ES2874479T3 - Agentes que modulan el dolor gastrointestinal - Google Patents
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Abstract
Lactobacillus reuteri DSM 17938 para su uso en la modulación local del receptor de potencial transitorio vainilloide 1 (TRPV1) en el sistema gastrointestinal de un sujeto que padece dolor gastrointestinal, en donde dicho L. reuteri DSM 17938 se selecciona para reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida localmente en dicho sistema gastrointestinal para prevenir o reducir el dolor gastrointestinal en dicho sujeto mientras se minimiza cualquier modulación de TRPV1 fuera de dicho sistema gastrointestinal.
Description
DESCRIPCIÓN
Agentes que modulan el dolor gastrointestinal
Campo técnico
La presente invención se refiere principalmente a la modulación de dolor gastrointestinal y, en particular, a bacterias acidolácticas capaces de modular el dolor gastrointestinal y al uso de tales agentes.
Antecedentes
El dolor gastrointestinal es un síntoma de muchas afecciones, enfermedades y trastornos asociados con el tracto gastrointestinal. Dolor abdominal funcional se refiere al dolor abdominal recurrente. La gran mayoría de los pacientes con dolor abdominal recurrente tienen dolor “funcional” o “ no orgánico” , lo que significa que el dolor no está provocado por anomalías físicas. Varios trastornos de motilidad también están asociados con dolor y estreñimiento o diarrea. El término se usa para describir una variedad de trastornos en los que el intestino no se ha desarrollado adecuadamente o ha perdido su capacidad para coordinar la actividad muscular debido a diversas causas.
Estos trastornos pueden manifestarse de diversas maneras e incluyen, pero no se limitan a, las siguientes:
• Distensión abdominal
• Obstrucción recurrente
• Dolor tipo cólico abdominal
• Estreñimiento
• Enfermedad por reflujo gastroesofágico
• Vómitos intratables y recurrentes
• Diarrea
• Síndrome de intestino irritable (SII)
• Enfermedad inflamatoria del intestino
• Incontinencia fecal
• Cólico infantil
• Frequent recurrent abdominal pain (Dolor abdominal recurrente frecuente - FRAP)
• Regurgitación
• Intolerancia alimentaria
En un sentido amplio, cualquier alteración significativa en el tránsito de los alimentos y las secreciones en el tracto digestivo puede considerarse un trastorno de motilidad intestinal y este tipo de trastorno está asociado, frecuentemente, con dolor gastrointestinal.
Los movimientos coordinados adecuados del estómago y los intestinos son necesarios para digerir e impulsar el contenido intestinal a lo largo del tracto digestivo. Los patrones de contracción y relajación necesarios para la motilidad adecuada del tracto gastrointestinal (GI) son complejos y usan los nervios y músculos dentro de las paredes GI. Todos los días, en cualquier momento, muchos factores pueden influir en la motilidad GI, p. ej., ejercicio físico y estrés emocional. Los lactantes recién nacidos tienen que desarrollar el complejo sistema de motilidad en el tracto GI. La motilidad gastrointestinal disfuncional está asociada, frecuentemente, con dolor GI.
El envejecimiento, la demencia, el accidente cerebrovascular, la enfermedad de Parkinson, las lesiones de la médula espinal, los desgarres rectales durante el parto, la diabetes, las complicaciones quirúrgicas y los trastornos neuromusculares, p. ej., miastenia grave, pueden provocar trastornos de motilidad que están asociados con dolor.
El síndrome de intestino irritable (SII), un trastorno diagnosticado habitualmente de motilidad intestinal y dolor GI, se ha considerado una enfermedad del colon durante décadas, pero la investigación sobre motilidad GI ha demostrado que también pueden producirse alteraciones de la motilidad subyacentes en el intestino delgado. El SII puede estar acompañado, frecuentemente, por dolor GI y se ha demostrado que la inmunorreactividad a TRPV1 está notablemente aumentada en pacientes con SII (Akbar, Yiangou etal, Gut 2008).
El estreñimiento, frecuentemente asociado con dolor GI, es la molestia digestiva más habitual en los Estados Unidos, pero a pesar de su frecuencia, permanece, frecuentemente, no reconocida hasta que el paciente desarrolla trastornos secundarios, tales como trastornos anorrectales o enfermedad diverticular. Tal como se mencionó anteriormente, el dolor GI es un síntoma habitual del estreñimiento.
El estreñimiento es muy habitual durante el embarazo. Las contracciones musculares que desplazan normalmente los alimentos a través del intestino disminuyen debido a mayores niveles de la hormona progesterona y posiblemente hierro adicional tomado como vitamina prenatal. Frecuentemente, esto también está acompañado de dolor en la parte inferior del abdomen.
El estreñimiento también está asociado con el aumento de la edad y el denominado “ intestino envejecido” que se encuentra habitualmente, en particular, en personas mayores de 70 años y en establecimientos sanitarios para pacientes crónicos.
En el otro extremo de los trastornos de motilidad intestinal del espectro de envejecimiento, el llanto persistente o excesivo de los cólicos infantiles es uno de los problemas más molestos de la infancia. Es inquietante para el lactante, los padres y los profesionales sanitarios involucrados. Frecuentemente, el dolor de tipo cólico se inicia y se detiene bruscamente
También se ha propuesto la hipermotilidad intestinal secundaria a un presunto desequilibrio autónomo como etiología para los cólicos. Muchos de los mecanismos que regulan la actividad motora están inmaduros en los lactantes. La inmadurez de estos mecanismos puede dar como resultado un aumento de la vulnerabilidad a la intolerancia a la alimentación. Por tanto, los cólicos pueden ser una manifestación clínica habitual en la subpoblación de lactantes que tienen disfunción madurativa en uno o más de los aspectos de la regulación de la motilidad y frecuentemente conducen a dolor GI para el lactante.
Los trastornos de motilidad intestinal se aplican a contracciones intestinales anómalas asociadas frecuentemente con dolor GI, existen muchos tipos diferentes de tratamientos y recomendaciones para los diferentes trastornos, funcionando algunos mejor que muchos otros.
Por tanto, existe una necesidad general y problemas específicos a resolver para diversos trastornos de motilidad y trastornos de dolor a saber; ¿Cómo seleccionar de la mejor manera los agentes para prevenir o reducir el dolor gastrointestinal?
El receptor de potencial transitorio vainilloide 1 (TRPV1) es un canal catiónico permeable a Ca2+ expresado, p. ej., en el sistema nervioso periférico (SNP), el sistema nervioso central (SNC), el sistema respiratorio y el tracto gastrointestinal. El TRPV1 se activa por estímulos físicos y químicos, p. ej., temperatura, cambio de pH y capsaicina, y es crítico para la detección de dolor inflamatorio nociceptivo y térmico. En el tracto gastrointestinal, puede encontrarse inmunorreactividad a TRPV1, p. ej., en aferentes sensitivas viscerales y las células de TRPV1 transmiten, p. ej., sensación de dolor gástrico a los centros superiores del cerebro. Se cree que el TRPV1 está involucrado en varias afecciones gastrointestinales que están asociadas con sensaciones de dolor y se ha demostrado que la inmunorreactividad a TRPV1 está notablemente aumentada, p. ej., en SII (Akbar, Yiangou et al, Gut 2008). Como ejemplo de esto, los pacientes diagnosticados con enfermedad inflamatoria del intestino activa demuestran una inmunorreactividad a TRPV1 altamente aumentada en fibras nerviosas colónicas (Wang, Miyares y Ahern, 2005 J. Physiol.).
Aunque el TRPV1 se considera una diana potencial para desarrollar fármacos para tratar diferentes modalidades de dolor, la expresión extendida del receptor puede dar como resultado acontecimientos adversos que limitan el uso de antagonistas sistémicos de TRPV1 en el tratamiento de dolor gastrointestinal. En particular, antagonizar el receptor podría conducir potencialmente a complicaciones cardiovasculares como resultado de la disminución de la liberación del péptido vasoactivo.
The Journal of Neuroscience (2005) 25(21): 5109-5116 da a conocer que el comportamiento relacionado con dolor agudo provocado por una fuerza iónica elevada se suprimió en ratones nulos para TRPV1 (TRPV1-null) y se inhibió por ido-resiniferatoxina.
Gut (2006) 55(2): 191-196 dio a conocer que Lactobacillus reuteri administrado por vía oral inhibió la respuesta cardio-autónoma constitutiva a la distensión colorrectal en ratas mediante efectos sobre los nervios entéricos. No se observaron efectos sobre el dolor somático con el tratamiento.
American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology (2009) 296(4): G868-G875 dio a conocer que L. reuteri administrado por vía oral previno la hiperexcitabilidad de neuronas de ganglios de la raíz dorsal (GRD) colónicas inducida por estímulos nocivos.
International Journal of Molecular Sciences (2014) 15(12): 21875-21895 dio a conocer que L. fermentum Suo administrado por vía oral tuvo efectos preventivos sobre el estreñimiento inducido por carbono en ratones.
Sumario de la invención
Es un objetivo general proporcionar bacterias acidolácticas eficaces en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal. Este y otros objetivos se cumplen con las realizaciones dadas a conocer en el presente documento.
La presente invención se define en la reivindicación independiente. Otras realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.
La invención se refiere a Lactobacillus reuteri DSM 17938 para su uso en la modulación local del receptor de potencial transitorio vainilloide 1 (TRPV1) en el sistema gastrointestinal de un sujeto que padece dolor gastrointestinal. Según la invención, L. reuteri DSM 17938 se selecciona para reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida localmente en el sistema gastrointestinal para prevenir o reducir el dolor gastrointestinal en el sujeto mientras se minimiza la modulación de TRPV1 fuera del sistema gastrointestinal.
Las presentes realizaciones proporcionan bacterias acidolácticas que pueden usarse para reducir o prevenir el dolor gastrointestinal en sujetos, preferiblemente en sujetos humanos, que padecen una enfermedad o un trastorno que provoca o está asociado con dolor gastrointestinal.
Breve descripción de las figuras
Las realizaciones, junto con otros objetivos y ventajas de las mismas, pueden entenderse mejor haciendo referencia a la siguiente descripción tomada junto con las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1 muestra el disparo espontáneo multiunitario mesentérico después de la adición de 1x108 unidades de DSM 17938 (ufc)/ml (A), 1x109 ufc/ml de DSM 17938 (B), medio condicionado con DSM 17938 diluido (1:5) (C), 1x109 ufc/ml de DSM 17938 irradiado con radiación y (D) y medio diluido solo (1:5) (E) (pruebas de Wilcoxon).
