KR20230142724A - 인자 XIa 억제제에 대한 항체 및 항원 결합 펩티드및 그의 용도 - Google Patents
인자 XIa 억제제에 대한 항체 및 항원 결합 펩티드및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 선택적인 FXIa 억제제 및/또는 FXIa의 이중 억제제, 및 혈장 칼리크레인에 특이적으로 결합하는 신규한 항원 결합 펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 본 발명은 추가로 대상체에게 본원에 제공된 항원 결합 펩티드의 제약상 유효 용량을 투여함으로써 FXIa 억제제의 항혈전 효과를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물학적 샘플에서 FXIa 억제제의 수준을 검출하기 위한 검출 시약 및 방법을 제공한다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 8일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/135,016, 2021년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/148,767, 2021년 2월 23일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/152,595 및 2021년 2월 24일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 63/153,045를 우선권으로 주장하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 약 316,130 바이트의 파일 크기를 갖고, 2020년 12월 23일에 생성된 055920-553P01US_Sequence_Lising.txt를 파일명으로 하는 서열 목록을 함유하며, 이는 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고, 그의 전문이 참조로 포함된다.
항응고제, 예컨대 다비가트란, 아픽사반, 리바록사반, 와르파린 (코우마딘(COUMADIN)®), 헤파린, 저분자량 헤파린 (LMWH), 및 합성 오당류 및 항혈소판제, 예컨대 아스피린 및 클로피도그렐 (플라빅스(PLAVIX)®)의 이용가능성에도 불구하고 혈전색전성 질환은 선진국에서 주요 사망 원인으로 남아 있다. 광범위한 혈전색전성 장애의 예방 및 치료를 위해 안전하고 효과적인 경구 항응고제를 발견하고 개발하는 것이 여전히 중요하다. 한 접근법은 응고 인자 XIa (FXIa)의 억제를 표적으로 함으로써 트롬빈 생성을 감소시키는 것이다. FXIa는 혈액 응고의 조절에 관여하는 혈장 세린 프로테아제이며, 이는 생체내에서 조직 인자 (TF)가 인자 VII (FVII)에 결합함으로써 개시되어 인자 Vlla (FVIIa)를 생성한다. 생성된 TF:FVIIa 복합체는 인자 IX (FIX) 및 인자 X (FX)를 활성화시켜, 인자 Xa (FXa)의 생성을 유도한다. 생성된 FXa는 프로트롬빈이 소량의 트롬빈으로 변환되는 것을 촉매하며, 그 후에 이 경로는 조직 인자 경로 억제제 (TFPI)에 의해 차단된다. 이어서, 응고 과정은 촉매량의 트롬빈에 의한 인자 V, VIII 및 XI의 피드백 활성화를 통해 추가로 전파된다. 그로 인한 트롬빈 파열은 피브리노겐을 피브린으로 전환시키고, 이는 중합하여, 혈전의 구조적 프레임워크를 형성하고, 응고의 핵심 세포 성분인 혈소판을 활성화시킨다. 따라서, FXIa는 이 증폭 루프의 전파에서 핵심 역할을 하므로, 항혈전 요법에 대한 매력적인 표적이다.
혈장 프리칼리크레인은 트립신-유사 세린 프로테아제의 자이모겐이며, 혈장에 35 내지 50 μg/mL로 존재한다. 구조는 인자 XI (FXI)와 유사하다. 전반적으로, 혈장 칼리크레인의 아미노산 서열은 FXI와 58% 상동성을 갖는다. 혈장 칼리크레인은 수많은 염증성 장애에서 역할을 하는 것으로 생각된다. 혈장 칼리크레인의 주요 억제제는 세르핀 C1 에스테라제 억제제이다. C1 에스테라제 억제제에 유전적 결함이 있는 환자는 유전적인 혈관부종 (HAE)을 앓으며, 이는 얼굴, 손, 목, 위장관 및 생식기의 간헐적 부종을 초래한다. 급성 에피소드 동안에 형성된 수포는 높은 수준의 혈장 칼리크레인을 함유하고, 이는 고분자량 키니노겐을 절단하여 브라디키닌을 유리시키고, 이로써 혈관 투과성이 증가된다. 대형 단백질 혈장 칼리크레인 억제제에 의한 치료는 혈관 투과성을 증가시키는 브라디키닌의 방출을 방지함으로써 HAE를 효과적으로 치료하는 것으로 나타났다.
혈장 칼리크레인-키닌 시스템은 진행된 당뇨병 황반 부종을 가진 환자에서 비정상적으로 풍부하다. 혈장 칼리크레인이 당뇨병 래트에서 망막 혈관 기능장애에 기여한다는 것이 최근에 발표되었다. 추가로, 혈장 칼리크레인 억제제 ASP-440의 투여는 당뇨병 래트에서 망막 혈관 투과성 및 망막 혈류 이상 둘 다를 개선시켰다. 따라서, 혈장 칼리크레인 억제제는 당뇨병 망막증 및 당뇨병 황반 부종과 연관된 망막 혈관 투과성을 감소시키는 치료로서 유용성을 가져야 한다. 당뇨병의 다른 합병증, 예컨대 뇌 출혈, 신장병증, 심근병증 및 신경병증은 모두 혈장 칼리크레인과 연관이 있으며, 또한 혈장 칼리크레인 억제제에 대한 표적으로 간주될 수 있다. 지금까지, 의학적 용도로 승인된 소분자 합성 혈장 칼리크레인 억제제는 없었다. 에칼란티드에 대해 보고되었던 바와 같이, 대형 단백질 혈장 칼리크레인 억제제는 아나필락시스 반응의 위험을 나타낸다.
신규하고 효과적인 선택적인 FXIa 억제제 또는 FXIa 및 혈장 칼리크레인의 이중 억제제는 혈전색전성 및/또는 염증성 장애를 치료하기 위한 것으로 WO2016053455A1에 제공되어 있으며, 그의 전문이 참조로 포함된다. 이들 선택적인 FXIa 억제제 또는 FXIa 및 혈장 칼리크레인의 이중 억제제, 예컨대 본 발명에 제공된 화합물의 개발은 추가 출혈의 위험이 거의 또는 전혀 없으면서 높은 수준의 항혈전 효능을 달성하는 능력을 기반으로 한다. 그러나, 이러한 FXIa 억제제가 환자에게 투여된 드문 임상 상황에서 출혈이 발생할 수 있다. 인간에서, FXI-결핍성 출혈은 예를 들어 외상 후에, 특히 높은 피브린 용해 활성을 가진 조직, 예를 들어 구강 인두 및 요로에서 발생할 수 있다.
응고 인자 농축물 및 재조합 활성화 인자 VII를 비롯한 지혈유발성 접근법이 존재한다. 이들 작용제는 주로 혈우병을 가진 환자에서 사용되는 것으로 승이되었고, 특정한 역전제가 이용가능하지 않은 경우에 트롬빈 또는 FXa 억제제로 치료받는 출혈 환자에 대해 고려될 수 있다. 그러나, 이들 접근법은 혈전유발성 위험을 갖는다. 따라서, 심각한 출혈이 있거나 또는 응급 수술 개입이 필요한 대상체에서 혈전유발성 위험과 연관이 없이 이들 선택적인 FXIa 억제제 또는 FXIa 및 혈장 칼리크레인의 이중 억제제, 예컨대 본원에 개시된 화합물의 항혈전 효과를 즉시 역전시킬 수 있는 화합물을 개발하는 것이 시급하다.
본 발명은 선택적인 FXIa 억제제 및/또는 FXIa 및 혈장 칼리크레인의 이중 억제제에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 또는 항원 결합 펩티드를 제공한다. 본 발명은 추가로 대상체에게 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 펩티드의 제약상 유효 용량을 투여함으로써 FXIa 억제제의 항혈전 효과를 감소시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 생물학적 샘플에서 FXIa 억제제의 수준을 검출하기 위한 검출 시약 및 방법을 제공한다.
구체적인 실시양태 1: 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드로서, 여기서 적어도 하나의 VH는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
(a) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 상보성-결정 영역 1 (VH-CDR1);
(b) 서열식별번호: 13-22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 또는
(c) 서열식별번호: 23-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 및
여기서 적어도 하나의 VL은 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
(d) 서열식별번호: 29-37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1;
(e) 서열식별번호: 38-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 또는
(f) 서열식별번호: 44-51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
구체적인 실시양태 2: 하기를 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드:
(a) 서열식별번호: 52-83으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열식별번호: 84-99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역.
구체적인 실시양태 3: 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드로서, 여기서 VH는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3을 포함하고, VL은 3개의 CDR: VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3을 포함하며, 여기서 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3의 아미노산 서열 각각은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
(a) 각각 서열식별번호: 1, 13, 23, 29, 38, 및 44;
(b) 각각 서열식별번호: 1, 14, 23, 29, 38, 및 45;
(c) 각각 서열식별번호: 1, 13, 24, 30, 38, 및 45;
(d) 각각 서열식별번호: 1, 13, 24, 29, 39, 및 45;
(e) 각각 서열식별번호: 1, 14, 25, 29, 38, 및 46;
(f) 각각 서열식별번호: 2, 13, 26, 31, 40, 및 47;
(g) 각각 서열식별번호: 3, 15, 24, 32, 40, 및 47;
(h) 각각 서열식별번호: 4, 16, 24, 29, 38, 및 46;
(i) 각각 서열식별번호: 5, 15, 24, 29, 38, 및 46;
(j) 각각 서열식별번호: 1, 14, 24, 29, 38, 및 46;
(k) 각각 서열식별번호: 6, 13, 24, 31, 40, 및 47;
(l) 각각 서열식별번호: 3, 15, 24, 32, 41, 및 48;
(m) 각각 서열식별번호: 1, 14, 24, 33, 38, 및 49;
(n) 각각 서열식별번호: 1, 14, 26, 29, 38, 및 46;
(o) 각각 서열식별번호: 7, 17, 26, 29, 38, 및 46;
(p) 각각 서열식별번호: 8, 17, 24, 34, 38, 및 46;
(q) 각각 서열식별번호: 1, 17, 26, 29, 38, 및 46;
(r) 각각 서열식별번호: 1, 17, 26, 35, 38, 및 46;
(s) 각각 서열식별번호: 1, 17, 24, 33, 38, 및 49;
(t) 각각 서열식별번호: 9, 14, 26, 29, 38, 및 46;
(u) 각각 서열식별번호: 9, 14, 26, 35, 38, 및 46;
(v) 각각 서열식별번호: 9, 17, 24, 29, 38, 및 46;
(w) 각각 서열식별번호: 9, 17, 24, 35, 38, 및 46;
(x) 각각 서열식별번호: 9, 17, 24, 34, 38, 및 46;
(y) 각각 서열식별번호: 9, 14, 24, 29, 38, 및 46;
(z) 각각 서열식별번호: 9, 18, 26, 35, 38, 및 46;
(aa) 각각 서열식별번호: 8, 14, 24, 29, 38, 및 46;
(bb) 각각 서열식별번호: 8, 17, 26, 29, 38, 및 46;
(cc) 각각 서열식별번호: 9, 19, 26, 29, 38, 및 46;
(dd) 각각 서열식별번호: 9, 17, 26, 34, 38, 및 46;
(ee) 각각 서열식별번호: 10, 20, 27, 36, 42, 및 50;
(ff) 각각 서열식별번호: 11, 21, 28, 37, 43, 및 51;
(gg) 각각 서열식별번호: 12, 22, 26, 33, 38, 및 46;
(hh) 각각 서열식별번호: 12, 17, 26, 33, 38, 및 46;
(ii) 각각 서열식별번호: 9, 17, 26, 33, 38, 및 46; 및
(jj) 임의의 아미노산 서열이 그 안에 1, 2 또는 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것인 (a) 내지 (ii)의 변이체.
구체적인 실시양태 4: 실시양태 3에 있어서, 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역 각각이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
(a) 각각 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 84;
(b) 각각 서열식별번호: 53 및 서열식별번호: 85;
(c) 각각 서열식별번호: 54 및 서열식별번호: 86;
(d) 각각 서열식별번호: 54 및 서열식별번호: 87;
(e) 각각 서열식별번호: 55 및 서열식별번호: 88;
(f) 각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 89;
(g) 각각 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 90;
(h) 각각 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 88;
(i) 각각 서열식별번호: 59 및 서열식별번호: 88;
(j) 각각 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 91;
(k) 각각 서열식별번호: 61 및 서열식별번호: 89;
(l) 각각 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 92;
(m) 각각 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 93;
(n) 각각 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 88;
(o) 각각 서열식별번호: 62 및 서열식별번호: 88;
(p) 각각 서열식별번호: 63 및 서열식별번호: 88;
(q) 각각 서열식별번호: 64 및 서열식별번호: 88;
(r) 각각 서열식별번호: 65 및 서열식별번호: 94;
(s) 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 88;
(t) 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 95;
(u) 각각 서열식별번호: 67 및 서열식별번호: 88;
(v) 각각 서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 93;
(w) 각각 서열식별번호: 69 및 서열식별번호: 88;
(x) 각각 서열식별번호: 69 및 서열식별번호: 95;
(y) 각각 서열식별번호: 70 및 서열식별번호: 88;
(z) 각각 서열식별번호: 70 및 서열식별번호: 95;
(aa) 각각 서열식별번호: 71 및 서열식별번호: 88;
(bb) 각각 서열식별번호: 71 및 서열식별번호: 94;
(cc) 각각 서열식별번호: 72 및 서열식별번호: 88;
(dd) 각각 서열식별번호: 73 및 서열식별번호: 95;
(ee) 각각 서열식별번호: 74 및 서열식별번호: 88;
(ff) 각각 서열식별번호: 75 및 서열식별번호: 88;
(gg) 각각 서열식별번호: 76 및 서열식별번호: 88;
(hh) 각각 서열식별번호: 77 및 서열식별번호: 94;
(ii) 각각 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 96;
(jj) 각각 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 97;
(kk) 각각 서열식별번호: 80 및 서열식별번호: 98;
(ll) 각각 서열식별번호: 81 및 서열식별번호: 99;
(mm) 각각 서열식별번호: 81 및 서열식별번호: 98;
(nn) 각각 서열식별번호: 82 및 서열식별번호: 99;
(oo) 각각 서열식별번호: 83 및 서열식별번호: 98; 및
(pp) 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 (a) 내지 (oo)의 변이체.
구체적인 실시양태 5: 이전의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 각각 1개의 경쇄 가변 영역과 쌍을 형성한 2개의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드.
구체적인 실시양태 6: 실시양태 5에 있어서, 서열식별번호: 196-199로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드.
구체적인 실시양태 7: 이전의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항원 결합 펩티드가 화학식 (I)에 제시된 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
여기서:
R1은 C1-4 알킬이고;
R2는 F, Cl, CF3, CHF2, CH2F, CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 CF3, CHF2, CH2F, 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H이고;
R5는 F 및 Cl로부터 독립적으로 선택됨.
구체적인 실시양태 8: 실시양태 7에 있어서, 화합물이 화학식 (II)를 갖는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 9: 이전의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 항체인 단리된 항원 결합 펩티드.
구체적인 실시양태 10: 이전의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 결합 펩티드가 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 디술피드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGACH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, scFv-Fc, 또는 탠덤 Fab인 단리된 항원 결합 펩티드.
구체적인 실시양태 11: 이전의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며:
(a) 각각 서열식별번호: 100 및 서열식별번호: 160;
(b) 각각 서열식별번호: 101 및 서열식별번호: 160;
(c) 각각 서열식별번호: 102 및 서열식별번호: 161;
(d) 각각 서열식별번호: 103 및 서열식별번호: 161;
(e) 각각 서열식별번호: 104 및 서열식별번호: 162;
(f) 각각 서열식별번호: 105 및 서열식별번호: 162;
(g) 각각 서열식별번호: 104 및 서열식별번호: 163;
(h) 각각 서열식별번호: 105 및 서열식별번호: 163;
(i) 각각 서열식별번호: 106 및 서열식별번호: 164;
(j) 각각 서열식별번호: 107 및 서열식별번호: 164;
(k) 각각 서열식별번호: 108 및 서열식별번호: 165;
(l) 각각 서열식별번호: 109 및 서열식별번호: 165;
(m) 각각 서열식별번호: 110 및 서열식별번호: 166;
(n) 각각 서열식별번호: 111 및 서열식별번호: 166;
(o) 각각 서열식별번호: 112 및 서열식별번호: 164;
(p) 각각 서열식별번호: 113 및 서열식별번호: 164;
(q) 각각 서열식별번호: 114 및 서열식별번호: 164;
(r) 각각 서열식별번호: 115 및 서열식별번호: 164;
(s) 각각 서열식별번호: 116 및 서열식별번호: 167;
(t) 각각 서열식별번호: 117 및 서열식별번호: 167;
(u) 각각 서열식별번호: 118 및 서열식별번호: 165;
(v) 각각 서열식별번호: 119 및 서열식별번호: 165;
(w) 각각 서열식별번호: 110 및 서열식별번호: 168;
(x) 각각 서열식별번호: 111 및 서열식별번호: 168;
(y) 각각 서열식별번호: 116 및 서열식별번호: 169;
(z) 각각 서열식별번호: 117 및 서열식별번호: 169;
(aa) 각각 서열식별번호: 116 및 서열식별번호: 164;
(bb) 각각 서열식별번호: 117 및 서열식별번호: 164;
(cc) 각각 서열식별번호: 120 및 서열식별번호: 164;
(dd) 각각 서열식별번호: 121 및 서열식별번호: 164;
(ee) 각각 서열식별번호: 122 및 서열식별번호: 164;
(ff) 각각 서열식별번호: 123 및 서열식별번호: 164;
(gg) 각각 서열식별번호: 124 및 서열식별번호: 164;
(hh) 각각 서열식별번호: 125 및 서열식별번호: 164;
(ii) 각각 서열식별번호: 126 및 서열식별번호: 170;
(jj) 각각 서열식별번호: 127 및 서열식별번호: 170;
(kk) 각각 서열식별번호: 128 및 서열식별번호: 164;
(ll) 각각 서열식별번호: 129 및 서열식별번호: 164;
(mm) 각각 서열식별번호: 128 및 서열식별번호: 171;
(nn) 각각 서열식별번호: 129 및 서열식별번호: 171;
(oo) 각각 서열식별번호: 130 및 서열식별번호: 164;
(pp) 각각 서열식별번호: 131 및 서열식별번호: 164;
(qq) 각각 서열식별번호: 132 및 서열식별번호: 169;
(rr) 각각 서열식별번호: 133 및 서열식별번호: 169;
(ss) 각각 서열식별번호: 134 및 서열식별번호: 164;
(tt) 각각 서열식별번호: 135 및 서열식별번호: 164;
(uu) 각각 서열식별번호: 134 및 서열식별번호: 171;
(vv) 각각 서열식별번호: 135 및 서열식별번호: 171;
(ww) 각각 서열식별번호: 136 및 서열식별번호: 164;
(xx) 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 164;
(yy) 각각 서열식별번호: 136 및 서열식별번호: 171;
(zz) 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 171;
(aaa) 각각 서열식별번호: 138 및 서열식별번호: 164;
(bbb) 각각 서열식별번호: 139 및 서열식별번호: 164;
(ccc) 각각 서열식별번호: 138 및 서열식별번호: 170;
(ddd) 각각 서열식별번호: 139 및 서열식별번호: 170;
(eee) 각각 서열식별번호: 140 및 서열식별번호: 164;
(fff) 각각 서열식별번호: 141 및 서열식별번호: 164;
(ggg) 각각 서열식별번호: 142 및 서열식별번호: 171;
(hhh) 각각 서열식별번호: 143 및 서열식별번호: 171;
(iii) 각각 서열식별번호: 144 및 서열식별번호: 164;
(jjj) 각각 서열식별번호: 145 및 서열식별번호: 164;
(kkk) 각각 서열식별번호: 146 및 서열식별번호: 164;
(lll) 각각 서열식별번호: 147 및 서열식별번호: 164;
(mmm) 각각 서열식별번호: 148 및 서열식별번호: 164;
(nnn) 각각 서열식별번호: 149 및 서열식별번호: 164;
(ooo) 각각 서열식별번호: 150 및 서열식별번호: 170;
(ppp) 각각 서열식별번호: 151 및 서열식별번호: 170;
(qqq) 각각 서열식별번호: 152 및 서열식별번호: 172;
(rrr) 각각 서열식별번호: 153 및 서열식별번호: 172;
(sss) 각각 서열식별번호: 154 및 서열식별번호: 173;
(ttt) 각각 서열식별번호: 155 및 서열식별번호: 173;
(uuu) 각각 서열식별번호: 156 및 서열식별번호: 174;
(vvv) 각각 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 174;
(www) 각각 서열식별번호: 158 및 서열식별번호: 175;
(xxx) 각각 서열식별번호: 159 및 서열식별번호: 175;
(yyy) 각각 서열식별번호: 158 및 서열식별번호: 174; 및
(zzz) 각각 서열식별번호: 159 및 서열식별번호: 174;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 12: 이전의 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며:
(a) 각각 서열식별번호: 176 및 서열식별번호: 160;
(b) 각각 서열식별번호: 177 및 서열식별번호: 160;
(c) 각각 서열식별번호: 178 및 서열식별번호: 160;
(d) 각각 서열식별번호: 179 및 서열식별번호: 160;
(e) 각각 서열식별번호: 180 및 서열식별번호: 164;
(f) 각각 서열식별번호: 181 및 서열식별번호: 164;
(g) 각각 서열식별번호: 182 및 서열식별번호: 164;
(h) 각각 서열식별번호: 183 및 서열식별번호: 164;
(i) 각각 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 163;
(j) 각각 서열식별번호: 185 및 서열식별번호: 163;
(k) 각각 서열식별번호: 186 및 서열식별번호: 163;
(l) 각각 서열식별번호: 187 및 서열식별번호: 163;
(m) 각각 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 162;
(n) 각각 서열식별번호: 185 및 서열식별번호: 162;
(o) 각각 서열식별번호: 186 및 서열식별번호: 162;
(p) 각각 서열식별번호: 187 및 서열식별번호: 162;
(q) 각각 서열식별번호: 188 및 서열식별번호: 165;
(r) 각각 서열식별번호: 189 및 서열식별번호: 165;
(s) 각각 서열식별번호: 190 및 서열식별번호: 165;
(t) 각각 서열식별번호: 191 및 서열식별번호: 165;
(u) 각각 서열식별번호: 192 및 서열식별번호: 161;
(v) 각각 서열식별번호: 193 및 서열식별번호: 161;
(w) 각각 서열식별번호: 194 및 서열식별번호: 161; 및
(x) 각각 서열식별번호: 195 및 서열식별번호: 161;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 13: 실시양태 11에 있어서, 각각 서열식별번호: 106 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인
단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 14: 서열식별번호: 106 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 Fab 단편:
구체적인 실시양태 15: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 180 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 16: 서열식별번호: 180 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 17: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 181 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 18: 서열식별번호: 181 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 19: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 182 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 20: 서열식별번호: 182 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 21: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 183 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 22: 서열식별번호: 183 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 23: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 176 및 서열식별번호: 160의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 24: 서열식별번호: 176 및 서열식별번호: 160의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 25: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 177 및 서열식별번호: 160의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 26: 서열식별번호: 177 및 서열식별번호: 160의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 27: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 162의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 28: 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 162의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 29: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 163의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 30: 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 163의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 31: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 188 및 서열식별번호: 165의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 32: 서열식별번호: 188 및 서열식별번호: 165의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 33: 실시양태 12에 있어서, 각각 서열식별번호: 192 및 서열식별번호: 161의 서열을 포함하며;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
구체적인 실시양태 34: 서열식별번호: 192 및 서열식별번호: 161의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서;
여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
구체적인 실시양태 35: 실시양태 1-34 중 어느 하나의 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
구체적인 실시양태 36: 실시양태 35의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터.
