ES2857751T3

ES2857751T3 - Métodos para predecir secuencias de virus ancestrales y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2857751T3
Application number: ES18190809T
Authority: ES
Inventors: Luk H Vandenberghe; Eric Zinn
Original assignee: Massachusetts Eye and Ear Infirmary; Schepens Eye Research Institute Inc
Current assignee: Schepens Eye Research Institute Inc; Massachusetts Eye and Ear
Priority date: 2013-10-11
Filing date: 2014-10-10
Publication date: 2021-09-29
Anticipated expiration: 2034-10-10
Also published as: US20160215024A1; JP2016536011A; AU2018200657B2; AU2014331708A1; AU2021290371A1; JP6754477B2; US20220017875A1; JP2022046460A; JP7200332B2; PT3459965T; CA3182790A1; AU2021290371B2; WO2015054653A2; JP7595731B2; LT3459965T; JP2019213528A; CN115141259A; AU2023226672B2; US12359174B2; CN106232618A

Abstract

Un polipéptido de cápside de virus adenoasociado (AAV) que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 23.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para predecir secuencias de virus ancestrales y usos de los mismos

Campo técnico

Generalmente esta divulgación se refiere a virus.

Antecedentes

Eludir y evitar una respuesta inmunitaria neutralizante o tóxica contra un vector de terapia génica es un desafío importante con todos los tipos de vectores de transferencia génica. Hasta la fecha, la transferencia génica se logra de manera más eficiente utilizando vectores basados en virus que circulan en seres humanos y animales, por ejemplo, adenovirus y virus adenoasociados (AAV). Sin embargo, si los sujetos han sido infectados de forma natural con un virus, un tratamiento posterior con un vector basado en ese virus conlleva un aumento de los riesgos de seguridad y una menor eficiencia de la transferencia génica debido a las respuestas inmunitarias celulares y humorales. Los antígenos de cápside son los principales responsables de la inmunidad innata y/o adaptativa hacia las partículas víricas, sin embargo, los polipéptidos codificados por genes víricos también pueden ser inmunógenos.

Calcedo et al., 2009 divulga la seroprevalencia mundial hacia varios tipos de AAV diferentes.

Resumen

La invención se define por las reivindicaciones.

Esta divulgación describe métodos para predecir y sintetizar secuencias víricas ancestrales o porciones de las mismas, y también describe partículas víricas que contienen tales secuencias víricas ancestrales. Los métodos descritos en el presente documento se aplicaron al virus adenoasociados (AAV); por lo tanto, esta divulgación describe secuencias de AAV ancestrales predichas y partículas de virus de AAV que contienen tales secuencias de AAV ancestrales. Esta divulgación también describe la reducida seroprevalencia presentada por partículas víricas que contienen secuencias ancestrales en relación con partículas víricas que contienen secuencias contemporáneas. En un aspecto, esta divulgación incluye polipéptidos de cápside de virus adenoasociado (AAV), por ejemplo, polipéptidos de cápside de AAV sintéticos y/o artificiales, que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 y 17. En algunas implementaciones, los polipéptidos de cápside de AAV o partículas víricas que comprenden los polipéptidos de cápside de AAV presentan una menor seroprevalencia que polipéptido de cápside de AAV2 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV2, y los polipéptidos de cápside de AAV o partículas víricas que comprenden los polipéptidos de cápside de AAV presentan una seroprevalencia igual o inferior a la de un polipéptido de cápside de AAV8 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV8. En algunas formas de realización, los polipéptidos de cápside de AAV o partículas víricas que comprenden los polipéptidos de cápside de AAV se neutralizan en una menor medida por suero humano que un polipéptido de cápside de AAV2 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV2, y los polipéptidos de cápside de AAV o partículas víricas que comprenden los polipéptidos de cápside de AAV se neutralizan en una menor medida o similar por suero humano que un polipéptido de cápside de AAV8 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV8. En algunas formas de realización, los polipéptidos de cápside de a Av están purificados. Los polipéptidos de cápside de AAV proporcionados en el presente documento pueden codificarse por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, y 18.

En un aspecto, la divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico sintéticas y/o artificiales, que codifican un polipéptido de cápside de virus adenoasociado (AAV) que tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, y 18. También se proporcionan vectores que incluyen tal ácido nucleico, y una célula huésped que incluye tal vector.

En otro aspecto, la divulgación proporciona partículas víricas purificadas que incluyen un polipéptido de cápside de AAV descrito en el presente documento. En algunas formas de realización, las partículas víricas incluyen un transgén.

En otros aspectos, la divulgación proporciona polipéptidos de cápside de virus adenoasociado (AAV), por ejemplo, polipéptidos de cápside de AAV sintéticos y/o artificiales, que tienen al menos el 95% (por ejemplo, 97, 98, 99 o el 100%) de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26. En algunas formas de realización, los polipéptidos de cápside de AAV o partículas víricas que comprenden el polipéptido de cápside de AAV presentan una menor seroprevalencia que un polipéptido de cápside de AAV2 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV2, y el polipéptido de cápside de AAV o una partícula vírica que comprende el polipéptido de cápside de AAV presentan una seroprevalencia aproximadamente igual o inferior a la de un polipéptido de cápside de AAV8 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV8. En algunas formas de realización, los polipéptidos de cápside de AAV o partículas víricas que comprenden el polipéptido de cápside de AAV se neutralizan en una menor medida por suero humano que un polipéptido de cápside de AAV2 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de ^aAV2, y el polipéptido de cápside de AAV o una partícula vírica que comprende el polipéptido de cápside de AAV se neutraliza en una menor medida o similar por suero humano que un polipéptido de cápside de AAV8 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV8. En algunas formas de realización, los polipéptidos de cápside de AAV están purificados.

En otro aspecto, los polipéptidos de cápside de AAV descritos en el presente documento pueden codificarse por secuencias de ácidos nucleicos como se describe en el presente documento. En una implementación, la divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de cápside de virus adenoasociado (AAV), en las que las moléculas de ácido nucleico tienen al menos el 95% (por ejemplo, 97, 98, 99 o el 100%) de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico como se muestra en el presente documento. La divulgación también proporciona vectores que incluyen dichas moléculas de ácido nucleico, como son las células huésped que incluyen tal vector.

En un aspecto, la divulgación proporciona partículas víricas que incluyen al menos uno de los polipéptidos de cápside de AAV descritos en el presente documento. En algunas formas de realización, las partículas víricas incluyen un transgén.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona métodos de administración de una partícula vírica como se describe en el presente documento a un sujeto que necesita transferencia génica o vacunación. En algunas formas de realización, las partículas víricas presentan menos seroprevalencia que una partícula vírica AAV2. En algunas formas de realización, las partículas víricas presentan aproximadamente la misma o menos seroprevalencia que una partícula vírica AAV8. En algunas formas de realización, las partículas víricas se neutralizan en una menor medida por suero humano que una partícula vírica de AAV2, y las partículas víricas de AAV se neutralizan en una menor medida o similar por suero humano que una partícula de virus de AAV8.

En un aspecto, la divulgación proporciona métodos de administración de un antígeno diana unido operativamente a un polipéptido de cápside de AAV como se describe en el presente documento a un sujeto que necesita vacunación. En algunas formas de realización, los polipéptidos de cápside de AAV presentan menos seroprevalencia que un polipéptido de cápside de AAV2. En algunas formas de realización, el polipéptido de cápside de AAV presenta aproximadamente la misma o menos seroprevalencia que un polipéptido de cápside de AAV8. En algunas formas de realización, los polipéptidos de cápside de AAV se neutralizan en una menor medida por suero humano que un polipéptido de cápside de AAV2, y el polipéptido de cápside de AAV se neutraliza en una menor medida o similar en suero humano que un polipéptido de cápside de AAV8.

En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos in silicio para predecir una secuencia de un virus ancestral o una porción del mismo. Dichos métodos típicamente incluyen proporcionar secuencias de nucleótidos o aminoácidos de una pluralidad de virus contemporáneos o porciones de los mismos; alinear las secuencias utilizando un algoritmo de alineamiento múltiple de secuencias (MSA); modelar la evolución para obtener una filogenia ancestral predicha de la pluralidad de virus contemporáneos o porciones de los mismos; estimar, en un nodo filogénico de la filogenia ancestral predicha, la probabilidad evolutiva de un nucleótido particular o un residuo de aminoácido en cada posición de la secuencia; y predecir, basándose en la probabilidad estimada en cada posición, una secuencia de un virus ancestral o una porción del mismo.

En algunas formas de realización de la presente divulgación, una o más, o todas, las etapas se realizan usando un procesador informático. En algunas formas de realización de la presente divulgación, el algoritmo MSA usa información filogenética para predecir si un hueco en el alineamiento es resultado de una eliminación o una inserción. En algunas formas de realización de la presente divulgación, el algoritmo MSA es un kit de alineamiento probabilístico (PRANK). En algunas formas de realización de la presente divulgación, el modelo utilizado para modelar la evolución se selecciona utilizando el criterio de información de Akaike (AIC). En algunas formas de realización de la presente divulgación, la filogenia ancestral predicha se obtiene utilizando un modelo JTT con un modelo de distribución gamma ("+G") y un cálculo de frecuencia de ni ("+F"). En algunas formas de realización de la presente divulgación, la modelación de la etapa de evolución se realiza utilizando un modelo JTT+G+F. En algunas formas de realización de la presente divulgación, los métodos incluyen la síntesis, basada en la secuencia predicha, del virus ancestral o una porción del mismo. En algunas formas de realización de la presente divulgación, los métodos incluyen ensamblar el virus ancestral o una porción del mismo en una partícula de virus ancestral.

En algunas formas de realización, los métodos también incluyen cribar la partícula de virus ancestral para al menos uno de los siguientes: (a) replicación; (b) propiedades de transferencia génica; (c) unión al receptor; o (d) seroprevalencia. En algunas formas de realización, las partículas de virus ancestrales presentan menos seroprevalencia que una partícula vírica ensamblada de al menos una de la pluralidad de virus contemporáneos o porciones de los mismos. En algunas formas de realización, la partícula vírica ancestral se neutraliza en menor medida por suero humano que una partícula vírica ensamblada a partir de al menos uno de la pluralidad de virus contemporáneos o porciones de los mismos. En algunas formas de realización, la pluralidad de virus contemporáneos o porciones de los mismos, pertenecen a una familia seleccionada del grupo que consiste en adenovirus (AV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), retrovirus, lentivirus, virus del herpes simple (VHS), virus vaccinia, virus de la viruela, virus de influenza, virus sincitial de las vías respiratorias, virus parainfluenza y virus espumoso.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona virus ancestrales o porciones de los mismos que muestran una susceptibilidad reducida a la inmunidad preexistente en las poblaciones humanas actuales en comparación con los virus contemporáneos o porciones de los mismos. Generalmente, la susceptibilidad reducida a la inmunidad preexistente mostrada por los virus ancestrales o porciones de los mismos en las poblaciones humanas actuales se refleja como una susceptibilidad reducida a anticuerpos neutralizantes.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenecen los métodos y composiciones de la materia. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en el ensayo de los métodos y composiciones de materia, a continuación, se describen los métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Descripción de los dibujos

El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado a color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.

La Figura 1 es un esquema que muestra las relaciones entre las infecciones víricas ancestrales/contemporáneas y la respuesta inmunitaria del huésped ancestral/contemporánea.

Las Figuras 2A a 2D son una serie de esquemas que muestran un ejemplo de un procedimiento de reconstrucción ancestral. Los datos mostrados están extraídos de un conjunto de datos completo y representan los residuos 564-584 (numeración VP1 de AAV2).

Las Figuras 3A a 3C juntas ilustran un árbol filogenético de secuencias contemporáneas de AAV generadas usando los métodos descritos en el presente documento.

Las Figuras 4A y 4B juntas ilustran un alineamiento de polipéptidos de VP 1 de AAV ancestrales.

Las Figuras 5A y 5B juntas ilustran un alineamiento de polipéptidos de VP1 de AAV ancestrales funcionales y polipéptidos de VP1 de AAV contemporáneos.

La Figura 6 es un gel electroforético que demuestra que las secuencias de VP1 de AAV ancestrales se transcriben y se someten a corte y empalme alternativamente de una manera similar a la de las secuencias de VP1 de AAV contemporáneas.

La Figura 7 es un gráfico que muestra la actividad de la luciferasa en células HEK293 transducidas con vectores de AAV ancestrales.

La Figura 9 es un gráfico que muestra la comparación de secuencias (% por encima de la diagonal, N.° de diferencias de aa a continuación) entre la biblioteca Anc80 y Anc80L65.

Las Figuras 10A-D son imágenes de resultados experimentales que demuestran que Anc80L65 es capaz de ensamblar y producir partículas de alto título. El panel A muestra que Anc80L65 es capaz de producir rendimientos vectoriales equivalentes a AAV2; el panel B es una imagen TEM de partículas víricas que incluyen Anc80L65; el panel C muestra que las partículas víricas que incluyen Anc80L65 son capaces de producir proteínas VP1, 2 y 3 de cap de AAV basadas en gel SDS-PAG^een condiciones de desnaturalización; y el panel D muestra una transferencia Western de Anc80L65 utilizando el anticuerpo de cápside AAV, B1.

Las Figuras 11A-C son imágenes de resultados experimentales que demuestran que Anc80L65 es capaz de infectar células in vitro en células HEK293 usando GFP como lectura (Panel A) o luciferasa (Panel B) en comparación con los controles de AAV2 y/o AAV8 y también es eficaz en el direccionamiento al hígado después de una inyección IV de AAV que codifica un transgén LacZ nuclear (fila superior, Panel C: hígado), después de la inyección IM directa de un AAV que codifica una GFP (fila central, Panel C: músculo), y después de la inyección subretiniana con un AAV que codifica GFP (fila inferior, Panel C: retina).

Las Figuras 13A y 13B son matrices de identidad de secuencia que producen el uso de MAFFT que muestran las secuencias de aminoácidos de las proteínas VP1 de vectores ancestrales alineadas con las de los AAV existentes representativos (Figura 13A), y las secuencias de aminoácidos de las proteínas VP3 de vectores ancestrales alineadas con las de AAV existentes representativos (Figura 13B).

La Figura 14 es un gráfico que demuestra que los vectores de AAV se produjeron por triplicado en pequeña escala (placas de 6 pocillos). Los virus en bruto se evaluaron mediante qPCR para determinar la producción absoluta de cada vector.

La Figura 15 es una tabla que muestra los títulos de cada vector, promediados y comparados, con los de AAV8. La Figura 16 son fotografías que muestran los resultados de los experimentos en los que se añadieron 1,9E3 GC/célula de cada vector a las células HEK293 (excepto para Anc126, en cuyo caso se lograron MOI de 2,5E2 -3,1E2 GC/célula). Sesenta horas más tarde, la infectividad se evaluó utilizando microscopía de fluorescencia. La Figura 17 es un gráfico que muestra los resultados de experimentos en los que las mismas células de la Figura 16 se lisaron y se analizaron para determinar la expresión de luciferasa. Como en la Figura 16, Anc126 no se controló de título con los otros vectores, sino que varió desde una MOI de 2,5E2 - 3,1E2 GC/celda.

La Figura 18 es una tabla que muestra la luminiscencia de las células transducidas por cada vector, que se promediaron y compararon con las de AAV8.

La Figura 19 es un gráfico que proporciona un resumen de experimentos in vitro para determinar la producción relativa y la infectividad de los vectores de AAV ancestrales descritos en el presente documento.

Descripción detallada

La transferencia génica, ya sea con fines experimentales o terapéuticos, se basa en un vector o sistema vectorial para transferir información genética a las células diana. El vector o sistema de vectores se considera el principal determinante de la eficiencia, especificidad, respuesta del huésped, farmacología y longevidad de la reacción de transferencia génica. Actualmente, la forma más eficiente y eficaz de lograr la transferencia génica es a través del uso de vectores o sistemas de vectores basados en virus que se han hecho defectuosos en la replicación.

