ES2859825T3

ES2859825T3 - Anticuerpos humanos con alta afinidad para el receptor IL-4 humano

Info

Publication number: ES2859825T3
Application number: ES14162081T
Authority: ES
Inventors: Sean Stevens; Tammy T Huang; Joel H Martin; Jeanette L Fairhurst; Ashique Rafique; Marcela Torres; Kevin J Pobursky; Raymond W Leidich; Joan A Windsor; Warren R Mikulka; Diana M Ahrens; Ergang Shi; Nicholas J Papadopoulos
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2007-10-02
Publication date: 2021-10-04
Anticipated expiration: 2027-10-02
Also published as: EP2769992B1; AU2007314522A2; HUE054090T2; BRPI0719953B1; ME00616B; RS61650B1; MY149079A; DOP2009000058A; KR20090088865A; AU2007314522C1; AU2007314522B8; AU2007314522B2; EP2069403A2; CO6160305A2; TN2009000110A1; NZ576040A; NO347180B1; CA2664343A1; MA31138B1; HK1200846A1

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al hIL-4R de la SEQ ID NO:1 que comprende la secuencia HCVR y LCVR de la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO:59.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanos con alta afinidad para el receptor IL-4 humano

Antecedente

La interleucina (IL-4, también conocida como factor estimulante de células B o BSF-1) se caracterizó originalmente por su capacidad para estimular la proliferación de células B en respuesta a bajas concentraciones de anticuerpos inmunoglobulina dirigidos a la superficie celular. Se ha demostrado que la IL-4 posee un amplio espectro de actividades biológicas, incluyendo la estimulación del crecimiento de células T, mastocitos, granulocitos, megacariocitos y eritrocitos. La IL-4 induce la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II en células B en reposo, y potencia la secreción de isotipos IgE e IgG1 por células B estimuladas.

Las actividades biológicas del IL-4 están mediadas por receptores de superficie específicos para la IL-4. El receptor alfa de la IL-4 humana (hIL-4R) (SEQ ID NO: 1) se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE. UU Nos 5.599.905, 5.767.065, y 5.840.869. Se han descrito anticuerpos para el hIL-4R en la Patente de EE. UU N° 5.717.072.

Las actividades biológicas de la IL-4 están mediadas por receptores de superficie específicos para la IL-4. El receptor alfa de la IL-4 humana (hIL-4R) (SEQ ID NO: 1) se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU Nos 5.599.905, 5.767.065, y 5.840.869. Se han descrito anticuerpos para el hIL-4R en la Patente de EE. UU Nos 5.717.072 y 7.186.809.

Los métodos para producir anticuerpos útiles como agentes terapéuticos para el ser humano incluyen la generación de anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados (véase, por ejemplo el documento US 6.949.245). Véase por ejemplo, el documento WO 94/02602 (Abgenix) y US 6.596.541 (Regeneron Pharmaceuticals) (cuyas publicaciones se incorporan en el presente documento de manera específica a modo de referencia) que describen métodos para generar ratones transgénicos no humanos capaces de producir anticuerpos humanos.

Los métodos para utilizar anticuerpos contra el hIL-4R se describen en las Patentes de EE. UU Nos 5.714.146; 5.985.280; y 6.716.587.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona:

• Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente al hIL-4R de la SEQ ID NO: 1 con una K^dde 50 pM o menos, medida por resonancia de plasmones superficiales, que comprende la secuencia HCVR y LCVR de la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO:59.

• Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de la invención.

• Un vector que comprende tal secuencia de ácido nucleico.

• Un sistema huésped - vector para la producción de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al receptor de la IL-4, que comprende tal vector, en una célula huésped adecuada, opcionalmente, en donde la célula huésped es una célula procariota o eucariota seleccionada de una de E. coli o una célula CHO.

• Un método de producción de un anticuerpo anti IL-4R o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende el cultivo de células de un sistema huésped - vector de la invención bajo condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento del mismo y la recuperación del anticuerpo o el fragmento que se expresa de esta manera.

• Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un ser humano, en donde la enfermedad o el trastorno se mejora, tiene una mejoría o se inhibe por eliminación, inhibición o reducción de la actividad de la interleucina-4 humana (hIL-4), en donde la enfermedad o el trastorno se selecciona de artritis, herpetiforme, urticaria idiopática crónica, esclerodermia, cicatrización hipertrófica, enfermedad de Whipple, hiperplasia benigna de próstata, trastornos pulmonares, trastornos inflamatorios, reacciones alérgicas, enfermedad de Kawasaki, drepanocitosis, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preeclampsia, síndrome de Sjogren , síndrome linfoproliferativo autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, esófago de Barrett, uveítis autoinmune, tuberculosis, dermatitis atópica, colitis ulcerosa, fibrosis y nefrosis..

Se desvelan en el presente documento anticuerpos humanos, preferentemente anticuerpos recombinantes humanos, que se unen específicamente al receptor humano de la interleucina -4 (hIL-4R). Los anticuerpos humanos se caracterizan por la unión al hIL-4R con alta afinidad y por la capacidad de neutralizar la actividad del hIL-4R. En casos específicos, los anticuerpos humanos son capaces de bloquear la unión del complejo hIL-13/ hIL-13R1 al hIL-4R, y así inhibe la señal de la hIL-13. Los anticuerpos pueden tener una longitud completa (por ejemplo un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender solo una parte de unión al antígeno (por ejemplo un fragmento Fab, F (ab')²o scFv), y se pueden modificar para ejercer una funcionalidad, por ejemplo, para eliminar funciones de efector residuales (Reddy y col. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