구체적인 실시양태 37: 실시양태 36의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
구체적인 실시양태 38: 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 제조하는 방법으로서, (a) 실시양태 37의 숙주 세포를 숙주 세포가 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 생성하도록 단백질 생성을 촉진시키는 배양 조건 하에 배양하는 것, 및 (b) 상기 배양물로부터 상기 항원 결합 펩티드 또는 상기 항체 Fab 단편 또는 상기 항체 탠덤 Fab 단편을 단리하는 것을 포함하는 방법.
구체적인 실시양태 39: 실시양태 1-34 중 어느 하나의 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편 및 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약.
구체적인 실시양태 40: 실시양태 39에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 검출가능한 표지에 연결된 것인 검출 시약.
구체적인 실시양태 41: 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체의 항혈전 효과의 감소를 필요로 하는 대상체에게 실시양태 1-34 중 어느 하나의 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 제약상 유효 용량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체의 항혈전 효과를 감소시키는 방법:
여기서:
R1은 C1-4 알킬이고;
R2는 F, Cl, CF3, CHF2, CH2F, CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 CF3, CHF2, CH2F, 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H이고;
R5는 F 및 Cl로부터 독립적으로 선택됨.
구체적인 실시양태 42: 실시양태 41에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)를 갖는 것인 방법:
구체적인 실시양태 43: 실시양태 41 또는 42에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 제약상 유효 용량이 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 용량에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 또는 대상체에서의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 존재에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 포함하는 것인 방법.
구체적인 실시양태 44: 실시양태 41-43 중 어느 하나에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여와 동시에 또는 그 후에 투여되는 것인 방법.
구체적인 실시양태 45: 실시양태 41-44 중 어느 하나에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 정맥내로, 근육내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
구체적인 실시양태 46: 실시양태 41-45 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
구체적인 실시양태 47: 생물학적 샘플에서 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 호변이성질체 또는 제약상 허용가능한 염의 수준을 검출하는 방법으로서,
여기서:
R1은 C1-4 알킬이고;
R2는 F, Cl, CF3, CHF2, CH2F, CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 CF3, CHF2, CH2F, 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H이고;
R5는 F 및 Cl로부터 독립적으로 선택됨;
(a) 생물학적 샘플을 실시양태 1-34 중 어느 하나의 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편과 접촉시키는 것, 및
(b) 상기 화합물 및 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 결합된 복합체의 수준을 검출하는 것
을 포함하는 방법.
구체적인 실시양태 48: 실시양태 47에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)를 갖는 것인 방법:
구체적인 실시양태 49: 실시양태 47 또는 48에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 표지되는 것인 방법.
구체적인 실시양태 50: 실시양태 47-49 중 어느 하나에 있어서, 검출이 면역학적 검정에 의해 수행되는 것인 방법.
구체적인 실시양태 51: 실시양태 47-50 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 샘플이 소변, 대변, 타액, 전혈, 혈장, 장기 조직, 모발, 피부, 세포, 또는 세포 배양물을 포함하는 것인 방법.
구체적인 실시양태 52: 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체의 치료 유효량을 복용 중인 대상체에게 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 제약상 유효 용량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체를 결합시키는 방법:
여기서:
R1은 C1-4 알킬이고;
R2는 F, Cl, CF3, CHF2, CH2F, CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 CF3, CHF2, CH2F, 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H이고;
R5는 F 및 Cl로부터 독립적으로 선택됨.
구체적인 실시양태 53: 실시양태 52에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)를 갖는 것인 방법:
구체적인 실시양태 54: 실시양태 52 또는 53에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 제약상 유효 용량이 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 용량에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 또는 대상체에서의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 존재에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 포함하는 것인 방법.
구체적인 실시양태 55: 실시양태 52-54 중 어느 하나에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여와 동시에 또는 그 후에 투여되는 것인 방법.
구체적인 실시양태 56: 실시양태 52-55 중 어느 하나에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 정맥내로, 근육내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
구체적인 실시양태 57: 실시양태 52-56 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
도 1a 및 1b는 26D5 mAb의 서열과 가장 가까운 인간 생식계열 V 및 J 유전자 서열의 비교를 도시한다. 도 1a: 26D5의 VH 서열을 IGHV3-53 및 IGHJ4 생식계열 서열과 비교하여 제시한다. 카바트(Kabat) 넘버링이 제시된다. HCDR2 및 HCDR3의 카바트 정의가 제시된다. HCDR1의 카바트 및 AbM 정의가 제시된다. 도 1a는 등장 순서대로 각각 서열식별번호 205, 83 및 220을 개시한다. 도 1b: 26D5의 VK 서열을 IGKV1-12 및 IGKJ4 생식계열 서열과 비교하여 제시한다. 카바트 넘버링이 제시된다. CDR의 카바트 정의가 제시된다. 도 1b는 등장 순서대로 각각 서열식별번호 206, 98 및 207을 개시한다.
도 2는 돌연변이 스캔을 위해 무작위화된 26D5-GV-Q mAb의 위치를 도시한다. 카바트 넘버링은 돌연변이 스캔에서 무작위화된 각각의 위치에 대해 제시된다. 카바트 정의는 LCDR1-3, HCDR2-3에 대해 제시되며 (그러나 마지막 6개의 아미노산이 여기서 HCDR2로부터 누락됨); AbM 정의는 HCDR1에 대해 제시된다. 도 2는 등장 순서대로 각각 서열식별번호 33, 46, 208-209 및 26을 개시한다.
도 3a-e는 항체 결합에 대해 지정된 위치에서의 돌연변이의 효과 (유리한, 중립 또는 불리한)를 나타내는 26D5-GV-Q mAb의 위치의 히트 맵 스캔을 도시한다. 도 3a는 LCDR1 (서열식별번호: 33)을 제시하고; 도 3b는 LCDR3 (서열식별번호: 46)을 제시하고; 도 3c는 HCDR1 (서열식별번호: 208)을 제시하고; 도 3d는 HCDR2 (서열식별번호: 209)를 제시하고; 도 3e는 HCDR3 (서열식별번호: 26)을 제시한다.
도 4a 및 4b는 26D5-GV-Q 항체의 친화도 성숙으로부터 유래된 자손의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 카바트 정의는 CDR 및 넘버링을 위해 사용된다. 도 4a는 중쇄 가변 영역의 정렬을 제시한다 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 83, 82, 74, 60, 67, 62, 75, 66, 64, 69, 71, 60, 68, 77, 66, 76, 69, 70, 71, 73, 72, 65, 70 및 63). 도 4b는 경쇄 가변 영역의 정렬을 제시한다 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 98, 99, 88, 88, 88, 88, 88, 88, 88, 88, 88, 93, 93, 94, 95, 88, 95, 88, 94, 95, 88, 94, 95 및 88).
도 5는 돌연변이 스캔을 위해 무작위화된 26D5-295-B08 mAb의 위치를 도시한다. 카바트 넘버링은 돌연변이 스캔에서 무작위화된 각각의 위치에 대해 제시된다. 도 5는 등장 순서대로 각각 서열식별번호 210-215를 개시한다.
도 6a-f는 항체 결합에 대해 지정된 위치에서의 돌연변이의 효과를 나타내는 26D5-295-B08 mAb의 CDR 및 인접한 프레임워크 위치의 히트 맵 스캔을 도시한다 (추가의 설명에 대해서는 도 3a 참조). 도 6a는 LCDR1 (서열식별번호: 210)을 제시하고; 도 6b는 LCDR2 (서열식별번호: 211)를 제시하고; 도 6c는 LCDR3 (서열식별번호: 212)을 제시하고; 도 6d는 HCDR1 (서열식별번호: 213)을 제시하고; 도 6e는 HCDR2 (서열식별번호: 214)를 제시하고; 도 6f는 HCDR3 (서열식별번호: 215)을 제시한다.
도 7a 및 7b는 복합 라이브러리를 생성하기 위해 무작위화된 26D5-295-B08 mAb의 아미노산 위치를 도시한다 (도 7a, 복합 칩 라이브러리 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 216-219); 도 7b, 복합 도핑 라이브러리 (서열식별번호: 215)).
도 8a 및 8b는 26D5-295-B08 mAb의 친화도 성숙으로부터 유래된 자손의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 카바트 정의는 CDR 및 넘버링을 위해 사용된다. 도 8a는 중쇄 가변 영역의 정렬을 제시한다 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 83, 82, 60, 54, 52, 54, 60, 53, 61, 56, 59, 57, 57, 58 및 55). 도 8b는 경쇄 가변 영역의 정렬을 제시한다 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 98, 99, 88, 86, 84, 87, 91, 85, 89, 89, 88, 92, 90, 88 및 88).
도 9는 화합물 A의 활성의 50% 이상 역전을 위해 필요한 항체의 양을 결정하기 위한 발색 효소 검정으로부터의 결과를 도시한다. 인자 XIa 기질 및 화합물 A의 농도는 일정하게 유지하면서, 인자 XIa 효소 활성의 활성 (y-축)은 대표적인 친화도 성숙 mAb의 농도 (x-축)의 함수로 플롯팅되었다. 상단 그래프는 모체 26D5의 mAb IgG1f 버전 (서열식별번호: 83 및 98; 본원에서 P1-072224로도 지칭되고; 도면에서 "26D5 mAb"로 표시됨)의 사용으로부터 유래된 데이터를 제시한다. 하단 그래프는 26D5-296-G07의 mAb IgG1f 버전 (서열식별번호: 65 및 94; 본원에서 P1-073056으로도 지칭되고; 도면에서 "26D5-296-G07 mAb"로 표시됨)의 사용으로부터 유래된 데이터를 제시한다.
도 10은 다양한 화합물 농도에서 측정된, 화합물 A에 대한 모체 mAb 26D5 (P1-072224) (도면에서 "26D5 mAb"로 표시됨)의 결합 친화도를 나타내는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 센서그램을 도시한다.
도 11은 다양한 mAb/Fab 농도에서 측정된, 화합물 2에 대한 (상단) mAb 26D5-GV-Q, (중간) mAb 26D5-295-B08 및 (하단) 항체 Fab 단편 26D5-295-B08의 결합 친화도를 나타내는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 센서그램을 도시한다.
도 12는 다양한 TanFab 농도에서 측정된, 화합물 5에 대한 (상단) 항체 탠덤 Fab (TanFab) 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab 및 (하단) 항체 탠덤 Fab (TanFab) 단편 26D5-75214-343-F06-TanFab의 결합 친화도를 나타내는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 센서그램을 도시한다.
도 13은 화합물 5에 각각 결합하는 (A) 26D5-GVR-Q-FT-Fab-LONG의 mAb 형태, (B) 26D5-295-B08-Fab-LONG의 mAb 형태 및 (C) 26D5-75747-348-D07-Fab-LONG의 mAb 형태의 시간-분해 형광 에너지 전달 (TR-FRET) 유래된 경쟁적 결합 데이터를 도시한다.
도 14는 화합물 5에 각각 결합하는 지정된 항체 및 항체 Fab 단편의 시간-분해 형광 에너지 전달 (TR-FRET) 유래된 경쟁적 결합 데이터를 도시한다.
도 15는 지정된 항체 Fab 단편의 DSC 써모그램을 도시한다.
도 16은 화합물 A에 결합된 항체 Fab 단편 26D5-GVR-Q-FT Fab의 결정학에 의해 결정되는 구조를 도시한다.
도 17은 화합물 A에 결합된 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 결정학에 의해 결정되는 구조를 도시한다.
도 18은 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT에 의한 화합물 A의 항응고 효과의 역전을 도시한다. 인간 혈장 응고 시간 (aPTT)은 화합물 A 및 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 혈장 농도의 함수로서 플롯팅되었다.
도 19는 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT가 존재하는지 또는 부재하는지 여부와 무관하게, 인간 혈장 응고 시간 (aPTT)이 결합되지 않은 화합물 A의 혈장 농도의 함수임을 도시한다. 인간 혈장 응고 시간 (aPTT)은 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 부재 시 (채워진 기호) 및 존재 시 (열린 기호) 화합물 A의 혈장 농도의 함수로서 플롯팅되었다.
도 20은 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT에 의한 화합물 A의 항응고 효과의 역전을 도시한다. 화합물 A의 IV 용량 (1 mg/kg), 20분 후 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 IV 용량 (160 mg/kg)을 토끼에게 투여하였다. 혈장 응고 시간 (aPTT)은 기준선에서, 화합물 A의 투여 직전에, 및 그 후 약 24시간 동안 측정되었다.
도 21은 화합물 A의 IV 용량 (1 mg/kg), 20분 후 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 IV 용량 (160 mg/kg)으로부터 생성된 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT, 화합물 A 및 유리 화합물 A의 약동학 (토끼 혈장 농도)을 도시한다.
도 22는 10분에 걸쳐 주입에 의해 투여된 각각 10 mg/kg의 IV 용량으로부터 생성된 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 약동학 (래트 혈장 농도)을 도시한다. 열린 원/탠덤 Fab는 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab 데이터 점을 나타낸다. 열린 삼각형/Fab는 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 데이터 점을 나타낸다.
도 23은 10분에 걸쳐 주입에 의해 투여된 0.4 mg/kg의 화합물 A의 IV 용량, 20분 후 10분에 걸쳐 주입에 의해 투여된 40 mg/kg의 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 IV 용량으로부터 생성된 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab, 화합물 A 및 유리 화합물 A의 약동학 (토끼 혈장 농도)을 도시한다. 닫힌 원/탠덤 Fab는 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab 데이터 점을 나타낸다.
도 24는 중화 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab에 의한 화합물 A의 항응고 효과의 역전을 도시한다. 인간 혈장 응고 시간 (aPTT)는 화합물 A 및 중화 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 혈장 농도의 함수로서 플롯팅되었다. "탠덤 Fab"는 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab를 나타낸다.
도 2는 돌연변이 스캔을 위해 무작위화된 26D5-GV-Q mAb의 위치를 도시한다. 카바트 넘버링은 돌연변이 스캔에서 무작위화된 각각의 위치에 대해 제시된다. 카바트 정의는 LCDR1-3, HCDR2-3에 대해 제시되며 (그러나 마지막 6개의 아미노산이 여기서 HCDR2로부터 누락됨); AbM 정의는 HCDR1에 대해 제시된다. 도 2는 등장 순서대로 각각 서열식별번호 33, 46, 208-209 및 26을 개시한다.
도 3a-e는 항체 결합에 대해 지정된 위치에서의 돌연변이의 효과 (유리한, 중립 또는 불리한)를 나타내는 26D5-GV-Q mAb의 위치의 히트 맵 스캔을 도시한다. 도 3a는 LCDR1 (서열식별번호: 33)을 제시하고; 도 3b는 LCDR3 (서열식별번호: 46)을 제시하고; 도 3c는 HCDR1 (서열식별번호: 208)을 제시하고; 도 3d는 HCDR2 (서열식별번호: 209)를 제시하고; 도 3e는 HCDR3 (서열식별번호: 26)을 제시한다.
도 4a 및 4b는 26D5-GV-Q 항체의 친화도 성숙으로부터 유래된 자손의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 카바트 정의는 CDR 및 넘버링을 위해 사용된다. 도 4a는 중쇄 가변 영역의 정렬을 제시한다 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 83, 82, 74, 60, 67, 62, 75, 66, 64, 69, 71, 60, 68, 77, 66, 76, 69, 70, 71, 73, 72, 65, 70 및 63). 도 4b는 경쇄 가변 영역의 정렬을 제시한다 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 98, 99, 88, 88, 88, 88, 88, 88, 88, 88, 88, 93, 93, 94, 95, 88, 95, 88, 94, 95, 88, 94, 95 및 88).
도 5는 돌연변이 스캔을 위해 무작위화된 26D5-295-B08 mAb의 위치를 도시한다. 카바트 넘버링은 돌연변이 스캔에서 무작위화된 각각의 위치에 대해 제시된다. 도 5는 등장 순서대로 각각 서열식별번호 210-215를 개시한다.
도 6a-f는 항체 결합에 대해 지정된 위치에서의 돌연변이의 효과를 나타내는 26D5-295-B08 mAb의 CDR 및 인접한 프레임워크 위치의 히트 맵 스캔을 도시한다 (추가의 설명에 대해서는 도 3a 참조). 도 6a는 LCDR1 (서열식별번호: 210)을 제시하고; 도 6b는 LCDR2 (서열식별번호: 211)를 제시하고; 도 6c는 LCDR3 (서열식별번호: 212)을 제시하고; 도 6d는 HCDR1 (서열식별번호: 213)을 제시하고; 도 6e는 HCDR2 (서열식별번호: 214)를 제시하고; 도 6f는 HCDR3 (서열식별번호: 215)을 제시한다.
도 7a 및 7b는 복합 라이브러리를 생성하기 위해 무작위화된 26D5-295-B08 mAb의 아미노산 위치를 도시한다 (도 7a, 복합 칩 라이브러리 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 216-219); 도 7b, 복합 도핑 라이브러리 (서열식별번호: 215)).
도 8a 및 8b는 26D5-295-B08 mAb의 친화도 성숙으로부터 유래된 자손의 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 카바트 정의는 CDR 및 넘버링을 위해 사용된다. 도 8a는 중쇄 가변 영역의 정렬을 제시한다 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 83, 82, 60, 54, 52, 54, 60, 53, 61, 56, 59, 57, 57, 58 및 55). 도 8b는 경쇄 가변 영역의 정렬을 제시한다 (등장 순서대로 각각 서열식별번호 98, 99, 88, 86, 84, 87, 91, 85, 89, 89, 88, 92, 90, 88 및 88).
도 9는 화합물 A의 활성의 50% 이상 역전을 위해 필요한 항체의 양을 결정하기 위한 발색 효소 검정으로부터의 결과를 도시한다. 인자 XIa 기질 및 화합물 A의 농도는 일정하게 유지하면서, 인자 XIa 효소 활성의 활성 (y-축)은 대표적인 친화도 성숙 mAb의 농도 (x-축)의 함수로 플롯팅되었다. 상단 그래프는 모체 26D5의 mAb IgG1f 버전 (서열식별번호: 83 및 98; 본원에서 P1-072224로도 지칭되고; 도면에서 "26D5 mAb"로 표시됨)의 사용으로부터 유래된 데이터를 제시한다. 하단 그래프는 26D5-296-G07의 mAb IgG1f 버전 (서열식별번호: 65 및 94; 본원에서 P1-073056으로도 지칭되고; 도면에서 "26D5-296-G07 mAb"로 표시됨)의 사용으로부터 유래된 데이터를 제시한다.
도 10은 다양한 화합물 농도에서 측정된, 화합물 A에 대한 모체 mAb 26D5 (P1-072224) (도면에서 "26D5 mAb"로 표시됨)의 결합 친화도를 나타내는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 센서그램을 도시한다.
도 11은 다양한 mAb/Fab 농도에서 측정된, 화합물 2에 대한 (상단) mAb 26D5-GV-Q, (중간) mAb 26D5-295-B08 및 (하단) 항체 Fab 단편 26D5-295-B08의 결합 친화도를 나타내는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 센서그램을 도시한다.
도 12는 다양한 TanFab 농도에서 측정된, 화합물 5에 대한 (상단) 항체 탠덤 Fab (TanFab) 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab 및 (하단) 항체 탠덤 Fab (TanFab) 단편 26D5-75214-343-F06-TanFab의 결합 친화도를 나타내는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 센서그램을 도시한다.
도 13은 화합물 5에 각각 결합하는 (A) 26D5-GVR-Q-FT-Fab-LONG의 mAb 형태, (B) 26D5-295-B08-Fab-LONG의 mAb 형태 및 (C) 26D5-75747-348-D07-Fab-LONG의 mAb 형태의 시간-분해 형광 에너지 전달 (TR-FRET) 유래된 경쟁적 결합 데이터를 도시한다.
도 14는 화합물 5에 각각 결합하는 지정된 항체 및 항체 Fab 단편의 시간-분해 형광 에너지 전달 (TR-FRET) 유래된 경쟁적 결합 데이터를 도시한다.
도 15는 지정된 항체 Fab 단편의 DSC 써모그램을 도시한다.
도 16은 화합물 A에 결합된 항체 Fab 단편 26D5-GVR-Q-FT Fab의 결정학에 의해 결정되는 구조를 도시한다.
도 17은 화합물 A에 결합된 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 결정학에 의해 결정되는 구조를 도시한다.
도 18은 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT에 의한 화합물 A의 항응고 효과의 역전을 도시한다. 인간 혈장 응고 시간 (aPTT)은 화합물 A 및 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 혈장 농도의 함수로서 플롯팅되었다.
도 19는 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT가 존재하는지 또는 부재하는지 여부와 무관하게, 인간 혈장 응고 시간 (aPTT)이 결합되지 않은 화합물 A의 혈장 농도의 함수임을 도시한다. 인간 혈장 응고 시간 (aPTT)은 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 부재 시 (채워진 기호) 및 존재 시 (열린 기호) 화합물 A의 혈장 농도의 함수로서 플롯팅되었다.
도 20은 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT에 의한 화합물 A의 항응고 효과의 역전을 도시한다. 화합물 A의 IV 용량 (1 mg/kg), 20분 후 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 IV 용량 (160 mg/kg)을 토끼에게 투여하였다. 혈장 응고 시간 (aPTT)은 기준선에서, 화합물 A의 투여 직전에, 및 그 후 약 24시간 동안 측정되었다.
도 21은 화합물 A의 IV 용량 (1 mg/kg), 20분 후 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 IV 용량 (160 mg/kg)으로부터 생성된 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT, 화합물 A 및 유리 화합물 A의 약동학 (토끼 혈장 농도)을 도시한다.
도 22는 10분에 걸쳐 주입에 의해 투여된 각각 10 mg/kg의 IV 용량으로부터 생성된 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 약동학 (래트 혈장 농도)을 도시한다. 열린 원/탠덤 Fab는 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab 데이터 점을 나타낸다. 열린 삼각형/Fab는 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 데이터 점을 나타낸다.
