura de un ácido nucleico en una muestra de tejido. La matriz de captura 100 comprende una disposición (por ejemplo, filas y columnas) de sitios de captura 105 sobre un soporte sólido 110. En algunas realizaciones, el soporte sólido 110 es un sustrato de vidrio plano. En algunas realizaciones, el soporte sólido 110 es una esfera (por ejemplo, ver la figura 1C). Al menos una sonda de captura 115 está inmovilizada a cada uno de los sitios de captura 105 de la matriz de captura 100, como se muestra en la figura 1B. Es decir, la figura 1B ilustra una vista lateral de un sitio de captura 105 de la matriz de captura 100, en el que el único sitio de captura 105 comprende al menos una sonda de captura 115 para la captura de un ácido nucleico en una muestra de tejido. La figura 1B muestra una sonda de captura 115 inmovilizada sobre la superficie del soporte sólido 110. En esta realización, se muestra una única sonda de captura 115, pero cualquier número de sondas de captura 115 puede inmovilizarse en el soporte sólido 110 en cada sitio de captura 105. La sonda de captura 115 puede comprender opcionalmente una secuencia escindible en una región escindible 120, una secuencia de cebador de SBS en un sitio de unión al cebador de SBS 125, una secuencia de dirección espacial en una región de dirección espacial 130 y una secuencia de captura en una región de captura 135. Puede utilizarse una región escindible 120 para liberar el ácido nucleico capturado de la matriz de captura 100 de manera que la región de dirección espacial 130 esté incluida en el ácido nucleico liberado y el ácido nucleico esté "marcado". La región de cebador de SBS 125 puede comprender una secuencia del cebador de SBS (por ejemplo, SBS12 o SBS3) que puede usarse en un proceso de secuenciación por síntesis (SBS). Como alternativa, la secuencia del cebador de SBS 125 o alguna porción de la misma puede añadirse posteriormente, por ejemplo, mediante acoplamiento o mediante síntesis por PCR. La región de cebador de SBS 125 también se puede usar en una reacción de amplificación para generar una biblioteca de secuenciación como se describe con más detalle con referencia a la figura 12 y la figura 13. La región de dirección espacial 130 corresponde con la posición de la sonda de captura 115 en la matriz de captura 100. Cada sonda de captura 115 en un sitio de captura 105 comprende una región de dirección espacial exclusiva 130. La posición de la sonda de captura 115 en la matriz de captura 100 puede correlacionarse con una posición en la muestra de tejido.

La región de captura 135 puede ser, por ejemplo, una región de captura universal (general). En algunas realizaciones, la región de captura 135 comprende un oligonucleótido poli-T que puede usarse para capturar el ARNm total en una muestra de tejido como se describe con más detalle con referencia a la figura 3. En algunas realizaciones, la región de captura 135 es una región de captura universal que puede usarse para capturar ADNc sintetizado por transcripción inversa in situ de ARN como se describe con más detalle con referencia a la figura 6. En algunas realizaciones, la región de captura 135 es una región de captura universal que se puede usar para capturar amplicones de ADN genómico como se describe con más detalle con referencia a la figura 9 y la figura 10.

En algunas realizaciones, la región de captura 135 es una región de captura específica de un gen o de una diana que se puede usar para capturar un ácido nucleico específico en una muestra de tejido. Cada sonda de captura 115 en la matriz de captura 100 puede comprender una o más regiones de captura específicas de genes exclusivas 135. La publicación de patente de EE. UU. n.° de publicación 2015148239, presentada el 22 de septiembre, 2014, de Peter et al., describe cebadores de PCR escindibles en los que cada sonda incluye múltiples cebadores escindibles, y que pueden emplearse en esta y otras realizaciones descritas en el presente documento. Diferentes sondas de captura 115 en la matriz de captura 110 pueden tener la misma región de captura específica de gen o pueden ser diferentes regiones de captura específicas de gen. En algunas realizaciones, el ácido nucleico en la muestra de tejido es un ARNm específico de gen como se describe con más detalle con referencia a la figura 4. En algunas realizaciones, el ácido nucleico en la muestra de tejido es un ADNc específico de gen sintetizado mediante transcripción inversa in situ de ARN como se describe con más detalle con referencia a la figura 7. En algunas realizaciones (no se muestra), la región de captura 135 es una región específica de gen que puede usarse para capturar amplicones de ADN genómico.

Las sondas pueden ponerse en contacto con tejido colocando el tejido directamente sobre la superficie que comprende las sondas; colocando el tejido sobre una sustancia, como un filtro o un gel o una capa fina de tampón , separando el tejido de las sondas de manera que los ácidos nucleicos diana puedan difundirse desde el tejido, a través de la sustancia hacia las sondas; colocando el tejido sobre una sustancia tal como un filtro o un gel o una fina de tampón fina que separa el tejido de las sondas de modo que las sondas puedan difundirse desde la superficie que comprende las sondas, a través de la sustancia hasta las dianas; extrayendo las dianas del tejido hacia un sustrato intermedio (por ejemplo, un gel, filtro, sustrato sólido o combinaciones de los anteriores), que luego se coloca sobre la superficie que soporta las sondas; y combinaciones de los anteriores. En cada caso, la técnica se selecciona para mantener sustancialmente la información que codifica la orientación espacial de las dianas en la muestra.

La figura 1C ilustra una vista lateral de una realización de una esfera de captura universal 150 para la captura de un ácido nucleico en una muestra de tejido. En algunas realizaciones, hay una esfera de captura universal 150 en cada uno de los sitios de captura 105 de la matriz de captura 100. Por ejemplo, las esferas de captura universales 150 pueden depositarse en pocillos sobre un soporte sólido 110 (por ejemplo, un sustrato de vidrio). La esfera de captura universal 150 comprende una esfera 155. Un oligonucleótido adaptador universal 160 está inmovilizado sobre la superficie de la esfera 155. El oligonucleótido adaptador universal 160 es esencialmente el mismo que la sonda de captura 115 de la figura 1B excepto que se omite la región de captura 135, es decir, el oligonucleótido de adaptador universal 160 comprende sólo la región escindible 120, la región de cebador de SBS 125 y la región de dirección espacial 130. La región de cebador de SBS 125 puede comprender, por ejemplo, una secuencia SBS12 o una secuencia SBS3. En esta realización, se muestra un único oligonucleótido adaptador universal 160, pero se puede inmovilizar cualquier número de oligonucleótidos adaptadores universales 160 sobre la esfera 155. La esfera de captura universal 150 se puede usar para capturar un ácido nucleico en una muestra de tejido mediante acoplamiento monocatenario de un ácido nucleico diana (por ejemplo, ADNc o amplicones de ADN genómico) al oligonucleótido adaptador universal 160 como se describe con más detalle con referencia a las figuras 12 a 15.

Se puede producir una matriz de captura específica de gen, tal como una matriz de esferas con una pluralidad de sondas de captura específicas de gen sobre cada esfera, usando una estrategia basada en el acoplamiento. Por ejemplo, una matriz de esferas puede diseñarse para tener 1 millón de direcciones espaciales sobre una esfera. La matriz puede diseñarse para capturar ácido nucleico de 1000 genes. Para capturar el ácido nucleico de 1000 genes sobre una esfera diseñada para tener 1 millón de direcciones espaciales se requerirían mil millones de sondas de captura (es decir, 1000 genes x 1 millón de direcciones espaciales = mil millones de oligonucleótidos de captura). Para evitar la síntesis de mil millones de sondas de captura, se puede acoplar un conjunto de oligonucleótidos que representan regiones de captura específicas de genes (por ejemplo, región de captura 135) sobre sondas de captura con direcciones espaciales que comprenden la región de escisión 120, la región de cebador de SBS 125 y la región de dirección espacial 130 (por ejemplo, oligonucleótidos que representan 1.000 regiones de captura específicas de genes 1 millón de regiones de direcciones espaciales = 1,1 millones de sondas de captura). En algunas realizaciones, el conjunto de regiones de captura específicas de genes se acopla con las sondas de captura con direcciones espaciales usando una estrategia de acoplamiento enzimática. En algunas realizaciones, el conjunto de regiones de captura específicas de genes se acopla con las sondas de captura con direcciones espaciales usando una estrategia de acoplamiento químico.

También se puede usar una estrategia basada en el acoplamiento para producir una pluralidad de direcciones espaciales para una matriz de esferas. La estrategia actual para producir una matriz de esferas con direcciones espaciales requiere la síntesis de cada oligonucleótido de forma independiente para cada dirección espacial diferenciada (por ejemplo, 1 millón de direcciones espaciales requiere la síntesis de 1 millón de oligonucleótidos). Para evitar la síntesis de 1 millón de oligonucleótidos, se puede utilizar una estrategia combinatoria. Por ejemplo, se sintetizan tres subconjuntos diferenciados de oligonucleótidos con secuencias exclusivas (por ejemplo, subconjunto A con 100 secuencias exclusivas, subconjunto B con 100 secuencias exclusivas y subconjunto C con 100 secuencias exclusivas) y se utilizan en una reacción de acoplamiento combinatorio, por ejemplo, 100 subconjunto A x 100 subconjunto B x 100 subconjunto C = 1 millón de oligonucleótidos con direcciones espaciales diferenciadas. La estrategia combinatoria requiere la síntesis de solo 300 oligonucleótidos diferentes.

En algunas realizaciones, se puede usar una estrategia de hibridación y extensión para producir sondas de captura específicas de genes con direcciones espaciales. Por ejemplo, se sintetiza un conjunto "X" de 1.000 oligonucleótidos con direcciones espaciales exclusivas. Se sintetiza un segundo conjunto "Y" de 1000 oligonucleótidos que captura individualmente un gen exclusivo y que puede hibridarse para formar oligonucleótidos del conjunto "X". Cada oligonucleótido individual de los oligonucleótidos del conjunto "Y" se hibrida con oligonucleótidos del conjunto “X” y se realiza una reacción de extensión. Con esta estrategia, se requiere la síntesis de 2000 oligonucleótidos para generar 1 millón de sondas de captura diferentes (1000 secuencias de dirección espacial exclusivas apareadas individualmente con 1000 secuencias de captura específicas de genes diferentes). Usando la síntesis general de oligonucleótidos, la producción de 1000 sondas de captura específicas de genes, cada una con 1000 direcciones espaciales diferentes, requeriría la síntesis de 1 millón de oligonucleótidos (1000 genes x 1000 direcciones).

Las esferas que comprenden las sondas pueden ponerse en contacto con el tejido colocando el tejido directamente sobre la superficie que comprende las esferas; colocar el tejido sobre una sustancia, tal como un filtro o un gel o una capa fina de tampón , separando el tejido de las esferas de manera que los ácidos nucleicos diana puedan difundirse desde el tejido, a través de la sustancia hasta las sondas; colocando el tejido sobre una sustancia tal como un filtro o un gel o una capa fina de tampón que separa el tejido de las sondas de manera que las sondas puedan difundirse desde las esferas, a través de la sustancia hasta las dianas; extrayendo las dianas del tejido sobre un sustrato intermedio (por ejemplo, un gel, filtro, sustrato sólido o combinaciones de los anteriores), que luego se coloca sobre la superficie que soporta las esferas; depositando las esferas directamente en el tejido; y combinaciones de los anteriores. En cada caso, la técnica se selecciona para mantener sustancialmente la información que codifica la orientación espacial de las dianas en la muestra.

4.2 Detección espacial y análisis del ácido nucleico en una muestra de tejido

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra.

La figura 2 ilustra un diagrama de flujo de una realización de un método 200 de detección espacial y análisis de un ácido nucleico en una muestra de tejido. El método 200 puede incluir, entre otros, algunas o todas las siguientes etapas.

En una etapa 210, se prepara una muestra de tejido para su análisis. En algunas realizaciones, la muestra de tejido es una muestra de tejido FFPE que se secciona sobre un portaobjetos. Otros ejemplos incluyen tejido fresco, tejido congelado, etc.

En una etapa 215, se realiza la bioquímica in situ en la sección de tejido para facilitar la manipulación posterior de un ácido nucleico en la muestra. En algunas realizaciones, se usa una reacción de transcripción inversa in situ para sintetizar ADNc a partir de ARNm diana en la muestra de tejido. En algunas realizaciones, se puede usar una reacción de amplificación in situ para producir múltiples amplicones de ADN genómico a partir de genes diana en la muestra de tejido. En algunas realizaciones, no hay una etapa de bioquímica in situ, y la síntesis de ADNc se realiza después de la captura o extracción del ARN del tejido.

En una etapa 220, el ácido nucleico diana en la sección de tejido se transfiere a una matriz de modo que la posición de un ácido nucleico sobre la matriz pueda correlacionarse con una posición en la sección de tejido. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana comprende un ARNm. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana comprende un ADNc sintetizado in situ. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende amplicones de ADN genómico generados por amplificación in situ. En algunas realizaciones, la matriz es una matriz de sitios de captura, como los sitios de captura 105 de la matriz de captura 100 mostrados en la figura 1A y la figura 1B. En algunas realizaciones, la matriz es una matriz de esferas (por ejemplo, esferas de captura universales 150 de la figura 1C) que incluyen una pluralidad de sondas de captura. Otros ejemplos de una matriz incluyen una matriz de pocillos o poros o proyecciones o una celda de flujo de secuenciación que incluye una pluralidad de sondas de captura. El ácido nucleico se puede capturar sobre la matriz, por ejemplo, hibridando el ácido nucleico con las sondas de captura sobre la matriz. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se puede capturar sobre la matriz mediante acoplamiento monocatenario del ácido nucleico sobre oligonucleótidos adaptadores universales.

En esta y otras realizaciones descritas en el presente documento, las sondas pueden ponerse en contacto con el ácido nucleico diana colocando el tejido directamente sobre la superficie que comprende las sondas; colocando el tejido sobre una sustancia tal como un filtro o un gel o una capa fina de tampón que separa el tejido de las sondas de modo que el ácido nucleico diana pueda difundirse desde el tejido, a través de la sustancia hasta las sondas; colocando el tejido sobre una sustancia, tal como un filtro o un gel o una capa fina de tampón que separa el tejido de las sondas de manera que las sondas puedan difundirse desde la superficie que comprende las sondas, a través de la sustancia hasta el ácido nucleico diana; extrayendo el ácido nucleico diana del tejido sobre un sustrato intermedio (por ejemplo, un gel, filtro, sustrato sólido o combinaciones de los anteriores), que luego se coloca sobre la superficie que soporta las sondas; y combinaciones de los anteriores. En cada caso, la técnica se selecciona para mantener sustancialmente la información que codifica la orientación espacial de las dianas en la muestra.

En la etapa 225, se prepara una biblioteca de secuenciación. En algunas realizaciones, la biblioteca de secuenciación se prepara para la secuenciación por síntesis. La preparación de la biblioteca se puede lograr sobre el sustrato de la matriz de captura, o los ácidos nucleicos se pueden escindir del sustrato y reunirse, de modo que la preparación de la biblioteca se puede lograr por separado, por ejemplo, utilizando un sistema de preparación de bibliotecas NeoPrep™ (Illumina, Inc., San Diego).

En una etapa 230, se secuencia la biblioteca. La secuenciación se puede lograr usando cualquier técnica de secuenciación. Los ejemplos de secuenciadores adecuados incluyen aquellos disponibles, o que están siendo desarrollados por, Illumina, Inc., F. Hoffmann-La Roche AG, Life Technologies, Inc., Beckman Coulter, Inc., Pacific Biosciences, Inc., Oxford Nanopore, Inc. y/o sus filiales.

En una etapa 235, se analizan los datos de secuencia (por ejemplo, mutaciones y/o llamadas de variantes) y se descodifica la información espacial. La información espacial se puede utilizar para proporcionar información sobre la ubicación del ácido nucleico en la sección de tejido.

(a) Captura del ácido nucleico basada en la hibridación

En algunas realizaciones, la captura basada en la hibridación se usa para capturar ácidos nucleicos diana en una muestra de tejido sobre sondas de captura en una matriz. La matriz puede ser, por ejemplo, una matriz de esferas o pocillos o poros o proyecciones, una superficie plana o una celda de flujo de secuenciación que incluye una pluralidad de sondas de captura. En un ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con sondas de captura que se fijan sobre la superficie de la matriz. La muestra de tejido puede colocarse directamente sobre la superficie que comprende las sondas de captura o la muestra de tejido puede colocarse sobre una sustancia como un filtro o un gel o una capa fina de tampón que separa la muestra de tejido de las sondas de captura de modo que el ácido nucleico diana puede difundirse desde el tejido a través de la sustancia hasta las sondas de captura.

En otro ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz y las sondas de captura sobre la matriz se liberan hacia la muestra de tejido para la hibridación con los ácidos nucleicos en la muestra de tejido. La muestra de tejido puede colocarse directamente sobre la superficie que comprende las sondas de captura o la muestra de tejido puede colocarse sobre una sustancia como un filtro o un gel o una capa fina de tampón que separa la muestra de tejido de las sondas de captura de modo que las sondas de captura liberadas pueden difundirse desde la matriz a través de la sustancia hasta el ácido nucleico en la muestra de tejido. Las sondas de captura se pueden anclar a la matriz usando un grupo liberable o una porción o conector selectivamente escindible. Las sondas de captura se pueden liberar de la matriz usando, por ejemplo, escisión química, escisión enzimática o fotoescisión. En otro ejemplo, las sondas de captura pueden imprimirse sobre la superficie de la matriz y secarse. Las sondas de captura se pueden liberar de la matriz mediante rehidratación. En otro ejemplo más, las sondas de captura pueden imprimirse sobre la matriz usando una sustancia que se disuelve en presencia de un determinado tratamiento. A continuación, se aplica el tratamiento para liberar las sondas de captura antes de colocar la muestra de tejido sobre la matriz.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ARNm total. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ARNm específico de gen.

La figura 3 ilustra una vista lateral de otra realización de un sitio de captura 105 de la matriz de captura 100 de la figura 1A y muestra una realización de un proceso de captura de ARNm total en una muestra de tejido sobre la matriz. En esta realización, la sonda de captura 115 comprende una región de captura de poli-T 310. Una muestra de ácido nucleico, tal como una muestra de tejido o sustrato que comprende dianas de ácido nucleico derivadas de una muestra de tejido (no se muestra), que incluye una pluralidad de moléculas de ARNm 315 se pone en contacto con el sitio de captura 105. La molécula de ARNm 315 comprende una cola de poli-A 320. Puede estar presente una mutación 325 en la molécula de ARNm 315. La mutación 325 puede ser, por ejemplo, un polimorfismo de un solo nucleótido (“single nucleotide polymorphism”, SNP). La molécula de ARNm 315 se captura sobre la sonda de captura 115 mediante la hibridación de la cola de poli-A 320 con la región de captura de poli-T 310. La región de captura de poli-T 310 también puede actuar como un cebador de transcriptasa inversa para la síntesis del ADNc de primera hebra de la molécula de ARNm capturada 315 (indicado por una flecha de trazo discontinuo).

En este ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con una sonda de captura 115 que se fija sobre la superficie del sitio de captura 105. La molécula de ARNm 315 se captura sobre la matriz mediante hibridación con la secuencia de captura de poli-T 310. En otro ejemplo (no se muestra) , la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz y la sonda de captura 115 se libera del sitio de captura 105 hacia la muestra de tejido mediante escisión de la secuencia escindible opcional 120.

En algunas realizaciones (no se muestra), la región de captura 310 es una región de captura de oligonucleótidos aleatorios ("randómeros") que puede usarse para capturar un grupo aleatorio de moléculas de ARN. La región de captura de oligonucleótidos aleatorios puede comprender, por ejemplo, una secuencia aleatoria con complejidad reducida de modo que la captura de ARN ribosómico en la muestra de tejido se reduce sustancialmente.

La figura 4 ilustra una vista lateral de algunas realizaciones de un sitio de captura 105 de la matriz de captura 100 de la figura 1A y muestra una realización de un proceso de captura de ARNm buscado individualmente (es decir, específico de gen) en una muestra de tejido sobre la matriz. En esta realización, se muestran dos sondas de captura 115, es decir, la sonda de captura 115a y 115b. La sonda de captura 115a comprende una región de captura específica de gen 410a. De manera similar, la sonda de captura 115b comprende una región de captura específica de gen diferente 410b. Una muestra de ácido nucleico, tal como una muestra de tejido o sustrato que comprende dianas de ácido nucleico derivadas de una muestra de tejido (no se muestra), que comprende una pluralidad de moléculas de ARNm diferentes 415, se pone en contacto con el sitio de captura 105. En esta realización, una primera molécula de ARNm 415a es el transcrito de un primer gen y una segunda molécula de ARNm 415b es el transcrito de un segundo gen. La molécula de ARNm 415a puede incluir una mutación 420a. La molécula de ARNm 415b puede incluir una mutación 420b. Las mutaciones 420 pueden ser, por ejemplo, SNP. La molécula de ARNm 415a se captura sobre la sonda de captura 115a mediante hibridación de secuencias de ARNm complementarias con la región de captura específica de gen 410a. De manera similar, la molécula de ARNm 415b se captura sobre la sonda de captura 115b mediante hibridación de una molécula de ARNm complementaria con la región de captura específica de gen 410b. La región de captura específica de gen 410 también puede actuar como cebador de la transcriptasa inversa para la síntesis del ADNc de primera hebra a partir de la molécula de ARNm capturada 415.

En este ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con las sondas de captura 115 que se fijan sobre la superficie del sitio de captura 105. Las moléculas de ARNm 415 se capturan sobre la matriz mediante hibridación con secuencias de captura específicas de genes 410. En otro ejemplo (no se muestra), la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz y las sondas de captura 115 se liberan desde el sitio de captura 105 hacia la muestra de tejido mediante escisión de la secuencia escindible opcional 120.

En algunas realizaciones, la captura basada en hibridación se usa para capturar ADNc generado por transcripción inversa in situ de ARN en una muestra de tejido sobre una matriz.

La figura 5 ilustra un diagrama de flujo de una realización de un método 500 para generar ADNc mediante transcripción inversa in situ de ARN en una muestra de tejido para capturar sobre una matriz (por ejemplo, la matriz de captura 100 de la figura 1A). El método 500 comprende, pero no se limita a algunas o todas las etapas siguientes.

En la etapa 510, el ADNc específico del gen se sintetiza a partir del ARNm diana en una muestra de tejido mediante transcripción inversa in situ. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de oligonucleótidos que comprende un primer cebador específico de gen y una secuencia de captura universal para cebar la síntesis de ADNc de primera hebra.

En una etapa opcional 515, el ADNc se amplifica en la muestra de tejido mediante amplificación isotérmica in situ. Por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos que comprende un segundo cebador específico de gen y una secuencia de cebador de SBS, por ejemplo, SBS12, puede usarse para amplificación isotérmica.

En una etapa 520, el ADNc amplificado se captura sobre una matriz. El ADNc se captura sobre la matriz hibridando el ADNc para capturar sondas sobre la matriz. En algunas realizaciones, las sondas de captura incluyen una secuencia de captura universal y se pueden usar para capturar ADNc sintetizado usando un cebador específico de gen que comprende una secuencia de captura complementaria como se describe con más detalle con referencia a la figura 6. En algunas realizaciones, las sondas de captura incluyen secuencias de captura específicas de genes y se pueden usar para capturar ADNc sintetizado usando un grupo de cebadores específicos de genes o cebadores aleatorios que incluyen una secuencia de cebador de SBS como se describe con más detalle con referencia a la figura 7.

La figura 6 ilustra una realización de las etapas de un método 500 de la figura 5. En esta realización, se usa una etapa de amplificación isotérmica in situ (es decir, la etapa opcional 515) antes de la transferencia de ADN a una matriz. Concretamente, una sección de tejido (no se muestra) comprende una molécula de ARNm diana 610. La molécula de ARNm diana 610 puede incluir una mutación 615. En la etapa 510, la molécula de ARNm diana 610 se transcribe de forma inversa in situ usando un cebador de transcripción inversa (RT) 620. El cebador de RT 620 comprende una primera región de cebador específica de gen 625 y una región de captura universal 630. El cebador de RT 620 también puede incluir una región de identificador molecular exclusivo (“unique molecular identifier”, UMI) (no se muestra). Una molécula de ADNc 635 sintetizada usando el cebador de RT 620 comprende la región de captura universal 630. En la etapa 515, la molécula de ADNc 635 se amplifica mediante amplificación isotérmica in situ usando un cebador de amplificación 640. El cebador de amplificación 640 comprende una segunda región de cebador específica de gen 645 y una región de cebador de secuenciación SBS 650 que comprende, por ejemplo, una secuencia de SBS12. Una molécula de ADN 655 generada usando el cebador de amplificación 640 comprende la región de captura universal 630 y el cebador de secuenciación SBS 650. En la etapa 520, la molécula de ADN 655 se captura sobre el sitio de captura 105. Por ejemplo, la muestra de tejido que contiene la molécula de ADN 655 o un sustrato que comprende ADN la molécula 655 derivada de la muestra de tejido (no se muestra) se pone en contacto con el sitio de captura 105. En algunas realizaciones, la sonda de captura 115 sobre el sitio de captura 105 comprende una región de captura 660 que es complementaria con la región de captura universal 630; el cebador de secuenciación SBS 130 es SBS3. La molécula de ADN 655 se captura sobre el sitio de captura 105 mediante la hibridación de la región de captura universal 630 con la región de captura 660.

En este ejemplo, tanto la región de captura 660 como la región de captura universal 630 también pueden actuar como cebadores para una reacción de extensión. Cuando se usa la región de captura 660 como cebador, se copia la mutación 615 en la molécula de ADN 655. Cuando se usa la región de captura universal 630 como cebador, se copian la región de dirección espacial 130 y la región de cebador de SBS 125. Ambos productos de extensión se pueden utilizar para la generación de bibliotecas corriente abajo.

En este ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con la sonda de captura 115 que se fija sobre la superficie del sitio de captura 105. La molécula de ADN 655 se captura sobre la matriz por hibridación de la región de captura universal 630 con la región de captura 660. En otro ejemplo (no se muestra), la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz y las sondas de captura 115 se liberan desde el sitio de captura 105 hacia la muestra de tejido por escisión de la secuencia escindible opcional 120.

La figura 7 ilustra una realización de las etapas de un método 500 de la figura 5. En esta realización, se usa una sonda de captura específica de gen para capturar un ADNc específico y se omite la etapa de amplificación isotérmica opcional 515 de la figura 5. Es decir, una sección de tejido (no se muestra) comprende la molécula de ARNm diana 610. La molécula de ARNm diana 610 puede incluir la mutación 615. En la etapa 510, la molécula de ARNm diana 610 se transcribe de forma inversa in situ usando un cebador de RT 710. El cebador de RT 710 comprende un región de cebador específica de gen 625 y una región de cebador de SBS 720, por ejemplo, SBS3. El cebador de RT 710 también puede incluir una secuencia UMI (no se muestra). Una molécula de ADNc 725 sintetizada usando el cebador de RT 710 comprende la región de cebador de SBS 720. En la etapa 520, la molécula de ADNc 725 se captura sobre el sitio de captura 105. Por ejemplo, la muestra de tejido que contiene la molécula de ADN 725 o un sustrato que comprende la molécula de ADN 725 derivada de la muestra de tejido (no se muestra) se pone en contacto con el sitio de captura 105. En esta realización, la sonda de captura 115 sobre el sitio de captura 105 comprende una región de captura específica de gen 730 que es complementaria con una secuencia en el extremo 3' de la molécula de ADNc 725; la región de cebador de SBS 125 es SBS12. La molécula de ADNc 725 se captura sobre el sitio de captura 105 mediante la hibridación de la región de captura 730 con secuencias complementarias en el extremo 3' de la molécula de ADNc 725.

En algunas realizaciones, la captura basada en la hibridación puede usarse para transferir amplicones generados por amplificación in situde ADN genómico en una muestra de tejido a una matriz. En algunas realizaciones, los amplicones de ADN genómico se generan usando una estrategia de amplificación "similar a TSCA". En algunas realizaciones, los amplicones de ADN genómico se generan usando una estrategia de ADN-candado.

La figura 8 ilustra un diagrama de flujo de una realización de un método 800 de captura de amplicones de ADN sobre una matriz (por ejemplo, la matriz de captura 100 de la figura 1A), en el que los amplicones de ADN se generan mediante amplificación in situ del ácido nucleico diana. En esta realización, la reacción de amplificación es una amplificación similar a TSCA (“T ruSeq Custom Amplicon assembly”, ensamblaje de amplicones personalizado T ruSeq, Illumina). El método 800 comprende, pero no se limita a algunas o todas las etapas siguientes.

En una etapa 810, un par de oligonucleótidos de captura específicos de gen que flanquean una región de interés se hibridan in situ con ADN genómico. Por ejemplo, un primer oligonucleótido de captura que se hibrida 5' a una región de interés puede comprender una secuencia específica de gen y una secuencia de captura universal. Un segundo oligonucleótido de captura que se hibrida 3' a la región de interés puede comprender una segunda secuencia específica de gen y una secuencia de cebador de SBS (por ejemplo, SBS12).

En una etapa 815, se realiza una reacción de extensión/acoplamiento in situ entre los oligonucleótidos de captura flanqueantes a través de la región de interés.

En la etapa 820, el ADN flanqueado por oligonucleótidos de captura se amplifica mediante amplificación isotérmica in situ para generar múltiples copias de la región de interés, es decir, múltiples amplicones genómicos. La amplificación isotérmica se puede realizar, por ejemplo, usando secuencias de cebadores que son complementarias con la secuencia de captura universal y la secuencia del cebador de SBS.

En una etapa 825, los amplicones genómicos se transfieren a una matriz y se capturan mediante hibridación con regiones de captura universales en la matriz.

La figura 9 ilustra una realización de las etapas de un método 800 de la figura 8. Concretamente, una sección de tejido (no se muestra) comprende una molécula de ADN genómico diana 910. La molécula de ADN diana 910 puede incluir una mutación 915. En la etapa 810, un primer oligonucleótido de captura específico de gen 920 y un segundo oligonucleótido de captura específico de gen 925 que flanquean una región de interés se hibridan in situ con la molécula de ADN 910. El oligonucleótido de captura 920 comprende una región de gen específica 930 y una región de captura universal 935. El oligonucleótido de captura 920 puede también comprender una región UMI (no se muestra). El oligonucleótido 925 de captura comprende una segunda región específica de gen 940 y una región de cebador de SBS 945 (por ejemplo, SBS12). En la etapa 815, se realiza una reacción de extensión/acoplamiento in situ entre los oligonucleótidos de captura flanqueantes 920 y 925 a través de la región de interés. Una molécula de ADN 950 que se forma en la reacción de extensión/acoplamiento comprende la región de captura universal 935 y la región de cebador de SBS 945. En la etapa 820, la molécula de ADN 950 se amplifica mediante amplificación isotérmica in situ para generar múltiples copias (múltiples amplicones) de la región diana de interés. La amplificación isotérmica se puede realizar, por ejemplo, usando una región de cebador 935a que es complementaria con la región de captura universal 935 y una región de cebador 945a que es complementaria con la región de cebador de SBS 945. En la etapa 825, los amplicones genómicos 950 se capturan sobre el sitio de captura 105. Por ejemplo, la muestra de tejido que contiene los amplicones genómicos 950 o un sustrato que comprende amplicones genómicos 950 derivados de la muestra de tejido (no se muestra) se pone en contacto con el sitio de captura 105. En este ejemplo, la sonda de captura 115 sobre el sitio de captura 105 comprende una región de captura 960 que es complementaria con la región de captura universal 935; la región de cebador de SBS 130 es SBS3. Los amplicones de ADN 950 se capturan sobre el sitio de captura 105 por hibridación de la región de captura universal 935 con la región de captura 960.

En este ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con la sonda de captura 115 que se fija sobre la superficie del sitio de captura 105. El amplicón genómico 950 se captura sobre la matriz mediante la hibridación de la secuencia de captura universal 935 con la secuencia de captura 960. En otro ejemplo (no se muestra), la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz y las sondas de captura 115 se liberan desde el sitio de captura 105 hacia la muestra de tejido por escisión de la secuencia escindible opcional 120.

La figura 10 ilustra un diagrama de flujo de realizaciones de un método 1000 de captura de amplicones de ADN en una matriz (por ejemplo, matriz de captura 100 de la figura 1A), en el que los amplicones de ADN se generan mediante amplificación in situ de ácido nucleico diana. En alguna realización, la reacción de amplificación puede ser una amplificación de candado de ADN. El método 1000 puede comprender, pero no se limita a algunas o todas las siguientes etapas.

En una etapa 1010, una sonda de captura de candado se hibrida in situ con ADN genómico. Por ejemplo, la sonda de captura de candado puede comprender una primera secuencia específica de gen y una secuencia de cebador de SBS que están unidas mediante una secuencia de conector a una secuencia de captura universal y una segunda secuencia específica de gen. La primera secuencia específica de gen y la segunda secuencia específica de gen flanquean una región diana de interés en el ADN genómico.

En la etapa 1015, se realiza una reacción de extensión/acoplamiento in situ entre las secuencias específicas del gen flanqueantes en la sonda de captura de candado a través de la región diana para generar una molécula circular.

En una etapa 1020, el ADN flanqueado por la sonda de captura de candado se amplifica mediante amplificación in situ de círculo rodante para generar un concatámero de amplicones diana. La amplificación de círculo rodante se puede realizar, por ejemplo, usando una secuencia de cebador que es complementaria con la secuencia del cebador de SBS en la sonda de captura de candado.

En una etapa 1025, los concatámeros de amplicón diana se capturan sobre una matriz que comprende una secuencia de captura universal.