Sin embargo, los estudios de seroprevalencia indican que se han expuesto previamente proporciones significativas de poblaciones humanas en todo el mundo (por ejemplo, por infección natural) a un gran número de los virus utilizados actualmente en la transferencia génica y, por lo tanto, albergan inmunidad preexistente. Se sabe que los anticuerpos neutralizantes hacia el vector viral en estos individuos expuestos previamente limitan, a veces significativamente, la extensión de la transferencia génica o incluso redirigen el virus lejos de la diana. Véanse, por ejemplo, Calcedo et al. (2009, J. Infect. Dis., 199:381-90) y Boutin et al. (2010, Human Gene Ther., 21:704-12). Por lo tanto, la presente divulgación se basa en el reconocimiento de que los virus ancestrales o porciones de los mismos presentan una susceptibilidad reducida a la inmunidad preexistente (por ejemplo, una susceptibilidad reducida a anticuerpos neutralizantes) en las poblaciones humanas actuales en comparación con los virus contemporáneos o porciones de los mismos.

La Figura 1 es un esquema que muestra las relaciones entre las infecciones víricas ancestrales y contemporáneas y la respuesta inmunitaria del huésped ancestral y contemporánea. La Figura 1 muestra cómo los AAV ancestrales pueden ser refractarios a la inmunidad preexistente contemporánea. Se presume que un virus contemporáneo existente (Vc) ha evolucionado a partir de una especie ancestral (Vanc), principalmente bajo presiones evolutivas de la inmunidad del huésped a través de mecanismos de escape inmunológico. Cada una de estas especies, Vanc y Vc, tienen la capacidad de inducir inmunidad adaptativa, incluyendo la inmunidad de linfocitos B y T (Ianc y Ic, respectivamente). Se formuló la hipótesis, y se confirmó en el presente documento, de que la inmunidad inducida por virus contemporáneos no necesariamente reacciona de forma cruzada con una especie vírica ancestral, que puede ser sustancialmente diferente en términos de la composición de epítopo que el virus existente.

Esta divulgación proporciona métodos para predecir la secuencia de un virus ancestral o una porción del mismo. Una o más de las secuencias de virus ancestrales predichas utilizando los métodos descritos en el presente documento se pueden generar y ensamblar en una partícula vírica. Como se demuestra en el presente documento, las partículas víricas ensambladas a partir de secuencias víricas ancestrales predichas pueden presentar menos, a veces significativamente menos, seroprevalencia que las partículas víricas contemporáneas actuales. Por lo tanto, las secuencias de virus ancestrales divulgadas en el presente documento son adecuadas para su uso en vectores o sistemas de vectores para la transferencia génica.

Métodos para predecir y sintetizar una secuencia vírica ancestral

Para predecir una secuencia vírica ancestral, las secuencias de nucleótidos o aminoácidos primero se compilan a partir de una pluralidad de virus contemporáneos o porciones de los mismos. Si bien los métodos descritos en el presente documento se ilustraron utilizando secuencias de cápside de virus adenoasociado (AAV), los mismos métodos se pueden aplicar a otras secuencias de AAV (por ejemplo, el genoma completo, secuencias rep, secuencias ⁱT^r) o cualquier otro virus o porción del mismo. Los virus distintos de AAV incluyen, sin limitación, adenovirus (AV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), retrovirus, lentivirus, virus del herpes simple (HSV), sarampión, virus vaccinia, virus de la viruela, virus de la influenza, virus sincitial de las vías respiratorias, virus parainfluenza, virus espumoso, o cualquier otro virus para el cual la inmunidad preexistente se considere un problema.

Se pueden usar secuencias de tan solo dos virus contemporáneos o porciones de los mismos, sin embargo, se entiende que es deseable un mayor número de secuencias de virus contemporáneos o porciones de los mismos para incluir la mayor parte del paisaje de la diversidad de secuencia diaria moderna posible, pero también porque un número mayor de secuencias puede aumentar las capacidades predictivas de los algoritmos descritos y utilizados. Por ejemplo, se pueden usar secuencias de 10 o más virus contemporáneos o porciones de los mismos, secuencias de 50 o más virus contemporáneos o porciones de los mismos, o secuencias de 100 o más virus contemporáneos o porciones de los mismos.

Dichas secuencias se pueden obtener, por ejemplo, de cualquier número de bases de datos públicas incluyendo, sin limitación, GenBank, UniProt, EMBL, Colaboración internacional de bases de datos de secuencias de nucleótidos (INSDC), o el Archivo europeo de nucleótidos. Adicionalmente, o como alternativa, dichas secuencias pueden obtenerse de una base de datos que sea específica de un organismo en particular (por ejemplo, la base de datos de VIH). Las secuencias contemporáneas pueden corresponder a todo el genoma, o solo se puede usar una porción del genoma, tal como, sin limitación, secuencias que codifican uno o más componentes de la cápside vírica, la proteína de replicación, o las secuencias ITR.

A continuación, las secuencias contemporáneas se alinean utilizando un algoritmo de alineamiento múltiple de secuencias (MSA). La Figura 2(a) es un esquema que muestra un alineamiento múltiple de secuencias. Los algoritmos MSA se conocen bien en la técnica y generalmente están diseñados para aplicarse a conjuntos de datos de diferentes tamaños y diferentes entradas (por ejemplo, ácido nucleico o proteína), y para alinear las secuencias de una manera particular (por ejemplo, programación dinámica, progresiva, heurística) y aplicar diferentes esquemas de puntuación en el alineamiento (por ejemplo, basado en matriz o basado en consistencia, por ejemplo, mínima entropía, suma de pares, matriz de similitud, puntuaciones de huecos). Los algoritmos MSA ya conocidos incluyen, por ejemplo, ClustalW (Thompson et al., 1994, Nuc. Acids Res., 22:4673-90), Kalign (Lassmann et al., 2006, Nuc. Acids Res., 34:W596-99), MAFFT (Katoh et al., 2005, Nuc. Acids Res., 33:511-8), MUSCLE (Edgar, 2004, BMC Bioinform., 5:113), y T-Coffee (Notredame et al., 2000, J. Mol. Biol., 302:205-17).

Como se describe en el presente documento, una de las características principales al seleccionar un algoritmo MSA para su uso en los métodos descritos en el presente documento es la manera en que el algoritmo trata un hueco en el alineamiento. A los huecos en un alineamiento de secuencias se les puede asignar un valor de penalización que es dependiente o independiente del tamaño del hueco. En los presentes métodos, se prefiere que el algoritmo MSA utilizado en los métodos descritos en el presente documento aplique información filogenética para predecir si un hueco en el alineamiento es el resultado de una eliminación o una inserción en oposición a un tratamiento sesgado, no filogenético de huecos debido, por ejemplo, a inserciones y/o eliminaciones. Un método adecuado para tratar los huecos en los alineamientos y el análisis evolutivo se describe en Loytynoja y Goldman, 2008, Science, 320:1632-5, y los algoritmos disponibles comercialmente que aplican huecos en los alineamientos de una manera que es adecuada para su uso en los métodos descritos en el presente documento son un kit de alineamiento probabilístico (PRANK; Goldman Group Software; Loytynoja y Goldman, 2005, PNAS USA, 102:10557-62), y variaciones del algoritmo PRANK.

Luego se aplica un modelo evolutivo al alineamiento resultante para obtener una filogenia ancestral predicha (véase la Figura 2(b)). Existe una serie de modelos evolutivos disponibles en la técnica, cada uno de los cuales aplica matrices de tasas de reemplazo ligeramente diferentes para los aminoácidos. Sin limitación, los algoritmos para aplicar modelos de evolución incluyen los modelos de Dayhoff (por ejemplo, PAM120, PAM160, PAM250; Dayhoff et al., 1978, In Atlas of Protein Sequence and Structure (ed. Dayhoff), págs. 345-52, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C.), el modelo JTT (Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82), el modelo WAG (Whelan y Goldman, 2001, Mol. Biol. Evol., 18:691-9), y los modelos Blosum (por ejemplo, Blosum45, Blosum62, Blosum80; Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS USA, 89:10915-9).

Además, las restricciones que la estructura y la función imponen en un modelo evolutivo pueden modelarse, por ejemplo, considerando que algunas posiciones son invariantes ("+I"; Reeves, 1992, J. Mol. Evol., 35:17-31), que algunas posiciones experimentan diferentes tasas de cambio ("+G"; Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401), y/o que las frecuencias de equilibrio de nucleótidos o aminoácidos son las mismas que las del alineamiento ("+F"; Cao et al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27).

La idoneidad de uno o más modelos de evolución puede evaluarse utilizando el criterio de información de Aikake (AIC; Akaike, 1973, In Second International Symposium on Information Theory, Petrov y Csaki, eds., págs. 267-81, Budapest, Akademiai Kiado), el criterio de información bayesiano (BIC; Schwarz, 1978, Ann. Statist. 6:461-4), o variaciones o combinaciones de los mismos. Además, se puede usar AIC, BIC, o variaciones o combinaciones de los mismos para evaluar la importancia relativa de incluir uno o más parámetros (por ejemplo, las restricciones analizadas anteriormente) en el modelo evolutivo.

Como se explica en la sección de Ejemplos a continuación, ProTest3 (Darriba et al., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5) se puede usar para determinar, en función del AIC más bajo, que un algoritmo JTT+G+F fue el modelo más adecuado para la evolución de AAV. También se entenderá por un experto en la técnica que un algoritmo JTT+G+F también se puede usar para predecir secuencias víricas ancestrales distintas de los polipéptidos de cápside de AAV, sin embargo, un experto en la técnica también entenderá que, dependiendo del conjunto de datos y la puntuación de aptitud, puede ser más adecuado un modelo diferente de evolución.

Una vez que se ha seleccionado un modelo de evolución y se ha determinado su aptitud, se puede construir un árbol filogenético de las secuencias víricas o porciones de las mismas. La construcción de árboles filogenéticos es conocida en la técnica y típicamente emplea métodos de máxima probabilidad tales como los implementados por PhyML (Guindon y Gascuel, 2003, Systematic Biology, 52:696-704)), MOLPHY (Adachi y Hasegawa, 1996, ed. Tokyo Institute of Statistical Mathematics), BioNJ (Gascuel, 1997, Mol. Biol. Evol., 14:685-95), o PHYLIP (Felsenstein, 1973, Systematic Biology, 22:240-9). Un experto en la materia entenderá que es deseable un equilibrio entre la complejidad computacional y la bondad del ajuste en un modelo de sustituciones de aminoácidos.

Si se desea, el árbol filogenético puede evaluarse para determinar su importancia. Se dispone de varios métodos estadísticos y se utilizan de forma rutinaria para evaluar la importancia de un modelo incluyendo, sin limitación, muestreo con reemplazo, jackknife, validación cruzada, pruebas de permutación o combinaciones o variaciones de los mismos. La importancia también puede evaluarse utilizando, por ejemplo, una prueba de razón de verosimilitud aproximada (aLRT; Anisimova y Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52)).

En cualquier nodo filogenético de la filogenia (por ejemplo, un nodo filogenético interior), la secuencia se puede reconstruir estimando la probabilidad evolutiva de un residuo particular de nucleótido o de aminoácido en cada posición de la secuencia (Figura 2(c)). Un nodo filogénico se refiere a un punto de ramificación evolutivo intermedio dentro de la filogenia ancestral predicha. Como se usa en el presente documento, la "probabilidad evolutiva" se refiere a la probabilidad de la presencia de un nucleótido o aminoácido particular en una posición particular basada en un modelo evolutivo en oposición a un modelo que no tiene en cuenta, por ejemplo, un cambio evolutivo en el uso del codón. Los modelos ejemplares que tienen en cuenta la probabilidad evolutiva de un residuo de nucleótido de aminoácido particular en una posición particular pueden estimarse utilizando, por ejemplo, cualquier número de métodos de máxima verosimilitud que incluyen, sin limitación, el análisis filogenético por máxima verosimilitud (PAML; Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6) o análisis filogenético usando parsimonia (PAUP; Sinauer Assoc., Inc., Sunderland, MA).

En base a la probabilidad evolutiva estimada de un residuo de nucleótido o aminoácido particular en cada posición, la secuencia predicha de un virus ancestral o una porción del mismo, puede ensamblarse para formar una secuencia completa o parcial sintética de ácido nucleico o polipéptido. Si se desea, puede calcularse la verosimilitud de que cualquier residuo se encuentre en un estado determinado en un nodo determinado a lo largo del nodo, y se puede identificar cualquier posición a lo largo de la secuencia que tenga una verosimilitud posterior calculada por debajo de un umbral particular (Figura 2(d)). De esta manera, se puede generar una secuencia de andamiaje ancestral, que puede incluir variaciones en aquellas posiciones que tienen una probabilidad por debajo del umbral particular.

Si la secuencia ancestral que se predice usando los métodos en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico, la secuencia puede optimizarse entonces por codón de modo que se pueda traducir de manera eficiente en una secuencia de aminoácidos. Se conocen en la técnica las tablas de uso de codones para diferentes organismos. Opcionalmente, sin embargo, se puede diseñar una tabla de uso de codones basada en una o más secuencias contemporáneas que tiene homología (por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia) con la secuencia de andamiaje ancestral, y una secuencia ancestral como se describe en el presente documento puede optimizarse por codones para el uso de codones mamíferos (por ejemplo, un ser humano).

Cualquiera o todas las etapas descritas en el presente documento para predecir una secuencia vírica ancestral se pueden realizar o simular en un ordenador (por ejemplo, in silicio) usando un procesador o un microprocesador.

Secuencias de andamiaje de virus adenoasociados (AAV) ancestrales

Los métodos descritos en el presente documento se aplicaron a virus adenoasociados (AAV) utilizando secuencias de cápside contemporáneas (descritas en detalle en los Ejemplos a continuación). El AAV es ampliamente considerado como un vector de transferencia génica terapéutico y un vehículo de vacuna genético, pero presenta una alta seroprevalencia en poblaciones humanas. Usando los métodos descritos en el presente documento, un árbol filogenético se ensambló utilizando secuencias de AAV contemporáneas (véanse las Figuras 3A-3C) y se obtuvieron secuencias de andamiaje ancestrales predichas en el nodo filogenético designado (Tabla 1). Como se usa en el presente documento, una secuencia de andamiaje ancestral se refiere a una secuencia que se construye usando los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, usando probabilidades evolutivas y modelos evolutivos) y no se sabe que hayan existido en la naturaleza. Como se usa en el presente documento, las secuencias de andamiaje ancestrales son diferentes de las secuencias consenso, que se construyen típicamente usando la frecuencia de los nucleótidos o residuos de aminoácidos en una posición particular.

Tabla 1.

La secuencia de andamiaje del polipéptido Anc80 se muestra en la SEQ ID NO:1, que está codificada por la secuencia de andamiaje del ácido nucleico Anc80 que se muestra en la SEQ ID NO:2. La secuencia de andamiaje de Anc80 contiene 11 posiciones en las que cualquiera de los dos residuos era probable. Por lo tanto, la secuencia de andamiaje de Anc80 representa 2048 (211) secuencias diferentes.

Para demostrar la eficacia de los métodos descritos en el presente documento para predecir la secuencia ancestral de un virus o porción del mismo, se generó una biblioteca de las 2048 secuencias ancestrales predichas en el nodo Anc80 de AAV y, como se describe en el presente documento, se demostró que forman partículas víricas viables que presentan menos seroprevalencia, en algunos casos, significativamente menos seroprevalencia, que las partículas víricas ensambladas con polipéptidos de cápside contemporáneos.

Métodos para hacer partículas víricas ancestrales

Después de que se haya obtenido la secuencia ancestral predicha de un virus o porción del mismo, la molécula y/o el polipéptido o polipéptidos de ácido nucleico real pueden generarse, por ejemplo, sintetizarse. Los métodos para generar una molécula o polipéptido de ácido nucleico artificial basado en una secuencia obtenida, por ejemplo, in silicio, se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, síntesis química o clonación recombinante. Se conocen en la técnica métodos adicionales para generar moléculas o polipéptidos de ácido nucleico y se describen con más detalle a continuación.

Una vez que se ha producido un polipéptido ancestral, o una vez que se ha generado y expresado una molécula de ácido nucleico ancestral para producir un polipéptido ancestral, el polipéptido ancestral puede ensamblarse en una partícula de virus ancestral usando, por ejemplo, una célula huésped empaquetadora. Los componentes de una partícula vírica (por ejemplo, secuencias rep, secuencias cap, secuencias de repetición terminales invertidas (ITR)) pueden introducirse, de forma transitoria o estable, en una célula huésped empaquetadora utilizando uno o más vectores como se describe en el presente documento. Uno o más de los componentes de una partícula vírica se pueden basar en una secuencia ancestral predicha como se describe en el presente documento, mientras que los componentes restantes se pueden basar en secuencias contemporáneas. En algunos casos, toda la partícula vírica puede basarse en secuencias ancestrales predichas.