도 23은 10분에 걸쳐 주입에 의해 투여된 0.4 mg/kg의 화합물 A의 IV 용량, 20분 후 10분에 걸쳐 주입에 의해 투여된 40 mg/kg의 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 IV 용량으로부터 생성된 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab, 화합물 A 및 유리 화합물 A의 약동학 (토끼 혈장 농도)을 도시한다. 닫힌 원/탠덤 Fab는 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab 데이터 점을 나타낸다.
도 24는 중화 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab에 의한 화합물 A의 항응고 효과의 역전을 도시한다. 인간 혈장 응고 시간 (aPTT)는 화합물 A 및 중화 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 혈장 농도의 함수로서 플롯팅되었다. "탠덤 Fab"는 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab를 나타낸다.
본 발명은 선택적인 FXIa 억제제 및/또는 FXIa 및 혈장 칼리크레인의 이중 억제제에 결합하는 신규한 항체 또는 항원 결합 펩티드를 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, FXIa 억제제는 화학식 (I)에 제시된 화합물이며, FXIa의 활성 또는 기능을 억제하는 능력을 갖는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 화학식 (I)에 제시된 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I)에서 R1은 C1-4 알킬이고; 화학식 (I)에서 R2는 F, Cl, CF3, CHF2, CH2F, CH3으로부터 독립적으로 선택되고; 화학식 (I)에서 R3은 CF3, CHF2, CH2F, 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되고; 화학식 (I)에서 R4는 H이고; 화학식 (I)에서 R5는 F 및 Cl로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 화학식 (II)에 제시된 화합물에 특이적으로 결합한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물은 화학식 (I) 또는 (II)을 갖는 모든 화합물, 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체를 포괄한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 펩티드에 의해 격리될 항원은 화학식 (II)의 화합물 (본원에서 화합물 A로도 지칭되고, 밀벡시안으로 공지됨)이다. 밀벡시안은 직접적으로 작용하는 가역적인 소분자 치료제이며, 인간 응고 인자 XI (FXIa)의 활성화된 형태에 높은 친화도 및 선택성으로 결합하여 그를 억제하한다. 밀벡시안은 화학명 (5R,9S)-9-(4-(5-클로로-2-(4-클로로-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)-6-옥소피리미딘-1(6H)-일)-21-(디플루오로메틸)-5-메틸-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-4-온을 갖는다. 밀벡시안 및 밀벡시안의 제조 방법은 미국 특허 번호 9,453,018 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, FXIa는 혈액 응고의 조절에 관여하는 고유한 경로에 있는 세린 프로테아제를 지칭한다. FXIa의 구조 및 생리학적 기능은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이는 주로 간세포에 의해 합성되고, 자이모겐 형태인 FXI로 순환한다. 이어서, FXI는 FXIIa 및 트롬빈에 의해 생리학적으로 활성화된다. 문헌 [Mohammed B. et al. Thromb Res., 161:94-105 (2018)]을 참조하며, 이는 참조로 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 펩티드"는 표적 분자 (즉, 항원)를 인식하고 그에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 표적 분자의 예에는 소분자 화합물, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 이들의 임의의 일부 또는 조합이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 펩티드는 항체 또는 항체 단편, 예컨대 비제한적으로 (Fab), Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 디술피드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGACH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, scFv-Fc, 또는 탠덤 Fab이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 펩티드, 예를 들어 항체 또는 Fab 단편은 단리될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 핵산, 펩티드 또는 단백질이 그의 본래의 환경으로부터, 예를 들어 세포 또는 그를 생성하는 유기체로부터, 또는 핵산, 펩티드 또는 단백질이 천연 발생하는 유체로부터 제거됨을 의미한다. 신규한 비천연 발생 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 단백질의 경우, "단리된" 펩티드 또는 단백질은 단백질 또는 펩티드가 펩티드 또는 단백질을 생성하는 조작된 세포로부터 제거되었음을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 펩티드 또는 단백질이 혼합물 또는 조성물, 예를 들어 제약 제형의 성분이지만, 단백질 또는 펩티드가 펩티드 또는 단백질을 생성하는 세포 내에 있지 않고, 그의 본래의 환경에 존재하지 않는 경우, 펩티드 또는 단백질은 단리된 것으로 여전히 간주될 수 있다.
본 발명의 한 구체적인 실시양태에서, Fab는 항원 결합 펩티드로서 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fab" 또는 "항체 Fab 단편"은 널리 공지된 용어이며, 항원에 결합하는 전장 항체 상의 영역을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항체 Fab 단편은 적어도 전장 경쇄 및 중쇄의 N-말단 부분으로 구성된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 전장 경쇄는 적어도 경쇄 불변 영역 (CL) 및 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고; 중쇄의 N-말단 부분은 적어도 중쇄 불변 영역의 CH1 도메인 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
본 발명의 한 구체적인 실시양태에서, 탠덤 Fab는 항원 결합 펩티드로서 제공된다. 본원에 제공된 탠덤 Fab는 중쇄의 적어도 하나의 N-말단 부분 (VH-CH1) 및 적어도 하나의 전장 경쇄 (VL-CL)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 탠덤 Fab는 링커를 통해 연결된 중쇄의 2개 이상의 N-말단 부분을 포함하며 (예를 들어, VH-CH1-링커-CH1-VH 또는 VH-CH1-링커-VH-CH1), 각각 1개의 전장 경쇄 (VL-CL)와 쌍을 형성한다. 예시적인 실시양태에서, 본원에 제공된 탠덤 Fab는 링커를 통해 연결된 중쇄의 2개의 N-말단 부분을 포함하며 (예를 들어, VH-CH1-링커-CH1-VH 또는 VH-CH1-링커-VH-CH1), 각각 1개의 전장 경쇄 (VL-CL)와 쌍을 형성한다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드 링커이다. 예시적인 탠덤 Fab는 본 발명의 표 4에 제공된다. 용어 "탠덤 Fab", "항체 탠덤 Fab 단편" 및 "항체 TanFab 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
항체의 "가변 영역"은 관련 기술분야에 널리 공지된 용어이며, 그의 항원에 결합하기 위한 항체의 특이성에 기여하는 경쇄 또는 중쇄의 말단을 지칭한다. 용어 "중쇄 가변 영역," "가변 중쇄," 및 "VH"는 상호교환적으로 사용되고, 그의 항원에 결합하기 위한 항체의 특이성에 기여하는 중쇄의 말단을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "경쇄 가변 영역," "가변 경쇄," 및 "VL"은 상호교환적으로 사용되고, 그의 항원에 결합하기 위한 항체의 특이성에 기여하는 경쇄의 말단을 지칭한다.
중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역은 일반적으로 초가변 영역으로도 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 구성된다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 도메인의 형성에 기여한다. CDR을 결정하는 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 적어도 2가지의 CDR 결정 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성을 기반으로 하는 접근법; 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기반으로 하는 접근법. 또한, CDR을 결정하기 위해 이들 두 접근법의 조합이 관련 기술분야에서 때때로 이용된다. 각각의 쇄의 CDR은 아미노 말단 끝에서 카르복시 말단 끝까지의 방향으로 넘버링된 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 넘버링된다.
항체의 "불변 영역"은 관련 기술분야에 널리 공지된 용어이며, 상이한 항체 분자 사이의 아미노산 서열에서 비교적 불변인 항체의 부분을 지칭한다. 전형적으로, 중쇄 불변 영역은 아미노 말단 (N-말단) 끝에서 카르복시 말단 (C-말단) 끝까지의 방향으로 넘버링된 CH1, CH2 및 CH3으로 명명되는 3개의 별개의 영역으로 구성된다. 전형적인 경쇄는 CL로 명명되는 1개의 불변 영역만을 갖는다. 항체의 불변 영역은 그의 특정한 효과 또는 기능을 결정한다. 관련 기술분야의 기술자는 항체의 불변 영역의 용어 및 구조적 특징을 용이하게 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드 분자가 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한, 항원 결합 펩티드는 적어도 하나의 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 변형된 폴리펩티드 분자를 포괄한다. 본원에 제공된 항원 결합 펩티드는 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성 동위원소, 형광 표지 등에 접합되거나 또는 접합되지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 관련 기술분야에 널리 공지된 용어이며, 면역글로불린 분자의 가변 영역의 적어도 일부 내에 있는 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 표적 분자를 인식하고 그에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체의 구조는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 종종 적어도 2개의 전장 중쇄로 구성된다. 대부분의 항체 (낙타 항체는 가장 주목할 만한 예외임)는 적어도 2개의 전장 중쇄 및 적어도 2개의 전장 경쇄로 구성된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (본원에서 "mAb"로도 지칭됨), 적어도 2개의 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 비인간 항체로부터 생성된 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체를 포괄한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항체"는 그들의 중쇄 불변 도메인의 동일성을 기반으로 하여 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 5가지 주요 면역글로불린 부류 중 임의의 것일 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 그의 하위 부류 (이소타입) (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2). 상이한 부류의 면역글로불린은 널리 공지된 상이한 서브유닛 구조 및 3차원 형태를 갖는다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭할 때 사용된다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]을 참조한다. CDR의 항원 상호작용 잔기 또한 항원-항체 복합체의 결정학 연구에 의해 결정될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 아미노산 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 중합체는 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 중합체는 표지화 성분과의 접합에 의해 변형된다. 관련 기술분야에 공지된 아미노산의 하나 이상의 유사체 뿐만 아니라, 비천연 아미노산을 함유하는 펩티드 또한 정의 내에 포함된다.
용어 "특이적으로 결합한다" (또는 "특이적 결합")는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 부분이 그의 항원 결합 도메인을 통해 항원을 특이적으로 인식하고, 결합이 항원 결합 도메인과 항원 사이의 적어도 일부 상보성을 수반하는 것을 의미한다. 이 정의에 따라, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 관련이 없는 무작위 항원에 결합하는 것보다 더 쉽게 그의 항원 결합 도메인을 통해 항원의 에피토프에 "특이적으로 결합한다"라고 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 표 1에 제공된 VH 및 VL CDR 서열의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 본원에 개시된 FXIa 억제제, 예컨대 비제한적으로 화학식 (I)의 FXIa 억제제에 특이적으로 결합하고, VH 및 VL CDR을 포함하며, 각각의 CDR이 독립적으로 표 1에 개시된 상응하는 CDR로부터 4개 이하의 (즉, 0, 1, 2, 3 또는 4개의) 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 표 2에 제공된 VH 및 VL 아미노산 서열의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 또는 항체 단편은 표 3에 제공된 부분 중쇄 아미노산 서열 및 전장 경쇄 아미노산 서열의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 또는 항체 단편은 표 4에 제공된 탠덤 부분 중쇄 아미노산 서열 및 전장 경쇄 아미노산 서열의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 개별 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 가변 경쇄 및 가변 중쇄 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 1개의 가변 경쇄과 쌍을 형성한 1개의 가변 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 1개의 가변 경쇄과 각각 쌍을 형성한 1개 초과의 가변 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 1개의 가변 경쇄과 각각 쌍을 형성한 2개의 가변 중쇄를 포함한다.
본 발명은 또한 표 2에 개시된 VH 및 VL 서열과 적어도 약 80%, 85%, 89%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 또한 포괄한다.
본 발명은 또한 본원에서 표 3에 개시된 부분 중쇄 아미노산 서열 및 전장 경쇄 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 89%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 부분 중쇄 아미노산 서열 및 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포괄한다. 본 발명은 또한 표 3의 전장 경쇄 중 어느 하나와 조합된 표 3의 중쇄의 N-말단 부분 중 어느 하나를 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나 또는 그것으로 이루어진 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항체 Fab 단편을 포괄한다. 본 발명은 또한 표 3의 중쇄의 N-말단 부분 및 표 3의 전장 경쇄의 지정된 쌍 중 어느 하나를 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나 또는 그것으로 이루어진 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항체 Fab 단편을 포괄한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 106의 서열 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하거나, 그것으로 본질적으로 이루어지거나 또는 그것으로 이루어진 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항체 Fab 단편을 포괄한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 106의 서열 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항체 Fab 단편을 포괄한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 106의 서열 및 서열식별번호: 164의 서열로 본질적으로 이루어진 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항체 Fab 단편을 포괄한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 106의 서열 및 서열식별번호: 164의 서열로 이루어진 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항체 Fab 단편을 포괄한다.
본 발명은 또한 본원에서 표 4에 개시된 부분 중쇄 아미노산 서열 및 전장 경쇄 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 89%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 탠덤 부분 중쇄 아미노산 서열 및 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포괄한다.
"동일성" 자체는 관련 기술분야에서 인식되는 의미를 가지며, 공개된 기술을 이용하여 게산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, (1988); BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, (1993); COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, (1994); SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, (1987); and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, (1991)]을 참조한다. 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 동일성을 측정하기 위한 수많은 방법이 존재하지만, 용어 "동일성"은 숙련된 기술자에게 널리 공지되어 있다. (Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988).) 두 서열 사이의 동일성 또는 유사성을 측정하기 위해 일반적으로 이용되는 방법에는 문헌 ["Guide to Huge Computers," Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, (1994), 및 Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988)]에 개시된 것들이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 정렬시키는 방법은 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990), 베스트핏(Bestfit) 프로그램 (유닉스(Unix)에 대한 위스콘신(Wisconsin) 서열 분석 패키지, 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, 미국 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크) ([Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482 489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘 사용)을 비롯한 컴퓨터 프로그램에 코드화되어 있다.
참조 뉴클레오티드 서열과 각각 적어도 예를 들어 95% "동일한" 폴리뉴클레오티드란, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개 뉴클레오티드당 5개 이하의 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일한 것으로 의도된다. 예를 들어, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 참조 서열 내의 뉴클레오티드의 5% 이하가 결실되거나 또는 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열 내의 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 수많은 뉴클레오티드가 참조 서열에 삽입될 수 있다.
실질적인 문제로서, 임의의 특정한 핵산 분자가 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 89%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한지 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 글로벌 서열 정렬로도 지칭되는, 쿼리 서열과 참조 서열 사이의 최상의 전체 매칭을 결정하는 1가지 방법은 문헌 [Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990))]의 알고리즘을 기반으로 하는 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 통상적인 뉴클레오티드 서열 정렬에서, 쿼리 및 참조 서열은 둘 다 DNA 서열이지만; U를 T로 변환하여 RNA 서열을 비교할 수 있다. 글로벌 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성으로 보고된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 퍼센트 동일성을 계산하기 위해 DNA 서열의 FASTDB 정렬에서 사용되는 파라미터는 다음과 같다: 매트릭스=단일, k-투플=4, 미스매치 패널티=1, 결합 패널티=30, 무작위화 그룹 길이=0, 컷오프 점수=1, 갭 패널티=5, 갭 크기 패널티=0.05, 윈도우 크기=500 또는 대상 뉴클레오티드 서열의 길이 (둘 중 더 짧은 것).
참조 서열이 예를 들어 내부 결실 때문이 아니라 5' 또는 3' 결실 때문에 쿼리 서열보다 짧은 경우에는, 결과에 대해 수동 수정이 이루어져야 한다. 이는 FASTDB 프로그램이 퍼센트 동일성을 계산할 때 참조 서열의 5' 및 3' 말단절단을 고려하지 않기 때문이다. 쿼리 서열에 비해 5' 또는 3' 말단에서 말단절단된 참조 서열의 경우, 퍼센트 동일성은 매칭/정렬되지 않은 참조 서열의 5' 및 3'인 쿼리 서열의 염기 수를 쿼리 서열의 총 염기의 퍼센트로서 계산함으로써 수정된다. 이어서, 이 백분율은 예를 들어 지정된 파라미터를 사용하여 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성로부터 차감되어, 최종 퍼센트 동일성 점수에 도달한다. 이 수정된 점수가 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. FASTDB 정렬에 의해 표시되는, 쿼리 서열과 매칭/정렬되지 않은 참조 서열의 5' 및 3' 염기 외부의 염기만이 퍼센트 동일성 점수를 수동으로 조정하는 목적을 위해 계산된다.
예를 들어, 90개 염기 참조 서열을 100개 염기 쿼리 서열에 대해 정렬시켜 퍼센트 동일성을 결정한다. 참조 서열의 5' 말단에서 결실이 발생하므로, FASTDB 정렬은 5' 말단에서 처음 10개 염기의 매칭/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 형성하지 않은 염기는 서열의 10% (매칭되지 않은 5' 및 3' 말단의 염기 수/쿼리 서열의 총 염기 수)이므로, FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성 점수로부터 10%가 차감된다. 나머지 90개의 염기는 완벽하게 매칭되었으므로, 최종 퍼센트 동일성은 90%가 된다. 또 다른 예에서, 90개 염기 참조 서열을 100개 염기 쿼리 서열과 비교한다. 이번에는 결실이 내부 결실이어서, 참조 서열의 5' 또는 3' 상에 쿼리와 매칭/정렬되지 않은 염기가 없다. 이 경우에는, FASTDB에 의해 계산된 퍼센트 동일성이 수동으로 수정되지 않는다. 다시 한 번, 쿼리 서열과 매칭/정렬되지 않은 참조 서열의 5' 및 3' 염기만이 수동으로 수정된다.
본 발명의 쿼리 아미노산 서열과 적어도 예를 들어 95% "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란, 대상 폴리펩티드 서열이 쿼리 아미노산 서열의 각각의 100개 아미노산당 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있는 것을 제외하고, 대상 폴리펩티드의 아미노산 서열이 쿼리 서열과 동일한 것으로 의도된다. 달리 말하면, 쿼리 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 참조 서열 내의 아미노산 잔기의 5% 이하가 결실되거나 또는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 참조 서열의 이들 변경은 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 또는 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 발생할 수 있으며, 이는 참조 서열의 잔기 사이에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속 그룹으로 산재될 수 있다.
실질적인 문제로, 임의의 특정한 폴리펩티드가 예를 들어 임의의 표 1-4에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 89%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한지 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 글로벌 서열 정렬로도 지칭되는, 쿼리 서열 (본 발명의 서열)과 참조 서열 사이의 최상의 전체 매칭을 결정하는 바람직한 방법은 상기 언급된 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 쿼리 및 참조 서열 둘 다 아미노산 서열이다. 상기 글로벌 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 퍼센트 동일성을 계산하기 위해 아미노산 서열의 FASTDB 정렬에서 사용되는 파라미터는 다음과 같다: 매트릭스=PAM 0, k-투플=2, 미스매치 패널티=1, 결합 패널티=20, 무작위화 그룹 길이=0, 컷오프 점수=1, 윈도우 크기=서열 길이, 갭 패널티=5, 갭 크기 패널티=0.05, 윈도우 크기=500 또는 대상 아미노산 서열의 길이(둘 중 더 짧은 것).
참조 서열이 예를 들어 내부 결실 때문이 아니라 N- 또는 C-말단 결실 때문에 쿼리 서열보다 짧은 경우에는, 결과에 대해 수동 수정이 이루어져야 한다. 이는 FASTDB 프로그램이 전체 퍼센트 동일성을 계산할 때 참조 서열의 N- 및 C-말단의 말단절단을 고려하지 않기 때문이다. 쿼리 서열에 비해 N- 및 C-말단에서 말단절단된 참조 서열의 경우, 퍼센트 동일성은 상응하는 대상 잔기와 매칭/정렬되지 않은 참조 서열의 N- 및 C-말단인 쿼리 서열의 잔기 수를 쿼리 서열의 총 잔기의 퍼센트로서 계산함으로써 수정된다. 잔기가 매칭/정렬되었는지 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이어서, 이 백분율은 지정된 파라미터를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성로부터 차감되어, 최종 퍼센트 동일성 점수에 도달한다. 이 최종 퍼센트 동일성 점수가 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 쿼리 서열과 매칭/정렬되지 않은 참조 서열의 N- 및 C-말단에 대한 잔기만이 퍼센트 동일성 점수를 수동으로 조정하는 목적을 위해 고려된다. 이는 참조 서열의 가장 먼 N- 및 C-말단 잔기 외부의 쿼리 잔기 위치만이다.
예를 들어, 90개 아미노산 잔기 참조 서열을 100개 잔기 쿼리 서열에 대해 정렬시켜 퍼센트 동일성을 결정한다. 참조 서열의 N-말단에서 결실이 발생하므로, FASTDB 정렬은 N-말단에서 처음 10개 잔기의 매칭/정렬을 나타내지 않는다. 10개의 쌍을 형성하지 않은 잔기는 서열의 10% (매칭되지 않은 N- 및 C-말단의 잔기 수/쿼리 서열의 총 잔기 수)이므로, FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성 점수로부터 10%가 차감된다. 나머지 90개의 잔기는 완벽하게 매칭되었으므로, 최종 퍼센트 동일성은 90%가 된다. 또 다른 예에서, 90개 잔기 참조 서열을 100개 잔기 쿼리 서열과 비교한다. 이번에는 결실이 내부 결실이어서, 참조 서열의 N- 또는 C-말단에 쿼리와 매칭/정렬되지 않은 잔기가 없다. 이 경우에는, FASTDB에 의해 계산된 퍼센트 동일성이 수동으로 수정되지 않는다. 다시 한 번, FASTDB 정렬에 표시되는, 쿼리 서열과 매칭/정렬되지 않은 참조 서열의 N- 및 C-말단 외부의 잔기 위치만이 수동으로 수정된다.
개시된 퍼센트 동일성의 범위 내에서, 본 발명은 또한 본 발명의 개시된 폴리펩티드의 치환 변이체에 관한 것이다. 치환 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되어 대안적인 잔기로 대체된 이들 폴리펩티드를 포함한다. 한 측면에서, 상기 개시된 퍼센트 동일성이 확인된 특정 서열의 전체 서열에 관한 것인 반면에, 일정하게 유지되고 변형되지 않는 아미노산 잔기는 CDR의 것들, 및 프레임워크가 변형되는 아미노산 잔기일 것이다. 예를 들어, 한 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편이 서열식별번호: 64의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 VH를 포함할 때, VH의 CDR 영역은 일정하게 유지되고, 프레임워크 영역은 가변적인 것을 허용하되, 단, 서열식별번호: 64의 전체 백분율 동일성은 실시양태의 범위 내에 속한다. 한 측면에서, 변형은 본질적으로 보존적인 치환이지만; 본 발명은 또한 보존적이지 않은 치환을 포괄한다. 본 발명의 목적을 위한 보존적 치환은 하기 표 5-7에 제시된 바와 같이 정의될 수 있다. 아미노산은 물리적 성질, 및 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 유사한 성질을 갖는 또 다른 아미노산에 대한 하나의 아미노산 치환으로 관련 기술분야에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 하기에 제시된다.
표 5: 보존적 치환
대안적으로, 보존적 아미노산은 하기 제시된 바와 같이 문헌 [Lehninger (1975) Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, pp. 71-77]에 기재된 바와 같이 분류될 수 있다.
표 6: 보존적 치환
여전히 다른 대안으로, 예시적인 보존적 치환은 하기에 제시된다.