La figura 11 ilustra las etapas de un método 1000 de la figura 10. Concretamente, una sección de tejido (no se muestra) comprende una molécula de ADN genómico diana 1110. La molécula de ADN diana 1110 puede incluir una mutación 1115. En la etapa 1010, una sonda de captura de candado 1120 es hibridada in situ con la molécula de ADN 1110. La sonda de captura de candado 1120 puede comprender una primera región específica de gen 1125 y una región de cebador de SBS 1130 (por ejemplo, SBS12) que se pueden unir a través una región de conector 1135 con una región de captura universal 1140 y una segunda región específica de gen 1145. La sonda de captura de candado 1120 también puede incluir una región de identificador molecular exclusivo (UMI) (no se muestra), para facilitar la corrección de errores de secuenciación. La primera región específica de gen 1125 y la segunda región específica de gen 1145 flanquean una región diana de interés en la molécula de ADN 1110. En una etapa 1015, se realiza una reacción de extensión/acoplamiento in situ entre la primera región específica de gen flanqueante 1125 y la segunda región específica de gen 1145 a través de la región diana de interés para formar una molécula circular 1150. En algunas realizaciones, se puede usar CircLigase™ (Epicenter, Illumina) para acoplar la molécula circular 1150 antes de la amplificación. En la etapa 1020, la molécula circular 1150 se amplifica mediante amplificación in situ de círculo rodante para generar un concatámero 1155 que comprende múltiples copias de la molécula circular 1150. La amplificación de círculo rodante se realiza utilizando una secuencia de cebador (no se muestra) que es complementaria con la región cebador de SBS 1130 en la molécula circular 1150. En la etapa 1025, el concatámero 1155 se captura sobre el sitio de captura 105 que comprende la región escindible 120, la región de cebador de secuenciación SBS 125 (por ejemplo, SBS3), la región de dirección espacial 130 y la región de captura 135 (por ejemplo, una secuencia de captura universal). Por ejemplo, la muestra de tejido que contiene el concatámero 1155 o un sustrato que comprende concatámero 1155 derivado de la muestra de tejido (no se muestra) se pone en contacto con el sitio de captura 105. En algunas realizaciones, las sondas de captura 115 sobre el sitio de captura 105 comprenden una región de captura 1160 que es complementario con la región de captura universal 1140; la región de cebador de SBS comprende una secuencia SBS3. El concatámero 1155 se captura sobre el sitio de captura 105 mediante la hibridación de las regiones de captura universales 1140 para capturar las regiones 1160.

En este ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con la sonda de captura 115 que se fija sobre la superficie del sitio de captura 105. El concatámero 1155 se captura sobre la matriz mediante la hibridación de las secuencias de captura universales 1140 para capturar la secuencia 1160. En otro ejemplo (no se muestra), la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz y las sondas de captura 115 se liberan desde el sitio de captura 105 hacia la muestra de tejido mediante escisión de la secuencia escindible opcional 120.

(B) Captura del ácido nucleico basada en el acoplamiento

En algunas realizaciones, se usa una captura basada en el acoplamiento para capturar ácidos nucleicos diana sobre una muestra de tejido en sondas de captura en una matriz. La matriz puede ser, por ejemplo, una matriz de esferas o pocillos o poros o proyecciones, una superficie plana o una celda de flujo de secuenciación que incluye una pluralidad de sondas de captura. En un ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con sondas de captura que están fijadas sobre la superficie de la matriz. La muestra de tejido puede colocarse directamente sobre la superficie que comprende las sondas de captura o la muestra de tejido puede colocarse sobre una sustancia, tal como un filtro o un gel o una capa fina de tampón, que separa la muestra de tejido de las sondas de captura de modo que el ácido nucleico diana puede difundirse desde el tejido a través de la sustancia hasta las sondas de captura.

En otro ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz y las sondas de captura de la matriz se liberan hacia la muestra de tejido para la hibridación con los ácidos nucleicos en la muestra de tejido. La muestra de tejido puede colocarse directamente sobre la superficie que comprende las sondas de captura o la muestra de tejido puede colocarse sobre una sustancia como un filtro o un gel o una capa fina de tampón que separa la muestra de tejido de las sondas de captura de modo que las sondas de captura liberadas pueden difundirse desde la matriz a través de la sustancia hasta el ácido nucleico en la muestra de tejido. Las sondas de captura se pueden anclar sobre la matriz usando un grupo liberable o un conector o porción selectivamente escindible. Las sondas de captura se pueden liberar de la matriz usando, por ejemplo, escisión química, escisión enzimática o fotoescisión. En otro ejemplo, las sondas de captura pueden imprimirse sobre la superficie de la matriz y secarse. Las sondas de captura se pueden liberar de la matriz mediante rehidratación. En otro ejemplo más, las sondas de captura pueden imprimirse sobre la matriz usando una sustancia que se disuelve en presencia de un determinado tratamiento. A continuación, se aplica el tratamiento para liberar las sondas de captura antes de colocar la muestra de tejido sobre la matriz.

En un ejemplo, el ácido nucleico es ADNc sintetizado mediante transcripción inversa in situ de ARN en una muestra de tejido. En otro ejemplo, el ácido nucleico son amplicones de ADN generados por amplificación in situ de ADN genómico en una muestra de tejido.

La figura 12 ilustra un diagrama de flujo de una realización de un método 1200 de captura de ADNc sobre una matriz (por ejemplo, la matriz de captura 100 de la figura 1A) mediante acoplamiento monocatenario, en el que el ADNc se genera mediante transcripción inversa in situ de moléculas de ARN diana. El método 1200 comprende, pero no se limita a algunas o todas las etapas siguientes.

En la etapa 1210, el ADNc se sintetiza in situ usando cebadores específicos de genes. Por ejemplo, se puede utilizar un cebador de transcripción inversa (RT) específico de gen que comprende una primera región de cebador específica de gen y una región de identificador molecular exclusivo (UMI) para cebar la síntesis del ADNc de primera hebra. El ADNc se puede modificar en el extremo 5' o 3' para evitar el autoacoplamiento. En algunas realizaciones, se puede incorporar previamente una modificación para prevenir el autoacoplamiento del ADNc en la secuencia de UMI antes de la síntesis de ADNc in situ. En algunas realizaciones, se puede añadir una modificación, tal como la adición de una región de oligonucleótidos de "cola", después de la síntesis de ADNc para prevenir el autoacoplamiento del ADNc.

En la etapa 1215, el ADNc se transfiere a una matriz de esferas y se captura acoplando el ADNc a oligonucleótidos adaptadores universales sobre la matriz de esferas. Los oligonucleótidos adaptadores universales pueden incluir una región escindible, una secuencia de cebador de SBS (por ejemplo, SBS3) y una dirección espacial como se describe con referencia a la figura 1A y la Figura 1C.

En la etapa 1220, el ADNc se escinde de la matriz de esferas.

En la etapa 1225, se sintetiza el ADNc de segunda hebra usando cebadores específicos de genes. Los cebadores específicos de genes pueden incluir, por ejemplo, una secuencia específica de genes y una secuencia de cebador de secuenciación de SBS (por ejemplo, SBS12).

En una etapa 1230, el ADNc se amplifica usando un par de cebadores de SBS para generar una biblioteca de secuenciación. Por ejemplo, un primer cebador de SBS puede comprender secuencias complementarias de SBS12 y secuencias P7. Un segundo cebador de SBS puede comprender secuencias complementarias de SBS3 y secuencias P5. Los amplicones de la biblioteca resultantes pueden estar flanqueados en el extremo 5' por la secuencia P7 y las secuencias de cebador de SBS y por UMI, una dirección espacial, un cebador de secuenciación SBS y secuencias P5 en el extremo 3'. Las secuencias de P7 y P5 pueden usarse para unir amplicones de ADN a la superficie de una celda de flujo para la posterior amplificación y secuenciación de grupos.

En la etapa 1235, se secuencia la biblioteca.

Las figuras 13A y 13B ilustran las etapas de un método 1200 de la figura 12. En algunas realizaciones, el ADNc sintetizado in situ puede capturarse sobre una matriz de esferas que comprende la esfera de captura universal 150 de la figura 1C. Concretamente, una sección de tejido (no se muestra) puede comprender una molécula de ARN diana 1310. La molécula de ARN diana 1310 puede incluir una mutación 1315. En la etapa 1210, el ADNc se sintetiza in situ usando un cebador de RT específico de gen 1320. El cebador de RT 1320 puede comprender una región específica de gen 1325 y una región UMI 1330. Una molécula de ADNc 1335 sintetizada usando el cebador de RT 1320 comprende la región UMI 1330. En la etapa 1215, la molécula de ADNc 1335 se captura sobre la esfera de captura universal 150. Por ejemplo, la muestra de tejido que contiene la molécula de ADNc 1335 o un sustrato que comprende la molécula de ADNc 1335 derivada de la muestra de tejido (no se muestra) se pone en contacto con la esfera de captura universal 150. La molécula de ADNc 1335 se captura sobre la esfera de captura universal 150 mediante el acoplamiento de UMI 1330 a la región de dirección espacial 130 en el oligonucleótido adaptador universal 160. En la etapa 1220, el ADNc 1335 se escinde de la esfera de captura universal 150. La molécula de ADNc 1335 ahora comprende la región de cebador de SBS 125 (por ejemplo, SBS3) y la región de dirección espacial 130. En la etapa 1225, el ADNc de segunda hebra se sintetiza usando un cebador 1340 específico de gen. El cebador específico de gen 1340 comprende una región específica de gen 1345 y una región de cebador de SBS 1350 (por ejemplo, SBS12). Una molécula de ADNc de segunda hebra 1355 sintetizada usando el cebador específico de gen 1340 comprende la región del cebador de secuenciación de SBS 1350, la región UMI 1330, la región de dirección espacial 130 y la región del cebador de SBS 125. En la etapa 1230, la molécula de ADNc 1355 se amplifica usando un primer cebador de SBS 1360 y un segundo cebador de SBS 1365. El cebador de SBS 1360 comprende una región complementaria de SBS 1350a que es complementaria con el cebador de secuenciación de SBS 1350 y una región de cebador de P71370. El cebador de SBS 1365 comprende una región complementaria de SBS 125a que es complementaria con la región de cebador de SBS 125 y un región de cebador P5 1375. Un amplicón de la biblioteca 1380 sintetizado usando los cebadores de SBS 1360 y 1365 está flanqueado en el extremo 5' por la región de cebador P71370 y la región de cebador de SBS 1350 y en el extremo 3' por la región UMI 1330, la región de dirección espacial 130, la región de cebador de secuenciación de SBS 125 y la región de cebador P51375. En la etapa 1235 (no se muestra), se secuencia la biblioteca.

En este ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con el oligonucleótido adaptador universal 160 que se fija sobre la superficie de la esfera de captura universal 150. La molécula de ADNc 1335 se captura sobre la matriz mediante el acoplamiento de UMI 1330 a la dirección espacial 130 en el oligonucleótido adaptador universal 160. En molécula otro ejemplo (no se muestra), la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz y los oligonucleótidos adaptadores universales 160 se liberan de la matriz hacia la muestra de tejido mediante escisión de la secuencia escindible opcional 120.

En algunas realizaciones, se puede realizar opcionalmente una etapa de PCR de anclaje (no se muestra) para enriquecer las secuencias de ADNc diana antes de la etapa 1225. Por ejemplo, se puede realizar primero una amplificación de PCR de anclaje usando cebadores específicos de gen sin la secuencia del cebador de SBS 1350. En la etapa de amplificación por PCR de anclaje, se puede realizar una segunda amplificación usando el cebador específico de gen 1340 que comprende la región específica de gen 1345 y la región del cebador de secuenciación de SBS 1350.

La figura 14 ilustra un diagrama de flujo de realizaciones de un método 1400 de captura de amplicones de ADN sobre una matriz (por ejemplo, matriz de captura 100 de la figura 1A), en el que los amplicones de ADN se pueden generar mediante amplificación in situdel ácido nucleico diana. El método 1400 puede comprender, pero no se limita a algunas o todas las etapas siguientes.

En la etapa 1410, un par de sondas de captura específicas de genes que flanquean una región o regiones de interés se hibridan in situ con el ADN genómico. Por ejemplo, un primer oligonucleótido de captura que se hibrida 5' a una región de interés puede comprender una primera secuencia específica de gen y una secuencia universal. Un segundo oligonucleótido de captura que se hibrida 3' con una región de interés puede comprender una segunda secuencia específica de gen, una UMI y una secuencia de cebador de SBS (por ejemplo, SBS3).

En la etapa 1415, se realiza una reacción de extensión/acoplamiento in situ entre las sondas de captura flanqueantes a través de las regiones de interés.

En una etapa 1420, el ADN flanqueado por sondas de captura se amplifica mediante amplificación isotérmica in situ para generar múltiples copias de las regiones de interés, es decir, múltiples amplicones. La amplificación isotérmica se puede realizar, por ejemplo, usando secuencias de cebadores que son complementarias con la secuencia universal y la secuencia del cebador de SBS.

En la etapa 1425, se puede añadir un oligonucleótido de cola 3' a los amplicones de ADN para evitar el autoacoplamiento.

En la etapa 1430, los amplicones de ADN se transfieren a una matriz de esferas (por ejemplo, una matriz de esferas de captura universal 150 que se muestra en la Figura 1C) y se capturan mediante acoplamiento sobre oligonucleótidos de captura universal en la matriz de esferas. Por ejemplo, los amplicones de ADN pueden desnaturalizarse, transferirse a la matriz de esferas y acoplarse a oligonucleótidos de captura universal. Los oligonucleótidos de captura universal pueden incluir una secuencia escindible, una secuencia de cebador de SBS (por ejemplo, SBS12) y una secuencia de dirección espacial como se describe con referencia a la figura 1C. Ambas hebras (es decir, la hebra superior y la hebra inferior) de los amplicones desnaturalizados pueden acoplarse a los oligonucleótidos de captura sobre la matriz de esferas.

En la etapa 1435, los amplicones de ADN se escinden de la matriz de esferas.

En la etapa 1440, los amplicones de ADN se amplifican usando un par de cebadores de SBS para generar una biblioteca de secuenciación. Por ejemplo, un primer cebador de SBS puede comprender secuencias complementarias de SBS12 y secuencias P7. Un segundo cebador de SBS puede comprender secuencias complementarias de SBS3 y secuencias P5. En algunas realizaciones, solo se amplifican las secuencias dianas que están flanqueadas por secuencias SBS12 y SBS3 (es decir, la hebra superior del amplicón de ADN). Los amplicones de la biblioteca resultantes están flanqueados en el extremo 5' por las secuencias del cebador SBS12 y P7 y por UMI, la dirección espacial, el cebador de SBS3 y las secuencias P5 en el extremo 3'.

En la etapa 1445, se secuencia la biblioteca.

Las figuras 15A, 15B y 15C ilustran las etapas de un método 1400 de la figura 14. Concretamente, una sección de tejido (no se muestra) comprende una región de ADN diana 1510. La molécula de ADN diana 1510 puede incluir una mutación 1515. En la etapa 1410, una primera sonda de captura específica de gen 1520 y una segunda sonda de captura específica de gen 1525 que flanquean una región de interés se hibridan in situ con la molécula de ADN 1510. La sonda de captura específica de gen 1520 comprende una región específica de gen 1530 y una región universal 1535. La sonda de captura específica de gen 1525 puede comprender una segunda región específica de gen 1540, una región UMI 1545 y una región del cebador de SBS 1550 (por ejemplo, SBS3). En la etapa 1415, se realiza una reacción de extensión/acoplamiento in situ entre las sondas de captura específicas de gen 1520 y 1525 flanqueantes en la región de interés para generar una molécula de ADN 1555. La molécula de ADN 1555 comprende la región universal 1535, la región UMI 1545 y la región de cebador de SBS 1550. En la etapa 1420, el ADN 1555 se amplifica (por ejemplo, amplificación isotérmica in situ) para generar múltiples copias (es decir, múltiples amplicones) de la región diana de interés. La amplificación, por ejemplo, la amplificación isotérmica, se realiza usando una región de cebador 1535a que es complementaria con la región universal 1535 y una región de cebador 1550a que es complementaria con la región de cebador de SBS 1550. En la etapa 1425, se agrega un oligonucleótido de cola 3' 1560 a los amplicones de ADN para prevenir el autoacoplamiento. En la etapa 1430, la molécula de ADN 1555 se desnaturaliza y se transfiere a la esfera de captura universal 150. Por ejemplo, la muestra de tejido que contiene la molécula de ADN 1555 o un sustrato que comprende la molécula de ADN 1555 derivada de la muestra de tejido (no se muestra) se pone en contacto con la esfera de captura universal 150. Cada hebra (es decir, la hebra superior "A" y la hebra inferior "B") de la molécula de ADN 1555 se captura sobre la esfera de captura universal 150 mediante el acoplamiento del oligonucleótido de cola 3' 1560 a la región de dirección espacial 130 en el oligonucleótido adaptador universal 160. En la etapa 1435, las moléculas de ADN 1555 se escinden de la esfera de captura universal 150. Se forman dos configuraciones diferentes de la molécula de ADN 1555: A) una molécula de ADN 1565 que comprende (en la dirección 3' a 5') la región de cebador de SBS 125 (por ejemplo, SBS12), la región de dirección espacial 130, el oligonucleótido de cola 3' 1560, la región universal 1535, la molécula de ADN 1555, la región UMI 1545 y la región de cebador de SBS 1550 (por ejemplo, SBS3), y B) una molécula de ADN 1570 que comprende (en la dirección 3' a 5') la región de cebador de SBS 125 (por ejemplo, SBS12), la región de dirección espacial 130, el oligonucleótido de cola 3' 1560, la región de cebador de SBS 1550 (por ejemplo, SBS3), la región UMI 1545, la molécula de ADN 1555 y la región universal 1535. En la etapa 1440, las moléculas de ADN 1565 (A) y 1570 (B) se amplifican usando un primer cebador de SBS 1575 y un segundo cebador de SBS 1580. El primer cebador de SBS 1575 comprende una secuencia de cebador de SBS 125a que es complementaria con la secuencia del cebador de SBS 125 y una secuencia P71585. El segundo cebador de SBS 1580 comprende una secuencia de cebador de SBS 1550a que es complementaria con la secuencia del cebador de SBS 1550 y una secuencia de P5. Un amplicón de la biblioteca 1595 amplificado a partir de la molécula de ADN 1565 usando los cebadores de SBS 1575 y 1580 está flanqueado en el extremo 3' por la región P7 1585, la región de cebador de SBS 125 (por ejemplo, SBS12), la región de dirección espacial 130, el oligonucleótido de cola 3' 1560 y la región universal 1535, y en el extremo 5' por la región UMI 1545, la región de cebador de SBS 1550 (por ejemplo, SBS3) y la región de cebador P51590. Debido a la configuración de las secuencias de SBS en la molécula de ADN 1570, la molécula de ADN 1570 no se amplifica.

En este ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con el oligonucleótido adaptador universal 160 que se fija sobre la superficie de la esfera de captura universal 150. La molécula de ADN 1555 se captura sobre la esfera de captura universal 150 mediante el acoplamiento del oligonucleótido de cola 3' 1560 a la dirección espacial 130. En otro ejemplo (no se muestra), la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz y los oligonucleótidos adaptadores universales 160 se liberan de la matriz hacia la muestra de tejido mediante escisión de la secuencia escindible opcional 120.

4.3 Transferencia de ácidos nucleicos a matrices de captura

En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, las moléculas de ácido nucleico pueden transferirse desde una muestra, tal como una sección de tejido, a una matriz de captura mediante difusión pasiva.

En algunas realizaciones, la transferencia de moléculas de ácido nucleico desde una muestra a una matriz de captura se puede facilitar, por ejemplo, mediante electroforesis o centrifugación.

En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico se pueden transferir directamente desde una muestra, como una sección de tejido, a una matriz de captura. Por ejemplo, una sección de tejido se puede colocar directamente sobre una matriz de captura.

En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico pueden transferirse indirectamente desde una muestra, como una sección de tejido, a una matriz de captura. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de una sección de tejido se pueden transferir primero a uno o más sustratos intermedios, por ejemplo, cualquier sustrato que no sea una matriz de captura, de modo que la orientación espacial relativa de los ácidos nucleicos en el sustrato intermedio refleje la orientación espacial relativa en la sección de tejido. A continuación, los ácidos nucleicos pueden transferirse desde el sustrato intermedio a la matriz de captura, de modo que la orientación espacial relativa de los ácidos nucleicos en la matriz de captura refleje la orientación espacial relativa de los ácidos nucleicos en la sección de tejido. La transferencia indirecta puede ocurrir, por ejemplo, mediante difusión pasiva o mediante transferencia facilitada (por ejemplo, electroforesis o centrifugación). El sustrato intermedio puede ser, por ejemplo, una membrana, tal como una membrana de nailon, un gel o una placa de micropocillos. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos procedentes de una muestra de tejido se pueden transferir primero a un gel, luego a una o más membranas y luego a la matriz de captura. En algunas realizaciones, el sustrato intermedio se puede configurar de manera que estabilice la separación de los ácidos nucleicos en diferentes regiones espaciales de la sección de tejido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos en diferentes regiones espaciales en la sección de tejido se pueden separar permanentemente entre sí colocando diferentes fragmentos de la sección de tejido (o de un gel o membrana que comprende ácidos nucleicos de la sección de tejido) en diferentes pocillos de la placa de micropocillos. de modo que la orientación espacial relativa de los fragmentos de la sección de tejido en la placa de micropocillos se pueda correlacionar con la orientación espacial relativa de los fragmentos en la sección de tejido. Los ácidos nucleicos de los fragmentos de tejido en la placa de micropocillos se pueden transferir posteriormente desde la placa de micropocillos a la matriz de captura.

En algunas realizaciones, se pueden usar sustratos intermedios para producir dos o más copias de ácidos nucleicos cuya orientación espacial relativa puede correlacionarse con su orientación espacial relativa en una sección de tejido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden transferir desde una sección de tejido a varias membranas, por ejemplo, colocando la sección de tejido sobre una membrana que forma la primera capa de varias membranas en capas. La transferencia desde la sección de tejido a las dos o más membranas estratificadas puede producirse, por ejemplo, mediante difusión pasiva o puede facilitarse. La orientación espacial de los ácidos nucleicos en cada una de las dos o más membranas en capas corresponde a la orientación espacial relativa de los ácidos nucleicos en la sección de tejido. Los ácidos nucleicos de las dos o más membranas estratificadas se pueden transferir posteriormente a dos o más matrices de captura.

En algunas realizaciones, la transferencia de moléculas de ácido nucleico de una muestra a una matriz de captura se puede facilitar utilizando nanopartículas magnéticamente sensibles.

(a) Transferencia facilitada de ácidos nucleicos a matrices de captura

En algunas realizaciones, la transferencia del ácido nucleico facilitada puede resultar en mayores rendimientos de transferencia de ácido nucleico de la muestra a la matriz de captura, en comparación con la transferencia de ácido nucleico por difusión pasiva en condiciones experimentales comparables (por ejemplo, temperatura de transferencia, tampón de transferencia y similares). En algunas realizaciones, la transferencia de ácido nucleico facilitada puede resultar en al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces mayores rendimientos en comparación con la transferencia de ácidos nucleicos por difusión pasiva. Los métodos para analizar la eficacia de la transferencia de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando ácidos nucleicos marcados con radioisótopos o marcados con fluorescencia, o comparando rendimientos o eficiencias de reacciones de secuenciación de próxima generación.

En algunas realizaciones, la transferencia del ácido nucleico facilitada puede permitir una reducción de los tiempos de transferencia, en comparación con la transferencia del ácido nucleico por difusión pasiva en condiciones experimentales por lo demás comparables (por ejemplo, una reducción de los tiempos de transferencia de más de 12 h, más de 24 h, más de 36 h, o de más de 48 h a menos de 6 h, menos de 4 h, menos de 2 h, o menos de 1 h). En algunas realizaciones, la transferencia del ácido nucleico facilitada puede resultar en al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces de reducción de los tiempos de transferencia, en comparación con la transferencia del ácido nucleico por difusión pasiva. Los métodos para analizar o comparar los tiempos de transferencia son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el tiempo de transferencia puede representar el tiempo requerido para transferir una cierta cantidad de ácido nucleico de la muestra a la matriz de captura, según se determina, por ejemplo, mediante el uso de ácidos nucleicos marcados con radioisótopos o marcados con fluorescencia, o comparando rendimientos. o eficiencias de reacciones de secuenciación de próxima generación.

En algunas realizaciones, la transferencia de ácidos nucleicos facilitada puede permitir la transferencia de ácidos nucleicos de muestras más grandes, por ejemplo, cortes de tejido más gruesos, a una matriz de captura, en comparación con la transferencia de ácidos nucleicos por difusión pasiva en condiciones experimentales por lo demás comparables. En algunas realizaciones, la transferencia de ácidos nucleicos facilitada puede permitir la transferencia de ácidos nucleicos de cortes de tejido que tienen al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces , al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces mayor espesor, en comparación con el espesor de las muestras que se aplican típicamente cuando se transfieren ácidos nucleicos por difusión pasiva (por ejemplo, desde aproximadamente 10 gm hasta aproximadamente 100 gm de espesor). En algunas realizaciones, el grosor de un corte de tejido puede ser inferior a aproximadamente 5 gm.

En algunas realizaciones, la transferencia del ácido nucleico de una muestra de tejido puede facilitarse con respecto a ciertos sitios de captura en una matriz de captura, mientras que la transferencia del ácido nucleico desde una muestra de tejido puede realizarse a través de difusión pasiva con respecto a ciertos otros sitios de captura en la matriz de captura. En algunas realizaciones, la transferencia del ácido nucleico desde una muestra de tejido a una matriz de captura se puede facilitar con respecto a un subconjunto seleccionado de sitios de captura, por ejemplo, un subconjunto de al menos 1 %, al menos 3 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de los sitios de captura.

(B) Sistema electroforético para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido

En algunas realizaciones, se puede integrar una matriz de captura (es decir, una matriz de sitios de captura) con un sistema electroforético para forzar a las moléculas de ácido nucleico a moverse directamente desde una sección de tejido a las sondas de captura. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ARN. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ADN (por ejemplo, ADNc o amplicones de ADN).

La figura 16 ilustra una vista lateral de una parte de un ejemplo de sistema de transferencia electroforética 1600 que está configurado para la detección espacial y el análisis de ácido nucleico en una muestra de tejido. El sistema de transferencia electroforética 1600 comprende una matriz de captura 1610. La matriz de captura 1610 puede ser la matriz de captura 100 de la figura 1A. La matriz de captura 1610 comprende un soporte sólido 1615. En algunas realizaciones, el soporte sólido 1615 es un sustrato de vidrio plano. Se forma una disposición (por ejemplo, filas y columnas) de sitios de captura 1620 sobre un soporte sólido 1615. En algunas realizaciones, se muestra una fila de seis sitios de captura 1620 (es decir, sitios de captura 1620a a 1620f), pero puede usarse cualquier número y configuración de sitios captura 1620. Se inmovilizan una pluralidad de oligonucleótidos (no se muestra) en cada uno de los sitios de captura 1620. Asociado con cada sitio de captura 1620 hay un electrodo inferior 1625 (por ejemplo, seis electrodos inferiores 1625a a 1625f). En este ejemplo, se muestra un electrodo inferior 1625 para cada sitio de captura 1620, pero se puede usar cualquier número de electrodos inferiores 1625 por sitio de captura 1620. Por ejemplo, la matriz de captura 1610 puede incluir 2 electrodos inferiores 1625 por sitio de captura 1620, o 10 electrodos inferiores 1625 por sitio de captura 1620, o 100 electrodos inferiores 1625 por sitio de captura 1620, o cualquier número de electrodos inferiores 1625 por sitio de captura 1620. Se coloca un sustrato de muestra 1630 encima de la matriz de captura 1610. En un ejemplo, el sustrato de muestra 1630 es un sustrato de vidrio plano. El sustrato de muestra 1630 incluye una disposición de electrodos superiores 1635. En este ejemplo, la disposición de los electrodos superiores 1635 corresponde a la disposición de los electrodos inferiores 1625 en la matriz de captura 1610, es decir, un electrodo superior 1635 (por ejemplo, electrodos superiores 1635a a 1635f) por electrodo inferior 1625 (por ejemplo, electrodos inferiores 1625a a 1625f). En otro ejemplo (no se muestra), el sustrato de muestra 1630 incluye un único electrodo superior 1635. Se monta una muestra de tejido 1640 sobre la superficie del sustrato de muestra 1630 que está frente a los sitios de captura 1620 de la matriz de captura 1610.

Los sitios de captura 1620, los electrodos inferiores 1625 y los electrodos superiores 1635 están configurados para la transferencia electroforética y la captura de ácidos nucleicos procedentes de una muestra de tejido de modo que se mantenga la orientación espacial y se produzca la difusión de ácidos nucleicos desde la muestra de tejido y se elimina, o se reduce sustancialmente, la pérdida de ácidos nucleicos entre los sitios de captura 1620. Cada uno de los sitios de captura 1620 puede dirigirse (cargarse) individualmente o todos los grupos o grupos seleccionados de los sitios de captura 1620 pueden dirigirse en común como una sola unidad. Una fuente de voltaje 1645 está conectada a través de los electrodos inferiores 1625 y los electrodos superiores 1635. En presencia de un campo eléctrico suministrado por la fuente de voltaje 1645, se transfieren una pluralidad de ácidos nucleicos 1650 desde la muestra de tejido 1640 a los sitios de captura 1620. Se capturan los ácidos nucleicos 1650 en los sitios de captura 1620 mediante hibridación para capturar sondas (no se muestra) que están inmovilizadas a los sitios de captura 1620.

4.4 Detección espacial y análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido utilizando conjuntos de sondas de captura

De acuerdo con los métodos descritos en este documento, la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido se pueden realizar utilizando conjuntos de dos o más sondas de captura (por ejemplo, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, o 10 o más sondas de captura). Normalmente, al menos una primera sonda de captura en un conjunto de sondas de captura se inmoviliza sobre una matriz de captura. En algunas realizaciones, se puede inmovilizar una segunda sonda de captura sobre la misma matriz de captura que la primera sonda de captura, por ejemplo, en las proximidades de la primera sonda de captura, por ejemplo, en el mismo sitio de captura. En algunas realizaciones, se puede inmovilizar una segunda sonda de captura sobre una partícula, tal como una partícula magnética o una nanopartícula magnética. Véase, por ejemplo, la sección 5.6. En algunas realizaciones, una segunda sonda de captura puede estar en disolución, por ejemplo, para usarse para realizar reacciones in situ con un ácido nucleico en una muestra de tejido.

Las sondas de captura en los conjuntos de sondas de captura individual e independientemente pueden tener una variedad de regiones diferentes, por ejemplo, una región de captura (por ejemplo, una región de captura universal o específica de gen), una región de unión al cebador (por ejemplo, una región de cebador de SBS, tal como una región SBS3 o SBS12, u otra región universal, tal como una región P5 o P7), una región de dirección espacial (por ejemplo, una región de dirección espacial parcial o combinatoria) o una región escindible.

En algunas realizaciones, solo una sonda de captura en un conjunto de sondas de captura comprende una región de captura. En algunas realizaciones, dos o más sondas de captura en un conjunto de sondas de captura comprenden una región de captura.

En algunas realizaciones, solo una sonda en un conjunto de sondas de captura comprende una región de dirección espacial, por ejemplo, tal como una región de dirección espacial completa que describe la posición de un sitio de captura en una matriz de captura. En algunas realizaciones, dos o más sondas en un conjunto de sondas de captura pueden comprender una región de dirección espacial, por ejemplo, dos o más sondas pueden comprender cada una una región de dirección espacial parcial (es decir, región de dirección combinatoria), en las que cada región de dirección parcial describe la posición de un sitio de captura en una matriz de captura, por ejemplo, a lo largo del eje x o el eje y.

En algunas realizaciones, un conjunto de sondas de captura puede comprender al menos una sonda de captura que comprende una región de captura y una región de dirección espacial (por ejemplo, una región de dirección espacial completa o parcial). En algunas realizaciones, ninguna sonda de captura en un conjunto de sondas de captura comprende tanto una región de captura como una región de dirección espacial.

En otro aspecto, en la presente se proporciona una matriz de captura para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende un sitio de captura que comprende un conjunto de sondas de captura. En algunas realizaciones, el conjunto de sondas de captura comprende al menos dos sondas de captura (es decir, al menos un par de sondas de captura). En algunas realizaciones, el conjunto de sondas de captura comprende tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, o diez o más sondas de captura. En algunas realizaciones, la matriz de captura se puede integrar en un sistema de transferencia electroforética descrito en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 5.3.