Dichas partículas víricas ancestrales pueden purificarse usando métodos de rutina. Como se usa en el presente documento, las partículas víricas "purificadas" se refieren a partículas víricas que se eliminan de los componentes en la mezcla en la que se fabricaron, tales como, pero sin limitación, componentes víricos (por ejemplo, secuencias rep, secuencias cap), células huésped empaquetadoras, y partículas víricas ensambladas parcialmente o de forma incompleta.

Una vez ensambladas, las partículas víricas ancestrales pueden cribarse, por ejemplo, para determinar la capacidad de replicación; las propiedades de la transferencia génica; la capacidad de unión al receptor; y/o la seroprevalencia en una población (por ejemplo, una población humana). Determinar si una partícula vírica puede replicarse es rutinario en la técnica y típicamente incluye infectar una célula huésped con una cantidad de partículas víricas y determinar si las partículas víricas aumentan en número con el tiempo. Determinar si una partícula vírica es capaz de realizar la transferencia génica también es rutinario en la técnica e incluye típicamente infectar células huésped con partículas víricas que contienen un transgén (por ejemplo, un transgén detectable tal como un gen indicador, analizado con más detalle más adelante a continuación). Tras la infección y la eliminación del virus, las células huésped pueden evaluarse para determinar la presencia o ausencia del transgén. La determinación de si una partícula de virus se une a su receptor es habitual en la técnica, y dichos métodos pueden realizarse in vitro o in vivo.

La determinación de la seroprevalencia de una partícula vírica se realiza de forma rutinaria en la técnica y típicamente incluye el uso de un inmunoensayo para determinar la prevalencia de uno o más anticuerpos en muestras (por ejemplo, muestras de sangre) de una población particular de individuos. La seroprevalencia se entiende en la técnica que se refiere a la proporción de sujetos en una población que es seropositiva (es decir, ha sido expuesta a un patógeno o inmunógeno en particular), y se calcula como el número de sujetos en una población que producen un anticuerpo contra un patógeno o inmunógeno particular dividido por el número total de individuos en la población examinada. Los inmunoensayos se conocen bien en la técnica e incluyen, sin limitación, una inmunotransferencia, transferencia Western, inmunoensayos enzimáticos (EIA), inmunoensayo enzimático ligado a enzimas (ELISA), o radioinmunoensayo (RIA). Como se indica en el presente documento, las partículas víricas ancestrales presentan menos seroprevalencia que las partículas víricas contemporáneas (es decir, partículas víricas ensambladas que usan secuencias víricas contemporáneas o porciones de las mismas). Simplemente a modo de ejemplo, véanse Xu et al. (2007, Am. J. Obstet. Gynecol., 196:43.e1-6); Paul et al. (1994, J. Infect. Dis., 169:801-6); Sauerbrei et al. (2011, Eurosurv., 16(44):3); y Sakhria et al. (2013, PLoS Negl. Trop. Dis., 7:e2429), cada uno de los cuales determinó la seroprevalencia para un anticuerpo en particular en una población dada.

Como se describe en el presente documento, las partículas víricas ancestrales se neutralizan por el sistema inmunitario de una persona, por ejemplo, del paciente, en menor medida que las partículas víricas contemporáneas. Se dispone de varios métodos para determinar la extensión de los anticuerpos neutralizantes en una muestra de suero. Por ejemplo, un ensayo de anticuerpos neutralizantes mide el título en el que una muestra experimental contiene una concentración de anticuerpos que neutraliza la infección en un 50% o más en comparación con una muestra de control sin anticuerpo. Véanse, también, Fisher et al. (1997, Nature Med., 3:306-12) y Manning et al.

(1998, Human Gene Ther., 9:477-85).

Con respecto a los polipéptidos de cápside de AAV ancestrales ilustrados en el presente documento, la seroprevalencia y/o el grado de neutralización pueden compararse, por ejemplo, con un polipéptido de cápside de AAV8 o partícula vírica que incluye un polipéptido de cápside de AAV8, o un polipéptido de cápside de AAV2 o partícula vírica que incluye un polipéptido de cápside de AAV2. Generalmente, en la técnica se entiende que los polipéptidos de cápside de AAV8 o partículas víricas presentan una seroprevalencia, y una neutralización resultante, en la población humana que se considera baja, mientras que el polipéptido de cápside de AAV2 o partículas víricas presentan una seroprevalencia y una neutralización resultante, en la población humana que se considera alta. Obviamente, la seroprevalencia particular dependerá de la población examinada, así como los métodos inmunológicos utilizados, pero hay informes de que AAV8 presenta una seroprevalencia de aproximadamente el 22% hasta aproximadamente el 38%, mientras que AAV2 presenta una seroprevalencia de aproximadamente el 43,5% hasta aproximadamente el 72%. Véanse, por ejemplo, Boutin et al., 2010, "Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against AAV types 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors", Hum. Gene Ther., 21:704-12. Véase, también, Calcedo et al., 2009, J. Infect. Dis., 199:381-90.

Ácido nucleico ancestral predicho y secuencias de polipéptidos ancestrales de virus adenoasociado (AAV)

Se secuenciaron varios clones diferentes de la genoteca que codificaba polipéptidos de cápside ancestrales predichos del nodo Anc80, y las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de cápside ancestrales predichos de AAV representativos se muestran en la SEQ ID NO: 19 (Anc80L27); SEQ ID NO: 20 (Anc80L59); SEQ ID NO: 21 (Anc80L60); SEQ ID NO: 22 (Anc80L62); SEQ ID NO: 23 (Anc80L65); SEQ ID NO: 24 (Anc80L33); SEQ ID NO: 25 (Anc80L36); y SEQ ID NO:26 (Anc80L44). Los expertos en la técnica apreciarán que la secuencia de ácido nucleico que codifica cada secuencia de aminoácidos puede determinarse fácilmente.

Además de los polipéptidos de cápside ancestral predichos que tienen las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26, se proporcionan polipéptidos que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% de identidad de secuencia) con los polipéptidos de cápside ancestral predichos que tienen las secuencias que se muestran en las SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o 26. De forma similar, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100% de identidad de secuencia) con las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de cápside ancestrales (es decir, que tienen al menos un 95% de identidad de secuencia).

En el cálculo del porcentaje de identidad de secuencia, se alinean dos secuencias y se determina el número de coincidencias idénticas de nucleótidos o residuos de aminoácidos entre las dos secuencias. El número de coincidencias idénticas se divide por la longitud de la región alineada (es decir, el número de nucleótidos o residuos de aminoácidos alineados) y se multiplica por 100 para llegar a un porcentaje de valor de identidad de secuencia. Se apreciará que la longitud de la región alineada puede ser una porción de una o ambas secuencias hasta el tamaño de longitud completa de la secuencia más corta. También se apreciará que una única secuencia puede alinearse con más de una secuencia diferente y, por lo tanto, puede tener diferentes valores de porcentaje de identidad de secuencia en cada región alineada.

El alineamiento de dos o más secuencias para determinar el porcentaje de identidad de secuencia puede realizarse utilizando el algoritmo descrito por Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res., 25:33893402) como se incorpora en los programas BLAST (herramienta de búsqueda de alineamiento local básico), disponibles en ncbi.nlm.nih.gov en Internet. Se pueden realizar búsquedas de BLAST para determinar el porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia (ácido nucleico o aminoácido) y cualquier otra secuencia o porción de la misma alineada usando el algoritmo de Altschul et al. BLASTN es el programa usado para alinear y comparar la identidad entre secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP es el programa usado para alinear y comparar la identidad entre secuencias de aminoácidos. Cuando se utilizan programas BLAST para calcular el porcentaje de identidad entre una secuencia y otra secuencia, generalmente se usan los parámetros predeterminados de los programas respectivos.

Se muestran alineamientos representativos en las Figuras 4A y 4B y en las Figuras 5A y 5B. Las Figuras 4A y 4B muestran un alineamiento de polipéptidos de cápside de VP1 de AAV ancestrales, designados como Anc80L65 (SEQ ID NO: 23), Anc80L27 (SEQ ID NO: 19), Anc80L33 (SEQ ID NO: 24), Anc80L36 (SEQ ID NO: 25), Anc80L44 (SEQ ID NO: 26), Anc80L59 (SEQ ID NO: 20), Anc80L60 (SEQ ID NO: 21), y Anc80L62 (SEQ ID NO: 22). El alineamiento mostrado en las Figuras 4A y 4B confirma la variación predicha en cada uno de los 11 sitios, y una única mutación no sinónima en la posición 609E de Anc80L60 (SEQ ID NO: 21), que puede ser un artefacto de clonación. Las Figuras 5A y 5B muestran un alineamiento entre los polipéptidos de cápside de VP1 de AAV ancestrales (Anc80L65 (SEQ ID NO: 23), Anc80L27 (SEQ ID NO: 19), Anc80L33 (SEQ ID NO: 24), Anc80L36 (SEQ ID NO: 25), Anc80L60 (SEQ ID NO: 21), Anc80L62 (SEQ ID NO: 22), Anc80L44 (SEQ ID NO: 26), y Anc80L59 (SEQ ID NO: 20)) y los polipéptidos de cápside de VP1 de AAV contemporáneos (AAV8 (SEQ ID NO: 27), AAV9 (SEQ ID NO: 28), AAV6 (SEQ ID NO: 29), AAV1 (SEQ ID NO: 30), AAV2 (SEQ ID NO: 31), AAV3 (SEQ ID NO: 32), AAV3B (SEQ ⁱD NO: 33), y AAV7 (SEQ ID NO: 34)). El alineamiento en las Figuras 5A y 5^bmuestra que las secuencias de AAV ancestrales tienen entre aproximadamente el 85% y el 91% de identidad de secuencia con las secuencias de AAV contemporáneas.

También se proporcionan vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos. Los vectores, incluidos los vectores de expresión, están disponibles comercialmente o pueden producirse mediante tecnología recombinante. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico puede tener uno o más elementos para la expresión unidos operativamente a tal molécula de ácido nucleico, y además puede incluir secuencias tales como las que codifican un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos), y/o aquellas que se pueden usar en la purificación de un polipéptido (por ejemplo, la etiqueta 6xHis). Los elementos para la expresión incluyen secuencias de ácido nucleico que dirigen y regulan la expresión de secuencias codificantes de ácido nucleico. Un ejemplo de un elemento de expresión es una secuencia promotora. Los elementos de expresión también pueden incluir uno o más de intrones, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta o elementos inducibles que modulan la expresión de una molécula de ácido nucleico. Los elementos de expresión pueden ser de origen bacteriano, levadura, insecto, mamífero o vírico y los vectores pueden contener una combinación de elementos de expresión de diferentes orígenes. Como se usa en el presente documento, unido operativamente significa que los elementos para la expresión se colocan en un vector con respecto a una secuencia codificante de tal manera que dirijan o regulen la expresión de la secuencia codificante.

Una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico en un vector (por ejemplo, un vector de expresión, un vector vírico) puede introducirse en una célula huésped. El término "célula huésped" se refiere no solo a la célula o células en particular en las que se ha introducido la molécula de ácido nucleico, sino también a la progenie o posible progenie de tal célula. Los expertos en la técnica conocen muchas células huésped adecuadas; las células huésped pueden ser células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células de levadura, células de insecto, células vegetales, células de mamífero). Las células huésped representativas pueden incluir, sin limitación, A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, células 293, Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 y fibroblastos primarios, hepatocitos y células de mioblastos derivadas de mamíferos, incluyendo seres humanos, monos, ratones, ratas, conejos y hámsteres. Los métodos para introducir moléculas de ácido nucleico en células huésped se conocen bien en la técnica e incluyen, sin limitación, precipitación con fosfato de calcio, electroporación, choque térmico, lipofección, microinyección y transferencia de ácido nucleico mediada por virus (por ejemplo, transducción).

Con respecto a los polipéptidos, "purificado" se refiere a un polipéptido (es decir, un péptido o un polipéptido) que se ha separado o purificado a partir de componentes celulares que lo acompañan de forma natural. Típicamente, el polipéptido se considera "purificado" cuando está al menos el 70% (por ejemplo, al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o el 99%) en peso seco, libre de los polipéptidos y moléculas de origen natural con las que se asocia de forma natural. Dado que un polipéptido que se sintetiza químicamente está, por naturaleza, separado de los componentes que lo acompañan de forma natural, un polipéptido sintético se considera "purificado", pero puede eliminarse adicionalmente de los componentes utilizados para sintetizar el polipéptido (por ejemplo, residuos de aminoácidos). Con respecto a las moléculas de ácido nucleico, "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que usualmente están asociadas con ésta en el genoma. Además, una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir una molécula de ácido nucleico modificada por ingeniería genética, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante o sintética.

Los polipéptidos se pueden obtener (por ejemplo, purificar) a partir de fuentes naturales (por ejemplo, una muestra biológica) mediante métodos conocidos tales como intercambio iónico DEAE, filtración en gel, y/o cromatografía de hidroxiapatita. También se puede obtener un polipéptido purificado, por ejemplo, expresando una molécula de ácido nucleico en un vector de expresión o mediante síntesis química. El grado de pureza de un polipéptido se puede medir utilizando cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis por HPLC. De manera similar, las moléculas de ácido nucleico se pueden obtener (por ejemplo, aislar) utilizando métodos de rutina tales como, sin limitación, tecnología de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, digestión con enzimas de restricción y ligadura) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). Además, las moléculas de ácido nucleico aisladas se pueden sintetizar químicamente.

Métodos de uso de virus ancestrales o porciones de los mismos

Un virus ancestral o una porción del mismo como se describe en el presente documento, particularmente aquellos que presentan una seroprevalencia reducida en relación con los virus contemporáneos o porciones de los mismos, se puede usar en varias aplicaciones de investigación y/o terapéuticas. Por ejemplo, un virus ancestral o una porción del mismo, como se describe en el presente documento, se puede usar en medicina humana o animal para terapia génica (por ejemplo, en un vector o sistema de vectores para transferencia génica) o para vacunación (por ejemplo, para la presentación de antígenos). Más específicamente, un virus ancestral o una porción del mismo, como se describe en el presente documento, se puede usar para la adición de genes, el aumento de genes, el suministro genético de un polipéptido terapéutico, la vacunación genética, el silenciamiento de genes, la edición del genoma, la terapia génica, el suministro de ARNi, el suministro de ADNc, el suministro de ARNm, el suministro de ARNmi, esponjamiento de ARNmi, la inmunización genética, la terapia génica optogenética, la transgénesis, la vacunación con ADN, o la inmunización con ADN.

Una célula huésped puede transducirse o infectarse con un virus ancestral o una porción del mismo in vitro (por ejemplo, creciendo en cultivo) o in vivo (por ejemplo, en un sujeto). Las células huésped que se pueden transducir o infectar con un virus ancestral o una porción del mismo in vitro se describen en el presente documento; las células huésped que pueden transducirse o infectarse con un virus ancestral o una porción del mismo in vivo incluyen, sin limitación, cerebro, hígado, músculo, pulmón, ojo (por ejemplo, retina, epitelio pigmentario de la retina), riñón, corazón, gónadas (por ejemplo, testículos, útero, ovarios), piel, fosas nasales, sistema digestivo, páncreas, células de los islotes, neuronas, linfocitos, oído (por ejemplo, oído interno), folículos pilosos, y/o glándulas (por ejemplo, tiroides).

Un virus ancestral o una porción del mismo como se describe en el presente documento puede modificarse para incluir un transgén (en cis o trans con otras secuencias víricas). Un transgén puede ser, por ejemplo, un gen indicador (por ejemplo, beta-lactamasa, beta-galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina cinasa, polipéptido verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), o luciferasa, o polipéptidos de fusión que incluyen un dominio de etiqueta de antígeno tal como hemaglutinina o Myc) o un gen terapéutico (por ejemplo, genes que codifican hormonas o receptores de los mismos, factores de crecimiento o receptores de los mismos, factores de diferenciación o receptores de los mismos, reguladores del sistema inmunitario (por ejemplo, citocinas e interleucinas) o receptores de los mismos, enzimas, ARN (por ejemplo, ARN inhibitorios o ARN catalíticos), o antígenos diana (por ejemplo, antígenos oncógenos, antígenos autoinmunitarios).

