ES2844000T3 - Animales no humanos que expresan el complejo CD3 humanizado - Google Patents
Animales no humanos que expresan el complejo CD3 humanizado Download PDFInfo
- Publication number
- ES2844000T3 ES2844000T3 ES15808501T ES15808501T ES2844000T3 ES 2844000 T3 ES2844000 T3 ES 2844000T3 ES 15808501 T ES15808501 T ES 15808501T ES 15808501 T ES15808501 T ES 15808501T ES 2844000 T3 ES2844000 T3 ES 2844000T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- mouse
- human
- protein
- antigen
- cd3y
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 28
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 262
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 209
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 183
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 135
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 103
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims abstract description 55
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims abstract 10
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 claims abstract 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 174
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 174
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 174
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 145
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 91
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 73
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 64
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 claims description 53
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 claims description 53
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 39
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 32
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 30
- 102000052645 human CD38 Human genes 0.000 claims description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 25
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 24
- 101000727061 Homo sapiens Complement receptor type 1 Proteins 0.000 claims description 22
- 102100030886 Complement receptor type 1 Human genes 0.000 claims description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 16
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 14
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 14
- -1 CD79 Proteins 0.000 claims description 13
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 11
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 claims description 8
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 8
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 8
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 claims description 8
- 102100023144 Zinc transporter ZIP6 Human genes 0.000 claims description 8
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 8
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 6
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 5
- 102100040036 Adhesion G-protein coupled receptor G4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100023003 Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Human genes 0.000 claims description 4
- 101100208111 Arabidopsis thaliana TRX5 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 208000006400 Arbovirus Encephalitis Diseases 0.000 claims description 4
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100027522 Baculoviral IAP repeat-containing protein 7 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100026094 C-type lectin domain family 12 member A Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 108091058556 CTAG1B Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100025466 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 4
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 4
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 claims description 4
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 4
- 102000012804 EPCAM Human genes 0.000 claims description 4
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150076616 EPHA2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150016325 EPHA3 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 claims description 4
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 4
- 102100030340 Ephrin type-A receptor 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100030324 Ephrin type-A receptor 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100031507 Fc receptor-like protein 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 101150032879 Fcrl5 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims description 4
- 102100035139 Folate receptor alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000369 Glutamate Carboxypeptidase II Proteins 0.000 claims description 4
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 4
- 101000959604 Homo sapiens Adhesion G-protein coupled receptor G4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000757191 Homo sapiens Ankyrin repeat domain-containing protein 30A Proteins 0.000 claims description 4
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000936083 Homo sapiens Baculoviral IAP repeat-containing protein 7 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000912622 Homo sapiens C-type lectin domain family 12 member A Proteins 0.000 claims description 4
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 101000793651 Homo sapiens Calreticulin Proteins 0.000 claims description 4
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000914337 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001023230 Homo sapiens Folate receptor alpha Proteins 0.000 claims description 4
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001011441 Homo sapiens Interferon regulatory factor 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 4
- 101001063456 Homo sapiens Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 claims description 4
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000576802 Homo sapiens Mesothelin Proteins 0.000 claims description 4
- 101000628547 Homo sapiens Metalloreductase STEAP1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000628535 Homo sapiens Metalloreductase STEAP2 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001133081 Homo sapiens Mucin-2 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000972284 Homo sapiens Mucin-3A Proteins 0.000 claims description 4
- 101000972286 Homo sapiens Mucin-4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000972282 Homo sapiens Mucin-5AC Proteins 0.000 claims description 4
- 101000972276 Homo sapiens Mucin-5B Proteins 0.000 claims description 4
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 claims description 4
- 101001131670 Homo sapiens PWWP domain-containing DNA repair factor 3A Proteins 0.000 claims description 4
- 101000613490 Homo sapiens Paired box protein Pax-3 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000601724 Homo sapiens Paired box protein Pax-5 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001123448 Homo sapiens Prolactin receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 101001136981 Homo sapiens Proteasome subunit beta type-9 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000579425 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Proteins 0.000 claims description 4
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000633784 Homo sapiens SLAM family member 7 Proteins 0.000 claims description 4
- 101100420560 Homo sapiens SLC39A6 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101000873927 Homo sapiens Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000904724 Homo sapiens Transmembrane glycoprotein NMB Proteins 0.000 claims description 4
- 101000638154 Homo sapiens Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000801255 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000836268 Homo sapiens U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000808108 Homo sapiens Uroplakin-3a Proteins 0.000 claims description 4
- 101000955999 Homo sapiens V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 4
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100030126 Interferon regulatory factor 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 241000701460 JC polyomavirus Species 0.000 claims description 4
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 claims description 4
- 241000589248 Legionella Species 0.000 claims description 4
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 claims description 4
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 claims description 4
- 102100031036 Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims description 4
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 claims description 4
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 102100025096 Mesothelin Human genes 0.000 claims description 4
- 102100026712 Metalloreductase STEAP1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100026711 Metalloreductase STEAP2 Human genes 0.000 claims description 4
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 claims description 4
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100034263 Mucin-2 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022497 Mucin-3A Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022693 Mucin-4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022494 Mucin-5B Human genes 0.000 claims description 4
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 claims description 4
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010012255 Neural Cell Adhesion Molecule L1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100024964 Neural cell adhesion molecule L1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 claims description 4
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 claims description 4
- 102100040891 Paired box protein Pax-3 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100037504 Paired box protein Pax-5 Human genes 0.000 claims description 4
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 4
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 claims description 4