La figura 17 ilustra una vista lateral de un sitio de captura 1700 sobre una matriz de captura (por ejemplo, la matriz de captura 100 de la figura 1A), en la que el único sitio de captura 1700 comprende dos conjuntos distintos de sondas de captura inmovilizadas. En algunas realizaciones, un conjunto de sondas de captura inmovilizadas comprende dos sondas de captura (es decir, un par de sondas de captura). En algunas realizaciones, un conjunto de sondas de captura inmovilizadas comprende tres o más sondas de captura. A modo de ejemplo, la figura 17 muestra el sitio de captura 1700a de una matriz de captura. Un primer conjunto de sondas de captura 1710 comprende una región de cebador de SBS 1715 (por ejemplo, SBS3) y una región de dirección espacial 1720. Cada sonda de captura 1710 inmovilizada al sitio de captura 1700a comprende la misma región de dirección espacial exclusiva 1720. Las sondas de captura 1710 inmovilizadas a otros sitios de captura 1700 (no se muestra), por ejemplo, sitios de captura 1700b a 1700f, incluyen cada una su propia región de dirección espacial exclusiva 1720 (por ejemplo, región de dirección espacial 1720b a 1720f), es decir, cada sitio de captura 1700 tiene una región de dirección espacial exclusiva. Un segundo conjunto de sondas de captura 1725 comprende una segunda región de cebador de SBS 1730 (por ejemplo, SBS12) y una región de captura específica de gen 1735, por ejemplo, región de captura específica de gen 1735a y región de captura específica de gen 1735b. En algunas realizaciones, el segundo conjunto de sondas de captura no comprende una secuencia de dirección espacial. En este ejemplo, se muestran dos sondas de captura con direcciones espaciales 1710 y sondas de captura 1725, pero puede inmovilizarse cualquier número de sondas de captura con direcciones espaciales 1710 y sondas de captura 1725 en el sitio de captura 1700a. En algunas realizaciones, la matriz de captura ilustrada en la figura 17 se puede integrar en un sistema de transferencia electroforética 1600 de la figura 16.

Debido a que se utilizan al menos dos conjuntos diferentes de sondas de captura, por ejemplo, en la realización ilustrada en la figura 17, el número de oligonucleótidos necesarios para lograr la captura específica de gen se reduce sustancialmente. Por ejemplo, en una estrategia convencional, para el ARN de 100 genes diferentes en 20.000 sitios de captura, se necesitarían 2 millones de oligonucleótidos de captura con direcciones espaciales diferentes. Sin embargo, de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, para capturar ARN de 100 genes diferentes en 20.000 sitios de captura, solo se requieren 20.000 oligonucleótidos con direcciones espaciales y 100 oligonucleótidos de captura.

En algunas realizaciones, una matriz de captura comprende un sitio de captura (por ejemplo, 1700a) que comprende un par de sondas de captura inmovilizadas sobre una superficie (por ejemplo, 1710 y 1725a), en la que una primera sonda de captura (por ejemplo, 1710) del par de sondas de captura comprende una primera región de unión al cebador (por ejemplo, la región de unión al cebador de SBS 1715; por ejemplo, SBS3) y una región de dirección espacial (por ejemplo, la región de dirección espacial 1720), y en la que una segunda sonda de captura (por ejemplo, 1725a) del par de sondas de captura comprende una segunda región de unión al cebador (por ejemplo, la región de unión al cebador de SBS 1730; por ejemplo, SBS12) y una región de captura (por ejemplo, 1735a).

En algunas realizaciones, la primera sonda de captura no comprende una región específica de gen.

En algunas realizaciones, la segunda sonda de captura no comprende una región de dirección espacial.

En algunas realizaciones, el sitio de captura es una pluralidad de sitios de captura. En algunas realizaciones, la pluralidad de sitios de captura es 2 o más, 10 o más, 30 o más, 100 o más, 300 o más, 1.000 o más, 3.000 o más, 10.000 o más, 30.000 o más, 100.000 o más, 300.000 o más, 1.000.000 o más 3.000.000 o más, o 10.000.000 o 1.000. 000.000 o más sitios de captura.

En algunas realizaciones, la matriz de captura comprende una densidad de sitios de captura de 1 o más, 2 o más, 10 o más, 30 o más, 100 o más, 300 o más, 1.000 o más, 3.000 o más, 10.000 o más, 100.000 o más, 1.000.000 o más, sitios de captura por centímetro cuadrado (cm2).

En algunas realizaciones, el par de sondas de captura en un sitio de captura es una pluralidad de pares de sondas de captura. En algunas realizaciones, la pluralidad de sondas de captura es 2 o más, 10 o más, 30 o más, 100 o más, 300 o más, 1.000 o más, 3.000 o más, 10.000 o más, 30.000 o más, 100.000 o más, 300.000 o más, 1.000.000 o más 3.000. 000 o más, o 10.000.000 o más, 100.000.000 o más, o 1.000.000.000 o más sondas de captura.

En algunas realizaciones, el par de sondas de captura en un sitio de captura de una matriz de captura es una pluralidad de pares de sondas de captura. En algunas realizaciones, cada primera sonda de captura en la pluralidad de pares de sondas de captura dentro del mismo sitio de captura comprende la misma secuencia de dirección espacial. En algunas realizaciones, cada primera sonda de captura en la pluralidad de pares de sondas de captura en diferentes sitios de captura comprende una secuencia de dirección espacial diferente.

En algunas realizaciones, uno o más sitios de captura de la matriz de captura tienen el mismo número de primeras sondas de captura y de segundas sondas de captura. En algunas realizaciones, uno o más sitios de captura tienen más primeras sondas de captura que segundas sondas de captura. Por ejemplo, en algunas realizaciones, uno o más sitios de captura tienen al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 10 veces, al menos 30 veces, al menos 100 veces, al menos 300 veces, en al menos 1.000 veces, al menos 3.000 veces o al menos 10.000 veces más primeras sondas de captura que segundas sondas de captura. En algunas realizaciones, uno o más sitios de captura tienen más segundas sondas de captura que primeras sondas de captura. Por ejemplo, en algunas realizaciones, uno o más sitios de captura tienen al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 10 veces, al menos 30 veces, al menos 100 veces, al menos 300 veces, en al menos 1000 veces, al menos 3000 veces o al menos 10.000 veces más segundas sondas de captura que primeras sondas de captura.

En algunas realizaciones, la matriz de captura está integrada en un sistema de electroforesis. En algunas realizaciones, el sistema de electroforesis es un sistema de electroforesis como se describe en la sección 5.3 (ver, por ejemplo, la figura 16). En algunas realizaciones, cada sitio de captura puede dirigirse eléctricamente de forma independiente en el sistema de electroforesis. En algunas realizaciones, un sitio de captura en el sistema de electroforesis está configurado para la transferencia y captura de ácidos nucleicos procedentes de una muestra de tejido de modo que la difusión de ácidos nucleicos desde la muestra de tejido y la pérdida de ácidos nucleicos entre los sitios de captura se reducen sustancialmente en relación con una transferencia pasiva de ácidos nucleicos que se produce en condiciones por lo demás idénticas en ausencia del sistema de electroforesis, por ejemplo, por difusión.

En algunas realizaciones, la superficie de la matriz de captura es una superficie plana, por ejemplo, una superficie de vidrio. Ver, por ejemplo, la figura 1B. En algunas realizaciones, la superficie de la matriz de captura comprende uno o más pocillos. En algunas realizaciones, dichos uno o más pocillos corresponden a uno o más sitios de captura. En algunas realizaciones, la superficie de la matriz de captura es una superficie de esferas, por ejemplo, como se ilustra en la figura 1C.

En algunas realizaciones, la región de captura en la segunda sonda de captura es una región de captura específica de gen. En algunas realizaciones, la región de captura específica de gen en la segunda sonda de captura comprende la secuencia de una sonda oligonucleotídica de TruSeq™ Custom Amplicon (TSCA) (Illumina, Inc.). Por ejemplo, las regiones de captura específicas de gen en una pluralidad de segundas sondas de captura en un sitio de captura pueden comprender una pluralidad de secuencias de sondas de oligonucleótidos de TSCA.

En algunas realizaciones, la región de captura en la segunda sonda de captura es una región de captura universal. En algunas realizaciones, la región de captura universal en la segunda sonda de captura comprende una secuencia de cebador aleatorio. Por ejemplo, las regiones de captura en una pluralidad de segundas sondas de captura en un sitio de captura pueden comprender secuencias aleatorias. En algunas realizaciones, la región de captura universal en una segunda sonda de captura comprende una secuencia de captura de poli-T. Por ejemplo, algunas o todas las secuencias de captura universal en una pluralidad de segundas sondas de captura en un sitio de captura pueden comprender una secuencia de captura de poli-T.

En algunas realizaciones, las regiones de captura en una o más segundas sondas de captura de un sitio de captura pueden ser esencialmente las mismas regiones de captura en dos o más sitios de captura de la matriz de captura. En algunas realizaciones, al menos el 1 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de las segundas sondas de captura tienen las mismas regiones de captura en dos o más sitios de captura de la matriz de captura (por ejemplo , en al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de los sitios de captura en una matriz de captura).

En algunas realizaciones, las regiones de captura en una o más segundas sondas de captura de una matriz de captura pueden ser esencialmente las mismas secuencias de captura en al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o al menos 99 % de los sitios de captura en una matriz de captura. En algunas realizaciones, las regiones de captura en una o más segundas sondas de captura de una matriz de captura pueden ser esencialmente las mismas secuencias de captura en esencialmente todos los sitios de captura en una matriz de captura.

En algunas realizaciones, la región de dirección espacial comprende dos o más regiones de direcciones espaciales parciales (por ejemplo, una primera, una segunda y, opcionalmente, una tercera región de dirección parcial) que se pueden combinar de manera combinatoria (por ejemplo, X * Y * Z). En algunas realizaciones, la región de dirección espacial comprende una primera y una segunda región de dirección parcial para identificar la posición de un sitio de captura sobre la matriz de captura en la primera (X) y la segunda (Y) dimensión. En algunas realizaciones, la región de dirección espacial comprende además una tercera región de dirección parcial para identificar la ubicación de un corte de tejido (y de un ácido nucleico transferido desde el corte de tejido) en la muestra de tejido en la tercera dimensión (Z).

En algunas realizaciones, la primera o segunda sonda de captura en la matriz de captura comprende además una región de dirección temporal (T) para identificar la secuencia relativa de los momentos en los que se obtuvo una muestra en el curso de un experimento de desarrollo en el tiempo (por ejemplo, un experimento de desarrollo en el tiempo para determinar cambios en las expresiones de genes en un tejido a lo largo del tiempo en respuesta a un estímulo químico, biológico o físico).

En algunas realizaciones, dos o más regiones de direcciones (por ejemplo, regiones de direcciones espaciales o temporales) en una sonda de captura son consecutivas. En algunas realizaciones, dos o más regiones de dirección están separadas por uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, por 2 o más, 3 o más, 10 o más, 30 o más, 100 o más, 300 o más, o 1.000 o más nucleicos ácidos).

La figura 18 ilustra un diagrama de flujo de una realización de un método 1800 para transferir ácidos nucleicos desde una muestra de tejido a una matriz de captura para la generación de una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales, en el que la matriz de captura comprende sitios de captura que incluyen pares separados de sondas de captura inmovilizadas, por ejemplo, como se muestra en la figura 17. En esta realización, el ácido nucleico es ARN. En algunas realizaciones del método ilustrado en la figura 18, la matriz de captura se integra en un sistema de transferencia electroforética, como el sistema de transferencia electroforética 1600 de la figura 16. El método 1800 comprende, pero no se limita a algunas o todas las siguientes etapas .

Opcionalmente, en una etapa 1810, un ácido nucleico de una muestra de tejido puede transferirse electroforéticamente a una matriz de captura. Por ejemplo y ahora con referencia a la figura 16 y la figura 17, el sustrato de muestra 1630 con la muestra de tejido 1640 sobre el mismo se puede colocar encima de la matriz de captura 1610. En este ejemplo, los sitios de captura 1620 de la matriz de captura 1610 incluyen pares distintos de sondas de captura inmovilizadas, por ejemplo, como se muestra en la figura 17. Se aplica un campo eléctrico a los sitios de captura 1620. A medida que se activan los sitios de captura 1620, los ácidos nucleicos 1650 de la muestra de tejido 1640 se transfieren a la matriz de captura 1610 y se hibridan para capturar las sondas 1725 que están inmovilizadas a los sitios de captura 1620. En esta realización, las sondas de captura 1725 son sondas de captura específicas de genes diseñadas para capturar ARNm específicos.

En algunas realizaciones, en la etapa 1810, la transferencia de un ácido nucleico de una muestra, tal como la muestra de tejido 1640, puede producirse por difusión pasiva. En algunas realizaciones, en la etapa 1810, la transferencia de un ácido nucleico de una muestra, tal como la muestra de tejido 1640, se facilita mediante un método distinto de la electroforesis.

En la etapa 1815, se sintetiza el ADNc de primera hebra. Por ejemplo, las regiones de captura específicas de genes 1735 pueden actuar como cebadores de transcriptasa inversa para la síntesis de ADNc de primera hebra a partir de moléculas de ARNm capturadas.

En la etapa 1820, el ADNc de primera hebra se une covalentemente a la segunda sonda de captura 1710 mediante acoplamiento monocatenario del ADNc a la región de dirección espacial 1720.

En la etapa 1825, se sintetiza el ADNc de segunda hebra usando un cebador que es complementario con la región de cebador de SBS 1715.

En la etapa 1830, se liberan moléculas de ADNc de segunda hebra desde el sitio de captura 1700 mediante desnaturalización.

En la etapa 1835, el ADNc se amplifica para generar una biblioteca de secuenciación.

Las figuras 19A, 19B, 19C y 19D muestran gráficamente las etapas del método 1800 de la figura 18. Concretamente, en la etapa 1810, una pluralidad de moléculas de ARNm 1910 se transfieren (por ejemplo, electroforéticamente) desde una sección de tejido (no se muestra) al sitio de captura. 1700 y se hibridan con las sondas de captura 1725. En algunas realizaciones, una primera molécula de ARNm 1910a es un transcrito de un primer gen y una segunda molécula de ARNm 1910b es un transcripto de un segundo gen. La molécula de ARNm 1910a puede incluir una mutación 1915a. La molécula de ARNm 1910b puede incluir una mutación 1915b. La molécula de ARNm 1910a se captura sobre la sonda de captura 1725a mediante hibridación de secuencias de ARNm complementarias con la región de captura específica de gen 1735a. De manera similar, la molécula de ARNm 1910b se captura sobre la sonda de captura 1725b por hibridación de secuencias de ARNm complementarias con la región de captura específica de gen 1735b.

En la etapa 1815, se sintetiza el ADNc de primera hebra usando la región de captura específica de gen 1735 como cebador. Una molécula de ADNc 1920 (es decir, moléculas de ADNc 1920a y 1920b) incluye la región de cebador de SBS 1730.

En la etapa 1820, la molécula de ADNc 1920 se une covalentemente a los oligonucleótidos con direcciones espaciales 1710 mediante acoplamiento monocatenario de la molécula de ADNc 1920 a la región de dirección espacial 1720.

En la etapa 1825, el ADNc de segunda hebra se sintetiza usando una región de cebador 1715a que es complementaria con la región de cebador de SBS 1715.

En la etapa 1830, las moléculas de ADNc de segunda hebra 1920 se liberan del sitio de captura 1700 mediante desnaturalización. Las moléculas de ADNc 1920 ahora incluyen la región del cebador de SBS 1715, la región de dirección espacial 1720 y la región del cebador de SBS 1730.

En la etapa 1835, las moléculas de ADNc 1920 se amplifican para generar una biblioteca de secuenciación. En una primera reacción de amplificación, las moléculas de ADNc se amplifican usando un primer cebador de SBS 1925. El cebador de SBS 1925 comprende una región complementaria de SBS 1730a que es complementaria con la región de cebador de SBS 1730a y una región P7 1930. Los amplicones 1935 (es decir, amplicones 1935a y 1935b) están flanqueados en el extremo 5 ' por la región P7 1930 y la región de cebador de SBS 1730, y en el extremo 3' por la región de dirección espacial 1720 y la región de cebador de SBS 1715. Los amplicones 1935 se amplifican usando un segundo cebador de SBS 1940. El cebador de SBS 1940 comprende un SBS región complementaria 1715a que es complementaria con la región de cebador de SBS 1715 y una región P5 1945. Los amplicones 1935 (es decir, los amplicones 1935a y 1935b) ahora están flanqueados por la región P71930 y la región de cebador de SBS 1730 y por la región de dirección espacial 1720, la región de cebador de SBS 1715 y la región P5 1945.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende proporcionar una matriz de captura descrita en este documento. En algunas realizaciones, la matriz de captura comprende un sitio de captura que comprende un conjunto de sondas de captura. En algunas realizaciones, el conjunto de sondas de captura comprende dos sondas de captura (es decir, un par de sondas de captura). En algunas realizaciones, el conjunto de sondas de captura comprende tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, o diez o más sondas de captura. En algunas realizaciones, la matriz de captura se puede integrar en un sistema de transferencia electroforética descrito en el presente documento. Véase, por ejemplo, la sección 5.3.

En algunas realizaciones, el método comprende (a) proporcionar una matriz de captura, que comprende un sitio de captura que comprende un par de sondas de captura (por ejemplo, 1710 y 1725a) inmovilizadas sobre una superficie, en el que una primera sonda de captura del par de sondas de captura comprende una primera región de unión al cebador (por ejemplo, 1715) y una región de dirección espacial (por ejemplo, 1720), y en el que una segunda sonda de captura del par de sondas de captura comprende una segunda región de unión al cebador (por ejemplo, 1730) y una región de captura (por ejemplo, 1735a).

En algunas realizaciones, la primera sonda de captura no comprende una región de captura.

En algunas realizaciones, el método comprende además una o más de las siguientes etapas: (b) poner en contacto la matriz de captura con una muestra de tejido de modo que la posición de un sitio de captura en la matriz pueda correlacionarse con una posición en la muestra de tejido; (c) permitir que los ácidos nucleicos de la muestra de tejido se hibriden con la región de captura de la segunda sonda de captura; (d) extender la región de captura de la segunda sonda de captura para formar una primera hebra complementaria inmovilizada del ácido nucleico hibridado con la secuencia específica de gen; (e) acoplar la primera hebra complementaria inmovilizada a la secuencia de dirección espacial de una primera sonda de captura para inmovilizar la primera hebra complementaria en ambos extremos; (f) sintetizar una segunda hebra complementaria usando un cebador complementario con la primera secuencia de unión al cebador de la primera sonda de captura; (f) liberar la segunda hebra complementaria de la superficie de la matriz de captura; (g) analizar la secuencia de la segunda hebra complementaria liberada, y (h) correlacionar la secuencia de la segunda hebra complementaria liberada con la posición del ácido nucleico en la muestra de tejido.

En algunas realizaciones, permitir que los ácidos nucleicos de la muestra de tejido se hibriden con la región de captura de la segunda sonda de captura comprende una transferencia electroforética de los ácidos nucleicos de la muestra de tejido a la matriz de captura.

En algunas realizaciones, permitir que los ácidos nucleicos de la muestra de tejido se hibriden con la región de captura de la segunda sonda de captura comprende la difusión pasiva de los ácidos nucleicos desde la muestra de tejido a la matriz de captura.

En algunas realizaciones, analizar la secuencia de la hebra complementaria liberada comprende una secuenciación de próxima generación, por ejemplo, secuenciación por síntesis.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la muestra de tejido comprenden un ácido ribonucleico mensajero (ARNm).

En algunas realizaciones, la primera o la segunda región de unión al cebador comprende una secuencia de cebador de SBS. En algunas realizaciones, la secuencia del cebador de SBS es una secuencia SBS3 o SBS12.

En algunas realizaciones, la región de captura de la segunda sonda de captura comprende una variación de un solo nucleótido (SNV). En algunas realizaciones, el método tiene una sensibilidad de detección de SNV de al menos 0,00025 % de SNV (1/400.000 células). La sensibilidad de la NGS espacial para la detección de variaciones de un solo nucleótido se describe con más detalle con referencia a la tabla 3 a continuación.

En algunas realizaciones, la región de captura en la segunda sonda de captura es una región de captura universal. En algunas realizaciones, la región de captura universal en la segunda sonda de captura comprende una secuencia de cebador aleatorio. En algunas realizaciones, las regiones de captura en la pluralidad de segundas sondas de captura en un sitio de captura comprenden 10 o más, 100 o más, 1.000 o más, 10.000 o más, 100.000 o más, o 1.000.000 o más secuencias de captura aleatorias. En algunas realizaciones, la región de captura universal en la segunda sonda de captura comprende una secuencia de captura de poli-T.

En algunas realizaciones, la región de captura en la segunda sonda de captura es una región de captura específica de gen. En algunas realizaciones, la región de captura específica de gen en la segunda sonda de captura comprende la secuencia de una sonda oligonucleotídica de TSCA. En algunas realizaciones, las regiones de captura en la pluralidad de segundas sondas de captura en un sitio de captura comprenden 10 o más, 100 o más, 1.000 o más, 10.000 o más, 100.000 o más, o 1.000.000 o más secuencias de captura de TSCA.

En algunas realizaciones, al menos una sonda de captura en un conjunto de sondas de captura está en disolución, por ejemplo, para hibridarse con un ácido nucleico en la muestra de tejido. La figura 20 muestra un ejemplo de realización de un proceso 2000 de captura de un ácido nucleico en una muestra de tejido para su posterior anclaje sobre una matriz. En esta realización, una sonda de captura 2010 comprende una región de captura de ácido nucleico 2015 y una región de captura de matriz universal 2020. En un ejemplo, la región de captura de ácido nucleico 2015 es una secuencia de cebador aleatorio. En otro ejemplo, la región de captura de ácido nucleico 2015 es una secuencia de cebador específica de gen. La región de captura de matriz universal 2020 es una secuencia universal que se utiliza para anclar una molécula de ácido nucleico sobre una matriz de captura. La sonda de captura 2010 se puede utilizar en una reacción de hibridación basada en disolución para capturar una molécula de ácido nucleico 2025 en una sección de tejido. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico 2025 es una molécula de ADN genómico. La sonda de captura 2010 se hibrida con la molécula de ácido nucleico 2025 procedente de una muestra de tejido y se extiende para formar un ácido nucleico complementario con la molécula de ácido nucleico 2025 (indicado por la flecha) e incorporar la región de captura de matriz universal 2020 en la hebra complementaria. La región de captura de matriz universal 2020 se usa luego para anclar la molécula de ácido nucleico copiada sobre una matriz de captura (no se muestra). En otro ejemplo, la molécula de ácido nucleico 2025 es una molécula de ARN. La sonda de captura 2010 se hibrida con la molécula de ácido nucleico 2025 y se usa como cebador en una reacción de transcripción inversa para sintetizar ADNc de primera hebra (indicado por la flecha) e incorporar la región de captura de matriz universal 2020 en la molécula de ADNc. La región de captura de matriz universal 2020 se usa luego para anclar la molécula de ADNc sobre una matriz de captura (no se muestra).

En algunas realizaciones, el método comprende (a) proporcionar una matriz de captura, que comprende un sitio de captura que comprende una primera sonda de captura inmovilizada sobre una superficie, en el que la sonda de captura comprende una región escindible, una primera región de unión al cebador y una región de dirección espacial.

En algunas realizaciones, el método comprende además una o más de las siguientes etapas: (b) poner en contacto una muestra de tejido con una segunda sonda de captura, en el que la segunda sonda de captura comprende una segunda región de unión al cebador y una región de captura (por ejemplo, un gen específico o una región de captura universal); (c) permitir que los ácidos nucleicos de la muestra de tejido se hibriden con la región de captura de la segunda sonda de captura; (d) extender la región de captura de la segunda sonda de captura para formar una primera hebra complementaria del ácido nucleico hibridada con el ácido nucleico.

En algunas realizaciones, el método comprende además una o más de las siguientes etapas: (e) opcionalmente, hibridar un oligonucleótido complementario con la región de dirección espacial de la sonda de captura para formar una región de dirección espacial bicatenaria; (f) poner en contacto la matriz de captura con la muestra de tejido que comprende la primera hebra complementaria del ácido nucleico de manera que la posición de un sitio de captura en la matriz pueda correlacionarse con una posición en la muestra de tejido; (g) permitir que la primera hebra complementaria del ácido nucleico se transfiera desde la muestra de tejido a la matriz de captura; (h) acoplar la primera hebra complementaria del ácido nucleico (que opcionalmente se hibrida con el ácido nucleico) a la primera sonda de captura (por ejemplo, mediante acoplamiento de extremos romos, tal como acoplamiento de extremos romos bicatenario) para formar un ácido nucleico bicatenario marcado espacialmente ácido nucleico que comprende un primer y un segundo sitio de unión al cebador y un dominio escindible; (g) liberar el ácido nucleico bicatenario de la superficie de la matriz de captura; (h) analizar la secuencia del ácido nucleico bicatenario liberado, y (i) correlacionar la secuencia del ácido nucleico liberado con la posición del ácido nucleico en la muestra de tejido.

En algunas realizaciones, permitir que la primera hebra complementaria del ácido nucleico se transfiera desde la muestra de tejido a la matriz de captura comprende una transferencia electroforética de los ácidos nucleicos desde la muestra de tejido a la matriz de captura.

En algunas realizaciones, permitir que la primera hebra complementaria del ácido nucleico se transfiera desde la muestra de tejido a la matriz de captura comprende la difusión pasiva de los ácidos nucleicos desde la muestra de tejido a la matriz de captura.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico bicatenario liberado comprende una secuenciación de próxima generación, por ejemplo, secuenciación por síntesis.

4.5 Sistema de indexación combinatorio

En otra realización, se usa un sistema de indexación (direccionamiento) combinatorio para proporcionar información espacial para el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido. En esta estrategia, se incorporan dos o más secuencias de dirección espacial a un ácido nucleico durante la preparación de una biblioteca de secuenciación. Se usa una primera dirección espacial para definir una determinada posición (es decir, un sitio de captura) en la dimensión X sobre una matriz de captura y se usa una segunda secuencia de dirección espacial para definir una posición (es decir, un sitio de captura) en la dimensión Y sobre la matriz de captura. Durante la secuenciación de la biblioteca, se determinan las secuencias de dirección espacial X e Y, y la información de la secuencia se analiza para definir la posición específica sobre la matriz de captura.

En un ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con sondas de captura que se fijan sobre la superficie de la matriz. La muestra de tejido puede colocarse directamente sobre la superficie que comprende las sondas de captura o la muestra de tejido puede colocarse sobre una sustancia como un filtro o un gel o una capa fina de tampón que separa la muestra de tejido de las sondas de captura de modo que el ácido nucleico diana puede difundirse desde el tejido a través de la sustancia hasta las sondas de captura.

Las figuras 21A y 21B muestran una matriz de rejilla 2100 de un esquema de indexación unidimensional y una matriz de rejilla 2105 de un esquema de indexación bidimensional, respectivamente, para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido. Con referencia a la figura 21A, para conseguir la dirección espacial de 100 posiciones en un esquema de indexación unidimensional, se requieren 100 direcciones espaciales exclusivas. Con referencia ahora a la figura 21B, para conseguir la dirección espacial de 100 posiciones en un esquema de indexación bidimensional, se requieren 10 direcciones espaciales exclusivas para la dimensión X y se requieren 10 direcciones espaciales exclusivas para la dimensión Y, es decir, las secuencias de dirección espacial exclusivas totales requeridas son 20. La indexación combinatoria reduce sustancialmente el número de direcciones espaciales que se necesitan para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido.

En algunas realizaciones, un sitio de captura en una matriz comprende una primera sonda de captura con una primera secuencia de dirección espacial para la dimensión X y una segunda sonda de captura con una segunda secuencia de dirección espacial para la dimensión Y. En algunas realizaciones, la primera y la segunda sondas de captura están orientadas en direcciones opuestas sobre el sitio de captura de manera que se capturan los extremos 5' y 3' de una molécula de ARN. Durante las siguientes etapas de preparación de la biblioteca, la primera y la segunda secuencias de dirección espacial se incorporan en los amplicones de la biblioteca como se describe con más detalle con referencia a la figura 22 y las figuras 23A y 23B.

En algunas realizaciones, la primera y la segunda sondas de captura están orientadas en la misma dirección sobre el sitio de captura de manera que solo se captura el extremo 3' de una molécula de ARNm. Durante las siguientes etapas de preparación de la biblioteca, la primera y la segunda secuencias de dirección espacial se incorporan en los amplicones de la biblioteca como se describe con más detalle con referencia a la figura 24 y las figuras 25A y 25B.

En algunas realizaciones, se pueden incorporar dos o más regiones de direcciones parciales (por ejemplo, una primera y una segunda región de dirección parcial) en una única sonda de captura. Las dos o más regiones de dirección parcial pueden formar una región consecutiva o estar separadas por uno o más ácidos nucleicos. Por ejemplo, se pueden incorporar dos o más regiones de direcciones parciales en una única primera sonda de captura de un par de sondas de captura, según las matrices de captura y los métodos ilustrados, por ejemplo, en las figuras 17-19.

La figura 22 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 2200 para usar un sistema de indexación combinatoria para la generación de una biblioteca de secuenciación de ADNc con direcciones espaciales. El método 2200 comprende, pero no se limita a algunas o todas las siguientes etapas.

En una etapa 2210, una muestra de tejido que comprende una pluralidad de moléculas de ARNm se pone en contacto con una matriz de captura. La matriz de captura puede ser, por ejemplo, la matriz de captura 100 de la figura 1 A. Para cada molécula de ARNm específica de gen (es decir, dirigida específicamente) se utilizan dos sondas de captura, es decir, una primera sonda de captura que comprende secuencias específicas para el extremo 3' de la molécula de ARNm y una segunda sonda de captura que comprende secuencias específicas para el extremo 5' de la molécula de ARNm. Las moléculas de ARNm se capturan sobre la matriz mediante la hibridación del ARNm con las regiones de captura específicas de gen sobre las sondas de captura. Un ejemplo de las sondas de captura sobre la matriz de captura 100 se describe con más detalle con referencia a la figura 23A.

En la etapa 2215, se sintetiza el ADNc de primera hebra. Por ejemplo, las regiones de captura específicas de genes en la primera sonda de captura se utilizan como cebadores de transcriptasa inversa para la síntesis de ADNc de primera hebra a partir de moléculas de ARNm capturadas. A continuación, la molécula de ADNc se acopla al extremo 5' de la segunda sonda de captura.

En la etapa 2220, la molécula de ADNc se libera de la matriz de captura. Por ejemplo, la molécula de ADNc se libera de la matriz de captura mediante una reacción de escisión.

En la etapa 2225, el ADNc se amplifica para generar una biblioteca de secuenciación.

Las figuras 23A y 23B ilustran las etapas del método 2200 de la figura 22. En este ejemplo, se muestra un único sitio de captura 105 de la matriz de captura 100 de la figura 1 A. El sitio de captura 105 comprende una primera sonda de captura 2310a y una segunda sonda de captura 2310b. Las sondas de captura 2310 incluyen un dominio escindible 2315, una región de cebador de SBS 2320, una región de dirección espacial 2325, un identificador molecular exclusivo (UMI) 2330 y una región de captura 2335. Por ejemplo, la sonda de captura 2310a comprende la región escindible 2315; la región de cebador de SBS 2320a, que comprende, por ejemplo, una secuencia de SBS3; la región de direcciones espaciales 2325a, que comprende una secuencia de dirección espacial exclusiva para la dimensión X; la región UMI 2330a, que comprende una secuencia exclusiva para la sonda de captura 2310a; y una región de captura específica de gen 2335a, que es específica para el extremo 3' de una molécula de ARNm. La sonda de captura 2320a está inmovilizada al sitio de captura 105 en la orientación 5' a 3' (es decir, el extremo 5' de la sonda de captura 2320a está unido a la superficie del sitio de captura 105). De forma similar, la sonda de captura 2310b comprende la secuencia escindible 2315; la región de cebador de SBS 2320b, que comprende una secuencia SBS12; la región de dirección espacial 2325b, que comprende una región de dirección espacial exclusiva para la dimensión Y; la región UMI 2330b, que comprende una secuencia exclusiva para la sonda de captura 2310b; y una región de captura específica de gen 2335b, que es específica para el extremo 5' de la molécula de ARNm. La sonda de captura 2320b está inmovilizada al sitio de captura 105 en la orientación 3' a 5' (es decir, el extremo 3' de la sonda de captura 2320a está unido a la superficie del sitio de captura 105).

En la etapa 2210, se captura una molécula de ARNm 2340 en una muestra de tejido sobre las sondas de captura 2310. Por ejemplo, la muestra de tejido que contiene la molécula de ARNm 2340 o un sustrato que comprende la molécula de ARNm 2340 derivada de la muestra de tejido (no se muestra) se pone en contacto con sondas de captura 2310. La molécula de ARNm 2340 puede incluir una mutación 2345. La molécula de ARNm 2340 se captura en el sitio de captura 105 mediante la hibridación del extremo 3' de la molécula de ARNm 2340 con la región de captura 2335a, y mediante la hibridación del extremo 5' de la molécula de ARNm 2340 con la región de captura 2335b.

En la etapa 2215, se sintetiza una molécula de ADNc 2350 usando la región de captura 2335a como cebador en una reacción de transcripción inversa. El extremo 3' de la molécula de ADNc 2350 se acopla luego al extremo 5' de la región de captura 2335b.

En la etapa 2220, la molécula de ADNc 2350 se libera del sitio de captura 105 mediante escisión de la región escindible 2315. La molécula de ADNc 2350 comprende la región de cebador de SBS 2320a (es decir, SBS3), la región de dirección espacial 2325a (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión X), la región UMI 2330a, la región UMI 2330b, la región de dirección espacial 2325b (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión Y) y la región de cebador de SBS 2320b (es decir, SBS12).