El transgén particular dependerá, al menos en parte, de la enfermedad o deficiencia particular que se está tratando. Simplemente a modo de ejemplo, la transferencia génica o la terapia génica pueden aplicarse al tratamiento de la hemofilia, retinitis pigmentosa, fibrosis quística, amaurosis congénita de Leber, trastornos de almacenamiento lisosomal, errores innatos del metabolismo (por ejemplo, errores innatos del metabolismo de los aminoácidos, incluyendo fenilcetonuria, errores innatos del metabolismo de los ácidos orgánicos, incluyendo academia propiónica, errores innatos del metabolismo de los ácidos grasos, incluida la deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCAD), cáncer, acromatopsia, distrofias de conos y bastones, degeneraciones maculares (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad), deficiencia de lipopolipéptido lipasa, hipercolesterolemia familiar, atrofia muscular espinal, distrofia muscular de Duchenne, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, obesidad, trastorno inflamatorio del intestino, diabetes, insuficiencia cardíaca congestiva, hipercolesterolemia, pérdida de la audición, enfermedad coronaria, amiloidosis familiar, síndrome de Marfan, insomnio familiar fatal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de células falciformes, enfermedad de Huntington, degeneración del lóbulo fronto-temporal, síndrome de Usher, intolerancia a la lactosa, trastornos de almacenamiento de lípidos (por ejemplo, enfermedad de Niemann-Pick, tipo C), enfermedad de Batten, coroideremia, enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II (enfermedad de Pompe), ataxia telangiectasia (síndrome de Louis-Bar), hipotiroidismo congénito, inmunodeficiencia combinada severa (SCID), y/o esclerosis lateral amiotrófica (ALS).

Un transgén también puede ser, por ejemplo, un inmunógeno que es útil para inmunizar a un sujeto (por ejemplo, un ser humano, un animal (por ejemplo, un animal de compañía, un animal de granja, un animal en peligro de extinción). Por ejemplo, los inmunógenos pueden obtenerse de un organismo (por ejemplo, un organismo patógeno) o una porción inmunógena o un componente del mismo (por ejemplo, un polipéptido de toxina o un subproducto del mismo). A modo de ejemplo, los organismos patógenos de los cuales se pueden obtener polipéptidos inmunógenos incluyen virus (por ejemplo, picornavirus, enterovirus, ortomixovirus, reovirus, retrovirus), procariotas (por ejemplo, neumococos, estafilococos, listeria, pseudomonas) y eucariotas (por ejemplo, amebiasis, malaria, leishmaniasis, nematodos). Se entenderá que los métodos descritos en el presente documento y las composiciones producidas por dichos métodos no se limitan por ningún transgén en particular.

Un virus ancestral o una porción del mismo, usualmente suspendido en un vehículo fisiológicamente compatible, puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un mamífero humano o no humano). Los vehículos adecuados incluyen una solución salina, que se puede formular con una diversidad de soluciones tamponantes (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina y agua. El virus ancestral o porción del mismo, se administra en cantidades suficientes para transducir o infectar las células y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión génica para proporcionar un beneficio terapéutico sin demasiados efectos adversos. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, la administración directa a un órgano tal como, por ejemplo, el hígado o el pulmón, por vía oral, intranasal, intratraqueal, por inhalación, intravenosa, intramuscular, intraocular, subcutánea, intradérmica, transmucosa, o por otras vías de administración. Las rutas de administración se pueden combinar, si se desea.

La dosis del virus ancestral o porción del mismo administrada a un sujeto dependerá principalmente de factores tales como la afección que se está tratando, y la edad, el peso y la salud del sujeto. Por ejemplo, una dosis terapéuticamente eficaz de un virus ancestral o una porción del mismo a administrar a un sujeto humano generalmente está en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10 ml de una solución que contiene concentraciones de aproximadamente 1 x 101 a 1 x 1012 copias genómicas (GC) de virus ancestrales (por ejemplo, aproximadamente 1 x 103 a 1 x 109 GC). La transducción y/o la expresión de un transgén se pueden controlar en diversos puntos de tiempo después de la administración por ADN, ARN o ensayos de proteínas. En algunos casos, los niveles de expresión del transgén se pueden controlar para determinar la frecuencia y/o la cantidad de dosis. Los regímenes de dosificación similares a los descritos con fines terapéuticos también pueden utilizarse para la inmunización.

Los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para modelar la evolución directa, para modificar o eliminar uno o más dominios inmunógenos de un virus o porción del mismo.

De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, bioquímica y ADN recombinante dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de los métodos y composiciones de materia que se describen en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Predicción computacional de secuencias ancestrales

Se obtuvo un conjunto de 75 secuencias de aminoácidos diferentes de cápsides de AAV a partir de varias bases de datos públicas, incluyendo GenBank, y las secuencias se alinearon utilizando el algoritmo PRANK-MSA, versión 121002, con la opción "-F".

Se usó ProtTest3 (véase, por ejemplo, Darriba et al., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5; disponible en darwin.uvigo.es/software/prottest3 en Internet) para evaluar diferentes modelos de la evolución polipeptídica (por ejemplo, los incluidos en ProTest3, concretamente, JTT, LG, WAG, VT, CpRev, RtRev, Dayhoff, DCMut, ^fL^u, Blosum62, VT, HIVb, MtArt, MtMam) en condiciones diferentes (por ejemplo, las incluidas en ProTest3, concretamente, "+I", "+F", "+ G", y combinaciones de los mismos). El modelo JTT (Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82) con G y F (Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401; y Cao et al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27) se seleccionó basándose en su puntuación del criterio de información de Aikake (AIC; Hirotugu, 1974, IEEE Transactions on Automatic Control, 19:716-23) de acuerdo como se implementó en ProTest3.

Se construyó una filogenia de la evolución de AAV utilizando PhyML (Guindon y Gascuel, 2003, Systematic Biology, 52:696-704)). Véase la Figura 3. El árbol se generó utilizando el modelo de sustitución JTT F con 4 categorías de sustitución discretas y un parámetro de forma Gamma estimado. Los árboles resultantes se mejoraron a través del intercambio de vecinos más cercanos (NNI) y la poda y reinjerto de subárbol (SPR), y se evaluó su importancia a través de muestreo por repetición y la prueba de razón de similitud aproximada (aLRT; Anisimova y Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52)) usando la variante "de tipo SH".

El árbol filogénico construido anteriormente se usó entonces para estimar los estados ancestrales de la cápside de AAV en cada nodo interior a la filogenia. Las secuencias de cápside ancestral se reconstruyeron utilizando los principios de máxima verosimilitud mediante el software Phylogenetic Analysis by Maximum Likelihood (PAML) (Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6; disponible en abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html en Internet) envuelto en Lazarus (Sourceforge en sf.net). Más específicamente, la reconstrucción de Lazarus/PAML se configuró para generar una reconstrucción de aminoácidos usando el modelo de sustitución JTT+F utilizando 4 categorías distribuidas por gamma. Se usó AAV5 como un grupo externo. Finalmente, se añadió la opción "I" para colocar los indeles (es decir, se codificó de forma binaria y se colocó a través de parsimonia máxima utilizando el algoritmo de Fitch) después de que se realizó la reconstrucción de PAML.

Debido a que la reconstrucción se realizó en un modo de máxima verosimilitud, se puede calcular la verosimilitud de que cualquier residuo se encuentre en una posición dada en un nodo dado. Para ello, se escribió un guión adicional para identificar todas las posiciones a lo largo de la secuencia con una probabilidad posterior calculada por debajo de un cierto umbral. Se seleccionó un umbral de 0,3, lo que significa que cualquier aminoácido con una probabilidad posterior calculada de más de 0,3 se incluyó en la síntesis de la genoteca. Estos residuos se seleccionaron como variantes de interés en la genoteca.

Para finalizar la secuencia, se tuvo que codificar una utilidad adicional para seleccionar los codones. Se escribió un guión para derivar codones similares a los de otra secuencia de AAV (AVVRh10, que tiene aproximadamente un 92% de identidad de secuencia con la secuencia de andamiaje de Anc80) y se aplica un algoritmo novedoso para sustituir codones en los que existían emparejamientos incorrectos de secuencia basados en una matriz de sustitución de codones. El nuevo algoritmo se muestra a continuación:

Dado: secuencia de aminoácidos, Pt, con la secuencia de nucleótidos correspondiente, Nt, donde Nt codifica Pt; y secuencia de proteínas, Pi, donde Pi presenta una fuerte homología con Pt.

Alinear Pi con Pt usando Needleman-Wunsch usando la tabla Blosum62 para la puntuación. Generar una nueva secuencia de nucleótidos, Ni, pasando por el alineamiento de proteínas, utilizando el codón correspondiente de Nt, donde el aminoácido en Pt coincide exactamente con el de Pi,

el codón de "mejor puntuación" de la matriz Codon-PAM (Schneider et al., 2005, BMC Bioinform., 6: 134) donde hay una sustitución,

un hueco donde existe un hueco en Pi alineada contra un aminoácido en Pt, y

el nucleótido que ocurre con mayor frecuencia en el Nt (que codifica un aminoácido dado) donde existe un aminoácido en Pi alineada contra un hueco en Pt.

Además, se realizaron dos cambios de un solo nucleótido para suprimir la transcripción de la proteína activadora del ensamblaje (AAP), que se codifica fuera del marco dentro del gen de la cápside del AAV en el AAV natural. Dado que la codificación de la AAP (contemporánea o ancestral) no fue parte de esta reconstrucción, la expresión de la AAP se eliminó haciendo una mutación sinónima en la secuencia cap, y la secuencia de AAP se proporcionó en trans durante la producción vírica.

Ejemplo 2 - Expresión de secuencias de VP1 de AAV ancestrales

Se realizaron experimentos para determinar si las secuencias de cápside de AAV ancestrales predichas se pueden usar para hacer vectores víricos.

Se clonaron varias de las secuencias de cápside de AAV ancestrales predichas. La genoteca de cápsides ancestrales se transfirió a un plásmido de expresión rep-cap para permitir la formación de partículas víricas en la transfección transitoria. Para mantener los niveles de expresión apropiados y el corte y empalme de VP1, VP2 y VP3, se clonaron los genes de cap de la genoteca cortando HindIII, ubicado en 5' de cap en la secuencia codificante rep, y SpeI, que se modificó entre el codón de parada cap y la señal de poliadenilación. En consecuencia, para clonar las cápsides ancestrales en una construcción "REP/cAp" más convencional, el plásmido de paso se digirió con HindIII y SpeI, se purificó en gel y se ligó en un plásmido rep/cap digerido de manera similar.

Los polipéptidos expresados se resolvieron en un gel de SDS al 10%. Como se muestra en la Figura 6, los polipéptidos de la cápside se expresaron y sometieron a corte y empalme adecuadamente en VP1, VP2 y VP3 a partir de varias secuencias de AAV ancestrales (Anc80L44, Anc80L27 y Anc80L65), así como de una secuencia de AAV contemporánea, AAV2/8.

Ejemplo 3 - Valoración vírica

El AAV se produjo en células HEK293 a través de la cotransfección transitoria de plásmidos que codifican todos los elementos necesarios para el ensamblaje de partículas víricas. Brevemente, las células HEK293 se hicieron crecer al 90% de confluencia y se transfectaron con (a) el plásmido del genoma vírico que codifica el transgén de luciferasa (expresado por el promotor de CMV) flanqueado por ITR de AAV2, (b) el plásmido de empaquetamiento de AAV que codifica rep de AAV2 y las proteínas de la cápside sintetizadas divulgadas en el presente documento, (c) cápside que expresa AAP de AAV2, y (d) genes auxiliares adenovirales necesarios para el empaquetado y el ensamblaje de AAV. Las células se incubaron a 37°C durante 2 días y las células y los medios se recolectaron y recogieron.

La suspensión de medio celular se lisó mediante 3 ciclos consecutivos de congelación y descongelación. A continuación, el lisado se eliminó por centrifugación y se trató con una enzima en condiciones para realizar una digestión exhaustiva del ADN, aquí Benzonase™, para digerir cualquier ADN presente fuera de la partícula vírica. La preparación de AAV se diluyó hasta estar dentro del intervalo de medición lineal de una plantilla de ADN de control, en este caso, un plásmido linealizado con el cebador TaqMan™ idéntico y la secuencia de unión de la sonda en comparación con el genoma del vector. Se realizó la PCR TaqMan™ con cebadores e hibridación de la sonda al genoma del vector vírico de elección. El título se calculó basándose en la medición de TaqMan™ en copias genómicas (GC) por mililitro (ml) como se muestra en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2

Los resultados de la producción de vectores a pequeña escala en partículas de cápside de AAV reconstruidas de forma ancestral demostraron rendimientos similares a AAV2, pero reducidos en relación con AAV8, ambos de los cuales son preparaciones de vectores basadas en AAV contemporáneos.

Ejemplo 4 - Transducción vírica in vitro

Se realizaron transducciones víricas in vitro para evaluar la capacidad de los virus que contienen las secuencias de AAV ancestrales predichas para infectar células.

Después de la producción vectorial de alto rendimiento utilizando la biblioteca de secuencias de Anc80, las células HEK293 se transdujeron con cada vector vírico. Además de una secuencia Anc80, cada vector vírico contenía un transgén de luciferasa. La luciferasa se midió mediante la cuantificación de la bioluminiscencia en un lector de placas de 96 pocillos después de la adición del sustrato de luciferina a las células transducidas o al lisado celular. Después de la cuantificación, se produjo un mapa de calor de la expresión de luciferasa en cuatro placas de 96 pocillos concatenadas (excluyendo una columna de controles en cada placa). Debido a la gran cantidad de inserciones, eliminaciones y transiciones asociadas con el proceso de producción de vectores de alto rendimiento, muchos de los vectores no eran funcionales. Para los fines del presente documento, solo se evaluaron adicionalmente los virus que eran funcionales en este ensayo (es decir, capaces de transducir células HEK293 y expresar el transgén).

Se transdujeron células HEK293, a igual multiplicidad de infección (MOI) de 1 x 104 copias genómicas (GC) por célula, con dos vectores de AAV contemporáneos (AAV2/2 y AAV2/8) y tres vectores de A^aV ancestrales predichos (Anc80L27, Anc80L44, y Anc80L65). Cada vector contenía un transgén que codificaba luciferasa o un transgén que codificaba eGFP. Se tomaron imágenes de las células 60 horas después utilizando el canal de GFP de un microscopio óptico AMG EvosF1. La Figura 7 muestra la expresión de luciferasa después de la transducción in vitro. Cada uno de los virus AAV ancestrales demostró una transducción eficiente de células HEK293.

Ejemplo 5 - Transducción retiniana in vivo

Se realizaron transducciones retinianas para determinar si los vectores AAV ancestrales son capaces de dirigirse a las células retinianas murinas in vivo.

Los ojos murinos se transdujeron con 2 x 108 copias genómicas (GC) de tres AAV ancestrales diferentes (Anc80L27, Anc80L44 y Anc80L65) y un AAV contemporáneo (AAV2/8), todos los cuales incluyen un transgén que codifica eGFP. Para las transducciones, cada vector AAV se administró quirúrgicamente debajo de la retina al generar un espacio entre el fotorreceptor y la capa del epitelio pigmentario de la retina a través de la administración de un bolo vectorial con un dispositivo de inyección. El bolo vectorial se dejó en el espacio subretiniano y el desprendimiento subretiniano se resolvió con el tiempo. La expresión de GFP se controló de forma no invasiva mediante fotografía de fondo de la retina del animal después de la dilatación de la pupila con Tropicamide™. Todas las retinas presentadas demostraron diversos grados de direccionamiento exitoso de Aa V ancestrales a la retina.

La histología retiniana también se realizó y se visualizó bajo microscopía fluorescente para identificar el tipo o tipos de células transducidos. La histología se realizó en una retina murina transducida con el vector de AAV ancestral Anc80L65 como se describe anteriormente. La expresión de eGFP mediada por Anc80L65 fue evidente en la capa nuclear externa (ONL), los segmentos internos (IS) y el epitelio pigmentario de la retina (RPE), lo que indica que el vector Anc80L65 ancestral se dirige a fotorreceptores murinos y células del epitelio pigmentario retiniano.