También se desvela en el presente documento un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente al hIL-4R (SEQ ID NO: 1) con una K^dde aproximadamente 200 pM o menos, medida por resonancia de plasmones superficiales. En una realización más específica, el anticuerpo o la parte de unión al antígeno del mismo presenta una K^dde menos de aproximadamente 20 pM. En varias realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno bloquea la actividad de hIL-4R con una CI⁵⁰de aproximadamente 200 pM o menos, medida por el bioensayo STAT6 luciferasa. En realizaciones más específicas, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno presenta una CI⁵⁰de aproximadamente 150 pM o menos, o aproximadamente 100 pM o menos, o incluso aproximadamente 50 pM o menos al medirse por el bioensayo de luciferasa. En varias realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno bloquea la actividad de la hIL-13 con una CI⁵⁰de aproximadamente 100 pM o menos, como se mide por el bioensayo de STAT6 luciferasa. En realizaciones más específicas el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno presenta una CI⁵⁰de aproximadamente 75 pM o menos, o aproximadamente 50 pM o menos, o incluso de aproximadamente 20 pM o menos.

El anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) de la SEQ ID NO: 51. La invención comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) con la SEQ ID NO: 59.

El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de la invención comprende una HCVR y una LCVR (HCVR/LCVR) de las SEQ ID NO: 51/59.

La invención engloba anticuerpos anti-hIL-4R que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación no deseables, o un anticuerpo que carece de un resto fucosa presente en la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (véase Shield y col. (2002) JBC 277: 26733). En otras aplicaciones, se puede hacer una modificación de la galactosilación con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

Adicionalmente se describen en el presente documento los vectores de expresión recombinante que llevan las moléculas de ácido nucleico de la invención, y las células huésped en la cuales se han incluido tales vectores, así como los métodos para fabricar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de la invención que se obtienen por cultivo de las células huésped de la invención. La célula huésped puede ser una célula procariota o eucariota, preferentemente la célula huésped es una célula de E. coli o una célula de mamífero, tal como una célula CHO. Además se describe en el presente documento una composición que comprende un anticuerpo recombinante humano que se une específicamente al hIL-4R y un vehículo aceptable.

Se desvelan en el presente documento métodos para inhibir la actividad de hIL-4 utilizando un anticuerpo o una parte de unión al antígeno del mismo, desvelado en el presente documento. En casos específicos, los anticuerpos desvelados en el presente documento también bloquean la unión del complejo hIL-13/hIL-13R1 al hIL-4R. En un caso, el método comprende poner en contacto el hIL-4R con el anticuerpo desvelado en el presente documento, o la parte de unión al antígeno del mismo, tal que se inhibe la actividad de hIL-4 o hIL-4/ hIL-13. En otro caso, el método comprende la administración de un anticuerpo desvelado en el presente documento, o la parte de unión al antígeno del mismo, a un sujeto humano que padece un trastorno que se mejora por la inhibición de la actividad de hIL-4/ hIL-13. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejore, tenga una mejoría, se inhiba o prevenga por la eliminación, inhibición o reducción de la actividad de hIL-4 o hIL-4/hIL-13.

También se desvela el uso de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para su uso en la atenuación o inhibición de una enfermedad o trastorno mediado por IL-4 en un ser humano.

Los trastornos mediados o relacionados con la IL-4 que se tratan con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención incluyen, por ejemplo, la artritis (incluyendo la artritis séptica), herpetiformis, urticaria idiopática crónica, escleroderma, cicatrización hipertrófica, Enfermedad de Whipple, hiperplasia prostática benigna, trastornos pulmonares, tal como asma ligera, moderada o grave, trastornos inflamatorios tales como la enfermedad inflamatoria de intestino grueso, reacciones alérgicas, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de células falciformes, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, pre-eclampsia, síndrome de Sjogren, síndrome linfoproliferativo autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, esófago de Barrett, uveítis autoinmune, tuberculosis, y nefrosis.

Otros objetivos y ventajas serán aparentes revisando la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 (A-C). Evaluación del perfil de unión del anticuerpo generado con ensayos de unión secuencial basados en OCTETTM. La Fig. 1 (A) es un gráfico de barras que muestra los resultados obtenidos cuando el primer anticuerpo expuesto al antígeno al que se une, es el anticuerpo control. En la Fig.1 (B) el primer anticuerpo expuesto al antígeno al que se une es VAB16F3-1. En la Fig. 1 (C) el primer anticuerpo expuesto al antígeno al que se une es VAK5H4-4. Segundo anticuerpo: 1= control; 2=VX4E7-9; 3= VX3F7-6; 4=VAB16G-1;5= VAB16F3-1; 6=VAB15C8-17; 7= VAB11G8-1; 8= VAB10C1-5; 9= VAB10G8-19; 10=VAB8G10-1; 11=VAB7B9-3; 12=VAB6C10-14; 13= VAB5C5-11; 14=VAB3B4-10; 15=VAB4D5-3; 16= VAB1H1-2; 17= VAK5H4-4; 18= VAK7G8-5; 19=VAK8G11-13; 20= VAK9C6-11; 21= VAK10G6-7; 22=VAK11D4-1; 23=VAK12B11-9; y 24=VAK10G12-5. Las barras abiertas muestran el nivel de unión del primer anticuerpo, las barras rellenas muestran la unión adicional del segundo anticuerpo. Descripción detallada

Antes de describir los presentes métodos, se tiene que entender que esta invención no está limitada a los métodos particulares, y las condiciones experimentales descritas, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. También se tiene que entender que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito solamente de la descripción de realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el ámbito de la presente invención se limitará únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos de que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se pueden utilizar cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o el ensayo de la presente invención, se describen a continuación los métodos y materiales preferidos.