En la etapa 2225, la molécula de ADNc 2350 se amplifica usando un cebador de SBS 2355 y un segundo cebador de SBS 2360. El cebador de SBS 2355 comprende una secuencia de SBS 2320a' que es complementaria con la región de cebador de SBS 2320a y una región P52365. El cebador de SBS 2360 comprende un región de SBS 2320b' que es complementaria con la región 2320b del cebador de SBS 2355 y una región P72370. Un amplicón de biblioteca sintetizado 2375 usando los cebadores de SBS2355 y 2360 está flanqueado en el extremo 5' por la región de P52365, la región del cebador de SBS 2320a (es decir, SBS3), la región de dirección espacial 2325a (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión X), la región UMI 2330a, y en el extremo 3' por la región UMI 2330b, la región de dirección espacial 2325b (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión Y), la región de cebador de SBS 2320b (es decir, SBS12) y la región P72370.

La figura 24 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método alternativo 2400 de uso de un sistema de indexación combinatoria para la generación de una biblioteca de secuenciación de ADNc con direcciones espaciales. El método 2400 comprende, pero no se limita a algunas o todas las etapas siguientes.

En una etapa 2410, una muestra de tejido que comprende una pluralidad de moléculas de ARNm se pone en contacto con una matriz de captura. La matriz de captura puede ser, por ejemplo, la matriz de captura 100 de la figura 1A. Para cada molécula de ARNm específico de gen se utilizan dos sondas de captura, es decir, una primera sonda de captura que comprende secuencias específicas para el extremo 3' de la molécula de ARNm y una segunda sonda de captura que comprende secuencias específicas para el extremo 3' de una correspondiente molécula de ADNc de primera hebra. Las moléculas de ARNm se capturan sobre la matriz mediante la hibridación del extremo 3' del ARNm con regiones específicas de genes sobre la primera sonda de captura. Un ejemplo de las sondas de captura sobre la matriz de captura 100 se describe con más detalle con referencia a la figura 25A.

En la etapa 2415, se sintetiza el ADNc de primera hebra. Por ejemplo, las regiones de captura específicas de genes sobre la primera sonda de captura se utilizan como cebadores de transcriptasa inversa para la síntesis de ADNc de primera hebra a partir de moléculas de ARNm capturadas.

En la etapa 2420, se captura el ADNc de primera hebra sobre la segunda sonda de captura. El ADNc de primera hebra se captura sobre la segunda sonda de captura mediante la hibridación del extremo 3' del ADNc con una región específica de gen sobre la segunda sonda de captura.

En la etapa 2425, se sintetiza el ADNc de segunda hebra. Por ejemplo, las regiones específicas de genes sobre las segundas sondas de captura se utilizan como cebadores para la síntesis de moléculas de ADN de segunda hebra.

En la etapa 2430, las moléculas de ADNc de segunda hebra se liberan de la matriz de captura. Por ejemplo, las moléculas de ADNc se liberan de la matriz de captura mediante una reacción de escisión.

En la etapa 2435, las moléculas de ADNc se amplifican para generar una biblioteca de secuenciación.

Las figuras 25A, 25B y 25C ilustran las etapas del método 2400 de la figura 24. En este ejemplo, se muestra un único sitio de captura 105 de la matriz de captura 100 de la figura 1A. El sitio de captura 105 es esencialmente el mismo que se describió anteriormente con referencia a la figura 23A, excepto que las sondas de captura 2310 están orientadas en la misma dirección en el sitio de captura 105, es decir, tanto la sonda de captura 2310a como la sonda de captura 2310b están inmovilizadas al sitio de captura 105 en la dirección 5' a 3' (es decir, el extremo 5' de las sondas de captura 2310a y 2310b está unido a la superficie del sitio de captura 105). La región de captura 2335a es específica para el extremo 3' de una molécula de ARNm, y la región de captura 2335b es específica para el extremo 3' de la correspondiente molécula de ADNc de primera hebra.

En la etapa 2410, se captura una molécula de ARNm 2510 en una muestra de tejido sobre la sonda de captura 2310a. Por ejemplo, la muestra de tejido que contiene la molécula de ARNm 2510 o un sustrato que comprende la molécula de ARNm 2510 derivada de la muestra de tejido (no se muestra) se pone en contacto con las sondas de captura 2310. La molécula de ARNm 2510 puede incluir una mutación 2515. La molécula de ARNm 2510 se captura en el sitio de captura 105 por hibridación del extremo 3' de la molécula de ARNm 2510 con la región de captura 2335a.

En la etapa 2415, se sintetiza el ADNc de primera hebra usando la región de captura 2335a como cebador en una reacción de transcripción inversa.

En la etapa 2420, se captura una molécula de ADNc de primera hebra 2520 sobre la sonda de captura 2310b por hibridación del extremo 3' de la molécula de ADNc 2520 con la región de captura 2335b.

En la etapa 2425, se sintetiza el ADNc de segunda hebra en una reacción de extensión usando la región de captura 2335b como cebador.

En la etapa 2430, se libera una molécula de ADNc 2525 desde el sitio de captura 105 mediante escisión de la región escindible 2315. La molécula de ADNc 2525 comprende la región de cebador de SBS 2320a (es decir, SBS3), la región de dirección espacial 2325a (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión X), la región UMI 2330a, la región UMI 2330b, la región de dirección espacial 2325b (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión Y) y la región de cebador de SBS 2320b (es decir, SBS12).

En la etapa 2435, la molécula de ADNc 2525 se amplifica usando un cebador de SBS 2530 y un segundo cebador de SBS 2535. El cebador de SBS 2530 comprende una región SBS 2320a' que es complementaria con la región de cebador de SBS 2320a y una región P52540. El cebador de SBS 2535 comprende un región de SBS 2320b' que es complementaria con la región de cebador de SBS 2320b y una región P7 2545. Un amplicón de la biblioteca 2550 sintetizado usando los cebadores de SBS 2530 y 2535 está flanqueado en el extremo 5' por la región P5 2540, la región de cebador de SBS 2320a (es decir, SBS3), la región de dirección espacial 2325a (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión X), la región UMI 2330a, y en el extremo 3' por la región UMI 2330b, la región de dirección espacial 2325b (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión Y), la región de cebador de SBS 2320b (es decir, SBS12) y la región P72545.

En algunas realizaciones, un sistema de indexación combinatoria puede implicar el uso de dos matrices diferentes, es decir, una primera matriz que comprende secuencias de dirección espacial para la dimensión X y una segunda matriz que comprende secuencias de dirección espacial para la dimensión Y. En un ejemplo, se puede usar una primera matriz para transportar cebadores de transcripción inversa (RT) a una muestra de tejido para la síntesis in situ de ADNc, y se usa una segunda matriz para capturar el ADNc para la generación de una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales.

La figura 26A ilustra una vista en planta de un ejemplo de una matriz 2600 para el transporte de cebadores de RT a una muestra de tejido para la síntesis in situ de ADNc. La matriz 2600 comprende una disposición, por ejemplo, filas, de sitios de entrega 2605 sobre un soporte sólido 2610. En este ejemplo, 10 sitios de entrega 2605 (por ejemplo, sitios de entrega 2605a a 2605j) están dispuestos sobre un soporte sólido 2610. En un ejemplo, el soporte sólido 2610 es un cubreobjetos de vidrio. Se deposita una pluralidad de cebadores RT 2615 (por ejemplo, impresos) en una franja a lo largo de la longitud de cada sitio de entrega 2605. Los cebadores RT 2615 se depositan en cada sitio de entrega 2605 de manera que puedan liberarse fácilmente desde la matriz 2600 sobre una muestra de tejido.

La figura 26B ilustra una vista lateral de una porción de un sitio de entrega 2605 de la matriz 2600, en la que la porción del sitio de entrega 2605 comprende al menos un cebador de RT 2615 para la síntesis de ADNc a partir de ARNm en una muestra de tejido. En este ejemplo, se muestra un solo cebador de RT 2615, pero se puede depositar cualquier número de cebadores RT 2615 sobre el soporte sólido 2610 en cada sitio de entrega 2605. El cebador de RT 2615 comprende una región de cebador de SBS 2620 (por ejemplo, SBS3), una región de dirección espacial 2625 (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión X), y una región de cebador específica de gen 2630. El cebador de RT 2615 tiene una región de dirección espacial exclusiva 2625 para cada sitio de entrega 2605, es decir, el sitio de entrega 2605a tiene una región de dirección espacial exclusiva 2625a, el sitio de entrega 2605b tiene una región de dirección espacial exclusiva 2625b, etc. La región de cebador específica de gen 2630 puede ser la misma región específica de gen o pueden ser diferentes secuencias específicas de gen.

La figura 27A ilustra una vista en planta de un ejemplo de una matriz de captura 2700 para la captura de ADNc sintetizado in situ usando los cebadores RT 2615 de la figura 26B. La matriz de captura 2700 comprende una disposición, por ejemplo, columnas, de los sitios de captura 2705 sobre un soporte sólido 2710. En este ejemplo, se disponen 10 sitios de captura 2705 (por ejemplo, los sitios de captura 2705a a 2705j) sobre un soporte sólido 2710. En un ejemplo, el soporte sólido 2710 es una superficie de vidrio plana. Se deposita una pluralidad de sondas de captura 2715 en una franja a lo largo de la longitud de cada sitio de captura 2705.

La figura 27B ilustra una vista lateral de una parte de un sitio de captura 2705 de la matriz de captura 2700, en la que la parte del sitio de captura 2705 comprende al menos una sonda de captura 2715 para la captura de ADNc sintetizado in situ usando los cebadores de RT 2615 de la figura 26B. En este ejemplo, se muestra una única sonda de captura 2715, pero se puede inmovilizar cualquier número de sondas de captura 2715 sobre el soporte sólido 2710 en cada sitio de captura 2705. La sonda de captura 2715 comprende una región escindible 2720, una región de cebador de SBS 2725 (por ejemplo, SBS12), una región de dirección espacial 2730, una región de identificador molecular exclusivo (UMI) 2735 y una región de captura específica de gen 2740. La sonda de captura 2715 tiene una región de dirección espacial exclusiva 2730 para cada sitio de captura 2705, es decir, el sitio de captura 2705a tiene la región de dirección espacial exclusiva 2730a, el sitio de captura 2705b tiene una región de dirección espacial exclusiva 2730b, etc. La región de captura 2740 es complementaria con la región de captura 2630 de la sonda de captura 2615 de la figura 26B.

La figura 28 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 2800 para generar una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales, en el que se usa una primera matriz para la síntesis in situ de ADNc de primera hebra, y se usa una segunda matriz para capturar el ADNc para la generación posterior de la biblioteca. El método 2800 comprende, pero no se limita a las siguientes etapas.

En una etapa 2810, una muestra de tejido que comprende una pluralidad de moléculas de ARNm se pone en contacto con una primera matriz. La matriz es, por ejemplo, la matriz 2600 de la figura 26A que comprende una pluralidad de cebadores de RT 2615. Los cebadores de Rt 2615 se liberan desde la matriz 2600 sobre la muestra de tejido.

En la etapa 2815, se sintetiza in situ el ADNc de primera hebra. Por ejemplo, las secuencias de cebadores específicos de genes en los cebadores de RT se utilizan para cebar el ADNc de primera hebra a partir de moléculas de ARNm diana en la muestra de tejido. Después de la síntesis del ADNc de primera hebra, la matriz 2600 se retira de la superficie de la muestra de tejido.

En la etapa 2820, se captura el ADNc de primera hebra sobre una segunda matriz y se sintetiza el ADNc de segunda hebra. Por ejemplo, la matriz de captura 2700 de la figura 27A que comprende una pluralidad de sondas de captura 2715 se pone en contacto con la muestra de tejido. El ADNc de primera hebra se captura sobre la matriz de captura 2700 mediante hibridación del extremo 3 'del ADNc con regiones específicas de genes en las sondas de captura 2715. El ADNc de segunda hebra se sintetiza usando regiones específicas de genes sobre la sonda de captura 2715 como cebadores en una reacción de extensión.

En la etapa 2825, las moléculas de ADNc de segunda hebra se liberan de la matriz de captura. Por ejemplo, las moléculas de ADNc se liberan de la matriz de captura mediante una reacción de escisión.

En la etapa 2830, las moléculas de ADNc se amplifican para generar una biblioteca de secuenciación.

Las figuras 29A y 29B ilustran las etapas del método 2800 de la figura 28. En la etapa 2810, una muestra de tejido (no se muestra) que comprende una molécula de ARNm 2910 se pone en contacto con la matriz 2600 (no se muestra). Por ejemplo, la muestra de tejido que contiene la molécula de ARNm 2910 o un sustrato que comprende la molécula de ARNm 2910 derivada de la muestra de tejido (no se muestra) se pone en contacto con la matriz 2600. La molécula de ARNm 2910 puede incluir una mutación 2915. Los cebadores de RT 2615 se liberan de la matriz 2600 sobre la muestra de tejido y se hibridan con la molécula de ARNm 2910 a través de la región específica de gen 2630.

En la etapa 2815, se sintetiza in situ una molécula de ADNc de primera hebra 2920 usando la región específica de gen 2630 como cebador en una reacción de transcripción inversa.

En la etapa 2820, la matriz de captura 2700 de la figura 27A que comprende una pluralidad de sondas de captura 2715 se pone en contacto con la muestra de tejido. El ADNc de primera hebra 2920 se captura en el sitio de captura 2705 mediante hibridación del extremo 3' del ADNc de primera hebra 2920 con la región de captura específica de gen 2740. El ADNc de segunda hebra se sintetiza en una reacción de extensión usando la región de captura específica de gen 2740 como cebador.

En la etapa 2825, se libera un ADNc de segunda hebra 2925 desde el sitio de captura 2705 mediante escisión de la región escindible 2720. La molécula de ADNc 2925 comprende la región de cebador de SBS 2725 (SBS12), la región de dirección espacial 2730 (es decir, la dirección espacial exclusiva para la dimensión Y), la región UMI 2735, la región de dirección espacial 2625 (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión X) y la región de cebador de SBS 2620 (SBS3).

En la etapa 2830, la molécula de ADNc 2925 se amplifica usando un cebador de SBS 2930 y un cebador de SBS 2935. El cebador de SBS 2930 comprende una región de SBS 2725a que es complementaria con la región de cebador de SBS 2725 y una región P5 2940. El cebador de SBS 2935 comprende una región de SBS 2620a que es complementaria con la región de cebador de SBS 2620 y una región P7 2945. Un amplicón de la biblioteca 2950 sintetizado usando los cebadores de SBS 2930 y 2935 está flanqueado en el extremo 5' por la región P5 2940, la región de cebador de SBS 2725 (es decir, SBS3), la región de dirección espacial 2730 (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión Y), la región UMI 2735, y en el extremo 3' por la región de dirección espacial 2625 (es decir, dirección espacial exclusiva para la dimensión X), la región de cebador de SBS 2620 (es decir, SBS3), y la región P72945.

En este ejemplo, la muestra de tejido se pone en contacto con las sondas de captura 2715 que se fijan sobre la superficie de los sitios de captura 2705. El ADNc de primera hebra 2920 se captura en el sitio de captura 2705 mediante hibridación del extremo 3' del ADNc de primera hebra 2920 con la secuencia de captura específica de gen 2740. En otro ejemplo (no se muestra), la muestra de tejido se pone en contacto con la matriz de captura 2700 y las sondas de captura 2715 se liberan desde los sitios de captura 2705 hacia la muestra de tejido por escisión de la secuencia escindible 2720. El ADNc de segunda hebra se sintetiza en una extensión reacción usando la secuencia de captura específica de gen 2740 como cebador.

4.5 Detección espacial y análisis del ácido nucleico en una muestra de tejido usando sondas de captura liberables

En otras realizaciones, se usa una matriz con direcciones espaciales para liberar sondas de captura hacia una sección de tejido para la generación de una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales. En esta estrategia, las sondas de captura con direcciones espaciales se depositan sobre la superficie de un sustrato (por ejemplo, un cubreobjetos de vidrio) en distintos sitios de captura o "características". En un ejemplo, las sondas de captura con direcciones espaciales se anclan sobre la superficie del sustrato mediante la formación de un enlace escindible. Las sondas de captura con direcciones espaciales se liberan hacia una sección de tejido mediante la escisión del enlace reversible y se incorporan al ácido nucleico en las etapas posteriores del procesamiento bioquímico. En algunas realizaciones, las sondas de captura con direcciones espaciales se depositan sobre el sustrato suspendido en una matriz, tal como una matriz BioGel. Las sondas de captura con direcciones espaciales suspendidas en el BioGel se liberan hacia una sección de tejido, por ejemplo, mediante la aplicación de un tratamiento térmico o un tratamiento químico. La inmovilización de sondas de captura con direcciones espaciales sobre una superficie de sustrato usando un enlace escindible o suspensión de BioGel evita la necesidad de capturar el ácido nucleico (es decir, ARN, ADNc o ADN genómico) de una sección de tejido sobre una superficie de sustrato para la generación de una biblioteca con direcciones espaciales.

En un ejemplo, una sonda de captura con dirección espacial comprende una secuencia de cebador aleatorio que se usa para la síntesis in situ de ADNc a partir de ARN total en una muestra de tejido.

La figura 30 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 3000 para generar una biblioteca de ADNc con direcciones espaciales usando sondas de captura liberables. El método 3000 comprende, pero no se limita a las siguientes etapas.

En una etapa 3010, se imprime un cubreobjetos con sondas de captura con direcciones espaciales para formar una matriz de características espaciales. En un ejemplo, las sondas de captura con direcciones espaciales se imprimen en un cubreobjetos de 2 cm x 2 cm para formar una matriz de características espaciales que tienen 100 gm de diámetro con una altura de 35 gm. Las sondas de captura con direcciones espaciales incluyen una secuencia de cebador aleatorio para la síntesis de ADNc en una reacción de transcripción inversa, una secuencia de dirección espacial y una secuencia de cebador de SBS biotinilada como se describe con más detalle con referencia a las figuras 31A y 31B. Las sondas de captura con direcciones espaciales también incluyen una modificación en el extremo 5' de la molécula para una unión reversible al cubreobjetos. En un ejemplo, las sondas de captura con direcciones espaciales incluyen una modificación de disulfuro 5' como se describe con más detalle con referencia a las figuras 32A, 32B y 32C. En algunas realizaciones, las sondas de captura con direcciones espaciales incluyen un conector fotoescindible 5' como se describe con más detalle con referencia a las figuras 33A, 33B y 33C.

En una etapa 3015, el cubreobjetos se coloca encima de una sección de tejido FFPE semipermeabilizada montada sobre un portaobjetos de vidrio, de manera que la superficie del cubreobjetos con las sondas de captura con direcciones espaciales sobre el mismo esté en contacto con la sección de tejido.

En una etapa 3020, las sondas de captura con direcciones espaciales inmovilizadas sobre el cubreobjetos se liberan desde la superficie del cubreobjetos hacia el espacio celular de la sección de tejido. En un ejemplo, las sondas de captura con direcciones espaciales que incluyen una modificación de disulfuro 5' se liberan haciendo fluir una disolución de ditiotreitol (DTT) a través de la sección de tejido semipermeabilizada. En algunas realizaciones, las sondas de captura con direcciones espaciales que incluyen un conector fotoescindible 5' se liberan usando irradiación con luz ultravioleta.

En la etapa 3025, se sintetiza in situ un ADNc de primera hebra usando una reacción de transcripción inversa. Por ejemplo, se hace fluir una disolución de mezcla maestra de transcripción inversa entre el cubreobjetos y el portaobjetos de vidrio hacia la sección de tejido semipermeabilizada. El cubreobjetos actúa como una barrera para evitar la evaporación durante la reacción. Debido al marcador de biotina interno en las sondas de captura con direcciones espaciales utilizadas en la reacción de transcripción inversa, se biotinila el ADNc de primera hebra.

En la etapa 3030, los híbridos de ARN:ADNc se disocian y la matriz celular se rompe. En un ejemplo, los dúplex de ARN:ADNc se disocian y la matriz celular se rompe usando una disolución de NaOH. En algunas realizaciones, los dúplex de ARN:ADNc se disocian y la matriz celular se rompe usando un protocolo de tratamiento térmico.

En la etapa 3035, la muestra de tejido semipermeabilizada con ARN y ADNc sobre ella se extrae de la superficie del portaobjetos de vidrio y se recoge en un tubo de recogida. En un ejemplo, la muestra de tejido semipermeabilizada con ARN y el ADNc de primera hebra se extrae del portaobjetos de vidrio raspando hacia un tubo Eppendorf. En algunas realizaciones, la muestra de tejido semipermeabilizada con ARN y el ADNc de primera hebra se extrae del portaobjetos de vidrio colocando el portaobjetos en un tubo de centrífuga de 50 ml y centrifugando para recoger el material en un receptáculo en el fondo del tubo.

En una etapa 3040, el ADNc de primera hebra biotinilado se purifica usando dos rondas de un protocolo de purificación basado en esferas de estreptavidina. El ADNc de primera hebra purificado se recoge en un tubo de PCR para las etapas de procesamiento posteriores. La molécula de ADNc comprende una secuencia de cebador de SBS (por ejemplo, SBS12), una secuencia de dirección espacial y la secuencia de cebador aleatorio.

En la etapa 3045, el ADNc de primera hebra se amplifica en una reacción múltiplex usando una mezcla de pares de cebadores directos e inversos que flanquean, por ejemplo, una o más SNV diana. Por ejemplo, un cebador directo comprende una secuencia específica de gen que se dirige a una SNV de interés, una secuencia de cebador de SBS (por ejemplo, SBS3) y secuencias P5. La secuencia específica de gen está diseñada para estar aproximadamente 50 pb cadena arriba de una SNV diana. Un cebador inverso comprende secuencias complementarias de SBS12 y secuencias P7.

En la etapa 3050, se secuencian los amplicones de la biblioteca. Por ejemplo, la lectura 1 (por ejemplo, de aproximadamente 50 pb a aproximadamente 75 pb) de una reacción de SBS proporciona información de secuencia para la SNV diana y la lectura 2 (aproximadamente 25 pb) proporciona información de secuencia para la dirección espacial.

Las figuras 31A y 31B ilustran diagramas esquemáticos de una sonda de captura con dirección espacial 3100 que comprende una modificación de disulfuro 5' y una sonda de captura con dirección espacial 3150 que comprende un conector fotoescindible 5', respectivamente. Con referencia a la figura 31A, la sonda de captura con dirección espacial 3100 comprende una región de cebador aleatorio 3110, una región de dirección espacial 3115 y una región de cebador de SBS 3120 (por ejemplo, SBS12). La región de cebador aleatorio 3110 puede comprender, por ejemplo, una secuencia de 6 pb que puede usarse para cebar la síntesis de ADNc de todo el transcriptoma de una célula en una reacción de transcripción inversa. La región de dirección espacial 3115 comprende una secuencia exclusiva para cada característica espacial en una matriz. La región de cebador de SBS 3120 comprende un marcador de biotina interno 3125. El marcador de biotina interno 3125 se usa para purificar el ADNc en las etapas de procesamiento posteriores. La sonda de captura con dirección espacial 3100 también comprende una modificación de disulfuro 5' 3130. La modificación de disulfuro 3130 se usa para anclar reversiblemente la sonda de captura con dirección espacial 3100 sobre la superficie de un sustrato de vidrio (por ejemplo, cubreobjetos de vidrio) como se describe con más detalle con referencia a las figuras 32A, 32B y 32C.

Con referencia a la figura 31B, la sonda de captura con dirección espacial 3150 es sustancialmente la misma que la sonda de captura con dirección espacial 3100, excepto porque el extremo 5' de la sonda de captura con dirección espacial 3150 está modificada con un conector de amino fotoescindible 3155. El conector de amino fotoescindible 3155 se usa para anclar reversiblemente la sonda de captura con dirección espacial 3150 sobre la superficie de un sustrato de vidrio (por ejemplo, cubreobjetos de vidrio) como se describe con más detalle con referencia a las figuras 33A, 33B y 33C.

Las figuras 32A, 32B y 32C ilustran un ejemplo de un proceso de anclaje reversible de la sonda de captura con dirección espacial 3100 de la figura 31A sobre la superficie de un cubreobjetos de vidrio.

En una primera etapa y con referencia ahora a la figura 32A, se proporciona un cubreobjetos de vidrio 3210 funcionalizado con una pluralidad de grupos tiol (SH) 3215. Los cubreobjetos funcionalizados con tiol están disponibles en el mercado.

En una etapa siguiente y con referencia ahora a la figura 32B, las sondas de captura con direcciones espaciales 3100 se depositan (por ejemplo, se imprimen) sobre la superficie del cubreobjetos de vidrio 3210.

En una etapa siguiente y haciendo referencia ahora a la figura 32C, las sondas de captura con direcciones espaciales 3100 se anclan sobre la superficie del cubreobjetos de vidrio 3210 mediante la formación de un enlace disulfuro en una reacción de intercambio de tiol-disulfuro entre los grupos tiol 3215 y las modificaciones de disulfuro 3130 sobre las sondas de captura con direcciones espaciales 3100. Las sondas de captura con direcciones espaciales 3100 se pueden liberar posteriormente del cubreobjetos de vidrio 3210 mediante la escisión del enlace disulfuro usando un agente reductor. En un ejemplo, se usa ditiotreitol (DTT) para escindir el enlace disulfuro y liberar las sondas de captura con direcciones espaciales 3100.

Las figuras 33A, 33B y 33C ilustran un ejemplo de un proceso de anclaje reversible de sondas de captura con direcciones espaciales 3150 de la figura 31B sobre la superficie de un cubreobjetos de vidrio.

En una primera etapa y con referencia ahora a la figura 33A, se proporciona un cubreobjetos de vidrio 3310 funcionalizado con una pluralidad de grupos aldehído 3315. Los sustratos de vidrio funcionalizados con aldehído están disponibles en el mercado.

En una etapa siguiente y con referencia ahora a la figura 33B, se depositan las sondas de captura con direcciones espaciales 3150 sobre la superficie del cubreobjetos de vidrio 3310.

En una etapa siguiente y haciendo referencia ahora a la figura 33C, las sondas de captura con direcciones espaciales 3150 se anclan sobre la superficie del cubreobjetos de vidrio 3310 mediante la formación de un enlace covalente entre los grupos aldehído 3315 y los conectores de amino fotoescindibles 3155 en las sondas de captura con direcciones espaciales 3150. Las sondas de captura con direcciones espaciales 3150 se pueden liberar posteriormente del cubreobjetos de vidrio 3310 mediante la escisión del enlace covalente usando irradiación con luz ultravioleta (por ejemplo, 350 nm durante aproximadamente 5 minutos).

Las figuras 34A y 34B muestran gráficamente las etapas del método 3000 de la figura 30. En la etapa 3010, se imprime un cubreobjetos 3410 con sondas de captura con direcciones espaciales (no se muestra) para formar una matriz de características espaciales 3415. En un ejemplo, las sondas de captura con direcciones espaciales se imprimen en un cubreobjetos de 2 cm x 2 cm para formar una matriz de características espaciales 3415 que tienen 100 gm de diámetro con una altura de 35 gm. Las sondas de captura con direcciones espaciales son, por ejemplo, la sonda de captura con dirección espacial 3100 de la figura 31 que se utilizan para capturar el transcriptoma completo de una célula.

En la etapa 3015, el cubreobjetos 3410 se coloca encima de una sección de tejido semipermeabilizada 3420 que está montada en un portaobjetos de vidrio 3425. La sección de tejido 3420 comprende una pluralidad de células 3430. Cada célula contiene una o más moléculas de ARN 3435. Una o más moléculas de ARN 3435 pueden incluir una variación de un solo nucleótido (SNV) 3440.

En la etapa 3020, las sondas de captura con direcciones espaciales (indicadas por flechas) inmovilizadas sobre el cubreobjetos 3410 se liberan de la superficie del cubreobjetos hacia el espacio celular.

En la etapa 3025, el ADNc de primera hebra se sintetiza in situ en una reacción de transcripción inversa utilizando secuencias de cebadores aleatorias 3110 sobre la sonda de captura con dirección espacial 3100. Por ejemplo, se hace fluir una disolución de mezcla maestra de transcripción inversa (no se muestra) entre el cubreobjetos 3410 y el portaobjetos de vidrio 3425 hacia la sección de tejido semipermeabilizado 3420.

En la etapa 3030, los híbridos de ARN:ADNc se disocian y la matriz celular en la muestra de tejido 3420 se rompe para liberar una molécula de ADNc 3445. En un ejemplo, los dúplex ARN:ADNc se disocian y la matriz celular se rompe usando una disolución de NaOH. En algunas realizaciones, los dúplex de ARN:ADNc se disocian y la matriz celular se rompe usando un protocolo de tratamiento térmico.

En la etapa 3035, la muestra de tejido semipermeabilizada 3420 con las células 3430, las moléculas de ARN 3435 y las moléculas de ADNc 3445 sobre ella se extraen de la superficie del portaobjetos de vidrio 3425 y se recogen en un tubo de recogida 3450. En un ejemplo, la muestra de tejido semipermeabilizado 3420 con las células 3430, las moléculas de ARN 3435 y las moléculas de ADNc 3445 se extraen del portaobjetos de vidrio 3425 raspando hacia un tubo Eppendorf. En algunas realizaciones, la muestra de tejido semipermeabilizada 3420 con las células 3430, las moléculas de ARN 3435 y las moléculas de ADNc 3445 sobre ella se extraen del portaobjetos de vidrio 3425 colocando el portaobjetos de vidrio 3425 en un tubo de centrífuga de 50 ml y centrifugando para recoger el material en un receptáculo en la parte inferior del tubo de 50 ml.

En la etapa 3040, las moléculas de ADNc biotiniladas 3445 se purifican usando dos rondas de un protocolo de purificación basado en esferas de estreptavidina.

En la etapa 3045, las moléculas de ADNc 3445 se amplifican en una reacción múltiplex usando una mezcla de pares de cebadores directos e inversos que flanquean las SNV diana. Por ejemplo, un cebador directo 3455 comprende una región específica de gen 3460 que se dirige a una SNV (por ejemplo, SNV 3440) de interés, una región de cebador de SBS 3465 (por ejemplo, SBS3) y una región P5 3470. La región específica de gen 3460 es diseñado para estar aproximadamente 50 pb cadena arriba de una SNV diana. Un cebador inverso 3475 comprende una región complementaria de SBS12 3120a y una región P7 3480. Un amplicón de la biblioteca 3485 sintetizado usando el cebador directo 3455 y el cebador inverso 3475 comprende la región P53470, la región de cebador de SBS 3465, SNV 3440, la región de cebador aleatorio 3110, la región de dirección espacial 3115, la región de cebador de SBS 3120 y la región P73480.

En algunas realizaciones, una sonda de captura con dirección espacial comprende secuencias para la captura dirigida in situ y la amplificación de ADN genómico en una muestra de tejido. En un ejemplo, la captura y amplificación de regiones de ADN genómico diana se realiza utilizando una estrategia similar a TSCA (TruSeq Custom Amplicon, Illumina). En la estrategia similar a TSCA, se usa un par de sondas de captura que flanquean una región de interés diana (por ejemplo, una SNV) para capturar el ADN genómico. La figura 35 ilustra un diagrama esquemático de un ejemplo de un par de sondas de captura 3500 para capturar una región de ADN genómico de interés. El par de sondas de captura 3500 comprende una primera sonda de captura 3510 que se hibrida 5' con una región de interés y una segunda sonda de captura 3515 que se hibrida 3' con la región de interés. La primera sonda de captura 3510 comprende una región de cebador de SBS 3520a (por ejemplo, SBS12), una región de dirección espacial 3525, y una región específica de gen 3530a. La segunda sonda de captura 3515 comprende una región de cebador de SBS 3520b (por ejemplo, SBS3) y una región específica de gen 3530b.

La figura 36 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 3600 para generar una biblioteca de amplicones genómicos con direcciones espaciales usando sondas de captura liberables. En este ejemplo, la captura y amplificación de regiones de ADN genómico diana se realiza utilizando una estrategia similar a TSCA (T ruSeq Custom Amplicon, Illumina). El método 3600 comprende, pero no se limita a las siguientes etapas.

En la etapa 3610, se coloca un cubreobjetos con sondas de captura con direcciones espaciales encima de una sección de tejido FFPE semipermeabilizada montada sobre un portaobjetos de vidrio. En un ejemplo, las sondas de captura con direcciones espaciales se suspenden en una matriz de BioGel que se deposita sobre la superficie del cubreobjetos. Las sondas de captura con direcciones espaciales son un par de sondas que incluyen secuencias de ADN que flanquean una región de interés (por ejemplo, una SNV) en el ADN genómico. Las sondas de captura también incluyen secuencias para la posterior amplificación por PCR (por ejemplo, secuencias de SBS3 y SBS12) como se describe anteriormente con referencia a la figura 35. Una (o ambas) de las sondas de captura también pueden incluir un marcador de biotina interno para la posterior purificación de la región del ADN diana. Las sondas de captura se liberan de la matriz de BioGel sobre la sección de tejido utilizando, por ejemplo, un protocolo de tratamiento térmico.

En una etapa 3615, las sondas de captura se hibridan con ADN genómico y se realiza una reacción de extensión/acoplamiento in situ entre las sondas de captura flanqueantes a través de la región diana de interés.

En la etapa 3620, se purifican los productos de extensión/acoplamiento. Por ejemplo, la muestra de tejido con productos de extensión/acoplamiento sobre ella se retira de la superficie del portaobjetos de vidrio y se recoge en un tubo de recogida. Los productos de extensión/acoplamiento se purifican luego usando una o más rondas de un protocolo de purificación, como un protocolo de purificación basado en esferas de estreptavidina.

En la etapa 3625, los productos de extensión/acoplamiento se amplifican por PCR para añadir índices y cebadores de secuenciación.

