ES2858472T3

ES2858472T3 - Formulaciones proteínicas

Info

Publication number: ES2858472T3
Application number: ES14721569T
Authority: ES
Inventors: Sungae Park; Scott Kuhns; Jennifer Rattan; Joseph Phillips
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2021-09-30
Anticipated expiration: 2034-03-07
Also published as: HK1220366A1; US20160025749A1; CA2904713A1; AU2020244570A1; AU2018271338A1; EP3888671A2; AU2014249458A1; AU2024203339A1; WO2014164301A3; EP2968460A2; EP3888671A3; AU2020244570B2; WO2014164301A2; EP2968460B1

Abstract

Una formulación proteínica sólida estable que comprende albúmina sérica bovina (BSA), fosfato potásico, manitol, sacarosa y polisorbato 20, en donde dicha proteína es darbepoetina.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones proteínicas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N° 61/775.974 presentada el 11 de marzo de 2013.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de esta invención se refiere a composiciones y métodos relacionados con formulaciones proteínicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La eritropoyetina (EPO) es una hormona glicoproteínica necesaria para la maduración de células progenitoras eritroides en eritrocitos. Se produce en el riñón y es esencial para regular los niveles de glóbulos rojos en la circulación. Las afecciones marcadas por bajos niveles de señal de oxígeno tisular incrementaban la producción de EPO, que a su vez estimula la eritropoyesis. Una pérdida de la función renal como la observada en la insuficiencia renal crónica, por ejemplo, típicamente da como resultado una disminución en la producción de EPO y una reducción concomitante en los glóbulos rojos.

EPO urinaria humana fue purificada por Miyake y cols. (J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)) de pacientes con anemia aplástica. Sin embargo, la cantidad de proteína de EPO purificada obtenida de esta fuente era insuficiente para aplicaciones terapéuticas. La identificación y la clonación del gen que codifica EPO humana y la expresión de proteína recombinante se divulgó en la Pat. EE. UU. N° 4.703.008 de Lin. Un método para la purificación de eritropoyetina humana recombinante desde medio celular se divulga en la Pat. EE. UU. N° 4.667.016 de Lai y cols. La producción de EPO biológicamente activa a partir de células hospedadoras de mamífero puso a disposición, por primera vez, cantidades de EPO adecuadas para aplicaciones terapéuticas. Además, el conocimiento de la secuencia génica y el incremento de la disponibilidad de proteína purificada condujeron a una mejor comprensión del modo de acción de esta proteína. El documento US6267958B1 describe una formulación proteínica liofilizada estable que se puede reconstituir con un diluyente adecuado para generar una formulación reconstituida de alta concentración de proteína que es adecuada para la administración subcutánea.

Como es el caso a menudo con un producto comercial de éxito, se comercializan productos falsificados en un intento de sacar provecho sin escrúpulos del nombre del producto original. En la industria farmacéutica, esto puede ser bastante peligroso, ya que un paciente que necesite el fármaco no recibirá la dosis terapéutica esperada si se administra un fármaco falsificado. Es imperativo que los fármacos falsificados sean detectados antes de que se introduzcan en el mercado y acaben siendo administrados a pacientes desconocidos. Según esto, existe una necesidad de formulaciones proteínicas estables que se puedan usar en ensayos reproducibles sensibles.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En una realización, la invención proporciona una formulación proteínica sólida estable que comprende albúmina sérica bovina (BSA), fosfato potásico, manitol, sacarosa y polisorbato 20, en la que dicha proteína es darbepoetina. La concentración de BSA puede estar entre 0,1% y 10%. La concentración de fosfato potásico puede estar entre 1 mM y 100 mM. La concentración de manitol puede estar entre 1% y 10%. La concentración de sacarosa puede estar entre 1% y 10%. La concentración de polisorbato 20 puede estar entre 0,005% y 0,5%. El pH puede estar entre 6,0 y 8,0. La concentración de proteína puede estar entre 1 ng/ml y 100 ng/ml. La formulación puede estar liofilizada. La formulación puede estar reconstituida con agua.

En otra realización, la invención proporciona un tampón de liofilización que comprende albúmina sérica bovina (BSA), fosfato potásico, manitol, sacarosa y polisorbato 20, en donde opcionalmente el tampón comprende además darbepoetina. La concentración de BSA puede estar entre 0,1% y 10%. La concentración de fosfato potásico puede estar entre 1 mM y 100 mM. La concentración de manitol puede estar entre 1% y 10%. La concentración de sacarosa puede estar entre 1% y 10%. La concentración de polisorbato 20 puede estar entre 0,005% y 0,5%. El pH puede estar entre 6,0 y 8,0. La concentración de proteína puede estar entre 1 ng/ml y 100 ng/ml. El tampón puede estar liofilizado. El tampón puede estar reconstituido con agua.

En una realización adicional, la invención proporciona un método para preparar una formulación proteínica sólida estable, comprendiendo dicho método: a) diluir una proteína con el tampón de liofilización de la invención; y b) liofilizar la proteína diluida.

Se divulga en la presente un estuche que comprende una formulación proteínica sólida estable de eritropoyetina y una formulación sólida estable de anticuerpo anti-eritropoyetina.

Se divulga en la presente un método para probar una muestra con respecto a la presencia de eritropoyetina, comprendiendo dicho método: a) reconstituir con agua una formulación sólida estable de eritropoyetina y una formulación sólida estable de anticuerpo anti-eritropoyetina; b) poner en contacto la formulación de anticuerpo antieritropoyetina de a) con una muestra de prueba y ensayar con respecto a la unión, en donde un resultado de unión positivo indica la presencia de eritropoyetina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. La Figura 1 describe un ensayo ELISA de detección de eritropoyetina que compara varios anticuerpos antieritropoyetina diferentes.

Figura 2. La Figura 2 demuestra la estabilidad de la muestra de eritropoyetina liofilizada en tiempos de 0, 1 y 2 meses.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a formulaciones proteínicas sólidas estables. La presente invención proporciona además composiciones y métodos relativos a formulaciones proteínicas sólidas estables. La presente invención se refiere a demás a composiciones y métodos para preparar dichas composiciones. Se divulgan métodos para detectar la presencia o ausencia de proteínas recombinantes, por ejemplo, pero no limitadas a, eritropoyetina humana recombinante. Se divulgan estuches relativos a formulaciones proteínicas sólidas estables.

Definiciones

A menos que se defina otra cosa en la presente, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que son entendidos comúnmente por los expertos normales en la especialidad. Además, a menos que se requiera otra cosa por el contexto, los términos singulares incluirán los plurales y los términos plurales incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la presente son las bien conocidas y comúnmente usadas en la especialidad. Los métodos y las técnicas de la presente invención se realizan generalmente según métodos convencionales muy conocidos en la especialidad y según se describe en diversas referencias generales y más específicas que son citadas y analizadas a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique otra cosa. Véanse, p. ej., Sambrook y cols. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel y cols., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones de los fabricantes, según se efectúan comúnmente en la especialidad o según se describen en la presente. La terminología usada en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, la química analítica, la química orgánica sintética y las química médica y farmacéutica descritos en la presente son los bien conocidos y comúnmente usados en la especialidad. Se pueden usar técnicas estándar para las síntesis químicas, los análisis químicos, la preparación farmacéutica, la formulación y el aporte y el tratamiento de los pacientes.

Se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:

Una "glicoproteína" es una proteína que tiene empalmados covalentemente oligosacáridos a cadenas laterales polipeptídicas.

Una "inmunoglobulina" es una molécula tetrámera. En una inmunoglobulina presente en la naturaleza, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento antigénico. La porción carboxiterminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están ligadas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo además la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 más aminoácidos. Véase generalmente Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Las cadenas inmunoglobulínicas presentes en la naturaleza exhiben la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas ligadas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDRs. Del extremo N al extremo C, las cadenas tanto ligeras como pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat y cois. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicación NIH n° 91 -3242, 1991.

Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una de sus porciones de unión antigénica que compita con el anticuerpo intacto para la unión específica, a menos que se especifique otra cosa. Las porciones de unión antigénica se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Porciones de unión antigénica incluyen, entre otras, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs), fragmentos que incluyen regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que sea suficiente para conferir una unión antigénica específica al polipéptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1 ; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab conectados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios Vh y Ch1; un fragmento Fv tiene los dominios Vl y Vh de una sola rama de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio Vh, un dominio Vl o un fragmento de unión antigénica de un dominio Vh o Vl (Pat. EE. UU. N° 6.846.634, 6.696.245, Publ. Sol. EE. UU. N° 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward y cols., Nature 341:544-546 (1989)).

Un anticuerpo monocatenario (scFv) es un anticuerpo en el que una región Vl y una Vh están ligadas a través de un conector (p. ej., una secuencia sintética de residuos de aminoácido) para formar una cadena proteínica continua en donde el conector es suficientemente largo para permitir que la cadena proteínica se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión antigénica monovalente (véanse, p. ej., Bird y cols., Science 242:423-26 (1988) y Huston y cols., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, en donde cada cadena polipeptídica comprende los dominios Vh y Vl ligados por un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se aparee con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica (véanse, p. ej., Holliger y cols., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993), y Poljak y cols., Structure 2:1121 -23 (1994)). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su apareamiento tendrá dos sitios de unión antigénica idénticos. Pueden usarse cadenas polipeptídicas que tienen diferentes secuencias para elaborar un diacuerpo con dos sitios de unión antigénica diferentes. De forma similar, los triacuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión antigénica, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.

Las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo dado se pueden identificar usando el sistema descrito por Kabat y cols. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicación n° 91 -3242, 1991. Una o más CDRs se pueden incorporar en una molécula bien covalentemente o bien no covalentemente para convertirla en un anticuerpo. Un anticuerpo puede incorporar la o las CDRs como parte de una cadena polipeptídica mayor, puede conectar covalentemente la o las CDRs a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar la o las CDRs no covalentemente. Las CDRs permiten que el anticuerpo se una específicamente a un antígeno de interés particular. Se divulga una molécula de unión que comprende al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o seis CDRs procedentes de los anticuerpos de la invención.

Fragmentos o análogos de anticuerpos pueden ser preparados fácilmente por los expertos normales en la especialidad siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva y usando técnicas bien conocidas en la especialidad. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos se presentan cerca de los límites de los dominios funcionales.

Formulaciones

La presente invención se refiere a formulaciones proteínicas sólidas estables. Dado que se divulgan estuches de detección de proteínas que se van a almacenar y usar en una variedad de condiciones ambientales (p. ej., amplios intervalos de temperatura), la invención proporciona formulaciones tales que mantienen la estabilidad de la proteína en una variedad de estas condiciones ambientales. Se divulgan en la presente memoria estuches y soluciones de prueba que se pueden usar bajo una amplia variedad de condiciones ambientales para ensayar la presencia de proteína recombinante (p. ej., una proteína terapéutica tal como eritropoyetina humana recombinante). Con las condiciones ambientales a las que se someterán los estuches y las soluciones de prueba, se desea y se contempla que estos estuches y soluciones proporcionen estabilidad a largo plazo a diversos intervalos de temperatura de modo que siga presente la actividad de los estuches y las soluciones.

En una realización, la invención proporciona una formulación proteínica sólida estable que comprende albúmina sérica bovina (BSA), fosfato potásico, manitol, sacarosa y polisorbato 20.

En otra realización, la invención proporciona un tampón de liofilización que comprende albúmina sérica bovina (BSA), fosfato potásico, manitol, sacarosa y polisorbato 20.

Dada la combinación de la invención de albúmina sérica bovina (BSA), fosfato potásico, manitol, sacarosa y polisorbato 20, se pueden determinar concentraciones apropiadas de cada excipiente para alcanzar la estabilidad deseada de la formulación proteínica sólida. Esta estabilidad se puede probar usando ensayos descritos en la presente, o con ensayos adicionales conocidos en la especialidad.

Por ejemplo, en una realización, la concentración de BSA está entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 10%. En una realización adicional, la concentración de BSA está entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 1%. En otra realización, la concentración de BSA está entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 5%. En otra realización, la concentración de BSA está entre aproximadamente 1% y aproximadamente 10%. En otra realización, la concentración de BSA está entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%. En otra realización, la concentración de BSA está entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 2%. En otra realización, la concentración de BSA es aproximadamente 2%. En otra realización, la concentración de BSA es aproximadamente 3%. En otra realización, la concentración de BSA es aproximadamente 4%. En otra realización, la concentración de BSA es aproximadamente 5%. En otra realización, la concentración de BSA es aproximadamente 0,5%. En otra realización más, la concentración de BSA es aproximadamente 1%. En una realización, la concentración de BSA está entre 0,1% y 10%. En una realización adicional, la concentración de BSA está entre 0,1% y 1%. En otra realización, la concentración de BSA está entre 0,1% y 5%. En otra realización, la concentración de BSA está entre 1% y 10%. En otra realización, la concentración de BSA está entre 1% y 5%. En otra realización, la concentración de BSA está entre 0,5% y 2%. En otra realización, la concentración de BSA es 2%. En otra realización, la concentración de BSA es 3%. En otra realización, la concentración de BSA es 4%. En otra realización, la concentración de BSA es 5%. En otra realización, la concentración de BSA es 0,5%. En otra realización más, la concentración de BSA es 1%.

En una realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es aproximadamente 1 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es aproximadamente 5 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es aproximadamente 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es aproximadamente 15 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es aproximadamente 20 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es aproximadamente 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es aproximadamente 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es aproximadamente 75 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es aproximadamente 100 mM.

En una realización, la concentración de fosfato potásico está entre 1 mM y 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre 1 mM y 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre 1 mM y 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre 1 mM y 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre 5 mM y 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre 5 mM y 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre 5 mM y 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre 10 mM y 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre 10 mM y 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico está entre 10 mM y 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es 1 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es 5 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es 15 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es 20 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es 75 mM. En otra realización, la concentración de fosfato potásico es 100 mM.

En una realización, la concentración de manitol está entre aproximadamente 1% y aproximadamente 10%. En otra realización, la concentración de manitol está entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%. En otra realización, la concentración de manitol está entre aproximadamente 1% y aproximadamente 3%. En otra realización, la concentración de manitol está entre aproximadamente 3% y aproximadamente 5%. En otra realización, la concentración de manitol está entre aproximadamente 5% y aproximadamente 10%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 1%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 2%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 3%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 4%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 5%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 6%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 7%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 8%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 9%. En otra realización, la concentración de manitol es aproximadamente 10%.

En una realización, la concentración de manitol está entre 1% y 10%. En otra realización, la concentración de manitol está entre 1% y 5%. En otra realización, la concentración de manitol está entre 1 otra realización, la concentración de manitol está entre 3% y 5%. En otra realización, la concentración d tá entre 5% y 10%.

En otra realización, la concentración de manitol es 1%. En otra realización, la c de manitol es 2%. En otra realización, la concentración de manitol es 3%. En otra realización, concentración de mani realización, la concentración de manitol es

En otra realización, concentración de mani realización, la concentración de manitol es 7%. En otra realización,

concentración de mani realización, la concentración de manitol es 9%. En otra realización, la concentración 10%.