Definiciones

La expresión “IL4R humano” (hIL-4R), como se utiliza en el presente documento pretende referirse a un receptor humano de citoquina que se une específicamente a la interleucina-4 (IL-4), IL-4Ra, (SEQ ID NO: 1). La expresión “interleucina-13 humana” (hIL-13) se refiere a una citoquina que se une específicamente al receptor IL-13 y “complejo hIL-13/hIL-13R1” se refiere al complejo formado por la unión de hIL-13 al receptor hIL-13R1, dicho complejo se une al receptor hIL-4 para iniciar su actividad biológica.

El término “anticuerpo”, como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviado aquí como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (CL1). Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, que se llaman regiones determinantes complementarias (CDR), intercaladas con regiones que están mejor conservadas, llamadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

La expresión “parte de unión al antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “parte de anticuerpo” o “fragmento de anticuerpo”), como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, el hIL-4R). Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo se puede llevar a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión que se engloban en la expresión “parte de unión al antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL1 y CH1; (ii) un fragmento F(ab')², un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos F(ab)' unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward y col. (1989) Nature 241:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante complementaria aislada (CDR). Además aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, por un conector sintético que les capacita para producirse como una cadena única contigua en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (que se conocen como Fv de cadena única (scFv); véase por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85:5879-5883. Tales anticuerpos de cadena única también se pretende que se engloben en la expresión “parte de unión al antígeno” de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena única, tales como los diacuerpos, también están englobadas (véase por ejemplo, Holliger y col. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448).

Un anticuerpo “neutralizante” o “bloqueante”, como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que al unirse al hIL4R da como resultado la inhibición de la actividad biológica de hIL-4 y/o hIL-13. Esta inhibición de la actividad biológica de hIL-4 y/o hIL-13 se puede evaluar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hIL-4 y/o hIL-13 que se conocen en la técnica, tales como la activación celular inducida por hIL-4 y/o hIL-13 y la unión de hIL-4 a hIL-4R (véanse los ejemplos posteriormente).

Una “CDR” o región determinante complementaria es una región de hipervariabilidad intercalada con regiones que están más conservadas, denominadas “regiones de marco” (FR). En distintas realizaciones del anticuerpo anti- hIL-4R o fragmento de la invención, las FR pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden estar modificadas natural o artificialmente.

El término “resonancia de plasmones superficiales”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real, por la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas en una matriz de biosensor, por ejemplo utilizando el sistema BIAcore™ (Pharmacia Biosensor AB).

El término “epítopo” es un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión específico al antígeno en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como un paratopo. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo. Los epítopos pueden ser o bien conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por yuxtaposición espacial de aminoácidos de distintos segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es el que se produce por restos adyacentes en una cadena polipeptídica. En ciertas circunstancias, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo, o grupos sulfonilo en el antígeno.

La expresión “identidad sustancial” o “sustancialmente idéntico”, cuando se refieren a un ácido nucleico o un fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea óptimamente con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria) que tiene inserciones de nucleótidos o eliminaciones apropiadas, hay una identidad de secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente un 95%, y más preferentemente al menos aproximadamente un 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótidos, medida por algún algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tales como FASTA, BLAST, o Gap, como se trata posteriormente.

Cuando se aplica a polipéptidos, la expresión “similitud sustancial” o “sustancialmente similar” significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean óptimamente, tal como hacen los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de huecos por defecto, comparte al menos un 95% de identidad, incluso más preferentemente al menos un 98% o 99% de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticos se diferencian por sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una “sustitución conservadora de aminoácidos” es en la que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, en cuanto a carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos se diferencian de otras por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de similitud se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales alifáticas-hidroxilo: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contiene amidas: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina, e histidina: (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen sulfuro son la cisteína y la metionina. Los grupos de aminoácidos de sustitución conservadora preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparaginasa-glutamina. De manera alternativa, una sustitución conservadora es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 desvelada en Gonnet y col. (1992) Science 256: 1443 45. Una sustitución “moderadamente conservadora” es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La similitud de secuencia de los polipéptidos, a la que también se hace referencia como identidad de secuencia, se mide típicamente utilizando un software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares utilizando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo las sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que se pueden utilizar con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como los polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias de polipéptidos también se pueden comparar utilizando FASTA que usa parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1 FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa de ordenador BLAST , especialmente BLASTP o TBLASTN, que utiliza parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 and Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402.

Preparación de los anticuerpos humanos

Los métodos para generar los anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo VelocImmune™ (Regeneron Pharmaceuticals), tecnología XenoMouse™ (Green y col. (1994) Nature Genetics 7:13-21; Abgenix), la estrategia del “minilocus”, y la exposición del fago (y véase, por ejemplo, los documentos US 5.545.807, US 6.787.637). La tecnología VelocImmune™ (documento US 6.596.541) engloba un método de generación de un anticuerpo humano completo de alta especificidad para un antígeno seleccionado.

Los roedores se pueden inmunizar por cualquier método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) citados anteriormente; Malik y Lillehoj (1994) Antibody techniques, Academic Press, CA). En una realización preferida, el antígeno hIL-4R se administra directamente a ratones que comprenden un loci ADN que codifica tanto la región variable de cadena pesada de Ig humana como la región variable de cadena ligera Kappa (VelocImmune™, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; documento US 6.596.541), con un adyuvante que estimula la respuesta inmune, por ejemplo, el adyuvante completo e incompleto de Freund, el sistema adyuvante MPL+TDM (Sigma), o RIBI (muramil dipéptidos) (véase, O'Hagan (2000) Vaccine Adjuvant, Human Press, NJ). Un adyuvante puede evitar la rápida dispersión del polipéptidos secuestrando el antígeno en un depósito local, y puede contener factores que pueden estimular la respuesta inmune del huésped. La tecnología VelocImmune™ implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende las regiones de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a los loci de la región constante endógena del ratón de forma que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón como respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de cadenas pesada y ligera humanas. Entonces se expresa el ADN en una célula capaz de expresar el anticuerpo humano completo. En una realización específica, la célula es una célula CHO.