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035764 Proteasome subunit beta type-9 Human genes 0.000 claims description 4
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 claims description 4
- 102100028286 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Human genes 0.000 claims description 4
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 4
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims description 4
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100037421 Regulator of G-protein signaling 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710140403 Regulator of G-protein signaling 5 Proteins 0.000 claims description 4
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 4
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 claims description 4
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 claims description 4
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 claims description 4
- 102100029198 SLAM family member 7 Human genes 0.000 claims description 4
- 108091006938 SLC39A6 Proteins 0.000 claims description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 4
- 241000607720 Serratia Species 0.000 claims description 4
- 102100035748 Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3 Human genes 0.000 claims description 4
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 claims description 4
- 101150057140 TACSTD1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 claims description 4
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 claims description 4
- 102100031989 Transmembrane protease serine 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100033726 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100027244 U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100038854 Uroplakin-3a Human genes 0.000 claims description 4
- 102100038929 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 4
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 claims description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 4
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 4
- 108040000983 polyphosphate:AMP phosphotransferase activity proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 4
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 claims description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 3
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims description 3
- 101100438927 Mus musculus Cd38 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000046508 human CR1 Human genes 0.000 claims description 3
- 108700039855 mouse a Proteins 0.000 claims description 3
- 101000691463 Homo sapiens Placenta-specific protein 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026181 Placenta-specific protein 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 claims 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 claims 1
- 101000621309 Homo sapiens Wilms tumor protein Proteins 0.000 claims 1
- 102100034937 Poly(A) RNA polymerase, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims 1
- 102000046004 human WT1 Human genes 0.000 claims 1
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 abstract description 8
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 abstract description 8
- 241001289435 Astragalus brachycalyx Species 0.000 abstract 1
- 235000002917 Fraxinus ornus Nutrition 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 254
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 148
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 68
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 44
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 42
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 41
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 22
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 19
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 19
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 18
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 16
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 13
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 12
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 9
- 241000712899 Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus Species 0.000 description 8
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 6
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 6
- 101000738335 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 5
- 102100037906 T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 101100438932 Homo sapiens CD3D gene Proteins 0.000 description 4
- 101100438942 Homo sapiens CD3E gene Proteins 0.000 description 4
- 101100112772 Homo sapiens CD3G gene Proteins 0.000 description 4
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 4
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 4
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 4
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 4
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100024003 Arf-GAP with SH3 domain, ANK repeat and PH domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 3
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 3
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 3
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 3
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 101100438934 Mus musculus Cd3d gene Proteins 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000040856 WT1 Human genes 0.000 description 3
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 description 3
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 3
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 101001073212 Arabidopsis thaliana Peroxidase 33 Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 2
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 2
- 101001123325 Homo sapiens Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101100112774 Mus musculus Cd3g gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 102100028961 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-beta Human genes 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 102100035891 T-cell surface glycoprotein CD3 delta chain Human genes 0.000 description 2
- 102100037911 T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain Human genes 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Chemical group OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100025218 B-cell differentiation antigen CD72 Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 description 1
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101150002659 CD38 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100115215 Caenorhabditis elegans cul-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100372902 Caenorhabditis elegans vha-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101000934359 Homo sapiens B-cell differentiation antigen CD72 Proteins 0.000 description 1
- 101100112778 Homo sapiens CD247 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100220062 Homo sapiens CD38 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101000854886 Homo sapiens Immunoglobulin iota chain Proteins 0.000 description 1
- 101000938702 Homo sapiens N-acetyltransferase ESCO1 Proteins 0.000 description 1
- 101500025562 Homo sapiens Saposin-A Proteins 0.000 description 1
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102100020744 Immunoglobulin iota chain Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100060131 Mus musculus Cdk5rap2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010018324 Surrogate Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000002663 Surrogate Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229940000425 combination drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003287 lymphocyte surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960003816 muromonab-cd3 Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012831 peritoneal equilibrium test Methods 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000012636 positron electron tomography Methods 0.000 description 1
- 238000012877 positron emission topography Methods 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000010242 retro-orbital bleeding Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 231100000155 toxicity by organ Toxicity 0.000 description 1
- 230000007675 toxicity by organ Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un ratón genéticamente modificado, que comprende en un locus CD3ε endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3ε quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de una proteína CD3ε humana unida operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3ε de ratón, en un locus CD3δ endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3δ quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD3δ humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3δ de ratón, y en un locus CD3γ endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3γ quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD3γ humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3γ de ratón, en donde el ratón expresa sobre la superficie de sus linfocitos T un complejo CD3 humanizado funcional que comprende las proteínas CD3ε, CD3δ y CD3γ quiméricas humanas/ratón y en donde los loci CD3ε, CD3δ y CD3γ endógenos de ratón están modificados genéticamente para no expresar dominios extracelulares funcionales de las proteínas CD3ε, CD3δ y CD3γ endógenas de ratón.
Description
DESCRIPCIÓN
Animales no humanos que expresan el complejo CD3 humanizado
Campo de la invención
Se proporciona un ratón genéticamente modificado, que comprende en su genoma una secuencia de ácido nucleico que codifica un CD3e humanizado, un CD38 humanizado y un CD3y humanizado. Por tanto, se proporcionan ratones genéticamente modificados que expresan el complejo CD3 humanizado. Se proporciona también en el presente documento un modelo para ensayos preclínicos de agentes terapéuticos basados en CD3, por ejemplo, anticuerpos basados en CD3, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos basados en CD3.