En la etapa 3630, se secuencian los amplicones de la biblioteca.

La figura 37 ilustra las etapas del método 3600 de la figura 36. En la etapa 3610, se coloca un cubreobjetos 3710 con sondas de captura con direcciones espaciales en una matriz BioGel encima de una sección de tejido FFPE semipermeabilizado 3715 montado en un portaobjetos de vidrio 3720. La sección de tejido 3715 comprende una célula 3725. La célula 3725 comprende una región de ADN genómico diana 3730. El ADN genómico 3730 puede incluir una SNV 3735. La primera sonda de captura 3510 y la segunda sonda de captura 3515 se liberan hacia la sección de tejido 3715 usando un protocolo de tratamiento térmico.

En la etapa 3615, la primera sonda de captura 3510 y la segunda sonda de captura 3515 se hibridan con el ADN genómico y se realiza una reacción de extensión/acoplamiento in situ entre las sondas de captura flanqueantes a través de la región diana de interés para generar un producto de extensión/acoplamiento 3740.

En la etapa 3620, se purifica el producto de extensión/acoplamiento 3740. Por ejemplo, la muestra de tejido con el producto de extensión/acoplamiento 3740 se retira de la superficie del portaobjetos de vidrio y se recoge en un tubo de recolección 3745. El producto de extensión/acoplamiento 3740 se purifica luego usando una o más rondas de un protocolo de purificación, tal como un protocolo de purificación basado en esferas de estreptavidina.

En la etapa 3625, el producto de extensión/acoplamiento 3740 se amplifica por PCR usando un cebador directo 3750 y un cebador inverso 3755 para añadir adaptadores de secuenciación. El cebador directo 3750 comprende una región SBS 3520b' que es complementaria con la región de cebador de SBS 3520b y una región P53760. El cebador inverso 3755 comprende una región SBS 3520a' que es complementaria con 3520a y una región P73765.

4.6 Captura de ácidos nucleicos basada en partículas

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos en muestras de tejido pueden capturarse primero mediante sondas inmovilizadas sobre partículas, tales como nanopartículas, y luego transferirse a una matriz de captura descrita en el presente documento. La transferencia de ácidos nucleicos basada en partículas puede aumentar la eficiencia, por ejemplo, el rendimiento o la cinética, de la transferencia del ácido nucleico desde la muestra de tejido a la matriz de captura.

Los ácidos nucleicos se pueden transferir desde una muestra de tejido a una matriz de captura transfiriendo partículas que comprenden los ácidos nucleicos de la muestra de tejido a la matriz de captura. La transferencia de partículas se puede facilitar, por ejemplo, mediante el uso de partículas magnéticamente sensibles, tales como nanopartículas magnéticamente sensibles, y aplicando un campo magnético a la muestra de tejido y la matriz de captura para facilitar la transferencia de las nanopartículas magnéticamente sensibles desde la muestra de tejido a la matriz de captura. En algunas realizaciones, la transferencia de partículas desde la muestra de tejido a la matriz de captura se puede facilitar, por ejemplo, usando una interacción molecular, tal como una interacción de unión al ligando (por ejemplo, una interacción de estreptavidina-biotina). Por ejemplo, la transferencia de partículas se puede facilitar, por ejemplo, mediante el uso de partículas recubiertas de estreptavidina, tales como nanopartículas recubiertas de estreptavidina, y una matriz de captura recubierta de biotina. Como alternativa, se puede usar cualquier interacción proteína-proteína, proteína-molécula pequeña o ácido nucleico-ácido nucleico, o cualquier reacción química específica (por ejemplo, "química de clic") para facilitar la transferencia rápida o completa de partículas que comprenden un ácido nucleico desde la muestra de tejido a la matriz de captura.

Puede inmovilizarse una variedad de sondas sobre las partículas para capturar ácidos nucleicos procedentes de la muestra de tejido y combinarse con una variedad de sondas sobre una matriz de captura descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, las sondas sobre las partículas consisten esencialmente en regiones de captura para capturar los ácidos nucleicos procedentes de la muestra de tejido (además, por ejemplo, de elementos adicionales para inmovilizar las sondas a la partícula). En algunas realizaciones, las sondas sobre las partículas pueden comprender una región de captura y una región de dirección espacial (por ejemplo, una región de dirección espacial parcial o combinatoria, o una región de dirección espacial completa). Las partículas recubiertas con sondas descritas en este documento se pueden usar en combinación, por ejemplo, con matrices de captura que comprenden sitios de captura que tienen sondas que comprenden esencialmente una región escindible, o una región escindible y una región de dirección espacial (por ejemplo, una región de dirección espacial parcial o combinatoria, o una región de dirección espacial completa), o una región escindible, una región de dirección espacial y una región de captura (por ejemplo, una región para capturar los ácidos nucleicos sobre las partículas), o cualquier otra combinación de regiones.

En algunas realizaciones, se usan nanopartículas magnéticamente sensibles para capturar el ácido nucleico (por ejemplo, ADNc sintetizado in situ) en una muestra de tejido para la generación de una biblioteca con direcciones espaciales.

En algunas realizaciones, las nanopartículas magnéticamente sensibles pueden comprender sondas inmovilizadas que comprenden esencialmente una región de captura (por ejemplo, una región de captura universal o específica de gen). En algunas realizaciones, las sondas pueden comprender además una región de cebador de SBS (por ejemplo, una región SBS3 o SBS12) u otras regiones universales, tales como regiones P5 o P7. En algunas realizaciones, las nanopartículas se usan en combinación con una matriz de captura que comprende sondas de captura que comprenden una región escindible, una región de dirección espacial y una región de captura (por ejemplo, una región de captura específica de un gen). En algunas realizaciones, las sondas sobre la matriz de captura comprenden además una región de cebador de SBS (por ejemplo, una región SBS 3 o SBS12) u otras regiones universales, tales como regiones P5 o P7.

La figura 38 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 3800 para generar una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales usando partículas, tales como nanopartículas magnéticamente sensibles, para capturar un ácido nucleico procedente de una muestra de tejido.

En la etapa 3810, el ADNc se sintetiza a partir del ARNm diana en una muestra de tejido mediante transcripción inversa in situ. En algunas realizaciones, el ADNc es un ADNc específico de gen (es decir, buscado). En algunas realizaciones, el ADNc es un ADNc aleatorio o un ADNc que representa el mRNA en masa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede usar un cebador de RT específico de gen unido a la superficie de una partícula, tal como una nanopartícula magnéticamente sensible, para cebar la síntesis de ADNc de primera hebra en una reacción de transcripción inversa.

En la etapa 3815, el ADNc de primera hebra unido a la superficie, por ejemplo, de una nanopartícula magnéticamente sensible se captura sobre una matriz. La matriz es, por ejemplo, un sustrato de vidrio que se imprime con sondas de captura con direcciones espaciales para formar una matriz de sitios de captura. Las sondas de captura con direcciones espaciales pueden comprender, por ejemplo, una secuencia de policonector escindible, una secuencia de dirección espacial y una secuencia de captura específica de gen que es complementaria con una secuencia en el ADNc de primera hebra. Las sondas de captura con direcciones espaciales se pueden unir al sustrato de vidrio mediante la secuencia de policonector escindible. La secuencia de dirección espacial suele ser una secuencia exclusiva para cada característica espacial de la matriz. Cada característica espacial puede incluir una pluralidad de sondas de captura con direcciones espaciales con diferentes secuencias de captura específicas de genes. Se puede colocar un imán cerca de la matriz. La reacción se puede calentar a una temperatura de incubación de aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 1 minuto para desnaturalizar los híbridos de ARN:ADNc. En la proximidad del imán, el ADNc de primera hebra unido a la superficie de una nanopartícula magnéticamente sensible puede anclarse sobre la superficie de la matriz. Las moléculas de ADNc de primera hebra pueden capturarse sobre la matriz mediante hibridación (por ejemplo, a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 10 minutos) con las secuencias de captura específicas de gen en las sondas de captura con direcciones espaciales.

En la etapa 3820, se puede sintetizar el ADNc de segunda hebra. Por ejemplo, el imán se retira de la proximidad de la matriz y las moléculas de ADNc de primera hebra que no están hibridadas con secuencias de captura específicas de genes en las sondas de captura con direcciones espaciales pueden eliminarse mediante lavado. El ADNc de segunda hebra se sintetiza en una reacción de extensión utilizando la segunda secuencia de captura específica de gen como cebador.

En la etapa 3825, el ADNc bicatenario puede liberarse de la matriz de captura mediante escisión de la secuencia de policonector escindible.

En la etapa 3830, el ADNc bicatenario puede opcionalmente repararse en los extremos y acoplarse a adaptadores de secuenciación para generar una biblioteca de secuenciación. En realizaciones en las que el cebador de RT y el cebador de captura sobre la matriz de captura comprenden regiones del cebador de SBS, la reparación de extremos

La figura 39 ilustra las etapas de un ejemplo de método 3800 de la figura 38. Es decir, una sección de tejido (no se muestra) comprende una molécula de ARN diana 3910. La molécula de ARN diana 3910 puede incluir una mutación 3915. En la etapa 3810, el ADNc se sintetiza in situ usando un cebador de RT específico de gen 3920 en una reacción de transcripción inversa. El cebador de RT 3920 está unido a la superficie de una nanopartícula magnéticamente sensible 3925. Una molécula de ADNc 3930 sintetizada usando el cebador de RT 3920 se une a la nanopartícula magnéticamente sensible 3925.

En la etapa 3815, las moléculas de ADNc 3930 se capturan sobre una matriz que comprende una pluralidad de sitios de captura 3935. En este ejemplo, se muestra un único sitio de captura 3935. El sitio de captura 3935 comprende una sonda de captura con dirección espacial 3940. La sonda de captura con dirección espacial 3940 comprende una región de policonector escindible 3945, una región de dirección espacial 3950 y una región de captura específica de gen 3955 que es complementaria con una secuencia en el ADNc de primera hebra. La sonda de captura con dirección espacial 3940 se une al sitio de captura 3935 a través de la región de policonector escindible 3945. Se coloca un imán 3960 cerca del sitio de captura 3935. La reacción se calienta hasta una temperatura de incubación de aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 1 minuto para desnaturalizar los híbridos de ARN:ADNc. En las proximidades del imán 3960, las moléculas de ADNc de primera hebra 3930 unidas a la superficie de la nanopartícula magnéticamente sensible 3925 se anclan sobre el sitio de captura 3935 de la superficie. Las moléculas de ADNc de primera hebra 3930 se capturan sobre el sitio de captura 3935 mediante hibridación (por ejemplo, a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 10 minutos) con la región de captura específica de gen 3955 en la sonda de captura con dirección espacial 3940.

En la etapa 3820, se sintetiza el ADNc de segunda hebra. Por ejemplo, el imán 3960 se elimina de la proximidad del sitio de captura 3935 y las moléculas de ADNc de primera hebra 3930 que no están hibridadas con la secuencia de captura específica de gen 3955 en la sonda de captura con dirección espacial 3940 se eliminan mediante lavado. El ADNc de segunda hebra se sintetiza en una reacción de extensión utilizando la región de captura específica de gen 3955 como cebador.

En la etapa 3825, una molécula de ADNc bicatenario 3965 que ahora comprende la región de dirección espacial 3950 se libera del sitio de captura 3935 mediante escisión de la región de policonector escindible 3945.

En la etapa 3830 (no mostrada en la figura 39), la molécula de ADNc bicatenaria 3965 se repara opcionalmente en los extremos y se acopla a adaptadores de secuenciación para generar una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales.

En algunas realizaciones, el cebador de RT y el cebador de captura sobre la matriz de captura pueden comprender opcional e independientemente regiones adicionales, como regiones del cebador de SBS (por ejemplo, regiones SBS3 o SBS12) o regiones universales (por ejemplo, regiones P5 o P7) que pueden, por ejemplo, incorporarse en la molécula de ADNc bicatenario 3965.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende proporcionar una nanopartícula magnéticamente sensible (por ejemplo, 3925) que comprende una sonda de captura inmovilizada que comprende una región de captura (por ejemplo, 3920).

En algunas realizaciones, la región de captura es una región de captura específica de gen (que comprende, por ejemplo, una secuencia de TSCA). En algunas realizaciones, la región de captura es una región de captura universal (que comprende, por ejemplo, una secuencia de poli-T o una secuencia de ácido nucleico aleatoria).

En algunas realizaciones, la sonda de captura inmovilizada no incluye una región de dirección espacial.

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la nanopartícula magnéticamente sensible con una muestra de tejido, de modo que la posición de la nanopartícula magnéticamente sensible sobre la muestra de tejido pueda correlacionarse con la posición de un ácido nucleico en la muestra de tejido, y permitir que el ácido nucleico ácido se hibride con la región de captura de la sonda de captura inmovilizada.

En algunas realizaciones, el método comprende además extender la región de captura de la sonda de captura inmovilizada para formar una primera hebra complementaria inmovilizada del ácido nucleico hibridado con la región de captura (por ejemplo, 3930).

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la muestra de tejido con una matriz de captura, de modo que la posición de un sitio de captura sobre la matriz de captura pueda correlacionarse con una posición en la muestra de tejido, en el que la matriz de captura comprende un sitio de captura (por ejemplo , 3935) que comprende una sonda de captura inmovilizada sobre una superficie (por ejemplo, 3940), en el que la sonda de captura comprende una región escindible (por ejemplo, 3945), una región de dirección espacial (por ejemplo, 3950) y una región específica de gen (por ejemplo, 3955).

En algunas realizaciones, el método comprende además aplicar un campo magnético a la matriz de captura y la muestra de tejido para transferir la nanopartícula magnéticamente sensible con la primera hebra complementaria inmovilizada a la matriz de captura, y permitir que la primera hebra complementaria inmovilizada se hibride con la región de captura de la sonda de captura sobre la matriz de captura.

En algunas realizaciones, el método comprende además extender la región de captura de la sonda de captura sobre la matriz de captura para formar una segunda hebra complementaria inmovilizada del ácido nucleico (por ejemplo, la hebra recién sintetizada de 3965).

En algunas realizaciones, el método comprende además escindir la sonda de captura sobre la matriz de captura en el dominio escindible para liberar una segunda hebra complementaria marcada espacialmente desde la superficie de la matriz de captura.

En algunas realizaciones, el método comprende además analizar la secuencia de la segunda hebra complementaria marcada espacialmente liberada.

En algunas realizaciones, el método comprende además correlacionar la secuencia de la segunda hebra complementaria marcada espacialmente liberada con la posición del ácido nucleico en la muestra de tejido.

En algunas realizaciones, las sondas asociadas a partículas (por ejemplo, nanopartículas) se pueden hibridar con un ácido nucleico procedente de una muestra de tejido antes de inmovilizar la sonda a la nanopartícula, y después el híbrido de sonda-ácido nucleico se puede inmovilizar a la nanopartícula. En algunas realizaciones, una sonda hibridada con un ácido nucleico procedente de la muestra de tejido puede extenderse para formar un ácido nucleico complementario con el ácido nucleico de la muestra de tejido, y después el ácido nucleico complementario puede inmovilizarse sobre la nanopartícula. En algunas realizaciones, las sondas pueden comprender un elemento de conector para unir un híbrido de sonda-ácido nucleico o un ácido nucleico complementario a la nanopartícula.

Las figuras 40A y 40B ilustran un ejemplo de un proceso 4000 de uso de una sonda de captura para formar un ácido nucleico complementario en una muestra de tejido y posteriormente inmovilizar el ácido nucleico complementario a una nanopartícula.

En una primera etapa y con referencia ahora a la figura 40A, una sonda de captura 4010 se hibrida con un ácido nucleico 4015 procedente de una muestra de tejido. La sonda de captura 4010 incluye una región de captura 4015 y un elemento de conector 4020. En un ejemplo, la región de captura 4015 comprende una secuencia de cebador aleatoria. En otro ejemplo, la región de captura 4015 comprende una secuencia de cebador específica de gen. El elemento de conector 4020 es un elemento para unir un híbrido de sonda-ácido nucleico o un ácido nucleico complementario a una nanopartícula. En un ejemplo, la molécula de ácido nucleico 4025 es una molécula de ADN genómico. En otro ejemplo, la molécula de ácido nucleico 4025 es una molécula de ARN. La sonda de captura 4010 se hibrida con la molécula de ácido nucleico 4025 procedente de una muestra de tejido y se extiende para formar una molécula de ácido nucleico complementaria 4025a.

En una etapa siguiente y haciendo referencia ahora a la figura 40B, el ácido nucleico complementario 4025a se inmoviliza a una nanopartícula 4030 a través del elemento de conector 4020 en la sonda de captura 4010. En un ejemplo, la nanopartícula 4030 es una nanopartícula magnéticamente sensible.

En otro aspecto, se proporciona en este documento un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende proporcionar un cebador que comprende una región de captura y un elemento de conector (por ejemplo, un grupo biotina, un grupo tiol u otro conector químico).

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto una muestra de tejido con el cebador y permitir que el cebador hibride con un ácido nucleico procedente de la muestra de tejido.

En algunas realizaciones, el método comprende además extender el cebador para formar una primera hebra complementaria inmovilizada del ácido nucleico hibridado con el cebador.

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la muestra de tejido con una nanopartícula magnéticamente sensible (por ejemplo, una nanopartícula magnéticamente sensible recubierta de estreptavidina), de modo que la posición de la nanopartícula magnéticamente sensible sobre la muestra de tejido pueda correlacionarse con la posición del cebador extendido en la muestra de tejido, e inmovilizar el cebador extendido que comprende la primera hebra inmovilizada del ácido nucleico a la nanopartícula magnéticamente sensible en el elemento de conector.

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la muestra de tejido con una matriz de captura de modo que la posición de un sitio de captura sobre la matriz de captura pueda correlacionarse con una posición en la muestra de tejido, en el que la matriz de captura comprende un sitio de captura que comprende una captura sonda inmovilizada sobre una superficie, en el que la sonda de captura comprende una región escindible, una región de dirección espacial y una región específica de gen.

En algunas realizaciones, el método comprende además aplicar un campo magnético a la matriz de captura y la muestra de tejido para transferir la nanopartícula magnéticamente sensible con la primera hebra complementaria inmovilizada a la matriz de captura y permitir que la primera hebra complementaria inmovilizada se hibride con la región específica de gen de la sonda de captura sobre la matriz de captura.

En algunas realizaciones, el método comprende además extender la región específica de gen de la sonda de captura sobre la matriz de captura para formar una segunda hebra complementaria inmovilizada del ácido nucleico.

En algunas realizaciones, el método comprende además escindir la sonda de captura sobre la matriz de captura para liberar una segunda hebra complementaria marcada espacialmente desde la superficie de la matriz de captura.

En algunas realizaciones, una partícula (por ejemplo, una nanopartícula magnéticamente sensible) puede comprender una sonda inmovilizada que comprende una región de captura (por ejemplo, una región de captura universal o específica de gen) y una primera región de dirección parcial. En algunas realizaciones, la sonda asociada a la partícula puede comprender además una región de cebador de SBS (por ejemplo, una región SBS3 o SBS12) u otra región universal, tal como una región P5 o P7. En algunas realizaciones, las partículas se pueden usar en combinación con una matriz de captura que comprende una sonda de captura que comprende una región escindible, una segunda región de dirección espacial y una región de captura (por ejemplo, una región de captura específica de gen). En algunas realizaciones, la sonda sobre la matriz de captura puede comprender además una región de cebador de SBS (por ejemplo, una región SBS 3 o SBS12) u otra región universal, tal como una región P5 o P7.

Las figuras 41A y 41B ilustran diagramas esquemáticos de un ejemplo de una sonda de captura asociada a una partícula que comprende una primera región de dirección espacial parcial y una segunda sonda de captura de matriz que comprende una segunda región de dirección parcial, respectivamente, para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido. Con referencia ahora a la figura 41A, una sonda de captura asociada a una partícula 4110 comprende una región de captura 4115 (por ejemplo, una región de captura universal o específica de gen) y una primera región de dirección parcial 4120 inmovilizada sobre una partícula 4125. En un ejemplo, la partícula 4125 es una nanopartícula magnéticamente sensible. La sonda de captura 4110 se hibrida con una molécula de ácido nucleico 4130 procedente de una sección de tejido y se extiende (indicado por la flecha) para formar un ácido nucleico complementario con la molécula de ácido nucleico 4130. El ácido nucleico complementario comprende la primera región de dirección parcial 4120 y la partícula 4125. La primera región de dirección parcial 4120 identifica la posición de un sitio de captura a lo largo de una primera dimensión de una matriz de captura. En algunas realizaciones, se usa un campo magnéti

la partícula 4125 a una matriz que comprende una sonda de captura de matriz.

Con referencia ahora a la figura 41B, una sonda de captura de matriz 4135 comprende una región de captura 4140 (por ejemplo, una región de captura específica de gen), una segunda región de dirección parcial 4145 y la región SBS 4150, y una región escindible 4155. La sonda de captura de matriz 4135 puede inmovilizarse sobre la superficie de una matriz de captura (no se muestra) a través de la región escindible 4155. La sonda de captura de matriz 4135 sobre una matriz de captura (no se muestra) puede ponerse en contacto con una muestra de tejido que comprende moléculas de ácido nucleico marcadas con la primera región de dirección parcial 4120 de la figura 41A de manera que la posición de la sonda de captura de matriz 4135 pueda correlacionarse con una posición en la muestra de tejido. La segunda región de dirección parcial 4145 identifica la posición de un sitio de captura a lo largo de una segunda dimensión de una matriz de captura.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende proporcionar una nanopartícula magnéticamente sensible que comprende una sonda de captura inmovilizada que comprende una región de captura y una primera región de dirección espacial parcial.

En algunas realizaciones, la primera región de dirección espacial parcial identifica la posición de un sitio de captura a lo largo de una primera dimensión de una matriz de captura.

En algunas realizaciones, el método comprende además extender la región de captura de la sonda de captura inmovilizada para formar una primera hebra complementaria inmovilizada del ácido nucleico hibridado con la región de captura, en el que la primera hebra complementaria inmovilizada comprende la primera región de dirección parcial.

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la muestra de tejido con una matriz de captura de modo que la posición de un sitio de captura sobre la matriz de captura pueda correlacionarse con una posición en la muestra de tejido, en el que la matriz de captura comprende un sitio de captura que comprende una captura sonda inmovilizada sobre una superficie, en el que la sonda de captura comprende una región escindible, una segunda región de dirección parcial y una región específica de gen.

En algunas realizaciones, la segunda región de dirección espacial parcial identifica la posición de un sitio de captura a lo largo de una segunda dimensión de una matriz de captura.

En algunas realizaciones, el método comprende además aplicar un campo magnético a la matriz de captura y la muestra de tejido para transferir la nanopartícula magnéticamente sensible con la primera hebra complementaria inmovilizada al sitio de captura de una matriz de captura y permitir que la primera hebra complementaria inmovilizada se hibride con la región de captura de la sonda de captura en el sitio de captura de la matriz de captura.

En algunas realizaciones, el método comprende además extender la región de captura de la sonda de captura sobre el sitio de captura para formar una segunda hebra complementaria inmovilizada del ácido nucleico, en el que la segunda hebra complementaria del ácido nucleico comprende la primera y segunda regiones de dirección espacial parcial.

En alguna realización, la combinación de la primera y segunda región de dirección espacial parcial define la posición del sitio de captura sobre la matriz de captura.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende proporcionar una nanopartícula magnéticamente sensible que comprende una sonda de captura inmovilizada que comprende una región de captura.

En algunas realizaciones, la sonda de captura inmovilizada no comprende una región de dirección espacial.

En algunas realizaciones, el método comprende además extender la región de captura de la sonda de captura inmovilizada para formar una primera hebra complementaria inmovilizada del ácido nucleico hibridado con la región de captura.

En algunas realizaciones, la primera hebra complementaria inmovilizada no comprende una región de dirección espacial.

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la muestra de tejido con una matriz de captura de modo que la posición de un sitio de captura sobre la matriz de captura pueda correlacionarse con una posición en la muestra de tejido, en el que la matriz de captura comprende un sitio de captura que comprende una sonda inmovilizada sobre una superficie, en el que la sonda comprende una región de dirección espacial.

En algunas realizaciones, la sonda no comprende una región de captura.

En algunas realizaciones, el método comprende además aplicar un campo magnético a la matriz de captura y la muestra de tejido para transferir la nanopartícula magnéticamente sensible con la primera hebra complementaria inmovilizada al sitio de captura de una matriz de captura, y acoplar la primera hebra complementaria inmovilizada a la región de dirección espacial de la sonda sobre la matriz de captura para inmovilizar la primera hebra complementaria en ambos extremos sobre la matriz de captura y sobre la nanopartícula magnéticamente sensible.

Las figuras 42A y 42B ilustran diagramas esquemáticos de un ejemplo de una sonda de captura asociada a una partícula y una segunda sonda de captura de matriz que comprende una región de dirección espacial, respectivamente, para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido. Con referencia ahora a la figura 42A, una sonda de captura asociada a una partícula 4210 comprende una región de captura 4215 (por ejemplo, una región de captura universal o específica de gen) inmovilizada sobre una nanopartícula magnéticamente sensible 4220. La sonda de captura 4210 se hibrida con una molécula de ácido nucleico 4225 procedente de una sección de tejido y se extiende (indicado por la flecha) para formar un ácido nucleico complementario con la molécula de ácido nucleico 4225. El ácido nucleico complementario comprende la nanopartícula magnéticamente sensible 4220. En algunas realizaciones, se usa un campo magnéti transferencia de la molécula de ácido nucleico complementaria que comprende la nanopartícula magnéticamente sensibles 4220 sobre una matriz que comprende una sonda de captura de matriz.

Con referencia ahora a la figura 42B, una sonda de captura de matriz 4230 comprende una región de dirección espacial 4235 y una región escindible 4240. La sonda de captura de matriz 4230 se puede inmovilizar sobre la superficie de una matriz de captura (no se muestra) a través de la región escindible 4240. La sonda de captura de matriz 4230 sobre una superficie de la matriz de captura (no se muestra) puede ponerse en contacto con una muestra de tejido que comprende las moléculas de ácido nucleico complementarias marcadas con la nanopartícula magnéticamente sensible 4220 de la figura 42A de modo que la posición de la sonda de captura de matriz 4230 se puede correlacionar con una posición en la muestra de tejido. Los ácidos nucleicos complementarios que comprenden la nanopartícula magnéticamente sensible 4220 pueden capturarse sobre la sonda de captura 4230 mediante el acoplamiento con la región de dirección espacial 4235. La región de dirección espacial 4240 identifica la posición de un sitio de captura sobre la matriz.

En algunas realizaciones, la primera hebra complementaria comprende una región de dirección espacial cuando está inmovilizada a ambos extremos sobre la matriz de captura y sobre la nanopartícula magnéticamente sensible.

En algunas realizaciones, la sonda de captura inmovilizada sobre la nanopartícula magnéticamente sensible y la región de dirección espacial opcionalmente comprenden cada una además una región de unión al cebador (por ejemplo, una región de unión al cebador de SBS, tal como una región SBS3 o SBS12). En algunas realizaciones, el método comprende además sintetizar una segunda hebra complementaria usando un par de cebadores complementarios con las regiones de unión al cebador en la primera hebra complementaria, en el que la segunda hebra complementaria comprende la región de dirección espacial, y liberar la segunda hebra complementaria desde la superficie de la matriz de captura. En algunas realizaciones, el método comprende además analizar la secuencia de la segunda hebra complementaria liberada y correlacionar la secuencia de la segunda hebra complementaria liberada con la posición del ácido nucleico en la muestra de tejido.

En algunas realizaciones, la sonda de captura inmovilizada sobre la nanopartícula magnéticamente sensible y la región de dirección espacial comprenden además opcionalmente cada una una región escindible (por ejemplo, la misma región escindible o diferentes regiones escindibles). En algunas realizaciones, el método comprende además liberar la primera hebra complementaria inmovilizada escindiendo las regiones escindibles en la primera hebra complementaria inmovilizada. En algunas realizaciones, el método comprende además analizar la secuencia de la primera hebra complementaria liberada y correlacionar la secuencia de la segunda hebra complementaria liberada con la posición del ácido nucleico en la muestra de tejido.

En algunas realizaciones, una partícula (por ejemplo, una nanopartícula magnéticamente sensible) puede comprender una sonda inmovilizada que comprende una región de captura (por ejemplo, una región de captura universal o específica de gen), una primera región de unión al cebador (por ejemplo, una región de cebador de SBS, tal como una región SBS3 o SBS 12) y una región de dirección espacial. En algunas realizaciones, la sonda asociada a partículas puede comprender además otra región universal, tal como una región P5 o P7. En algunas realizaciones, las partículas se pueden usar en combinación con una matriz de captura que comprende una sonda de captura que comprende esencialmente una segunda región de unión al cebador (por ejemplo, una región de cebador de SBS, como una región SBS 3 o SBS12) y, opcionalmente, otra región universal, tal como una región P5 o P7.

Las figuras 43A y 43B ilustran diagramas esquemáticos de un ejemplo de una sonda de captura asociada a una partícula y una segunda sonda de captura de matriz, respectivamente, para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos de una muestra de tejido. Con referencia ahora a la figura 43A, una sonda de captura asociada a una partícula 4310 comprende una región de captura 4315 (por ejemplo, una región de captura universal o específica de gen), una región de dirección espacial 4320 y un primer sitio de unión al cebador 4325 (por ejemplo, un SBS región de cebador de SBS3) inmovilizada sobre una nanopartícula 4330 magnéticamente sensible. La sonda de captura 4310 se puede poner en contacto con una muestra de tejido (no se muestra), de modo que la posición de la sonda de captura 4310 sobre la muestra de tejido se puede correlacionar con la posición de una molécula de ácido nucleico 4335 en la muestra de tejido. La sonda de captura 4310 se hibrida con la molécula de ácido nucleico 4335 procedente de la sección de tejido y se extiende (indicado por la flecha) para formar un ácido nucleico complementario con la molécula de ácido nucleico 4335. El ácido nucleico complementario (no se muestra) comprende la región de dirección espacial 4320, el primer sitio de unión al cebador 4325 y la nanopartícula magnéticamente sensible 4330. En algunas realizaciones, se usa un campo magnético generado por un imán (no se muestra) para facilitar la transferencia de la molécula de ácido nucleico complementario que comprende la nanopartícula magnéticamente sensible 4330 a una matriz que comprende una sonda de captura de matriz .

Con referencia ahora a la figura 43B, una sonda de captura de matriz 4340 comprende un segundo sitio de unión al cebador 4325a (por ejemplo, una región de cebador de SBS SBS12) que es diferente del primer sitio de unión al cebador 4325 de la figura 43A. La sonda de captura de matriz 4340 puede inmovilizarse en la superficie de una matriz de captura (no se muestra). La sonda de captura de matriz 4340 sobre una superficie de matriz de captura (no se muestra) puede ponerse en contacto con una muestra de tejido que comprende las moléculas de ácido nucleico complementarias marcadas con la nanopartícula magnéticamente sensible 4330 de la figura 43A. El ácido nucleico complementario que comprende la nanopartícula magnéticamente sensible 4330 se puede capturar sobre la sonda de captura 4340 mediante el acoplamiento al segundo sitio de unión al cebador 4325a.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende proporcionar una nanopartícula magnéticamente sensible que comprende una sonda de captura inmovilizada que comprende una región de captura, una primera región de unión al cebador y una región de dirección espacial.

En algunas realizaciones, el método comprende además extender la región de captura de la sonda de captura inmovilizada para formar una primera hebra complementaria inmovilizada del ácido nucleico hibridado con la región de captura, en el que la primera hebra complementaria inmovilizada comprende la región de dirección espacial.

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la muestra de tejido con una matriz de captura de modo que la posición de un sitio de captura sobre la matriz de captura pueda correlacionarse con una posición en la muestra de tejido, en el que la matriz de captura comprende un sitio de captura que comprende una captura sonda inmovilizada sobre una superficie, en el que la sonda de captura comprende esencialmente una segunda región de unión al cebador (por ejemplo, una región de cebador de SBS, tal como una región SBS3 o SBS12).

En algunas realizaciones, el método comprende además aplicar un campo magnético a la matriz de captura y la muestra de tejido para transferir la nanopartícula magnéticamente sensible con la primera hebra complementaria inmovilizada al sitio de captura de una matriz de captura y acoplar la primera hebra complementaria inmovilizada a la sonda de captura. en el sitio de captura de la matriz de captura para inmovilizar la primera hebra complementaria en ambos extremos.

En algunas realizaciones, el método comprende además sintetizar una segunda hebra complementaria usando un cebador complementario con la primera secuencia de unión al cebador de la primera sonda de captura y liberar la segunda hebra complementaria desde la superficie de la matriz de captura.

En algunas realizaciones, el método comprende además analizar la secuencia de la segunda hebra complementaria liberada y correlacionar la secuencia de la segunda hebra complementaria liberada con la posición del ácido nucleico en la muestra de tejido.