표 7: 보존적 치환
본 발명의 항체 또는 항체 단편의 일부 실시양태에서, CH1 도메인은 하기 아미노산 서열을 갖는 부분 중쇄 불변 영역을 포함한다: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (서열식별번호: 202). 본 발명은 또한 서열식별번호: 202의 CH1 도메인과 적어도 약 80%, 85%, 89%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CH1 도메인을 포함하는 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 포괄한다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 일부 실시양태에서, CH1 도메인은 하기 아미노산 서열을 갖는 부분 중쇄 불변 영역을 포함한다: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH (서열식별번호: 203). 본 발명은 또한 서열식별번호: 203의 CH1 도메인과 적어도 약 80%, 85%, 89%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CH1 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포괄한다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편의 일부 실시양태에서, CL 도메인은 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역을 포함한다: RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 204). 본 발명은 또한 서열식별번호: 204의 CH1 도메인과 적어도 약 80%, 85%, 89%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CL 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포괄한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 중쇄의 개별 N-말단 부분 및 전장 경쇄 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 본원에 기재된 중쇄의 N-말단 부분 및 전장 경쇄 서열 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 중쇄의 1개의 N-말단 부분을 포함하며, 본원에 기재된 1개의 전장 경쇄와 쌍을 형성한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 중쇄의 1개 초과의 N-말단 부분을 포함하며, 각각 본원에 기재된 1개의 전장 경쇄와 쌍을 형성한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 중쇄의 2개의 N-말단 부분을 포함하며, 각각 본원에 기재된 1개의 전장 경쇄와 쌍을 형성한다. 특정 실시양태에서, 중쇄의 2개의 N-말단 부분은 링커를 통해 연결된다.
표 4는 본 발명의 예시적인 탠덤 Fab의 중쇄 및 경쇄에 대한 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 탠덤 Fab의 중쇄는 링커를 통해 연결된 항체의 중쇄의 1개 또는 2개의 N-말단 부분을 포함하고, 탠덤 Fab의 경쇄는 항체의 전장 경쇄 (VL-CL)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탠덤 Fab의 중쇄는 VH-CH1-링커-CH1-VH 또는 VH-CH1-링커-VH-CH1로 표현될 수 있다.
본 발명에 포함되는 링커는 다양한 구조의 임의의 적합한 분자일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드 링커이다. 폴리펩티드 링커는 다양한 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 약 20개 이하의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다. 예시적인 폴리펩티드 링커 서열은 표 8에 제공되고, 표 4에서 이중 밑줄 표시된 부분이다.
표 8: 예시적인 링커 서열
표 9: mAb 서열
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 201의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 펩티드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 VH 및 적어도 하나의 VL을 포함하는 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 VH는 서열식별번호: 1-12를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 상보성-결정 영역 1 (VH-CDR1); 서열식별번호: 13-22를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 또는 서열식별번호: 23-28을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 VL은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 서열식별번호: 29-37을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; 서열식별번호: 38-43을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 또는 서열식별번호: 44-51을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 그의 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3을 포함하다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 서열식별번호: 52-83을 포함하는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 VH; 및 서열식별번호: 84-99를 포함하는 군으로부터 선택된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 표 2에 개시된 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역은 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체 서열을 포괄한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 탠덤 Fab는 표 4의 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 및 99% 동일한 서열을 포함한다.
본 발명은 본원에 제공된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 부분적으로 또는 전체적으로 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포괄한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 표 1에 제공된 CDR 서열 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 표 2에 제공된 VH 또는 VL 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 표 3에 제공된 중쇄의 N-말단 부분 또는 전장 경쇄 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 표 4에 제공된 탠덤 Fab 중쇄 및 경쇄 서열 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 본 발명은 본원에 개시된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이체를 추가로 제공한다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비코딩 영역, 또는 이들 둘 다에서 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 치환, 부가 또는 결실을 생성하는 변경을 함유하지만, 코딩된 폴리펩티드의 성질 또는 활성을 변경시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 유전자 코드의 축퇴로 인한 침묵 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 예를 들어 특정한 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해 다양한 이유로 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현 및 분비에 도움이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 동일한 리딩 프레임에서 융합된 성숙한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 성숙한 폴리펩티드는 본원에 개시된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 기능하는 리더 폴리펩티드 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프리단백질이며, 숙주 세포에 의해 절단된 리더 서열을 가져서 폴리펩티드의 성숙한 형태를 형성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 성숙한 단백질에 추가의 5' 아미노산 잔기를 더한 프로단백질을 코딩할 수 있다. 프로서열을 갖는 성숙한 폴리펩티드는 프로단백질이며, 단백질의 비활성 형태이다. 프로서열이 절단되면, 활성의 성숙한 단백질이 남는다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 코딩된 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 동일한 리딩 프레임에서 융합된 성숙한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 벡터를 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 서열을 전달하고 임의적으로 발현할 수 있는 구축물을 지칭한다. 벡터의 예에는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵생물 세포, 예컨대 생산자 세포가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 본원에 제공된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 단리된 세포이다. 일부 실시양태에서, 단리된 숙주 세포는 본원에 제공된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 생성한다. 적합한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵생물 세포가 포함된다. 원핵생물에는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실루스가 포함된다. 고등 진핵생물 세포에는 하기 기재된 포유동물 기원의 확립된 세포주가 포함된다. 무세포 번역 시스템 또한 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주에서 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양물 시스템 또한 유리하게는 재조합 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고, 적절하게 변형되고, 완벽하게 기능하기 때문에, 포유동물 세포에서 이러한 단백질의 발현이 수행될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 원숭이 신장의 COS-7 세포주, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), HeLa, 및 BHK 세포주가 포함된다. 또한, 곤충 세포에서 이종 단백질의 생성을 위한 바쿨로바이러스 시스템은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생성된 본 발명의 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 이러한 표준 방법에는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술이 포함된다. 친화도 태그, 예컨대 헥사히스티딘 (서열식별번호: 221), 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 단백질에 부착하여, 적절한 친화도 칼럼을 통과시킴으로써 용이하게 정제할 수 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질 분해, 핵 자기 공명, 질량 분광법 및 x-선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특징분석될 수 있다. 항체 및 다른 단백질을 정제하는 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 본원에서 상기 제공된 숙주 세포를 숙주 세포가 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 생성하도록 단백질 생성을 촉진시키는 배양 조건 하에 배양하는 것; 및 (b) 배양된 세포로부터 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 단리하는 것을 포함한다. 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 항원 결합 펩티드의 제조 방법을 이용하여 본 발명의 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 검출 시약으로서사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 검출가능하게 표지된다. 용어 "표지"는 본원에서 사용될 때 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편에 직접적으로 또는 간접적으로 접합하는 검출가능한 화합물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출가능하거나 (예를 들어 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 기질의 화학적 변경을 촉매할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표지는 면역형광 표지, 화학발광 표지, 인광 표지, 효소 표지, 방사성 표지, 아비딘/비오틴, 콜로이드성 금 입자, 착색된 입자, 및 자성 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 시험관내에서 또는 생체내에서 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물과 결합된 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 결합된 복합체는 면역복합체이다. 일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 수많은 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출은 면역학적 검정, 또는 면역검정에 의해 수행된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 면역학적 검정은 시험관내에서 또는 생체내에서 항체-항원 결합의 특이성을 이용하는 임의의 검정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 표적 분자의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 검정이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 분자의 양 또는 수준을 측정하기 위해 검정이 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 시험관내에서 또는 생체내에서 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물과 함께 형성된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 면역복합체이다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 자체이다. 일부 예시적인 실시양태에서, 면역학적 검정에는 방사성 면역검정, 면역조직화학, 화학발광 면역검정 (CLIA), 효소 면역검정 (EIA) 또는 효소-결합 면역 흡착 검정 (ELISA), 웨스턴 블롯, 카운팅 면역검정, 유세포 분석, 형광 면역검정, 및 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 생물학적 샘플은 대상체로부터 유래된 임의의 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 소변, 대변, 타액, 전혈, 혈장, 장기 조직, 모발, 피부, 세포, 또는 세포 배양물이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 액체 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 고정제에 의해 고정될 수 있다. 예를 들어, 알데히드 고정제, 예컨대 포르말린 (포름알데히드) 및 글루타르알데히드가 전형적으로 사용된다.
본 발명은 FXIa 억제제, 또는 FXIa 및 혈장 칼리크레인의 이중 억제제의 항혈전 효과의 감소를 필요로 하는 대상체에서 FXIa 억제제, 또는 FXIa 및 혈장 칼리크레인의 이중 억제제의 항혈전 효과를 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 FXIa 억제제의 항혈전 효과를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, FXIa 억제제는 화학식 (I) 또는 II의 화합물이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 본원에 제공된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 시험관내에서 또는 생체내에서 높은 친화도로 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물에 결합할 수 있고, 그의 항혈전 효과를 역전시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물에 대한 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 결합은 시험관내에서 또는 생체내에서 그의 항혈전 효과를 중화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드는 FXIa 억제제, 예를 들어, 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물에 결합하여, FXIa 억제제가 FXIa에 결합하는 것을 방지한다.
용어 "대상체"는 인간, 비인간 영장류를 비롯하여 이로 제한되지 않는 임의의 동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 특정한 치료의 수용자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 본원에 제공된 치료를 필요로 하는 인간 환자이다. 일부 실시양태에서, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"치료하는", "치료" 또는 "치료하기 위한"과 같은 용어는 상호교환적으로 사용되고, 병리학적 상태를 치유하고, 늦추고, 그의 증상을 감소시키거나 또는 줄이고, 그의 효과를 역전시키거나 또는 중화시키고/거나, 그의 진행을 멈추게 하는 치료 조치를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 치료는 본 발명의 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편 중 적어도 하나를 제공하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 용어 "예방하다" 또는 "위험을 감소시키다"는 표적 병리학적 상태를 예방하고/거나 그의 발달을 늦추거나, 또는 치료를 제공받고 있지 않은 개체와 비교하여 대상체가 비정상적인 상태를 획득할 위험을 줄이는 예방 또는 방지 조치를 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 상태 (예컨대 혈전증)를 갖고 있는 대상체, 상태를 갖기 쉬운 대상체, 및 상태가 예방되어야 하는 개체가 포함된다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 치료 조성물 및/또는 예방 조성물을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 치료 유효 용량, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 제약상 허용가능한 부형제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일반적인 부형제에는 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 붕해제, 활택제, 윤활제, 흡수제, 비히클, 감미제, 향료, 착색제, 착취제, 염 (본 발명의 물질 자체는 제약상 허용가능한 염의 형태로 제공될 수 있음), 완충제, 코팅제, 및 항산화제가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 예시적인 부형제에는 식염수, 완충된 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 수크로스, 소르비톨 및 이들의 임의의 조합이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 제약상 허용가능한 부형제는 비활성 성분이다. 그러나, 제약상 허용가능한 부형제가 때때로 제약 조성물의 제조, 품질, 안전성 또는 효능에 영향을 미칠 수 있는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 또한 본 발명의 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편 외에도 치료 활성 작용제를 함유할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 단일-용량 또는 다중-용량 컨테이너, 예를 들어 밀봉된 앰풀 및 바이알로 제시될 수 있고, 사용하기 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용 물 또는 식염수를 첨가하는 것만을 필요로 하는 냉동 건조된 (동결 건조된) 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
제약 조성물은 용도에 따라 편리하고 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 비경구 경로로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 종양내, 피하, 비강내 또는 피내 경로일 수 있다.
경피 투여에 적합한 제약 조성물은 연장된 기간 동안 수용자의 표피와 긴밀한 접촉을 유지하도록 의도된 별개의 패치로서 제시될 수 있다. 예를 들어, 활성 성분은 일반적으로 문헌 [Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986)]에 기재된 바와 같이 이온 삼투압에 의해 패치로부터 전달될 수 있다.
담체가 고체인 비강 투여에 적합한 제약 조성물에는 예를 들어 20 내지 500 마이크로미터 범위의 입자 크기를 갖는 거친 분말이 포함되며, 이는 코로 들이쉬는 방식으로, 즉, 코 가까이에 유지되는 분말 컨테이너로부터 비강을 통한 신속한 흡입에 의해 투여된다. 담체가 액체인 비강 스프레이 또는 비강 점적제로서 투여하기에 적합한 조성물에는 활성 성분의 수성 또는 유성 용액이 포함된다.
비경구 투여에 적합한 제약 조성물에는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제형이 의도된 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함될 수 있다. 주사가능한 용액을 위해 사용될 수 있는 부형제에는 예를 들어 물, 알콜, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일이 포함된다.
용어 "유효 용량", "치료 유효 용량" 및 "제약상 유효 용량"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 생리학적 효과를 생성하는데 충분한 용량을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 그를 필요로 하는 대상체에서 본원에 개시된 화합물의 항혈전 효과를 감소시키거나 또는 중화시키는데 효과적인 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 하나의 제약상 유효 용량의 투여는 출혈이 심한 대상체에서 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 항혈전 효과를 즉시 역전시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 하나의 제약상 유효 용량의 투여는 제한된 작용 기간을 갖는다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 단일 제약상 유효 용량은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 항혈전 효과를 역전시키는데 충분히 긴 작용 기간을 갖는다. 한편, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 단일 제약상 유효 용량은 단일 제약상 유효 용량의 투여 직후에 항혈전 요법의 재개를 가능하게 하고, 혈전색전성 사건의 위험 증가 기간을 최소화시키는데 충분히 짧은 작용 지속기간을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제약상 유효 용량은 명시된 목적과 관련하여 경험적으로 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 화학식 (II)의 화합물의 용량은 약 25 밀리그램 (mg) quaque die (q.d., 또는 1일 1회) 내지 약 375 mg bis in die (b.i.d., 또는 1일 2회)의 범위이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 25 mg q.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 50 mg q.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 75 mg q.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 100 mg q.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 125 mg q.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 150 mg q.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 175 mg q.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 200 mg q.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 375 mg q.d이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 25 mg b.i.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 50 mg b.i.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 75 mg b.i.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 100 mg b.i.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 125 mg b.i.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 150 mg b.i.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 175 mg b.i.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 200 mg b.i.d이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 약 375 mg b.i.d이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 주로 이전에 투여된 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 용량과 관련하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 제약상 유효 용량은 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 이전에 대상체에게 투여된 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 용량에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약상 유효 용량은 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 대상체에게 투여된 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 용량에 대해 적어도 약 2:1 내지 약 10:1 몰비로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제약상 유효 용량은 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 이전에 대상체에게 투여된 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 용량에 대해 적어도 약 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 또는 100:1 몰비로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약상 유효 용량은 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 대상체에서 존재하는 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 양에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약상 유효 용량은 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 대상체에서 존재하는 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 양에 대해 적어도 약 2:1 내지 약 10:1 몰비로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약상 유효 용량은 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편을 대상체에서 존재하는 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 양에 대해 적어도 약 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 또는 100:1 몰비로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 제약상 유효 용량은 질량비로 계산된다. 예를 들어, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 분자량 (MW)은 화학식 (II)의 화합물의 MW의 약 75배일 수 있다. 이 예에서, 약 100 mg의 화학식 (II)의 화합물에 대해, 등몰의 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 약 7.5 그램이다. 따라서, 관련 기술분야의 기술자는 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편 대 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 질량비를 용이하게 계산할 수 있는데, 그들의 질량비가 본 발명에 따라 용이하게 이용가능하기 때문이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 용량은 임상 연구에서 결정될 것이다. 이들 연구 전에, (1) 인간 약동학 및 약력학 정보 (1상 연구로부터), (2) 결합 동역학 및 (3) 예측된 인간 PK 파라미터를 통합하는 컴퓨터 모델링 및 시뮬레이션이 수행된다.
본 발명의 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여와 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여 직후에 투여된다. 예시적인 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여를 시작한지 약 30분 후에 투여된다. 일부 예시적인 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여가 종료된지 약 20분 후에 투여된다. 그러나, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편, 및 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여는 관련 기술분야의 기술자에 의해 적절하다고 고려되는 임의의 순서로 동시에 또는 연속으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 숙련가가 적합하다고 고려하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 정맥내로, 근육내로 또는 피하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 1일 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 1일 1회 초과로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 약 10분의 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 약 10분 미만의 기간에 걸쳐 투여된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편은 약 10 분 초과의 기간에 걸쳐 투여된다.
본 발명은 생물학적 샘플에서 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 수준을 검출하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 및 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 결합된 복합체의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편과 접촉시킨 다음, 화합물 및 항원 결합 펩티드, 예컨대 비제한적으로 항체 또는 항체 단편의 결합된 복합체의 수준을 검출하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 폭과 범위는 임의의 상기 기재된 예시적인 측면에 의해 제한되지 않아야 하고, 하기 청구항 및 그들의 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용된 참고문헌 (문헌, 특허, 특허 출원 및 웹사이트 포함)의 내용은 참고문헌이 본원에 인용되는 바와 같이 명백히 임의의 목적을 위해 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 인간 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 화합물 A에 대한 인간 모노클로날 항체의 생성 - 항원 및 관련 화합물의 제조
인자 XIa의 특이적 억제제인 화합물 A에 대한 완전 인간 모노클로날 항체는 화합물 A의 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole limpet haemocyanin, KLH) 접합된 버전 (하기 제시됨)에 의해 트랜스제닉 마우스를 면역화시킴으로써 제조되었다.
실시예 1A. 화합물 3의 합성
단계 1: tert-부틸 1-(4-클로로-2-(1-((5R,9S)-21-(디플루오로메틸)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-9-일)-6-옥소-1,6-디히드로피리미딘-4-일)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복실레이트 (화합물 1)의 합성
아세토니트릴 (3.7 mL) 중 tert-부틸 1-(4-클로로-2-(6-히드록시피리미딘-4-일)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복실레이트 (105 mg, 0.28 mmol)의 백색 현탁액을 함유하는 100 mL 플라스크에 HATU (1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트) (117 mg, 0.31 mmol) 및 DBU (1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데스-7-엔) (55.0 μl, 0.37 mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 실온에서 5분 동안 교반하였다. (5R,9S)-9-아미노-21-(디플루오로메틸)-5-메틸-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-4-온 (94 mg, 0.281 mmol)을 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 3시간 동안 교반하고, 이 시점에서 농축 건조시켰다. 잔류물을 1 mL EtOAc에 용해시키고, 40g 이스코(Isco) 칼럼 상에 로딩하였다. 생성물을 35분에 걸쳐 헥산 중 0% 내지 100% EtOAc의 선형 구배로 용리시켰다. 생성물은 100% EtOAc에서 바로 용리되었다. Tert-부틸 1-(4-클로로-2-(1-((5R,9S)-21-(디플루오로메틸)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-9-일)-6-옥소-1,6-디히드로피리미딘-4-일)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복실레이트 (161 mg, 0.233 mmol, 83 % 수율)는 백색 고체로서 단리되었다.
단계 2: 1-(4-클로로-2-(1-((5R,9S)-21-(디플루오로메틸)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-9-일)-6-옥소-1,6-디히드로피리미딘-4-일)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복실산 히드로클로라이드 (화합물 1A)의 합성
Tert-부틸 1-(4-클로로-2-(1-((5R,9S)-21-(디플루오로메틸)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-9-일)-6-옥소-1,6-디히드로피리미딘-4-일)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복실레이트 (161 mg, 0.233 mmol)를 디옥산 중 HCl (3 ml, 12.00 mmol)에 용해시키고, 2시간 동안 교반하였고, 이 시점에서 LCMS에 의해 탈보호가 완료되었다. 반응 혼합물을 농축 건조시키고, 추가로 밤새 진공에서 건조시켰다. 1-(4-클로로-2-(1-((5R,9S)-21-(디플루오로메틸)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-9-일)-6-옥소-1,6-디히드로피리미딘-4-일)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복실산 히드로클로라이드 (150 mg, 0.223 mmol, 96 % 수율)는 옅은 황색 고체로서 단리되었다.
단계 3: 3-(2-(2-(1-(4-클로로-2-(1-((5R,9S)-21-(디플루오로메틸)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-9-일)-6-옥소-1,6-디히드로피리미딘-4-일)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복스아미도)에톡시)에톡시)프로판산 (화합물 1B)의 합성
1-(4-클로로-2-(1-((5R,9S)-21-(디플루오로메틸)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-9-일)-6-옥소-1,6-디히드로피리미딘-4-일)페닐)-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복실산 히드로클로라이드 (40 mg, 0.063 mmol), tert-부틸 3-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)프로파노에이트 (14.67 mg, 0.063 mmol) 및 트리에틸아민 (8.77 μl, 0.063 mmol)을 DMF (N,N-디메틸포름아미드) (2 mL)에 용해시켰다. BOP (벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트) (27.8 mg, 0.063 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 잔류물을 농축 건조시키고, 후속적으로 CH2Cl2 (4 mL) 및 TFA (트리플루오로아세트산) (2 mL)로 희석하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 다음, 건조 잔류물로 농축시켰다.
화합물 1의 정제는 예비 HPLC에 의해 수행되었다.
예비 HPLC - 칼럼 = 선파이어(Sunfire) 예비 C18 OBD 5 마이크로미터 (30 x 100 mm)
용매 A = 10% MeOH, 90% 물, 10 mM 아세트산암모늄
용매 B = 90% MeOH, 10% 물, 10 mM 아세트산암모늄
25% B 내지 100% B의 선형 구배
실시예 1B. 화합물 2 및 3의 합성
3-(2-(2-(2-((5R,9S)-9-(4-(5-클로로-2-(4-클로로-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)-6-옥소피리미딘-1(6H)-일)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(3,4)-피라졸아시클로노나판-21-일)에톡시)에톡시)에톡시)프로판산 (화합물 2) 및 3-(2-(2-(2-((5R,9S)-9-(4-(5-클로로-2-(4-클로로-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)-6-옥소피리미딘-1(6H)-일)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-21-일)에톡시)에톡시)에톡시)프로판산 (화합물 3)의 합성
(5R,9S)-9-(4-(5-클로로-2-(4-클로로-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)-6-옥소피리미딘-1(6H)-일)-5-메틸-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(5,4)-피라졸아시클로노나판-4-온 (화합물 4) (70 mg, 0.121 mmol), tert-부틸 3-(2-(2-(2-브로모에톡시)에톡시)에톡시)프로파노에이트 (41.4 mg, 0.121 mmol), 및 탄산세슘 (39.6 mg, 0.121 mmol)을 DMF (N,N-디메틸포름아미드) (3 mL) 중에서 1시간 동안 60℃로 가열한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 여과한 다음, 농축 건조시켰다. 잔기를 CH2Cl2 (4 mL) 및 TFA (2 mL)로 희석한 다음, 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 생성된 화합물 2 및 화합물 3의 정제는 예비 HPLC에 의해 수행되었다.
예비 HPLC - 칼럼 = 선파이어 예비 C18 OBD 5 마이크로미터 (30 x 100 mm)
용매 A = 10% MeOH, 90% 물, 10 mM 아세트산암모늄
용매 B = 90% MeOH, 10% 물, 10 mM 아세트산암모늄
25% B 내지 100% B의 선형 구배
화합물 2 (40 mg, 0.051 mmol, 41.8 % 수율) 및 화합물 3 (15 mg, 0.019 mmol, 15.51 % 수율)은 백색 고체로서 단리되었다.