Antecedentes de la invención
Además de las subunidades receptoras de linfocitos T, por ejemplo, TCRa y TCRp muy variables, el complejo receptor de linfocitos T sobre la superficie de un linfocito T comprende las cadenas invariantes CD3e, CD38 y CD3y, que forman heterodímeros que consisten en CD3eS y CPB3ey. Asociada también con el complejo TCR/CD3 está la cadena Z, que está presente como homodímero unido a disulfuro.
Las cadenas de CD3 juegan un papel crucial en el ensamblaje del receptor de linfocitos T, el transporte a la superficie celular, la endocitosis de los receptores superficiales, el desarrollo de linfocitos T, y la señalización de linfocitos T. Por ejemplo, se ha demostrado a través de estudios de deficiencias de diversas subunidades de CD3, que las cadenas de CD3 son importantes para la transición de linfocitos T de doble negativo (CD4-CD8- o DN) a doble positivo (CD4+CD8+ o DP) a un único positivo (CD4+ o CD8+ o SP). Además, cada una de las cadenas CD3e, CD38 y CD3y contiene un motivo de activación basado en la tirosina inmunorreceptora (ITAM) mientras que el dímero de la cadena Z contiene 6 ITAM totales. Estos motivos sirven como módulos de señalización, y se fosforilan mediante las quinasas asociadas tras la participación del TCR.
Los anticuerpos contra CD3 han mostrado agrupar CD3 sobre los linfocitos T, produciendo por tanto la activación de los linfocitos T de una manera similar a la participación de los TCR por las moléculas MHC cargadas de péptidos. Por tanto, se han propuesto anticuerpos dirigidos contra CD3 como candidatos terapéuticos destinados a la activación de los linfocitos T. Además, se han propuesto anticuerpos biespecíficos con capacidad de unión a CD3 y un antígeno diana para usos terapéuticos que implican el direccionamiento de las respuestas inmunitarias de los linfocitos T a tejidos y células que expresan el antígeno diana.
Es particularmente deseado un modelo animal conveniente para el ensayo preclínico de anticuerpos terapéuticos monoespecíficos y biespecíficos basados en CD3.
El documento WO2003/006639 divulga un animal transgénico que comprende un polipéptido humano implicado en el reconocimiento y/o la activación antigénica por linfocitos T. U. Kuhn et al., Sci Transl Med. 3(68):68ra10 (20l1), divulga ratones transgénicos que expresan la cadena s humana del complejo CD3.
Sumario de la invención
Se proporciona en el presente documento un ratón modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1. El locus CD3 endógeno de ratón está genéticamente modificado para codificar un dominio extracelular de CD3e humana, un dominio extracelular de CD38 humana y un dominio extracelular de CD3y humana. El locus CD3 endógeno de ratón está genéticamente modificado de tal manera que no expresa el dominio o dominios extracelulares de la proteína o proteínas de ratón correspondientes. En una realización, el locus CD3 endógeno de ratón codifica además los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína o proteínas endógenas CD3 de ratón correspondientes, en donde el animal expresa una proteína CD3 quimérica sobre la superficie de sus linfocitos T que comprende el dominio extracelular de la proteína CD3 humana y los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína CD3 endógena de ratón. En una realización, la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifica(n) el dominio extracelular de CD3 humano en el ratón se une de manera operativa a la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifica(n) los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína o proteínas CD3 endógenas de ratón correspondientes. En una realización particular, el animal no humano comprende (a) en un locus CD3e endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una CD3e humana unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3e endógena de ratón, (b) en el locus CD38 endógeno, una secuencia de ácido nucleico codifica un dominio extracelular de CD38 humana unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de una c D38 endógena de ratón, y (c) en un locus CD3y endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una CD3y humana unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de una c D3y endógena de ratón, en donde el ratón expresa las proteínas CD3e, CD38 y CD3y quiméricas, sobre la superficie de sus linfocitos T. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de la proteína CD3 humana del ratón comprende la secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el ratón comprende dominios extracelulares de las proteínas CD3
humanas que comprenden las secuencias de las SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35.
En algunas realizaciones, el animal no humano genéticamente modificado descrito en el presente documento comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de la proteína CD3 humana unido operativamente a un promotor CD3. Por tanto, en algunas realizaciones, el ratón descrito en el presente documento comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de una CD3e humana, unido operativamente a un promotor CD3, un dominio extracelular de CD38 humana, unido operativamente a un promotor CD3 y un dominio extracelular de CD3y humana unido operativamente a un promotor CD3. En una realización, el promotor CD3 es un promotor CD3 de un animal no humano. En una realización, el promotor CD3 es un promotor CD3 humano. En una realización, el promotor CD3 es un promotor CD3 endógeno de ratón.