La figura 44 ilustra una vista en perspectiva de un sistema de transferencia basado en el magnetismo 4400 que está configurado para la detección espacial y el análisis de ácido nucleico en una muestra de tejido. El sistema de transferencia basado en el magnetismo 4400 incluye la matriz de captura 4410. La matriz de captura 4410 incluye un soporte sólido 4415. En un ejemplo, el soporte sólido 4415 es un sustrato de vidrio plano. Impresos sobre la superficie del soporte sólido 4415 hay una pluralidad de sitios de captura diferenciados ("características espaciales") 4420, que son regiones que contienen oligonucleótidos con dirección espacial. Un ejemplo de un único sitio de captura 4420 se describe con más detalle con referencia a la figura 45. Superpuesto sobre la matriz de captura 4410 hay un sustrato de muestra 4425. En un ejemplo, el sustrato de muestra 4425 es un portaobjetos de vidrio. Se monta una muestra de tejido 4430 sobre la superficie del sustrato de muestra 4425 que está frente a los sitios de captura 4420 sobre la matriz de captura 4410. En un ejemplo, la sección de tejido 4430 es una sección de tejido FFPE. El ácido nucleico (no se muestra) en la muestra de tejido 4430 está marcado con una nanopartícula magnéticamente sensible. Colocado debajo y cerca de la matriz de captura 4410 hay un imán 4435. El imán 4435 puede ser un imán permanente o un electroimán. En un ejemplo, el imán 4435 es un imán móvil. Concretamente, el imán 4435 se puede mover cerca o lejos de la matriz de captura 4410. Se usa un campo magnético generado por el imán 4435 para atraer las moléculas de ácido nucleico marcadas con nanopartículas (no se muestra) desde la sección de tejido 4430 a los sitios de captura 4420 sobre la matriz de captura 4410. El campo magnético generado por el imán 4435 está configurado de manera que la transferencia de ácidos nucleicos desde la muestra de tejido y la pérdida de ácidos nucleicos entre los sitios de captura 4420 se eliminan o reducen sustancialmente.

En otra realización (no se muestra), los sitios de captura 4420 son micropocillos en el soporte sólido 4415. Impresos en la superficie inferior de cada micropocillo están los oligonucleótidos con dirección espacial. En presencia de un campo magnético, los micropocillos actúan para atrapar el ácido nucleico marcado con nanopartículas y eliminar o reducir sustancialmente la agregación de las nanopartículas magnéticamente sensibles.

La figura 45 ilustra una vista lateral de un sitio de captura 4420 sobre la matriz de captura 4410, en la que el único sitio de captura 4420 incluye una pluralidad de sondas de captura. En un ejemplo, una pluralidad de sondas de captura 4510 incluye una secuencia de cebador de SBS 4515 (por ejemplo, SBS3) y una secuencia de dirección espacial 4520. En otro ejemplo (no se muestra), la captura 4510 incluye una secuencia P7, una secuencia de cebador de SBS (por ejemplo, SBS12) y una secuencia de dirección espacial como se describe con más detalle con referencia a la figura 49A. Cada sonda de captura 4510 inmovilizada a un único sitio de captura 4420 incluye la misma secuencia de dirección espacial exclusiva 4520 (por ejemplo, secuencia de dirección espacial 4520a). Por ejemplo, en la figura 45, tanto la sonda de captura 4510a como la sonda de captura 4510b tienen la misma secuencia de dirección espacial exclusiva 4520a. Otros sitios de captura 4420 (no se muestra) incluyen cada uno su propia secuencia de dirección espacial exclusiva 4520 (por ejemplo, secuencias de dirección espacial 4520b, 4520c, 4520d, 4520e, etc.). Por consiguiente, las sondas de captura 4510 inmovilizadas a otros sitios de captura 4420 incluyen cada una su propia secuencia de dirección espacial exclusiva 4520. La secuencia del cebador de SBS 4515 se usa en las etapas de procesamiento posteriores para la preparación de la biblioteca.

La figura 46 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 4600 para transferir ADNc desde una muestra de tejido a una matriz de captura para la generación de una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales usando el sistema de transferencia basado en el magnetismo 4100 de la figura 44 y la figura 45. El método 4600 incluye, pero no se limita a las siguientes etapas.

En la etapa 4610, el ADNc de primera hebra se sintetiza in situ a partir de ARN en una muestra de tejido en una reacción de transcripción inversa (RT). Por ejemplo, un cebador de RT unido a la superficie de una nanopartícula magnéticamente sensible se usa para cebar el ADNc de primera hebra procedente del ARNm en la muestra de tejido 4430 montada sobre el sustrato de muestra 4425. En un ejemplo, el cebador de RT incluye una secuencia de cebador específica de gen y una secuencia del cebador de SBS (por ejemplo, SBS3). En otro ejemplo, el cebador de RT incluye secuencias de cebador aleatorias y una secuencia de cebador de SBS (por ejemplo, SBS3). Debido a que el cebador de RT está unido a la superficie de una nanopartícula magnéticamente sensible, el ADNc de primera hebra se marca con la nanopartícula magnéticamente sensible.

En la etapa 4615, el ADNc de primera hebra se transfiere a una matriz de captura con direcciones espaciales usando un campo magnético. Por ejemplo, el sustrato de muestra 4425 con la muestra de tejido 4430 sobre el mismo se coloca encima de la matriz de captura 4410. El imán 4435 se coloca muy cerca de la matriz de captura 4410. El campo magnético generado por el imán 4435 se usa para atraer el ADNc de primera hebra marcada con nanopartículas procedente de la sección de tejido 4430 sobre los sitios de captura 4420 sobre la matriz de captura 4410. Por consiguiente, el ADNc de primera hebra se inmoviliza en los sitios de captura 4420 mediante el imán 4435.

En una etapa 4620, el ADNc de primera hebra se une covalentemente a las sondas de captura 4510 mediante acoplamiento monocatenario del extremo 3' del ADNc a la secuencia de dirección espacial 4520.

En una etapa 4625, el imán 4435 se aleja de la matriz de captura 4410 de manera que la matriz de captura 4410 ya no esté dentro del campo magnético del imán 4435. A medida que el campo magnético en la matriz de captura 4410 disminuye, el extremo 5' de la molécula de ADNc de primera hebra se libera del sitio de captura 4420. El ADNc de primera hebra ahora está anclado en el sitio de captura 4420 a través de la sonda de captura 4510.

En la etapa 4630, se sintetiza el ADNc de segunda hebra usando un cebador que es complementario con la secuencia del cebador de SBS 4515 sobre las sondas de captura 4510.

En la etapa 4635, el ADNc de segunda hebra se libera desde el sitio de captura 4420. En un ejemplo, el ADNc de segunda hebra se libera del sitio de captura 4420 usando un protocolo de desnaturalización térmica. En otro ejemplo, el ADNc de segunda hebra se libera usando un protocolo de desnaturalización química (por ejemplo, NaOH).

En la etapa 4640, el ADNc de segunda hebra se amplifica para generar una biblioteca de secuenciación.

Las figuras 47A, 47B y 47C muestran gráficamente las etapas del método 4600 de la figura 46. Concretamente, una sección de tejido (no se muestra) incluye una molécula de ARN 4710. La molécula de ARN 4710 puede incluir una mutación 4715. En la etapa 4610, se obtiene el ADNc de primera hebra sintetizado in situ usando un cebador de RT 4720. El cebador de RT 4720 incluye una secuencia de cebador aleatoria 4725 y una secuencia de cebador de SBS 4730 (por ejemplo, SBS3). El cebador de RT 4720 está unido a la superficie de una nanopartícula magnéticamente sensible 4735. Una molécula de ADNc de primera hebra 4740 sintetizada usando el cebador de RT 4720 incluye la secuencia del cebador de SBS 4730 y la nanopartícula magnéticamente sensible 4735.

En la etapa 4615, las moléculas de ADNc de primera hebra 4740 se transfieren desde la sección de tejido (no se muestra) al sitio de captura 4420. El imán 4435 se coloca muy cerca de la matriz de captura 4410. El campo magnético generado por el imán 4435 se usa para atraer moléculas de ADNc de primera hebra 4740 marcadas con nanopartículas desde la sección de tejido (no se muestra) hacia el sitio de captura 4420. Por consiguiente, las moléculas de ADNc de primera hebra 4740 se inmovilizan en los sitios de captura 4420 mediante el imán 4435.

En la etapa 4620, las moléculas de ADNc de primera hebra 4740 se unen covalentemente a las sondas de captura 4510 mediante acoplamiento monocatenario de las moléculas de ADNc 4740 a las secuencias de dirección espacial 4520.

En la etapa 4625, el imán 4435 se aleja de la matriz de captura 4410 de modo que la matriz de captura 4410 ya no esté dentro del campo magnético del imán 4435. A medida que el campo magnético en la matriz de captura 4410 disminuye, el extremo 5' de las moléculas de ADNc de primera hebra 4740 es liberado desde el sitio de captura 4420. Las moléculas de ADNc de primera hebra 4740 están ahora ancladas en el sitio de captura 4420 a través de la sonda de captura 4510.

En la etapa 4630, se sintetiza una molécula de ADNc de segunda hebra 4745 usando un cebador 4515a que es complementario con la secuencia del cebador de SBS 4515 sobre las sondas de captura 4510.

En la etapa 4635, la molécula de ADNc de segunda hebra 4745 se libera del sitio de captura 4420. La molécula de ADNc de segunda hebra 4745 incluye la secuencia del cebador de SBS 4730 (por ejemplo, SBS3), la mutación 4715, la secuencia de dirección espacial 4520 y la secuencia del cebador de SBS 4515 (por ejemplo, SBS12) .

En la etapa 4640, la molécula de ADNc de segunda hebra 4745 se amplifica usando un primer cebador de SBS 4750 y un segundo cebador 4755 para generar una biblioteca de secuenciación. El primer cebador de SBS 4750 incluye una secuencia complementaria de SBS 4730a que es complementaria con la secuencia del cebador de SBS 4730 y una secuencia P54760. El segundo cebador de SBS 4755 incluye una secuencia complementaria de SBS 4515a que es complementaria con la secuencia del cebador de SBS 4515 y una secuencia P74765. Un amplicón de la biblioteca 4770 sintetizado usando los cebadores de SBS 4750 y 4755 incluye la secuencia P54760, la secuencia del cebador de SBS 4730 (por ejemplo, SBS3), la mutación 4715, la secuencia de dirección espacial 4520, la secuencia del cebador de SBS 4515 (por ejemplo, SBS12) y la secuencia P74765.

En otra realización, el ARN en una muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de tejido FFPE) se marca in situ con nanopartículas magnéticamente sensibles y posteriormente se transfiere a una matriz de captura para la generación de una biblioteca de ADNc con direcciones espaciales.

La figura 48 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 4800 de transferencia de ARN desde una muestra de tejido a una matriz de captura para la generación de una biblioteca de secuenciación con direcciones espaciales usando el sistema de transferencia basado en el magnetismo 4400 de la figura 44. El método 4800 incluye, pero no se limita a las siguientes etapas.

En la etapa 4810, el ARN de una muestra de tejido se marca con nanopartículas magnéticamente sensibles. Por ejemplo, un oligonucleótido cebador de SBS unido a la superficie de una nanopartícula magnéticamente sensible se acopla al ARN en una muestra de tejido. A continuación, el extremo 3' de las moléculas de ARN se modifica (es decir, se bloquea) para evitar el acoplamiento no deseado en una etapa de procesamiento posterior.

En una etapa 4815, el ARN marcado se transfiere al sitio de captura 4420 usando un campo magnético como se describió anteriormente para el ADNc en la etapa 4615 del método 4600 de la figura 46.

En la etapa 4820, se sintetiza el ADNc de primera hebra a partir del ARN transferido en una reacción de RT. Por ejemplo, se usa un cebador de RT que incluye una secuencia de cebador específica de gen y un oligonucleótido de acoplamiento para cebar el ADNc de primera hebra. En otro ejemplo, se usa un cebador de RT que incluye secuencias de cebadores aleatorias y un oligonucleótido de acoplamiento para cebar el ADNc de primera hebra.

En la etapa 4825, el ADNc de primera hebra se une covalentemente a las sondas de captura sobre el sitio de captura 4420 mediante acoplamiento monocatenario. Las sondas de captura se describen con más detalle con referencia a la figura 49A.

En una etapa 4830, el molde de ARN utilizado para generar el ADNc se libera del sitio de captura 4420. Por ejemplo, el imán 4435 se aleja de la matriz de captura 4410. De ese modo, se disminuye el campo magnético en el sitio de captura 4420 y se libera la nanopartícula magnéticamente sensible de los sitios de captura de superficie 4420. Los dúplex de ARN:ADNc se disocian usando un protocolo de tratamiento térmico. El ADNc de primera hebra se ancla en el sitio de captura 4420 a través del acoplamiento a las sondas de captura.

En la etapa 4835, se sintetiza el ADNc de segunda hebra en una reacción de extensión. Por ejemplo, se usa un cebador que incluye una secuencia que es complementaria con la secuencia del cebador de SBS en el ADNc y una secuencia P5 para cebar la síntesis de ADNc de segunda hebra.

En la etapa 4840, las moléculas de la biblioteca de ADNc se liberan del sitio de captura 4420 mediante desnaturalización.

Las figuras 49A, 49B y 49C muestran gráficamente las etapas del método 4800 de la figura 48. Concretamente, una sección de tejido (no se muestra) incluye una molécula de ARN 4910. La molécula de ARN 4910 puede incluir una mutación 4915. En la etapa 4810, un oligonucleótido cebador de SBS 4920 unido a la superficie de una nanopartícula magnéticamente sensible 4925 se acopla in situ a la molécula de ARN 4910. El extremo 3' de la molécula de ARN 4910 luego se modifica (es decir, se bloquea) para evitar el acoplamiento no deseado en una etapa de procesamiento posterior.

En la etapa 4815, la molécula de ARN 4910 con la nanopartícula de respuesta magnética 4925 sobre la misma se transfiere desde la sección de tejido (no se muestra) al sitio de captura 4420 usando un campo magnético como se describió anteriormente para el ADNc en la etapa 4615 del método 4600 de la figura 46. En este ejemplo, el sitio de captura 4420 incluye una sonda de captura 4935. La sonda de captura 4935 incluye una secuencia P7 4940, una secuencia de cebador de SBS 4945 (por ejemplo, SBS12) y una secuencia de dirección espacial 4950.

En la etapa 4820, el ADNc se sintetiza a partir de la molécula de ARN 4910 en una reacción de RT. Por ejemplo, un cebador de RT 4955 que incluye una secuencia de cebador específica de gen 4960 y un oligonucleótido de acoplamiento 4965 se usa para cebar el ADNc de primera hebra.

En la etapa 4825, una molécula de ADNc 4970 que incluye la secuencia del cebador de SBS 4920 (por ejemplo, SBS3) y el oligonucleótido de acoplamiento 4965 se une covalentemente a la sonda de captura 4935 mediante acoplamiento monocatenario del oligonucleótido de acoplamiento 4965 a la secuencia de dirección espacial 4950.

En la etapa 4830, la molécula de ARN 4910 se libera del sitio de captura 4420. Por ejemplo, el imán 4435 se aleja del sitio de captura 4420. De ese modo, se disminuye el campo magnético en el sitio de captura 4420 y se libera la nanopartícula magnéticamente sensible 4925 unida a la molécula de ARN 4910 desde el sitio de captura de superficie 4420. El dúplex de ARN:ADNc (es decir, dúplex de la molécula de ARN 4910:molécula de ADNc 4970) se disocia entonces usando un protocolo de tratamiento térmico. La molécula de ADNc 4970 está ahora anclada en el sitio de captura 4420 por la sonda de captura 4935.

En la etapa 4835, se copia la molécula de ADNc 4970 en una reacción de extensión. Por ejemplo, un cebador 4975 que incluye una secuencia 4920a que es complementaria con la secuencia del cebador de SBS 4920 (por ejemplo, SBS3) y una secuencia P54980 se usa para cebar la síntesis de ADNc de segunda hebra. La molécula de ADNc 4970 ahora incluye la secuencia P74940, la secuencia del cebador de SBS 4945 (por ejemplo, SBS12), la secuencia de dirección espacial 4950, el oligonucleótido de acoplamiento 4965, la mutación 4915, la secuencia del cebador de SBS 4920 (por ejemplo, SBS3) y la secuencia P54980.

En la etapa 4840, se libera una molécula de ADNc 4970 del sitio de captura 4420 mediante desnaturalización (por ejemplo, desnaturalización térmica o química). La molécula de ADNc 4970 ya está lista para secuenciar.

4.7 Perfiles de tejidos espaciales basados en ADN

Las técnicas descritas proporcionan métodos de detección y análisis espacial (por ejemplo, análisis mutacional o detección de variación de un solo nucleótido (SNV)) de ADN genómico en una muestra de tejido. En un ejemplo, la muestra de tejido es una muestra de tejido FFPE. La detección espacial y el análisis del ADN en una muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de FFPE) tiene varias ventajas en comparación con la detección espacial y el análisis de ARN en una muestra de tejido: (1) el ADN es más estable que el ARN; (2) los fragmentos de ADN en una muestra de tejido FFPE son más largos (por ejemplo, 300-400 pb) en comparación con los fragmentos de ARN en una muestra de tejido FFPE (por ejemplo, 100-200 pb); (3) las moléculas de ARN expresadas a un nivel relativamente bajo pueden ser indetectables; y (4) los cambios en los genes supresores de tumores se detectan en el ADN mientras que no se detectan en el ARN.

Una desventaja de usar ADN para la elaboración de perfiles de tejido espaciales es que para la mayoría de los genes puede haber solo 2 copias de un gen por célula. Los métodos descritos en este documento incluyen una etapa inicial de preamplificación del genoma completo in situ que se usa para aumentar el número de copias del gen antes de realizar otras etapas del proceso bioquímico.

La figura 50 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 5000 para obtener el perfil del ADN genómico en una muestra de tejido. En un ejemplo, el método 5000 se utiliza para obtener el perfil de las SNV de interés en el ADN genómico. El método 5000 incluye, pero no se limita a las siguientes etapas.

En la etapa 5010, se imprime un sustrato de vidrio con cebadores de PCR con dirección espacial para formar una matriz de características espaciales. En un ejemplo, los cebadores de PCR con dirección espacial se imprimen sobre un cubreobjetos de 2 cm x 2 cm para formar una matriz de características espaciales que tiene 100 gm de diámetro con una altura de 35 gm. En otro ejemplo, los cebadores de PCR con dirección espacial se imprimen en micropocillos fabricados sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio. Los cebadores de PCR con dirección espacial se imprimen sobre un cubreobjetos o portaobjetos de vidrio utilizando, por ejemplo, tecnologías de impresión disponibles en el mercado. Los cebadores de PCR con dirección espacial incluyen una secuencia de cebador aleatoria, una secuencia de dirección espacial, una secuencia de cebador de SBS y una marcador de biotina como se describe con más detalle con referencia a la figura 51. Los cebadores de PCR con dirección espacial también pueden incluir una modificación en el extremo 5 ' de la molécula para la unión reversible al cubreobjetos. En un ejemplo, los cebadores de PCR con dirección espacial pueden incluir una modificación de disulfuro 5' como se describe para la sonda de captura con dirección espacial 3100 del proceso 3200 de las figuras 32A, 32B y 32C. En otro ejemplo, los cebadores de PCR con dirección espacial pueden incluir un conector fotoescindible 5' como se describe para la sonda de captura con dirección espacial 3100 del proceso 3300 de las figuras 33A, 33B y 33C.

En la etapa 5015, se dispensa una disolución de mezcla maestra de PCR sobre la superficie de una sección de tejido FFPE semipermeabilizada montada sobre un portaobjetos de vidrio. La disolución de mezcla maestra de PCR incluye, por ejemplo, dNTP, ADN polimerasa, MgCl²y tampones de reacción.

En una etapa 5020, el sustrato de vidrio con los cebadores de PCR con dirección espacial sobre el mismo se coloca encima de la sección de tejido FFPE semipermeabilizada, de modo que la superficie del sustrato de vidrio con los cebadores de PCR con dirección espacial sobre el mismo esté en contacto con la sección de tejido. Los cebadores de PCR con dirección espacial se liberan desde la superficie del sustrato de vidrio hacia el espacio celular de la sección de tejido.

En la etapa 5025, el ADN genómico se amplifica mediante amplificación isotérmica in situ. En un ejemplo, la reacción de amplificación es una reacción de amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA). La tabla 1 a continuación muestra otros ejemplos de métodos de amplificación de ADN isotérmicos que pueden usarse para amplificar el ADN genómico. En otro ejemplo, se usa una reacción de amplificación del genoma completo basada en PCR convencional para amplificar el ADN genómico. En un ejemplo, el método convencional basado en PCR es una PCR de preamplificación de extensión de cebadores mejorada (iPEP PCR). En otro ejemplo, el método convencional basado en PCR es una PCR cebada con oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR; por ejemplo, kit Rubicon Picoplex).

Tabla 1. Resumen de los métodos de amplificación de ácidos nucleicos isotérmicos

Volumen

Método* ^Tiempo

_cación ^dede Objetivo Límite de _amplifidetección reacción

MDA 10-16 h ADN genómico de E. coli -

dentro de

gen mecA gen de Staphylo
menos de 10 copias

RPA

1 h 9 nL ^{ADN ge}

_e ^nó

_a ^m

_la ^ico

_me ^d

_ti ^e

_cilin ^S

_a ^{taphylococcus aur} _resistent ^eus 300 copias/mL

* LAMP = amplificación isotérmica mediada por bucle; HDA = amplificación dependiente de helicasa; MDA = amplificación de desplazamiento múltiple; RCA = amplificación de círculo rodante; RPA = amplificación con polimerasa recombinasa

En una etapa 5030, la muestra de tejido semipermeabilizada con el ADN genómico amplificado sobre ella se retira de la superficie del portaobjetos de vidrio y se recoge en un tubo de recogida. En un ejemplo, la muestra de tejido semipermeabilizado con el ADN genómico amplificado sobre ella se extrae del portaobjetos de vidrio raspando hacia un tubo Eppendorf. Debido al marcador de biotina en el cebador de PCR utilizado en la reacción de amplificación, el ADN amplificado está biotinilado. El ADN biotinilado amplificado se purifica utilizando un protocolo de purificación basado en esferas de estreptavidina.

En la etapa 5035, los cebadores de PCR monocatenarios residuales se eliminan mediante digestión usando una exonucleasa 3' a 5'.

En la etapa 5040, el ADN se amplifica en una reacción de PCR múltiplex dirigida a las SNV de interés. Por ejemplo, un cebador directo incluye una secuencia específica de gen que se dirige a una SNV de interés, una secuencia de cebador de SBS (por ejemplo, SBS3) y una secuencia P5. Un cebador inverso incluye secuencias complementarias de SBS12 y una secuencia P7. En otro ejemplo, se usa una estrategia similar a TSCA para dirigirse a regiones de ADN de interés.

En la etapa 5045, se secuencia el producto de PCR.

La figura 51 ilustra un diagrama de un cebador de PCR con dirección espacial 5100 para la preamplificación y la indexación espacial de ADN genómico completo. El cebador de PCR con dirección espacial 5100 incluye una secuencia de cebador aleatorio 5110, una secuencia de dirección espacial 5115 y una secuencia de cebador de SBS 5120 (por ejemplo, SBS12). La secuencia de cebador aleatorio 5110 es una secuencia de 9 pb que se utiliza para amplificar el ADN genómico en una reacción de preamplificación del genoma completo. La secuencia de dirección espacial 5115 es una secuencia exclusiva para cada sitio de captura (característica espacial) sobre una matriz. La secuencia del cebador de SBS 5120 incluye el marcador de biotina 5125. El marcador de biotina 5125 se usa para purificar el ADN amplificado en etapas de procesamiento posteriores.

Las figuras 52A y 52B muestran gráficamente las etapas del método 5000 de la figura 50. En la etapa 5010, se imprime un sustrato de vidrio 5210 con cebadores de PCR con dirección espacial (no se muestra) para formar una matriz de características espaciales 5215. En este ejemplo, el sustrato de vidrio 5210 es un cubreobjetos de 2 cm x 2 cm con características espaciales de 100 gm de diámetro. Los cebadores de PCR con dirección espacial son, por ejemplo, el cebador de PCR con dirección espacial 5100 de la figura 51.

En la etapa 5015, una sección de tejido semipermeabilizada 5220 montada sobre un portaobjetos de vidrio 5225 se recubre con una disolución de mezcla maestra de PCR 5230. La muestra de tejido semipermeabilizada 5220 incluye una célula 5235. La célula 5235 incluye una molécula de ADN genómico 5240. La molécula de ADN genómico 5240 puede incluir una variación de un solo nucleótido (SNV) 5245.

En la etapa 5020, el sustrato de vidrio 5210 se coloca encima de la sección de tejido 5220 y la disolución de mezcla maestra de PCR 5230 de manera que el sustrato de vidrio de superficie 5210 con los cebadores de PCR con dirección espacial 5100 sobre el mismo (no se muestra) esté en contacto con la sección de tejido 5220. Los cebadores de PCR 5100 (no se muestra) se liberan desde la superficie del sustrato de vidrio 5210 hacia el espacio celular de la sección de tejido 5220.

En la etapa 5025, el ADN genómico se amplifica mediante amplificación isotérmica in situ utilizando cebadores de PCR 5100.

En la etapa 5030, la sección de tejido 5220 con el ADN amplificado 5260 sobre ella se retira de la superficie del portaobjetos de vidrio 5225 y se recoge en un tubo de recogida 5255. En un ejemplo, el tubo de recogida 5255 es un tubo Eppendorf. Debido al marcador de biotina 5125 sobre el cebador de PCR 5100, el ADN amplificado 5260 está biotinilado.

En la etapa 5035 (no mostrado en la figura 52), el ADN amplificado 5260 se purifica usando un protocolo de purificación basado en esferas de estreptavidina.

En la etapa 5040 (no mostrado en la figura 52), los cebadores de PCR monocatenarios residuales 5100 se eliminan mediante digestión usando una exonucleasa 3' a 5'.

En la etapa 5045, las moléculas de ADN 5260 se amplifican en una reacción de PCR múltiplex específica de diana. Por ejemplo, un cebador directo 5265 incluye una secuencia específica de gen 5270 que se dirige a la SNV 5240, una secuencia de cebador de SBS 5275 (por ejemplo, SBS3) y una secuencia P55280. Un cebador inverso 5285 incluye una secuencia complementaria DE SBS12 5120a y una secuencia P7 5290. Un amplicón de la biblioteca 5295 sintetizado usando el cebador directo 5265 y el cebador inverso 5285 incluye la secuencia P55285, la secuencia del cebador de SBS 5275, la SNV 5240, la secuencia de dirección espacial 5115, la secuencia del cebador de SBS 5120 y la secuencia P75290.

4.8 Compartimentación espacial

Para limitar la difusión de oligonucleótidos con dirección espacial (y otros componentes o productos de reacción) sobre una sección de tejido y mantener la resolución espacial, puede usarse la compartimentación de reacciones bioquímicas en "reactores de micropocillos'' o "microrreactores". La compartimentación espacial se puede combinar con cualquiera de las técnicas bioquímicas descritas en este documento para la caracterización de transcriptomas y/o de la variación genómica en tejidos mientras se conserva la información espacial relacionada con el origen de los ácidos nucleicos diana en el tejido.

La figura 53 ilustra una vista en perspectiva de un ejemplo de una superposición de reactor de micropocillos 5300. La superposición de reactor de micropocillos 5300 incluye un portaobjetos de vidrio 5310. Montado encima del portaobjetos de vidrio 5310 hay una sección de tejido 5315. En un ejemplo, la sección de tejido 5315 es una sección de tejido FFPE. Se dispensa un fluido de reacción 5320 sobre el portaobjetos de vidrio 5310 de manera que la sección de tejido 5315 esté cubierta por el fluido de reacción 5320. En un ejemplo, el fluido de reacción 5320 es una disolución de mezcla maestra de PCR utilizada en una reacción de amplificación. En otro ejemplo, el fluido de reacción 5320 es una disolución de mezcla de transcripción inversa. Se coloca un sustrato de micropocillos 5325 sobre el fluido de reacción 5320 y la sección de tejido 5315 sobre el portaobjetos de vidrio 5320. El sustrato de micropocillos 5325 incluye una pluralidad de micropocillos 5330. Impreso sobre la superficie inferior de cada micropocillo 5330 hay una pluralidad de oligonucleótidos con dirección espacial (no se muestra). Los micropocillos 5330 actúan como cámaras de reacción compartimentadas para realizar una reacción bioquímica (por ejemplo, amplificación por PCR). Los micropocillos 5330 se describen con más detalle con referencia a la figura 54.

La figura 54 ilustra una vista en perspectiva de un solo micropocillo 5330 de la superposición de reactor de micropocillos 5300 de la figura 53. En este ejemplo, el micropocillo 5330 tiene un diámetro de aproximadamente 200 gm y una altura de aproximadamente 100\gm. El volumen del micropocillo 5350 es de aproximadamente 3 nL. Impreso sobre la superficie inferior del micropocillo 5350 hay una pluralidad de oligonucleótidos con dirección espacial 5410. Los oligonucleótidos con dirección espacial 5410 incluyen una secuencia de dirección espacial exclusiva para cada micropocillo 5330.

Las figuras 55A y 55B ilustran un ejemplo de un proceso 5500 de fabricación del sustrato de micropocillos 5325 de la superposición de reactor de micropocillos 5300 de la figura 53. En este ejemplo solo se muestra una porción del sustrato de micropocillos 5325.

En una primera etapa y con referencia ahora a la figura 55A, el sustrato de micropocillos 5325 incluye un sustrato de vidrio 5510. En un ejemplo, el sustrato de vidrio 5510 es un sustrato de vidrio hidrófilo que tiene aproximadamente 1 mm de espesor. Se dispone una capa de poliimida 5515 sobre la superficie del sustrato de vidrio 5510. En un ejemplo, la capa de poliimida 5515 es una capa de Kapton negra que tiene aproximadamente 100 gm de espesor. Se dispone una capa hidrófoba 5520 sobre la superficie de la capa de poliimida 5515. En un ejemplo, la capa hidrófoba 5520 se forma silanizando la capa de poliimida 5515.

En una etapa siguiente y con referencia ahora a la figura 55B, se forma una pluralidad de micropocillos 5525 en la capa de poliimida 5515. En este ejemplo, se muestran dos micropocillos 5525, pero se puede usar cualquier número y disposición de micropocillos 5525. En un ejemplo, los micropocillos 5525 se forman en la capa de poliimida 5515 usando ablación con láser ultravioleta precisa para eliminar porciones de la capa de poliimida 5515 y la capa hidrófoba 5520. En este ejemplo, los micropocillos 5525 tienen aproximadamente 200 gm de diámetro. La tabla 2 a continuación muestra otros ejemplos de dimensiones adecuadas para los micropocillos 5525. Los micropocillos 5525 son regiones hidrófilas que actúan como cámaras de reacción para realizar reacciones bioquímicas. Debido a la presencia de la capa hidrófoba 5520 en las regiones intersticiales entre los micropocillos 5525, la difusión lateral de los componentes o productos de reacción se elimina o se reduce sustancialmente. El volumen relativamente pequeño del micropocillo 5525 proporciona un volumen de reacción pequeño y reacciones de mayor eficacia. La compartimentación (confinamiento) de oligonucleótidos con dirección espacial dentro de los micropocillos 5525 también evita la necesidad de etapas de proceso que pueden ser necesarias para liberar los oligonucleótidos impresos desde la superficie de un sustrato de vidrio.

La figura 56 ilustra una vista lateral de un ejemplo de una estructura de micropocillos 5600 para la captura y compartimentación espacial de ácidos nucleicos de una muestra de tejido. La estructura de micropocillos 5600 incluye un sustrato 5610. En un ejemplo, el sustrato 5610 es un portaobjetos de vidrio. El sustrato 5610 incluye una matriz de micropocillos 5615. En un ejemplo, los micropocillos 5615 se forman en el sustrato 5610 usando un proceso de grabado, tal como por ablación precisa con láser ultravioleta. Los micropocillos 5615 son regiones hidrófilas, mientras que las regiones intersticiales entre los micropocillos 5615 son regiones hidrófobas. Los micropocillos 5615 actúan como cámaras de reacción para realizar reacciones bioquímicas (por ejemplo, transcripción inversa de ARN a ADNc, amplificación de ADN genómico). Debido a que las regiones intersticiales entre los micropocillos 5615 son hidrófobas, la difusión lateral de los componentes o productos de reacción fuera de los micropocillos 5615 se elimina o se reduce sustancialmente. En un ejemplo, los micropocillos 5615 tienen un diámetro de aproximadamente 1 mm y una altura de aproximadamente 100 gm. El espacio entre los micropocillos 5615 es de aproximadamente 1 mm.

En cada micropocillo 5615 se deposita una cantidad de material de gel 5620. La cantidad de material de gel 5620 depositada en cada micropocillo 5615 se selecciona de manera que, como el material de gel 5620 se hidrata posteriormente, el material de gel 5620 se hincha para llenar y sobresalir de los micropocillos 5615 sin entrar en contacto con los micropocillos adyacentes 5615. En un ejemplo, el material de gel 5620 es un material de hidrogel, tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-coacrilamida) (PAZAM) que está funcionalizado con oligonucleótidos de captura con dirección espacial unidos covalentemente (no se muestra). Los oligonucleótidos de captura con dirección espacial (no se muestra) incluyen una secuencia de dirección espacial que es exclusiva para cada micropocillo 5615. Los oligonucleótidos de captura con dirección espacial también incluyen una secuencia de captura para la captura de ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN o ADN genómico) de una sección de tejido. La secuencia de captura puede ser, por ejemplo, una secuencia de captura específica de gen o una secuencia de captura universal. El material de gel 5620 se puede depositar en cada micropocillo 5615 mediante impresión (por ejemplo, impresión por contacto o impresión piezoeléctrica).

La figura 57 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 5700 para capturar ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido usando la estructura de micropocillos 5600 de la figura 56 para la preparación de una biblioteca de secuenciación. El método 5700 incluye, pero no se limita a las siguientes etapas.