면역화 및 ELISA 스크리닝을 위해 화합물 2, 화합물 3 및 화합물 1을 BSA 및 KLH에 접합시켰다.
KLH에 대한 접합 : 화합물 1, 2 또는 3의 2mg 샘플을 90μL의 DMSO에 이어서 390μL의 MES 완충제로 용해시키고, 볼텍싱에 의해 혼합하였다. 이어서, 200μL의 KLH (10mg/mL 스톡)를 혼합물에 첨가하였다. 최종적으로 50μL의 EDC (20mg/mL 스톡)를 첨가하였다. 샘플을 어두운 곳에서 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한 다음, 5L의 1xDPBS (론자(Lonza), cat# 17-512Q)에 대해 투석하였다.
BSA 접합 : 화합물 (화합물 2, 화합물 3, 또는 화합물 1)의 2mg 샘플을 200μL의 DMSO에 이어서 200μL의 MES 접합 완충제 (MES pH4.7)로 용해시키고, 볼텍싱에 의해 혼합하였다. 이어서, 400μL의 BSA (5mg/mL 스톡)를 혼합물에 첨가하였다. 최종적으로, 50μL의 EDC (20mg/mL 스톡)를 첨가하였다. (첨가된 비는 10x화합물:1x담체:2x활성화제이었음.) 샘플을 어두운 곳에서 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한 다음, 5L의 1xDPBS (론자, cat# 17-512Q)에 대해 투석하였다.
화합물 5 (화합물 2의 비오틴-표지된 버전)는 하기 구조를 갖는다:
N-(1-((5R,9S)-9-(4-(5-클로로-2-(4-클로로-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)페닐)-6-옥소피리미딘-1(6H)-일)-5-메틸-4-옥소-21H-3-아자-1(4,2)-피리디나-2(3,4)-피라졸아시클로노나판-21-일)-12-옥소-3,6,9-트리옥사-13-아자펜타데칸-15-일)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]아미다졸-4-일)펜탄아미드 (화합물 5)의 합성
화합물 2 (16 mg, 0.02 mmol), N-(2-아미노에틸)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]아미다졸-4-일)펜탄아미드 (5.9 mg, 0.02 mmol), 비오틴 및 트리에틸아민 (2.9 μl, 0.02 mmol)을 DMF (2 mL)에 용해시켰다. BOP (9.1 mg, 0.02 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 예비 HPLC에 의해 정제하였다.
예비 HPLC - 칼럼 = 선파이어 예비 C18 OBD 5 마이크로미터 (30 x 100 mm)
용매 A = 10% MeOH, 90% 물, 10 mM 아세트산암모늄
용매 B = 90% MeOH, 10% 물, 10 mM 아세트산암모늄
25% B 내지 100% B의 선형 구배
화합물 5 (18 mg, 80%)는 백색 고체로서 단리되었다.
실시예 2: 인간 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 화합물 A에 대한 인간 모노클로날 항체의 생성 - 마우스의 면역화
인간 항-화합물 A 항체는 인간 Ig 트랜스제닉 마우스 균주 HCo42:01 KCo5:01 [J/K]의 마우스를 면역화시킴으로써 생성되었다 (Lonberg, Handbook of Experimental Pharmacology 113:49, 1994; Lonberg et al. Nature 368:856, 1994). 면역원은 리비(Ribi) 아주반트 (RA)와 함께 3가지 KLH-화합물 접합된 형태: 화합물 1-KLH, 화합물 2-KLH, 및 화합물 3-KLH의 혼합물이었다. 면역화 프로토콜은 리비 아주반트에서 면역원 혼합물의 발바닥 주사로 구성되었다. 마우스를 총 7회의 주사로 3주 동안 3 내지 5일마다 면역화시키고, 조직 수집 전날에 융합 부스팅 후에 림프절을 수확하였다. 생체내 실험은 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니(Bristol-Myers Squibb Company)의 동물 관리 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 규정에 따라 수행되었다. 3마리의 면역화된 마우스로부터의 림프절을 수확하고, 균질화하고, 풀링하였다. 하이브리도마는 전계-기반 전기융합에 의해 마우스 골수종 융합 파트너 SP2/0-Ag14 (ATCC CRL-1581™)와의 전기융합에 의해 생성되었다. 융합된 세포를 7일 동안 선택적인 HAT 배지에서 다중-웰 플레이트에 플레이팅하고, 후속적으로 항원 결합에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 이들 결과를 기반으로 하여, 융합 6938로부터의 하이브리도마 클론 1H2, 9C8, 24H1, 및 26D5를 추가의 분석, 서브클로닝 및 시퀀싱을 위해 선택하였다. 서브클로닝된 하이브리도마를 정제를 위해 400ml 배양물로 확장시켰다. 분비된 완전 인간 항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 하이브리도마 서브클론 1873.6938.26D5.D12 (본원에서 '26D5'로 지칭됨)로부터 최고 성능의 완전 인간 항체가 궁극적으로 친화도 성숙으로 진행되었다.
실시예 3: 항체의 친화도 성숙
화합물 A에 대한 친화도를 개선시키기 위해 인간 mAb 26D5에 대해 친화도 성숙 캠페인을 수행하였다. 먼저, mAb 26D5 서열을 가장 가까운 인간 생식계열 V 및 J 유전자 서열과 비교하였다 (도 1a-b). 인간에서 면역원성의 위험을 감소시키기 위해, 생식계열과 상이한 프레임워크 위치를 돌연변이시키거나 또는 생식계열 서열로 되돌려서, 인간 mAb 26D5-GV-Q (그의 완전 인간 항체 포맷에서는 본원에서 P1-072226으로도 지칭됨)를 생성하였고, 이는 화합물 A에 대해 유사한 결합을 유지하였다. 이어서, mAb 26D5-GV-Q (P1-072226)는 도 2에 제시된 항체 CDR 위치에서 가능한 모든 단일 아미노산 치환의 상대적인 적합도를 측정하는 돌연변이 스캔을 위한 출발 시점이었다. 심층 돌연변이 스캐닝 접근법은 문헌 [Araya et al., Trends in Biotechnology 29:435, 2001; Forsynth et al., mAbs 5:523, 2013; 및 Wrenbeck et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 45:36, 2017]에 기재되어 있다. 먼저, 도 2에 제시된 CDR 위치에서 NNK 올리고뉴클레오티드를 사용하여 각각의 개별 아미노산 치환을 생성하는 scFv (단일 쇄) 라이브러리를 생성하였다. 단일 돌연변이체의 이 라이브러리를 생성하는데 있어서, 각각 단일 위치에서 NNK 코돈 (여기서, N=A, C, G, T, 및 K=G, T)을 개별적으로 통합한 다중 올리고뉴클레오티드가 설계되었다. 이들 축퇴 코돈의 사용은 NNK 코돈이 통합된 위치에서 20가지 모든 천연 발생 아미노산을 코딩하는 코돈 (플러스 정지 코돈)의 사용을 가능하게 하였다. HCDR1 (AbM 정의가 사용됨)을 제외한 모든 CDR에 대해 카바트 정의가 사용되었고 (Abhinandan and Martin, Mol. Immunol. 45:3832, 2008; Swindells et al., J. Mol. Biol. 429:356, 2017), HCDR2의 위치 60-65는 분석에 포함되지 않았다. 다음으로, mRNA 디스플레이 (Xu et al., Chemistry & Biology 9: 933, 2002; Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297, 1997; Kurz et al., Nucleic Acids Res. 28: E83, 2000)를 이용하여, DNA 라이브러리는 시험관내 전사 및 번역의 단일 라운드를 진행하였고, 그 동안에 코딩 mRNA가 퓨로마이신 연결을 통해 자신의 scFv 단백질 분자에 융합되었다. 선택 동안에, 화합물 5 (화합물 2의 비오틴-표지된 버전)와 결합한 임의의 scFv를 자성 스트렙타비딘 비드에 의해 포획하고, 용리시키고, PCR에 의해 증폭시켰다. 최종적으로, 생성된 초기 DNA 라이브러리 및 용리된 DNA (화합물 5에 결합하는 scFv를 코딩함) 둘 다 차세대 시퀀싱 (NGS)을 이용하여 시퀀싱하였다.
NGS 데이터의 분석을 위해, NGS로부터의 페어드-엔드 정방향 및 역방향 판독 서열을 FLASH를 사용하여 조립하고 (Magoc and Salzberg, Bioinformatics 27:2957, 2011), 성숙한 아미노산의 돌연변이 위치 및 동일성에 따라 비닝하였다. 불량을 품질을 갖는 모든 서열 및 다중 돌연변이 부위를 함유하는 것들은 분석으로부터 제거되었다. 다음으로, 선택 후 집단에서 각각의 서열의 빈도를 출발 집단에서의 빈도로 나누어, 농축비 (ER)를 도출하였다. 달리 말하면, 농축비는 화합물 5-결합된 샘플에서의 특정한 서열 변이체의 카운트를 초기 라이브러리에서의 카운트로 나눈 것이다. 이어서, 이를 모체 26D5-GV-Q mAb의 농축비에 대해 정규화하였다. 이러한 방식으로, 본원에서 논의된 CDR 영역에서 모든 단일 아미노산 치환의 화합물 5 결합 (따라서, 추론에 의해 A)에 대한 효과를 평가하였다. 도 3a는 돌연변이 스캔 데이터 분석을 이용하여 생성된 LCDR1 히트 맵을 제시하고, 단일 아미노산 치환의 서열-활성 관계의 해석을 가능하게 한다. 일반적으로, 이 방법에서의 오차는 대략 2배이다. 따라서, 0.5 내지 2의 농축비 (ER) 값은 중립 치환, 즉, 화합물 5에 대한 결합 성질을 유지하는 치환으로 간주된다. 2 초과의 ER 값은 결합에 대해 유리한 또는 바람직한 것으로 간주되고, 0.5 미만의 ER 값은 결합에 대해 불리한 것으로 간주된다. 도 3b-e는 나머지 CDR에 대한 히트 맵을 제시한다.
NGS 데이터로부터 계산된 농축비를 기반으로 하여, 유리한 아미노산 치환의 단일 및 조합에 대한 가변 영역 유전자를 합성하고, 인간 IgG1f Fc 영역 및 인간 LC 카파 영역 (CK)을 갖는 IgG 발현 벡터로 클로닝하였다. 벡터를 소규모로 (2ml 배양물) Expi293 HEK 세포에 일시적으로 형질감염시키고, 단백질 A 여과기 플레이트를 사용하여 정제하였다. SPR (표면 플라즈몬 공명) 및 기능적 활성을 이용하여 (하기 데이터 참조) IgG 단백질을 평가하였다. 이 평가에 따라 확인된 관심 항체의 서열이 도 4a-b에 제시된다.
특히, 자손 26D5-295-B08은 3가지 상이한 라이브러리 설계를 이용하여 추가의 친화도 성숙을 위해 선택되었다. 첫 번째 설계의 경우, 제2 돌연변이 스캔을 26D5-295-B08에 대해 수행하여, 도 5에 제시된 잔기를 무작위화하였다. 이 제2 돌연변이 스캔에서, 카바트 및/또는 AbM CDR 정의 외부의 위치는 공결정 구조에서 화합물 A에 대한 그들의 근접성을 기반으로 하여 무작위화되었다. 26D5-295-B08의 돌연변이 스캔으로부터의 히트 맵은 도 6a-f에 제시된다. 이전과 같이, 유리한 아미노산 치환의 단일 및 조합에 대한 가변 영역 유전자를 합성하여, 검정을 위해 IgG1f 발현 벡터에 클로닝하였다. 26D5-295-B08의 돌연변이 스캔으로부터 확인된 관심 MAb에는 다음이 포함되었다: 26D5-75202-343-A09, 26D5-75229-343-A10, 26D5-75203-343-B09, 26D5-75017-343-F04, 및 26D5-75214-343-F06 (서열에 대해서는 표 1-3 참조). 실시예에 개시된 모든 인간 항체는 달리 구체적으로 나타내지 않는다면 IgG1f (예를 들어, 서열식별번호: 200) 및 인간 LC 카파 포맷 (예를 들어, 서열식별번호: 204)이다.
또한, 26D5-295-B08을 기반으로 하는 2가지 복합 라이브러리 (칩 및 도핑)를 구축하여, 관심 위치를 더 완전하게 무작위화하였다 (도 7a-b). 칩 라이브러리는 CDR 및 플랭킹 프레임워크 위치 내에서 모든 아미노산 (시스테인 및 메티오닌은 제외)에 대한 단일 및 이중 치환을 함유하도록 설계되었고, 일부 추가의 변형은 도 7a에 표시된다. 상기 설계는 또한 화학적 책임을 함유하는 서열을 제거하였고, 칩 올리고뉴클레오티드 (트위스트 바이오사이언스(Twist Bioscience))를 통해 합성되었다. 도핑된 라이브러리는 단일 CDR 내에서 2개 초과의 돌연변이에 접근하기 위해 HCDR3 및 주변 프레임워크 잔기에 대한 무작위화에 집중하였다. 이 라이브러리를 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 26D5-295-B08 DNA 서열을 기반으로 하여 무작위화 영역을 "도핑"함으로써 생성되었다. 무작위화 영역에서 각각의 뉴클레오티드에 대해, 올리고는 70%의 26D5-295-B08 DNA 염기, 및 10%의 각각의 다른 염기를 함유하였다. 예를 들어, 26D5-295-B08 DNA가 특정한 위치에서 G를 갖는 경우, 도핑된 올리고는 해당 위치에서 70% G, 10% A, 10% C, 및 10% T를 함유할 것이다. 이는 원래의 모체 서열을 향해 라이브러리를 여전히 편향시키면서 관심 영역의 더 심층의 무작위화를 가능하게 한다. 올리고를 사용하여 별도의 칩 및 도핑 DNA scFv 라이브러리를 생성하였다. 이들 라이브러리는 상기 프로토콜에 따라 mRNA 디스플레이를 이용하여 선택되었지만, 이후 라운드에서 오프-속도를 통합하는 다중 연속 라운드가 있었다. 생성된 집단은 NGS를 사용하여 시퀀싱하고, 데이터를 분석하여, 합성을 위한 가변 영역을 선택하고, 시험을 위해 IgG 발현 벡터에 클로닝하였다. 칩 라이브러리로부터 확인된 관심 MAb에는 다음이 포함된다: 26D5-75592-348-A04, 26D5-75768-348-A10, 26D5-75576-348-B03, 26D5-75746-348-C07, 26D5-75747-348-D07, 및 26D5-75602-348-F04 (서열에 대해서는 표 1-3 참조). MAb 26D5-75616-348-F10은 도핑된 라이브러리로부터 관심 항체로서 확인되었다. 도 8a-b는 mAb 26D5-295-B08의 친화도 성숙으로부터의 관심 서열을 제시한다.
소규모 결과를 확인하기 위해, 관심 항체의 발현 벡터를 340mL 규모로 Expi293 HEK 세포에 일시적으로 형질감염시키고, 패키징된 20mL POROS A 칼럼을 사용하여 정제하고, 아미콘(Amicon) 30K MWCO 여과기를 사용하여 PBS로 완충제 교환하고, 0.2μm PES 여과기 상에서 멸균 여과하고, 분취하고, -80℃에서 보관하였다. 각각의 샘플은 LC/MS에 의해 질량 확인되고, 분석용 SEC에 의해 특징분석되었다.
실시예 4: 발색 효소 검정에 의한 mAb의 특징분석
mAb가 화합물 A의 존재 하에 FXIa 효소 활성을 보존하는 능력은 개선된 친화도를 갖는 항체에 대한 스크리닝 검정으로서 이용되었다. 검정은 인자 XIa 효소에 대한 기질로서 크로모제닉스(Chromogenix)로부터의 S-2366 발색 펩티드를 사용하였다. 각각의 시험한 mAb를 100 nM에서 1.5 nM로 계열 희석하고, 2.5 nM 화합물 A 또는 대조군 화합물과 함께 10분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 발색성 기질 S-2366을 최종 농도 0.5 mM로 첨가하고, 인간 FXIa 효소 (헤마톨로직 테크놀로지즈, 인크.(Haematologic Techologies, Inc.); HCZIA-0160)를 최종 농도 0.2 nM로 첨가하였다. 2.5 nM의 화합물 A의 농도는 FXIa 활성의 ~90% 억제, 즉, FXIa의 거의 완전한 점유를 생성하였다. 여기에 기재된 검정은 의미있는 동적 범위를 생성하기 위해 구축되었다. 플레이트를 OD 405nm에서 37℃에서 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices) SPECTRAmax 상에서 즉시 판독하여, 기질 가수분해 속도를 측정하였다. 신호는 0% 활성화 (화합물 A를 갖는 FXIa 효소) 및 100% 활성화 (억제제가 없는 FXIa 효소)에 대해 정규화되었다. 화합물 A 유도된 억제의 50% 이상을 역전시킨 항체에 대해 EC50을 결정하였다. 실시예 결과는 도 9에 제시된다.
실시예 5: 재조합 α-화합물 A 항체 Fab 단편의 생성
선택된 항체는 Expi293 발현을 위해 태그 부착되지 않은 항체 Fab 단편으로서 pTT5 벡터에 클로닝되었다. Fab 서열에 대한 서열식별번호를 참조한다. 최적화된 DNA 서열은 포유동물 발현을 위해 진스크립트(GenScript)로부터 제공 받았다. 1L 규모의 발현을 위해, 900 mL의 세포를 3 x 106 세포/mL에서 2L 코닝(Corning) 플라스크에 시딩하였다. 0.25 mg의 각각의 중쇄 및 경쇄 DNA 구축물을 50 mL의 옵티-MEM(Opti-MEM)™에 첨가하였다. 150 mL의 옵티-MEM™ 중 4.1 mL의 엑스피펙타민(ExpiFectamine)™을 5분 동안 실온에서 인큐베이션한 다음, 상기 150 mL 중 50 mL를 DNA/옵티-MEM™ 혼합물에 첨가하고, 20분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이러한 총 100 mL 형질감염 혼합물을 900 mL의 세포에 첨가하고, 37℃ 진탕기 (125 rpm, 공기 중 8% CO2)에 두었다. 생성물은 첫째 날에 2 mM VPA 및 50 ml의 CHO CD 효율적인 피드 B로 공급되었다. 세포 생존력을 시험하고, 생성물을 5일차에 수확하였다. 평균 세포 생존력/세포 밀도는 80%/6 x 106 세포/mL이었다. 생성물을 2,000 rpm에서 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 조건화된 배지 상청액을 0.2 um 여과기를 통해 여과하였다. 30 mL r단백질A(rProteinA) 세파로스 FF 칼럼을 2 칼럼 부피 (CV)의 6M 구아니딘, 2 CV의 0.033M HCl로 세척한 다음, 1x 둘베코(Dulbecco) PBS에서 평형화하였다. 상청액 pH는 >7.0인 것으로 검증되었고, 이어서 r단백질A 세파로스 칼럼 상에 10 mL/min으로 로딩하였다. 프레임워크 단백질A 상호작용을 통한 r단백질A 결합이 친화도 성숙 변이체를 비롯한 1873.6938.26D5.D12의 모든 자손에 대해 관찰되었다. 기준선에 도달할 때까지 칼럼을 1xDPBS로 세척한 다음, 용리되는 동안 단백질이 중화될 수 있도록, 80 mM 아세트산나트륨 (pH 2.8)을 ~20 ml Tris HCl (pH 8.0)로 채워진 컨테이너로 용리시켰다. 이어서, 칼럼을 1xDPBS로 중화시켰다. 용리된 샘플을 <10 mL로 농축시키고, 평형화된 (1xDPBS) S200 26/600 칼럼 상에 2.5 mL/min으로 로딩하엿다. 5 mL 분획을 2.5 mL/min으로 수집하고, 풀링을 위해 SDS-PAGE 및 크로마토그램에 의해 분석하였다. 전형적인 수율은 정제된 항체 Fab 단편의 150-250 mg/L이었다.
실시예 6: 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (비아코어(Biacore)™) 분석에 의한 mAb 및 Fab의 특징분석
하이브리도마 발현된 26D5 모체 mAb (IgG1f 포맷에서 VH 서열식별번호: 83 및 VL 서열식별번호: 98)(P1-072224) 및 친화도 성숙 mAb의 화합물 A에 대한 결합을 단백질 A 포획 방법을 이용하여 SPR (비아코어™)에 의해 조사하였다. 러닝 완충제는 0.05% Tween 20 및 2% DMSO를 갖는 1xPBS (인산염 완충된 식염수, pH 7.4)였다. 결합 실험은 37℃에서 수행되었다. 단백질 A는 고밀도에서 (2000+ RU의 단백질 A) CM5 S-시리즈 센서 칩 (싸이티바(Cytiva), 카탈로그 번호 29149603) 상에 코팅되었다. 단백질 A의 고정은 제조자에 의해 권고되는 표준 아민 커플링 고정 절차를 이용하여 수행되었다. 이어서, 친화도 성숙 항체는 3uL/min의 유속에서 2분 동안 단백질 A 표면 상에서 2ug/mL의 농도로 포획되었다. 이어서, 화합물 A를 100-3 nM 범위의 농도 (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM)에서 (도 10) 및 100-3 nM 범위의 스크리닝 농도 (100, 33, 11 nM)를 위해 2분 동안 100 uL/min의 유속으로 포획된 항체에 걸쳐 주사하고, 적어도 450초 동안 해리될 수 있게 하였다. 10 mM 글리신, pH 1.5의 40초 펄스로 각 주기 후에 칩 표면을 재생시켰다. 단백질 A 표면 단독에 대한 백그라운드 결합을 이용하여 비특이적 결합을 차감하였다. 모든 실험은 비아코어 T200 제어 소프트웨어 v. 2를 사용하여 비아코어 T200 표면 플라즈몬 공명 장비 상에서 작동시켰다. 데이터 분석은 비아코어 T200 평가 소프트웨어 v 3.1을 사용하여 수행되었다. 해리 속도가 비아코어에 의해 측정되기에는 너무 느리기 때문에 순위화에 대해서만 겉보기 친화도를 결정하였다. 실시예 결합 검정 데이터는 도 10에 제시되고, 결합 검정 데이터는 표 10에 보고된다. 표 10에서 mAb의 명칭은 IgG1f 포맷에서 표 3의 상응하는 Fab의 H 및 L 쇄 서열을 갖는 mAb를 지칭한다.