En una realización, la concentración de sacarosa está entre aproximadamente 1% y aproximadamente 10%. En otra realización, la concentración de sacarosa está entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%. En otra realización, la concentración de sacarosa está entre aproximadamente 1% y aproximadamente 3%. En otra realización, la concentración de sacarosa está entre aproximadamente 3% y aproximadamente 5%. En otra realización, la concentración de sacarosa está entre aproximadamente 5% y aproximadamente 10%. En otra realización, la concentración de sacarosa es aproximadamente 1%. En otra realización, la concentración de sacarosa

es aproximadamente 2%. En otra realización, la concentración de sacarosa es aproximadamente 3%. En otra realización, la concentración de sacarosa es aproximadamente 4%. En otra realización, la concentración de sacarosa

es aproximadamente 5%. En otra realización, la concentración de sacarosa es aproximadamente 6%. En otra realización, la concentración de sacarosa es aproximadamente 7%. En otra realización, la concentración de sacarosa

es aproximadamente 8%. En otra realización, la concentración de sacarosa es aproximadamente 9%. En otra realización, la concentración de sacarosa es aproximadamente 10%.

En una realización, la concentración de sacarosa está entre 1% y 10%. En otra realización, la concentración de sacarosa está entre 1% y 5%. En otra realización, la concentración de sacarosa está entre 1% y 3%. En otra realización, la concentración de sacarosa está entre 3% y 5%. En otra realización, la concentración de sacarosa está

entre 5% n otra realización, la concentración de sacarosa es 1%. En otra realización, la concentración de sacarosa n otra realización, la concentración de sacarosa es 3%. En otra realización, la concentración de sacarosa n otra realización, la concentración de sacarosa es 5%. En otra realización, la concentración de sacarosa n otra realización, la concentración de sacarosa es 7%. En otra realización, la concentración de sacarosa

n otra realización, la concentración de sacarosa es 9%. En otra

realización, la concentración de sacarosa

En una realización, la concentración de polisorbato 20 está entre aproximadamente 0,005% y aproximadamente 0,5%.

En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre aproximadamente 0,005% y aproximadamente 0,1%.

En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre aproximadamente 0,005% y aproximadamente

0,05%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente

0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente

0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es aproximadamente 0,005%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es aproximadamente 0,001%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20

es aproximadamente 0,05%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es aproximadamente 0,01%. En

otra realización, la concentración de polisorbato 20 es aproximadamente 0,05%. En otra realización, la concentración

de polisorbato 20 es aproximadamente 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es aproximadamente 0,5%.

En una realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,005% y 0,5%. En otra realización, la concentración

de polisorbato 20 está entre 0,005% y 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,005%

y 0,05%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,01% y 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,5% y 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,005%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,001%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,05%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,01%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,05%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,5%.

En una realización, el pH está entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0. En otra realización, el pH está

entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 10,0. En otra realización, el pH está entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 7,0. En otra realización, el pH está entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 9,0. En otra realización, el pH está entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 9,0. En otra realización, el pH es aproximadamente 5,0. En otra realización, el pH es aproximadamente 6,0. En otra realización, el pH es aproximadamente 6,5. En otra realización, el pH es aproximadamente 7,0. En otra realización, el pH es aproximadamente 7,5. En otra realización, el pH es aproximadamente 8,0. En otra realización, el pH es aproximadamente 8,5. En otra realización, el pH es aproximadamente 9,0. En otra realización, el pH es aproximadamente 9,5. En otra realización, el pH es aproximadamente 10,0.

En una realización, el pH está entre 6,0 y 8,0. En otra realización, el pH está entre 4,0 y 10,0. En otra realización, el pH está entre 5,0 y 7,0. En otra realización, el pH está entre 5,0 y 9,0. En otra realización, el pH está entre 6,0 y 9,0. En otra realización, el pH es 5,0. En otra realización, el pH es 6,0. En otra realización, el pH es 6,5. En otra realización, el pH es 7,0. En otra realización, el pH es 7,5. En otra realización, el pH es 8,0. En otra realización, el pH es 8,5. En otra realización, el pH es 9,0. En otra realización, el pH es 9,5. En otra realización, el pH es 10,0.

En una realización, la concentración de proteína está entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 100 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 25 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre aproximadamente 1 ng/ml y aproximadamente 10 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre aproximadamente 5 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre aproximadamente 5 ng/ml y aproximadamente 25 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre aproximadamente 10 ng/ml y aproximadamente 100 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre aproximadamente 10 ng/ml y aproximadamente 50 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre aproximadamente 10 ng/ml y aproximadamente 25 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 1 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 5 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 10 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 20 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 30 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 40 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 50 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 60 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 70 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 80 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 90 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es aproximadamente 100 ng/ml.

En una realización, la concentración de proteína está entre 1 ng/ml y 100 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 1 ng/ml y 50 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 1 ng/ml y 25 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 1 ng/ml y 10 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 5 ng/ml y 50 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 5 ng/ml y 25 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 10 ng/ml y 100 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 10 ng/ml y 50 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 10 ng/ml y 25 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 1 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 5 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 10 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 20 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 30 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 40 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 50 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 60 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 70 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 80 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 90 ng/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 100 ng/ml.

En una realización específica, la invención proporciona una formulación proteínica sólida estable que comprende albúmina sérica bovina (BSA), fosfato potásico, manitol, sacarosa y polisorbato 20, en donde dicha concentración de proteína es aproximadamente 10 ng/ml, dicha concentración de BSA es aproximadamente 1%, dicha concentración de fosfato potásico es aproximadamente 10 mM, dicha concentración de manitol es aproximadamente 4%, dicha concentración de sacarosa es aproximadamente 2% y dicha concentración de polisorbato 20 es aproximadamente 0,05%. En una realización específica adicional, el pH de la susodicha formulación proteínica es aproximadamente 7,0.

En una realización adicional, la formulación proteínica sólida estable está liofilizada. La liofilización, también conocida como criosecado, es un procedimiento de deshidratación ampliamente usado para conservar un material (p. ej., proteínas), en el que el material se congela y deshidrata rápidamente mientras está bajo condiciones de vacío.

En otra realización, la invención proporciona un método para preparar una formulación proteínica sólida estable, comprendiendo dicho método: a) diluir dicha proteína con el tampón de liofilización de la invención; y b) liofilizar dicha proteína diluida.

Se divulga en la presente un estuche que comprende una formulación proteínica sólida estable de eritropoyetina y una formulación sólida estable de anticuerpo anti-eritropoyetina. Todos los reactivos del estuche pueden ser estables a temperatura ambiente. Todos los reactivos del estuche pueden ser estables en una amplia variedad de intervalos de temperatura según se describe previamente en la presente. El estuche puede comprender un anticuerpo antieritropoyetina conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) (p. ej. Cat. de Sigma n° P8375-250 KU); eritropoyetina humana recombinante (p. ej., Epogen®); solución de polisorbato sérico bovino (BSAT); tampón de lavado; revelador del color; y solución de dilución de eritropoyetina.

En una realización específica de la invención, la formulación de la invención no comprende histidina.

En una realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 30 días a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 60 días a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 90 días a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 120 días a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 6 meses a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 9 meses a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 12 meses a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 18 meses a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 24 meses a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 36 meses a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 48 meses a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 60 meses a 25 grados C, 40 grados C y 45 grados C.

En una realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 30 días a 25 grados C. En una realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 30 días a 40 grados C. En una realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 30 días a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 60 días a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 60 días a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 60 días a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 90 días a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 90 días a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 90 días a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 120 días a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 120 días a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 120 días a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 6 meses a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 6 meses a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 6 meses a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 9 meses a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 9 meses a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 9 meses a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 12 meses a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 12 meses a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 12 meses a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 18 meses a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 18 meses a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 18 meses a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 24 meses a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 24 meses a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 24 meses a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 36 meses a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 36 meses a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 36 meses a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 48 meses a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 48 meses a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 48 meses a 45 grados C.

En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 60 meses a 25 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 60 meses a 40 grados C. En otra realización, la formulación proteínica sólida estable es estable durante al menos 60 meses a 45 grados C.