Por tanto, en una realización, se proporciona en el presente documento un ratón genéticamente modificado, en donde el ratón comprende (a) en un locus CD3e endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una CD3e humana unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de una CD3e endógena de ratón, (b) en el locus CD38 endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de CD38 humana unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de una CD38 endógena de ratón, y (c) en un locus CD3y endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una CD3y humana unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de una CD3y endógena de ratón, y el ratón expresa las proteínas CD3e, CD38 y CD3y humanizadas sobre la superficie de sus linfocitos T. En una realización, la secuencia de aminoácidos de la proteína CD3e humanizada en dicho ratón se muestra en la SEQ ID NO: 24, la secuencia de aminoácidos de la proteína CD38 humanizada se muestra en la SEQ ID NO: 25, y la secuencia de aminoácidos de la proteína CD3y humanizada se muestra en la SEQ ID NO: 26. En una realización, el ratón genéticamente modificado proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de la CD3 humana unida operativamente a un promotor CD3. En una realización, el promotor es un promotor CD3 endógeno de ratón. En otra realización, el ratón genéticamente modificado proporcionado en el presente documento comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de la CD3 humana unido operativamente a un promotor CD3. En una realización, el ratón muestra una relación celular CD4+ a CD8+ similar en el timo en comparación con un ratón que no está genéticamente modificado para expresar proteínas CD3 humanizadas. En una realización, el ratón muestra una relación linfocitos T CD4+ a linfocitos T CD8+ en el timo que está dentro del 30 %, dentro del 25 %, dentro del 20 %, dentro del 15 %, dentro del 12 %, dentro del 10 %, dentro del 5 % o dentro del 2 % de la relación CD4+ a CD8+ de un ratón que no está genéticamente modificado para expresar proteínas CD3. En una realización, el ratón muestra porcentajes de linfocitos T y B similares en el bazo, ganglios linfáticos y sangre periférica como un ratón que no está genéticamente modificado para expresar proteínas CD3 humanizadas. En una realización, el ratón muestra cantidades similares en circulación de glóbulos blancos, linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos, y basófilos como un ratón que no está genéticamente modificado para expresar proteínas CD3 humanizadas.
Se divulga en el presente documento un ratón genéticamente modificado que comprende, en un locus CD3 endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una proteína CD3 humana, en donde la proteína CD3 humana se selecciona del grupo que consiste en CD3e, CD38, CD3y, CD3Z, y una combinación de las mismas. El ratón de la invención comprende dominios extracelulares de CD3e, CD38 y CD3y humanas. En una realización del ratón, el dominio extracelular de CD3e humana se muestra en la SEQ ID NO: 33, el dominio extracelular de CD38 humana se muestra en la SEQ ID NO: 34, y el dominio extracelular de CD3y humanizada se muestra en la SEQ ID NO: 35. El ratón expresa una CD3e humanizada, una CD38 humanizada y una CD3y humanizada. En una realización del ratón, la CD3e humanizada se muestra en la SEQ ID NO: 24, una c D38 humanizada se muestra en la SEQ ID NO: 25 y la CD3y humanizada se muestra en la SEQ ID NO: 26. El ratón comprende además los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3e, CD38 y CD3y. En una realización, el ratón comprende además los dominios transmembrana y citoplásmico endógenos de CD3e, CD38 y CD3y.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un método para preparar un ratón genéticamente modificado que expresa una proteína CD3 humanizada, de acuerdo con la reivindicación 7. En una realización del método, el animal no comprende uno o más dominios extracelulares funcionales de la proteína o proteínas de ratón correspondientes. En el método, el animal comprende, en el locus CD3 endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de CD3e humana, un dominio extracelular de CD38 humana y un dominio extracelular de CD3y humana. En una realización del método, el dominio extracelular de CD3e humana se muestra en la SEQ ID NO: 33, el dominio extracelular de CD38 humana se muestra en la SEQ ID NO: 34, y el dominio extracelular de CD3y humanizada se muestra en la SEQ ID NO: 35. En una realización del método, el animal no comprende uno o más dominios extracelulares funcionales de la proteína o proteínas de ratón correspondientes. En una realización particular, el método comprende sustituir, en el locus CD3 endógeno, un dominio extracelular de una o más proteínas CD3 no humanas por un dominio extracelular correspondiente de una o más proteínas CD3 humanas. En una realización del método, el animal comprende además una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican además los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína o proteínas endógenas CD3 correspondientes. En una realización del método, la sustitución es en el locus CD3 endógeno de ratón. En una realización, el ratón expresa una proteína CD3 humanizada seleccionada entre el grupo que consiste en la CD3e humanizada que se muestra en la SEQ ID NO: 24, una CD35 humanizada que se muestra en la SEQ ID NO: 25, una CD3y humanizada que se muestra
en la SEQ ID NO: 26, y una combinación de las mismas. En una realización del método, la sustitución se realiza en una célula ES individual, y la célula ES única se introduce en el embrión de ratón para generar un ratón.
En otro aspecto más, se proporciona en el presente documento un modelo de ratón, por ejemplo, un modelo de ratón para ensayar una proteína de unión a antígeno biespecífica basada en CD3, en donde la proteína de unión a antígeno tiene capacidad de unión a CD3 y a un antígeno de interés, comprendiendo el modelo de ratón un ratón genéticamente modificado para codificar un dominio extracelular de la proteína CD3 humana, en donde la proteína CD3 humana es CD3e, CD38 y CD3y, y que comprende la célula que expresa o comprende el antígeno no de ratón de interés. En una realización del modelo de ratón, la una o más secuencias de ácidos nucleicos de la proteína o proteínas CD3 humanizadas se localiza en el locus CD3 endógeno. En una realización del modelo de ratón, la proteína de unión a antígeno se ha introducido en dicho ratón. el ratón expresa los dominios extracelulares CD3e, CD38 y CD3y. En un modelo de ratón, el ratón expresa además los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3e, CD38 y CD3y.