표 10. SPR 데이터
비아코어 단백질 A mAb 포획
화합물 A의 접합된 버전에 대한 첫 번째 라운드 친화도 성숙 항체 Fab 단편의 결합은 화합물 2, 화합물 3 또는 화합물 1에 이전에 접합된 BSA로 코팅된 CM5 S-시리즈 센서 칩 (싸이티바, 카탈로그 번호 29149603)을 사용하여 SPR (비아코어™)에 의해 조사하였다. 고정 수준은 150-250 RU였다. 러닝 완충제는 0.05% Tween 20을 갖는 1xPBS (인산염 완충된 식염수, pH 7.4)였다. 결합 실험은 25℃에서 수행되었다. 200-0.8 nM 농도의 항체 Fab 단편을 30 uL/min의 유속에서 2분 동안 BSA-화합물 코팅된 표면 상에 주사하였다. 이어서, 항체 Fab 단편을 15분 동안 해리시켰다. 10 mM 글리신, pH 2의 1분 펄스, 및 50 mM NaOH의 1분 펄스로 각 주기 후에 칩 표면을 재생시켰다. 모든 실험은 동일한 장비에서 실행되었고, 상기 기재된 바와 같이 동일한 소프트웨어로 분석되었다. 해리 속도가 비아코어에 의해 측정되기에는 너무 느리기 때문에 순위화에 대해서만 겉보기 친화도를 결정하였다. 선택된 mAb에 의한 비교 실험 또한 유사한 방식으로 수행되었다 (도 11 참조). 실시예 결합 검정 데이터는 도 11에 제시되고, 화합물 2-BSA에 대한 결합 검정 데이터는 표 11에 보고된다. 표 11의 Fab 서열은 표 3에 나타내었다.
표 11. SPR 데이터
화합물 A의 접합된 버전에 대한 제1 및 제2 라운드 친화도 성숙 항체 Fab 단편의 결합은 싸이티바 (카탈로그 번호: 28920234)로부터의 비오틴-CAP S-시리즈 센서 칩 및 키트 시약을 이용하여 SPR (비아코어™)에 의해 조사되었다. 비오틴-CAP 칩을 완충제 중에서 밤새 수화시켰다. 물 중 50%에서 비오틴-CAP 시약을 2 uL/min의 유속에서 150초 동안 칩 표면 상에 유동시켰다. 화합물 5 (화합물 2의 비오틴화 버전)는 20초 펄스 동안 10uL/min의 유속에서 0.25ug/mL로 비오틴 CAP 표면 상에 포획되었다. 러닝 완충제는 0.05% Tween 20을 갖는 1xPBS (인산염 완충된 식염수, pH 7.4)였다. 실험은 25℃ 또는 37℃에서 수행되었다. 100-3 nM 농도의 항체 Fab 단편을 30 uL/mni의 유속에서 3분 동안 비오틴-CAP-화합물 5 표면 상에 주사하였다. 항체 Fab 단편을 11.7분 동안 해리시켰다. 250 mM NaOH 중에서 6 M 구아니딘-HCl의 2분 펄스 2회로 각 주기 후에 칩 표면을 재생시켰다. 모든 실험은 동일한 장비에서 실행되었고, 이전에 기재된 것과 동일한 소프트웨어로 분석되었다. 해리 속도가 비아코어에 의해 측정되기에는 너무 느리기 때문에 순위화에 대해서만 겉보기 친화도를 결정하였다. 실시예 결합 검정 데이터는 도 12에 제시되고, 항체 TanFab 단편에 대한 결합 검정 데이터는 표 12에 보고된다. 표 12의 TanFab 서열은 표 4에 나타내었다.
표 12. SPR 데이터
실시예 7: TR-FRET 검정에 의한 mAb 및 Fab의 특징분석
37℃에서 평형에 도달함에 따라, 경쟁적 TR-FRET (시간-분해 형광 공명 에너지 전달) 검정은 화합물 A로부터 α-화합물 A mAb의 해리를 순위화하기 위해 개발되었다. 검정 완충제는 HBS-N (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4; 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)), 0.1% (w/v) BSA (소 혈청 알부민; 시그마(Sigma)), 2% DMSO (디메틸 술폭시드; 시그마)였다. 모든 시약은 검정 완충제 중에서 제조되고, 하기 최종 농도에서 웰당 20 μl의 최종 부피인 백색 384 마이크로플레이트에 동등한 부피로 분배되었다: 4 nM 화합물 5, 화합물 2의 비오틴화 유사체, 인간 α-화합물 A 항체의 100 - 0.1 nM 7-pt 적정, 0.1 nM 유로퓸-표지된 α-마우스 IgG (LANCE Eu-W1024; 퍼킨엘머(PerkinElmer)), 5 nM 스트렙타비딘-D2 (시스바이오(Cisbio)), 및 4 nM mAb 26D5 VH_A10G_Y33A_S53P_M89V_G95A; VK_W32N_H38Q (P1-075621, 마우스 IgG Fc로 포맷된 두 번째 라운드 최적화 모체 26D5-295-B08). 화합물 5 및 α-화합물 A 항체 적정을 먼저 마이크로플레이트에 첨가하고, 37℃, 1000 rpm에서, 1시간 동안 초기 인큐베이션에 적용하여 화합물에 대한 항체 결합을 용이하게 하였다. 초기 인큐베이션 기간 후, 유로퓸 α-마우스 IgG, 스트렙타비딘-D2, 및 26D5-마우스 IgG (P1-075621)를 순차적으로 첨가한 다음, 플레이트를 37℃, 1000 rpm 인큐베이션으로 되돌렸다. 퍼킨 엘머 엔비전(EnVision) 플레이트 판독기를 사용하여 마이크로플레이트를 판독하고, 측정된 FRET 신호는 [665 nm]/[620 nm] * 10,000으로 정의되었다. 마이크로플레이트를 30분째 (T0) 및 24시간 후 (T24) 간격으로 판독하였다. 각각의 항체 적정의 경우, FRET 신호는 α-화합물 A 항체가 없는 웰에 대한 % 억제로 전환되었다: (100 - (([항체 농도]에서 FRET/0 nM에서 FRET) * 100). % 억제 항체 적정을 팁코 스팟파이어(TIBCO Spotfire) (v.7)를 사용하여 플롯팅하고, IC50은 4-파라미터 모델 곡선 대입을 이용하여 결정하였다. 각각의 시점의 IC50 뿐만 아니라 T0에 비한 IC50 곡선 이동을 보고하였다. IC50 곡선 이동은 검정이 평형에 도달함에 따라 비오틴화 화합물로부터 α-화합물 A 항체 해리를 나타내었고, 이는 후속적으로 26D5-마우스 IgG1 (P1-075621) 경쟁자가 결합하여, 검정에서 검출된 FRET 신호를 생성할 수 있게 하였다.
α-화합물 A 26D5 친화도 최적화 스크리닝으로부터 수집된 예시적인 경쟁적 FRET 데이터는 도 13에 제시된다. 3가지 대표적인 인간 항체가 제시된다: 1) 26D5-GVR-Q-FT-Fab-LONG의 IgG1f mAb 포맷; 본원에서 P1-072226으로도 지칭됨 (26D5-GVR-Q-FT HC의 R31이 P1-072226 HC의 S31인 것은 제외함), 상단 패널, 2) 첫 번째 라운드 최적화 자손 26D5-295-B08-Fab-LONG의 IgG1f mAb 포맷 (본원에서 P1-072963으로도 지칭됨), 중간 패널, 및 3) 두 번째 라운드 최적화 자손 26D5-75747-348-D07-Fab-LONG의 IgG1f mAb 포맷 (본원에서 P1-075747로도 지칭됨), 하단 패널. IC50은 각각의 항체 적정 곡선을 따라 별표로 표시된다. T0과 T24 IC50 사이의 차이는 Δ로 정의되고, 값은 각각의 패널에 보고된다. 26D5-GVR-Q-FT-Fab-LONG mAb 모체는 가장 유의한 T0 - T24 IC50 이동, 63 nM을 나타내었다. 화합물 A 해리 속도 (오프-속도)가 후속적인 자손 (P1-072963: 20.5 nM, 이어서 P1-075747: 4.3 nM)에서 친화도 성숙의 연속 라운드를 통해 개선됨에 따라, T0 - T24 IC50 이동이 최소화되었다. mAb 26D5-GVR-Q-FT-Fab-LONG 모체 및 mAb 26D5-295-B08 (P1-072963)에 비해 개선된 37℃ 화합물 A 해리 속도를 갖는 항체를 확인하기 위해, α-화합물 A 항체를 T24 IC50 및 IC50 이동 (Δ)에 의해 순위화되었다.
상기 정의된 경쟁적 TR-FRET 검정을 변형시켜, Fab로 재포맷된 최적화된 26D5 항체 자손을 평가하였다. α-화합물 A 항체 및 Fab 적정 시리즈를 250 - 0.244 nM (11-pt 적정)로 확장시키고, 각각의 농도의 반복을 4회 수집하였다. 검정 인큐베이션을 추가의 48시간 시점을 포함하도록 확장시켜, 평형에 도달하는 것을 보장하고, T48hr IC50 및 IC50 이동을 보고하였다. % 억제 적정을 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) (v.8)에서 플롯팅하고, 4-파라미터 모델에 대입하였다. 모든 다른 실험 설정 조건은 항체 TF-FRET 검정과 달리 동일하였다.
인간 항체와 Fab를 비교하는 친화도-최적화된 α-화합물 A 26D5 자손에 대해 수집된 경쟁적 FRET 데이터는 도 14 및 표 13에 제시된다. 각각의 패널은 단일 α-화합물 A 서열을 나타내고, 항체 (mAb, 실선, 원) 및 Fab (점선, 삼각형) 포맷이 오버레이되었다. 26D5 모체 Fab (Fab 26D5-GV-Q; 본원에서 P1-073708로도 지칭됨) 및 첫 번째 라운드 최적화 자손 Fab 26D5-295-C08 (본원에서 P1-074468-1로도 지칭됨)은 적어도 26 nM의 유의한 T48 IC50 이동을 나타내었다. 두 번째 라운드 친화도 성숙된 최적화된 자손은 항체 및 Fab 포맷 둘 다에서 화합물 A로부터 느린 37℃ 해리를 유지하였고, 이는 최소 T48 IC50 이동을 나타내었다. FRET 데이터는 표 13에 제공된다. 표 13의 mAb/Fab 명칭은 표 1-3의 상응하는 서열을 지칭한다. 표 13에 나열된 모든 mAb는 인간 IgG1f/LC 카파 포맷이었다.
표 13 ("-1", "-2" 등은 달리 동일한 mAb 또는 Fab의 로트 번호를 지칭함)
실시예 8: 겔 여과
0.3mL/min의 유속에서 쇼덱스(Shodex) K403-4F 및 100mM 인산나트륨 150 mM 염화나트륨, pH 7.3의 이동상을 갖는 애질런트(Agilent) 1260 HPLC 시스템을 이용하여, 정제된 Fab의 분취량을 20분의 작동 시간 동안 주사하였다 (20ug). 겔 여과 표준을 통해, 대부분의 Fab가 75% 초과의 회수율을 갖는 적어도 98% 단량체임이 확인되었다.
실시예 9: Fab의 열 안정성 분석
열 안정성 분석은 50 uM 농도의 화합물 A (또는 대조군 화합물)를 갖거나 또는 갖지 않는 20 uM 농도의 Fab를 사용하여 언체인드 랩스(UNchained Labs) UNcle TM/Tagg 분석에 의해 수행되었다. 모세관은 0.5℃/min으로 25 내지 90℃에서 스캔되었다. 또한, 선택 Fab는 맬버른 마이크로칼 브이피-카필러리(Malvern MicroCal VP-Capillary) DSC를 사용하여 시차 주사 열량계 분석에 의해 분석되었다. 샘플을 완충제 일치시키고, 15uM 농도의 화합물 A (또는 대조군 화합물)를 갖거나 또는 갖지 않는 10 uM 농도의 Fab로 로딩하였다. 스캔 온도 범위는 60℃/Hr의 속도에서 15-110℃였다 (여과기 기간: 16 sec, 획득: 없음). 샘플 분석은 UNcle 및 맬버른 카필러리 DSC 둘 다에 대한 제조자에 의해 제공된 소프트웨어를 이용하였다. 하기 도 15 및 표 14는 대표적인 DSC 결과를 나타낸다. 표 14의 Fab 서열은 표 3에 나타내었다.
표 14 (시차 주사 열량계에 의한 열 안정성)
실시예 10: 동역학 배제 분석 (KinExA)
화합물 A에 대한 본원에 개시된 항체 Fab 단편의 용액 친화도는 동역학 배제 검정 (KinExA)을 이용하여 측정하였다. 화합물 A의 이벌식 적정은 100, 200, 및 300 pM의 26D5 친화도 성숙 항체 Fab 단편을 사용하여 수행되었다 (24-72시간 동안 평형화됨). 26D5 친화도 성숙 항체 Fab 단편의 상대적인 결합되지 않은 농도는 화합물 5에 의해 스트렙타비딘 코팅된 비드 상에서 포획한 후, 인간 IgG Fab를 인식하는 형광 표지된 항체를 검출함으로써 측정되었다. 복합체 회합 속도를 결정하기 위한 동역학 분석은 혼합물의 단일 튜브가 제조되고 (200 pM Fab 및 400 pM 화합물 A), 시점이 즉시 제거되는 (평형화 없음) 것을 제외하고는 동일한 검정 포맷으로 측정되었다. 결과는 하기 표 15에 나타내었다. 2가지 Fab, 26D5-75229-343-A10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT가 DSC 열 안정성 및 KinExA 분석에 의해 상위 2가지 Fab로서 확인되었다. 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT (서열식별번호: 106 및 서열식별번호: 164; 표 3 참조)는 하기 기재된 X-선 결정학 및 실시예 12에 기재된 생체내 연구를 위해 선택되었다.
표 15 KinExA (동역학 배제 분석)
실시예 11: Fab의 결정화
GGHHHHHHH (서열식별번호: 222) 친화도 태그를 갖는 Fab 26D5-GVR-Q-FT-Fab-SHORT를 DPBS (둘베코 인산염 완충된 식염수) 완충제 중에서 10 mg/ml로 농축시켰다. 단백질을 5배 몰 과량의 화합물 A와 복합체화하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 적하 증기 확산에 의해 복합체를 결정화하였다. 점적물은 1 μl의 복합체 및 1 μl의 저장소로 구성되었다. 결정화 저장소는 100 ml의 총 부피가 되도록 물에 용해된 20 g PEG 3350 및 20 mM의 완충되지 않은 시트르산나트륨으로 구성되었다. 2.5 μl 40% PEG400:40% 글리세롤 (v/v)과 7.5 μl의 저장소 용액의 혼합물을 점적물에 연속 첨가함으로써 결정을 액체 질소에서 급랭을 위해 준비하였다.
항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT는 DPBS 완충제에서 20 mg/ml로 농축되었다. 단백질을 5배 몰 과량의 화합물 A와 복합체화하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 적하 증기 확산에 의해 복합체를 결정화하였다. 점적물은 1 μl의 복합체 및 1 μl의 저장소로 구성되었다. 결정화 저장소는 100 mM CAPS (N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산), pH 10.5, 200 mM 황산리튬, 1.2 M 인산나트륨 및 0.8 M 인산칼륨으로 구성되었다. 2.5 μl 40% PEG400:40% 글리세롤 (v/v)과 7.5 μl의 저장소 용액의 혼합물을 점적물에 연속 첨가함으로써 결정을 액체 질소에서 급랭을 위해 준비하였다.
필라투스(Pilatus) 6M 검출기를 사용하여 빔라인 17-ID에서 어드밴스드 포톤 소스(Advanced Photon Source)에서 데이터를 수집하였다. 데이터는 프로세싱을 위한 기본 소프트웨어 XDS, 스케일링을 위한 XSCALE 및 데이터의 이방성 정도를 위한 STARANISO를 비롯한 오토프록(autoPROC) 패키지 [Vonrhein, C., Flensburg, C , Keller, P., Sharff, A., Smart, O., Paciorek, W., Womack, T. & Bricogne, G. (2011). Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallogr. Sect. D 67, 293-302]에 의해 가공되었다 [W. Kabsch (2010). XDS. Acta Crystallogr. Sect. D 66, 125-132 and W. Kabsch (2010). Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement. Acta Crystallogr. Sect. D 66, 133-144; STARANISO (Tickle, I.J., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Sharff, A., Vonrhein, C., Bricogne, G. (2018). STARANISO (available on the world-wide web at staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi) Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd).
26D5-GVR-Q-FT-Fab-SHORT/화합물 A 결정은 a = 57.7 Å; b = 75.1 Å; 및 c = 84.7 Å의 단위 셀 에지를 갖는 공간 그룹 P212121과 일치하는 대칭을 가졌고, 비대칭 단위당 1개의 복합체를 갖는다. 데이터는 등방성으로 가공될 때 1.47 Å으로 확장되었지만, a*에서 1.38 Å, b*에서 1.44 Å, 및 c*에서 1.32 Å로 확장된 타원체 컷오프를 사용하여 데이터를 유지하였다. 구조는 PHASER를 사용하여 분자 대체에 의해 결정되었고 (McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C. & Read, R.J. (2007). Phaser Crystallographic Software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674.), 이는 PDB 2O5X로부터 유래된 CL:CH1 (Verdino, P., Aldag, C., Hilvert, D., Wilson, I.A. (2008) Closely Related Antibody Receptors Exploit Fundamentally Different Strategies for Steroid Recognition. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 105, 11725-11730), PDB 4PY7로부터 유래된 VL (Wyrzucki, A., Dreyfus, C., Kohler, I., Steck, M., Wilson, I.A., Hangartner, L. (2014). Alternative Recognition of the Conserved Stem Epitope In Influenza A Virus Hemagglutinin By A VH3-30-Encoded Heterosubtypic Antibody. J. Virol. 88, 7083-7092.), 및 PDB 4TSA로부터 유래된 VH (Wensley, B. Structure of a Lysozyme Fab Complex, unpublished.)에 대한 모델을 갖는다. 모든 CDR (상보성 결정 영역)은 VH 및 VL 모델로부터 제거되었다. 초기 전자 밀도 맵은 화합물 A에 대해 명확한 전자 밀도를 나타내었다. 리간드에 대한 기하학적 제한은 GRADE를 사용하여 생성되었고 (Smart, O.S., Womack, T.O., Sharff, A., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Vonrhein, C. and Bricogne, G., Global Phasing, Ltd., Cambridge, United Kingdom), 초기에 RHOFIT로 대체되었다 (Womack, T.O., Smart, O.S., Sharff, A., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W, Vonrhein, C. and Bricogne, G., Global Phasing, Ltd., Cambridge, United Kingdom). 구조는 쿠트(Coot)에 의한 모델 빌딩의 교대 라운드 (Emsley, P., Lokhamp, B., Scott, W.G. & Cowtan, K. (2010). Features and Development of Coot. Acta Crystallogr Sect. D 66, 486-501) 및 오토버스터(autoBUSTER)에 의한 정련을 통해 개선되었다. (Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C , Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P, Sharff, A., Smart, O., Vonrhein, C , Womack, T. BUSTER version 2.11.7. Global Phasing, Ltd., Cambridge, United Kingdom). 도 16의 영상은 26D5-GVR-Q-FT-Fab-SHORT/화합물 A의 복합체에 대한 정련된 구조를 제시한다.
26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT/화합물 A 결정은 a = 64.8 Å; b = 84.9 Å; c = 100.9 Å; α = 83.4°; β = 88.4°; γ = 67.9°의 단위 셀 에지를 갖는 공간 그룹 P1과 일치하는 대칭을 가지며, 비대칭 단위당 4개의 복합체를 갖는다. 데이터는 등방성으로 가공될 때 2.7 Å로 확장되었지만, 0.880a* + 0.436b* - 0.189c*에서 1.91 Å, 0.063a* + 0.898b* - 0.436c*에서 2.20 Å, 및 0.093a* + 0.382b* + 0.920c*에서 2.98 Å로 확장된 타원체 컷오프를 사용하여 데이터를 유지하였다. 구조는 PHASER를 사용하여 분자 대체에 의해 결정되었고 (McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C. & Read, R.J. (2007). Phaser Crystallographic Software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674.), VH 모델로부터 제거된 CDR-H3을 갖는 항체 Fab 단편 26D5-GVR-Q-FT-Fab-SHORT로부터 유래된 CL:CH1, VL 및 VH에 대한 모델을 갖는다. 초기 전자 밀도 맵은 화합물 A에 대한 전자 밀도를 나타내었다. 구조는 쿠트에 의한 모델 빌딩의 교대 라운드 (Emsley, P., Lokhamp, B., Scott, W.G. & Cowtan, K. (2010). Features and Development of Coot. Acta Crystallogr Sect. D 66, 486-501) 및 자동화 NCS 제한을 이용하는 오토버스터에 의한 정련을 통해 개선되었다. (Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P, Sharff, A., Smart, O., Vonrhein, C. & Womack, T. BUSTER version 2.11.7. Global Phasing, Ltd., Cambridge, United Kingdom and Smart, O.S. Womack, T.O., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Sharff, A., Vonrhein, C. & Bricogne, G. (2012). Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallogr Sect. D 68, 368-380). 도 17의 영상은 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT/화합물 A의 복합체에 대한 정련된 구조를 제시한다.
2가지 Fab, 26D5-75229-343-A10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT가 DSC 열 안정성 및 KinExA 분석에 의해 상위 2가지 Fab로 확인되었다. 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 X-선 결정학은 항체 Fab 단편과 화합물 A의 결합의 1:1 화학량론 및 항체 Fab 단편의 중쇄 및 경쇄 사이의 갈라진 틈에서의 결합 메카니즘을 입증하였다.
실시예 12: 항체 Fab 단편의 혈장 결합 연구
26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT가 혈장에서 밀벡시안의 항응고 효과를 역전시키는 능력을 평가하기 위한 연구가 수행되었다.
시험관내 연구
항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT가 인자 XIa 억제제 화합물 A의 시험관내 항응고제 활성을 중화시키는 능력은 Fab 단편을 공지된 양의 화합물 A를 함유하는 혈장과 조합하여 결정하였다. 화합물 A의 혈장 농도는 aPTT에서 유의한 증가를 제공하도록 선택되었고, 유의한 증가는 인자 XIa 억제제 부재 시의 응고 시간보다 적어도 20% 더 큰 응고 시간 (예를 들어 aPTT)으로 정의될 수 있다. 혈장 내에서 인자 XIa 억제제에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 Fab 단편은 인자 XIa 억제제가 인자 XIa에 결합하는 능력을 감소시켜, 항체 또는 항체 Fab 단편 부재 시의 응고 시간에 비해 응고 시간 (예를 들어 aPTT)을 감소시킨다.
화합물 A를 8000, 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3 및 15.6 nM의 농도에서 풀링된 정상 인간 혈장에 첨가하였다. 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT를 8000, 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3 및 15.6 nM의 동일한 농도에서 풀링된 정상 인간 혈장에 첨가하였다. 화합물 A-함유 혈장, 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT-함유 혈장 및 정상 혈장을 합하여, 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 부재 시의 화합물 A를 비롯하여, 5:5, 5:4, 5:3 및 5:2의 화합물 A:26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 몰비에서 각각의 다양한 농도를 생성하였다.