En ciertas realizaciones, la proteína usada con las formulaciones y los tampones de liofilización de la invención es una glicoproteína. La proteína puede ser eritropoyetina. En otra realización, la proteína es un análogo de eritropoyetina. En una realización adicional, la proteína es darbepoetina alfa. La proteína puede ser un anticuerpo. La proteína puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

Eritropoyetina

La eritropoyetina es una hormona glicoproteínica implicada en la maduración de células progenitoras eritroides en eritrocitos. Es esencial en la regulación de los niveles de glóbulos rojos en circulación. La eritropoyetina presente en la naturaleza es producida por el hígado durante la vida fetal y por el riñón de adultos y circula en la sangre y estimula la producción de glóbulos rojos en la médula ósea. La anemia es casi invariablemente una consecuencia de la insuficiencia renal debida a una disminución en la producción de eritropoyetina a partir del riñón. Se ha encontrado que la eritropoyetina recombinante producida mediante técnicas de manipulación genética que implican la expresión de un producto proteínico a partir de una célula hospedadora transformada con el gen que codifica eritropoyetina es eficaz cuando se usa en el tratamiento de la anemia resultante de la insuficiencia renal crónica.

La identificación, la clonación y la expresión de genes que codifican eritropoyetina se describen en la Pat. EE. UU. N° 4.703.008 de Lin. Una descripción de la purificación de eritropoyetina recombinante desde medio celular que soportaba el crecimiento de células de mamífero que contenían plásmidos de eritropoyetina recombinante, por ejemplo, se incluye en la Pat. EE. UU. N° 4.667.016 de Lai y cols. La expresión y la recuperación de eritropoyetina recombinante biológicamente activa desde hospedadores de células de mamífero que contienen el gen de eritropoyetina sobre plásmidos recombinantes ha puesto a disposición cantidades de eritropoyetina adecuadas para aplicaciones terapéuticas. Se conocen las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de varias especies de eritropoyetina.

Actualmente, existen en el mercado varios productos farmacológicos de eritropoyetina humana recombinante (p. ej. Epogen®; epoetina alfa). Además de la epoetina alfa, existen otras epoetinas que se han desarrollado (p. ej., epoetina beta, delta, omega, zeta). En el contexto de la presente invención, se entiende que todas las formas de eritropoyetinas están abarcadas cuando se usa el término "eritropoyetina" o "eritropoyetina humana recombinante".

Anticuerpos

Se divulgan en la presente anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, muteínas de anticuerpo y variantes de anticuerpo, que se unen específicamente a eritropoyetina humana.

Los anticuerpos pueden comprender cualquier región constante conocida en la especialidad. La región constante de la cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de la cadena ligera tipo kappa o lambda, p. ej., una región constante de la cadena ligera tipo kappa o lambda humana. La región constante de la cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu, p. ej., una región constante de la cadena pesada tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu humana. En una realización, la región constante de la cadena ligera o pesada es una fragmento, un derivado, una variante o una muteína de una región constante presente en la naturaleza.

Se divulga en la presente un anticuerpo que comprende además los dominios constantes kappa o lamba de la cadena ligera o un fragmento de estos. Las secuencias de las regiones constantes de la cadena ligera y los polinucleótidos que las codifican son muy conocidos en la especialidad. Se divulga en la presente un anticuerpo que comprende además un dominio constante de la cadena pesada, o uno de sus fragmentos, tal como la región constante de la cadena pesada de IgG1 o IgG2, estas secuencias son muy conocidas en la especialidad.

Los anticuerpos de la presente invención incluyen los que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE y IgD) así como sus fragmentos Fab o F(ab')². Por otra parte, si se desea una IgG4, también se puede desear introducir una mutación puntual en la región de bisagra según se describe en Bloom y cols., 1997, Protein Science 6:407, para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro intra-H que pueden conducir a heterogeneidad en los anticuerpos de IgG4.

El término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, o uno de sus fragmentos de unión antigénica, según se describe a fondo en la sección de Definiciones. Un anticuerpo puede comprender una molécula de anticuerpo completa (incluyendo versiones policlonales, monoclonales, quiméricas, humanizadas o humanas que tienen cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa), o comprender uno de sus fragmentos de unión antigénica. Fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab')², Fab, Fab', Fv, Fc, y Fd, y se pueden incorporar en anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos monocatenarios, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase p. ej., Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). También se incluyen polipéptidos de anticuerpo tales como los divulgados en la Patente de EE. UU. N° 6.703.199, incluyendo monocuerpos polipeptídicos de fibronectina. Otros polipéptidos de anticuerpo se divulgan en la Publicación de Patente de EE. UU.

2005/0238646, que son polipéptidos monocatenarios. Se divulgan en la presente hibridomas capaces de producir los anticuerpos de la invención, y métodos para producir anticuerpos a partir de hibridomas, según se describe más adelante.

Se pueden preparar anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados mediante técnicas conocidas. Se divulga en la presente un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende el dominio variable de un anticuerpo murino (o la totalidad o parte de su sitio de unión antigénica) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión antigénica de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio de unión antigénica) derivado de un anticuerpo humano. Procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales manipulados incluyen los descritos en Riechmann y cols., 1988, Nature 332:323, Liu y cols., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439, Larrick y cols., 1989, Bio/Technology 7:934, y Winter y cols., 1993, TIPS 14:139. El anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo injertado en CDR. Técnicas para humanizar anticuerpos se divulgan, p. ej., en las Pat. de EE. UU. N° 5.869.619, 5.225.539, 5.821.337, 5.859.205, 6.881.557, Padlan y cols., 1995, FASEB J. 9:133-39, Tamura y cols., 2000, J. Immunol. 164:1432-41, Zhang, W., y cols., Molecular Immunology. 42(12):1445-1451,2005; Hwang W. y cols., Methods. 36(1):35-42, 2005; Dall'Acqua W f , y cols., Methods 36(1):43-60, 2005; y Clark, M., Immunology Today.

21 (8):397-402, 2000.

Un anticuerpo también puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos se pueden generar mediante cualquier número de técnicas con las que estén familiarizados los que tienen una experiencia normal en la especialidad. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, transformación con virus de Epstein Barr (EBV) de células de sangre periférica humana (p. ej., que contienen linfocitos B), inmunización in vitro de células B humanas, fusión de esplenocitos procedentes de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento desde fagotecas de la región V de inmunoglobulina humana u otros procedimientos que son conocidos en la especialidad y se basan en la presente divulgación.

Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos monoclonales humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se han preparado ratones en los que uno o más genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado por diversos medios. Se han introducido genes de inmunoglobulina humana en los ratones para reemplazar a los genes de ratón inactivados. En esta técnica, elementos del locus de las cadenas pesadas y ligeras humanas se introducen en cepas de ratones derivados de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones elegidas de los locus endógenos de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras (véase además Bruggemann y cols., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser construcciones minigénicas, o translocus sobre cromosomas artificiales de levadura, que sufren reordenación e hipermutación de ADN específicas de células B en el tejido linfoide del ratón.

Los anticuerpos producidos en el animal incorporan cadenas peptídicas de inmunoglobulina humana codificadas por el material genético humano introducido en el animal. Un animal no humano, tal como un ratón transgénico, se inmuniza con un inmunógeno de eritropoyetina humana adecuado.

Ejemplos de técnicas para la producción y el uso de animales transgénicos para la producción de anticuerpos humanos o parcialmente humanos se describen en las Patentes de EE. UU. 5.814.318, 5.569.825 y 5.545.806, Davis y cols., Production of human antibodies from transgenic mice en Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ: 191-200 (2003), Kellermann y cols., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel y cols., 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo y cols., 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Davis y cols., 1999, Cancer Metastasis Rev.

18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42, Green y cols., 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14, Tsuda y cols., 1997, Genomics. 42:413-21, Mendez y cols., 1997, Nat Genet. 15:146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones y cols., 1994, Immunity. 1:247-60, Green y cols., 1994, Nat Genet. 7:13-21, Jakobovits y cols., 1993, Nature.