La Figura 2 muestra los efectos del DSM 17938 en la tasa de disparo espontáneo de aferentes espinales. A) La tasa de disparo multiunitario disminuyó cuando se añadieron 1x109 ufc/ml de DSM 17938 a la luz (prueba de Wilcoxon). B) Panel izquierdo, el disparo espinal monounitario se redujo por DSM 17938 (prueba de Wilcoxon). C) Paneles superiores, perfiles representativos de descarga multiunitaria espontánea antes y después de añadir DSM 17938; paneles inferiores, formas de onda superpuestas de una única unidad que se produjo en los tiempos marcados por “o” en los perfiles superiores.
La Figura 3 muestra que DSM 17938 antagonizó la respuesta excitadora de las fibras espinales mediante la adición de capsaicina al superfundido seroso. A) Se representó gráficamente la curva dosis-respuesta de capsaicina de 113 unidades individuales espinales (•) y se ajustó con una ecuación logística de tres parámetros, c E50= 200 nM. Máx.= 238 ± 27 %; con 116 fibras adicionales, adicionalmente se representó gráficamente una curva dosis-respuesta para capsaicina en presencia de 1x109 ufc/ml de DSM 17938 (■) y se ajustó con la misma ecuación logística, para la que CE50= 500 nM y máx. = 129 ± 17 % (P=0,7 y P= 0,004 para las diferencias en CE50 y máx., respectivamente, prueba de la F de suma de cuadrados extra). B) Diagramas de dispersión resumen con medias y E.E.M. que muestran cómo variaron las respuestas monounitarias con dosis crecientes de capsaicina en ausencia o presencia de 1x109 ufc/ml de DSM. (n) indica la proporción de unidades individuales para cada grupo.
La Figura 4 muestra que DSM 17938 o un antagonista de TRPV1 reducen la respuesta excitadora provocada por la distensión en unidades individuales espinales. A) Diagramas de dispersión que muestran que la adición de 1x109 de DSM 17938 a la luz redujo el aumento de la tasa de disparo monounitario espinal provocado por el aumento de la presión intraluminal hasta 48 hPa. B) La adición de 10 pM del antagonista de TRPV1 6-yodonordihidrocapsaicina a la luz imitó el efecto de la adición de DSM 17938 (pruebas de Wilcoxon).
La Figura 5 muestra que DSM 17938 redujo la elevación de Ca2+ provocada por capsaicina en somas de neuronas de ganglios de la raíz dorsal. A) Capsaicina 1 pM evocó un aumento de la entrada de Ca2+ en neuronas de GRD que disminuyó de manera dependiente de la dosis por DSM 17938 intraluminal y no se vio afectado por 1x109 ufc/ml de JB-1. B) Diagrama resumen que muestra cómo la razón (F/F0) de la fluorescencia máxima de Ca2+ (F) provocada por capsaicina con respecto a la fluorescencia de Ca2+ de nivel inicial (F0) varió con la concentración de DSM 17938 o JB-1. (valores de P, prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni).
La Figura 6 muestra que la alimentación durante 9 días con DSM 17938 redujo la bradicardia provocada por distensión gástrica. A) Valores resumen para las disminuciones porcentuales de la frecuencia cardíaca en reposo provocada por la distensión gástrica de 40 y 60 mmHg (valores de P, pruebas de la t para datos independientes). B) Diagramas resumen que muestran cómo cambió la frecuencia cardíaca en reposo con el tiempo en respuesta a la distensión gástrica de 60 mmHg. (P=0,01, prueba ANOVA de dos factores).
La Figura 7 muestra que la disminución inducida por DSM 17938 de las acciones excitadoras de capsaicina sobre aferentes espinales se imitó por el medio condicionado con DSM 17938. Diagrama resumen que muestra el aumento de la frecuencia de disparo de fibras espinales monounitarias inducido por capsaicina 1 pM en condiciones de control, con medio condicionado con DSM 17938 (1:5) o con 1x109 ufc/ml de DSM 17938 (0,02, prueba ANOVA de un factor; valores de P post-hoc, prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak).
Descripción detallada
Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se definen una serie de términos.
El “dolor gastrointestinal” , también denominado dolor GI, indica dolor en el sistema gastrointestinal de un sujeto. Frecuentemente, dolor gastrointestinal de este tipo está provocado por o está asociado con, es decir, es un síntoma o un componente de dolencia de, diversas enfermedades y trastornos, normalmente, del sistema gastrointestinal. El dolor gastrointestinal incluye dolor general en el sistema gastrointestinal, frecuentemente denominado dolor gastrointestinal general en la técnica, dolor asociado con trastornos de motilidad intestinal, dolor debido a enfermedades inflamatorias del intestino y síndrome del intestino irritable, dolor gástrico, dolor abdominal general, dolor visceral, dolor abdominal funcional, dolor abdominal recurrente frecuente y dolor en otros trastornos gastrointestinales funcionales.
El “dolor abdominal funcional” se refiere al dolor abdominal recurrente. La gran mayoría de los pacientes con dolor abdominal recurrente tienen dolor “funcional” o “ no orgánico” , lo que significa que el dolor no está provocado por anomalías físicas.
“Trastornos de motilidad intestinal” se usa para describir una variedad de trastornos en los que el intestino no se ha desarrollado adecuadamente o ha perdido su capacidad para coordinar la actividad muscular debido a diversas causas. Estos trastornos pueden manifestarse de diversas maneras e incluyen, pero no se limitan a, las siguientes:
• Distensión abdominal
• Obstrucción recurrente
• Dolor tipo cólico abdominal
• Estreñimiento
• Enfermedad por reflujo gastroesofágico
• Vómitos intratables y recurrentes
• Diarrea
• Síndrome de intestino irritable (SII)
• Enfermedad inflamatoria del intestino
• Incontinencia fecal
• Cólico infantil
• Frequent recurrent abdominal pain (Dolor abdominal recurrente frecuente - FRAP)
• Regurgitación
• Intolerancia alimentaria
En un sentido amplio, cualquier alteración significativa en el tránsito de los alimentos y las secreciones en el tracto digestivo puede considerarse un trastorno de la motilidad intestinal y esto está asociado, frecuentemente, con dolor gastrointestinal.
El “dolor gástrico” es un término colectivo usado para describir el dolor o la molestia en la parte superior del abdomen.
En una realización, la causa de dolor gástrico se selecciona del grupo que comprende, tal como que consiste en, dispepsia no ulcerosa, úlcera péptica, enfermedad por reflujo gastroesofágico y gastritis.
En una realización particular, la causa de dolor gástrico es gastritis y/o dispepsia no ulcerosa.
Tal como se usa en el presente documento, el término “frecuencia de disparo” se usa para medir los trenes de potenciales de acción sensitivos al cerebro.
Tal como se usa en el presente documento, el término “ presión pico intraluminal” (PPr) se basa en registros de presión intraluminal, en los que se miden los cambios de presión intraluminal en el punto medio del eje longitudinal del segmento intestinal. Se analiza la señal de presión y se identifica y mide la presión pico intraluminal (PPr).
Tal como se usa en el presente documento, el término “frecuencia del complejo motor migratorio” (frecuencia de MMC) se calcula contando el número de bandas de MC oscuras en mapas espacio-temporales.
Tal como se usa en el presente documento, el término “velocidad del complejo motor migratorio” (velocidad de MMC) se mide a partir de la(s) pendiente(s) de cada banda en el mapa espacio-temporal generado por los complejos motores migratorios.
Tal como se usa en el presente documento, el término “agente” se usa para referirse a cualquier sustancia o material que incluye células completas; microorganismos; medio condicionado; proteínas, péptidos, enzimas y/o moléculas derivados de tal medio condicionado; proteínas, péptidos, enzimas y/o moléculas secretados o derivados de células completas o microorganismos; u otro material biológico o químico que puede usarse para modular el dolor gastrointestinal en el sistema gastrointestinal de un mamífero. Un ejemplo de agentes preferidos son las cepas bacterianas, p. ej., cepas bacterianas probióticas y, particularmente, cepas de bacterias acidolácticas. Otro ejemplo de agente preferido es un medio condicionado a partir de cepas bacterianas, p. ej., cepas bacterianas probióticas y, particularmente, cepas de bacterias acidolácticas.
Un medio condicionado, algunas veces también denominado medio de cultivo condicionado, es un medio (de cultivo) en el que las células se han cultivado durante un periodo de tiempo. Las células cultivadas en el medio “condicionan” el medio al liberar o secretar diversos componentes o moléculas, tales como proteínas, péptidos, enzimas, citocinas, quimiocinas, sustancias químicas, etc.
Comienza a aceptarse que los microorganismos intestinales señalizan al cerebro como parte del denominado eje microbioma-intestino-cerebro. Sin embargo, se conoce muy poco acerca del papel del microbioma intestinal en el desarrollo o la función del sistema nervioso. Actualmente solo se conoce poco acerca de la naturaleza cuantitativa de la señal nerviosa retransmitida desde el intestino al sistema nervioso central.
Las neuronas sensitivas individuales, incluyendo aquellas entre las fibras del nervio vago, representan estímulos físicos continuos como trenes de potenciales de acción con patrón que codifican la naturaleza e intensidad del estímulo. Además de esto, los estímulos pueden representarse en un código poblacional determinado por el número de fibras activas en el fascículo. Toda la información que llega al cerebro a través de aferentes primarias tiene que codificarse en el lenguaje de trenes de potenciales de acción neuronales. Por tanto, saber cómo se ven afectados los trenes de potenciales de acción sensitivos por diversos agentes, tales como cepas comensales, cepas probióticas y diferentes sustancias, permitirá identificar nuevos microorganismos intestinales beneficiosos y sus moléculas activas por sus efectos sobre el disparo de aferentes primarias, así como nuevos fármacos y otros compuestos que pueden intervenir de diversas maneras en este sistema de señalización, particularmente mediante la modulación de la activación de TRPV1.
El método de las realizaciones en el presente documento se usa para seleccionar un agente para su uso en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal mediante la inhibición de la señalización a través del receptor TRPV1. De esta manera, el método de las realizaciones puede usarse para evaluar agentes que podrían ser eficaces potencialmente en la prevención de dolor gastrointestinal y/o eficaces en la reducción, inhibición o el tratamiento de dolor gastrointestinal. Por tanto, el método puede usarse para identificar agentes eficaces capaces de modular el dolor gastrointestinal asociado con el sistema nervioso central y/o periférico (entérico).