En una realización del modelo de ratón, el ratón comprende un xenoinjerto de un tumor que expresa el antígeno de interés. En una realización del modelo de ratón, la célula que expresa o que comprende el antígeno de interés es una célula tumoral. En una realización del modelo de ratón, la proteína de unión a antígeno biespecífica seleccionada se une a la proteína CD3 humanizada y al antígeno de interés. En una realización del modelo de ratón, el antígeno de interés es un antígeno humano. En una realización del modelo de ratón, la proteína de unión a antígeno tiene capacidad de unión a la proteína CD3 de mono. En una realización del modelo de ratón, el antígeno de interés es un antígeno asociado a tumor. En dicha realización, el antígeno asociado a tumor puede seleccionarse entre el grupo que consiste en ALK, proteínas BAGE, BIRC5 (survivina), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR variante III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, proteínas GAGE, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, LMP2 derivada de VEB, L1CAM, proteínas MAGE, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLACI, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, nuevo antígeno de Thompson, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1.
En otra realización, el antígeno de interés es un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa. En dicha realización, el ratón puede infectarse con un agente infeccioso. En una de dichas realizaciones, el antígeno asociado a enfermedad infecciosa puede ser un antígeno vírico y el antígeno vírico se selecciona entre el grupo que consiste en VIH, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, virus del herpes (por ejemplo, VHS-1, VHS-2, CMV, VhA-6, VVZ, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC, virus del ébola, y antígeno del virus de la encefalitis arbovírica. En otra de dichas realizaciones, el antígeno asociado a la enfermedad infecciosa puede ser un antígeno bacteriano y el antígeno bacteriano se selecciona entre el grupo que consiste en clamidia, rickettsia, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos, gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospira, y antígeno bacteriano de la enfermedad de Lyme.
En una realización del modelo de ratón proporcionado, la proteína de unión a antígeno basada en CD3 es un anticuerpo. En una realización, la proteína de unión a antígeno basada en CD3 es una proteína de unión a antígeno humana o humanizada. Dicho modelo de ratón puede permitir ensayar la eficacia y/o la toxicidad de la proteína de unión a antígeno en el ratón.
Se proporciona también en el presente documento un método de cribado de un fármaco candidato que se dirige a un antígeno de interés que comprende (a) introducir el antígeno de interés en un ratón genéticamente modificado que comprende un locus CD3 endógeno de ratón genéticamente modificado para codificar un dominio extracelular de una proteína CD3 humana, en donde la proteína CD3 humana es CD3e, CD35 y CD3y, (b) poner en contacto el ratón con un fármaco candidato de interés, en donde el fármaco candidato se dirige contra la CD3 humana y el antígeno de interés, y (c) determinar si el fármaco candidato es eficaz en la prevención, la reducción o la eliminación de células caracterizadas por la presencia o la expresión del antígeno de interés. En el método, el ratón genéticamente modificado comprende en el locus CD3 endógeno de ratón una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de CD3e humana, un dominio extracelular de CD38 humana y un dominio extracelular de CD3y humana. En una realización del método, el ratón no comprende un dominio extracelular funcional de las proteínas de ratón correspondientes. En el método, el ratón comprende además una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican además los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína o proteínas endógenas CD3 de ratón correspondientes. En el método, la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican el dominio extracelular de CD3 humana se une de manera operativa a la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos que codifican los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína o proteínas CD3 endógenas de ratón correspondientes. En una realización del método, el dominio extracelular de una CD3e humana se muestra en la SEQ ID NO: 33, el dominio extracelular de CD38 humana se muestra en la SEQ ID NO: 34, y el dominio extracelular de CD3y humana se muestra en la SEQ ID NO: 35. Por tanto, En una realización particular del método, el ratón expresa una proteína CD3e humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 24, una proteína CD38
humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 25, y una proteína CD3y humanizada que comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 26.
En una realización particular del método de cribado de fármacos candidatos descritos en el presente documento, la etapa de introducir el antígeno de interés en el ratón descrito en el presente documento comprende expresar en el ratón el antígeno de interés. En una realización, la etapa de expresar en el ratón el antígeno de interés comprende modificar genéticamente el ratón para expresar el antígeno de interés. En una realización, la etapa de introducir el antígeno de interés comprende infectar el ratón con el antígeno de interés. En una realización del método, la etapa de introducción comprende introducir en dicho ratón una célula que exprese el antígeno de interés. En diversas realizaciones del método, la célula puede ser una célula tumoral, una célula bacteriana, o una célula infectada con un virus. Por tanto, En algunas realizaciones del método, el ratón comprende una infección que es tanto una infección vírica como bacteriana. Por tanto, el antígeno de interés puede ser un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa. En una realización, el antígeno de interés es un antígeno vírico, y el antígeno vírico se selecciona entre el grupo que consiste en VIH, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, virus del herpes (por ejemplo, VHS-1, VHS-2, CMV, VHA-6, v Vz , virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC, virus del ébola, y antígeno del virus de la encefalitis arbovírica. En otra realización, el antígeno de interés es un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa, que es antígeno bacteriano seleccionado entre el grupo que consiste en clamidia, rickettsia, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos, gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospira, y antígeno bacteriano de la enfermedad de Lyme.
En otra realización del método de cribado de fármacos candidatos, el antígeno de interés es un antígeno asociado a tumor. En una realización del método, el antígeno asociado a tumor se selecciona entre el grupo que consiste en ALK, proteínas BAGE, BIRC5 (survivina), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR variante III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, proteínas GAGE, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, LMP2 derivada de VEB, L1CAM, proteínas MAGE, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, nuevo antígeno de Thompson, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1.