Los anticuerpos pueden ser útiles terapéuticamente en el bloqueo de la interacción ligando-receptor o inhibiendo la interacción del componente receptor, más que destruyendo células por medio de la fijación del complemento (citotoxicidad dependiente de complemento) (CDC) y la participación de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y mediar en la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse en base a si se desea que el anticuerpo medie en la citotoxicidad.

Las inmunoglobulinas humanas pueden existir en dos formas que están asociadas con la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción estable de cuatro cadenas de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos por un enlace disulfuro intercatenario de cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están ligados por medio de enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por un acoplamiento covalente entre las cadenas ligera y pesada (semi-anticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso tras purificación por afinidad. La frecuencia de aparición de la segunda forma en varios isotipos de IgG intactos es debido, pero sin limitarse a estas, las diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región bisagra del anticuerpo. De hecho, una sustitución de un solo aminoácido en la región bisagra de la bisagra de igG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal y col. (1993) Molecular Immunology 30: 105) hasta los niveles que se observan típicamente utilizando la bisagra de IgG1. La presente invención engloba anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región de bisagra, CH2 o CH3 que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Los anticuerpos de la invención se preparan preferentemente con el uso de tecnología VelocImmune™. Un ratón transgénico en el que se han sustituido las regiones variables de cadena pesada y ligera de su inmunoglobulina endógena por las regiones variables humanas correspondientes, se desafía con el antígeno de interés, y se recuperan las células linfáticas (tales como las células B) de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y en tales líneas celulares de hibridoma se hace una criba para identificar las líneas celulares de hibridoma y seleccionar las que producen anticuerpos específicos del antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera se pueden aislar y unirse a las regiones constantes isotípicas de cadena pesada y cadena ligera deseables. Tal proteína anticuerpo se puede producir en una célula, tal como una célula CHO. De manera alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o las regiones variables de cadenas ligera y pesada se pueden aislar directamente de los linfocitos específicos de antígeno.

En un caso, el ratón transgénico comprende hasta 18 genes funcionales de cadena variable pesada humana y 12 genes funcionales de la cadena variable ligera kappa humana. En otro caso, el ratón transgénico comprende hasta 39 genes de cadena variable pesada humana y 20 genes de cadena variable ligera kappa humana. En otra realización, el ratón transgénico comprende hasta 80 genes de cadena variable pesada humana y 40 genes de cadena variable ligera kappa humana.

En general, los anticuerpos desvelados poseen afinidades muy altas, típicamente poseen K^ddesde aproximadamente 10‘9 hasta aproximadamente 10‘12 M, cuando se miden por unión al antígeno sea en fase inmovilizada o en fase sólida o medidas en solución.

Inicialmente, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad que se aíslan tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como se describe posteriormente, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por características deseables, incluyendo la afinidad de unión por hIL-4R, la capacidad de bloquear la unión de IL-4 a hIL-4R, y/o la selectividad por la proteína humana. Las regiones constantes de ratón se sustituyen con las regiones constantes humanas que se deseen para generar los anticuerpos humanos completos de la invención, por ejemplo, el tipo silvestre o modificado de IgG4 o IgG1 (por ejemplo, las SEC ID Nos 588, 589, 590). Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo al uso específico, las características de alta afinidad de unión al antígeno y la de especificidad con la diana residen en la región variable.

Mapeado del epítopo y Tecnologías relacionadas

Para seleccionar los anticuerpos que se unen a un epítopo en particular, se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado de rutina como el que se describe en Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane, eds. Otros métodos incluyen la selección de mutantes de alanina, transferencias proteicas (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), o análisis de escisión de péptidos. Además, se pueden emplear métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science: 9:487-496).

El Perfil de Modificación Asistida (MAP), también conocido como Perfil de Anticuerpos basado en la Estructura Antigénica (ASAP) es un método que categoriza un gran número de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra el mismo antígeno según las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a las superficies antigénicas modificadas química o enzimáticamente (Solicitud de Publicación de Patente de eE. UU N° 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un único epítopo que sea distintivamente diferente de, o esté parcialmente solapado con, un epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos idénticos genéticamente, de forma que la caracterización pueda enfocarse sobre los anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica a la selección en hibridoma, el MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridoma poco frecuentes con las características deseadas. El MAP se puede utilizar para clasificar los anticuerpos hIL-4R de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.

Los agentes útiles para alterar la estructura de los antígenos inmovilizados son enzimas, tales como, por ejemplo, enzimas proteolíticas, y agentes químicos. La proteína antigénica puede estar inmovilizada sobre las superficies de un chip biosensor o en perlas de poliestireno. Estas últimas se pueden procesar, por ejemplo, en ensayos tales como un ensayo de detección multiple Luminex™ (Luminex Corp., TX). Debido a la capacidad de Luminex™ para manejar múltiples análisis con hasta 100 tipos diferentes de perlas, Luminex™ proporciona superficies antigénicas casi ilimitadas con varias modificaciones, lo que resulta en una mayor resolución en el perfil de anticuerpos para epítopos con respecto al ensayo con el biosensor.