Por tanto, una realización se refiere a un método para seleccionar un agente eficaz en, es decir para su uso en, la reducción o prevención de dolor gastrointestinal en un sujeto. El método comprende seleccionar un agente capaz de reducir la activación espontánea y/o inducida del receptor de potencial transitorio vainilloide 1 (TRPV1).
De ese modo, las realizaciones se basan en el uso de la ruta de señalización de TRPV1 como herramienta de selección en la identificación de agentes que son eficaces en la modulación, particularmente, la prevención o reducción, tal como la inhibición o el tratamiento, de dolor gastrointestinal en sujetos que padecen enfermedades o trastornos que involucran o provocan dolor gastrointestinal de este tipo y que podrían denominarse enfermedades o trastornos con dolor gastrointestinal.
El método de las realizaciones se realiza, normalmente, in vitro o ex vivo tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Sin embargo, el agente es capaz preferiblemente de reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida en el sujeto cuando se administra al sujeto.
Por tanto, el método de las realizaciones puede usarse para hallar agentes adecuados para la reducción o prevención de dolor gastrointestinal en diferentes trastornos y enfermedades con dolor gastrointestinal. Los agentes se seleccionan para afectar a la activación de TRPV1 del sujeto de una manera beneficiosa para modular, es decir preferiblemente prevenir, reducir o tratar el dolor gastrointestinal.
En una realización, la enfermedad o el trastorno asociado con dolor gastrointestinal que ha de prevenirse o tratarse con un agente seleccionado mediante el método es una enfermedad o un trastorno con dolor gastrointestinal.
En una realización, el dolor gastrointestinal es dolor gástrico.
En una realización, el dolor gastrointestinal es dolor visceral.
En una realización, el dolor gastrointestinal puede estar presente en un sujeto que padece cólicos.
En una realización, el dolor gastrointestinal puede estar presente en un sujeto que padece síndrome de intestino irritable (SII).
En una realización, el dolor gastrointestinal puede estar presente en un sujeto que padece estreñimiento. El dolor gastrointestinal puede estar presente en sujetos que padecen trastornos de motilidad intestinal tal como se definió anteriormente.
Por tanto, en una realización, el sujeto padece de un trastorno de motilidad intestinal con dolor gastrointestinal asociado.
El método de las realizaciones se basa en el descubrimiento inesperado de que el dolor gastrointestinal incluyendo dolor asociado con diferentes afecciones y trastornos tales como trastornos de motilidad, y manifestado de manera central o periférica, está relacionado con la activación de TRPV1, que puede modularse mediante agentes previamente desconocidos, tales como bacterias acidolácticas.
Un tipo de dolor gastrointestinal es el dolor visceral que resulta de la activación de nociceptores de las vísceras abdominales (órganos). Las estructuras viscerales son altamente sensibles a la distensión (estiramiento), isquemia e inflamación, pero relativamente insensibles a otros estímulos que normalmente provocan dolor. El dolor visceral es difuso, difícil de localizar y frecuentemente se refiere a una estructura distante, habitualmente superficial. Puede estar acompañado de síntomas tales como náuseas, vómitos, cambios en las constantes vitales, así como manifestaciones emocionales. El dolor puede describirse como espantoso, profundo, opresivo y sordo. Distintas lesiones estructurales o anomalías bioquímicas explican este tipo de dolor solo en una proporción de pacientes. Estas enfermedades se agrupan a veces en gastrointestinal neuromuscular diseases (enfermedades neuromusculares gastrointestinales - GINMD). Las personas también pueden experimentar dolores viscerales, frecuentemente de naturaleza muy intensa, sin ninguna evidencia de motivo estructural, bioquímico o histopatológico para tales síntomas.
Un nociceptor es un receptor sensorial que responde a estímulos potencialmente dañinos mediante el envío de potenciales de acción a neuronas nociceptivas específicas (A5 o C) que se transmiten a los cordones anterolaterales de la médula espinal (más una proyección vagal menor) y, después, al tálamo, y al prosencéfalo que incluye las cortezas insular y cingulada. La activación de mensajes de dolor es crítica para la percepción de dolor que se origina en la patología intestinal desde el intestino hasta el sistema nervioso central a través de las fibras aferentes primarias extrínsecas que discurren en fascículos de nervios aferentes mesentéricos.
El método puede usarse para examinar agentes con el fin de seleccionar agentes con propiedades deseadas, p. ej., reducción de la activación de TRPV1, para su uso en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal. El parámetro que va a medirse en el método, es decir, la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida, puede monitorizarse y determinarse en modelos y sistemas diferentes. Al usar esta información, puede obtenerse un perfil útil para definir los efectos detallados y potencialmente matizados que tienen agentes específicos sobre la señalización de dolor en el dolor gastrointestinal.
Otros parámetros que pueden medirse en el método incluyen la señalización de dolor general, la actividad de disparo nervioso, p. ej., análisis de fascículos de nervios mesentéricos, y posiblemente con el uso de diferentes modelos in vivo de dolor gastrointestinal.
En una realización, se mide la activación de TRPV1 en células que expresan TRPV1, tales como neuronas de ganglios de la raíz dorsal (GRD), células CaCo2 u otra línea celular epitelial intestinal humana convencional. Puede medirse tanto la activación de TRPV1 espontánea como la activación de TRPV1 después de la inducción, p. ej., por capsaicina, cambio de pH o temperatura. Generalmente, cualquier célula o tejido que expresa TRPV1 puede usarse para medir la activación de TRPV1 según las realizaciones.
Por tanto, en una realización, el método comprende poner en contacto una célula que expresa TRPV1 con un agente que va a someterse a prueba. El método también comprende medir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida en la célula tras, es decir, después de, poner en contacto la célula con el agente que va a someterse a prueba. El método comprende además comparar la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida medida con una activación de TRPV1 de control. En esta realización, el método comprende además seleccionar el agente que va a someterse a prueba como agente eficaz en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal si la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida medida es menor que la activación de TRPV1 de control.
La activación de TPRV1 de control puede determinarse según diversas realizaciones. Por ejemplo, la activación de TRPV1 podría predefinirse y determinarse a partir de células que expresan TRPV1 con un nivel de activación que representa la activación normal o de nivel inicial correspondiente a, p. ej., sustancialmente la ausencia de dolor gastrointestinal.
Sin embargo, una realización preferida de determinación de la activación de TRPV1 de control es usar la célula que expresa TRPV1 como control interno. Por tanto, en una realización, el método comprende medir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida en la célula antes de poner en contacto la célula con el agente que va a someterse a prueba. El método también comprende determinar la activación de TRPV1 de control basándose en la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida medida en la célula antes de poner en contacto la célula con el agente que va a someterse a prueba.
En este enfoque, por tanto, se realizan preferiblemente mediciones de activación de TRPV1 espontánea y/o inducida dos veces: antes de poner en contacto la célula con el agente que va a someterse a prueba y después de poner en contacto la célula con el agente que va a someterse a prueba.
Alternativamente, pueden realizarse mediciones de activación de TRPV1 espontánea y/o inducida en dos experimentos paralelos: un experimento en el que se pone en contacto una célula con el agente que va a someterse a prueba y un experimento de control en el que no se pone en contacto una célula con el agente. Las células usadas
en los dos experimentos son entonces del mismo tipo, tales como ambas neuronas de GRD, células CaCo2 u otra línea celular epitelial intestinal humana convencional. La activación de TRPV1 espontánea y/o inducida se mide en ambos experimentos y luego se comparan entre sí.
La célula que va a usarse en el método puede ser cualquier célula que expresa TRPV1 incluyendo, pero sin limitarse a, preparaciones ex vivo, líneas celulares que expresan TRPV1, tales como líneas celulares epiteliales intestinales humanas que expresan TRPV1 y células primarias que expresan TRPV1.
La activación de TRPV1 espontánea y/o inducida medida y la activación de TRPV1 de control pueden expresarse generalmente como un valor de parámetro o métrica respectivo, incluyendo un valor que representa el nivel de activación de TRPV1 espontánea y/o inducida.
En una realización, se usan células primarias, tales como p. ej., neuronas de ganglios de la raíz dorsal (GRD), para analizar la activación de TRPV1.
En otra realización, se usan líneas celulares que expresan TRPV1 tales como CaCo2 u otra línea celular epitelial intestinal humana convencional para analizar la activación de TRPV1.
En otras realizaciones, se usan líneas celulares disponibles comercialmente que expresan TRPV1 para analizar la activación de TRPV1, véase, p. ej., el n.° de cat. CT6105 de Chantest.
También es posible usar células de genes indicadores, también denominadas células indicadoras en la técnica, que pueden usarse para monitorizar y medir la expresión de TRPV1 y/o la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida.
Pueden usarse varios métodos diferentes para estudiar la activación de TRPV1, incluyendo, pero sin limitarse a, análisis funcional mediante el uso, p. ej., de flujo de entrada de calcio inducido por p. ej. capsaicina y/o su prevención por un agente en células que expresan TRPV1 y frecuencias del disparo de fascículos de nervios mesentéricos, espontáneo y/o inducido, p. ej., por capsaicina. En otra realización, puede usarse una evaluación funcional de la actividad de canales iónicos regulada por la temperatura mediante el uso de una máquina de PCR en tiempo real, tal como se describe en Reubish, Emerling et al., BioTechniques 2009, para analizar la activación de TRPV1. En otra realización, pueden usarse ratones indicadores para el canal de TRPV1 para investigar la activación de TRPV1. También pueden usarse diversos paradigmas in vivo para analizar los efectos sobre el dolor en la invención. Estos métodos incluyen, p. ej., modelos de distensión gástrica y efectos sobre la frecuencia cardíaca (véase el ejemplo 3) y de distensión colorrectal.
Por tanto, en una realización, el método comprende medir el flujo de entrada de Ca2+ en la célula inducido por capsaicina u otra sustancia capaz de inducir la activación de TRPV1, p. ej., un análogo de capsaicina u otras sustancias capaces de activar TRPV1. Además, puede usarse la exposición de la célula a condiciones físicas seleccionadas para inducir la activación de TRPV1, incluyendo el cambio del pH o la temperatura. Por tanto, la exposición de la célula a pH ácido, pH básico y/o calor (temperaturas elevadas, normalmente mayores que aproximadamente 42 0C) puede inducir la activación de TRPV1. En esta realización, el flujo de entrada de Ca2+ en la célula que expresa TRPV1 se usa de esta manera como parámetro que representa la activación de TRPV1. Puede medirse entonces una reducción de la activación de TRPV1, y en particular una reducción de la activación de TRPV1 inducida por el pH, inducida por calor y/o inducida por capsaicina, como una reducción del flujo de entrada de Ca2+. En otra realización, el método comprende medir la actividad de canales iónicos regulada por la temperatura en la célula. En esta realización, la actividad de canales iónicos regulada por la temperatura en la célula que expresa TRPV1 se usa como parámetro que representa la activación de TRPV1. La actividad de canales iónicos regulada por la temperatura podría ser espontánea o inducida, tal como inducida por el aumento de la temperatura. Puede medirse entonces una reducción de la activación de TRPV1 como una reducción de la actividad de canales iónicos regulada por la temperatura en la célula.