362:255-58, Jakobovits y cols., 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90:2551-55. Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. "Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus." International Immunology 5 (1993): 647-656, Choi y cols., 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild y cols., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-51, Harding y cols., 1995, Annals of the New York Academy of Sciences, Lonberg y cols., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies en Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg y cols., 1995, Internal Review of Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826, Taylor y cols., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95, Taylor y cols., 1994, International Immunology 6: 579-91, Tomizuka y cols., 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka y cols., 2000, Proceedings de the National Academy de Sciences u Sa 97: 722-27, Tuaillon y cois., 1993, Proceedings of the National Academy de Sciences USA 90: 3720-24, y Tuaillon y cois., 1994, Journal de Immunology 152: 2912-20.; Lonberg y cols., Nature 368:856, 1994; Taylor y cols., Int. Immun. 6:579, 1994; la Patente de EE. UU. N° 5.877.397; Bruggemann y cols., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits y cols., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35. Además, protocolos que implican el XenoMouse® (Abgenix, ahora Amgen, Inc.) se describen, por ejemplo en los documentos U.S. 05/0118643 y WO 05/694879, WO 98/24838, WO 00/76310, y la Patente de e E. UU. 7.064.244.

Células linfoides procedentes de los ratones transgénicos inmunizados se fusionan con células de mieloma, por ejemplo, para producir hibridomas. Las células de mieloma para el uso en procedimientos de fusión de producción de hibridomas son preferiblemente células no productoras de anticuerpos, tienen una alta eficacia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento solamente de las células fusionadas deseadas (hibridomas). Ejemplos de líneas celulares adecuadas para el uso en estas fusiones incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8,653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LIc R-LON-HMy2 y UC729-6.

Las células linfoides (p. ej., del bazo) y las células de mieloma se pueden combinar durante unos pocos minutos con un agente promotor de la fusión membranaria, tal como polietilenglicol o un detergente iniónico, y a continuación sembrarse a baja densidad sobre un medio selectivo que soporta el crecimiento de células de hibridoma pero no células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente aproximadamente de una a dos semanas, se observan colonias de células. Se aíslan colonias individuales y los anticuerpos producidos por las células se pueden probar con respecto a la actividad de unión a eritropoyetina humana usando uno cualquiera de una variedad de inmunoensayos conocidos en la especialidad y descritos en la presente. Los hibridomas se clonan (p. ej., mediante clonación por dilución limitada o mediante aislamiento en placas de agar blando) y clones positivos que producen un anticuerpo específico para eritropoyetina humana se seleccionan y se cultivan. Los anticuerpos monoclonales procedentes de los cultivos de hibridoma se pueden aislar de los sobrenadantes de cultivos de hibridoma. Así, se divulgan en la presente hibridomas que comprenden polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención en los cromosomas de la célula. Estos hibridomas se pueden cultivar según métodos descritos en la presente y conocidos en la especialidad.

Otro método para generar anticuerpos humanos incluye inmortalizar células de sangre periférica humana mediante transformación con EBV. Véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 4.464.456. Esta línea de células B (o línea celular linfoblastoide) inmortalizada que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a eritropoyetina humana se puede identificar mediante métodos de inmunodetección como los proporcionados en la presente, por ejemplo, un ELISA, y a continuación se puede aislar mediante técnicas de clonación estándar. La estabilidad de la línea celular linfoblastoide que produce un anticuerpos anti-eritropoyetina humana se puede mejorar al fusionar la línea celular transformada con un mieloma murino para producir una línea celular híbrida de ratón-ser humano según métodos conocidos en la especialidad (véase, p. ej., Glasky y cols., Hybridoma 8:377-89 (1989)). Otro método más para generar anticuerpos monoclonales humanos es la inmunización in vitro, que incluye cebar células B esplénicas humanas con eritropoyetina humana, seguido por la fusión de las células B cebadas con un socio de fusión heterohíbrido. Véase, p. ej., Boerner y cols., 1991 J. Immunol. 147:86-95.

Se puede seleccionar una célula B que está produciendo un anticuerpo anti-eritropoyetina humana y las regiones variables de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas se pueden clonar a partir de la célula B según técnicas de biología molecular conocidas en la especialidad (documento WO 92/02551; Patente de EE. UU. 5.627.052; Babcook y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)) y descritas en la presente. Células B procedentes de un animal inmunizado se pueden aislar del bazo, un nódulo linfático o una muestra de sangre periférica al seleccionar una célula que esté produciendo un anticuerpo que se une específicamente a eritropoyetina humana. También se pueden aislar células B de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Métodos para detectar células B individuales que están produciendo un anticuerpo con la especificidad deseada son muy conocidos en la especialidad, por ejemplo, mediante formación de placas, clasificación celular activada por fluorescencia, estimulación in vitro seguida por detección de un anticuerpo específico, y similares. Métodos para la selección de células B productoras de anticuerpo específico incluyen, por ejemplo, preparar una suspensión monocelular de células B en agar blando que contiene eritropoyetina humana. La unión del anticuerpo específico producido por la célula B al antígeno da como resultado la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de que se seleccionen las células B que producen el anticuerpo deseado, los genes del anticuerpo específico se pueden clonar al aislar y amplificar ADN o ARNm según métodos conocidos en la especialidad y descritos en la presente.

Un método adicional para obtener anticuerpos es mediante exposición en fagos. Véanse, p. ej., Winter y cols., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton y cols., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Se pueden crear bibliotecas combinatorias de genes de regiones variables de inmunoglobulina humana o murina en vectores fágicos que se pueden cribar para seleccionar fragmentos de Ig (Fab, Fv, sFv, o sus multímeros) que se unen específicamente a proteína de unión a TGF-beta o una de sus variantes o fragmentos. Véanse, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 5.223.409; Huse y cols., 1989 Science 246:1275-81; Sastry y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 86:5728-32 (1989); Alting-Mees y cols., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang y cols., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 88:4363-66; Hoogenboom y cois., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch y cois., 1997 Hybridoma 16:47-52 y las referencias citadas en las mismas. Por ejemplo, una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de regiones variables de Ig se puede insertar en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una de sus variantes, en el marco con la secuencia que codifica una proteína de revestimiento del fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de revestimiento con el dominio de la región variable de la cadena ligera y/o con el dominio de la región variable de la cadena pesada. Fragmentos Fab de inmunoglobulina también se pueden exponer sobre una partícula fágica (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. No. 5.698.426).

También se pueden preparar bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulinas de las cadenas pesadas y ligeras en fago lambda, por ejemplo, usando los vectores AlmmunoZap™(H) y AImmunoZap™(L) (Stratagene, La Jolla, California). Brevemente, se aísla ARNm de una población de células B, y se usa para crear bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulinas de las cadenas pesadas y ligeras en los vectores AlmmunoZap(H) y AlmmunoZap(L). Estos vectores se pueden cribar individualmente o coexpresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse y cols., anteriormente; véase además Sastry y cols., anteriormente). Posteriormente, las placas positivas se pueden convertir en un plásmido no lítico que permite la expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpo monoclonal a partir de E. coli.

En un hibridoma, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal de interés se pueden amplificar usando cebadores nucleotídicos. Estos cebadores pueden ser sintetizados por un experto normal en la especialidad, o se pueden adquirir de fuentes disponibles comercialmente. (Véase, p. ej., Stratagene (La Jolla, California), que vende cebadores para regiones variables de ratón y ser humano incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa, VHb, Vhc, VHd, Ch1, Vl y CL). Estos cebadores se pueden usar para amplificar regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, que a continuación se pueden insertar en vectores tales como ImmunoZAP™H o ImmunoZAP™L (Stratagene), respectivamente. A continuación, estos vectores se pueden introducir en sistemas para expresión basados en E. coli, levadura o mamífero. Se pueden producir grandes cantidades de una proteína monocatenaria que contiene una fusión de los dominios Vh y Vl usando estos métodos (véase Bird y cols., Science 242:423-426, 1988).