Administración terapéutica y formulaciones

La administración de las entidades terapéuticas de acuerdo con la invención se puede conseguir con vehículos adecuados, excipientes y otros agentes que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, suministro, tolerancia, y similares. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por los químicos farmacéuticos: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003, 20a ed, Lippincott Williams & Wilkins). Estas formulaciones incluyen por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares), geles semisólidos, y mezclas semi-sólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, siempre que el principio activo de la formulación no se inactive por la formulación, y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Powell y col. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238-311 y las citas en el mismo para información adicional relativa a los excipientes y vehículos bien conocidos por los químicos farmacéuticos.

Las moléculas terapéuticas de la invención se pueden administrar a un paciente de una manera apropiada a la indicación, por ejemplo, vía parenteral, vía tópica, o por inhalación. Si se inyecta, el antagonista se puede administrar, por ejemplo, por vía intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal, o subcutánea, por inyección en embolada, o por infusión continua. Se contempla la administración localizada en un sitio de enfermedad o lesión, como es el suministro transdérmico y la liberación sostenida con implantes. El suministro por inhalación incluye, por ejemplo, la inhalación nasal u oral, el uso de un nebulizador, inhalación del antagonista en forma de aerosol, y similares. Otras alternativas incluyen las gotas oftálmicas, las preparaciones orales que incluyen píldoras, jarabes, grageas o chicle; y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, aerosoles, y ungüentos.

Las dosificaciones y frecuencia de administración pueden variar de acuerdo a factores tales como la vía de administración, la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratarse, si la afección es aguda o crónica, y el tamaño y estado general del paciente. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar por procedimientos pertinentes conocidos en la técnica, por ejemplo, en ensayos clínicos que pueden implicar los estudios de escalado de dosis. Las moléculas terapéuticas de la invención se pueden administrar una vez o de manera repetida. En realizaciones particulares, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra durante un periodo de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos, o tres meses o incluso indefinidamente. Para tratar las afecciones crónicas, el tratamiento a largo plazo generalmente es el más eficaz. Sin embargo, para tratar afecciones agudas, puede ser suficiente la administración durante periodos más cortos, por ejemplo de una a seis semanas. En general, el agente terapéutico se administra hasta que el paciente manifiesta un grado relevante médicamente de mejoría sobre una línea básica del indicador o indicadores elegidos. El nivel de IL-4 se puede controlar durante y/o después del tratamiento con la molécula terapéutica de la invención. Los métodos para medir los niveles de IL-4 en el suero se conocen en la técnica, por ejemplo por ELISA, etc.

Uso terapéutico y terapias de combinación

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la invención son útiles para tratar una enfermedad o trastorno que es mejorada, se mejora o se inhibe mediante la eliminación, inhibición o reducción de la actividad de la interleucina-4 humana (hIL-4), donde la enfermedad o trastorno se selecciona de artritis, herpetiforme, urticaria idiopática crónica, esclerodermia, cicatrización hipertrófica, enfermedad de Whipple, hiperplasia benigna de próstata, trastornos pulmonares, trastornos inflamatorios, reacciones alérgicas, Kawasaki enfermedad de células falciformes, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preeclampsia, síndrome de Sjogren, síndrome linfoproliferativo autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, esófago de Barrett, uveítis autoinmune, tuberculosis, dermatitis atópica, colitis ulcerosa, fibrosis y nefrosis.Estos trastornos incluyen los que se caracterizan por una expresión anormal o excesiva de IL-4, o por una respuesta anormal del huésped a la producción de IL-4. Los trastornos relacionados con IL-4 que se tratan con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención, incluyen, por ejemplo, artritis (incluyendo la artritis séptica), herpetiformis, urticaria idiopática crónica, escleroderma, cicatrización hipertrófica, Enfermedad de Whipple, hiperplasia prostática benigna, trastornos pulmonares, tal como el asma (ligera, moderada o grave), trastornos inflamatorios tales como la enfermedad inflamatoria de intestino grueso, reacciones alérgicas, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de células falciformes, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, pre-eclampsia, síndrome de Sjogren, síndrome linfoproliferativo autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, esófago de Barrett, uveítis autoinmune, tuberculosis, dermatitis atópica, colitis ulcerativa, fibrosis y nefrosis (véase el documento U.S. 7.186.809).

La invención engloba un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno para su uso en terapias de combinación en las que el anticuerpo anti- IL-4R o el fragmento de anticuerpo se administran en combinación con un segundo agente terapéutico. La coadministración y la terapia de combinación no se limita a la administración simultánea, sino que incluye regímenes en los que el anticuerpo anti- IL-4R o fragmento de anticuerpo se administra al menos una vez durante el curso un de tratamiento que implica la administración al paciente de al menos otro agente terapéutico. Un segundo agente terapéutico puede ser otro antagonista IL-4, tal como otro anticuerpo/fragmento de anticuerpo, o un receptor de citoquina soluble, un antagonista de IgE, una medicación antiasmática (corticosteroides, agentes no esteroideos, beta agonistas, antagonistas de leucotrienos, xantinas, fluticasona, salmeterol, albuterol) que se pueden suministrar por inhalación o por otros medios adecuados. En una realización específica, el anticuerpo anti- IL-4R o fragmento de anticuerpo de la invención se puede administrar con un antagonista IL-1, tal como el rilonacept, o un antagonista IL-13. El segundo agente puede incluir uno o más antagonistas del receptor del leucotrieno para tratar trastornos tales como las enfermedades inflamatorias alérgicas, por ejemplo, asma y alergias. Ejemplos de antagonistas del receptor del leucotrieno incluyen, pero sin estar limitados a montelukast, pranlukast, y zafirlukast. El segundo agente puede incluir un inhibidor de citoquina tal como uno o más de un TNF (etanercept, ENBREL™), antagonistas IL-9, IL-5 o IL-17.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos habituados en la técnica, una divulgación completa y una descripción de cómo hacer y utilizar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el ámbito que los inventores consideran que tiene su invención. Se ha hecho un esfuerzo para asegurar la precisión de los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero se tiene que contar con algunos errores experimentales y desviaciones. A menos de que se indique otra cosa, las partes son partes por peso, el peso molecular es la media de pesos moleculares, la temperatura es en grados centígrados, y la presión es la, o cercana a la, atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos para el receptor IL-4 humano.