En una realización, se mide la activación de TRPV1 mediante el uso de experimentos de fascículos de nervios aferentes mesentéricos. Por tanto, otro parámetro que puede medirse son las frecuencias de disparo espontáneo y/o inducido, p. ej., por capsaicina, cambio de pH o calor, de fascículos de nervios aferentes mesentéricos. Esta técnica puede usarse para determinar los cambios en la excitabilidad de las fibras nerviosas mesentéricas inducidos por diferentes agentes que van a someterse a prueba. En una realización, se extirpa un segmento gastrointestinal con o sin la arcada mesentérica que contiene el fascículo nervioso que suministra al segmento compuesto de fibras tanto espinales como vagales para los registros de fascículos nerviosos ex vivo (véase el ejemplo 1).
En algunas realizaciones, tiene importancia la especificidad regional del tracto gastrointestinal. Los segmentos adecuados para el análisis de nervios mesentéricos del método comprenden preferiblemente un fascículo nervioso adecuado para permitir la medición del disparo de nervios aferentes mesentéricos. Esto puede proporcionarse convenientemente al tener un segmento gastrointestinal con tejido mesentérico unido (véase el ejemplo 1). Por tanto, esta realización se lleva a cabo convenientemente en segmentos ex vivo de un animal de experimentación adecuado, por ejemplo, en segmentos
gastrointestinales de ratón (p. ej., segmentos de colon o yeyuno de ratón). La capacidad para realizar una comparación del efecto de un agente sobre el intestino delgado frente al intestino grueso podría ser ventajosa particularmente ya que, dependiendo del trastorno de motilidad intestinal que vaya a tratarse y el estadio clínico y los síntomas del mismo, podría ser beneficioso un tratamiento que es específico de la región, p. ej., específico para el intestino o bien delgado o bien grueso.
En una realización, se analiza el tráfico espinal de nervios aferentes mesentéricos para detectar partes específicas y seleccionadas del intestino. Sorprendentemente, se ha descubierto que diferentes agentes, tales como bacterias acidolácticas, pueden influir o modular los sistemas de señalización de dolor gastrointestinal en una parte, pero no en otra parte del tracto GI, y a través de diferentes rutas nerviosas, tales como vagal, o a través del ganglio de la raíz dorsal para el dolor visceral.
Por tanto, en una realización, el método comprende poner en contacto un segmento gastrointestinal ex vivo con tejido mesentérico unido con un agente que va a someterse a prueba. El método también comprende medir el disparo aferente mesentérico espontáneo y/o inducido en el segmento gastrointestinal ex vivo después de poner en contacto el segmento gastrointestinal ex vivo con el agente que va a someterse a prueba. El método comprende además comparar el disparo aferente mesentérico espontáneo y/o inducido medido con un disparo aferente mesentérico de control. En esta realización, el método comprende además seleccionar el agente que va a someterse a prueba como agente eficaz en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal si el disparo aferente mesentérico espontáneo y/o inducido medido es menor que el disparo aferente mesentérico de control.
El disparo aferente mesentérico de control puede determinarse tal como se comentó en lo anterior mediante el uso del segmento gastrointestinal ex vivo como control interno. En tal caso, el método comprende medir el disparo aferente mesentérico espontáneo y/o inducido en el segmento gastrointestinal ex vivo antes de poner en contacto el segmento gastrointestinal ex vivo con el agente que va a someterse a prueba. El método también comprende determinar el disparo aferente mesentérico de control basándose en el disparo aferente mesentérico espontáneo y/o inducido medido en el segmento gastrointestinal ex vivo antes de poner en contacto el segmento gastrointestinal ex vivo con el agente que va a someterse a prueba.
Alternativamente, pueden realizarse dos experimentos paralelos. En uno de ellos, se pone en contacto un segmento gastrointestinal ex vivo con el agente que va a someterse a prueba y en el otro experimento de control, no se pone en contacto un segmento gastrointestinal ex vivo con el agente. El disparo aferente mesentérico espontáneo y/o inducido se mide en ambos experimentos y se comparan entre sí.
El análisis de uno o más de estos parámetros anteriores dará como resultado un método para seleccionar agentes eficaces en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal.
En una realización particular, el segmento gastrointestinal ex vivo se selecciona de un segmento de colon o yeyuno ex vivo. En tal caso, el método comprende poner en contacto un segmento de colon o yeyuno ex vivo con tejido mesentérico unido con el agente que va a someterse a prueba.
Se describen ejemplos de métodos y aparatos adecuados para analizar la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida en los ejemplos y en las Figuras.
Por tanto, en métodos preferidos, el análisis presentado proporcionará datos sobre la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida. El análisis de uno o varios de estos parámetros dará como resultado un método preferido para seleccionar agentes eficaces en la reducción y/o prevención de dolor gastrointestinal.
Por tanto, el método de las realizaciones puede usarse para hallar agentes adecuados para el tratamiento, la prevención y/o reducción de dolor gastrointestinal, mediante el uso del modelo del presente documento.
El método presentado proporcionará datos sobre la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida con el uso de diferentes modelos. El análisis de este parámetro dará como resultado un método para seleccionar agentes eficaces en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal.
En una realización, el método analiza el efecto de un agente sobre la activación de TRPV1 (espontánea y/o inducida, p. ej., por capsaicina, cambio de pH y/o calor y su prevención por un agente) y, por tanto, puede usarse como una lectura para determinar la señalización de dolor gastrointestinal, es decir, si es probable que un agente tenga efecto sobre el dolor gastrointestinal, p. ej., dolor visceral. Un aumento o ningún efecto significativo sobre la actividad de TRPV1 espontánea o inducida (p. ej., por capsaicina, cambio de pH y/o calor) es indicativo de un agente que es probable que dé como resultado un aumento del dolor gastrointestinal, o ningún efecto significativo sobre el dolor gastrointestinal, respectivamente, mientras que una disminución de la actividad de TRPV1 espontánea y/o inducida (p. ej., por capsaicina, cambio de pH y/o calor) es indicativa de un agente que reducirá el dolor gastrointestinal. Por tanto, son agentes preferidos aquellos que dan como resultado una disminución de la actividad de TRPV1 espontánea y/o inducida (p. ej., por capsaicina).
En otra realización, el método analiza el efecto de un agente sobre la actividad de TRPV1 mediante el análisis del disparo espontáneo y/o inducido (p. ej., por capsaicina, cambio de pH y/o calor) de nervios aferentes mesentéricos (señalización de dolor) y, por tanto, puede usarse como una lectura para determinar el dolor gastrointestinal, es decir, si es probable o no que un agente tenga un efecto sobre el dolor gastrointestinal, p. ej., dolor visceral. Un aumento o ningún efecto significativo sobre el disparo de nervios aferentes es indicativo de un agente que es probable que dé como resultado un aumento del dolor gastrointestinal, o ningún efecto significativo sobre el dolor gastrointestinal, respectivamente, mientras que una disminución del disparo de nervios aferentes es indicativa de un agente que reducirá el dolor gastrointestinal. Por tanto, son agentes preferidos aquellos que dan como resultado una disminución del disparo de nervios aferentes, p. ej., una disminución de la frecuencia de disparo espontáneo y/o inducido de los fascículos de nervios aferentes.
El agente que va a someterse a prueba se añade al sistema elegido para el análisis de la actividad de TRPV1 de cualquier manera adecuada. Para analizar el efecto del agente sobre la señalización de dolor, los métodos se llevan a cabo convenientemente en presencia y ausencia del agente. Por ejemplo, la etapa del método se lleva a cabo antes y después de aplicar el agente. Por tanto, en esos métodos, el efecto del agente se compara con un control adecuado, por ejemplo, los resultados en presencia del agente de prueba se comparan con los resultados en ausencia de un agente de prueba, p. ej., resultados con tampón solo frente al tampón más agente.
Sorprendentemente, los inventores han descubierto que determinadas cepas de bacterias acidolácticas, p. ej. DSM 17938, pueden reducir la activación de TRPV1 en diferentes modelos ex vivo e in vitro (véanse los ejemplos 1 y 2). Por tanto, en una realización preferida, el agente es una cepa bacteriana, más preferiblemente, una bacteria acidoláctica. Por tanto, el método de las realizaciones puede usarse ventajosamente para someter a prueba diversas bacterias acidolácticas con el fin de identificar y seleccionar una o más cepas de bacterias acidolácticas que sean eficaces en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal en un sujeto tal como se determina mediante el método en términos de ser capaz de reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida.
Otro aspecto de las realizaciones es un agente seleccionado mediante el método de las realizaciones, es decir, que puede obtenerse mediante el método de selección.
Un agente preferido es un microorganismo, más preferiblemente una cepa bacteriana, preferentemente una bacteria acidoláctica, incluyendo partes o metabolitos de la misma.
Otro agente preferido es un medio condicionado a partir de tal microorganismo.
Un aspecto relacionado de las realizaciones define un agente que puede obtenerse mediante el método de selección de las realizaciones para su uso en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal en un sujeto.
En una realización particular, el agente puede obtenerse mediante el método de selección de las realizaciones para ser capaz de reducir la activación de RPTV1 espontánea y/o inducida para su uso en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal en un sujeto.
En una realización, para la reducción o prevención de dolor gastrointestinal se seleccionará un agente que actúa preferiblemente para disminuir la señalización de dolor según se evalúa mediante la monitorización del efecto del agente sobre la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida. Tal agente actuará preferiblemente para reducir o disminuir la activación de TRPV1 en neuronas de GRD, u otras células o tejidos que expresan TRPV1. Preferiblemente, el agente actuará para reducir la actividad de TRPV1 espontánea y/o inducida (p. ej., por capsaicina, cambio de pH y/o calor) mediante el uso de diferentes sistemas o modelos in vitro que incluyen, pero no se limitan a, células primarias y líneas celulares que expresan el receptor TRPV1 tal como se describió anteriormente.