패키지 삽입물의 지시에 따라 액틴(ACTIN)® FS (지멘스(Siemens)/데이드-베링(Dade-Behring))을 사용하여 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) (즉, 인간 혈장 응고 시간)을 각각의 샘플에 대해 결정하였다. aPTT 검정의 설명에 대해서는, 문헌 [Goodnight, S.H. et al., "Screening Tests of Hemostasis", Disorders of Thrombosis and Hemostasis: A Clinical Guide, 2nd Edition, pp. 41-51, McGraw-Hill, New York (2001)]을 참조한다. 혈장 (0.05 mL)을 1분 동안 37℃로 가온시켰다. 액틴® FS (0.05 mL)을 혈장에 첨가하고, 추가 3분 동안 인큐베이션하였다. 염화칼슘 (25 mM, 0.05 mL)을 반응에 첨가하여 응고를 개시하였다. 응고 시간은 염화칼슘을 첨가한 순간부터 응괴가 검출될 때까지의 시간 (초)였다.
도 18은 인자 XIa 억제제, 즉, 화합물 A 농도 및 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 농도의 함수로서 혈장 응고 시간 (aPTT)을 제시한다. 도 19는 중화 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 부재 시 (채워진 기호) 및 존재 시 (열린 기호) 유리 인자 XIa 억제제 화합물 A의 농도의 함수로서 혈장 응고 시간 (aPTT)을 제시한다. 플롯은 응고 시간 (aPTT)이 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 부재 시 및 존재 시 결합되지 않은 화합물 A 혈장 농도의 함수임을 나타낸다.
다양한 농도 및 몰비의 화합물 A 및 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT를 함유하는 인간 혈장 샘플을 가공하고, 각각의 샘플에서 화합물 A 및 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT (결합되지 않은 및 결합된)의 농도를 하기에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이 결정하였다.
혈장에서 화합물 A의 총 농도는 결합되지 않은 화합물 A, 혈장 단백질에 결합된 화합물 A 및 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT에 결합된 화합물 A를 지칭한다. 유리 또는 결합되지 않은 화합물 A는 혈장 단백질 또는 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT에 결합되지 않은 화합물 A를 지칭한다.
혈장에서 결합되지 않은 화합물 A는 한외여과 방법 (센트리프리(Centrifree)®, 밀리포어시그마(MilliporeSigma)) (30 kDa 분자량 컷오프)을 통해 수득되었다. 혈장 (0.5 mL)을 한외여과 기기 (센트리프리®, 울트라셀(Ultracel) PL 막, REF# 4104; 밀리포어시그마)의 상부 챔버에 두었다. 기기를 고정각 원심분리 회전자 (소르발(SORVALL) SLA-3000; 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))에 두고, 2,000 x g 20분 동안 (소르발 RC 6 Plus; 써모 사이언티픽)에서 원심분리한 후 한외여과물을 수집하였다.
혈장 및 혈장 한외여과물의 분취량을 폴리프로필렌 튜브에서 -80℃에서 냉동시켰다. 혈장에서 화합물 A의 총 농도 및 혈장 한외여과물에서 결합되지 않은 화합물 A의 농도를 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 (LC/MS) 분석을 이용하여 측정하였다. LC/MS 분석에 대한 샘플을 하기 기재된 단백질 침전 절차를 이용하여 제조하였다.
생물학적 샘플의 분취량 (20 μL)을 96-딥 웰 플레이트 (1.2 mL, 둥근 바닥 폴리 프로필렌)에 전달하였다. 50% 물 및 0.5% 포름산을 함유하는 메탄올 용액 (20 μL)을 첨가하였다. 플레이트를 캡핑하고, 진탕기에서 95℃에서 20분 동안 혼합하였다. 내부 표준 [10 nM, 안정한 동위원소-표지된 (13C,15N) 화합물 A] 및 1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴 (80 μL)을 이전 단계의 생성된 용액에 첨가함으로써 단백질 침전 과정을 수행하였다. 플레이트를 15분 동안 실온에서 추가로 볼텍싱 혼합한 다음, 3,600 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액의 분취량 (100 μL)을 주입 플레이트 (96 웰, 0.3 mL)에 전달하였다. 상청액 (5 μL)을 QTRAP MS/MS (에이비 사이엑스(AB Sciex) 6500) 탠덤 질량 분광계와 경계를 이룬 초성능 LC 시스템 (워터스® 액퀴티(Acquity) UPLC)에 주입하였다. 피분석물을 60℃에서 2가지 완충제 용액 (A: 물, 0.1% 포름산; B: 아세토니트릴, 0.1% 포름산)으로 이루어진 C18 칼럼 (워터스 HSS T3, 2X 50 mm, 1.8 μm) 상에서 0.7 ml/min의 구배 유속으로 분리하였다. 전구체 (M+H)+ 종을 나타내는 양성 전기분무 이온화 모드에서 다중 반응 모니터링 (MRM)을 이용하여 검출하였다. 모니터링된 MRM 전이는 화합물 A의 경우 626→319, 동위원소-표지된 화합물 A의 경우 630→323였다. 정량 하한은 0.5 nM이었다.
혈장에서 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 농도는 다음과 같이 결정하였다. 혈장에서 총 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 화합물 A에 결합되지 않은 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 둘 다의 혈장 농도는 자이로랩(Gyrolab)® 자동화 미세유체 플랫폼 (기로스 프로테인 테크놀로지즈 아베(Gyros Protein Technologies AB)) 상에서 리간드 결합 검정에 의해 측정하였다. 비오틴화 마우스 항-인간 카파 (써던바이오텍(SouthernBiotech), 알라바마주)는 총 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT에 대한 포획 분자로서 사용되었다. 샘플, 표준 및 QC는 1xPTB (1%BSA/0.05%Tween20/PBS)에서 10% 혈장의 최종 매트릭스 농도까지 되었고, 자이로랩® 자동화 미세유체 플랫폼에 로딩되었다. 자이로랩® 바이오아피(Bioaffy) 200 CD에 의한 3-단계-2-세척 위저드(Wizard) 방법을 이용하였다 (기로스 프로테인 테크놀로지즈 아베). 최종 세척 단계 후, 포획된 총 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647 표지된 마우스 항-인간 Ig 카파 경쇄 mAb 클론 G20-361 (BD 카탈로그 번호 555861, 로트 번호 8333691)을 사용하여 검출하였다. 혈장 샘플에서 총 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 농도는 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 캘리브레이터로부터 생성된 4-파라미터 로지스틱 (4-PL) 보정 곡선을 사용하여 자이로랩® 기술에 의해 측정되는 형광 강도로부터 계산되었다. 총 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 보정 곡선의 범위는 혈장에서 250 내지 25000 ng/mL였다. 정량화 상한 및 하한은 25000 및 250 ng/mL였다. 품질 관리 샘플은 혈장 중 20000, 7500, 750 ng/mL에서 제조되었다. 캘리브레이터 및 QC는 허용가능한 검정 성능을 보장하기 위해 각각의 실험에서 분석되었다. 검정 성능은 허용가능한 범위 내에 있었다: 표준 및 QC의 % CV는 20% 미만이었고, QC 회수율은 공칭 값의 ± 20% 이내였다.
화합물 5는 화합물 A에 결합되지 않은 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT에 대한 포획 분자로서 사용되었다. 샘플, 표준 및 QC는 1x PTB (1%BSA/0.05%Tween20/PBS)에서 10% 혈장의 최종 매트릭스 농도까지 되었고, 자이로랩® 자동화 미세유체 플랫폼에 로딩하였다. 자이로랩® 바이오아피 200 CD에 의한 3-단계-2-세척 위저드 방법을 이용하였다. 최종 세척 단계 후, 포획된 "활성/유리" 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT는 알렉사 플루오르® 647 표지된 마우스 항-인간 Ig 카파 경쇄 mAb 클론 G20-361 (BD 카탈로그 번호 555861, 로트 번호 8333691)를 사용하여 검출하였다. 혈장 샘플에서 "활성/유리" Fab (26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT)의 농도는 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 캘리브레이터로부터 생성된 4-파라미터 로지스틱 (4-PL) 보정 곡선을 사용하여 자이로랩®에 의해 측정되는 형광 강도로부터 계산되었다. "활성/유리" 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 보정 곡선의 범위는 혈장에서 250 내지 25000 ng/mL였다. 정량화 상한 및 하한은 25000 및 250 ng/mL였다. 품질 관리 샘플은 혈장 중 20000, 7500, 750 ng/mL에서 제조되었다. 캘리브레이터 및 QC는 허용가능한 검정 성능을 보장하기 위해 각각의 실험에서 분석되었다. 검정 성능은 허용가능한 범위 내에 있었다: 표준 및 QC의 % CV는 20% 미만이었고, QC 회수율은 공칭 값의 ± 20% 이내였다.
생체내 연구
생체내 실험은 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니의 동물 관리 및 사용 위원회의 규정에 따라 수행하였다. 토끼 (수컷 뉴질랜드 백색, 2 내지 4 kg)에게 혈액 샘플링을 위해 중앙 귀 동맥에 및 물질 투여를 위해 가장자리 귀 정맥에 유치 카테터를 장착하였다. 화합물 A를 10분에 걸쳐 1.0 mg/kg의 용량으로 일정한 정맥내 주입으로 투여하였다. 화합물 A 주입을 완료한 후 20분에 시작하여, 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT를 10분에 걸쳐 160 mg/kg의 용량으로 일정한 정맥내 주입으로 투여하였다. 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 투여된 용량은 화합물 A의 투여된 용량에 대해 공칭 2배 몰 과량을 나타내었다. 화합물 A의 투여 전에, 화합물 A의 주입 종료 시에, 항체 Fab 단편의 투여 직전에, 항체 Fab 단편의 투여 종료 시에, 및 항체 Fab 단편의 투여 후 화합물 A의 투여 시작으로부터 최대 24시간 동안 다양한 간격으로 1.5 mL의 혈액 샘플을 취하였다. 혈액 샘플을 폴리프로필렌 튜브에 있는 0.167 mL의 3.8% 시트르산나트륨에 첨가하고, 적어도 2회 뒤집어서 철저히 혼합하고, 얼음 상에 두었다. 혈액 샘플링 1시간 내에, 전혈을 적어도 1,500 x 중력에서 적어도 10분 동안 원심분리함으로써 혈장을 단리하였다. 결합되지 않은 화합물 A가 상기 기재된 한외여과 방법에 의해 수득되었다.
화합물 A의 항응고 효과는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)에서 측정되었다. aPTT는 패키지 삽입물의 지시에 따라 액틴® FS (지멘스/데이드-베링)을 사용하여 결정되었다. 혈장 (0.05 mL)을 1분 동안 37℃로 가온시켰다. 액틴® FS (0.05 mL)을 혈장에 첨가하고, 추가 3분 동안 인큐베이션하였다. 염화칼슘 (25 mM, 0.05 mL)을 반응에 첨가하여 응고를 개시하였다. 응고 시간은 염화칼슘을 첨가한 순간부터 응괴가 검출될 때까지의 시간 (초)였다.
화합물 A의 생체내 투여 후, 토끼 혈장 aPTT는 기준선에 비해 대략 2배 증가하였다. 20분 후에 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT를 투여한 후, 토끼 혈장 aPTT는 기준선으로 되돌아 왔고, 12시간에 걸쳐 해당 수준에서 유지되었다. 도 20은 화합물 A의 IV 용량 (1 mg/kg), 20분 후 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 IV 용량 (160 mg/kg) 이후 토끼 혈장 응고 시간 (aPTT)을 제시한다. 결과는 3마리의 동물로부터의 평균이다.
화합물 A (총 및 결합되지 않은) 및 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 혈장 농도는 상기 기재된 바와 같이 결정되었다. PK 파라미터는 혈장 농도 대 시간 데이터의 비구획 분석에 의해 수득되었다 (피닉스 윈놀린(Phoenix WinNonlin) 소프트웨어, 버전 6.4, 파사이트 코퍼레이션(Pharsight Corporation, 캘리포니아주 마운틴 뷰)). 정량화 하한 미만의 값은 계산에서 사용되지 않았다. 혈장 농도 대 시간 곡선 아래의 면적 (AUC [0-T])은 선형 및 로그 사다리꼴 합계의 조합을 이용하여 계산되었다. 총 혈장 클리어런스 (CL), 정상 상태 분포 부피 (Vss), 말단 반감기 (T-HALF), 및 평균 체류 시간 (MRT)은 IV 투여 후 추정되었다. T-HALF의 추정은 정량화가능한 농도로 최소 3개의 시점을 이용하여 이루어졌다.
토끼에게 화합물 A (1 mg/kg)를 투여한 후, 화합물 A의 혈장 농도는 4.3 μM이었고, 결합되지 않은 화합물 A의 혈장 농도는 290 nM이었다. 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT (160 mg/kg)의 투여 후, 화합물 A의 혈장 농도는 14 μM이었고, 결합되지 않은 화합물 A의 혈장 농도는 0.2 nM 미만이었다. 결합되지 않은 화합물 A의 혈장 농도에서의 감소는 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT에 대한 그의 높은 결합 친화도로 인한 것이었다. 화합물 A의 혈장 농도에서의 증가는 주로 혈관 구획에서 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 분포 및 질량 작용의 법칙에 따라 혈관외 공간에서 혈관 공간으로 화합물 A의 재분포로 인한 것이었다. 결합되지 않은 화합물 A의 토끼 혈장 농도는 12시간 초과 동안 10 nM 미만으로 유지되었다. 도 21은 화합물 A의 IV 용량 (1 mg/kg), 20분 후 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT의 IV 용량 (160 mg/kg) 이후 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT, 화합물 A 및 결합되지 않은 화합물 A의 토끼 혈장 농도를 제시한다. 결과는 3마리의 동물로부터의 평균이다.
실시예 13: 항체 탠덤 Fab 단편의 약동학
상기 실시예 5에 기재된 방법과 유사하게 관련 기술분야에 공지된 표준 절차에 따라 26D5-75616-348-F10-TanFab (탠덤 Fab 중쇄 서열식별번호: 180, 탠덤 Fab 경쇄 서열식별번호: 164)를 생성하고 정제하였다.
래트에서의 약동학
브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니의 동물 관리 사용 위원회의 규정에 따라 생체내 실험을 수행하였다. 래트 (수컷 스프라구-돌리, 0.2 내지 0.4 kg)에게 혈액 샘플링 및 물질 투여를 위해 경정맥에 유치 카테터를 장착하였다. 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab 각각을 10분에 걸쳐 10 mg/kg 용량에서 일정한 정맥내 주입으로 투여하였다. 0.2 mL의 혈액 샘플을 주입 종료 시 및 투여 시작으로부터 최대 48시간 동안 다양한 간격으로 취하였다. 혈액 샘플을 폴리프로필렌 튜브에 있는 EDTA에 첨가하고, 적어도 2회 뒤집어서 철저히 혼합하고, 얼음 상에 두었다. 혈액 샘플링 1시간 내에, 전혈을 적어도 1,500 x 중력에서 적어도 10분 동안 원심분리함으로써 혈장을 단리하였다. 혈장에서 항체 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 농도는 다음과 같이 결정되었다.
혈장에서 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab의 농도는 다음과 같이 결정되었다. 혈장에서 총 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab, 및 화합물 A에 결합되지 않은 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab의 혈장 농도 둘 다 자이로랩® 자동화 미세유체 플랫폼 (기로스 프로테인 테크놀로지즈 아베) 상에서 리간드 결합 검정에 의해 측정되었다. 비오틴화 마우스 항-인간 카파 (써던바이오텍 카탈로그 번호 9230-08, 로트 번호 K5613-X088)는 총 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab에 대한 포획 분자로 사용되었다. 샘플, 표준 및 QC는 1xPTB (1%BSA/0.05%Tween20/PBS)에서 10% 혈장의 최종 매트릭스 농도까지 되었고, 자이로랩® 자동화 미세유체 플랫폼에 로딩되었다. 자이로랩® 바이오아피 200 CD에 의한 3-단계-2-세척 위저드 방법을 이용하였다 (기로스 프로테인 테크놀로지즈 아베). 최종 세척 단계 후, 포획된 총 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab는 알렉사 플루오르® 647 표지된 마우스 항-인간 Ig 카파 경쇄 mAb 클론 G20-361 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) 카탈로그 번호 555861, 로트 번호 833694)를 사용하여 검출하였다. 혈장 샘플에서 총 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab의 농도는 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab 캘리브레이터로부터 생성된 4-파라미터 로지스틱 (4-PL) 보정 곡선을 이용하여 자이로랩® 기술에 의해 측정되는 형광 강도로부터 계산되었다. 총 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab 보정 곡선의 범위는 혈장에서 10 내지 25000 ng/mL였다. 정량화 상한 및 하한은 25000 및 10 ng/mL였다. 품질 관리 샘플은 혈장 중 20000, 7500, 750, 75 및 30 ng/mL에서 제조되었다. 캘리브레이터 및 QC는 허용가능한 검정 성능을 보장하기 위해 각각의 실험에서 분석되었다. 검정 성능은 허용가능한 범위 내에 있었다: 표준 및 QC의 % CV는 20% 미만이었고, QC 회수율은 공칭 값의 ± 20% 이내였다.
화합물 5는 화합물 A에 결합되지 않은 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab에 대한 포획 분자로서 사용되었다. 샘플, 표준 및 QC는 1x PTB (1%BSA/0.05%Tween20/PBS)에서 10% 혈장의 최종 매트릭스 농도까지 되었고, 자이로랩® 자동화 미세유체 플랫폼에 로딩하였다. 자이로랩® 바이오아피 200 CD에 의한 3-단계-2-세척 위저드 방법을 이용하였다. 최종 세척 단계 후, 포획된 "활성/유리" 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab는 알렉사 플루오르® 647 표지된 마우스 항-인간 Ig 카파 경쇄 mAb 클론 G20-361 (벡톤 디킨슨 카탈로그 번호 555861, 로트 번호 8333694)를 사용하여 검출하였다. 혈장 샘플에서 "활성/유리" 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab의 농도는 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab 캘리브레이터로부터 생성된 4-파라미터 로지스틱 (4-PL) 보정 곡선을 사용하여 자이로랩®에 의해 측정되는 형광 강도로부터 계산되었다. "활성/유리" 26D5-75616-348-F10-Fab-SHORT 및 26D5-75616-348-F10-TanFab 보정 곡선의 범위는 혈장에서 10 내지 25000 ng/mL였다. 정량화 상한 및 하한은 25000 및 10 ng/mL였다. 품질 관리 샘플은 혈장 중 20000, 7500, 750, 75 및 30 ng/mL에서 제조되었다. 캘리브레이터 및 QC는 허용가능한 검정 성능을 보장하기 위해 각각의 실험에서 분석되었다. 검정 성능은 허용가능한 범위 내에 있었다: 표준 및 QC의 % CV는 20% 미만이었고, QC 회수율은 공칭 값의 ± 20% 이내였다.
도 22는 생성된 약동학 데이터를 제시한다.
토끼에서의 약동학
생체내 실험은 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니의 동물 관리 및 사용 위원회의 규정에 따라 수행하였다. 토끼 (수컷 뉴질랜드 백색, 2 내지 4 kg)에게 혈액 샘플링을 위해 대퇴부 동맥 및 정맥에 및 물질 투여를 위해 가장자리 귀 정맥에 유치 카테터를 장착하였다. 화합물 A를 10분에 걸쳐 0.4 mg/kg (0.64 마이크로몰/kg)의 용량으로 일정한 정맥내 주입으로 투여하였다. 화합물 A 주입을 완료한 후 20분에 시작하여, 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab를 10분에 걸쳐 40 mg/kg (0.43 마이크로몰/kg)의 용량으로 일정한 정맥내 주입으로 투여하였다. 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 투여된 용량은 화합물 A의 투여된 용량 (2*0.43 / 0.64)에 대해 공칭 1.34배 몰 과량 (2:1 결합 용량을 설명함)을 나타내었다. 화합물 A의 투여 전에, 화합물 A의 주입 종료 시에, 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 투여 직전에, 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 투여 종료 시에, 및 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 투여 후 화합물 A의 투여 시작으로부터 최대 24시간 동안 다양한 간격으로 1.5 mL의 혈액 샘플을 취하였다.
혈액 샘플을 폴리프로필렌 튜브에 있는 0.167 mL의 3.8% 시트르산나트륨에 첨가하고, 적어도 2회 뒤집어서 철저히 혼합하고, 얼음 상에 두었다. 혈액 샘플링 1시간 내에, 전혈을 적어도 1,500 x 중력에서 적어도 10분 동안 원심분리함으로써 혈장을 단리하였다. 결합되지 않은 화합물 A가 상기 기재된 한외여과 방법에 의해 수득되었다. 혈장 및 혈장 한외여과물의 분취량을 폴리프로필렌 튜브에서 -80℃에서 냉동시켰다. 혈장에서 화합물 A의 총 농도 및 혈장 한외여과물에서 결합되지 않은 화합물 A의 농도를 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 (LC/MS) 분석을 이용하여 측정하였다. LC/MS 분석에 대한 샘플을 하기 기재된 단백질 침전 절차를 이용하여 제조하였다.
생물학적 샘플의 분취량 (20 μL)을 96-딥 웰 플레이트 (1.2 mL, 둥근 바닥 폴리 프로필렌)에 전달하였다. 50% 물 및 0.5% 포름산을 함유하는 메탄올 용액 (20 μL)을 첨가하였다. 플레이트를 캡핑하고, 진탕기에서 95℃에서 20분 동안 혼합하였다. 내부 표준 [1 μM] 및 1% 포름산을 함유하는 아세토니트릴 (80 μL)을 이전 단계의 생성된 용액에 첨가함으로써 단백질 침전 과정을 수행하였다. 플레이트를 15분 동안 실온에서 추가로 볼텍싱 혼합한 다음, 3,700 rpm에서 8분 동안 원심분리하였다. 상청액의 분취량 (100 μL)을 주입 플레이트 (96 웰, 0.3 mL)에 전달하였다. 상청액 (3 μL)을 사극자 MS/MS (써모 콴티바) 탠덤 질량 분광계와 경계를 이룬 초성능 LC 시스템 (워터스® 액퀴티 아이클래스(iClass) uPLC)에 주입하였다. 피분석물을 40℃에서 2가지 완충제 용액 (A: 물, 5 mM 포름산암모늄, 0.1% 포름산; B: 아세토니트릴, 0.1% 포름산)으로 이루어진 C18 칼럼 (워터스 HSS T3, 2 X 50 mm, 1.8 μm) 상에서 0.6 ml/min의 구배 유속으로 분리하였다. 전구체 (M+H)+ 종을 나타내는 양성 전기분무 이온화 모드에서 다중 반응 모니터링 (MRM)을 이용하여 검출하였다. 모니터링된 MRM 전이는 화합물 A의 경우 626.3→319.1, 내부 표준의 경우 474.3→269였다. 정량 하한은 0.5 nM이었다.