En algunas realizaciones del método de cribado de fármacos candidatos, el ratón es un ratón inmunocompetente. En algunas realizaciones del método que se describe en el presente documento, el antígeno de interés es un antígeno de interés humano.
En algunas realizaciones del método, el fármaco candidato es un anticuerpo. En algunas realizaciones, el fármaco candidato es una proteína de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el fármaco candidato es un anticuerpo biespecífico o una proteína de unión a antígeno biespecífica. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno biespecífica tiene capacidad de unión a la proteína CD3 humana y al antígeno de interés. En una realización, el fármaco candidato es capaz de reconocer una proteína CD3 de mono.
En algunas realizaciones del método de cribado de fármacos candidatos, el fármaco candidato puede reducir, eliminar o prevenir el crecimiento del tumor en comparación con un agente que no se dirige al antígeno de interés. En algunas realizaciones de dicho método, la etapa de determinar si el fármaco candidato es eficaz en la prevención, reducción o eliminación de células caracterizadas por la presencia o expresión del antígeno de interés comprende un ensayo del volumen tumoral o un ensayo de destrucción de células tumorales mediado por linfocitos T.
En otras realizaciones, el fármaco candidato puede reducir, eliminar o prevenir la infección bacteriana o vírica en comparación con un agente que no se dirige al antígeno de interés. En algunas de dichas realizaciones, la etapa de determinar si el fármaco candidato es eficaz en la prevención, reducción o eliminación de células caracterizadas por la presencia o expresión del antígeno de interés comprende la medición de los títulos víricos o bacterianos.
Se divulga en el presente documento un modelo de ratón, para ensayar la seguridad, la eficacia, y la farmacocinética de las terapias combinadas de fármacos en donde la terapia combinada incluye un fármaco, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno, que se une a una molécula CD3 humana. Dichas terapias combinadas tienen como objetivo el direccionamiento a tumores, infecciones, u otras enfermedades específicas descritas en el presente documento que se pueden beneficiar del alistamiento y/o la activación de linfocitos T.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 representa la estructura del complejo receptor de linfocitos T. El complejo comprende dos subunidades CD3e, una subunidad CD36, una subunidad CD3y y dos subunidades CD3Z, complejadas con el heterodímero TCRap sobre la superficie de un linfocito T. Los asteriscos indican las localizaciones de los motivos ITAM.
Las FIGS. 2A y B son la representación esquemática (no a escala) del vector de direccionamiento CD3y§£ grande
humanizado. La FIG. 2A representa el vector de direccionamiento grande antes de la deleción del casete de selección (Neo), con las secuencia CD3E, CD3D y CD3G humanas inactivadas en las localizaciones indicadas. A, B, C, D, E, F y G indican la localización de la unión de las secuencias de ácidos nucleicos representadas en la Tabla 1. La FIG. 2B representa el vector de direccionamiento grande después de la deleción del casete de selección (Neo); de manera similar a la FIG. 2A, se indican las localizaciones de las CD3E, CD3D y CD3G humanas. A-B, C, D, E, F, y G son las localizaciones de la unión de las secuencias de ácidos nucleicos representadas en las Tablas 1 y 3.
La FIG. 3 representa las secuencias de aminoácidos de las proteínas CD3 humanizadas en los ratones CD3y8e humanizados. Las secuencias de la proteína CD3 de origen humano están subrayadas.
La FIG. 4 representa alineamientos entre las secuencias CD3e, CD3d, y CD3g de ratón y humana. Los extremos 5' y 3' de las secuencias humanas que se introdujeron en los loci CD3 de ratón están marcadas con * y **, respectivamente.
La FIG. 5A, fila superior, es un gráfico de un análisis FACS que demuestra una distribución normal de timocitos CD4+ y CD8+ en ratones de tipo silvestre (WT), ratones CD3y8e heterocigóticos humanizados (HET) o ratones CD3y8e homocigóticos humanizados (HO). La Fig. 5B, fila superior, son datos que representan porcentajes así como cantidades de linfocitos B y T en sangre periférica de los animales indicados. La Fig. 5B fila superior son datos que representan porcentajes de linfocitos T y B en el bazo de los animales indicados. La FIG. 5C muestra la policlonalidad del repertorio Vp en linfocitos T CD4+ y CD8+ obtenidos de los bazos de los ratones CD3y8e humanizados.
Las FIGS. 6A-B son una demostración de títulos de LCMV víricos en los bazos tanto de ratones del control de tipo natural como de ratones CD3y8e humanizados en ratones infectados con el clon 13 de LCMV (FIG. 6A), o el clon 13 de LCMV tras la infección anterior por el clon Armstrong de LCMV (FIG. 6B).
La FIG. 7 son los datos del análisis FACS de esplenocitos de ratones de tipo natural (WT), ratones CD3y8e heterocigóticos humanizados (hCD3Y8£ Het), o ratones CD3y8e homocigóticos humanizados (hCD3Y8sHo) clasificados con dos anticuerpos dirigidos contra CD3 humana que también reaccionan en cruzado con CD3 de ratón (ah/mfCD3-2 y ah/mfCD3-1), dos anticuerpos dirigidos contra CD3 humana que son específicos de CD3 humana (ahCD3-1 y ahCD3-2), un anticuerpo del control dirigido contra CD3 de ratón (amCD3-2C11), un anticuerpo del control no relacionado con IgG humana (hIgG del control) y un anticuerpo del control solo secundario (2° solo). Los valores del IMF se enumeran en las tablas debajo de cada gráfico.