En una realización, se selecciona un agente que actúa preferiblemente para reducir o disminuir la activación de TRPV1 en fascículos de nervios aferentes mesentéricos. El agente actuará para reducir las frecuencias de disparo espontáneo y/o inducido (p. ej., por capsaicina, cambio de pH y/o calor) de los fascículos de nervios aferentes mesentéricos.
Está claro a partir de lo anterior que el método de las realizaciones también puede usarse para seleccionar o identificar agentes que no son adecuados para el tratamiento de dolor gastrointestinal, por ejemplo, agentes que no tienen un efecto beneficioso sobre la reducción de la señalización de dolor. En particular, es improbable que aquellos agentes que no muestran ningún efecto sobre este parámetro sean adecuados para la reducción o prevención de dolor gastrointestinal. Además, es improbable que aquellos agentes que tienen un efecto de aumentar la señalización de dolor, medido mediante un aumento de la actividad de TRPV1 espontánea y/o inducida, sean adecuados para la reducción o prevención de dolor gastrointestinal.
Un aspecto adicional de las realizaciones se refiere a una composición que comprende un agente seleccionado mediante el método de las realizaciones y al menos un componente adicional. Así, al menos un componente
adicional se selecciona preferiblemente de un grupo que consiste en un portador farmacéuticamente aceptable, un diluyente farmacéuticamente aceptable, un excipiente farmacéuticamente aceptable, un producto alimenticio, un complemento alimenticio y otro agente preventivo o terapéutico.
Por tanto, una realización se refiere a una composición que comprende un agente que puede obtenerse mediante el método de selección de las realizaciones y al menos un componente adicional seleccionado de un grupo que consiste en un portador farmacéuticamente aceptable, un diluyente farmacéuticamente aceptable, un excipiente farmacéuticamente aceptable, un producto alimenticio, un complemento alimenticio y otro agente preventivo o terapéutico para su uso en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal en un sujeto.
El al menos un componente adicional puede administrarse junto con el agente seleccionado según las realizaciones o puede administrarse por separado. Además, el al menos un componente adicional puede administrarse al mismo tiempo que el agente seleccionado según las realizaciones o en puntos de tiempo diferentes. Los regímenes y momentos de administración adecuados pueden determinarse fácilmente por el experto dependiendo del componente adicional en cuestión.
En una realización, el al menos un componente adicional es cualquier componente nutricional adecuado, p. ej., un producto alimenticio o un complemento alimenticio.
En una realización, el otro agente preventivo o terapéutico puede ser cualquier agente adicional, que sea útil en la prevención o reducción, tal como el tratamiento, del dolor gastrointestinal en cuestión.
En otra realización, el otro agente preventivo o terapéutico es un agente capaz de afectar al mezclado y/o la motilidad gastrointestinal. El otro agente preventivo o terapéutico es entonces preferiblemente capaz de modular (aumentar o reducir, dependiendo de la afección que vaya a tratarse tal como se conoce en la técnica y se describe más adelante) el mezclado y/o la motilidad gastrointestinal.
En una realización adicional, el agente de las realizaciones puede tener funciones dobles, es decir, tener funciones tanto sobre el dolor gastrointestinal como en el mezclado y/o la motilidad gastrointestinal.
El agente seleccionado según las presentes realizaciones con el propósito de ser eficaz en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal puede someterse además a otro método de análisis o selección adicional con el propósito de determinar si el agente es eficaz adicionalmente en la modulación del mezclado y/o la motilidad gastrointestinal. El uso de tal agente puede ser interesante para la prevención o el tratamiento, p. ej., de trastornos de motilidad, ya que aborda tanto el dolor gastrointestinal como la alteración de la motilidad en conjunto. Se conocen en la técnica maneras de analizar la motilidad y/o mezclado. Los parámetros a analizar incluyen, pero no se limitan a, frecuencia de MMC, velocidad de MMC, presión intraluminal tal como PPr y otros modelos funcionales.
En los análisis de motilidad, los cambios en la motilidad gastrointestinal inducidos por un agente pueden detectarse, p. ej., como una alteración en el patrón de motilidad o las amplitudes de contracción. Algunos agentes no tendrán ningún efecto en absoluto. Un agente que puede aumentar la motilidad gastrointestinal, por ejemplo, aumentando la frecuencia de MMC y/o la velocidad de MMC y/o la presión intraluminal tal como PPr probablemente será útil para tratar trastornos asociados con dolor gastrointestinal en los que sería ventajoso aumentar la motilidad propulsora a lo largo del tubo digestivo tales como estreñimiento y cólicos.
Alternativamente si, por ejemplo, el trastorno de motilidad intestinal para el tratamiento es uno en el que se desea aumentar el tiempo de tránsito del material a través del intestino, p. ej., trastornos que implican un tránsito de paso rápido, tales como SII o diarrea, entonces actuará un agente de interés, además de sus efectos sobre la modulación de dolor gastrointestinal, para disminuir la motilidad gastrointestinal, por ejemplo disminuyendo la frecuencia de MMC o la velocidad de MMC o la presión intraluminal, p. ej., PPr. Los agentes preferidos disminuirán al menos la velocidad de MMC. Los agentes preferidos disminuirán dos o más de estos parámetros, por ejemplo disminuirán la velocidad de MMC y la frecuencia de MMC o disminuirán la frecuencia de MMC y la presión intraluminal (p. ej., PPr) o disminuirán la velocidad de MMC y la presión intraluminal (p. ej., PPr). Los agentes más preferidos disminuirán todos estos parámetros, por ejemplo disminuirán la frecuencia de MMC, la velocidad de MMC y la presión intraluminal (p. ej., PPr). El análisis de motilidad puede evaluarse en un segmento gastrointestinal adecuado del intestino delgado o grueso, por ejemplo, un segmento de yeyuno del intestino delgado o un segmento de colon del intestino grueso. En algunas realizaciones, se prefiere el uso de segmentos del intestino grueso, p. ej., del colon.
Un aspecto adicional de las realizaciones se refiere a un agente seleccionado mediante el método de las realizaciones o una composición tal como se definió anteriormente para su uso en la reducción o prevención de dolor gastrointestinal en un sujeto.
Un aspecto relacionado de las realizaciones define el uso de un agente seleccionado mediante el método de las realizaciones, p. ej., que puede obtenerse mediante el método de selección según las realizaciones, o una
composición tal como se definió anteriormente para la fabricación de un medicamento, un producto alimenticio o un producto de complemento alimenticio para la reducción o prevención de dolor gastrointestinal en un sujeto.
Otra realización define un método para la reducción o prevención de dolor gastrointestinal en un sujeto. El método comprende administrar una cantidad eficaz de un agente seleccionado mediante el método de las realizaciones, p. ej., que puede obtenerse mediante el método de selección según las realizaciones, o una composición tal como se definió anteriormente al sujeto.
En una realización de estos aspectos, el agente es una cepa bacteriana preferiblemente una cepa de bacterias acidolácticas y, más preferiblemente, una cepa de Lactobacillus reuteri, tal como una cepa bacteriana capaz de reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida, preferiblemente una cepa de bacterias acidolácticas capaz de reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida y, más preferiblemente, una cepa de Lactobacillus reuteri capaz de reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida.
En una realización de estos aspectos, el agente es preferiblemente Lactobacillus reuteri DSM 17938. En otra realización, el agente es otra cepa de bacterias acidolácticas, es decir, el agente es una cepa de bacterias acidolácticas distinta de Lactobacillus reuteri DSM 17938 preferiblemente una cepa de Lactobacillus reuteri distinta de Lactobacillus reuteri DSM 17938.
En una realización de estos aspectos, el agente es un medio condicionado a partir de una cepa bacteriana, preferentemente a partir de una cepa de bacterias acidolácticas y, más preferiblemente, a partir de una cepa de Lactobacillus reuteri, tal como un medio condicionado a partir de una cepa bacteriana capaz de reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida, preferiblemente a partir de una cepa de bacterias acidolácticas capaz de reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida y, más preferiblemente, a partir de una cepa de Lactobacillus reuteri capaz de reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida.
En una realización, el agente es un medio condicionado a partir de cepas de bacterias acidolácticas, preferiblemente a partir de Lactobacillus reuteri DSM 17938 o una cepa de Lactobacillus reuteri distinta de Lactobacillus reuteri DSM 17938. El medio usado para medio condicionado de este tipo puede ser cualquier medio adecuado para cultivar cepas de bacterias acidolácticas conocidas en la técnica. En una realización, el medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe) se usa como material de partida para producir medio condicionado a partir de cepas de bacterias acidolácticas, preferiblemente de Lactobacillus reuteri DSM 17938. En una realización de la invención, el medio condicionado de cepas de bacterias acidolácticas, preferiblemente de Lactobacillus reuteri DSM 17938, se liofiliza antes de introducirse o usarse como composición.
En otra realización, uno o varios componentes del medio condicionado a partir de cepas de bacterias acidolácticas, preferiblemente de Lactobacillus reuteri DSM 17938, se aíslan y administran como componentes purificados y/o enriquecidos a un sujeto en forma de una composición adecuada. Los ejemplos de tales componentes incluyen proteínas, péptidos, enzimas y otras moléculas secretados preferiblemente a partir de la cepa de bacterias acidolácticas al medio. Además, estos componentes extraídos directamente de las cepas de bacterias acidolácticas pueden usarse según las realizaciones.
Se eligen un modo de administración y una formulación adecuados del agente o la composición dependiendo del sitio de la enfermedad. Un modo de administración preferido es por vía oral, sin embargo, igualmente será adecuado para algunos tratamientos la inyección intravenosa o intramuscular.
Las dosis adecuadas del agente o la composición pueden seleccionarse fácilmente o determinarlas un experto dependiendo del trastorno que va a tratarse, el modo de administración y la formulación en cuestión.
En una realización, el receptor TRPV1 se modula localmente, p. ej., mediante el uso de bacterias acidolácticas administradas por vía oral que pueden modular la activación de TRPV1 selectivamente en el tracto GI, en un sujeto que padece dolor gastrointestinal y minimizando de ese modo cualquier efecto adverso en dicho sujeto. Se cree que esta ruta de administración preferida del agente, particularmente, una cepa de bacterias acidolácticas seleccionada mediante el método de las realizaciones, afectará principalmente a la activación de TRPV1 localmente, es decir, dentro del sistema gastrointestinal. Por tanto, el agente tendrá entonces un efecto beneficioso en la prevención o reducción de dolor gastrointestinal mientras se minimiza cualquier modulación de TRPV1 no deseada fuera del sistema gastrointestinal.