Se inmunizaron ratones que comprendían loci ADN que codifica tanto la región variable de cadena pesada de Ig humana como la región variable de cadena ligera kappa (VelocImmune™, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; Patente de EE. UU. N° 6.596.541), con IL-4R humano (hIL-4R, SEQ ID NO: 1). El hIL-4R se administró por inyección directa de antígeno purificado en un adyuvante o indirectamente proporcionando la secuencia de ADN de hIL-4R en un plásmido ADN que contiene el gen hIL-4R y expresa hIL-4R utilizando la maquinaria de expresión proteica celular del huésped para producir el polipéptido antigénico in vivo. Para obtener la respuesta inmune óptima, los animales fueron posteriormente reforzados cada 3-4 semanas y se obtuvo sangre 10 después de cada refuerzo para evaluar la progresión de la respuesta anti-antigénica.

Cuando los ratones alcanzaron el máximo de la respuesta inmune, se recolectaron las células B que expresaban los anticuerpos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para formar hibridomas. Los anticuerpos monoclonales funcionalmente deseables se seleccionaron en un medio condicionado de selección para hibridomas o células transfectadas, según la especificidad, afinidad de unión antigénica, y potencia del bloqueo de la unión de hIL-4 a hIL-4R (descrito posteriormente).

Los anticuerpos seleccionados que demostraron afinidad de unión antigénica, potencia, y/o capacidad para bloquear la unión de hIL-4 a hIL-4R que se deseaban, incluían (HCVR/LCVR): VX 4E7-9 (SEQ ID NO: 3/11; 387/389; 391/393); VX 3F7-6 (SEQ ID NO: 19/27; 395/397; 399/401); VAB 16G1-1 (SEQ ID NO: 35/43; 403/405; 407/409); VAB 16F3-1 (SEQ ID NO: 51/59, 411/413, 415/417, 579/59 and 581/59); VAB 15C8-17 (SEQ ID NO: 67/75, 419/421, 423/425); VAB 13A1-6 (SEQ ID NO: 83/91, 427/429, 431/433); VAB 11 G8-1 (SEQ I D NO:99/107, 435/437, 439/441); VAB 10G8-19 (SEQ ID NO: 115/123, 443/445, 447/449); VAB 10C1-5 (SEQ ID NO: 131/139, 451/453, 455/457); VAB 8G10-1 (SEQ ID NO: 147/155, 459/461, 463/465); VAB 7B9-3 (SEQ ID NO: 163/171, 467/469, 471/473); VAB 6C10-14 (SEQ ID NO: 179/187, 475/477, 479/481); VAB 5C5-1 (SEQ ID NO: 195/203, 483/485, 487/489); VAB 3B4-10 (SEQ ID NO: 211/219, 491/493, 495/497); VAB 4D5-3 (SEQ ID NO: 227/235, 499/501, 503/505); VAB 1 H1-2 (SEQ ID NO: 243/251, 507/509, 511/513); VAK5H4-4 (SEQ ID NO: 259/267, 515/517, 519/521); VAK7G8-5 (SEQ ID NO: 275/283, 523/525, 527/529); VAK8G11-13 (SEQ ID NO: 291/299, 531/533, 535/537); VAK9C6-11 (SEQ ID NO: 307/315, 539/541, 543/545); VAK10G6-7 (SEQ ID NO: 323/331, 547/549, 551/553); VAK11D4-1 (SEQ ID NO: 339/347, 555/557, 559/561); VAK12B11-9 (SEQ ID NO: 355/363, 563/565, 567/569); and VAK10G12-5 (SEQ ID NO: 371/379, 571/573, 575/577).

Ejemplo 2. Determinación de la afinidad de unión al antígeno.

La afinidad de unión (K^d) de los anticuerpos seleccionados con respecto al hIL-4R se determinó utilizando el ensayo de resonancia de plasmones superficiales (BIAcore™ 2000). Brevemente, el anticuerpo se capturo en la superficie de un anticuerpo policlonal IgG (GAM) de cabra anti-ratón creado a través del emparejamiento químico directo del GAM IgG a un chip BIAcore™ para formar una superficie de anticuerpo capturado. Se inyectaron varias concentraciones (que variaban desde 12,5 nM a 0,625 nM) de hIL-4R monomérico (R&D Systems) o hIL-4R-hFc dimérico, sobre la superficie de anticuerpo capturado. La unión del antígeno al anticuerpo, y la disociación del complejo de unión, se controlaron en tiempo real. Las constantes de disociación de equilibrio (K^d) y la tasa de constantes de disociación se aseguraron llevando a cabo el análisis cinético utilizando el software de evaluación BIA. El software de evaluación BIA también se utilizó para calcular la semi-vida de disociación del complejo antígeno/ anticuerpo (T^1/2). Los resultados se muestran en la Tabla 1. Control: un anticuerpo anti-IL-4R (Patente de EE. UU. N° 7.186.809; SEC ID Nos 10 y 12). Los resultados de los análisis cinéticos revelaron que los anticuerpos seleccionados incluían anticuerpos de alta afinidad que eran capaces de unirse al receptor dimérico con K^dpor debajo de 1 nM. También se ensayó la afinidad de unión de los anticuerpos anti- hIL-4R a IL-4R tanto de ratón como de mono (Macaca fascicularis). Los anticuerpos seleccionados (1) no tenían reacción cruzada con el IL-4R de ratón; y (2) o bien fallaban en unirse a IL-4R de mono o se unían a IL-4R de mono con muy baja afinidad.