Ejemplo 6 - Ensayo de anticuerpos neutralizantes

Se realizaron ensayos de anticuerpos neutralizantes para evaluar si un virus AAV ancestral es más resistente a la neutralización de anticuerpos que un virus AAV contemporáneo. Los ensayos de anticuerpos neutralizantes miden la concentración de anticuerpos (o el título en el que una muestra experimental contiene una concentración de anticuerpos) que neutraliza una infección en un 50% o más en comparación con un control en ausencia del anticuerpo.

Las muestras de suero o la solución madre de IVIG (200 mg/ml) se diluyeron en serie dos veces, y las muestras sin diluir y diluidas se incubaron conjuntamente con un virus AAV ancestral, Anc80L65, y un virus AAV contemporáneo, AAV2/8, a una MOI de 104 durante aproximadamente 30 minutos a 37°C. Cada virus incluía un transgén de luciferasa. El vector mezclado y una muestra de anticuerpo se transdujeron entonces en células HEK293. Para estos experimentos, la muestra de anticuerpos utilizada fue inmunoglobulina intravenosa (IGIV), IgG agrupadas extraídas del plasma de más de mil donantes de sangre (vendidos comercialmente, por ejemplo, como Gammagard™ (Baxter Healthcare; Deerfield, IL) o Gamunex™ (Grifols; Los Angeles, CA)). 48 horas después del inicio de la transducción, las células se analizaron por bioluminiscencia para detectar luciferasa. El título de anticuerpos neutralizantes se determinó identificando la dilución de la muestra para la cual se alcanzó un 50% o más de neutralización (transducción de muestra/transducción del virus de control en ausencia de muestra).

Ejemplo 7 - Caracterización de Anc80

En base a los métodos descritos en el presente documento, se obtuvo la secuencia Anc80 más probable (de acuerdo como se determinó a través de la probabilidad posterior) y se designó Anc80L1 (la SEQ ID nO:35 muestra la secuencia de ácido nucleico de la cápside de Anc80L1 y la SEQ ID NO:36 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido de VP1 de Anc80L1). La genoteca probabilística de Anc80 también se sintetizó utilizando las secuencias descritas en el presente documento por una empresa comercial y se subclonó en vectores de expresión. La genoteca de Anc80 se evaluó clonalmente para determinar el rendimiento vectorial y la infectividad en ensayos combinados. Fuera de este cribado, se caracterizaron adicionalmente Anc80L65 (SEQ ID NO:23), así como varias otras variantes.

La genoteca de Anc80 y Anc80L65 se compararon en términos de diferencia de secuencia (Figura 9; % por encima de la diagonal, N.° de diferencias de aminoácidos a continuación). Usando NCBI-BLAST, la secuencia más cercana disponible públicamente para Anc80L65 es rh10 (GenBank N.° de acceso AAO88201.1).

La Figura 10 muestra que Anc80L65 produjo rendimientos vectoriales equivalentes a AAV2 (Panel A), generó partículas víricas bajo electroscopia de transmisión (TEM) (Panel B), y produjo bioquímicamente la cap de AAV y las proteínas VP1, 2 y 3 basadas en SDS page en condiciones de desnaturalización (Panel C) y transferencia Western utilizando el anticuerpo de cápside de AAV, B1 (Panel D). Estos experimentos se describen con más detalle en los párrafos siguientes.

Brevemente, los vectores AAV2/8, AAV2/2, AAV2/Anc80L27, AAV2/Anc80L44, y AAV2/Anc80L65 se produjeron a pequeña escala que contenían una construcción de indicador compuesta por eGFP y luciferasa de luciérnaga bajo un promotor de CMV a pequeña escala. Los títulos de estas preparaciones de virus a pequeña escala se obtuvieron después a través de qPCR. Basándose en estos experimentos, se encontró que los vectores Anc80L27, Anc80L44 y Anc80L65 producen niveles víricos comparables a los de AAV2 (Figura 10A).

Para confirmar que las proteínas de la cápside Anc80L65 se ensamblaron en partículas pseudovíricas intactas del tamaño y conformación apropiados, se obtuvieron micrografías utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Una preparación purificada a gran escala de Anc80-L065 se cargó en rejillas de cobre recubiertas con polivinilo formal (Formvar®) y luego se tiñó con acetato de uranilo. Las micrografías revelaron partículas hexagonales intactas con diámetros entre 20 y 25 nm (Figura 10B).

Para determinar si los genes de cápside ancestrales sintéticos se procesaron adecuadamente (es decir, se sometieron a corte y empalme y se expresaron), se cargaron preparaciones purificadas a gran escala de vectores AAV2/8, AAV2/2 y AAV2/Anc80L65 en un gel S^dS-PAGE (1E10 GC/pocillo) en condiciones de desnaturalización. Las bandas que representaban las proteínas de cápside vírica VP1, VP2 y VP3 estaban claramente presentes para cada preparación de vector (Figura 10C). La transferencia de Western con el anticuerpo de cápside de AAV B1 confirmó además que estas bandas representaban las proteínas predichas (Figura 10D).

Además, la Figura 11 muestra que Anc80L65 infectó tejidos y células de mamífero in vitro en células HEK293 en MOI 10E4 GC/célula usando GFP como lectura (Panel A) o luciferasa (Panel B) frente a controles de AAV2 y/o AAV8. Anc80L65 también fue eficaz en el direccionamiento al hígado después de una inyección IV del AAV indicado que codifica un transgén LacZ nuclear (fila superior, Panel C), después de la inyección intramuscular (IM) directa del AAV indicado que codifica GFP (fila central, Panel C), y después de la inyección subretiniana con el AAV indicado que codifica GFP (fila inferior, Panel C). Estos experimentos se describen con más detalle en los párrafos siguientes.

Para obtener una medida relativa de la infectividad de los viriones ancestrales, se produjeron preparaciones en bruto de AAV2/2, AAV2/8, AAV2/Anc80L65, AAV2/Anc80L44, AAV2/Anc80L27, AAV2/Anc80L121, AAV2/Anc80L122, AAV2/Anc80L123, AAV2/Anc80L124, y AAV2/Anc80L125 que contienen una construcción indicadora bi-cistrónica que incluye una eGFP y secuencias de luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor de CMV. Las placas de 96 pocillos confluentes con células HEK293 se sometieron luego a transducción con cada vector a una MOI de 1E4 GC/célula (títulos obtenidos a través de qPCR como anteriormente). 48 horas después, la microscopía de fluorescencia confirmó la presencia de GFP en células transducidas (Figura 11A). Después, las células se analizaron para determinar la presencia de luciferasa (Figura 11B), que determinó que la expresión de luciferasa en células transducidas con vectores derivados de Anc80 estaba en medio de células transducidas con AAV8 (nivel inferior de transducción) y AAV2 (nivel superior de transducción).

Para evaluar la eficacia relativa de la transferencia génica en un contexto in vivo, se obtuvieron preparaciones purificadas de alto título de AAV2/2, AAV2/8 y AAV2/Anc80L65. Se inyectaron 3,9E10 GC de cada vector, encapsidando un transgén que codifica LacZ nuclear bajo el control de un promotor TBG, en ratones C57BL/6 (3 ratones por condición) a través de una inyección IP después de la anestesia general. 28 días después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tejidos. Los hígados se seccionaron mediante técnicas histológicas estándar y se tiñeron para determinar la beta-galactosidasa. Luego, se tomaron imágenes de las secciones bajo un microscopio y se muestran imágenes representativas en la Figura 11C, fila superior.

Después, se obtuvieron vectores de los mismos serotipos que contenían un transgén bicistrónico que codificaba eGFP y hAIAT bajo el control de un promotor pCASI. Para evaluar la capacidad de Anc80L65 para transducir el músculo esquelético murino, se inyectó 1E10 GC de cada vector en el músculo esquelético de ratones C57BL/6 (5 ratones por condición) después de la anestesia general. 28 días después de la inyección, los ratones se sacrificaron, los tejidos se sometieron a criosección y se evaluó la presencia de eGFP utilizando microscopía confocal fluorescente (azul es DAPI, verde es eGFP). Las imágenes representativas se muestran en la Figura 11C, fila central. Estos experimentos demostraron que los vectores Anc80L65 eran capaces de transducir el músculo esquelético murino mediante inyección intramuscular.

Se obtuvieron vectores de los mismos serotipos, esta vez encapsidando construcciones que codificaban solo un transgén de eGFP bajo el control de un promotor de CMV. Las partículas de 2E9 se inyectaron por vía subretiniana en ratones C57BL/6 después de la anestesia general. 28 días después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se recogieron los ojos, se sometieron a criosección, y se evaluó la presencia de eGFP utilizando microscopía confocal fluorescente (azul es DAPI, verde es eGFP). Se muestran imágenes representativas en la Figura 11C, fila inferior. Estos experimentos demuestran que los vectores Anc80L65 pueden transducir la retina murina a un nivel que es comparable a los vectores AAV8.

Brevemente, se obtuvieron preparaciones purificadas y de alto título de vectores víricos AAV2/8, AAV2/2, AAV2/rh32.33 y AAV2/Anc80L65 que encapsidaban un transgén bicistrónico que incluye eGFP y luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor de CMV. Estos vectores se incubaron luego con diluciones seriadas de dos veces de IVIG (10 mg, 5 mg, 2,5 mg, etc.) o se incubaron sin IVIG (1E9 GC por condición). Después de la incubación, se usaron vectores para transducir células HEK293 a una MOI de 1E4 por pocillo (una dilución por pocillo).

Ejemplo 8 - Generación de cápsides de AAV ancestrales adicionales

Las secuencias de cápside de AAV ancestrales más probables (de acuerdo con lo determinado por la probabilidad posterior) se sintetizaron luego a través de un laboratorio comercial (Gen9) y se proporcionaron como ADNds lineal. Estas secuencias de aminoácidos se compararon entonces con las de los AAV existentes para determinar el grado en que difieren (Figura 13). Cada proteína VP1 ancestral difiere de las de los AAV existentes representativos seleccionados entre un 3,6% y un 9,3% (Figura 13A), mientras que las proteínas VP3 ancestrales difieren entre un 4,2 y un 9,4% (Figura 13B). Estas cápsides se subclonaron en plásmidos de producción de AAV (pAAVector2/Vacío) a través de la digestión con enzimas de restricción (HindIII y SpeI) y la ligadura de T4. Estos clones se confirmaron a través de digestión de restricción y secuenciación de Sanger, y luego se produjeron preparaciones a escala media de ADN plasmídico.

Cada uno de estos plásmidos se usó luego para producir vectores de AAV que contenían un gen indicador que codificaba tanto eGFP como luciferasa de luciérnaga. Estos vectores se produjeron por triplicado en pequeña escala como se describe anteriormente. Las preparaciones en bruto del virus se titularon luego a través de qPCR y se encontró que producían entre un 2,71% y un 183,1% de partículas víricas en relación con AAV8 (Figuras 14 y 15). Estos títulos se utilizaron entonces para configurar un experimento controlado por títulos para evaluar la infectividad relativa. Anc126 no estaba controlado por título debido a su producción significativamente reducida y, en consecuencia, los datos sobre la infectividad de Anc126 no se pueden comparar con precisión con la infectividad de los otros virus en el experimento. Los otros vectores se usaron para transducir células HEK293 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1,9E3 GC/célula.

60 horas después de la transducción, las células se evaluaron para determinar la expresión de GFP a través de microscopía de fluorescencia. Se detectaron células positivas para eGFP en cada una de las condiciones, excepto para el control negativo (Figura 16). Esto indica que cada una de las secuencias ancestrales predichas, sintetizadas y clonadas es capaz de producir partículas víricas infecciosas y viables. Para tener una idea de los niveles relativos de infectividad, los ensayos de luciferasa también se realizaron en las mismas células. Los resultados indican que cada uno de los vectores ancestrales es capaz de transducir células HEK293 entre un 28,3% y un 850,8% en relación con AAV8 (Figuras 17 y 18). Se observa que Anc126 se excluyó del análisis de la transducción relativa ya que no se controló por título.

En resumen, se sintetizaron ocho nuevos genes de cápside de AAV ancestrales y se usaron en la producción de vectores víricos funcionales junto con AAV8, AAV2 y los vectores Anc80L65 descritos previamente. La producción y la infectividad se evaluaron in vitro y se muestra un resumen de estos hallazgos en la Figura 19.

Ejemplo 9 - Inmunoprofilaxis vectorizada

En la inmunoprofilaxis vectorizada, los vehículos de terapia génica (tal como el AAV) se utilizan para administrar transgenes que codifican anticuerpos ampliamente neutralizantes contra agentes infecciosos. Véanse, por ejemplo, Balazs et al. (2013, Nat. Biotechnol., 31:647-52); Limberis et al. (2013, Sci. Transl. Med., 5:187ra72); Balazs et al. (2012, Nature, 481:81-4); y Deal et al. (2014, PNAS USA, 111:12528-32). Una ventaja de este tratamiento es que el huésped produce los anticuerpos en sus propias células, lo que significa que una única administración tiene el potencial de conferir una protección de por vida contra los agentes etiológicos.

Ejemplo 10 - Vehículos de administración farmacológica

LUCENTIS® (ranibizumab) y AVASTIN® (bevacizumab) son ambos agentes anti-angiogénesis basados en los mismos anticuerpos monoclonales de ratón humanizados contra el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A). Aunque el bevacizumab es un anticuerpo completo y el ranibizumab es un fragmento (Fab), ambos actúan para tratar la degeneración macular relacionada con la edad húmeda a través del mismo mecanismo: antagonizando el VEGF. Véanse, por ejemplo, Mao et al. (2011, Hum. Gene Ther., 22:1525-35); Xie et al. (2014, Gynecol. Oncol., doi: 10.1016/j.ygyno.2014.07.105); y Watanabe et al. (2010, Gene Ther., 17:1042-51). Debido a que ambas de estas moléculas son proteínas, pueden codificarse por el ADN y producirse en células transducidas con vectores que contienen un transgén, y son lo suficientemente pequeñas como para ser empaquetadas en vectores de AAV.

Otras formas de realización

Debe entenderse que, si bien los métodos y las composiciones de materia se han descrito en el presente documento junto con varios aspectos diferentes, la descripción anterior de los diversos aspectos pretende ilustrar y no limitar el alcance de los métodos y composiciones de la materia. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Se divulgan métodos y composiciones que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en la preparación para, o son productos de los métodos y composiciones que se divulgan. Estos y otros materiales se divulgan en el presente documento, y se entiende que se describen combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos métodos y composiciones. Es decir, aunque la referencia específica a cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estas composiciones y métodos no se puede divulgar explícitamente, cada una se contempla y se describe específicamente en el presente documento. Por ejemplo, si se describe y se analiza una composición particular de materia o un método particular y se analizan varias composiciones o métodos, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de las composiciones y los métodos se contemplan específicamente a menos que se indique específicamente de otro modo. Asimismo, también se contempla específicamente y se divulga cualquier subconjunto o combinación de estas.