Una vez que las células que producen anticuerpos según esto se han obtenido usando cualquiera de las técnicas de inmunización descritas anteriormente y otras, los genes del anticuerpo específico se pueden clonar al aislar y amplificar ADN o ARNm procedente de los mismos según procedimientos estándar como los descritos en la presente. Los anticuerpos producidos a partir de los mismos se pueden secuenciar y las CDRs se pueden identificar y el ADN que codifica las CDRs se puede manipular según se describe previamente para generar otros anticuerpos según la invención.

Se pueden generar anticuerpos al identificar en primer lugar anticuerpos que se unen a células que expresan eritropoyetina humana y/o compiten con respecto a la unión con los anticuerpos descritos en esta solicitud.

Se entenderá por un experto en la especialidad que algunas proteínas, tales como anticuerpos, pueden sufrir una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y el grado de estas modificaciones depende a menudo de la línea celular hospedadora usada para expresar la proteína así como las condiciones de cultivo. Estas modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilación, la oxidación de metionina, la formación de dicetopipericinas, la isomerización de aspartato y la desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxiterminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (según se describe en Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).

Un método alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singeneico, por ejemplo, un ratón que ha sido tratado (p. ej., cebado con pristano) para promover la formación de fluido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Estas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con proteína A Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2,9.3; Baines y cols., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado basándose en propiedades particulares del anticuerpo (p. ej., isotipo de la cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado sobre un soporte sólido, incluyen proteína A, proteína G, un anticuerpo anti-región constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo antiidiotípico y una proteína que se une a TGF-beta, o uno de sus fragmentos o variantes.

La evolución molecular de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) en el centro del sitio de unión del anticuerpo también se ha usado para aislar anticuerpos con afinidad incrementada, por ejemplo, anticuerpos que tienen una afinidad incrementada para c-erbB-2, según se describe por Schier y cols., 1996, J. Mol. Biol. 263:551. Según esto, estas técnicas son útiles para preparar anticuerpos para eritropoyetina humana.

Los anticuerpos dirigidos contra eritropoyetina humana se pueden usar, por ejemplo, en ensayos para detectar la presencia de eritropoyetina humana, bien in vitro o bien in vivo.

Los anticuerpos también se pueden preparar mediante cualquiera de un número de técnicas convencionales. Por ejemplo, se pueden purificar de células que los expresan naturalmente (p. ej., un anticuerpo se puede purificar de un hibridoma que lo produce), o producirse en sistemas de expresión recombinantes, usando cualquier técnica conocida en la especialidad. Véanse, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet y cols. (eds.), Plenum Press, New York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Esto se analiza en la sección de ácidos nucleicos posterior.

Cuando se desee mejorar la afinidad de los anticuerpos según la invención que contienen una o más de las susodichas CDRs, se pueden obtener mediante un número de protocolos de maduración por afinidad incluyendo mantenimiento de las CDRs (Yang y cols., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), intercambio de cadenas (Marks y cols., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutación de E. coli. (Low y cols., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), intercambio de ADN (Patten y cols., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), exposición en fagos (Thompson y cols., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) y técnicas de PCR adicionales (Crameri, y cols., Nature, 391, 288-291, 1998). Todos estos métodos de maduración por afinidad son analizados por Vaughan y cols. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

Conjugados

Se pueden conjugar agentes a los anticuerpos divulgados. Estos anticuerpos pueden ser útiles para detectar la presencia o ausencia de proteínas recombinantes, tales como, pero no limitadas a, eritropoyetina. Estos conjugados se pueden generar como proteínas de fusión. Numerosas proteínas, enzimas, florocromos, isótopos u otros marcadores detectables se pueden conjugar opcionalmente a los anticuerpos. Opcionalmente, los anticuerpos pueden estar conectados covalentemente o no covalentemente a este marcador detectable.

Marcadores detectables adecuados para este uso incluyen, pero no se limitan a, diversas enzimas, tales como, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero no limitados a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no limitados a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero no limitados a, luciferasa, luciferina y acuorina; materiales radiactivos, tales como, pero no limitados a, yodo (131I, 125I, 123I, y 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In y 111In), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Sn; y metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión positrónica e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.

Se contemplan modificaciones covalentes de los anticuerpos. Se pueden elaborar mediante síntesis química o mediante escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo anti-eritropoyetina humana se introducen en la molécula al hacer reaccionar residuos de aminoácido elegidos del anticuerpo con un agente derivador orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N o C-terminales.

Lo más comúnmente, los residuos cisteinilo se hacer reaccionar con alfa-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. De forma similar, también se pueden usar reactivos yodados. Los residuos cisteinilo se derivan mediante una reacción con bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridildisulfuro de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidilo se derivan mediante una reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 debido a que este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el para-bromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisilo y aminoterminales se hacen reaccionar con anhídrido de ácido succínico u otro ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de invertir el cambio de los residuos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivar residuos que contienen amino en alfa y/o residuos que contienen amino en e incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona y reacción con glioxato catalizada por transaminasa.

Los residuos arginilo se modifican mediante la reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanidiona y ninhidrina. Generalmente, la derivación de residuos arginilo requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo con funcionalidad guanidina. Por otra parte, estos reactivos pueden reaccionar con grupos amino en épsilon de lisina así como el grupo amino en épsilon de arginina.

La modificación específica de residuos tirosilo se puede realizar, con particular interés en la introducción de marcadores espectrales en residuos tirosilo mediante la reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Lo más comúnmente, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y derivados nitrados en 3, respectivamente. Los residuos tirosilo se yodan usando I125 o I131 para preparar proteínas marcadas para el uso en un radioinmunoensayo.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante la reacción con carbodiimidas (R-N==C==N-R'), donde R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1 -etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Por otra parte, los residuos aspartilo y glutamilo se convierten en residuos asparaginilo y glutamininlo mediante la reacción con iones amonio.

Los residuos glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente hasta los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente. Estos residuos se desamidan bajo condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos residuos se encuentra dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilación de los grupos amino en alfa de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente implica acoplar químicamente o enzimáticamente glucósidos al anticuerpo. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la producción del anticuerpo en una célula hospedadora que tenga capacidades de glicosilación para la glicosilación conectada a N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el azúcar o los azúcares pueden estar empalmados a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 publicado el 11 sep. 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

Ensayos

La invención se puede usar para ensayar la presencia o ausencia de proteínas recombinantes, tales como eritropoyetina humana, en una muestra usando métodos inmunohistológicos clásicos como los descritos en la presente o como se conoce por los expertos en la especialidad (p. ej., véanse Jalkanen y cols., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; y Jalkanen y cols., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096). Otros ejemplos no limitativos de métodos inmunológicos útiles para detectar la expresión de genes de proteínas incluyen inmunoensayos. Marcadores adecuados para ensayos de anticuerpos son conocidos en la especialidad y ejemplos no limitativos se describen en la presente. Los anticuerpos anti-eritropoyetina humana se pueden marcar, según se describe en la presente.