En una etapa 5710, se deposita una cantidad de material de gel 5620 en cada micropocillo 5615 de la estructura de micropocillos 5600, de modo que cada micropocillo 5615 incluye material de gel 5620 que tiene una secuencia de dirección espacial exclusiva sobre él. En algunas realizaciones, la estructura de micropocillos 5600 que tiene el material de gel 5620 depositado sobre la misma puede almacenarse durante un período de tiempo antes de su uso.

En una etapa 5715, en el momento de uso, la estructura de micropocillos 5600 se sumerge en una disolución de reacción bioquímica para hidratar el material de gel 5620. En algunas realizaciones, la disolución de reacción bioquímica incluye transcriptasa inversa y componentes de reacción para sintetizar ADNc a partir de ARN diana en una muestra de tejido. En algunas realizaciones, la disolución de reacción bioquímica incluye ADN polimerasa y componentes de reacción para producir múltiples amplicones de ADN genómico a partir de genes diana en una muestra de tejido. La estructura de micropocillos 5600 se sumerge en la disolución de reacción bioquímica durante un período de tiempo suficiente para la hidratación del material de gel 5620. A medida que se hidrata el material de gel 5620, el material de gel 5620 se hincha para llenar y sobresalir de los micropocillos 5615. La estructura de micropocillos 5600 después se retira de la disolución de reacción bioquímica. Debido a que la región intersticial entre los micropocillos 5615 es hidrófoba, no queda disolución de reacción bioquímica entre los micropocillos 5615. Los oligonucleótidos de captura con dirección espacial unidos covalentemente al material de gel 5620 se localizan en cada micropocillo 5615.

En una etapa 5720, se coloca una sección de tejido encima de la estructura de micropocillos 5600 de manera que la sección de tejido esté en contacto con el material de gel hidratado 5620 que tiene oligonucleótidos de captura con dirección espacial sobre él. En un ejemplo, la sección de tejido es una sección de tejido FFPE semipermeabilizada. Cuando la sección de tejido entra en contacto con el material de gel hidratado 5620 que tiene oligonucleótidos de captura con dirección espacial sobre él, se inicia la reacción bioquímica. Debido a que las regiones intersticiales entre los micropocillos 5615 son hidrófobas, los componentes y productos de reacción se localizan en cada micropocillo 5615.

En una etapa 5725, los productos de reacción (por ejemplo, ADNc o ADN) se retiran del material de gel 5620. Los productos de reacción se pueden purificar del PAZAM usando métodos de purificación de esferas. En la etapa 5730, se prepara una biblioteca de secuenciación.

La figura 58A ilustra una vista lateral de un ejemplo de un sistema de clavijas 5800 para la escisión de tejido y la preparación de una biblioteca de ácidos nucleicos con direcciones espaciales. El sistema de clavijas 5800 incluye una estructura de clavija 5810 y un bloque de micropocillos 5815. La estructura de clavija 5810 incluye un sustrato 5820. En un ejemplo, el sustrato 5820 es un sustrato de vidrio. Del sustrato 5820 sobresale una matriz de clavijas 5825. En un ejemplo, las clavijas 5825 están formadas de un material de vidrio. En un ejemplo, las clavijas 5825 tienen un diámetro de aproximadamente 100 gm y una altura de aproximadamente 10 gm a aproximadamente 20 gm. El espacio entre las clavijas 5825 es de aproximadamente 100 gm. En el extremo de cada clavija 5825 hay una superficie de escisión 5830. La superficie de escisión 5830 puede tener cualquier forma que facilite la extracción de una muestra de tejido de una sección de tejido. Los ejemplos de diferentes superficies de escisión se describen con más detalle con referencia a la figura 58B. Las clavijas 5825 se pueden revestir con una sustancia (no se muestra) para facilitar la adherencia del tejido a las clavijas 5825. En un ejemplo, las clavijas 5825 se pueden revestir con polilisina. En otro ejemplo, las clavijas 5825 se revisten con un material adhesivo. En otro ejemplo más, las clavijas 5825 se revisten con PAZAM. El sustrato 5820 también incluye orificios de alineación 5835. En este ejemplo, se muestran dos orificios de alineación 5835, pero se puede usar cualquier número de orificios de alineación 5835. Los orificios de alineación 5835 se utilizan para alinear la estructura de clavijas 5810 con el bloque de micropocillos 5815.

El bloque de micropocillos 5815 incluye un sustrato 5840. El sustrato 5840 incluye una matriz de micropocillos 5845. Los micropocillos 5845 están dispuestos para alinearse con las clavijas 5825 en la estructura de clavijas 5810. Los micropocillos 5845 se cargan con una cantidad de una mezcla de reacción bioquímica 5850. En varias realizaciones, la mezcla de reacción bioquímica 5850 incluye oligonucleótidos de captura con dirección espacial para dirigirse y marcar ácidos nucleicos en una muestra de tejido. Los oligonucleótidos de captura con dirección espacial (no se muestra) en la mezcla de reacción bioquímica 5850 incluyen una secuencia de dirección espacial que es exclusiva para cada micropocillo 5845. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción bioquímica 5850 incluye oligonucleótidos de captura con dirección espacial, transcriptasa inversa y componentes de reacción para sintetizar ADNc a partir de ARN diana en una muestra de tejido. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción bioquímica 5850 incluye oligonucleótidos de captura, ADN polimerasa y componentes de reacción con dirección espacial para producir múltiples amplicones de ADN genómico a partir de genes diana en una muestra de tejido. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción bioquímica 5850 es una disolución de aproximadamente 1 ul en volumen. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción bioquímica 5850 es una mezcla de reacción deshidratada o parte de la misma que se rehidrata antes de usar el bloque de micropocillos 5815. Los micropocillos 5845 con la mezcla de reacción bioquímica 5850 están cubiertos con una película perforable 5855, tal como una lámina. El bloque de micropocillos 5815 también incluye clavijas de alineación 5860. En este ejemplo, se muestran dos clavijas de alineación 5860, pero se puede usar cualquier número de clavijas de alineación 5860. El bloque de micropocillos 5815 se alinea con la estructura de clavijas 5810 ajustando las clavijas de alineación 5860 del bloque de micropocillos 5815 en los orificios de alineación 5835 de la estructura de clavijas 5810.

La figura 58B ilustra ejemplos de diferentes superficies de escisión 5830 para las clavijas 5825 sobre la estructura de clavijas 5810 de la figura 58A. En un ejemplo, la superficie de escisión 5830a tiene forma cóncava. En otro ejemplo, la superficie de escisión 5830b tiene forma de "v". En otro ejemplo más, la superficie de escisión 5830c tiene una forma de borde dentado relativamente poco profundo. En otro ejemplo más, la superficie de escisión 5830d tiene una forma de borde dentado relativamente profundo.

La figura 59 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 5900 para capturar ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido usando el sistema de clavijas 5800 de la figura 58A para la preparación de una biblioteca de secuenciación. En este ejemplo, la estructura de clavijas 5810 se usa como una estructura de clavijas "táctil" para ponerse en contacto con una sección de tejido montada sobre un sustrato sólido y extraer muestras de tejido para su posterior traslado al bloque de micropocillos 5815 para la captura de ácidos nucleicos. El método 5900 incluye, pero no se limita a las siguientes etapas.

En la etapa 5910, se recogen muestras de tejido procedentes de una sección de tejido utilizando la estructura de clavijas 5810. Por ejemplo, una sección de tejido sobre un portaobjetos de vidrio se pone en contacto con clavijas 5825 de modo que la muestra de tejido se adhiere a las superficies de escisión 5830. A medida que se retira la estructura de clavijas 5810 de la superficie de la sección de tejido, se extraen muestras de tejido adherentes de la sección de tejido. En un ejemplo, la sección de tejido es una sección de tejido FFPE semipermeabilizada.

En una etapa 5915, la estructura de clavijas 5810 que tiene muestras de tejido sobre ella se traslada al bloque de micropocillos 5815. Por ejemplo, la estructura de clavijas 5810 se alinea y se acopla al bloque de micropocillos 5815. Al hacerlo, se rompe la película perforable 5855 y las clavijas 5825 que tienen las muestras de tejido sobre ellas se sumergen en la mezcla de reacción bioquímica 5850 dentro de los micropocillos 5845.

En una etapa 5920, en un período de incubación, se realiza la reacción bioquímica.

En una etapa 5925, la estructura de clavijas 5810 se retira del bloque de micropocillos 5815 y la mezcla de reacción bioquímica que tiene productos de reacción (por ejemplo, ADNc o amplicones de ADN genómico) se recoge de los micropocillos 5845.

En la etapa 5930, se prepara una biblioteca de secuenciación.

La figura 60 ilustra vistas laterales del sistema de clavijas 5800 de la figura 58A y muestra gráficamente las etapas 5910 y 5915 del método 5900 de la figura 59. Concretamente, en la etapa 5910, una sección de tejido 6010 (por ejemplo, una sección de tejido FFPE) encima de un portaobjetos de vidrio 6015 se pone en contacto con la estructura de clavijas 5815 del sistema de clavijas 5800. El tejido en contacto con las superficies de escisión 5830 se adhiere a las clavijas 5825. A medida que la estructura de clavijas 5815 se retira de la superficie de la sección de tejido 6010, las muestras de tejido adherentes 6020 se retiran de la sección de tejido.

En la etapa 5915, la estructura de clavijas 5810 que tiene muestras de tejido 6020 sobre ella se traslada al bloque de micropocillos 5815. Por ejemplo, la estructura de clavijas 5810 se alinea y se acopla al bloque de micropocillos 5815. Al hacerlo, se rompe la película perforable 5855 y las clavijas 5825 que tienen las muestras de tejido 6020 sobre las mismas se sumergen en la mezcla de reacción bioquímica 5850 dentro de los micropocillos 5845.

La figura 61 ilustra un diagrama de flujo de otro ejemplo de un método 6100 para capturar ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido usando el sistema de clavijas 5800 de la figura 58A para la preparación de una biblioteca de secuenciación. En este ejemplo, la estructura de clavijas 5810 se usa como una estructura de clavijas de "empuje" para ponerse en contacto con una sección de tejido montada sobre un sustrato perforable y empujar las muestras de tejido directamente hacia el interior de los micropocillos 5845 para la captura de ácidos nucleicos. El método 6100 incluye, entre otros, las siguientes etapas.

En una etapa 6110, se coloca una sección de tejido montada sobre un sustrato perforable sobre el bloque de micropocillos 5815, concretamente, encima de la película perforable 5855 del bloque de micropocillos 5815. En un ejemplo, la sección de tejido es una sección de tejido FFPE semipermeabilizada.

En una etapa 6115, la estructura de clavijas 5810 se traslada al bloque de micropocillos 5815. Por ejemplo, la estructura de clavijas 5810 se alinea y se acopla al bloque de micropocillos 5815. Al hacerlo, tanto el sustrato perforable que tiene la sección de tejido sobre el mismo como la película perforable 5855 se rompen y las clavijas 5825 que tienen muestras de tejido sobre ellas se sumergen en la mezcla de reacción bioquímica 5850 dentro de los micropocillos 5845.

En una etapa 6120, en un período de incubación, se realiza la reacción bioquímica.

En una etapa 6125, la estructura de clavijas 5810 se retira del bloque de micropocillos 5815 y la mezcla de reacción bioquímica con los productos de reacción (por ejemplo, ADNc o amplicones de ADN genómico) en la misma se recoge de los micropocillos 5845.

En la etapa 6130, se prepara una biblioteca de secuenciación.

La figura 62 ilustra vistas laterales del sistema de clavijas 5800 de la figura 58A y muestra gráficamente las etapas 6110 y 6115 del método 6100 de la figura 61. Concretamente, en la etapa 6110, una sección de tejido 6210 (por ejemplo, una sección de tejido FFPE) montada sobre un sustrato perforable 6215 se coloca encima del bloque de micropocillos 5815. En la etapa 6115, la estructura de clavijas 5810 se traslada al bloque de micropocillos 5815. Por ejemplo, la estructura de clavijas 5810 se alinea y se acopla al bloque de micropocillos 5815. Al hacerlo, el sustrato perforable 6215 que tiene una sección de tejido 6210 sobre el mismo y la película perforable 5855 se rompen ambos y las clavijas 5825 que tienen las muestras de tejido 6225 sobre ellas se sumergen en la mezcla de reacción bioquímica 5850 dentro de los micropocillos 5845.

La figura 63 ilustra una vista en perspectiva de un sistema de "microrreactor" capilar 6300 para la captura de ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido para la preparación de una biblioteca de ácidos nucleicos con direcciones espaciales. El sistema de microrreactor capilar 6300 incluye una pluralidad de tubos capilares 6310. En una realización, los tubos capilares 6310 pueden usarse individualmente para recolectar y procesar una muestra o pueden agruparse en una matriz y usarse como una unidad. En este ejemplo, se muestran 4 tubos capilares 6310, pero se puede usar cualquier número de tubos capilares 6310. Los tubos capilares 6310 tienen un extremo de contacto con la muestra 6315 y un extremo de no contacto 6320. El extremo de contacto con la muestra 6315 de cada tubo capilar 6310 incluye una pequeña protuberancia 6325. En un ejemplo, los tubos capilares 6310 tienen aproximadamente 100 gm de diámetro. Secada en la superficie interna de cada tubo capilar 6310 hay una cantidad de oligonucleótidos de captura con dirección espacial (no se muestra) para dirigirse y marcar a los ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido. Los oligonucleótidos de captura con dirección espacial (no se muestra) incluyen una secuencia de dirección espacial que es exclusiva para cada tubo capilar 6310. Los oligonucleótidos de captura con dirección espacial también incluyen una secuencia de captura para la captura de ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN o ADN genómico) procedentes de una sección de tejido. La secuencia de captura puede ser, por ejemplo, una secuencia de captura específica de gen o una secuencia de captura universal.

En el momento de uso, los tubos capilares 6310 se rellenan con una disolución de reacción bioquímica 6330. En un ejemplo, los tubos capilares 6310 se rellenan con la disolución de reacción bioquímica 6330 mediante "mechas" o acción capilar. En algunas realizaciones, la disolución de reacción bioquímica 6330 incluye transcriptasa inversa y componentes de reacción para sintetizar ADNc a partir de ARN diana en una muestra de tejido. En algunas realizaciones, la disolución de reacción bioquímica 6330 incluye ADN polimerasa y componentes de reacción para producir amplicones de ADN genómico a partir de genes diana en una muestra de tejido.

Los tubos capilares 6310 se "estampan" y se prensan sobre una sección de tejido 6335 montada sobre un sustrato 6340. En un ejemplo, la sección de tejido 6335 es una sección de tejido FFPE semipermeabilizada. A medida que los tubos capilares 6310 se prensan sobre la sección de tejido 6335, se presiona una muestra de tejido hacia el tubo capilar 6310 a través de la protuberancia 6325. En algunas realizaciones, se coloca un sustrato inerte (no se muestra) entre la sección de tejido 6335 y el sustrato 6340. El sustrato inerte es utilizado para sellar los extremos de contacto con la muestra 6315 de los tubos capilares 6310.

La figura 64 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 6400 de captura de ácidos nucleicos procedentes de una sección de tejido usando el sistema de microrreactor capilar 6300 de la figura 63 para la preparación de una biblioteca de secuenciación. El método 6400 incluye, pero no se limita a las siguientes etapas.

En una etapa 6410, en el momento de uso, la disolución de reacción bioquímica 6330 se carga mediante acción capilar en tubos capilares 6310.

En una etapa 6415, los tubos capilares 6310 que tienen la disolución de reacción bioquímica 6330 en su interior se imprimen y se prensan sobre la sección de tejido 6335 montada sobre el sustrato 6340 para recoger muestras de tejido.

En una etapa 6420, los tubos capilares 6310 se retiran del sustrato 6340 y se sellan en el extremo de contacto con la muestra 6315 para evitar la evaporación. En algunas realizaciones, los tubos capilares 6310 se retiran del sustrato 6340 y los extremos de contacto con la muestra 6315 se estampan sobre un sustrato inerte para sellar contra la evaporación. En algunas realizaciones, se coloca un sustrato inerte entre la sección de tejido 6335 y el sustrato 6340. A medida que los tubos capilares 6310 se presionan sobre la sección de tejido 6335 y a través de esta, los extremos de contacto con la muestra 6315 se presionan hacia el interior del sustrato inerte y se sellan contra la evaporación.

En una etapa 6425, los extremos de no contacto 6320 de los tubos capilares 6310 se sellan contra la evaporación. En algunas realizaciones, los extremos de no contacto 6320 están estampados sobre un sustrato inerte para sellar contra la evaporación.

En una etapa 6430, en un período de incubación, se realiza la reacción bioquímica.

En una etapa 6435, la disolución de reacción bioquímica con los productos de reacción (por ejemplo, ADNc o amplicones de ADN genómico) se recoge de los tubos capilares 6310 y se agrupa.

En la etapa 6440, se prepara una biblioteca de secuenciación.

4.9 Flujo de trabajo de ADN/ARN de secciones en serie

Se puede usar un conjunto de oligonucleótidos cebadores aleatorios con dirección espacial en un flujo de trabajo de ADN/ARN en serie para la detección espacial y el análisis de ADN y ARN en una muestra de tejido. Por ejemplo, un oligonucleótido cebador aleatorio con dirección espacial puede incluir una secuencia de cebador aleatorio, una secuencia de dirección espacial, una secuencia de cebador de SBS y una marcador de biotina como se describe anteriormente para el cebador de PCR con dirección espacial 5100 de la figura 51. Un conjunto de oligonucleótidos cebadores aleatorios con dirección espacial se utiliza en una reacción de amplificación de a Dn genómico completo in situ para amplificar e indexar espacialmente el ADN en una sección en serie de la muestra de tejido. El ADN amplificado e indexado espacialmente se usa luego para generar una biblioteca de secuenciación. El mismo grupo de oligonucleótidos cebadores aleatorios con dirección espacial se usa en una reacción de RT in situ para sintetizar e indexar espacialmente el ADNc a partir del ARN en una segunda sección en serie de la muestra de tejido. El ADNc indexado espacialmente se usa luego para generar una segunda biblioteca de secuenciación. El flujo de trabajo combinado de ADN/ARN proporciona una mayor salida de datos de una sola muestra de tejido.

4.10 Accionador de gotitas configurado para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos

La figura 65 ilustra una vista lateral de una parte del accionador de gotitas 6500 que está configurado para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido. El accionador de gotitas 6500 incluye un sustrato inferior 6510 que está separado de un sustrato superior 6515 por un espacio de actuación de gotitas 6520. Las actuaciones de gotitas se llevan a cabo en un espacio de actuaciones de gotitas 6520 sobre una superficie de actuaciones de gotitas. El sustrato inferior 6510 incluye una disposición de electrodos de actuación de gotitas 6525 (por ejemplo, electrodos de electrohumectación). Las actuaciones de gotitas se llevan a cabo encima de los electrodos de actuación de gotitas 6525 sobre una superficie de actuación de gotitas. El sustrato superior 6515 incluye un electrodo de referencia 6530. El sustrato superior 6515 también incluye un área rebajada 6535 que tiene el tamaño y la forma suficientes para acomodar una lámina de poros 6540. La lámina de poros 6540 se describe con más detalle con referencia a la figura 66. Asociada con área rebajada 6535 hay un electrodo de electroforesis 6545. El sustrato inferior 6510 incluye un electrodo de electroforesis correspondiente 6550. Los electrodos de electroforesis 6545 y 6550 están conectados a una fuente de voltaje 6555. La lámina de poros 6540, los electrodos de electroforesis 6545 y 6550 están configurados para la transferencia electroforética y la captura de ácidos nucleicos en una muestra de tejido de manera que se mantenga la orientación espacial. Además, la lámina de poros 6540 está instalada en el área rebajada 6535 de manera que hay una cierta cantidad de espacio 6536 entre la parte superior de la lámina de poros 6540 y el electrodo de electroforesis 6545.

Una capa hidrófoba 6560 está dispuesta sobre la superficie del sustrato superior 6515 que está frente al espacio de actuaciones de gotitas 6520. De manera similar, otra capa hidrófoba 6565 está dispuesta sobre la superficie del sustrato inferior 5610 que está frente al espacio de actuaciones de gotitas 6520.

La figura 66 ilustra una vista lateral de la lámina de poros 6540 del accionador de gotitas 6500 de la figura 65. La lámina de poros 6540 incluye un sustrato 6610 que tiene una superficie superior 6615 y una superficie inferior 6620. El sustrato 6610 incluye una matriz de poros 6625. Los poros 6625 son orificios pasantes (por ejemplo, microporos) en el sustrato 6610 que se extienden a través del sustrato 6610 desde la superficie superior 6615 hasta la superficie inferior 6620. Cada poro 6625 se rellena con un gel o una disolución o una matriz de reacción que incluye una pluralidad sondas de capturas con direcciones espaciales exclusivas (no se muestra). Cada dirección espacial corresponde a la posición de las sondas de captura sobre la lámina de poros 6540. La posición de cada poro 6625 puede correlacionarse con una posición en una muestra de tejido. La superficie inferior 6620 del sustrato 6610 puede incluir una capa hidrófoba (no se muestra) para facilitar el transporte de una gotita a la lámina de poros 6540 y lejos de la lámina de poros 6540.

Las figuras 67A y 67B ilustran vistas laterales del accionador de gotitas 6500 de la figura 65 y muestran un proceso 6700 de aislamiento de un ácido nucleico en una muestra de tejido para la detección y el análisis espacial. El proceso 6700 es un ejemplo de un protocolo de aislamiento de ácidos nucleicos en el que los ácidos nucleicos de una muestra de tejido se transfieren electroforéticamente a una matriz de microporos que contiene sondas de captura con direcciones espaciales exclusivas, son marcados con la secuencia de dirección espacial exclusiva y son transferidos a una gotita para su posterior procesamiento. en el accionador de gotitas. El proceso 6700 incluye, pero no se limita a las siguientes etapas.

En una etapa y con referencia ahora a la figura 67A, una muestra de tejido 6710 montada sobre un sustrato de muestra 6715 se coloca en el área rebajada 6535; concretamente, en el espacio 6536 encima de la lámina de poros 6540. En un ejemplo, la muestra de tejido 6710 es una sección de tejido FFPE. En un ejemplo, la muestra de tejido 6710 se coloca directamente sobre la superficie de la lámina de poros 6540. En otro ejemplo, la muestra de tejido 6710 se coloca sobre una sustancia (no se muestra) como un gel o una capa fina de tampón que separa la muestra de tejido 6710 de la lámina de poros 6540 para facilitar la transferencia electroforética de los ácidos nucleicos desde la muestra de tejido 6710 a la lámina de poros 6540. Una gotita 6720 se transporta usando actuaciones de gotitas a un electrodo de actuación de gotitas concreto 6525 alineado con la lámina de poro 6540. Se aplica un voltaje desde la fuente de voltaje 6555 a los electrodos de electroforesis 6545 y 6550, creando un campo eléctrico. En presencia del campo eléctrico, una pluralidad de ácidos nucleicos 6725 se transfieren desde la muestra de tejido 6710 hacia el interior de los poros 6625 de la lámina de poros 6540. El ácido nucleico 6725 en cada poro 6625 de la lámina de poros 6540 está marcado con una secuencia de dirección espacial (no se muestra) que corresponde a la posición de cada poro 6625 sobre la lámina de poros 6540.

En otra etapa y con referencia ahora a la figura 67B, después de un período de tiempo suficiente para la captura de los ácidos nucleicos 6725 sobre sondas de captura con direcciones espaciales contenidas en cada poro 6625, los ácidos nucleicos 6725 se transfieren electroforéticamente hacia el interior de la gotita 6720. La gotita 6720 con ácidos nucleicos marcados 6725 en su interior se transporta utilizando actuaciones de gotitas fuera de la lámina de poros 6540 para las etapas de procesamiento posteriores en el accionador de gotitas 6500. Por ejemplo, el accionador de gotitas 6500 puede incluir una zona de reacción (no se muestra) para realizar las etapas de procesamiento en un protocolo de preparación de una biblioteca de secuenciación (por ejemplo, transcripción inversa de ARN a ADNc, digestión con exonucleasa I, amplificación por PCR y preparación de bibliotecas Nextera). El accionador de gotitas 6500 también puede incluir una zona de secuenciación (no se muestra) para realizar un protocolo de secuenciación de ADN (por ejemplo, un protocolo SBS). La zona de secuenciación puede ser, por ejemplo, una celda de flujo de secuenciación.

4.11 Perfiles de tejidos espaciales basados en la tagmentación de ADN

La "tagmentación", tal como se usa en este documento, es un proceso de fragmentación y marcaje mediado por transposasa. La tagmentación implica a menudo la modificación del ADN mediante un complejo de transposoma que comprende una enzima transposasa complejada con adaptadores que comprenden una secuencia terminal de transposón. La tagmentación da como resultado la fragmentación simultánea del ADN y el acoplamiento de los adaptadores a los extremos 5' de ambas hebras de fragmentos de dúplex de ADN.

Esta descripción se basa, en parte, en la constatación de que la tagmentación se puede utilizar de forma eficaz para buscar las direcciones espaciales de ácidos nucleicos procedentes de una muestra de tejido sobre una matriz de captura.

La figura 68 ilustra un diagrama de flujo de un ejemplo de un método 6800 de obtención del perfil del ADN genómico en una muestra de tejido usando la tagmentación del ADN. En este ejemplo, el método 6800 se utiliza para obtener el perfil de las SNV de interés en el ADN genómico. El método 6800 puede comprender, pero no se limita a algunas o todas las siguientes etapas.

En la etapa 6810, se imprime un sustrato de vidrio con oligonucleótidos con dirección espacial para formar una serie de características espaciales. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos con dirección espacial pueden imprimirse sobre un cubreobjetos de 2 cm x 2 cm para formar una matriz de características espaciales que tienen 100 pm de diámetro con una altura de 35 pm. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos con dirección espacial se pueden imprimir en micropocillos formados sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio. Los oligonucleótidos con dirección espacial se pueden imprimir sobre un cubreobjetos o portaobjetos de vidrio usando, por ejemplo, tecnologías de impresión disponibles en el mercado. Los oligonucleótidos con dirección espacial pueden comprender una secuencia de conector, una secuencia de cebador de SBS, una secuencia de dirección espacial y una secuencia Mosaic End (ME) de 19 pb como se describe con más detalle con referencia a la figura 69A. En algunas realizaciones, la secuencia ME es una secuencia de reconocimiento de transposasa Tn5. En algunas realizaciones, la secuencia ME es una secuencia de reconocimiento de transposasa Mu. Los oligonucleótidos con dirección espacial pueden comprender además una modificación en el extremo 5' de la molécula para la unión reversible al cubreobjetos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos con dirección espacial pueden comprender una modificación de disulfuro 5' como se describe para la sonda de captura con dirección espacial 3100 del proceso 3200 de las figuras 32A, 32B y 32C. En algunas realizaciones, los cebadores de PCR con dirección espacial pueden incluir un conector fotoescindible 5' como se describe para la sonda de captura con dirección espacial 3100 del proceso 3300 de las figuras 33A, 33B y 33C.

En la etapa 6815, una secuencia de oligonucleótido de complemento inverso se hibrida con la secuencia de ME para formar una región de ADN bicatenario.

En la etapa 6820, se añade una disolución de enzima transposasa sobre la superficie de la matriz de oligonucleótidos con dirección espacial para formar un homodímero de transposoma en cada región del ADN bicatenario. En algunas realizaciones, la disolución de enzima transposasa comprende Tn5. En algunas realizaciones, la disolución de enzima transposasa comprende Mu.

En una etapa 6825, se coloca una sección de tejido sobre la matriz, de modo que la superficie del sustrato de la matriz con los oligonucleótidos con dirección espacial y los homodímeros de transposoma sobre los mismos esté en contacto con la sección de tejido. En un ejemplo, la sección de tejido es una sección de tejido FFPE.

En la etapa 6830, el ADN bicatenario se tagmenta con un complejo de transposoma. Los métodos, composiciones y kits para tratar ácidos nucleicos y, en particular, los métodos y composiciones para fragmentar y marcar ADN utilizando composiciones de transposones se describen en detalle, por ejemplo, en los documentos US2010/0120098 y US2011/0287435.

En la etapa 6835, el ADN tagmentado se amplifica usando un cebador específico de gen y un cebador universal que incluye una región complementaria con la secuencia del cebador de SBS para generar una biblioteca de ADN genómico tagmentado.

En la etapa 6840, se secuencia la biblioteca de ADN genómico tagmentado.

Las figuras 69A, 69B y 69C ilustran las etapas del método 6800 de la figura 68. En la etapa 6810 (ver figura 69A), se imprime una superficie de matriz 6910 con oligonucleótidos 6915 con dirección espacial para la indexación espacial y la tagmentación del ADN genómico completo. En este ejemplo, se muestra un único oligonucleótido con dirección espacial 6915, pero se puede inmovilizar cualquier número de oligonucleótidos 6915 sobre la superficie de la matriz 6010.El oligonucleótido con dirección espacial 6015 incluye una región de conector 6920, una región de cebador de SBS 6925, una región de dirección espacial 6930, y una región ME 6935. La región de dirección espacial 6930 comprende una secuencia exclusiva para cada sitio de captura (característica espacial) sobre una matriz. La secuencia ME de 19 pb de la región ME 6935 o el extremo de transposón se describen en detalle, por ejemplo, en los documentos US2010/0120098 y US2011/0287435. Los métodos, composiciones y kits para tratar ácidos nucleicos y, en particular, los métodos y composiciones para fragmentar y marcar ADN usando composiciones de transposones se describen en detalle, por ejemplo, en los documentos US2010/0120098 y US2011/0287435.

La región de conector 6920 en este ejemplo comprende una secuencia escindible que se puede usar para liberar el ácido nucleico capturado de la superficie de la matriz 6910 de manera que la región de dirección espacial 6930 esté incluida en el ácido nucleico liberado y el ácido nucleico esté "tagmentado". La región de cebador de SBS 6925 comprende una secuencia del cebador de SBS (por ejemplo, SBS12 o SBS3) que se puede usar en un proceso de secuenciación por síntesis (SBS). La región de cebador de SBS 6925 también se puede usar en una reacción de amplificación para generar una biblioteca de secuenciación como se describe con más detalle con referencia a la figura 12 y la figura 13.

En la etapa 6815 (ver figura 69A), una secuencia de complemento inverso ME 6940 se hibrida con la región ME 6935.

En la etapa 6820 (véase la figura 69B), se añade una disolución de enzima transposasa (no se muestra) sobre la superficie de la matriz 6910 para formar un homodímero de transposoma 6945 en cada región de ADN bicatenario. En algunas realizaciones, los extremos del transposoma comprenden extremos del transposoma Mu y la transposasa es la transposasa Mu. En algunas realizaciones, los extremos del transposoma comprenden extremos del transposoma Tn5 y la transposasa es la transposasa Tn5.

En la etapa 6825 (ver figura 69B), se coloca una sección de tejido 6950 encima de la superficie de la matriz 6910 de manera que los oligonucleótidos con direcciones espaciales 6915 y los homodímeros 6945 del transposoma sobre los mismos estén en contacto con la sección de tejido 6950. En algunas realizaciones, la sección de tejido 6950 es una sección de tejido FFPE. La sección de tejido 6950 incluye una célula 6955. La célula 6955 incluye una molécula de ADN genómico 6960. La molécula de ADN genómico 6960 puede incluir una variación de un solo nucleótido (SNV) 6965.

En la etapa 6830 (ver figura 69C), se tagmenta el ADN genómico 6960. Por ejemplo, el ADN genómico 6960 está tagmentado de manera que la SNV 6965 esté "A" cadena arriba de un acontecimiento de tagmentación o "B" cadena abajo de un acontecimiento de tagmentación.

En la etapa 6835 (ver figura 69C), se amplifica el ADN genómico 6960 marcado. Por ejemplo, si la SNV 6965 está "A" cadena arriba de un acontecimiento de tagmentación, el ADN genómico 6960 se amplifica usando un cebador específico de gen 6970 y un cebador universal 6975 que incluye una región complementaria con la región de cebador de SBS 6925. Si la SNV 6965 está "B" cadena abajo de un acontecimiento de tagmentación, el ADN genómico 6960 se amplifica usando un cebador específico de gen 6980 y el cebador universal 6975.

En la etapa 6840 (no mostrada en las figuras 69A, 69B y 69C), se secuencia el producto de PCR.

En otro aspecto, en la presente se proporciona una matriz de captura para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende un sitio de captura que comprende una sonda de captura (por ejemplo, 6915) que comprende una región de dirección espacial (por ejemplo, 6930) y una región de extremo de transposón (TE) (por ejemplo, 6935). En algunas realizaciones, la sonda de captura comprende además una región escindible (por ejemplo, 6920) y una región de unión al cebador de SBS (por ejemplo, 6925). En algunas realizaciones, la región de extremo de transposón se hibrida con un oligonucleótido complementario inverso (por ejemplo, 6940) para formar una región de extremo de transposón bicatenario. En algunas realizaciones, la región TE comprende una secuencia ME.

En algunas realizaciones, la matriz de captura comprende además una transposasa para formar un transposoma (por ejemplo, 6945).