Tabla 1

(continuación)

La afinidad de unión anticuerpo-antígeno también se evaluó utilizando el ensayo de competición en solución basado en ELISA. Resumiendo, los anticuerpos (proteínas purificadas a 1 a 3,3 ng/ml) se premezclaron con diluciones seriadas de la proteína antigénica (monomérica o dimérica) que variaba de 0 a 10 |ig/ml. Las soluciones de la mezcla anticuerpo y antígeno se incubaron durante dos a cuatro horas a temperatura ambiente hasta alcanzar el equilibrio de unión. Los anticuerpos libres en las mezclas se midieron utilizando un sándwich ELISA cuantitativo. Brevemente, se revistieron placas de 96 pocillos Maxisorp™ (VWR, West Chester, PA) con 2 |ig/ml de proteína hIL-4R-hFc en PBS durante una noche a 4 °C y después se bloqueó la unión no específica con BSA. Las soluciones de mezcla antígeno-anticuerpo se transfirieron a las placas revestidas Maxisorb™ y después se incubó durante una hora. Las placas se lavaron entonces con tampón de lavado y se detectaron los anticuerpos unidos de la placa con un reactivo de anticuerpo IgG policlonal de cabra anti-ratón conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) o un reactivo de anticuerpo IgG policlonal de cabra anti-humano conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) para controlar el anticuerpo y el desarrollo utilizando sustratos colorimétricos tales como BD OptEIATM (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Después se paró la reacción con ácido fosfórico o sulfúrico 1 M, se registraron las absorbancias a 450 nm y los datos se analizaron utilizando el software GraphPad™ Prism. La dependencia de las señales en las concentraciones de antígenos en solución se analizó con un análisis de cuatro parámetros ajustado y se refirieron como CI⁵⁰, la concentración de antígeno necesaria para conseguir la reducción del 50% de la señal de las muestras de anticuerpo sin la presencia de antígeno en solución. Las IC⁵⁰se determinaron como se ha descrito anteriormente y se resumen en la Tabla 2. En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención muestra una IC⁵⁰para el hIL-4R dimérico de aproximadamente 20 pM o menos, y una IC⁵⁰para hIL-4R monomérico de aproximadamente 150 pM o menos, o aproximadamente 100 pM o menos, medida por ensayo de competición en solución ELISA.

Tabla 2

(continuación)

Ejemplo 3. Inhibición de hIL-4 e interacción con hIL-4R

La capacidad de los anticuerpos seleccionados para bloquear la unión de hIL-4 al hIL-4R se valoró por el ensayo de bloqueo de hIL-4 BIAcore™ y se midió la potencia por un inmunoensayo de bloqueo hIL-4 cuantitativo como se ha descrito posteriormente. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

La capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión hIL-4 al receptor hIL-4R se determinó utilizando la resonancia de plasmones superficiales. Las moléculas purificadas de hIL-4R-hFc se capturaron con anticuerpo IgG de cabra anti-humano policlonal inmovilizado sobre CM-5 a una densidad de 260 RU, para preparar una superficie revestida de receptor. Entonces se inyectó la IL-4 humana (0,25 ml a 50 nM) sobre la superficie revestida de receptor y se registró la cantidad de hIL-4 unida (primera inyección de hIL-4). La unión de la hIL-4 se eliminó entonces con un pulso de MgCh 3 M seguido de tampón acondicionador. Los anticuerpos anti-hIL-4R purificados se inyectaron entonces sobre la superficie del receptor y a continuación se inyectó una segunda inyección de hIL-4 a la misma concentración (segunda inyección de hIL-4). El porcentaje de reducción de la unión hIL-4 resultante del complejo preformado de anticuerpo receptor se muestra en la Tabla 3.

Para evaluar además la capacidad de bloqueo de la unión hIL-4 a hIL-4R, se llevó a cabo un inmunoensayo cuantitativo. En resumen, se premezclaron soluciones de hIL-4R-Fc 26 pM con de proteína anticuerpo con una concentración que variaba desde ~ 50 nM a 0 nM en diluciones seriadas, después se incubaron una hora a temperatura ambiente. La concentración de hIL-4R-Fc libre (no unido a anticuerpos) se determinó utilizando un sándwich ELISA específico de hIL-4R. Las placas de detección para hIL-4R se prepararon uniendo hIL-4 biotinilado (0,5 |ig/ml) sobre placas de 96 pocillos cubiertas con estreptavidina. Las muestras de antígeno anticuerpo pre-unidas se transfirieron la placa de detección cubierta con hIL-4. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se lavó la placa de detección y se detectó la unión hIL-4R-hFc en la placa utilizando anticuerpos policlonales de cabra anti hFc conjugados con HRP y se desarrolló utilizando sustratos colorimétricos tales como BD OptEIA™ (BD Biosciences Pharmigen, San Diego, CA). Después de pararse la reacción con ácido sulfúrico o fosfórico 1 M, se registraron las absorbancias a 450 nm y los datos se analizaron utilizando el software GraphPadTM Prism. Se determinaron las CI⁵⁰como la cantidad de anticuerpos necesaria para reducir al 50% el IL-4R-hFc detectable en la placa de unión. En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención muestra una CI⁵⁰para bloquear 25 pM de hIL-4R de menos de aproximadamente 50 pM, o menos de aproximadamente 40 pM, o menos de aproximadamente 30 pM, o menos de aproximadamente 20 pM, al medirse por ELISA.