También se divulga la detección de la presencia de un complejo anticuerpo-antígeno que comprende un anticuerpo que se une selectivamente a una proteína, tal como eritropoyetina. Se prevé que se puede usar cualquier sistema de detección para poner en práctica aspectos de este método inmunológico, con la condición de que la relación de señal a ruido pueda distinguir hasta un grado estadísticamente significativo la señal procedente del complejo anticuerpoantígeno de la señal de fondo. Ejemplos no limitativos de sistemas de detección inmunológicos incluyen análisis de inmunotransferencia, como transferencia Western y transferencia por puntos, análisis de inmunoprecipitación, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) y ELISA tipo sándwich. La detección de la señal se puede alcanzar usando autorradiografía con obtención de imágenes u obtención de imágenes fosforescente (AU), quimioluminiscencia (CL), electroquimioluminiscencia (ECL), bioluminiscencia (BL), fluorescencia, transferencia de energía de resonancia, polarización plana, colorimetría o citometría de flujo (FC). Descripciones de sistemas de detección inmunológicos se divulgan en, p. ej., Michael M. Rauhut, Chemiluminescence, En Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology (Ed. Grayson, 3a ed, John Wiley and Sons, 1985); A. W. Knight, A Review of Recent Trends in Analytical Applications of Electrogenerated Chemiluminescence, Trends Anal. Chem. 18(1): 47-62 (1999); K. A. Fahnrich, y cols., Recent Applications of Electrogenerated Chemiluminescence in Chemical Analysis, Talanta 54(4): 531-559 (2001); Commonly Used Techniques in Molecular Cloning, pp. A8,1-A8-55 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3.sup.rd ed. 2001); Detection Systems, pp. A9.1-A9-49 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3.sup.rd ed. 2001); Electrogenerated Chemiluminescence, (Ed. Allen J. Bard, Marcel Dekker, Inc., 2004).

Un ELISA tipo sándwich (o inmunoensayo tipo sándwich) es un método basado en dos anticuerpos, que se unen a diferentes epítopos sobre el antígeno. Un anticuerpo de captura que tiene una alta especificidad de unión para el antígeno de interés se une a una superficie sólida. A continuación, se añade el antígeno seguido por la adición de un segundo anticuerpo denominado anticuerpo de detección. El anticuerpo de detección se une al antígeno en un epítopo diferente que el anticuerpo de captura. Por lo tanto, el antígeno está 'emparedado' entre los dos anticuerpos. La afinidad de unión del anticuerpo para el antígeno es habitualmente el principal determinante de la sensibilidad del inmunoensayo. A medida que se incrementa la concentración de antígeno, se incrementa la cantidad de anticuerpo de detección conduciendo a una respuesta medida superior. Para cuantificar el nivel de unión, se pueden usar diferentes sistemas indicadores, tales como, p. ej., una enzima empalmada al anticuerpo secundario y un sustrato indicador en el que la reacción enzimática forma una lectura como la señal de detección. La señal generada es proporcional a la cantidad de antígeno elegido presente en la muestra. El sustrato indicador usado para medir el episodio de unión determina el modo de detección. Un lector de placas espectrofotométrico se usa para la detección colorimétrica. Se han desarrollado sustratos quimioluminiscentes y electroquimioluminiscentes que amplifican adicionalmente la señal y se pueden leer en un lector luminiscente. El indicador también puede ser una lectura fluorescente en el que la etapa enzimática del ensayo se reemplaza por un fluoróforo y a continuación se mide la lectura usando un lector fluorescente. Reactivos y protocolos necesarios para realizar un ELISA tipo sándwich ECL están disponibles comercialmente, incluyendo, pero no limitados a, la plataforma de detección de ELISA tipo sándwich-ECL MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Md.).

Se divulga en la presente un método para detectar la presencia de eritropoyetina humana en una muestra. El método puede comprender poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-eritropoyetina humana bajo condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-eritropoyetina humana a eritropoyetina humana, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-eritropoyetina humana y la eritropoyetina humana.

Los anticuerpos anti-eritropoyetina humana se pueden inmovilizar sobre una matriz insoluble. La inmovilización implica separar el anticuerpo anti-eritropoyetina humana de cualquier eritropoyetina humana que quede libre en solución. Esto se efectúa convencionalmente bien al insolubilizar el anticuerpo anti-eritropoyetina humana antes del procedimiento de ensayo, como mediante la adsorción a una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich y cols., Pat. EE. UU. N° 3.720.760), bien mediante acoplamiento covalente (por ejemplo, usando reticulación con glutaraldehído), o bien al insolubilizar el anticuerpo anti-eritropoyetina humana después de la formación de un complejo entre el anticuerpo antieritropoyetina humana y la eritropoyetina humana, p. ej., mediante inmunoprecipitación.

Se divulga en la presente un método inmunológico para detectar proteínas, tales como eritropoyetina, recombinantes. Los métodos inmunológicos divulgados en la presente memoria descriptiva se pueden evaluar mediante varios parámetros incluyendo, p. ej., fidelidad, precisión, límite de detección (LOD), límites de cuantificación (LOQ), intervalo lineal, especificidad, selectividad, linealidad, robustez e idoneidad del sistema. La fidelidad de un método es la medida de la exactitud de un método analítico, o la proximidad de concordancia entre el valor medido y el valor que es aceptado como un valor cierto convencional o un valor de referencia aceptado. La precisión de un método es el grado de concordancia entre resultados de pruebas individuales, cuando el procedimiento se aplica repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea. Como tal, la precisión evalúa 1) la variabilidad dentro del ensayo; 2) la variabilidad dentro del día (repetitividad); y 3) la variabilidad entre días (precisión intermedia); y 4) la variabilidad entre laboratorios (reproducibilidad). El coeficiente de variación (CV %) es una medida cuantitativa de la precisión expresada con relación al valor medio observado o teórico.

Un método inmunológico divulgado en la presente memoria descriptiva debe ser capaz de detectar, sobre el fondo, la presencia de un complejo anticuerpo-antígeno. El límite de detección (LOD) de un método se refiere a la concentración de analito que da lugar a una señal que es significativamente diferente del control negativo o el blanco y representa la concentración más baja de analito que se puede distinguir del fondo. Así, el método inmunológico divulgado en la presente memoria descriptiva puede detectar el LOD en una cantidad que es significativamente diferente de un control negativo o blanco.

Los límites de cuantificación (LOQ) son las concentraciones más baja y más alta de analito en una muestra o un espécimen que se pueden medir con un nivel aceptable de fidelidad y precisión. El límite de cuantificación inferior se refiere a la dosis más baja que puede medir un método de detección coherentemente desde el fondo. El límite de cuantificación superior es la dosis más alta que puede medir un método de detección coherentemente antes de que se produzca la saturación de la señal. El intervalo lineal del método es la zona entre los límites de cuantificación inferior y superior. El intervalo lineal se calcula al sustraer el límite de cuantificación inferior del límite de cuantificación superior. Así, en una realización, el método inmunológico divulgado en la presente memoria descriptiva puede detectar el LOQ a una cantidad que es significativamente diferente de un control negativo o un blanco.

Se divulga en la presente un anticuerpo conectado a un soporte en fase sólida. Según se usa en la presente, el término "soporte en fase sólida" es sinónimo de "fase sólida " y se refiere a cualquier matriz que se pueda usar para inmovilizar un anticuerpo divulgado en la presente memoria descriptiva. Ejemplos no limitativos de soportes en fase sólida incluyen, p. ej., un tubo; una placa; una columna; varillas o "varillas de nivel"; una partícula magnética, una cuenta u otro medio cromatográfico esférico o fibroso, tal como, p. ej., agarosa, Sepharose, sílice y plástico; y láminas o membranas, tales como, p. ej., nitrocelulosa y poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF). El soporte en fase sólida se puede construir usando una amplia variedad de materiales tales como, p. ej., vidrio, carbono, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, diazocelulosa o almidón. El soporte en fase sólida seleccionado puede tener una propiedad física que lo hace fácilmente separable de material soluble o no unido y generalmente permite que los materiales no unidos, tales como, p. ej., reactivos en exceso, subproductos de reacción o disolventes, se separen o retiren de otro modo (p. ej., mediante lavado, filtración, centrifugación, etc.) del componente de ensayo unido al soporte en fase sólida. Ejemplos no limitativos de cómo elaborar y usar soportes en fase sólida se describen, p. ej., en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, anteriormente, (2001); y Current Protocols in Molecular Biology, anteriormente, (2004).