En algunas realizaciones, los extremos del transposoma comprenden extremos del transposoma Mu y la transposasa es la transposasa Mu. En algunas realizaciones, los extremos del transposoma comprenden extremos del transposoma Tn5 y la transposasa es la transposasa Tn5.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende proporcionar una matriz de captura descrita en este documento. En algunas realizaciones, la matriz de captura comprende un sitio de captura que comprende una sonda de captura (por ejemplo, 6915) que comprende una región de dirección espacial (por ejemplo, 6930) y una región de extremo de transposón (TE) (por ejemplo, 6935). En algunas realizaciones, la sonda de captura comprende además una región escindible (por ejemplo, 6920) y una región de unión al cebador de SBS (por ejemplo, 6925).

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la matriz de captura con un oligonucleótido que es un complemento inverso de la región TE (por ejemplo, 6940) para formar una región de extremo de transposón bicatenario.

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la matriz de captura con una transposasa para formar un transposoma (por ejemplo, 6945). En algunas realizaciones, los extremos del transposoma comprenden extremos del transposoma Mu y la transposasa es la transposasa Mu. En algunas realizaciones, los extremos del transposoma comprenden extremos del transposoma Tn5 y la transposasa es la transposasa T n5.

En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la matriz de captura con una muestra de tejido de manera que la posición de un sitio de captura sobre la matriz pueda correlacionarse con una posición en la muestra de tejido; y permitir que se produzca una reacción de tagmentación entre el ADN genómico de la muestra de tejido y el transposoma en el sitio de captura. En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende una SNV.

En algunas realizaciones, el método comprende además analizar la secuencia del ADN tagmentado. En algunas realizaciones, la secuenciación del ADN tagmentado comprende realizar una reacción de secuenciación usando una combinación de un cebador específico de gen y un cebador universal. En algunas realizaciones, analizar la secuencia del ADN tagmentado comprende detectar la SNV.

En algunas realizaciones, el método comprende además correlacionar la secuencia del ADN tagmentado con la posición del ADN genómico en la muestra de tejido. En algunas realizaciones, correlacionar la secuencia del ADN tagmentado comprende correlacionar la SNV con una posición en la muestra de tejido.

4.12 Métodos de secuenciación

Los métodos descritos en el presente documento se pueden usar junto con una variedad de técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos. Las técnicas particularmente aplicables son aquellas en las que los ácidos nucleicos se unen en ubicaciones fijas en una matriz de modo que sus posiciones relativas no cambien y en las que se forman repetidamente imágenes de la matriz. Son particularmente aplicables las realizaciones en las que se obtienen imágenes en diferentes canales de color, por ejemplo, coincidiendo con diferentes marcadores utilizados para distinguir un tipo de base de nucleótidos de otra. En algunas realizaciones, el proceso para determinar la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana puede ser un proceso automático. Las realizaciones preferidas incluyen técnicas de secuenciación por síntesis ("SBS").

Las "técnicas de secuenciación por síntesis ("SBS")" implican generalmente la extensión enzimática de una hebra de ácido nucleico naciente mediante la adición iterativa de nucleótidos contra una hebra molde. En los métodos tradicionales de SBS, se puede proporcionar un monómero de un solo nucleótido a un nucleótido diana en presencia de una polimerasa en cada entrega. Sin embargo, en los métodos descritos en el presente documento, se puede proporcionar más de un tipo de monómero nucleotídico a un ácido nucleico diana en presencia de una polimerasa en una entrega.

La SBS puede utilizar monómeros de nucleótidos que tienen un resto terminador o aquellos que carecen de restos terminadores. Los métodos que utilizan monómeros de nucleótidos que carecen de terminadores incluyen, por ejemplo, pirosecuenciación y secuenciación utilizando nucleótidos marcados con Y-fosfato, como se expone con más detalle a continuación. En los métodos que utilizan monómeros de nucleótidos que carecen de terminadores, el número de nucleótidos añadidos en cada ciclo es generalmente variable y depende de la secuencia molde y del modo de suministro de nucleótidos. Para las técnicas de SBS que utilizan monómeros de nucleótidos que tienen un resto terminador, el terminador puede ser efectivamente irreversible en las condiciones de secuenciación utilizadas, como es el caso de la secuenciación tradicional de Sanger que utiliza didesoxinucleótidos, o el terminador puede ser reversible, como es el caso de los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).

Las técnicas de SBS pueden utilizar monómeros de nucleótidos que tienen un resto marcador o aquellos que carecen de un resto marcador. Por consiguiente, los acontecimientos de incorporación pueden detectarse basándose en una característica del marcador, como la fluorescencia del marcador; una característica del monómero nucleotídico, como el peso molecular o la carga; un subproducto de la incorporación del nucleótido, como la liberación de pirofosfato; o similares. En realizaciones en las que están presentes dos o más nucleótidos diferentes en un reactivo de secuenciación, los diferentes nucleótidos pueden distinguirse entre sí o, como alternativa, los dos o más marcadores diferentes pueden ser indistinguibles según las técnicas de detección que se utilizan. Por ejemplo, los diferentes nucleótidos presentes en un reactivo de secuenciación pueden tener diferentes marcadores y pueden distinguirse usando ópticas apropiadas como se ejemplifica mediante los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).

Las realizaciones preferidas incluyen técnicas de pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos concretos a la hebra naciente (Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. y Nyren, P. (1996), "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release", Analytical Biochemistry, 242 (1), 84-89; Ronaghi, M. (2001), "Pyrosequencing Sheds Light on DNA Sequencing", Genome Res., 11 (1), 3-11; Ronaghi, M., Uhlen, M. y Nyren, P. (1998), "A sequencing method based on real-time pyrophosphate", Science, 281 (5375), 363; patente de Ee . UU. n.° 6.210.891; patente de EE. UU. n.° 6.258.568 y patente de EE. UU. n.° 6.274.320. En la pirosecuenciación, el PPi liberado puede detectarse convirtiéndolo inmediatamente en adenosina trifosfato (ATP) mediante la ATP sulfurilasa, y el nivel de ATP generado se detecta mediante fotones producidos por luciferasa. Los ácidos nucleicos que se van a secuenciar se pueden unir a características en una matriz y se pueden formar imágenes de la matriz para capturar las señales quimioluminiscentes que se producen debido a la incorporación de nucleótidos en las características de la matriz. Se puede obtener una imagen después de que la matriz se trate con un tipo de nucleótido particular (por ejemplo, A, T, C o G). Las imágenes obtenidas después de la adición de cada tipo de nucleótido diferirán con respecto a las características de la matriz que se detecten. Estas diferencias en la imagen reflejan el contenido de secuencia diferente de las características en la matriz. Sin embargo, las ubicaciones relativas de cada característica permanecerán sin cambios en las imágenes. Las imágenes pueden almacenarse, procesarse y analizarse utilizando los métodos establecidos en este documento. Por ejemplo, las imágenes obtenidas después del tratamiento de la matriz con cada tipo de nucleótido diferente se pueden manipular de la misma manera que se ejemplifica en el presente documento para imágenes obtenidas de diferentes canales de detección para métodos de secuenciación basados en terminadores reversibles.

En otro ejemplo de tipo de SBS, la secuenciación de ciclo se logra mediante la adición escalonada de nucleótidos terminadores reversibles que contienen, por ejemplo, un marcador de colorante escindible o fotoblanqueable como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente internacional n.° WO 04/018497 y la patente de EE. UU. 7.057.026. Esta estrategia está siendo comercializada por Solexa (ahora Illumina Inc.), y también se describe en la publicación de patente internacional. n.° WO 91/06678 y la publicación internacional de patente n.° WO 07/123.744. Existen terminadores marcados con fluorescencia disponibles en los que la terminación puede invertirse y el marcador fluorescente escindido facilita la secuenciación de terminación cíclica reversible (“cyclic reversible termination”, CRT) eficiente. Las polimerasas también pueden modificarse conjuntamente para realizar la incorporación y la extensión de modo eficaz a partir de estos nucleótidos modificados.

Preferiblemente, en realizaciones de secuenciación basadas en terminadores reversibles, los marcadores no inhiben sustancialmente la extensión en las condiciones de reacción de SBS. Sin embargo, los marcadores de detección pueden retirarse, por ejemplo, mediante escisión o degradación. Las imágenes pueden capturarse tras la incorporación de marcadores en características de ácidos nucleicos en una matriz. En realizaciones particulares, cada ciclo implica el suministro simultáneo de cuatro tipos de nucleótidos diferentes a la matriz, y cada tipo de nucleótido tiene un marcador espectralmente distinto. A continuación, se pueden obtener cuatro imágenes, cada una de las cuales utiliza un canal de detección que es selectivo para uno de los cuatro marcadores diferentes. Como alternativa, se pueden agregar secuencialmente diferentes tipos de nucleótidos y se puede obtener una imagen de la matriz entre cada etapa de adición. En tales realizaciones, cada imagen mostrará las características de ácido nucleico que han incorporado nucleótidos de un tipo particular. Diferentes características estarán presentes o ausentes en las diferentes imágenes debido al diferente contenido de secuencia de cada característica. Sin embargo, la posición relativa de las características permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas a partir de dichos métodos de terminación reversible-SBS pueden almacenarse, procesarse y analizarse como se establece en el presente documento. Después de la etapa de captura de imágenes, los marcadores se pueden eliminar y los restos terminadores reversibles se pueden eliminar para los ciclos posteriores de adición de nucleótidos y detección. La eliminación de los marcadores después de que se hayan detectado en un ciclo particular y antes de un ciclo posterior puede proporcionar la ventaja de reducir la señal de fondo y la diafonía entre ciclos. A continuación, se exponen ejemplos de marcadores útiles y de métodos de eliminación.

En realizaciones particulares, algunos o todos los monómeros de nucleótidos pueden incluir terminadores reversibles. En tales realizaciones, los terminadores reversibles/flúores escindibles pueden incluir flúor unido al resto ribosa a través de un enlace éster 3' (Metzker, Genome Res., 15: 1767-1776 (2005)). Otras estrategias han separado la química del terminador de la escisión del marcador de fluorescencia (Ruparel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 5932 5937 (2005). Ruparel et al. describieron el desarrollo de terminadores reversibles que usaban un pequeño grupo alilo 3' para bloquear la extensión, pero que podían desbloquearse fácilmente mediante un tratamiento corto con un catalizador de paladio. El fluoróforo se unió a la base mediante un conector fotoescindible que se podía escindir fácilmente mediante una exposición de 30 segundos a luz UV de longitud de onda larga. Por tanto, se puede utilizar la reducción con disulfuro o la fotoescisión como conector escindible. Otra estrategia para la terminación reversible es el uso de la terminación natural que se produce después de la colocación de un tinte voluminoso sobre un dNTP. La presencia de un colorante voluminoso cargado sobre el dNTP puede actuar como un terminador eficaz a través de un impedimento estérico y/o electrostático. La presencia de un acontecimiento de incorporación evita otras incorporaciones a menos que se elimine el tinte. La escisión del tinte elimina el flúor e invierte eficazmente la terminación. También se describen ejemplos de nucleótidos modificados en la patente de EE. UU. 7.427.673, y la patente de EE. UU. 7.057.026.

Otros ejemplos de métodos y sistemas de SBS que se pueden utilizar con los métodos y sistemas descritos en este documento se describen en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0166705, publicación de patente de EE. UU. n.° 2006/0188901, patente de EE. UU. 7.057.026, publicación de patente de EE. UU. n.° 2006/0240439, publicación de patente de EE. UU. n.° 2006/0281109, publicación de patente internacional n.° WO 05/065814, publicación de patente de EE. UU. n.° 2005/0100900, publicación de patente internacional n.° WO 06/064199, publicación de patente internacional n.° WO 07/010,251, publicación de patente de EE. UU. n.° 2012/0270305 y publicación de patente de EE. UU. n.° 2013/0260372.

Algunas realizaciones pueden utilizar la detección de cuatro nucleótidos diferentes usando menos de cuatro marcadores diferentes. Por ejemplo, la SBS se puede realizar utilizando métodos y sistemas descritos en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2013/0079232. Como primer ejemplo, se puede detectar un par de tipos de nucleótidos en la misma longitud de onda, pero distinguirlos en función de la diferencia de intensidad de un miembro del par en comparación con el otro, o en función de un cambio en un miembro del par (por ejemplo, mediante modificación química, modificación fotoquímica o modificación física) que hace que la señal aparente aparezca o desaparezca en comparación con la señal detectada para el otro miembro del par. Como segundo ejemplo, se pueden detectar tres de los cuatro tipos de nucleótidos diferentes en condiciones particulares cuando un cuarto tipo de nucleótidos carezca de un marcador que sea detectable en esas condiciones, o que se detecte mínimamente en esas condiciones (por ejemplo, detección mínima debido a la fluorescencia de fondo, etc.). La incorporación de los primeros tres tipos de nucleótidos a un ácido nucleico se puede determinar basándose en la presencia de sus respectivas señales, y la incorporación del cuarto tipo de nucleótidos al ácido nucleico se puede determinar basándose en la ausencia o detección mínima de cualquier señal. Como tercer ejemplo, un tipo de nucleótidos puede incluir uno o más marcadores que se detectan en dos canales diferentes, mientras que otros tipos de nucleótidos se detectan en no más de uno de los canales. Las tres configuraciones ejemplares mencionadas anteriormente no se consideran mutuamente excluyentes y pueden usarse en varias combinaciones. Un ejemplo de realización que combina los tres ejemplos es un método SBS basado en la fluorescencia que utiliza un primer tipo de nucleótido que se detecta en un primer canal (por ejemplo, dATP que tiene un marcador que se detecta en el primer canal cuando se excita con una primera longitud de onda de excitación), un segundo tipo de nucleótido que se detecta en un segundo canal (por ejemplo, dCTP que tiene un marcador que se detecta en el segundo canal cuando se excita con una segunda longitud de onda de excitación), un tercer tipo de nucleótido que se detecta tanto en el primero como en el segundo canal (por ejemplo, dTTP que tiene al menos una marcador que se detecta en ambos canales cuando se excita con la primera y/o segunda longitud de onda de excitación) y un cuarto tipo de nucleótido que carece de un marcador que no se detecta en ninguno de los canales, o se detecta mínimamente (por ejemplo, dGTP sin marcador).

Además, como se describe en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2013/0079232, los datos de secuenciación se pueden obtener utilizando un solo canal. En las llamadas estrategias de secuenciación de un colorante, el primer tipo de nucleótido se marca, pero el marcador se elimina después de que se genere la primera imagen, y el segundo tipo de nucleótido se marca solo después de que se genere una primera imagen. El tercer tipo de nucleótido conserva su marcador tanto en la primera como en la segunda imagen, y el cuarto tipo de nucleótido permanece sin marcar en ambas imágenes.

Algunas realizaciones pueden utilizar una secuenciación mediante técnicas de acoplamiento. Tales técnicas utilizan ADN ligasa para incorporar oligonucleótidos e identificar la incorporación de tales oligonucleótidos. Los oligonucleótidos tienen típicamente diferentes marcadores que se correlacionan con la identidad de un nucleótido particular en una secuencia con la que se hibridan los oligonucleótidos. Al igual que con otros métodos de SBS, se pueden obtener imágenes tras el tratamiento de una matriz de características de ácidos nucleicos con los reactivos de secuenciación marcados. Cada imagen mostrará características de ácidos nucleicos que han incorporado marcadores de un tipo particular. Diferentes características estarán presentes o ausentes en las diferentes imágenes debido al diferente contenido de secuencia de cada característica, pero la posición relativa de las características permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas a partir de métodos de secuenciación basados en el acoplamiento pueden almacenarse, procesarse y analizarse como se establece en el presente documento. Se describen ejemplos de métodos y sistemas de SBS que se pueden utilizar con los métodos y sistemas descritos en este documento en la patente de EE. UU.6.969.488, la patente de EE. UU. 6.172.218, y la patente de EE. UU. 6.306.597.

Algunas realizaciones pueden utilizar la secuenciación de nanoporos (Deamer, D. W. y Akeson, M., "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing", Trends Biotechnol., 18, 147-151 (2000); Deamer, D. y D. Branton, "Characterization of Nucleic Acids by Nanopore Analysis", Acc. Chem. Res., 35: 817-825 (2002)); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin y J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope", Nat. Mater., 2: 611-615 (2003)). En tales realizaciones, el ácido nucleico diana pasa a través de un nanoporo. El nanoporo puede ser un poro sintético o una proteína de membrana biológica, tal como la a -hemolisina. A medida que el ácido nucleico diana pasa a través del nanoporo, cada par de bases se puede identificar midiendo las fluctuaciones en la conductancia eléctrica del poro (patente de EE. UU. 7.001.792; Soni, G. V. y Meller, A., “Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores", Clin. Chem., 53, 1996-2001 (2007); Healy, K., "Nanopore-based singlemolecule DNA analysis", Nanomed., 2, 459-481 (2007); Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. y Ghadiri, M. R., "A singlemolecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution", J. Am. Chem. Soc., 130, 818-820 (2008)). Los datos obtenidos de la secuenciación de nanoporos se pueden almacenar, procesar y analizar como se establece en este documento. En particular, los datos se pueden tratar como una imagen según el ejemplo de tratamiento de imágenes ópticas y otras imágenes que se expone en este documento.

Algunas realizaciones pueden utilizar métodos que implican el control en tiempo real de la actividad ADN polimerasa. Las incorporaciones de nucleótidos se pueden detectar a través de interacciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (“fluorescence resonance energy transfer”, FRET) entre una polimerasa que porta un fluoróforo y nucleótidos marcados con Y-fosfato como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 7.329.492 y la patente de EE. UU. 7.211.414 o pueden detectarse incorporaciones de nucleótidos con guías de onda de modo cero como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 7.315.019, y usando análogos de nucleótidos fluorescentes y polimerasas modificadas como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 7.405.281 y la publicación de patente de EE. UU. n.° 2008/0108082. La iluminación se puede restringir a un volumen de escala de zeptolitros alrededor de una polimerasa unida a la superficie de modo que se pueda observar la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia con un fondo bajo (Levene, M. J. et al., "Zero-mode waveguides for singlemolecule analysis at high concentrations", Science, 299, 682-686 (2003); Lundquist, P. M. et al., "Parallel confocal detection of single molecules in real time", Opt. Lett., 33, 1026-1028 (2008); Korlach, J. et al., "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 1176-1181 (2008)). Las imágenes obtenidas de dichos métodos pueden almacenarse, procesarse y analizarse como se establece en este documento.

Algunas realizaciones de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido en un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede utilizar un detector eléctrico y técnicas asociadas que están disponibles en el mercado en Ion Torrent (Guilford, CT, una filial de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2009/0026082; publicación de patente de EE. UU. n.° 2009/0127589; publicación de patente de EE. UU. n.° 2010/0137143; o publicación de patente de EE. UU. n.° 2010/0282617. Los métodos expuestos en la presente para amplificar ácidos nucleicos diana usando exclusión cinética pueden aplicarse fácilmente a sustratos usados para detectar protones. Más específicamente, los métodos establecidos en el presente documento pueden usarse para producir poblaciones clonales de amplicones que se usan para detectar protones.

Los métodos de SBS anteriores se pueden llevar a cabo ventajosamente en formatos múltiplex de modo que se manipulen simultáneamente múltiples ácidos nucleicos diana diferentes. En realizaciones particulares, se pueden tratar diferentes ácidos nucleicos diana en un recipiente de reacción común o sobre una superficie de un sustrato particular. Esto permite el suministro conveniente de reactivos de secuenciación, la eliminación de reactivos que no han reaccionado y la detección de acontecimientos de incorporación de una manera múltiplex. En realizaciones que usan ácidos nucleicos diana unidos a una superficie, los ácidos nucleicos diana pueden estar en un formato de matriz. En un formato de matriz, los ácidos nucleicos diana pueden unirse típicamente a una superficie de una manera espacialmente distinguible. Los ácidos nucleicos diana pueden unirse mediante unión covalente directa, unión a una esfera u otra partícula, o unión a una polimerasa u otra molécula que esté unida a la superficie. La matriz puede incluir una única copia de un ácido nucleico diana en cada sitio (también denominado característica) o pueden estar presentes múltiples copias que tienen la misma secuencia en cada sitio o característica. Pueden producirse múltiples copias mediante métodos de amplificación, tales como la amplificación en puente o la PCR en emulsión como se describe con más detalle a continuación.

Los métodos establecidos en este documento pueden usar matrices que tengan características en cualquiera de una variedad de densidades que incluyen, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 características/cm2, 100 características/cm2, 500 características/cm2, 1.000 características/cm2, 5.000 características/cm2, 10.000 características/cm2, 50.000 características/cm2, 100.000 características/cm2, 1.000.000 características/cm2, 5.000.000 características/cm2, o mayores.

Una ventaja de los métodos expuestos en este documento es que proporcionan una detección rápida y eficaz de una pluralidad de ácidos nucleicos diana en paralelo. Por consiguiente, la presente descripción proporciona sistemas integrados capaces de preparar y detectar ácidos nucleicos usando técnicas conocidas en la técnica, tales como las ejemplificadas anteriormente. Por tanto, un sistema integrado de la presente descripción puede incluir componentes fluídicos capaces de suministrar reactivos de amplificación y/o reactivos de secuenciación a uno o más fragmentos de ADN inmovilizados, comprendiendo el sistema componentes tales como bombas, válvulas, depósitos, conductos fluídicos y similares. Una celda de flujo puede configurarse y/o usarse en un sistema integrado para la detección de ácidos nucleicos diana. Se describen ejemplos de celdas de flujo, por ejemplo, en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2010/0111768 A1 y en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 13/273.666. Como se ejemplifica para las celdas de flujo, uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado pueden usarse para un método de amplificación y para un método de detección. Tomando una realización de secuenciación de ácidos nucleicos como ejemplo, se pueden usar uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado para un método de amplificación establecido en este documento y para la administración de reactivos de secuenciación en un método de secuenciación como los ejemplificados anteriormente. Como alternativa, un sistema integrado puede incluir sistemas fluídicos separados para llevar a cabo métodos de amplificación y para llevar a cabo métodos de detección. Los ejemplos de sistemas de secuenciación integrados que son capaces de crear ácidos nucleicos amplificados y también de determinar la secuencia de los ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, la plataforma MiSeq™ (Illumina, Inc., San Diego, CA) y los dispositivos descritos en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 13/273.666, que se incorpora en la presente como referencia. Por ejemplo, la plataforma MiSeq™ puede implementarse con sondas de captura 5' CAACGATCGTCGAAATTCGC[cebador diana] 3' y 5' [cebador dianajAGATCGGAAGAGCGTCGTGTA 3', en los que [cebador diana] es una secuencia que es complementaria con un ácido nucleico diana.

4.13 Observaciones finales

La descripción detallada de realizaciones anterior se refiere a los dibujos adjuntos, que ilustran realizaciones específicas de la presente descripción. Otras realizaciones que tienen diferentes estructuras y funcionamiento no se apartan del alcance de la presente descripción. Esta memoria descriptiva está dividida en secciones solo para conveniencia del lector. Los encabezados no deben interpretarse como una limitación del alcance de la descripción proporcionada en este documento. Las definiciones pretenden ser parte de la descripción proporcionada en este documento. Además, la descripción anterior tiene únicamente fines ilustrativos y no fines limitativos.

5. Ejemplos

5.1 Sensibilidad de la NGS espacial para la detección de variaciones de un solo nucleótido

Este ejemplo demuestra que la sensibilidad de la detección de SNV se puede incrementar sustancialmente usando secuenciación con direcciones espaciales en comparación con la secuenciación masiva.

La sensibilidad de la detección de SNV mediante la secuenciación masiva o datos de secuenciación con direcciones espaciales se evaluó mediante conjuntos de datos simulados. Los cálculos utilizados para obtener un conjunto de datos de secuenciación masiva se basaron en las siguientes suposiciones: (1) una sección típica de FFPE es de 1,5 cm x 1,5 cm, que tiene aproximadamente 225.000.000 pm2; (2) una celda típica es de 20 x 20 pm, que tiene un área de aproximadamente 400 pm2; (3) el número de células en una sección FFPE típica es de aproximadamente 563.000 (es decir, 225.000.000 pm2 bloque de FFPE r 400 pm2 celda = aproximadamente 563K celdas por sección); y (4) la densidad de compactación de las células en una sección FFPE es aproximadamente 70 %, entonces el número de células en una sección FFPE típica es de aproximadamente 400.000. La tabla 3 a continuación muestra datos simulados para la sensibilidad de la detección de SNV en una secuenciación masiva. Para identificar poblaciones poco frecuentes de células mutadas clonalmente mediante secuenciación masiva, la frecuencia de variante (porcentaje de SNV) debe estar por encima de la tasa de error de secuenciación, que es aproximadamente 1 %. Por ejemplo, 1 célula variante ("células mutadas localizadas") en una sección FFPE tiene una frecuencia de variante (porcentaje de SNV) de 0,00025 (es decir, (1 célula r 400.000 células en la sección FFPE) x 100) = 0,00025 % de SNV), que está muy por debajo de la tasa de error de secuenciación y, por lo tanto, no es detectable en los datos de secuenciación masiva. Se requieren al menos aproximadamente 4000 células para detectar una SNV en los datos de secuenciación masiva, por ejemplo, 4096 células r 400.000 células en la sección FFPE) x 100) = 1,024, que está por encima de la tasa de error de secuenciación.

Se descubrió que la sensibilidad de la detección de SNV se puede incrementar sustancialmente usando una secuenciación con direcciones espaciales como se ejemplifica usando un conjunto de datos simulados basado en una sección de tejido de 1,5 cm x 1,5 cm superpuesta sobre una matriz de 2 cm x 2 cm. La figura 70 ilustra una vista en planta de una superposición de direcciones espaciales 7000. La superposición de direcciones espaciales 7000 comprende un sustrato 7005. En un ejemplo, el sustrato 7005 es un sustrato de vidrio plano tal como un cubreobjetos que tiene un tamaño de 2 cm x 2 cm. Impresas sobre la superficie del sustrato 7005 hay una pluralidad de características diferenciadas (no se muestra) que son regiones que contienen oligonucleótidos con direcciones espaciales. Un ejemplo de una única característica espacial se describe con más detalle con referencia a la figura 71. Superpuesta sobre el sustrato 7005 hay una sección de tejido 7010. En un ejemplo, la sección de tejido 7005 es una sección de tejido FFPE de 1,5 cm x 1,5 cm de tamaño.

La figura 71 ilustra una vista en planta de una única característica espacial 7100 sobre el sustrato 7005 de la figura 70. En este ejemplo, la característica espacial 7100 es un cuadrado de 100 pm x 100 pm (área = 10.000 pm2). La característica espacial 7100 es de tamaño suficiente para abarcar una pluralidad de células 7105 contenidas en una muestra de tejido. Las células 7105 pueden ser células normales (por ejemplo, 7105a) o células variantes (mutadas) (por ejemplo, 7105b). En un ejemplo, las células 7105 tienen un tamaño de 20 pm x 20 pm (área = 400 pm2) y la densidad de compactación celular en la sección de tejido es de aproximadamente 70 %. Según estos parámetros, el número de células 7105 que se incluyen en la característica espacial 7100 es aproximadamente 18 (es decir, (10.000 pm2 -f 400 pm2) * 0,7) = aproximadamente 18).

La tabla 4 a continuación muestra los datos simulados para la sensibilidad de la detección de SNV en datos de secuenciación con direcciones espaciales basados en la superposición de direcciones espaciales 7000 de la figura 70 y la figura 71. Por ejemplo, 1 célula variante ("células mutadas localizadas) en una única característica espacial 3000 tiene una frecuencia de variante (% de SNV) de aproximadamente 6 (es decir, (1 célula -f 18 células por característica espacial) * 100 = 6 % de SNV), que está por encima de la tasa de error de secuenciación del 1 % y, por lo tanto, es detectable en los datos de secuenciación con direcciones espaciales. En comparación, se requieren alrededor de 4000 células o más para la detección de SNV en los datos de secuenciación masiva.

El número (x) de las características espaciales 7100 en el sustrato 7005 necesarias para lograr el nivel deseado de sensibilidad de detección se puede calcular de la siguiente manera: (X Y longitud de la matriz) = (borde de la característica espacial x x) ((x - 1) x espaciado de las características espaciales)), en la que la longitud de la matriz es de 20.000 gm, el borde de la característica espacial es de 100 gm y el espaciado de las características espaciales es, por ejemplo, 50 gm; entonces x = 133 características espaciales para la dimensión X y 133 características espaciales para la dimensión Y. El número total de características sobre el sustrato 7005 (2 cm x 2 cm) es 133 x 133 = aprox. 17.689.

Claims

REIVINDICACIONES

1 Una matriz de captura para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende una pluralidad de sitios de captura, en la que cada sitio de captura comprende un par de sondas inmovilizadas sobre una superficie, en la que una primera sonda del par de sondas comprende una primera secuencia de región de unión al cebador y una secuencia de región de dirección espacial exclusiva y no comprende una secuencia de región de captura, y en la que una segunda sonda del par de sondas comprende una segunda secuencia de región de unión al cebador y la secuencia de la región de captura y no comprende la secuencia de la región de la dirección espacial, en la que la secuencia de la región de captura comprende una secuencia de captura de poli-T y la secuencia de captura de poli-T está configurada para hibridarse con un ácido nucleico diana que comprende una cola de poli-A; o la secuencia de la región de captura comprende una secuencia de captura específica de gen y la secuencia de captura específica de gen está configurada para hibridarse con un ácido nucleico diana que comprende una secuencia específica de gen; o la secuencia de la región de captura comprende una secuencia de captura de cebador aleatorio y la secuencia de captura de cebador aleatorio está configurada para hibridarse con un ácido nucleico diana que comprende una secuencia complementaria con la secuencia de captura de cebador aleatorio.
2. - La matriz de captura de la reivindicación 1, en la que el par de sondas en un sitio de captura es una pluralidad de pares de sondas.
3. - La matriz de captura de la reivindicación 2, en la que uno o más sitios de captura de la matriz de captura tienen el mismo número de primeras sondas y de segundas sondas, opcionalmente en la que uno o más sitios de captura de la matriz de captura tienen más primeras sondas que segundas sondas, y opcionalmente en la que uno o más sitios de captura de la matriz de captura tienen más segundas sondas que primeras sondas.
4. - La matriz de captura de la reivindicación 1, en la que la matriz de captura está integrada en un sistema de electroforesis.
5. - La matriz de captura de la reivindicación 4, en la que el sitio de captura en el sistema de electroforesis está configurado para la transferencia y captura de ácidos nucleicos procedentes de una muestra de tejido, de manera que la difusión de los ácidos nucleicos desde la muestra de tejido y la pérdida de ácidos nucleicos entre los sitios de captura se reducen sustancialmente en relación con una transferencia pasiva de ácidos nucleicos que se produce en condiciones por lo demás idénticas por difusión pasiva.
6. - Un método para la detección espacial y el análisis de ácidos nucleicos en una muestra de tejido, que comprende (a) proporcionar la matriz de captura de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, (b) poner en contacto la pluralidad de sitios de captura con una muestra de tejido, de manera que la posición de cada sitio de captura sobre la matriz puede correlacionarse con una posición en la muestra de tejido.
7. - El método de la reivindicación 6, que comprende además (c) permitir que los ácidos nucleicos de la muestra de tejido se hibriden con la respectiva secuencia de captura de poli-T, la secuencia de captura específica de gen o con la secuencia de captura de cebador aleatorio de la segunda sonda de la pluralidad de sitios de captura para formar segundas sondas hibridadas; (d) extender la secuencia de la región de captura de las segundas sondas hibridadas para formar primeras hebras complementarias inmovilizadas del ácido nucleico diana; (e) acoplar las primeras hebras complementarias inmovilizadas a la secuencia de la región de dirección espacial de las primeras sondas en cada sitio de captura para inmovilizar las primeras hebras complementarias en ambos extremos; (f) sintetizar segundas hebras complementarias usando un cebador complementario con la primera secuencia de región de unión al cebador de las primeras sondas; (g) liberar las segundas hebras complementarias de la superficie de la matriz de captura; (h) analizar la secuencia de las segundas hebras complementarias liberadas, y (i) correlacionar la secuencia de las segundas hebras complementarias liberadas con la posición del ácido nucleico en la muestra de tejido.
8. - El método de la reivindicación 7, en el que permitir que los ácidos nucleicos de la muestra de tejido se hibriden con la secuencia de la región de captura de poli-T, la secuencia de captura específica de gen o con la secuencia de captura del cebador aleatorio de la segunda sonda comprende una transferencia electroforética de los ácidos nucleicos procedentes de la muestra de tejido a la matriz de captura.
9. - El método de la reivindicación 6, en el que la primera o la segunda secuencia de región de unión al cebador comprende una secuencia de cebador de SBS, que puede usarse en un proceso de secuenciación por secuenciación (SBS).
10. - El método de la reivindicación 9, en el que la secuencia de cebador de SBS es una secuencia SBS3 o SBS12.
11. - El método de la reivindicación 6, en el que la primera secuencia de región de unión al cebador y la segunda secuencia de región de unión al cebador son diferentes.
12. - El método de la reivindicación 6, en el que la región de captura de la segunda sonda comprende una variación de un solo nucleótido (SNV).
13. - El método de la reivindicación 12, en el que el método tiene una sensibilidad de detección de SNV de menos de aproximadamente 0,0001 % en una sección de FFPE típica, que comprende hasta 1 millón de células fijadas.
14. - El método de la reivindicación 6, en el que la secuencia de la región de captura en la segunda sonda es una secuencia de captura específica de gen.
15. - El método de la reivindicación 14, en el que la secuencia de captura específica de gen en la segunda sonda comprende la secuencia de una sonda específica de amplicón.