Tabla 3

(continuación)

Ejemplo 4. Neutralización del efecto biológico de hIL-4 in vitro

La ruta de señal de la transducción mediada por IL-4 se ha documentado extensamente en la literatura (por ejemplo, véase la revisión de Hebenstreit y col. 2006 Cytokine Growth Factor Rev.17 (3):173-88, 2006). La IL-4 puede estimular dos complejos receptores, tipo I y tipo II. Los complejos de receptor tipo I se forman por unión del IL-4 a IL-4R y la posterior heterodimerización con la cadena gamma común. De manera alternativa, el complejo IL-4/IL-4R se puede heterodimerizar con el receptor IL-13R1 para formar los complejos de receptor tipo II. Ambos complejos tipo I y tipo II señalizan por medio de STAT6. Por lo tanto se evaluó la capacidad de los anticuerpos seleccionados para bloquear la señalización por medio de STAT6 como se describe a continuación.

Se estableció una línea celular con alta sensibilidad a hIL-4 y hIL-13. Las células HEK293 se transfectaron establemente con STAT6 humano y un plásmido indicador de luciferasa STAT6, y se mantuvieron en medio de crecimiento (DMEM, 10% de FBS, L-glutamina, penicilina, estreptomicina). Se consiguió una fuerte respuesta mediada por el receptor IL-4 cuando se añadieron 10 pM de hIL-4 al medio de cultivo de las células HEK293 transfectadas con STAT6. Para el bioensayo de la respuesta a hIL-4, se lavaron una vez las células con medio de ensayo (Optimem I (Gibco) más 0,1% de f Bs ) y se pusieron en placas a 1 x 104 células/pocillo (placa de 96 pocillos) en 80 |il de medio de ensayo. Los anticuerpos purificados se diluyeron separadamente en medio de ensayo (concentraciones finales variando de 20 nM a 0), y se añadieron 10 |il de cada anticuerpo de ensayo a las células junto con 10|il de hIL-4 (concentración final constante 10 pM). Las células se incubaron entonces a 37 °C, 5% de CO²durante 6 h. La extensión de la respuesta celular se midió en un ensayo de luciferasa (Promega Biotech). Los resultados se muestran en la Tabla 4.

La inhibición de la actividad biológica dependiente de IL-4 in vitro se confirmó también utilizando o bien una línea celular de eritroblastos, TF1, o una línea celular TF1 que sobre-expresa IL-13Ra (TF/A12). En este bioensayo, se sembraron 20.000 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FBS, L-glutamina 2 mM, y penicilina y estreptomicina. Se añadieron veinticinco |il de anticuerpos purificados que variaban de 0 a 50 nM (concentración final) junto con 25 |il de proteína recombinante hIL-4 a una concentración final de 50 pM para la línea celular TF1 o 20 pM para la línea celular TF1/A12. Las células se dejaron crecer durante 3 días a 37 °C y se midieron los recuentos celulares finales utilizando un kit CCK8 (Dojindo, Japón). La capacidad del anticuerpo para bloquear el crecimiento celular de TF-1 se muestra en la Tabla 4 como la concentración de anticuerpo necesaria para conseguir el 50% de reducción en la proliferación celular.

Tabla 4

(continuación)

Ejemplo 5. Neutralización del efecto biológico de hIL-13 in vitro

Aunque se ha demostrado que IL-4R es un modulador de la actividad de IL-13 por medio de su unión al complejo IL-13/IL-13R. Los anticuerpos seleccionados se ensayaron para ver su capacidad de bloqueo de la actividad de IL-13 en una modificación del ensayo HEK293 STAT6 luciferasa descrito anteriormente, estando la modificación en la sustitución de 10 pM de IL-4 por 40 pM de hIL-13. También se evaluó la potencia de los anticuerpos en el bloqueo de la actividad hIL-13 por el ensayo de la línea celular TF-1 descrito anteriormente, con 150 pM de hIL-13 en presencia de 0-50 nM de anticuerpos. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al hIL-4R de la SEQ ID NO:1 que comprende la secuencia HCVR y LCVR de la SEQ ID NO:51 y la SEQ ID NO:59.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Un sistema huésped-vector para la producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une de manera específica al receptor de IL-4, que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 3, en una célula huésped adecuada, en donde, opcionalmente, la célula huésped es una célula procariota o eucariota seleccionada de una de E. coli o una célula CHO.

5. Un método para producir un anticuerpo anti-IL-4R o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende hacer crecer células de un sistema huésped vector de acuerdo con la reivindicación 5 en condiciones que permiten la producción del anticuerpo o del fragmento del mismo y recuperar el anticuerpo o el fragmento expresado de ese modo.

6. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un ser humano, en donde la enfermedad o el trastorno mejora, se reduce o se inhibe mediante la eliminación, la inhibición o la reducción de la actividad de la interleucina-4 humana (hIL-4), en donde la enfermedad o el trastorno se selecciona de artritis, herpetiforme, urticaria idiopática crónica, esclerodermia, cicatrización hipertrófica, enfermedad de Whipple, hiperplasia benigna de próstata, trastornos pulmonares, trastornos inflamatorios, reacciones alérgicas, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de células falciformes, síndrome de Churg-Strauss, enfermedad de Grave, preeclampsia, síndrome de Sjogren, síndrome linfoproliferativo autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, esófago de Barrett, uveítis autoinmune, tuberculosis, dermatitis atópica, colitis ulcerosa, fibrosis y nefrosis.

7. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso en un método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho trastorno pulmonar es asma, dicho trastorno inflamatorio es enfermedad intestinal inflamatoria, o dicha artritis es artritis séptica.

8. Una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 y un vehículo aceptable.