Habiéndose descrito la invención, se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración, y no de limitación. EJEMPLOS

Ejemplo 1:

SUMARIO DE EXPERIMENTOS

Se diluyeron anti-EPO de conejo-HRP hasta 10 ng/ml usando tampón de liofilización (LBT: 1% de BSA, 10 mM de fosfato potásico, 4% de manitol, 2% de sacarosa, 0,05% de polisorbato 20, pH 7,0) y se tomó una parte alícuota de 2 ml en un vial de 5 cc antes de la liofilización. Este conjugado liofilizado (10 ng/ml) se reconstituyó con 2 ml de agua y se usó para el análisis de una muestra. El conjugado liofilizado se puede almacenar a temperatura ambiente durante hasta 1 año y se puede probar con respecto a la estabilidad del conjugado mediante ELISA a los 3 meses, 6 meses y 1 año si se requiere con respecto a la estabilidad. Se formuló Epogen a granel en el mismo tampón de formulación (LBT: 1% de BSA, 10 mM de fosfato potásico, 4% de manitol, 2% de sacarosa, 0,05% de polisorbato 20, pH 7,0) para ser 2000 U/ml en un vual de 5 cc.

MATERIALES Y EQUIPO

Materiales

Rb Anti-EPO HRP: 0,63 mg/ml (630 ng/ul), 0,67 ml/vial

EPO: RB-EPO FPB, 3,84 mg/ml

Tampón de form ulación:

1x PBS: Solución salina tamponada con fosfato

8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH²PO⁴en 800 ml de agua destilada y el pH se ajustó hasta 7,4 con HCl y se añadió agua para formar 1 litro

Tampón de dilución de muestras (BSAT):

1% de Albúmina sérica bovina en 1x PBS con 0,05% de polisorbato 20

Tampón de liofilización (LBT):

1% de BSA, 10 mM de fosfato potásico, 4% de manitol, 2% de sacarosa, 0,05% de polisorbato 20, pH 7,0 Equipo

Instrumento de liofilización B2

Viales de 5 cc

Tapón para liofilización

PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA

Preparación de muestras para el conjugado:

Cada muestra se diluyó según la tabla de muestras posterior (Tabla 1) para formar 10 ng/ml con tampón de liofilización (LBT). Se pipetearon 2 ml de muestra en un vial de a 5 cc. Las muestras se liofilizaron según el procedimiento. Después de la liofilización, las muestras se almacenaron a temperatura ambiente. La muestra se reconstituyó con 2 ml de agua por cada placa antes del uso

Tabla 1. Esquema de dilución de muestras para la form ulación de liofilización de conjugado

Preparación para EPO:

Cada muestra se diluyó según la tabla de muestras posterior (Tabla 2) para formar 16,8 ug/ml (2019 U/ml) con tampón de liofilización (LBT), 2 ml de muestra se pipetearon en un vial de 5 cc.

Las muestras se liofilizaron según el procedimiento. Después de la liofilización, las muestras se almacenaron a temperatura ambiente. La muestra se reconstituyó con 2 ml de agua por cada placa antes del uso.

Tabla 2. Esquema de dilución de muestras para la formulación de liofilización de EPO

Preparación de placebo

Se pipetearon 2 ml de LBT en un vial de 5 cc y se liofilizaron con la muestra. Se elaboraron 20 viales.

Procedimiento de liofilización

Los viales de muestra se cargaron en estantes 'prerrefrigerados’ (4°C) de un liofilizador. Las muestras se sometieron a tres etapas de congelación, secado primario y secado secundario. En primer lugar las muestras se mantuvieron durante 30 minutos a 4°C y a continuación se enfriaron de 4°C a -45°C a lo largo de 123 minutos y se mantuvieron a -45°C durante 180 minutos. La temperatura del estante se elevó hasta -12°C a lo largo de 150 minutos y se mantuvo a -12°C durante 240 minutos. A continuación, la temperatura se disminuyó hasta -45°C de nuevo a lo largo de 150 min y se mantuvo a -45°C durante 120 minutos. Para el secado primario, el vacío de la cámara se disminuyó hasta 120 mTorr y el condensador se enfrió hasta menos de -50°C. Posteriormente, la temperatura del estante se elevó hasta -10°C y se mantuvo durante 25 horas manteniendo el vacío de la cámara a 120 mTorr. Para el secado secundario, la temperatura del estante se elevó hasta 25°C a lo largo de 234 min mientras la presión de la cámara se disminuía hasta 100 mTorr. Después de que la temperatura del estante se mantuviera a 25°C durante 11 horas mientras se mantenía la presión de la cámara a 100 mTorr. Después de la terminación de la etapa de secado secundaria, los viales se taparon dentro de la cámara de secado a una presión de la cámara de 9/10 de una atmósfera.

Preparación de medios

Ensayo ELISA para EPO

La placa se revistió con Mu anti-EPO F12 frente a Mu anti EPO D11 a 2,5 ug/ml. Se incubaron patrones de EPO. La eritropoyetina se unió al anticuerpo inmovilizado sobre la placa. Después de retirar el patrón en exceso, los pocillos se incubaron con Rb anti-EPO HRP a una concentración de 10 ng/ml. Durante este período de incubación, el conjugado se unió a la EPO inmovilizada. El conjugado en exceso de retiró mediante lavado. Se añadió Chromagen y se oxidó mediante la reacción enzimática para formar un complejo de color azul y a continuación la reacción se detuvo mediante la adición del ácido, ácido fosfórico 1 M, que pasaba de azul a amarillo. La placa se leyó a 450-650 nm. Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 1.

Prueba de Estabilidad

Las muestras se almacenaron a 25°C y 40°C para ser probadas durante hasta 1 año con respecto a la estabilidad. Estas muestras se pueden probar al menos en tiempo cero, 3 meses, 6 meses y 1 año mediante ELISA.

La presente invención no se ha de limitar en alcance por las realizaciones específicas descritas en la presente, que están destinadas a ser simples ilustraciones de aspectos individuales de la invención, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes son invención. En efecto, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, se harán evidentes para los expertos en la especialidad a partir de la descripción precedente y los dibujos adjuntos. Estas modificaciones están destinadas a encontrarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación proteínica sólida estable que comprende albúmina sérica bovina (BSA), fosfato potásico, manitol, sacarosa y polisorbato 20, en donde dicha proteína es darbepoetina.

2. Un tampón de liofilización que comprende albúmina sérica bovina (BSA), fosfato potásico, manitol, sacarosa y polisorbato 20, en donde opcionalmente el tampón comprende además darbepoetina.

3. La formulación según la reivindicación 1 o el tampón según la reivindicación 2, en donde la concentración de BSA está entre 0,1% y 10%.

4. La formulación según la reivindicación 1 o el tampón según la reivindicación 2, en donde la concentración de fosfato potásico está entre 1 mM y 100 mM.

5. La formulación según la reivindicación 1 o el tampón según la reivindicación 2, en donde la concentración de manitol está entre 1% y 10%.

6. La formulación según la reivindicación 1 o el tampón según la reivindicación 2, en donde la concentración de sacarosa está entre 1% y 10%.

7. La formulación según la reivindicación 1 o el tampón según la reivindicación 2, en donde la concentración de polisorbato 20 está entre 0,005% y 0,5%.

8. La formulación según la reivindicación 1 o el tampón según la reivindicación 2, en donde el pH está entre 6,0 y 8,0.

9. La formulación según la reivindicación 1 o el tampón según la reivindicación 2, en donde la concentración de proteína está entre 1 ng/ml y 100 ng/ml.

10. La formulación o el tampón según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha formulación está liofilizada.

11. La formulación o el tampón según la reivindicación 10, en donde dicha formulación está reconstituida con agua.

12. Un método para preparar una formulación proteínica sólida estable, comprendiendo dicho método:

a) diluir dicha proteína con el tampón de liofilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11; y b) liofilizar dicha proteína diluida.