혈장에서 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab의 농도는 이 실시예에서 상기 기재된 바와 같이 결정되었다.
도 23은 생성된 약동학 데이터를 제시한다.
시험관내 연구
화합물 A를 2000 nM의 농도에서 풀링된 정상 인간 혈장에 첨가하였다. 항체 탠덤 Fab 단편 26D5-75616-348-F10-TanFab를 1000 nM의 농도에서 풀링된 정상 인간 혈장에 첨가하였다. 화합물 A-함유 혈장, 26D5-75616-348-F10-TanFab-함유 혈장 및 정상 혈장을 합하여, 화합물 A에서 각각 다양한 농도를 생성하였다: 2:1, 2:0.8, 2:0.6 및 2:0.4의 26D5-75616-348-F10-TanFab 몰비, 26D5-75616-348-F10-TanFab 부재 시의 화합물 A 포함. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) (즉, 인간 혈장 응고 시간)는 실시예 12에 상기 기재된 바와 같이 각각의 샘플에 대해 결정되었다. 도 24는 생성된 혈장 응고 데이터를 제시한다.
SEQUENCE LISTING
<110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY
<120> ANTIBODIES AND ANTIGEN BINDING PEPTIDES FOR FACTOR XIA INHIBITORS
AND USES THEREOF
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Pro
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His
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Gln Gln Ala Asn Glu Phe Pro Leu Thr
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Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr
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Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Leu Thr
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Gln Gln His Asn Ser Phe Pro Leu Thr
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 55
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 57
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 58
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 59
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<211> 116
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<211> 116
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Thr Val Ser Ser
115
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<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Glu Asn
20 25 30
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Glu Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<211> 116
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
20 25 30
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100 105 110
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
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100 105 110
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
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100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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115
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Glu Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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115
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Glu Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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115
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
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115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
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115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 78
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<210> 79
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
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Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
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65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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115 120 125
<210> 80
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 81
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 82
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 116
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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100 105 110
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115
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
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100 105
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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100 105
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Glu Phe Pro Leu
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<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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100 105
<210> 89
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
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<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Gln
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100 105
<210> 91
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Gln
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Pro Ala Ser Asn Leu Trp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 94
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 96
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Gln
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 97
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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50 55 60
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
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35 40 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
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<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<210> 109
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<211> 223
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 111
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Gln Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Phe Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Ala Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
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Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 113
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Lys Ala Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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210 215
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 115
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 119
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
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<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 125
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<211> 219
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 126
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<210> 127
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 128
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 155
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 156
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 157
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 158
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 159
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly
210 215 220
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
245 250 255
Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg
275 280 285
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
290 295 300
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp
325 330 335
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
340 345 350
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
355 360 365
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
370 375 380
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
385 390 395 400
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
405 410 415
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
420 425 430
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
435 440 445
Lys Ser Cys
450
<210> 194
<211> 455
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 194
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Leu Gln Leu Glu
210 215 220
Glu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Glu Gly Glu Leu Glu Glu Val Gln Leu
225 230 235 240
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
245 250 255
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp
260 265 270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Tyr
275 280 285
Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe
325 330 335
Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
340 345 350
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
355 360 365
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
370 375 380
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
385 390 395 400
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
405 410 415
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
420 425 430
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
435 440 445
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
450 455
<210> 195
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 195
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly
275 280 285
Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
290 295 300
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly
325 330 335
Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
420 425 430
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys
450
<210> 196
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 196
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1 5
<210> 197
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 197
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 198
Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Glu Gly Glu Leu
1 5 10 15
Glu
<210> 199
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 199
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 200
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 200
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 201
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 201
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 202
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 202
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 203
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 203
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
100 105
<210> 204
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 204
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 205
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 205
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 206
<211> 94
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 206
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe
85 90
<210> 207
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 207
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 208
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 208
Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 209
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 209
Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 210
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 210
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr
1 5 10
<210> 211
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 211
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 212
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 212
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 213
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 213
Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val
1 5 10
<210> 214
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 214
Trp Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 215
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 215
Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp
1 5 10
<210> 216
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 216
Asn Leu Ala Trp Tyr
1 5
<210> 217
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 217
Ala Met Ser Trp Val
1 5
<210> 218
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 218
Trp Val Ser Phe Ile
1 5
<210> 219
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 219
Ala Arg Ala Gly Phe
1 5
<210> 220
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 221
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 221
His His His His His His
1 5
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 222
Gly Gly His His His His His His His
1 5
Claims (57)
- 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드로서, 여기서 적어도 하나의 VH는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
(a) 서열식별번호: 1-12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 상보성-결정 영역 1 (VH-CDR1);
(b) 서열식별번호: 13-22로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 또는
(c) 서열식별번호: 23-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3;
여기서 적어도 하나의 VL은 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
(d) 서열식별번호: 29-37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1;
(e) 서열식별번호: 38-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 또는
(f) 서열식별번호: 44-51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3. - 하기를 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드:
(a) 서열식별번호: 52-83으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열식별번호: 84-99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 경쇄 가변 영역. - 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 적어도 하나의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드로서, 여기서 VH는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3을 포함하고, VL은 3개의 CDR: VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3을 포함하며, 여기서 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3의 아미노산 서열 각각은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
(a) 각각 서열식별번호: 1, 13, 23, 29, 38, 및 44;
(b) 각각 서열식별번호: 1, 14, 23, 29, 38, 및 45;
(c) 각각 서열식별번호: 1, 13, 24, 30, 38, 및 45;
(d) 각각 서열식별번호: 1, 13, 24, 29, 39, 및 45;
(e) 각각 서열식별번호: 1, 14, 25, 29, 38, 및 46;
(f) 각각 서열식별번호: 2, 13, 26, 31, 40, 및 47;
(g) 각각 서열식별번호: 3, 15, 24, 32, 40, 및 47;
(h) 각각 서열식별번호: 4, 16, 24, 29, 38, 및 46;
(i) 각각 서열식별번호: 5, 15, 24, 29, 38, 및 46;
(j) 각각 서열식별번호: 1, 14, 24, 29, 38, 및 46;
(k) 각각 서열식별번호: 6, 13, 24, 31, 40, 및 47;
(l) 각각 서열식별번호: 3, 15, 24, 32, 41, 및 48;
(m) 각각 서열식별번호: 1, 14, 24, 33, 38, 및 49;
(n) 각각 서열식별번호: 1, 14, 26, 29, 38, 및 46;
(o) 각각 서열식별번호: 7, 17, 26, 29, 38, 및 46;
(p) 각각 서열식별번호: 8, 17, 24, 34, 38, 및 46;
(q) 각각 서열식별번호: 1, 17, 26, 29, 38, 및 46;
(r) 각각 서열식별번호: 1, 17, 26, 35, 38, 및 46;
(s) 각각 서열식별번호: 1, 17, 24, 33, 38, 및 49;
(t) 각각 서열식별번호: 9, 14, 26, 29, 38, 및 46;
(u) 각각 서열식별번호: 9, 14, 26, 35, 38, 및 46;
(v) 각각 서열식별번호: 9, 17, 24, 29, 38, 및 46;
(w) 각각 서열식별번호: 9, 17, 24, 35, 38, 및 46;
(x) 각각 서열식별번호: 9, 17, 24, 34, 38, 및 46;
(y) 각각 서열식별번호: 9, 14, 24, 29, 38, 및 46;
(z) 각각 서열식별번호: 9, 18, 26, 35, 38, 및 46;
(aa) 각각 서열식별번호: 8, 14, 24, 29, 38, 및 46;
(bb) 각각 서열식별번호: 8, 17, 26, 29, 38, 및 46;
(cc) 각각 서열식별번호: 9, 19, 26, 29, 38, 및 46;
(dd) 각각 서열식별번호: 9, 17, 26, 34, 38, 및 46;
(ee) 각각 서열식별번호: 10, 20, 27, 36, 42, 및 50;
(ff) 각각 서열식별번호: 11, 21, 28, 37, 43, 및 51;
(gg) 각각 서열식별번호: 12, 22, 26, 33, 38, 및 46;
(hh) 각각 서열식별번호: 12, 17, 26, 33, 38, 및 46;
(ii) 각각 서열식별번호: 9, 17, 26, 33, 38, 및 46; 및
(jj) 임의의 아미노산 서열이 그 안에 1, 2 또는 3개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것인 (a) 내지 (ii)의 변이체. - 제3항에 있어서, 적어도 하나의 VH 영역 및 적어도 하나의 VL 영역 각각이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
(a) 각각 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 84;
(b) 각각 서열식별번호: 53 및 서열식별번호: 85;
(c) 각각 서열식별번호: 54 및 서열식별번호: 86;
(d) 각각 서열식별번호: 54 및 서열식별번호: 87;
(e) 각각 서열식별번호: 55 및 서열식별번호: 88;
(f) 각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 89;
(g) 각각 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 90;
(h) 각각 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 88;
(i) 각각 서열식별번호: 59 및 서열식별번호: 88;
(j) 각각 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 91;
(k) 각각 서열식별번호: 61 및 서열식별번호: 89;
(l) 각각 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 92;
(m) 각각 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 93;
(n) 각각 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 88;
(o) 각각 서열식별번호: 62 및 서열식별번호: 88;
(p) 각각 서열식별번호: 63 및 서열식별번호: 88;
(q) 각각 서열식별번호: 64 및 서열식별번호: 88;
(r) 각각 서열식별번호: 65 및 서열식별번호: 94;
(s) 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 88;
(t) 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 95;
(u) 각각 서열식별번호: 67 및 서열식별번호: 88;
(v) 각각 서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 93;
(w) 각각 서열식별번호: 69 및 서열식별번호: 88;
(x) 각각 서열식별번호: 69 및 서열식별번호: 95;
(y) 각각 서열식별번호: 70 및 서열식별번호: 88;
(z) 각각 서열식별번호: 70 및 서열식별번호: 95;
(aa) 각각 서열식별번호: 71 및 서열식별번호: 88;
(bb) 각각 서열식별번호: 71 및 서열식별번호: 94;
(cc) 각각 서열식별번호: 72 및 서열식별번호: 88;
(dd) 각각 서열식별번호: 73 및 서열식별번호: 95;
(ee) 각각 서열식별번호: 74 및 서열식별번호: 88;
(ff) 각각 서열식별번호: 75 및 서열식별번호: 88;
(gg) 각각 서열식별번호: 76 및 서열식별번호: 88;
(hh) 각각 서열식별번호: 77 및 서열식별번호: 94;
(ii) 각각 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 96;
(jj) 각각 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 97;
(kk) 각각 서열식별번호: 80 및 서열식별번호: 98;
(ll) 각각 서열식별번호: 81 및 서열식별번호: 99;
(mm) 각각 서열식별번호: 81 및 서열식별번호: 98;
(nn) 각각 서열식별번호: 82 및 서열식별번호: 99;
(oo) 각각 서열식별번호: 83 및 서열식별번호: 98; 및
(pp) 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 (a) 내지 (oo)의 변이체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 1개의 경쇄 가변 영역과 쌍을 형성한 2개의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드.
- 제5항에 있어서, 서열식별번호: 196-199로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는 단리된 항원 결합 펩티드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (I)에 제시된 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
여기서:
R1은 C1-4 알킬이고;
R2는 F, Cl, CF3, CHF2, CH2F, CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 CF3, CHF2, CH2F, 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H이고;
R5는 F 및 Cl로부터 독립적으로 선택됨. - 제7항에 있어서, 화합물이 화학식 (II)를 갖는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체인 단리된 항원 결합 펩티드.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 쇄 Fv 또는 scFv, 디술피드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGACH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, scFv-Fc, 또는 탠덤 Fab인 단리된 항원 결합 펩티드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며:
(a) 각각 서열식별번호: 100 및 서열식별번호: 160;
(b) 각각 서열식별번호: 101 및 서열식별번호: 160;
(c) 각각 서열식별번호: 102 및 서열식별번호: 161;
(d) 각각 서열식별번호: 103 및 서열식별번호: 161;
(e) 각각 서열식별번호: 104 및 서열식별번호: 162;
(f) 각각 서열식별번호: 105 및 서열식별번호: 162;
(g) 각각 서열식별번호: 104 및 서열식별번호: 163;
(h) 각각 서열식별번호: 105 및 서열식별번호: 163;
(i) 각각 서열식별번호: 106 및 서열식별번호: 164;
(j) 각각 서열식별번호: 107 및 서열식별번호: 164;
(k) 각각 서열식별번호: 108 및 서열식별번호: 165;
(l) 각각 서열식별번호: 109 및 서열식별번호: 165;
(m) 각각 서열식별번호: 110 및 서열식별번호: 166;
(n) 각각 서열식별번호: 111 및 서열식별번호: 166;
(o) 각각 서열식별번호: 112 및 서열식별번호: 164;
(p) 각각 서열식별번호: 113 및 서열식별번호: 164;
(q) 각각 서열식별번호: 114 및 서열식별번호: 164;
(r) 각각 서열식별번호: 115 및 서열식별번호: 164;
(s) 각각 서열식별번호: 116 및 서열식별번호: 167;
(t) 각각 서열식별번호: 117 및 서열식별번호: 167;
(u) 각각 서열식별번호: 118 및 서열식별번호: 165;
(v) 각각 서열식별번호: 119 및 서열식별번호: 165;
(w) 각각 서열식별번호: 110 및 서열식별번호: 168;
(x) 각각 서열식별번호: 111 및 서열식별번호: 168;
(y) 각각 서열식별번호: 116 및 서열식별번호: 169;
(z) 각각 서열식별번호: 117 및 서열식별번호: 169;
(aa) 각각 서열식별번호: 116 및 서열식별번호: 164;
(bb) 각각 서열식별번호: 117 및 서열식별번호: 164;
(cc) 각각 서열식별번호: 120 및 서열식별번호: 164;
(dd) 각각 서열식별번호: 121 및 서열식별번호: 164;
(ee) 각각 서열식별번호: 122 및 서열식별번호: 164;
(ff) 각각 서열식별번호: 123 및 서열식별번호: 164;
(gg) 각각 서열식별번호: 124 및 서열식별번호: 164;
(hh) 각각 서열식별번호: 125 및 서열식별번호: 164;
(ii) 각각 서열식별번호: 126 및 서열식별번호: 170;
(jj) 각각 서열식별번호: 127 및 서열식별번호: 170;
(kk) 각각 서열식별번호: 128 및 서열식별번호: 164;
(ll) 각각 서열식별번호: 129 및 서열식별번호: 164;
(mm) 각각 서열식별번호: 128 및 서열식별번호: 171;
(nn) 각각 서열식별번호: 129 및 서열식별번호: 171;
(oo) 각각 서열식별번호: 130 및 서열식별번호: 164;
(pp) 각각 서열식별번호: 131 및 서열식별번호: 164;
(qq) 각각 서열식별번호: 132 및 서열식별번호: 169;
(rr) 각각 서열식별번호: 133 및 서열식별번호: 169;
(ss) 각각 서열식별번호: 134 및 서열식별번호: 164;
(tt) 각각 서열식별번호: 135 및 서열식별번호: 164;
(uu) 각각 서열식별번호: 134 및 서열식별번호: 171;
(vv) 각각 서열식별번호: 135 및 서열식별번호: 171;
(ww) 각각 서열식별번호: 136 및 서열식별번호: 164;
(xx) 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 164;
(yy) 각각 서열식별번호: 136 및 서열식별번호: 171;
(zz) 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 171;
(aaa) 각각 서열식별번호: 138 및 서열식별번호: 164;
(bbb) 각각 서열식별번호: 139 및 서열식별번호: 164;
(ccc) 각각 서열식별번호: 138 및 서열식별번호: 170;
(ddd) 각각 서열식별번호: 139 및 서열식별번호: 170;
(eee) 각각 서열식별번호: 140 및 서열식별번호: 164;
(fff) 각각 서열식별번호: 141 및 서열식별번호: 164;
(ggg) 각각 서열식별번호: 142 및 서열식별번호: 171;
(hhh) 각각 서열식별번호: 143 및 서열식별번호: 171;
(iii) 각각 서열식별번호: 144 및 서열식별번호: 164;
(jjj) 각각 서열식별번호: 145 및 서열식별번호: 164;
(kkk) 각각 서열식별번호: 146 및 서열식별번호: 164;
(lll) 각각 서열식별번호: 147 및 서열식별번호: 164;
(mmm) 각각 서열식별번호: 148 및 서열식별번호: 164;
(nnn) 각각 서열식별번호: 149 및 서열식별번호: 164;
(ooo) 각각 서열식별번호: 150 및 서열식별번호: 170;
(ppp) 각각 서열식별번호: 151 및 서열식별번호: 170;
(qqq) 각각 서열식별번호: 152 및 서열식별번호: 172;
(rrr) 각각 서열식별번호: 153 및 서열식별번호: 172;
(sss) 각각 서열식별번호: 154 및 서열식별번호: 173;
(ttt) 각각 서열식별번호: 155 및 서열식별번호: 173;
(uuu) 각각 서열식별번호: 156 및 서열식별번호: 174;
(vvv) 각각 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 174;
(www) 각각 서열식별번호: 158 및 서열식별번호: 175;
(xxx) 각각 서열식별번호: 159 및 서열식별번호: 175;
(yyy) 각각 서열식별번호: 158 및 서열식별번호: 174; 및
(zzz) 각각 서열식별번호: 159 및 서열식별번호: 174;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며:
(a) 각각 서열식별번호: 176 및 서열식별번호: 160;
(b) 각각 서열식별번호: 177 및 서열식별번호: 160;
(c) 각각 서열식별번호: 178 및 서열식별번호: 160;
(d) 각각 서열식별번호: 179 및 서열식별번호: 160;
(e) 각각 서열식별번호: 180 및 서열식별번호: 164;
(f) 각각 서열식별번호: 181 및 서열식별번호: 164;
(g) 각각 서열식별번호: 182 및 서열식별번호: 164;
(h) 각각 서열식별번호: 183 및 서열식별번호: 164;
(i) 각각 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 163;
(j) 각각 서열식별번호: 185 및 서열식별번호: 163;
(k) 각각 서열식별번호: 186 및 서열식별번호: 163;
(l) 각각 서열식별번호: 187 및 서열식별번호: 163;
(m) 각각 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 162;
(n) 각각 서열식별번호: 185 및 서열식별번호: 162;
(o) 각각 서열식별번호: 186 및 서열식별번호: 162;
(p) 각각 서열식별번호: 187 및 서열식별번호: 162;
(q) 각각 서열식별번호: 188 및 서열식별번호: 165;
(r) 각각 서열식별번호: 189 및 서열식별번호: 165;
(s) 각각 서열식별번호: 190 및 서열식별번호: 165;
(t) 각각 서열식별번호: 191 및 서열식별번호: 165;
(u) 각각 서열식별번호: 192 및 서열식별번호: 161;
(v) 각각 서열식별번호: 193 및 서열식별번호: 161;
(w) 각각 서열식별번호: 194 및 서열식별번호: 161; 및
(x) 각각 서열식별번호: 195 및 서열식별번호: 161;
여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 제11항에 있어서, 각각 서열식별번호: 106 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 106 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 180 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 180 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 181 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 181 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 182 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 182 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 183 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 183 및 서열식별번호: 164의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 176 및 서열식별번호: 160의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 176 및 서열식별번호: 160의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 177 및 서열식별번호: 160의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 177 및 서열식별번호: 160의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 162의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 162의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 163의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 184 및 서열식별번호: 163의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 188 및 서열식별번호: 165의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 188 및 서열식별번호: 165의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제12항에 있어서, 각각 서열식별번호: 192 및 서열식별번호: 161의 서열을 포함하며; 여기서 상기 단리된 항원 결합 펩티드가 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항원 결합 펩티드:
- 서열식별번호: 192 및 서열식별번호: 161의 서열을 포함하는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편으로서; 여기서 상기 단리된 항체 탠덤 Fab 단편은 화학식 (II)의 화합물에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항체 탠덤 Fab 단편:
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제35항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제36항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 제조하는 방법으로서, (a) 제37항의 숙주 세포를 숙주 세포가 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 생성하도록 단백질 생성을 촉진시키는 배양 조건 하에 배양하는 것, 및 (b) 상기 배양물로부터 상기 항원 결합 펩티드 또는 상기 항체 Fab 단편 또는 상기 항체 탠덤 Fab 단편을 단리하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편 및 검출가능한 표지를 포함하는 검출 시약.
- 제39항에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 검출가능한 표지에 연결된 것인 검출 시약.
- 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체의 항혈전 효과의 감소를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 제약상 유효 용량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체의 항혈전 효과를 감소시키는 방법:
여기서:
R1은 C1-4 알킬이고;
R2는 F, Cl, CF3, CHF2, CH2F, CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 CF3, CHF2, CH2F, 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H이고;
R5는 F 및 Cl로부터 독립적으로 선택됨. - 제41항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)를 갖는 것인 방법:
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 제약상 유효 용량이 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 용량에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 또는 대상체에서의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 존재에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 포함하는 것인 방법.
- 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여와 동시에 또는 그 후에 투여되는 것인 방법.
- 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 정맥내로, 근육내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
- 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
- 생물학적 샘플에서 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 호변이성질체 또는 제약상 허용가능한 염의 수준을 검출하는 방법으로서,
여기서:
R1은 C1-4 알킬이고;
R2는 F, Cl, CF3, CHF2, CH2F, CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 CF3, CHF2, CH2F, 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H이고;
R5는 F 및 Cl로부터 독립적으로 선택됨;
(a) 생물학적 샘플을 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편과 접촉시키는 것, 및
(b) 상기 화합물 및 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 결합된 복합체의 수준을 검출하는 것
을 포함하는 방법. - 제47항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)를 갖는 것인 방법:
- 제47항 또는 제48항에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 표지된 것인 방법.
- 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 면역학적 검정에 의해 수행되는 것인 방법.
- 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 소변, 대변, 타액, 전혈, 혈장, 장기 조직, 모발, 피부, 세포, 또는 세포 배양물을 포함하는 것인 방법.
- 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체의 치료 유효량을 복용 중인 대상체에게 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 제약상 유효 용량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 입체이성질체 또는 호변이성질체를 결합시키는 방법:
여기서:
R1은 C1-4 알킬이고;
R2는 F, Cl, CF3, CHF2, CH2F, CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R3은 CF3, CHF2, CH2F, 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되고;
R4는 H이고;
R5는 F 및 Cl로부터 독립적으로 선택됨. - 제52항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 화학식 (II)를 갖는 것인 방법:
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편의 제약상 유효 용량이 항원 결합 펩티드 또는 항체 Fab 단편 또는 항체 탠덤 Fab 단편을 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 용량에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 또는 대상체에서의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 존재에 대해 적어도 약 1:1 몰비로 포함하는 것인 방법.
- 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 투여와 동시에 또는 그 후에 투여되는 것인 방법.
- 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항원 결합 펩티드 또는 단리된 항체 Fab 단편 또는 단리된 항체 탠덤 Fab 단편이 정맥내로, 근육내로 또는 피하로 투여되는 것인 방법.
- 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
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