Apéndice A

SEQ ID NO:1: Polipéptido Anc80

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

DAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGA

KTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKKGQQPAX1KRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGSNTM

X2AGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGX3STN

DNTYFGYSTPW GYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKX4LNFKLFNIQVKEVTTNDGTTTIANN

LTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQ GCLPPFPADVFM IPQYGYLTLN NGSQAVGRSSFYCLEYFPSQM L

RTG N N FX5FSYTFED V PFH SSYA H SQ SLD RLM N PLID Q YLYYLSRTQ TTSG TA G N RX6LQ FSQ AG PSS

MANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTX7NQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMATHKDDEDKFFPM

SGVLIFGKQGAGNSNVDLDNVM ITX8EEEIKTTNPVATEX9YGTVATNLQSX10NTAPATGTVNSQGA

LPGM VW Q X11RDVYLQGPIW AKIPHTDGHFHPSPLM GGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPTTFSPAKF

ASFITQ YSTGQVSVEIEW ELQKEN SKRW NPEIQYTSN YN KSTN VDFAVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRN

L

X1 = K/R; X2 = A/S; X3 = A/G; X4 = R/K; X5 = E/Q; X6 = T/E; X7 = A/T; X8 = S/N; X9 = Q/E; X10 = S/A; X11 = N/D

SEQ ID NO:2: ADN Anc80

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTG

GGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGG

TGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGC'GGCG

GACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCT

GCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCrGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACC

TCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTT CTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCT

AAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAATCACCCCAGGAACCAGACTCCTCTTCGGGCAT

CGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCGXXX1AAGAGACTCAACTTTGGGCAGACAGGCGACTCAGAGTCA

GTGCCCGACCCTCAACCACTCGGAGAACCCCCCGCAGCCCCCTCTGGTGTGGGATCTAATACAATGXX

X2GCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAACGCCTCAGGA

AATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCT

CCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGCCAATCGGGAXXX3AGCACCAACGACAAC

ACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACC

ACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGXXX4CTCAACTTCAAGCTC

TTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCACCACGACCATCGCCAATAACCTTACCAG

CACGGTTCAGGTCTTTACGGACTCGGAATACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGGCT

GCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAATGGC

AGTCAGGCCGTGGGCCGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAAATGCTGAGAACGGG

CAACAACTTTXXX5TTCAGCTACACGTTTGAGGACGTGCCTTTTCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAA

AGCCTGGACCGGCTGATGAACCCCCTCATCGACCAGTACCTGTACTACCTGTCTCGGACTCAGACCAC

GAGTGGTACCGCAGGAAATCGGXXX6TTGCAATTTTCTCAGGCCGGGCCTAGTAGCATGGCGAATCAG

GCCAAAAACTGGCTACCCGGGCCCTGCTACCGGCAGCAACGCGTCTCCAAGACAXXX7AATCAAAATA

ACAACAGCAACTTTGCCTGGACCGGTGCCACCAAGTATCATCTGAATGGCAGAGACTCTCTGGTAAAT

CCCGGTCCCGCTATGGCAACCCACAAGGACGACGAAGACAAATTTTTTCCGATGAGCGGAGTCTTAAT

ATTTGGGAAACAGGGAGCTGGAAATAGCAACGTGGACCTTGACAACGTTATGATAACCXXX8GAGGAA

GAAATTAAAACCACCAACCCAGTGGCCACAGAAXXX9TACGGCACGGTGGCCACTAACCTGCAATCGX

XX10AACACCGCTCCTGCTACAGGGACCGTCAACAGTCAAGGAGCCTTACCTGGCATGGTCTGGCAGX

XX11CGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCTATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGACACTTTCATC

CCTCGCCGCTGATGGGAGGCTTTGGACTGAAACACCCGCCTCCTCAGATCCTGATTAAGAATACACCT

GTTCCCGCGAATCCTCCAACTACCTTCAGTCCAGCTñAGTTTGCGTCGTTCATCACGCAGTACAGCAC

CGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAACCCAGAGA

TTCAATACACTTCCAACTACAACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTTGACACAAATGGCGTTTAT

TCTGAGCCTCGCCCCATCGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTG

XXX1 = AAG/AAA; XXX2 = GCA/AGC; XXX3 = GCA/GGC; XXX4 = AGA/AAG; XXX5 = GAG/CAG; XXX6 = ACG/GAG; XXX7 = GCG/ACC; XXX8 = AGT/AAC; XXX9 = CAG/GAG; XXX10 = TCA/GCC; XXX11 = AAC/GAC

SEQ ID NO:3: Polipéptido Anc81

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

DAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGA

KTAPG KK R PV EQ SPQ EPD SSX1G IG K K G Q Q PA X2K R LN FG Q TG D SESV PD PQ PLG EPPA A PSG V G SN T

MAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVXTTSTRTWALPTYKNHLYKQISX3X4QSGGS

TN D N TYFG YSTPW G YFD FN RFH CH FSPRD W Q RLIN N N W G FRPKX5LN FKLFN IQ V KEVTTN D G TTTIA

N N LTSTV Q V FTD SEYQ LPYV LG SA H Q G C LPPFPA D V FM IPQ YG YLTLN N G SQ A V G R SSFYC LEYFPSQ

M LR T G N N FX 6FSYT FED V PFH SSY A H SQ SLD R LM N PLID Q Y LYY LSR T Q T TG G T A G N X7X 8LQ FSQ A G

PSSMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTTNQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFF

P S S G V L IF G K Q G A G N X 9N V D X 10X 11N V M IT X 12E E E IK T T N P V A T E E Y G X 13V A T N L Q S X 14N T A P Q

TGTVNSQG ALPGM VW QNRDVYLQ GPIW AKIPH TDG NFHPSPLM G GFG LKHPPPQILIKNTPVPANPPT

T FX 15PA K FA SFIT Q Y ST G Q V S V EIEW ELQ K EN S K R W N P EIQ Y T S N Y N K S T N V D FA V D T EG V Y S EP R P

IG T R Y LT R N L

X1=T/S; X2=K/R; X3=N/S; X4=S/H; X5=R/K; X6=E/Q; X7=R/Q; X8=T/E; X9=D/S; X10=L/Y; X11=D/S; X12=S/N; X13=V/I; X14=A/S; X15=S/T

SEQ ID NO:4: ADN Anc81

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTG

GGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGG

TGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCG

GACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACeAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCT

GCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACC

TCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCT

AAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAATCACCCCAGGAACCAGACTCCTCTXXX1GGCA

T C GG CAAGAAAGG C CAG CAGO C C G C GXXX 2 AAGAGACTO AAC T T T G GG CAGAC T GG CG AC T C AG AGT C

AGTGCCCGACCCTCAACCACTCGGAGAACCCCCCGCAGCCCCCTCTGGTGTGGGATCTAATACAATGG

CTGCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCAGGA

AATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCT

C C CCA C CTAC AACAACCACC T C T ACAAGCAAAT C T C C X X X 3X X X 4C AATCG GGAG GAAGCACCAACGA

CAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCT

CACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGXXX5CTCAACTTCAA

GCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCACCACGACCATCGCCAATAACCTTA

c c a g c a c g g t t c a g g t c t t t a c g g a c t c g g a a t a c c a g c t c c c g t a c g t c c t c g g c t c t g c g c a c c a g

GGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAA

TGGCAGTCAGGCCGTGGGCCGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAAATGCTGAGAA

CGGGCAACAACTTTXXX6TTCAGCTACACGTTTGAGGACGTGCCTTTTCACAGCAGCTACGCGCACAG

c c a a a g c c t g g a c c g g c t g a t g a a c c c c c t c a t c g a c c a g t a c c t g t a c t a c c t g t c t c g g a c t c a g a

CCACGGGAGGTACCGCAGGAAATXXX7XXX8TTGCAATTTTCTCAGGCCGGGCCTAGTAGCATGGCGA

a t c a g g c c a a a a a c t g g c t a c c c g g g c c c t g c t a c c g g c a g c a a c g c g t c t c c a a g a c a a c g a a t c a a a a t a a c a a c a g c a a c t t t g c c t g g a c c g g t g c c a c c a a g t a t c a t c t g a a t g g c a g a g a c t c t c t g g t AAATCCCGGTGTCGCrATGGCAACCCACAAGGACGACGAAGACCGATTTTTTCCGTCCAGCGGAGTCT

TAATAT TT GG GAAACAG G GAG C T G GAAA TXX X 9 AAC GTG GA C X X X 10 X X X 11 AACGTT ATGATAACCX

XX12GAGGAAGAAATTAAAACCACCAACCCAGTGGCCACAGAAGAGTACGGCXXX13GTGGCCACTAA

CCTGCAATCGXXX14AACACCGCTCCTCAAACAGGGACCGTCAACAGTCAAGGAGCCTTACCTGGCAT

GGTCTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCTATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGACGGAA

ACTTTCATCCCTCGCCGCTGATGGGAGGCTTTGGACTGAAACACCCGCCTCCTCAGATCCTGATTAAG

AATACACCTGTTCCCGCGAATCCTCCAACTACCTTCXXX15CCAGCTAAGTTTGCGTCGTTCATCACG

CAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTG

GAACCCAGAGATTCAATACACTTCCAACTACAACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTTGACACAG

AAGGCGTTTATTCTGAGCCTCGCCCCATCGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTG

XXX1 = ACG/AGC; XXX2 = AAA/AAG; XXX3 = AAC/AGT; XXX4 = AGC/CAC; XXX5 = AGA/AAG; XXX6 = GAG/CAG; XXX7 = CGG/CAG; XXX8 = ACG/GAG; XXX9 = GAC/AGC; XXX10 = CTT/TAC; XXX11 = GAC/AGC; XXX12 = AGT/AAC; XXX13 = GTG/ATC; XXX14 = GCA/AGC; XXX15 = AGT/ACC

SEQ ID NO:5: Polipéptido Anc82

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

DAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGA

KTAPG KKRPV EQ SPQ REPD SSX1G IG K K G Q Q PA X2K RLN FG Q TG D SESV PD PQ PLG EPPA A PSG V G SN

TMAAG GGA PMADNNEGA DGVGN S S GNWHC D S TWL G D RV ITTSTRTW A L P T YNNHLYKQISNGTSGGST

N D N TYFG YSTPW G YFDFN RFH CH FSPRD W Q RLIN N N W G FRPKRLN FKLFN IQ V KEVTTN EG TKTIAN N

LT ST V Q V FTD SEY Q LPYV LG SA H Q G C LPPFPA D V FM IPQ Y G Y LTLN N G SQ A V G R SSFY C LEY FPSQ M L

RTG M N FQ FSYTFED V PFH SSYA H SG SLD RLM N PLID Q YLYYLSRTQ TTG G TA G TQ TLQ FSQ A G PSSM A

NQAKWWLPGPCYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGV

LIFG K Q G A G N D W D YSN V M ITX3EEEIK TTN PV A TEEYG W A TN LQ SA N TA PQ TG TV N SQ G A LPG M V W

Q N R D V Y LQ G PIW A K IPH T D G N FH PSPLM G G FG LK H PPPQ ILIK N T PV PA D PPTT FN Q A K LN SFIT Q Y S

TG Q V SV EIEW ELQ K EN SK R W N PEIQ Y T SN YY K ST N V D FA V N TEG V Y SEPR PIG TR YLT R N L

X1=T/S; X2=K/R; X3=S/N

SEQ ID NO:6: ADN Anc82

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTG

GGACCTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGG

TGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCG

GACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCT

GCGGTATAATCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACC

TCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCT

AAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAGTCACCACAGCGTGAGCCCGACTCCTCCXXX1G

GCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCCXXX2AAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACTCAGA

GTCAGTCCCCGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGATCTAATACAA

TGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCG

GGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGC

C C TG C C CAC C TACAACAACCA C C TC T ACAAG CAAA T C T C CAAC GGGACCTCGGGAGGCAGCACCAACG

ACAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTC

TCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAA

GCTCTTCAACATCCAGGTCAAAGAGGTCACGACGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTCA

CCAGCACCGTCCAGGTGTTTACGGACTCGGAATACCAGCTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCCCACCAG

GGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGCTACCTGACTCTCAACAA

CGGTAGTCAGGCCGTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTCCCCTCTCAGATGCTGAGAA

CGGGCAACAACTTTCAATTCAGCTACACTTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGC

CAGAGTTTGGACAGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTACTACCTGTCAAGAACCCAGAC

TACGGGAGGCACAGCGGGAACCCAGACGTTGCAGTTTTCTCAGGCCGGGCCTAGCAGCATGGCGAATC

AGGCCAAAAACTGGCTGCCTGGACCCTGCTACAGACAGCAGCGCGTCTCCACGACAACGAATCAAAAC

AACAACAGCAACTTTGCCTGGACTGGTGCCACCAAGTATCATCTGAACGGCAGAGACTCTCTGGTGAA

TCCGGGCGTCGCCATGGCAACCCACAAGGACGACGAGGACCGCTTCTTCCCATCCAGCGGCGTCCTCA

TATTTGGCAAGCAGGGAGCTGGAAATGACAACGTGGACTATAGCAACGTGATGATAACCXXX3GAGGA

AGAAATCAAGACCACCAACCCCGTGGCCACAGAAGAGTATGGCGTGGTGGCTACTAACCTACAGTCGG

CAAACACCGCTCCTCAAACGGGGACCGTCAACAGCCAGGGAGCCTTACCTGGCATGGTCTGGCAGAAC

CGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAGATTCCTCACACAGATGGCAACTTTCACCCGTC

TCCTTTAATGGGCGGCTTTGGACTTAAACATCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACTCCTGTTC

CTGCGGATCCTCCAACAACGTTCAACCAGGCCAAGCTGAATTCTTTCATCACGCAGTACAGCACCGGA

CAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAGAACAGCAAGCGCTGGAACCCAGAGATTCA

GTATACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTTAATACTGAGGGTGTTTACTCTG

AGCCTCGCCCCATTGGCACTCGTTACCTCACCCGTAATCTG

XXX1 = ACG/AGC; XXX2 = AAA/AGA; XXX-3 = AGC/AAC

SEQ ID NO:7: Polipéptido Anc83

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

DAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGA

TMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGST

N D N TYFG YSTPW G YFD FN RFH CH FSPRD W Q RLIN H N W G FRPKRLX3FKLFN IQ VKEV TQ N EG TKTIAN M LT ST IQ V FT D SEYQ LPY V LG SA H Q G C LPPFPA D V FM IPQ YG YLT LH N G SQ A V G R SSFY C LEY FPSQ M

LR T G N N FX 4FSYT FED V PFH SSY A H SQ SLD R LM N PLID Q Y LYY LSR T Q T TG G T A G T Q T LQ FSQ A G PSX

5MANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEX7RFFP

SSG X7LIFG KQ G AG KD W VD YSN VM LTSEEEIKTTN PV ATEEYG W AD N LQ Q Q N TA PQ X8G TV N SQ G AL

p g m v w q n r d v y l q g p i w a k i p h t d g h f h p s p l m g g f g l k h p p p q i l i k n t p v p a d p p t t f n q a k l m s f

IT Q Y S T G Q V SV EIEW ELQ K EN SK R W N PEIQ Y TSN Y Y K STN V D FA V N T EG V Y SEPR PIG T R Y LT R N L

X1=T/S; X2=R/K; X3=N/S; X4=Q/E; X5=N/T/S; X6=D/E; X7=I/V; X8=I/V

SEQ ID NO:8: ADN Anc83

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTG

GGACCTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGG

TGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCG

GACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCT

GCGGTATAATCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACC

TCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCT

AAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAGTCACCACAGCGTGAGCCCGACTCCTCCXXX1G

GCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCCXXX2AAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACTCAGA

GTCAGTCCCCGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGATCTAATACAA

TGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCG

GGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGC

CCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACCTCGGGAGGCAGCACCAACG

ACAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTC

TCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCXXX3TTCA

AGCTCTTCAACATCCAGGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTC

ACCAGCACCATCCAGGTGTTTACGGACTCGGAATACCAGCTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCCCACCA

GGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGCTACCTGACTCTCAACA

ACGGTAGTCAGGCCGTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTCCCCTCTCAGATGCTGAGA

ACGGGCAACAACTTTXXX4TTCAGCTACACTTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACA

GCCAGAGTTTGGACAGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTACTACCTGTCAAGAACCCAG

ACTACGGGAGGCACAGCGGGAACCCAGACGTTGCAGTTTTCTCAGGCCGGGCCTAGCXXX5ATGGCGA

ATCAGGCCAAAAACTGGCTGCCTGGACCCTGCTACAGACAGCAGCGCGTCTCCACGACAACGTCGCAA

AACAACAACAGCAACrTTGCCTGGACTGGTGCCACCAAGTATCATCTGAACGGCAGAGACTCTCTGGT

GAATCCGGGCGTCGCCATGGCAACCCACAAGGACGACGAGXXX6CGCTTCTTCCCATCCAGCGGCXXX

7CTCATATTTGGCAAGCAGGGAGCTGGAAAAGACAACGTGGACTATAGCAACGTGATGCTAACCAGCG

AGGAAGAAATCAAGACCACCAACCCCGTGGCCACAGAAGAGTATGGCGTGGTGGCTGATAACCTACAG

CAGCAAAACACCGCTCCTCAAXXX8GGGACCGTCAACAGCCAGGGAGCCTTACCTGGCATGGTCTGGC

AGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAGATTCCTCACACAGATGGCAACTTTCAC

CCGTCTCCTTTAATGGGCGGCTTTGGACTTAAACATCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACTCC

TGTTCCTGCGGATCCTCCAACAACGTTCAACCAGGCCAAGCTGAATTCTTTCATCACGCAGTACAGCA CCGGACAAGT CAGC G TGGAGA T CGAGTGGGAGC T GCAGAAGGAGAACAGCAAGCGCT GGAACCCAGAG

ATTCAGTATACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTTAATACTGAGGGTGTTTA

CTCTGAGCCTCGCCCCATTGGCACTCGTTACCTCACCCGTAATCTG

XXX1 = ACG/AGC; XXX2 = AGA/AAG; XXX3 = AAC/AGC; XXX4 = CAA/GAA; XXX-5 = AAC/ACC/AGC; XXX-6 = GAC/GAG; XXX7 = ATC/GTC; XXX8 = ATA/GTA

SEQ ID NO:9: Polipéptido Anc84

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

DAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGA

KTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAX1KRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSGT

MAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTN

DNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLIWNMWGFRPKRLX2FKLFNIQVKEVTQNEGTKTIAKN

LTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQML

R T G U N FEFSY T FED V PFH SSYA H SQ SLD R LM N PLID Q Y LY Y LSR T Q ST G G T A G T Q Q LLFSQ A G PSN M S

AQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNFGVAMATHKDDEX3RFFPSSG

X4LMFGKQGAGKDNVDYSNVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGWADHLQQQNTAPIVGAVNSQGALPGMV

WQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGWFHP S PLMGG FGLKHPPPQIL I KNTPVPADPPTTFNQAKLNSFITQY

STGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL

X1=R/K; X2=N/S; X3=D/E; X4=I/V

SEQ ID NO:10: ADN Anc84

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTG GGACCTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGG TGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCG GACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCT GCGGTATAATCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACC TCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCT AAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCGTCACCACAGCGTTCCCCCGACTCCTCCACGGG CATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCCXXX1AAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACTCAGAG TCAGTCCCCGACCCTCAACCTATCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGATCTGGTACAAT G G CT G CAGG C GGTG GC GCACCAAT GG CAGACAATAAC GAAGGT G C C GAC GGAGTG G GTAG TTC C T CG G GAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCC CTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACCTCGGGAGGCAGCACCAACGA CAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCT CACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCXXX2TTCAA GCTCTTCAACATCCAGGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTCA CCAGCACCATCCAGGTGTTTACGGACTCGGAATACCAGCTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCCCACCAG GGCTGCCTGCCTCCGrTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGCTACCTGACTCTCAACAA CGGTAGTCAGGCCGTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTCCCCTCTCAGATGCTGAGAA CGGGCAACAACTTTGAGTTCAGCTACACTTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGC CAGAGTTTGGACAGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTACTACCTGTCAAGAACCCAGTC TACGGGAGGCACAGCGGGAACCCAGCAGTTGCTGTTTTCTCAGGCCGGGCCTAGCAACATGTCGGCTC AGGC CAAAAAC T GG C TG C C T GGAC CC T G C TACAGACAGCAGCGC GT CT C C AC GAC AC T G T C GC AAAAC AACAACAGCAACTTTGCCTGGACTGGTGCCACCAAGTATCATCTGAACGGCAGAGACTCTCTGGTGAA TCCGGGCGTCGCCATGGCAACCCACAAGGACGACGAGXXX3CGCTTCTTCCCATCCAGCGGCXXX4CT C ATG T T TG GCAAGC AGG GAGC TG GAAAAGACAAC G TG GAC TATAGCAAC GTGAT G C TAAC CAGC GAGG AAGAAATCAAGACCACCAACCCCGTGGCCACAGAACAGTATGGCGTGGTGGCTGATAACCTACAGCAG CAAAACACCGCTCCTATTGTGGGGGCCGTCAACAGCCAGGGAGCCTTACCTGGCATGGTCTGGCAGAA CCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAGATTCCTCACACAGATGGCAACTTTCACCCGT CTCCTTTAATGGGCGGCTTTGGACTTAAACATCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACTCCTGTT CCTGCGGATCCTCCAACAACGTTCAACCAGGCCAAGCTGAATTCTTTCATCACGCAGTACAGCACCGG ACAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAGAACAGCAAGCGCTGGAACCCAGAGATTC AGTATACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTTAATACTGAGGGTGTTTACTCT GAGCCTCGCCCCATTGGCACTCGTTACCTCACCCGTAATCTG

XXX-1 = AGA/AAA; XXX2 = AAC/AGC; XXX3 = GAC/GAG; XXX4 = ATC/GTC

SEQ ID NO:11: Polipéptido Anc94

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA DAAALE H DKAYDQQLKA G DNPYL RYNHADAEFQERLQEDTSFGGNL GRAVFQAKKRVLE P L G LVE E GA KTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGGTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTM AAGGGAPMADNWEGADGVGSSSGWWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYWNHLYKQISNGTSGGSTND NTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDKQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLT STIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRT GWNFEFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPX1NMSA QAKNWL PG PCYRQQRVS TTL SQNWNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFF PS SGVL MFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGWADNLQQQNTAPIVGAVNSQGALPGMVWQN RDVYLQGPIW AKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPABPPTTFSQAKLASFITQYSTG QVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL

X1=S/N

SEQ ID NO:12: ADN Anc94

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTG GGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGG TGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCG GACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCT GCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACC TCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCT AAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGTTCTCCAGACTCCTCTACGGG CA T C G GCAAGAAAGGC CAGCAGC CC GC GAAAAAGAGACTCAACT TTGGGCAGAC T GG C GAC T CAGAG T CAGTGCCCGACCCTCAACCAATCGGAGAACCCCCCGCAGGCCCCTCTGGTCTGGGATCTGGTACAATG GCTGCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCAGG AAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCC TCCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACTTCGGGAGGAAGCACCAACGAC AACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCTC ACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGC TCTTCAACATCCAGGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTTACC

AGCACGATTCAGGTCITTACGGACTCGGAATACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGG

CTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAATG

GCAGTCAGGCCGTGGGCCGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAAATGCTGAGAACG

GGCAACAACTTTGAG1TCAGCTACACGTTTGAGGACGTGCCTTTTCACAGCAGCTACGCGCACAGCCA

AAGCCTGGACCGGCTGATGAACCCCCTCATCGACCAGTACCTGTACTACCTGTCTCGGACTCAGTCCA

CGGGAGGTACCGCAGGAACTCAGCAGTTGCTATTTTCTCAGGCCGGGCCTXXXAACATGTCGGCTCAG

GCCAAAAACTGGCTACCCGGGCCCTGCTACCGGCAGCAACGCGTCTCCACGACACTGTCGCAAAATAA

CAACAGCAACTTTGCCTGGACCGGTGCCACCAAGTATCATCTGAATGGCAGAGACTCTCTGGTAAATC

CCGGTGTCGCTATGGCAACCCACAAGGACGACGAAGAGCGATTTTTTCCGTCCAGCGGAGTCTTAATG

TTTGGGAAACAGGGAGCTGGAAAAGACAACGTGGACTA'TAGCAGCGTTATGCTAACCAGTGAGGAAGA

AATTAAAACCACCAACCCAGTGGCCACAGAACAGTACGGCGTGGTGGCCGATAACCTGCAACAGCAAA

ACACCGCTCCTATTGrAGGGGCCGTCAACAGTCAAGGAGCCTTACCTGGCATGGTCTGGCAGAACCGG

GAGGTGTACCTGCAGGGTCCTATCTGGGCCAAG ATTCCTCACACGGACGGAAACT T T CA TCC CTCGCC

GCTGATGGGAGGCTT TGGACTGAAACACCC GC CTCC TCAGATCC TGAT TAAGAATACACCTGTT CCCG

CGGATCCTCCAACTACCTTCAGTCAAGCTAAGCTGGCG'TCGTTCATCACGCAGTACAGCACCGGACAG

GTCAGCGTG GAAAT T GAA T GG GAG CTG C AGAAAGAAAACAG CAAAC GC T GGAAC C CAGAGAT TC AATA

CACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTTAACACAGAAGGCACTTATTCTGAGC

CTCGCCCCATCGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTG

XXX1 = AGT/AAT

SEQ ID NO:13: Polipéptido Anc113

MAADGYLPDW LEDNLSEGIREW W DLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

DAAALEH DKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQ EKLQEDTSFG GNLG RAVFQAKKRVLEPLGLVEEGA

K T A PG K K R PV EX1SPQ R SPD SST G IG K K G Q Q PA X 2K R LN FG Q T G D SESV PD PQ PLG EPPA A PSG V G SG

TMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTHALPTYNNHLYKQISSQSAGSTN

D N TYFG YSTPW G YFD FN RFH CH FSPRD W Q RLIN N N W G FRPK K LX3FK LFH IQ V K EV TTN D G V TTIA M N

LT ST V Q V FSD S EY Q LP Y V LG S A H Q G C LP P FP A D V FM IP Q Y G Y LT LN N G S Q S V G R S SFY C LEY FPS Q M L

R T G N N FEFS Y T FED V P FH S S Y A H S Q S LD R LM N P LID Q Y LY Y LA R T Q S T T G G T A G N R ELQ FX ÍQ ñ G P S T

MAEQAKMWLPGPC YRQQRVSKTLDQWNNSN FAWTGATKYHLMGRNSLVNPGVAMATHKDDE DRF F P S S

G V LIFG K TG A A W K TT LEN V LM TX 5EEEIK T T N PV A TEEY G X 6V SSN LQ SX 7N T A PQ T Q T V N SQ G A LPG

M V W Q N R D V YLQ G PIW A K IPH TD G N FH PSPLM G G FG LK H PPPQ ILIK N T PV PA N PPEV FT PA K FA SFIT

Q Y STG Q V SV EIEW ELQ K EN SK R W N PEIQ Y TSN Y D K ST N V D FA V D SEG V Y SEPR PIG T R Y LT R N L

X-1=P/Q; X-2=K/R; X-3=R/N; X4=Y/H; X-5=N/S; X-6=V/I; X-7=A/S

SEQ ID NO:14: ADN Anc113

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTG G GAC C T GAAAC CT GGAGC CCCGAAACC CAAAGC CAAC CAGCAAAAGCAGGAC GACGGCCGGGGTCTGG TGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCG GACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCT GCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCATTTGGGGGCAACC TCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCT AAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGXXX1TCACCTCAGCGTTCCCCCGACTCCTCCACGG GCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCCXXX2AAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACTCAGA GTCAGTCCCCGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCGCCCTCTGGTGTGGGATCTGGTACAA TGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGACGGAGTGGGTAATGCCTCA GGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATTACCACCAGCACCCGAACCTGGGC CCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAGTCAAAGTGCAGGTAGTACCAACGACA ACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCTCA CCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAAGCTGXXX3TTCAAGC TCTTCAACATCCAGGrCAAGGAGGTCACGACGAATGACGGCGTTACGACCATCGCTAATAACCTTACC

AGCACGGTTCAGGTAT'TCTCGGACTCGGAATACCAGCTGCCGTACGTCCTCGGCTCTGCGCACCAGGG

CTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGCTACCTGACTCTCAACAATG

GCAGTCAGTCTGTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTCCCCTCTCAGATGCTGAGAACG

GGCAACAACTTTGAGTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCACACAGCCA

GAGCCTGGACCGGCTGATGAATCCCCTCATCGACCAGTACTTGTACTACCTGGCCAGAACACAGAGTA

CCACAGGAGGCACAGCTGGCAATCGGGAACTGCAGTTTXXX4CAGGCCGGGCCTTCAACTATGGCCGA

ACAAGCCAAGAATTGGTTACCTGGACCTTGCTACCGGCAACAAAGAGTCTCCAAAACGCTGGATCAAA ACAACAACAGCAACTTTGCTTGGACTGGTGCCACCAAATATCACCTGAACGGCAGAAACTCGTTGGTT AATCCCGGCGTCGCCATGGCAACTCACAAGGACGACGAGGACCGCTTTTTCCCATCCAGCGGAGTCCT

GATTTTTGGAAAAACTGGAGCAGCTAACAAAACTACATTGGAAAATGTGTTAATGACAXXX5GAAGAA

GAAAT TAAAAC TAC TAAT C C T G TAGC CAC G GAAGAATAC GGGXXX 6 GT CAGC AG C AAC T TACAATC GX

XX7AATACTGCACCCCAGACACAAACTGTCAACAGCCAGGGAGCCTTACCTGGCATGGTCTGGCAGAA

CCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCACACGGATGGCAACTTTCACCCGT

CTCCTTTGATGGGCGGCTTTGGACTTAAACATCCGCCTCCTCAGATCCTGATCAAGAACACTCCCGTT

CCCGCTAATCCTCCGGAGGTGTTTACTCCTGCCAAGTTTGCTTCGTTCATCACACAGTACAGCACCGG

ACAAGTCAGCGTGGAAATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATTC AGTACACCTCCAACTATGATAAGTCGACTAATGTGGACTTTGCCGTTGACAGCGAGGGTGTTTACTCT GAGCCTCGCCCTATTGGCACTCGTTACCTCACCCGTAATCTG

XXX1 = CCG/CAG; XXX2 = AAA/AGA; XXX3 = CGG/AAC; XXX4 = TAC/CAC; XXX5 = AAT/AGT; XXX6 = GTA/ATA; XXX7 = GCT/TCT

SEQ ID NO:15: Polipéptido Anc126

M AADGYLPDW LEDNLSEGIREW W DLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

D AAALEH DKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQ ERLQEDTSFGGNLG RAVFQAKKRVLEPLGLVEEGA

K T A P G K K R PV EQ SPQ EPD SSSG IG K X 1G Q Q PA X 2K R LN FG Q T G D SESV PD PQ PLG EPPA A PSG V G SN T

MASGGGAPM ADNNEGADGVGNX3SGNKHCDSTW LGDRVITTSTRTW ALPTYNNHLYKQISSQSGASND

N H YFG YST PW G Y FB FN R FH C H FSPR D K Q R LIN N N W G FR PK X4LN FK LFN IQ V K EV T TN D G T TT IA N N L

T ST V Q V FT D SEY Q LPY V LG SA H Q G C LPPFPA D V FM IPQ Y G Y LT LN N G SQ A V G R SSFY C LEY FPSQ M LR

T G M N F X 5FS Y T FE D V P FH S S Y A H S Q S L D R L M N P L ID Q Y L Y Y L X 6R T Q T T S G T A Q N R E L X 7FS Q A G P S S

MX8NQAKNWLPGPCYRQQRVSKTAHDNHNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEDKFFPM

SG VLIFG KQ G AG ASN VD LD N VM ITD EEEIKTTN PVATEQ YG TVATN LQ SSN TAPATG TVN SG G ALPG M

W Q D R D V Y L Q G P IW A K IP H T D G H FH P S P L M G G FG L K H FP P Q IL IK N T P V P A N P P T T FS P A K FA S FIT Q

Y ST G Q V S V EIEW ELQ K EN SK R W N PEIQ Y T SN Y N K SX 9N V D FT V D T N G V Y SEPR PIG T R Y LT R N L

X1=S/T; X2=K/R; X3=A/S; X4=R/K; X5=T/Q; X6=S/N; X7=Q/L; X8=A/S; X9=A/T

SEQ ID NO:16: ADN Anc126

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTG

GGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGG

TGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCG

GATGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCT

GCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACC

TCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGAGGGTTCTCGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGGTGCT

AAGACGGCTCCTGGAAAGAAACGTCCGGTAGAGCAGTCGCCACAAGAGCCAGACTCCTCCTCGGGCAT

TGGCAAGXXX1GGCCAGCAGCCCGCTXXX2AAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACTCAGAGTC

AGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCCCCCTCTGGTGTGGGATCTAATACAATGG

C TT CAGGC GGTGGCGCAC CAAT G G CAGACAAT AACGAAG GC GCC GAC GGAGT G GG TAAT XXX3TCA G G

AAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACATGGGCCT

TGCC CACCT ATAACAAC CAC C T C TACAAGCAAA TCTCCAGT CAATCAG G G GC CAG CAAC GACAACCAC

TACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGATTTCAACAGATTCCACTGCCATTTCTCACCACG

TGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGXXX4CTCAACTTCAAGCTCTTC

AACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGACGAATGATGGCACCACGACCATCGCTAATAACCTTACCAGCAC

g g t t c a a g t c t t c a c g g a c t c g g a g t a c c a g t t g c c g t a c g t c c t c g g c t c t g c g c a c c a g g g c t g c c

TCCCTCCGTTCCCGGCGGACGTGTTCATGATTCCGCAGTACGGCTACCTAACGCTCAACAATGGCAGC

CAGGCAGTGGGACGGrCATCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACGGGCAA

TAACTTTXXX5TTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGC

CTGGACCGGCTGATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGXXX6AGAACTCAGACTACGT