La FIG. 8 demuestra la respuesta de los anticuerpos dirigidos contra CD3 en ratones CD3y8e humanizados. La FIG. 8A demuestra el agotamiento de los linfocitos T y B transitorios en la sangre de los ratones tratados con anticuerpos dirigidos contra CD3; tanto el agotamiento de los linfocitos T en el día 1 para cada anticuerpo indicado (figura de la izquierda), como el agotamiento de los linfocitos T y B y la recuperación en aproximadamente 14 días para cada anticuerpo ensayado ( figuras intermedia y de la derecha). La FIG. 8B representa un aumento en la concentración de citoquinas liberadas (IFNy, KC, TNFa, IL-6 e IL-10) 2 horas después del tratamiento con los anticuerpos indicados.
La FIG. 9 demuestra la proliferación de esplenocitos (medido como doble activación sobre las células solo) tras el tratamiento con cantidades crecientes de los anticuerpos indicados en ratones de tipo silvestre (WT) y ratones CD3y8e homocigóticos humanizados (hCD3Y8£ Ho).
La FIG. 10 es una tabla que resume diversas propiedades del modelo de ratones CD3 humanizados.
La FIG. 11A demuestra el efecto de un anticuerpo dirigido contra CD3 (Ab-1; un anticuerpo biespecífico que reconoce CD3 y CD20, ensayado a dos concentraciones diferentes en el volumen tumoral de tumores B16F10.9/CD20 cuando se inició el tratamiento al mismo tiempo como implante tumoral (modelo profiláctico). La FIG. 11B demuestra el efecto del anticuerpo dirigido contra CD3 (Ab-1; un anticuerpo biespecífico que reconoce CD3 y CD20, ensayado a dos concentraciones diferentes) sobre el volumen tumoral de tumores B16F10.9/CD20 ya establecidos (modelo terapéutico).
Descripción detallada
Definiciones
La presente invención proporciona ratones genéticamente modificados de acuerdo con la reivindicación 1. Se divulgan en el presente documento ratones genéticamente modificados que comprenden en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, loci CD3 genéticamente modificados que codifican proteínas CD3 humanizadas, por ejemplo, proteínas CD3 quiméricas ser humano/ratón. Se divulgan también embriones, células y tejidos que comprenden los mismos, métodos para preparar los mismos, así como métodos para utilizar los mismos. A menos que se definan de otro modo, todos los términos y expresiones utilizados en el presente documento incluyen los significados que los términos y las expresiones tienen en la técnica, salvo que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se usa un término o expresión.
"CD3", como se usa en el presente documento, incluye un antígeno que se expresa en linfocitos T como parte del complejo del receptor de linfocitos T multimolecular (TCR); el complejo TCR multimolecular formado a partir de la asociación de homodímeros y/o heterodímeros que comprende una o más de las siguientes cadenas de receptores: CD3-épsilon (s), CD3-delta (8), CD3-zeta (Z) y CD3-gamma (y) (véase la FIG. 1). Las secuencias y los números de registro del GenBank de CD3-delta, CD3-zeta, y CD3-gamma humana y de ratón se presentan en la Tabla 4 siguiente. A lo largo de la solicitud, s o épsilon pueden escribirse también como E, 8 o delta pueden también escribirse como D,
Z o zeta pueden también escribirse como Z, y y o gamma pueden también escribirse como G.
Como se usa en el presente documento, "un anticuerpo que se une a CD3" o un "anticuerpo dirigido contra CD3" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente una subunidad CD3 única (por ejemplo, épsilon, delta, gamma o zeta), así como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente un complejo dimérico de dos subunidades CD3 (por ejemplo, dímeros gamma/épsilon, delta/épsilon y zeta/zeta de CD3). Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención pueden unirse a CD3 soluble y/o CD3 expresada en la superficie celular. CD3 soluble incluye proteínas CD3 naturales, así como variantes de proteínas CD3 recombinantes como, por ejemplo, construcciones CD3 monoméricas y diméricas, que carecen de un dominio transmembrana o que no están asociadas con una membrana celular.
El término "conservativa", cuando se usa para describir una sustitución conservativa de aminoácidos, incluye la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R de la cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). Se pueden conseguir sustituciones conservativas de aminoácidos modificando una secuencia de nucleótidos con el fin de introducir un cambio de nucleótidos que codificará la sustitución conservativa. En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de las proteínas CD3 de jugar un papel en el ensamblaje y la señalización del receptor de los linfocitos T. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales de hidroxilo alifáticas tales como serina y treonina; cadenas secundarias que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas secundarias aromáticas tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunas realizaciones, una sustitución de aminoácidos conservativa puede ser una sustitución de cualquier resto natural en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, mutagénesis por barrido de alanina. En algunas realizaciones, se realiza una sustitución conservativa que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica de PAM250 divulgada en Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45).
En algunas realizaciones, la sustitución es una sustitución moderadamente conservativa en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica de PAM250.
Por tanto, está abarcado por la invención un ratón genéticamente modificado que expresa proteínas CD3 humanizadas que comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas en la secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento.