En los métodos y usos de las presentes realizaciones descritas en el presente documento, los términos “ aumentar” , “disminuir” , “ reducir” , etc., se refieren a un cambio medible en los niveles, preferiblemente un cambio significativo en los niveles, más preferiblemente un cambio estadísticamente significativo, preferiblemente con un valor de probabilidad de <0,05.
Los sujetos preferidos son mamíferos, más preferiblemente, seres humanos.
Cuando el trastorno de motilidad intestinal asociado con dolor gastrointestinal que va a tratarse es estreñimiento, entonces los sujetos preferidos son pacientes de edad avanzada o mujeres embarazadas. Generalmente, se entenderá que un paciente de edad avanzada es un paciente de 70 años de edad o más.
Cuando el trastorno de motilidad intestinal asociado con dolor gastrointestinal que va a tratarse son cólicos, preferiblemente esto es cólico infantil.
Los usos de los agentes preferiblemente cepas de bacterias acidolácticas, seleccionados según el método de las realizaciones incluyen la reducción, prevención o el alivio del trastorno o síntomas del trastorno relevantes (p. ej., puede dar como resultado la modulación de los síntomas de la enfermedad). Tal reducción, prevención o alivio de un trastorno o síntomas del mismo puede medirse mediante cualquier ensayo adecuado.
Es un objetivo de una realización hallar agentes, tales como bacterias acidolácticas, incluyendo partes o metabolitos de las mismas, tales como presentes en o extraídos de un medio condicionado, adecuados para el tratamiento, la reducción, prevención o modulación de dolor gastrointestinal, p. ej., en trastornos de motilidad específicos y/u otros trastornos/enfermedades con dolor gastrointestinal, mediante el uso del modelo en el presente documento basado en el efecto del agente sobre la actividad de TRPV1 espontánea y/o inducida.
En una realización, el objetivo es seleccionar una cepa bacteriana probiótica, tal como una cepa de bacterias acidolácticas, que puede ser eficaz en la prevención o reducción de dolor gastrointestinal asociado con estreñimiento en seres humanos, especialmente sujetos de edad avanzada o mujeres embarazadas.
En una realización, el objetivo es seleccionar un agente, por ejemplo, una cepa de bacterias acidolácticas, que puede ser eficaz en la prevención o reducción de dolor gastrointestinal asociado con cólicos infantiles.
En una realización, el objetivo es seleccionar un agente, por ejemplo, una cepa de bacterias acidolácticas, que puede ser eficaz en el tratamiento, la prevención o reducción de síntomas de dolor gastrointestinal del síndrome de intestino irritable (SII).
Los siguientes son algunos ejemplos de la invención, los cuales no deben considerarse limitativos del uso en el presente documento, sino para mostrar con detalle ejemplos prácticos de cómo puede usarse la invención. El ejemplo 1 se refiere a un experimento de fascículos de nervios mesentéricos que muestra que DSM 17938 inhibe la frecuencia de disparo de nervios mesentéricos. El ejemplo 2 muestra que DSM 17938 bloquea el flujo de entrada de calcio inducido por capsaicina en cultivos primarios de GRD. El ejemplo 3 demuestra que DSM 17938 inhibe la ralentización de la frecuencia cardíaca provocada por la distensión gástrica.
Ejemplos
Ejemplo 1
Experimentos de fascículos de nervios mesentéricos
Registros extracelulares
Se adquirieron ratones Swiss Webster macho adultos (20-30 g) de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Se sacrificaron los ratones mediante dislocación cervical. Todos los procedimientos siguientes fueron ex vivo.
Se extirparon segmentos de yeyuno distal (~ 2,5 cm) con tejido mesentérico unido de los animales recién sacrificados y se colocaron en una placa de Petri recubierta con Sylgard llena de tampón de Krebs (en mM): NaCl 118, KCl 4,8, NaHCO3 25, NaH2PO4 1,0, MgSO4 1,2, glucosa 11,1 y CaCl2 2,5 burbujeados con carbógeno (95 % de O2 - 5 % de CO2). Se canularon los extremos bucal y anal de cada segmento con una tubería de plástico y se vaciaron. Se sujetó el tejido con alfileres al Sylgard y se expuso el fascículo de nervios mesentéricos. Se colocó la placa de Petri sobre la platina de un microscopio invertido y se perfundió por gravedad la luz a 0,5-1 ml/min con tampón de Krebs oxigenado o tampón de Krebs con aditivos (Perez-Burgos A., Wang B et al., American journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology 2013;304:G211-20). Se perfundió el compartimento seroso por separado con tampón de Krebs precalentado (34 0C) a 3-5 ml/min. Se aspiró suavemente el fascículo nervioso en una pipeta de vidrio unida a un portaelectrodos de registro electrofisiológico de fijación de voltaje (CV-7 B; Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se realizaron registros nerviosos extracelulares elaborados con el uso de un amplificador Multi-Clamp 700B y un convertidor de señales Digidata 1440A (Molecular Devices). Se filtraron con filtros paso banda señales eléctricas a 0,1-2 kHz, se muestrearon a 20 kHz y se almacenaron en un ordenador personal que ejecuta el software pClamp 10 (Molecular Devices). Se realizaron distensiones repetidas de segmentos elevando la presión intraluminal por encima de 2 hPa. Se aplicó una altura piezoeléctrica por gravedad constante de 48 hPa al tampón de Krebs que perfundía la luz y se elevó la presión cerrando el tubo de flujo de salida durante 1 min hasta un máximo de 3 distensiones consecutivas. Se dejaron los segmentos en reposo durante 9 minutos entre distensiones. Se registró la actividad eléctrica multiunitaria constitutiva en ausencia de presión intraluminal positiva.
Vagotomía
Se llevó a cabo vagotomía subdiafragmática tal como se describió previamente (van der Kleij H, O 'Mahony C et al. American Journal of Physiology Regulatory, Integrative and Comparative Physiology 2008;295:R1131-7). Se permitió que los animales se recuperasen durante 10-14 días antes de extraer el yeyuno y el tejido mesentérico para los experimentos electrofisiológicos. Se realizaron vagotomías simuladas en 3 animales. Después de la operación, se midieron diariamente el peso corporal y la salud general de los ratones. No se hallaron evidencias de diferencias significativas en el aumento de peso 1 semana después de la cirugía en animales vagotomizados o tratados de manera simulada (datos no mostrados). Todos los ratones vagotomizados se sometieron a prueba para determinar si se completó el procedimiento registrando después de cada experimento las respuestas a la aplicación serosa de colecistoquinina (CCK). La vagotomía solo se consideró eficaz cuando la CCK no aumentó la tasa de disparo de nervios mesentéricos (Perez-Burgos A., Wang B et al., American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology 2013;304:G211 -20).
Fármacos y bacterias
DSM 17938 lo donó BioGaia AB (Estocolmo, Suecia), mientras que Lactobacillus rhamnosus JB-1 se tomó de una reserva en el Brian-Body Institute en McMaster University (Ontario, Canadá). Todos los procedimientos fueron tal como se notificó previamente (Kunze WA, Mao YK et al., Journal of Cellular and Molecular Medicine 2009;13:2261-70, Ma X, Mao YK et al., American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology 2009;296:G868-75, Wang B, Mao YK, FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 2010;24:4078-88). Los números de bacterias se determinaron ópticamente y se verificó la viabilidad después de la siembra sobre placas de agar con medio de crecimiento. Se descongelaron las bacterias de las reservas congeladas, se centrifugaron a 2000 rpm durante 15 min, y se suspendió el sedimento en tampón de Krebs y se centrifugó de nuevo y se resuspendió. Antes del uso, se diluyeron las bacterias hasta concentraciones de trabajo con tampón de Krebs. Se obtuvo colecistoquinina (CCK) sulfatada (25-33) de AnaSpec (Fremont, CA); nicardipino, capsaicina y 6-yodonordihidrocapsaicina de Sigma-Aldrich y w-conotoxina GVIA (w-Cg-GVIA) y w-conotoxina MVIIC (w-Cg-MVIIC) de Alomone Labs (Jerusalén, Israel). Se disolvieron la 6-yodonordihidrocapsaicina y CCK en DMSO; se disolvió la capsaicina en etanol para preparar alícuotas de disolución madre. El día del experimento se diluyeron las alícuotas en tampón de Krebs hasta concentraciones de trabajo con concentraciones finales de DMSO y etanol < 0,01 % y < 0,1 %, respectivamente.
Análisis de datos fuera de línea
Se midieron las frecuencias de disparo espontáneo multiunitario y monounitario mediante el uso del software Clampfit 10.2 (Molecular Devices) y Origin 8.5 (Northampton, MA). Se usaron registros de potenciales de acción multiunitarios y monounitarios de manera rutinaria para determinar cambios en las tasas de disparo de fibras nerviosas mesentéricas inducido mediante la exposición del intestino a diferentes estímulos o agentes farmacológicos (Perez-Burgos A., Wang B et al., American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology 2013;304:G211-20). Se determinó el ritmo de los potenciales de acción en el registro multiunitario mediante el uso del módulo de detección de picos de Clampfit, y se calculó la frecuencia de disparo promedio a partir de intervalos entre potenciales de acción. Se extrajeron las componentes monounitarias de la señal multiunitaria mediante coincidencia de forma de potencial de acción mediante el uso de la herramienta de detección de plantillas de forma de potencial de acción de Clampfit (análisis computarizado de forma de onda). Después de ejecutar el algoritmo de detección de plantillas, siempre se verificó la discriminación de potenciales de acción monounitarios mediante inspección visual, y se descartaron eventos de potenciales de acción no coincidentes (<0,2 %) (Perez-Burgos A., Wang B et al., American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Hhysiology 2013;304:G211 -20).
Estadística
Los datos se expresan como la media ± E.E., en los que N se refiere al número total de segmentos de yeyuno registrados y n se refiere al número de actividad de fibras individuales extraída de registros multiunitarios. Se extrajo un máximo de 6 componentes multiunitarios de cada registro multiunitario. Se usaron las pruebas de Wilcoxon o de la t para datos independientes para comparaciones de datos emparejados o independientes, respectivamente; Se usó ANOVA de un factor y de dos factores con la prueba post hoc de Bonferroni para comparar múltiples grupos según fuese adecuado. Debido a que pueden producirse grandes variaciones en la actividad espontánea entre una preparación y otra en comparaciones de actividad neural multiunitaria, se emparejaron antes y después de realizar registros de tratamiento, en los que cada fascículo nervioso sirvió como su propio control para garantizar cambios significativos en cada tratamiento o dosis del fármaco. Se representó gráficamente el porcentaje de aumento del disparo por encima de la frecuencia de nivel inicial frente a la concentración de capsaicina (en presencia o ausencia de bacterias) y se ajustó esto mediante una ecuación logística de dosis-respuesta [Y = parte inferior (parte superior -parte inferior/10LogCE50-x)j. Los parámetros que describen los ajustes logísticos se compararon mediante una prueba de la F de suma de cuadrados extra. Se realizaron todas las pruebas estadísticas mediante el uso del software Prism 5.0 (software GraphPad, San Diego, CA).