CCGGAACTGCCCAAAACAGGGAGTTGXXX7TTTAGCCAGGCGGGTCCATCTAGCATGXXX8AATCAGG

CCñAAAACTGGCTACCTGGACCCTGTTACCGGCAGCAGCGCGTTTCTAAAACAGCAAATGACAACAAC

AACAGCAACTTTGCCTGGACTGGTGCTACAAAATATCACCTTAATGGGCGTGATTCTTTAGTCAACCC

TGGCCCTGCTATGGCCTCACACAAAGACGACGAAGACAAGTTCTTTCCCATGAGCGGTGTCTTGATTT

TTGGAAAGCAGGGCGCCGGAGCTTCAAACGTTGATTTGGACAATGTCATGATCACAGACGAAGAGGAA

ATCAAAACCACTAACCCCGTGGCCACCGAACAATATGGGACTGTGGCAACCAATCTCCAGAGCAGCAA

CACAGCCCCTGCGACCGGAACTGTGAATTCTCAGGGAGCCTTACCTGGAATGGTGTGGCAAGACAGAG

ACGTATACCTGCAGGGTCCTATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGATGGACACTTTCACCCGTCTCCT

CTCATGGGCGGCTTTGGACTTAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACGCCTGTTCCTGC

GAATC C T C C GACAAC G TTTTCGCCT GCAAAG TTTG CTTC ATT CATCAC C CAGTAT T CCACAG GACAAG

TGAGCGTGGAGATTGAATGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATACAGTAT

ACATCTAACTATAATAAATCTXXX9AACGTTGATTTCACTGTGGACACCAATGGAGTTTATAGTGAGC CTCGCCCCATTGGCACeCGTTACCTCACCCGTAACCTG

XXX1 = TCA/ACA; XXX2 = AAA/AGA; XXX3 = GCC/TCC; XXX4 = AGA/AAA; XXX5 = ACC/CAG; XXX6 = AGC/AAC; XXX7 = CAG/CTG; XXX8 = GCT/TCT; XXX9 = GCC/ACC

SEQ ID NO:17: Polipéptido Anc127

M AADGYLPDW LEDNLSEGIREW W DLKPGAPQPKANQQHQDDXlRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNE

ADAAALEH DKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQ ER LQ E DTS FGGNLGRAVFQAKKRVLE P L G L V E E A

A K TA PG K K R PV EQ SPQ EPD SSSG IG K SG Q Q PA X2K R LN FG Q TG D SESV PD PQ PLG EPPA A PSG V G SN T

MASGGGAPMADNMEGADGVGNS SGNWHCDSTWLGDRVITTS TRTW A LPTYNHHLYKQI S SQSGASNDN

H YFG YSTPW G YFD FN RFH CH FSPRD W Q RLIN N N W G FRPKX3LN FKLFKIIG VKEV TG N D G TTTIAN T1LT

S T V Q V FT D SEY Q LPY V LG SA H Q G C LPPFPA D V FM IPQ Y G Y LT LN H G SQ A V G R SSFY C LEY FPSQ M LR T

G N N FX 4FS Y T FE D V P F H S S Y A H S Q S L D R L M N P L ID Q Y L Y Y L X 5R T Q T T S G T T Q Q S R LX 6FS Q A G P S S M

X7QQAX8N W LPG PCYRQQRVSKTANDN NNSNFAW TX9ATKYH LNGRDSLVN PG PAM ASHKDDEEKFFP

M H G X10LIFG KG G TG A SN V D LD H V M ITD EEEIRTTN PV A TEG YG TV A TN LQ SSW TA PA TG TV N SQ G A L

PG M V W Q D RD V Y LQ G PIW A K IPH T D G H FH PSPLM G G FG LK H PPPQ ILIK N TPV PA N PPT T FSPA K FA SF

I TQYS TGQVS V E I E WELQ KEN SKRWNP E I QYT SNYNKSVNVDFTVDTNGV Y S E P R P IG T R Y L TRNL

X1=G/S; X2=R/K; X3=K/R; X4=T/Q; X5=S/R; X6=Q/L; X7=A/S; X8=K/R; X9=G/A; X10=V/N

SEQ ID NO:18: ADN Anc127

ATGGCTGCTGACGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTTCTGAAGGCATTCGTGAGTGGTG GGATCTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAAGCGAACCAACAACACCAGGACGACXXX1CGGGGTCTT GTGCTTCCGGG TTACAAATAC C T C GGAC CC T T TAAC GGA C T C GACAAAG GAGAGCCG GT CAAC GAGG C GGACGCGGCAGCCCTCGAACACGACAAAGCTTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGTGACAACCCGTACC T C AAG TACAAC CAC GC C GAC G C C GAGT T TCAGGAG C GTC T T CAAGAAGATAC GTCTTTTGGGG GCAAG CTTGGCAGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGGTCCTTGAGCCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCAGC TAAAACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAACAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCATCATCTGGTA TT GGCAAA T C GG GC CAACAGC C T GC C X X X 2 AAAAGACTAAAT T TC GG T CAGACT G GAGA C TCAGAG T C

AGTCCCAGACCCTCAACCTCTCGGAGAACCACCAGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTAATACAATGG

CTTCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGTGCCGATGGAGTGGGTAATTCCTCAGGA

AATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCAGAACCTGGGCCCT

GCCCACTTACAACAACCATCTCTACAAGCAAATCTCCAGCCAATCAGGAGCTTCAAACGACAACCACT

ACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTTAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGT

GACTGGCAGCGACTCATTAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGXXX3CTCAACTTCAAGCTCTTCA

ACATCCAAGTTAAAGAGGTCACGCAGAACGATGGCACGACGACTATTGCCAATAACCTTACCAGCACG

GTTCAAGTGTTTACGGACTCGGAGTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCGCACCAAGGCTGTCT

CCCGCCGTTTCCAGCGGACGTCTTCATGATCCCTCAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGAAGTC

AAGCGGTGGGACGCTCATCCTTTTACTGCCTGGAGTACTTCCCTTCGCAGATGCTAAGGACTGGAAAT

AA CTTCXXX4TTCAGCTATACCTTCG AGG ATGTACCTTTTCACAGCAG CTACGCTCACAGCCAG AGTT

TGGATCGCTTGATGAATCCTCTTATTGATCAGTATCTGTACTACCTGXXX5AGAACGCAAACAACCTC

TGGAACAACCCAACAATCACGGCTGXXX6TTTAGCCAGGCTGGGCCTTCGTCTATGXXX7CAGCAGGC

C X X X 8 AATT G GC TAC CT GGGC C C T GC TA C C G G CAACAGAGAGT TT CAAAGAC T GCTAA C GACAACAAC

AACAGTAACTTTGCTTGGACAXXX9GCCACCAAATATCATCTCAATGGCCGCGACTCGCTGGTGAATC

CAGGACCAGCTATGGCCAGTCACAAGGACGATGAAGAAAAATTTTTCCCTATGCACGGCXXX10CTAA

TATT T GGCAAACAAGGGA CAG G GG CAAG TAAC GTAGATT T AGATAAT GTAAT GATTAC G GAT GAAGAA GAGAT TC G TAC CAC C AAT C CT G T G GCAA CAGAGCAG TAT GGAAC T G T G GCAAC TAAC T T GCAGAGC T C

AAATACAGCTCCCGCGACTGGAACTGTCAATAGTCAGGGGGCCTTACCTGGCATGGTGTGGCAAGATC

GTGACGTGTACCTTCAAGGACCTATCTGGGCAAAGATTCCTCACACGGATGGACACTTTCATCCTTCT

CC TC T GAT GGGAGGCTTTGGACT GAAACAT CCGCCTCCTC AAATC T T GATCAAAAATAC TC C G GTAC C

GGCAAAT C C T CC GACGACT TT CAG CC CGGC CAAGT T TGC T T CATT T AT CAC T CAGTAC T CCAC TGGAC

AGGTCAGCGTGGAAATTGAGTGGGAGCTACAGAAAGAAAACAGCAAACGTTGGAATCCAGAGATTCAG

TACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTAGACACTAATGGTGTTTATAGTGA

ACCTCGCCCTATTGGAACCCGGTATCTCACACGAAACTTG

XXX-1 = GGT/AGT; XXX2 = AGA/AAA; XXX3 = AAA/AGA; XXX4 = ACA/CAG; XXX5 =-AGC/AGA; XXX6 = CAA/CTC; XXX7 = GCT/TCT; XXX8 = AAA/AGA; XXX9 = GGG/GCG; XXX10 = GTT/GAC

SEQ ID NO:19: Polipéptido Anc80L27

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

DAAALEHDKAYDQQLKAG DNPYLRYNHADAE FQ ER LQ E DT S FGGHLGRAVFQAKKRVLE PLG LV EEG A

KTAPG KKRFVEQ SPQ EPD SSSG IG KKG Q Q PARKRLN FG Q TG D SESV PD PQ PLG EPPA APSG VG SN TM A

AGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTHLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGGSTNDNT

YFG YSTPW G YFD FN RFH C H FSPRD W Q R LIN N N W G FRPK RLN FK LFN IQ V K EV TTN D G TTTIA N N LTST

V Q V FTD SEYQ LPYV LG SA H Q G C LPFFPA D V FM IPQ YG YLTLN N G SQ A V G R SSFYC LEYFPSQ M LR TG N W FEFSYTFED V PFH SSYA H SQ SLD R LM N PLID Q YLYYLSR TQ TTSG TA G N R TLQ FSQ A G PSSM A H Q A K NW LPGPCYRQQRVSKTANQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMATHKDDEDKFFPMSGVLIFG

KQGAGNSNVDLDNVMITNEEEIKTTNPVATEQYGTVATNLQSANTAPATGTVNSQGALPGMVWQDRDV

Y LQ G P IW A K IP H T D G H FH PS P LM G G FG LK H P PP Q ILIK N T P V P A H P P T T FS P A K FA S FIT Q Y S T G Q V S

V EIEW ELQ K EN SK R W N PEIQ YT SN Y N K ST N V D FA V D TN G V Y SEPR PIG TR YLT R N L

SEQ ID NO:20: Polipéptido Anc80L59

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

DAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGA

KTAPG KKRPV EQ SPQ EPD SSSG IG KKG Q Q PA KKRLN FG Q TG D SESV PDPQ PLG EPPAAPSG V G SN TM A

SGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASTNDNT

YFG YSTPW G YFD FN RFH C H FSPRD W Q R LIN N N W G FRPK RLN FK LFN IQ V K EV TTN D G TTTIA N N LTST V Q V FTD SEYQ LPYV LG SA H Q G CLPPFFA D V FM IPQ YG YLTLN N G SQ fiV G RSSFYC LEYFPSQ M LRTG N N FQ FSYTFED V PFH SSYA H SQ SLD RLM M PLID Q YLYYLSRTQ TTSG TAG W RELQ FSQ A G PSSM A H Q A K NWLPGPCYRQQRVSKTTNQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMATHKDDEDKFFPMSGVLIFG KQGAGNSNVDLDNVMITNEEEIKTTNPVATEEYGTVATNLQSANTAPATGTVNSQGALPGMVWQNRDV Y LQ G PIW A K IP H T D G H FH PS P LM G G FG LK H P PP Q ILIK N T P V P A N P P T T FS P A K FA S FIT Q Y S T G Q V S V EIEW ELQ K EN SK RW N PEIQ YTSW YN K STN V D FA V D TN G V YSEPRPIG TRYLTRN L

SEQ ID NO:21: Polipéptido Anc80L60

MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAA

DAAALE H DKAYDQQL KA G DN PYLRYN HA DAE FQ E RLQEDTSFGGN LGRAVFQAKKRVL E P L G LV EE GA

KTAPG KKRPV EQ SPQ EPD SSSG IG KK G Q Q PA RKRLN FG Q TG D SESVPD PQ PLG EPPAA PSG V G SN TM A AGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGGSTNDNT YFG YSTPW G YFD FN RFH CH FSPRD W Q RLIN N N W G FRPKRLN FKLFW IQ VKEV TTN D G TTTIAW N LTST V Q V FTD SEYQ LPYV LG SA H Q G C LPPFPA D V FM IPQ YG YLTLN N G SQ A V G RSSFYC LEYFPSQ M LRTG N N FEFSYTFED V PFH SSYA H SQ SLD RLM M PLID Q YLYYLSR TQ TTSG TA G N RELQ FSQ A G PSSM A N Q A K HW LPGPCYRQQRVSKTTNQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMATHKDDEDKFFPMSGVLIFG KQGAGNSNVDLDNVM ITSEEEIKTTNPVATEEYGTVATNLQSSNTAPATGTVNSQGALPGM VW QERDV Y LQ G P IW A K IP H T D G H FH PS P LM G G FG LK H P PP Q ILIK N T P V P A N P P T T FS P A K FA S FIT Q Y S T G Q V S V EIEW ELQ K EN SK RW N PEIQ YTSN YM K STN V D FA V D TN G V YSEPRPIG TRYLTRW L

SEQ ID NO:22: Polipéptido Anc80L62

M AADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKFGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVWAA

DAAALE H DKAY DQQ L KA G DN P Y L RYNHA DAE FQ E RLQ E DTSFGGNL GRAV FQAKKRVL E P L G L V E E GA

K TA PG K K R PV EQ SPQ EPD SSSG IG K K G Q Q PA RK RLN FG Q TG D SESV PD PQ PLG EPPA A PSG V G SN TM A

SGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGGSTNDNT

YFG YSTPW G YFD FN RFH C H FSPRD W Q R LIN N H W G FRPK K LN FK LFN IQ V K EV TTN D G TTTIA N N LTST V Q V FT D SEY Q LPY V LG SA H Q G C LPPFPA D V FM IPQ Y G Y LT LN N G SG A V G R SSFY C LEY FPSQ M LR T G N N FEFSY T FED V PFH SSY A H SQ SLD R LM N PLID Q YLY Y LSR T Q T TSG T A G N R ELQ FSQ A G PSSM A N Q A K KWLPGPCYROQRVSKTTNQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMATHKDDEDKFFPMSGVLTFG KQGAGW SNVDL DNVMIT S E E E I K T TNPVATEEYGTVATNLQSANTAPATGTVNSQGALPGMVWQDRDV YLQG P IW A K IP HTDGHFH P S PLM G G FG LK H P PP Q ILIK U T P VPAN P P T T F S P A K F A S F IT Q Y S T G Q V S V E I E W ELQKENS K R W N PEIQ YT SN YN K STNVDFAVDTNGVYS E P R P I GTR Y LT R N L

SEQ ID NO:23: Polipéptido Anc80L65

MAADGYL PD W LED N LSEG IR E WWDLK P GA PK P KANQQ KQ D DGRGLVL P GYKY L G P FNG L DK GE PVNAA

DAAALEH DKAYDQGLKAGDNPYLRYNHADAEFQ ERLQEDTSFGGNLG RAVFQAKKRVLEPLGLVEEGA

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de cápside de virus adenoasociado (AAV) que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 23.

2. El polipéptido de cápside de AAV de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de cápside de AAV o una partícula vírica que comprende el polipéptido de cápside de AAV:

presenta una menor seroprevalencia que un polipéptido de cápside de AAV2 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV2, y en el que el polipéptido de cápside de AAV o una partícula vírica que comprende el polipéptido de cápside de a Av presenta una seroprevalencia aproximadamente igual o inferior a la de un polipéptido de cápside de ^aAV8 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV8; y/o

se neutralizan en menor medida por suero humano que un polipéptido de cápside de AAV2 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV2, y en el que el polipéptido de cápside de AAV o una partícula vírica que comprende el polipéptido de cápside de AAV se neutraliza en una menor medida o similar por suero humano, que un polipéptido de cápside de AAV8 o una partícula vírica que comprende un polipéptido de cápside de AAV8.

3. El polipéptido de cápside de AAV de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de cápside de AAV está purificado.

4. El polipéptido de cápside de AAV de la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 23.

9. El polipéptido de cápside de AAV de la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene al menos un 98 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 23.

6. El polipéptido de cápside de AAV de la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 23.

7. El polipéptido de cápside de AAV de la reivindicación 1, en el que el polipéptido tiene un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 23.

Una partícula vírica que comprende el polipéptido de cápside de AAV de la reivindicación 1.

9. La partícula vírica de la reivindicación 8, que además comprende un transgén.