Efectos de DSM 17938 sobre la frecuencia de disparo espontáneo de nervios mesentéricos
DSM 17938 luminal influyó en la descarga espontánea multiunitaria del nervio mesentérico (Perez-Burgos A., Wang B et al., American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology 2013;304:G211 -20).
1x109 ufc/ml de DSM 17938 intraluminal provocó una disminución de la frecuencia de disparo multiunitario espontáneo en 22 % desde 36,3 ± 8,4 hasta 28,2 ± 7,2 Hz (N = 7, P = 0,02, Figura 1A); DSM 17938 a 1x108 ufc/ml cambió la descarga espontánea en 19 % desde 21,6 ± 5,1 hasta 17,6 ± 6 Hz, N = 6, P= 0,09, Figura 1B). El medio condicionado con DSM 17938 (1:5) también disminuyó la descarga espontánea en 37 % desde 22,6 ± 4,2 hasta 14,17 ± 2,4 Hz (N = 7, P= 0,03, Figura 1C). Sin embargo, DSM 17938 destruido mediante irradiación con radiación y o caldo solo no disminuyó la excitabilidad de aferentes: desde 17,84 ± 5,3 hasta 18,25 ± 4,1 Hz (N = 6, P= 0,84) y desde 20,48 ± 1,6 hasta 21,49 ± 2,8 Hz (N= 6, P = 0,10), respectivamente (Figuras 1 D-E).
Vagotomía y parálisis muscular no inhibieron la reducción por DSM 17938 de disparo espontáneo de nervios mesentéricos
Se investigó si el efecto de 1 x109 ufc/ml de DSM 17938 sobre la descarga espontánea se suprimía mediante vagotomía previa. Para controlar las posibles acciones directas de DSM 17938 sobre células de músculo liso, se añadió aquí y en todos los experimentos subsiguientes de disparo espontáneo el bloqueante de canal de Ca2+ de tipo L, nicardipino (3 pM) que inhibe las contracciones musculares. Por tanto, después de la vagotomía y de la adición de nicardipino, DSM 17938 redujo la frecuencia de disparo multiunitario en 18 % desde 16,72 ± 1,9 hasta 13,77 ± 1,9 Hz (N= 17, P= 0,001, Figuras 2A, 2C). Los datos de los animales vagotomizados y músculo paralizado se analizaron entonces con respecto a las tasas de disparo monounitario. DSM 17938 redujo la frecuencia de disparo monounitario en 19 % desde 0,36 ± 0,05 hasta 0,29 ± 0,03 Hz (n= 30, P= 0,02, Figuras 2B, 2C); de estas fibras, la mayoría (20/30) mostró una disminución de la frecuencia de 36 % desde 0,42 ± 0,06 hasta 0,27 ± 0,04 Hz (P< 0,0001), pero la fracción más pequeña de las fibras restantes aumentó su tasa de disparo en 29 % desde 0,24 ± 0,04 hasta 0,31 ± 0,06 Hz (n= 10/30, P= 0,006).
DSM 17938 disminuyó la frecuencia de disparo monounitario espinal y la respuesta a la capsaicina por el antagonismo parcial insuperable de los receptores TRPV1
Se sometió a prueba si DSM 17938 podía modificar el aumento de la frecuencia de disparo inducido por capsaicina en la excitación monounitaria en el tejido tomado de ratones vagotomizados previamente. La capsaicina aplicada al compartimento seroso aumentó la tasa de disparo espontáneo multiunitario y monounitario, con latencias iniciales de ~ 60 s y de manera dependiente de la dosis. Dado que los receptores sensibles a la capsaicina TRPV1 se desensibilizan, y las aplicaciones posteriores del agonista pueden dar lugar a un efecto disminuido, se examinaron las respuestas a un rango de dosis de capsaicina (100 nM-100 pM) en segmentos de yeyuno individuales. Esto se hizo con y sin 20 min de aplicación intraluminal previa de 1x109 ufc/ml de DSM 17938 (N=25 para cada curva, 5 segmentos por cada concentración; se analizaron ~ 6 componentes monounitarias espinales para cada segmento). Se representó gráficamente el porcentaje de aumento de la frecuencia de disparo frente a la concentración de capsaicina o concentración de capsaicina más DSM 17938 y se ajustó con una ecuación logística de tres parámetros de la forma Y= parte inferior (parte superior-parte inferior)/(1 10LogCE50-X). CE50 para capsaicina sola fue de 200 nM en comparación con 500 nM para capsaicina en presencia de DSM 17938 (P= 0,71). La respuesta máxima (parte superior) obtenida con capsaicina fue de 238,4 ± 27,5 % frente a 129 ± 17 % obtenida con capsaicina más DsM 17938 (P= 0,004, Figura 3A). Según los informes anteriores, algunas fibras espinales no fueron excitadas por capsaicina. Se examinó si la capsaicina excitó las fibras espinales directamente, o si la excitación dependía de la transmisión sináptica intraparietal desde neuronas entéricas a terminaciones espinales intraganglionares. Se añadió capsaicina 1 pM en el compartimento seroso después de bloquear la transmisión sináptica intraparietal mediante la adición de 500 nM de cada uno de los bloqueantes de Ca2+ w-Cg-GVIA y w-Cg-MVIIC. El bloqueo sináptico intraparietal no disminuyó la excitación provocada por capsaicina que fue de 187,5 ± 42,9 % (n= 17) en ausencia de las conotoxinas y del 219,1 ± 72,6 (n= 12) en presencia de las mismas (P= 0,947, Figura 3B). Se concluyó que la acción de DSM 17938 sobre aferentes espinales no implica la transmisión sináptica intraparietal.
Efectos del medio condicionado con DSM 17938 que contiene productos liberados bacterianos de DSM 17938 redujeron las acciones de capsaicina sobre fibras espinales
Se sometió a prueba si los productos bacterianos de DSM 17938 subyacen al antagonismo de TRPV1 sobre aferentes mesentéricas. La diana de DSM 17938 en las aferentes mesentéricas son predominantemente fibras espinales, dado que el porcentaje de reducción de la frecuencia de disparo espontáneo inducido por DSM 17938 fue muy similar con y sin vagotomía previa (18 % en comparación con 22 %, respectivamente); entonces, se aplicó capsaicina 1 pM en fibras mesentéricas no vagotomizadas que recibieron una aplicación intraluminal previa del medio condicionado con DSM 17938 durante 20 min. El medio condicionado con DSM 17938 (1:5) inhibió el aumento de la frecuencia de disparo inducido por capsaicina (%) sobre fibras individuales mesentéricas desde 187,5 ± 43 % (grupo de control, N= 17) hasta
74,89 ± 22 % (N= 14), y fue similar al porcentaje de aumento inducido por capsaicina sobre fibras espinales con 1 x 109 ufc/ml de tratamiento con DSM 17938 (80,29 ± 22 %, N= 17) (P= 0,02, prueba ANOVA de un factor; Figura 7).
El antagonismo de DSM 17938 o TRPV1 redujo el disparo provocado por distensión
En ausencia de nicardipino para permitir la contracción muscular, se registró la frecuencia de disparo multiunitario y monounitario de las fibras que se supone que son nociceptores (Grundy D, Gut 2004;53 Supl. 2:ii5-8). Se sometió a prueba si DSM 17938 podía reducir su respuesta excitadora provocada por la elevación de la presión intraluminal hasta una intensidad nociceptiva de 48 hPa (36 mmHg) (Perez-Burgos A., Wang B et al., American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology 2013;304:G211-20). La primera respuesta de estas fibras a la distensión intestinal es generalmente mayor que la obtenida con una distensión posterior, pero permanece constante hasta 3 distensiones adicionales (Perez-Burgos A., Wang B et al., American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology 2013;304:G211-20). Por tanto, se usó la 2a de 3 distensiones sucesivas para comparaciones. El disparo multiunitario fue de 111,5 ± 16,7 Hz durante la distensión, pero después de añadir DSM 17938 durante 20 min, la distensión aumentó el disparo solo hasta 86,5 ± 10,6 Hz (N= 5, P= 0,31). La frecuencia de disparo monounitario espinal fue de 3,01 ± 0,44 Hz durante la distensión, pero en presencia de DSM 17938, el disparo fue de 1,71 ± 0,16 durante la distensión (n= 28, P= 0,008, Figura 4A). La frecuencia de disparo previa a la distensión fue de 0,31 ± 0,05 frente a 0,25 ± 0,07 Hz (n= 28, P= 0,053, Figura 4A) para el control frente a DSM 17938 añadido. El antagonista de TRPV1 6-yodonordihidrocapsaicina (10 pM) imitó el efecto de DSM 17938 en la respuesta monounitaria al reducir la respuesta a la distensión desde 3,26 ± 0,73 hasta 2,23 ± 0,50 Hz (n= 13, P= 0,0002, prueba de Wilcoxon, Figura 4B en ausencia de nicardipino).
Ejemplo 2
DSM 17938 bloqueó el aumento de Ca2+ inducido por capsaicina en cultivos primarios neuronales de GRD
Cultivos primarios de ganglios de la raíz dorsal (GRD)
Se extirpó la columna vertebral del cuerpo, se transfirió a un vaso de precipitados que contenía tampón de Krebs enfriado con hielo y se sometió a bisección longitudinalmente. Se expusieron los GRD y recogieron de los niveles toracolumbares. Se lavaron los GRD completos dos veces con medio L-15 de Leibovitz estéril (GIBCO, Gaithersburg, MD), y se incubaron durante 40 min en colagenasa tipo 1 a 1 mg/ml (Sigma-Aldrich; Oakville, ON, Canadá) y 0,5 ml de tripsina (a 0,25 %, GIBCO) en 20 ml de medio L-15 a 37 °C. Después de la adición posterior de 5 ml de medio L-15 que contenía suero bovino fetal a 10 % (FBS, GIBCO), se centrifugaron los ganglios durante 5 min a 1000 rpm y, luego, se lavaron dos veces con medio de crecimiento (medio L-15 que contenía FBS a 10 %, penicilina/estreptomicina/glutamina a 1 %, HEPES a 1 % y piruvato de Na a 1 %). Se pusieron los GRD en 2 ml de medio de crecimiento y se trituraron 10 veces. Luego, se centrifugaron los ganglios durante de 10 s a 500 rpm y se transfirió el sobrenadante a un tubo estéril. Se resuspendieron en 2 ml de medio de crecimiento, se trituraron repetidamente hasta que el volumen de sobrenadante transferido fue de 10 ml, se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm y se resuspendió el sedimento final en 3 ml de medio de crecimiento. Se sembraron neuronas sobre 3 placas de Petri de fondo de vidrio recubiertas con poli-D-lisina (MatTek, Ashland, MA). Se añadieron 1,5 ml adicionales de medio de crecimiento a cada placa después de 30 min y se incubó el conjunto durante 24 h a 37 °C con carbógeno.
Obtención de imágenes con Ca2+
Se pusieron neuronas de GRD dentro de una placa de registro de Plexiglass y se cargaron con el indicador de Ca2+ Fluo-4-AM (8 pM) diluido en tampón de Krebs con ácido plurónico a 0,1 % (en DMSO) a 37 °C durante 60 min. Se colocó la placa en el compartimiento de registro y se superfundió con tampón de Krebs recién preparado (~ 34 °C) durante 15 min para permitir la retirada por lavado del colorante. Se observaron las células en un microscopio invertido (Nikon eclipse TE 2000-S, Melville, NY) y se tomaron imágenes mediante el uso de una cámara Rolera-XR (Surrey, BC, Canadá). Se registró la intensidad de fluorescencia en neuronas individuales mediante el software Simple PCI 6 (Compix Inc, Imaging systems, Sewickley, PA). Se administraron fármacos mediante una micropipeta unida a un dispositivo de insuflación de pulsos de presión controlado electrónicamente (Picospritzer II; General Valve Fairfield, NJ) con la punta <100 pm desde la célula. Se almacenaron imágenes, registradas en 0,9 fotogramas/s, en un disco duro local. Se analizaron los archivos de imagen fuera de línea mediante el uso del software Image J (NIH, EE. UU., http://imagei.nih.gov/ii). Se midió el aumento de Fluo-4 Ca2+ cuando se aplicó capsaicina como la intensidad de fluorescencia de la razón (F/F0) después de la capsaicina (F) dividida entre la intensidad antes de la capsaicina (F0). Las bacterias y los fármacos se manipularon como en el ejemplo 1.
Resultados
Se investigó adicionalmente la especificidad del efecto de DSM 17938 sobre neuronas espinales sometiendo a la prueba la capacidad de la bacteria para inhibir la respuesta del agonista del receptor TRPV1, capsaicina. En estos experimentos, también se incluyó JB-1. Previamente, se ha demostrado que JB-1 (Lactobacillus rhamnosus) reduce el dolor y la descarga de disparo de fibras individuales de GRD inducidos por distensión gástrica (Duncker et al., The
Journal of Nutrition 2011). Puesto que la apertura de los canales de TRPV1 eleva la concentración de Ca2+ intracelular, se usó la obtención de imágenes con Ca2+ del cultivo primario neuronal de GRD para estos experimentos. La insuflación de capsaicina 1 pM sobre neuronas de GRD provocó un aumento de Ca2+ intracelular en un plazo de ~ 30 s (Figura 5A). Puesto que el canal de TRPV1 puede desensibilizarse con la exposición repetida a ligandos, solo se aplicó capsaicina una vez a cada placa de cultivo. Luego, se añadió DSM 17938 o JB-1 30 min antes de aplicar la capsaicina. DSM 17938 a 1x109 ufc/ml disminuyó la razón de elevación de fluorescencia desde 2,36 ± 0,31 (grupo de control, N= 14) hasta 1,25 ± 0,04 F/F0. Pero, 1x108 ufc/ml de DSM 17938 cambió F/F0 a 2,67 ± 0,35 y 1x108® ufc/ml de DSM 17938 a 2,07 ± 0,27. La adición de 1x109 ufc/ml de JB-1 tuvo poco efecto y cambió la razón F/F0 a 2,48 ± 0,19 (N= 9), lo que es similar a la razón obtenida con capsaicina sola (Figura 5B). Estos resultados demuestran que DSM 17938 puede bloquear el aumento de Ca2+ inducido por capsaicina en cultivos primarios neuronales de GRD.
Ejemplo 3
DSM 17938 inhibió la ralentización de la frecuencia cardíaca provocada por la distensión gástrica
Un total de 17 ratas se asignaron a 2 grupos. A su llegada, se permitió que las ratas se aclimatasen durante 1 semana seguido de manipulación durante 1 semana (10 min/d) para minimizar los efectos del estrés durante los experimentos. Se alimentaron las ratas por sonda nasogástrica cada mañana durante 9 d con o bien 0,2 ml (1x109 ufc/ml) de DSM 17938 vivo en tampón de Krebs o bien solo tampón de Krebs como control (vehículo). Los métodos para GD se han publicado previamente (Tougas, Wang, American Journal of Physiology 1999;277:R272-8). En resumen, las ratas estuvieron en estado de ayuno toda la noche, se anestesiaron con una mezcla de clorhidrato de ketamina (75 mg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal. Se administró anestesia complementaria según fue necesario. Después de una laparotomía de línea media, se insertó un dispositivo de distensión que consistía en un balón gástrico de forma esférica (2 cm de d.i.) fijado a un catéter de teflón (20 cm) en el estómago a través de una pequeña incisión en la parte proximal del duodeno y se conectó a un sistema barostático (Distender, G&J Electronic, Toronto, Canadá). Se midió la respuesta cardíaca mientras se inflaba el balón con aire hasta presiones de 40 y 60 mm Hg durante 60 s. Se permitieron 10 min de descanso para la recuperación después de cada distensión. Solo se aplicó un conjunto de distensiones a cada rata para evitar posibles mecanismos compensatorios y se sacrificaron las ratas después de las mediciones antes de recobrar la conciencia. Se realizaron registros continuos de la frecuencia cardíaca a través de un electrocardiograma de superficie que consiste en 3 electrodos de aguja aplicados a los hombros izquierdo y derecho y las patas traseras derechas. Se amplificó la señal y se registró en un ordenador personal mediante el uso de un programa de adquisición de datos comercial (Experimenter 's Workbench, DataWave Technologies, Loveland, CO). Se midió la frecuencia cardíaca durante 60 s antes, durante y después de cada distensión para un total de 180 s. El registro de la heart rate (frecuencia cardíaca - HR) antes de cada distensión permitió la corrección de posibles cambios en los valores iniciales debido a las variaciones en los niveles de anestesia y aseguró que cualquier respuesta a la frecuencia cardíaca pudiera estar relacionada con la distensión. Para controlar el efecto de GD a lo largo del tiempo, los datos se presentan como cambio medio a partir de la HR en reposo (100 % = descanso) con el uso de la HR media registrada durante un periodo de 10 s durante la distensión (10, 20, 30, 40, 50 y 60 s). Los grupos se compararon mediante el uso de la media de los cambios de HR (porcentaje de HR en reposo) en todas las ratas del mismo grupo durante los 60 s de cada distensión (40 y 60 mm Hg). Las bacterias y los fármacos se manipularon como en el ejemplo 1.
Resultados
La disminución de la frecuencia cardíaca provocada por 40 mm Hg no se modificó por la alimentación mediante sonda nasogástrica de DSM 17938 (P= 0,121, Figura 6A) (N= 8 y 9 con vehículo y DSM 17938, respectivamente). El inflado con 60 mm Hg disminuyó la frecuencia cardíaca en un plazo de 10 s, lo que persistió durante 30 s durante la distensión (Figura 6B). La alimentación mediante sonda nasogástrica de DSM 17938 durante 9 d antes de la realización de las pruebas moderó la respuesta a 60 mm Hg (P= 0,028, prueba de la t para datos independientes, Figuras 6A, 6B). La distensibilidad gástrica (volumen/presión) no difirió entre los animales tratados con vehículo o DSM 17938, para presiones de distensión gástrica de 40 o 60 mm Hg (datos no mostrados). Estos resultados demuestran un efecto antinociceptivo por las bacterias.
Claims (8)
1. Lactobacillus reuteri DSM 17938 para su uso en la modulación local del receptor de potencial transitorio vainilloide 1 (TRPV1) en el sistema gastrointestinal de un sujeto que padece dolor gastrointestinal, en donde dicho L. reuteri DSM 17938 se selecciona para reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida localmente en dicho sistema gastrointestinal para prevenir o reducir el dolor gastrointestinal en dicho sujeto mientras se minimiza cualquier modulación de TRPV1 fuera de dicho sistema gastrointestinal.
2. El L. reuteri DSM 17938 para su uso según la reivindicación 1, en donde dicho L. reuteri DSM 17938 no induce complicaciones cardiovasculares provocadas por una disminución en la liberación del péptido vasoactivo.
3. El L. reuteri DSM 17938 para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho L. reuteri DSM 17938 se formula para administración por vía oral.
4. El L. reuteri DSM 17938 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho L.
reuteri DSM 17938 se selecciona para reducir la activación de TRPV1 espontánea y/o inducida selectivamente en fascículos de nervios aferentes mesentéricos y/o en neuronas de ganglios de la raíz dorsal (GRD) en dicho sistema gastrointestinal.
5. El L. reuteri DSM 17938 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho L.
reuteri DSM 17938 se formula como una composición que comprende dicho L. reuteri DSM 17938 y al menos un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en un portador farmacéuticamente aceptable, un diluyente farmacéuticamente aceptable, un excipiente farmacéuticamente aceptable, un producto alimenticio, un complemento alimenticio y otro agente terapéutico.
6. El L. reuteri DSM 17938 para su uso según la reivindicación 5, en donde dicho L. reuteri DSM 17938 se formula como una composición que comprende dicho L. reuteri DSM 17938 y otro agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en un agente capaz de afectar al mezclado y/o la motilidad gastrointestinal.
7. El L. reuteri DSM 17938 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho dolor gastrointestinal es dolor gástrico o dolor visceral.8
8. El L. reuteri DSM 17938 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho sujeto padece una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cólicos, síndrome de intestino irritable y estreñimiento que provoca dicho dolor gastrointestinal en dicho sujeto.
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