Un experto en la materia entenderá que en la adición a los restos de ácidos nucleicos que codifican las proteínas CD3 humanizadas descritas en el presente documento, debido a la degeneración del código genético, otros ácidos nucleicos pueden codificar los polipéptidos de la invención. Por lo tanto, además de un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas CD3 humanizadas descritas en el presente documento, se proporciona también un ratón que comprende en su genoma secuencias de nucleótidos que difieren de las descritas en el presente documento debido a la degeneración del código genético.
El término "identidad", cuando se usa junto con secuencia incluye identidad, como se determina mediante numerosos algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se determinan las identidades usando una alineación ClustalW v. 1.83 (lenta) que emplea una penalización por apertura de hueco de 10.0, una penalización por extensión de hueco de 0,1, y que utiliza una matriz de similitud de Gonnet (MacVector™ 10.0. 2, MacVector Inc., 2008). La longitud de las secuencias comparadas con respecto a la identidad de las secuencias dependerá de las secuencias concretas. En diversas realizaciones, la identidad se determina comparando la secuencia de una proteína madura desde su extremo N a su extremo C. En diversas realizaciones, cuando se compara una secuencia humanizada con una secuencia humana, la parte humana de la secuencia humanizada (pero no la parte no humana) se usa en la realización de una comparación con el fin de discernir un nivel de identidad entre una secuencia humana y una secuencia humanizada.
La expresión "unido operativamente" incluye una yuxtaposición en la que los componentes descritos de esta manera están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Como tal, una secuencia del ácido nucleico que codifica una proteína puede estar unida operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, un promotor, potenciador, secuencia silenciadora, etc.) con el fin de conservar la regulación de la transcripción adecuada. Además, varias partes de la proteína humanizada de la invención pueden unirse operativamente para retener el adecuado plegado, procesamiento, direccionamiento, expresión y otras propiedades funcionales de la proteína en la célula. Salvo que se indique lo contrario, varios dominios de la proteína humanizada de la invención se unen operativamente entre sí. El enlace operativo de un dominio extracelular humano de una proteína CD3 y los dominios transmembrana y citoplásmico no humanos puede conseguirse mediante la expresión de estos componentes como una proteína de
fusión contigua a partir de una secuencia que codifica un ácido nucleico.
El término "sustitución", en referencia a la sustitución de genes, incluye colocar material genético exógeno en un locus genético endógeno, sustituyendo, por tanto, la totalidad o una porción del gen endógeno con una secuencia del ácido nucleico ortóloga u homóloga. En un caso, un gen no humano endógeno o fragmento del mismo se sustituye con un gen humano correspondiente o el fragmento del mismo. Por ejemplo, el ADN que codifica el dominio extracelular de una proteína CD3 de ratón u otra no humana puede sustituirse por ADN que codifica el dominio extracelular de la proteína A humana correspondiente que corresponde a un gen humano o un fragmento del mismo es un gen humano o fragmento que es un ortólogo de, un homólogo de, o es sustancialmente idéntico o el mismo en estructura y/o función, que el gen no humano endógeno o fragmento del mismo que se sustituye. Como se demuestra en los Ejemplos siguientes, las secuencias de nucleótidos que codifican los dominios extracelulares CD3 no humanos endógenos se sustituyeron por las secuencias de nucleótidos que correspondían a dominios extracelulares de CD3 humanos.
"Funcional" como se usa en el presente documento, por ejemplo, en referencia a una proteína funcional, incluye una proteína que retiene al menos una actividad biológica normalmente asociada con la proteína nativa. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la invención, una sustitución en un locus endógeno (por ejemplo, la sustitución en los loci de CD3 no humanos endógenos) da como resultado un locus que fracasa en expresar un polipéptido endógeno funcional.
El término "locus" como en el locus CD3 incluye el ADN genómico que comprende una región que codifica CD3. Los genes CD3 CD3e, CD38, CD3y se cartografían próximos entre sí en el mismo cromosoma. Dependiendo por tanto del contexto, la referencia a un locus CD3 endógeno puede referirse a un locus que incluye alguna o todas de estas regiones de codificación o una región de codificación individual. Por ejemplo, si solo una de las CD3 humana, tal como una CD3e se introduce en un animal no humano, entonces, el ácido nucleico que codifica esta CD3 modifica preferentemente el locus de la CD3 no humana correspondiente. Si algunas CD3 humanas se introducen en un animal no humano tales como CD3e, CD38, CD3y, entonces el locus endógeno modificado incluye las regiones de codificación de cada una de las CD3e, CD38 y CD3y. Un locus CD3 puede referirse también al locus de CD3Z, que ocupa un cromosoma diferente que CD3e, CD38 y CD3y. Si CD3Z humana se introduce junta con cualquiera de CD3e, CD38 o CD3y humanas, entonces, dos o más loci CD3 pueden modificarse en diferentes cromosomas. Se pueden incluir otras secuencias en el locus de CD3 que se han introducido para los fines de manipulación genética, por ejemplo, casetes de selección, sitios de restricción, etc.
El término "línea germinal" en referencia a una secuencia de ácido nucleico de la inmunoglobulina incluye una secuencia de ácido nucleico que se puede pasar a la progenie.
La expresión "molécula de inmunoglobulina" incluye dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas pueden ser idénticas o diferentes, y las cadenas ligeras pueden ser idénticas o diferentes.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende un dominio variable de cadena pesada dominio y una región constante de cadena pesada (Ch). La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera (Cl). Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada dominio variable de cadena pesada y cadena ligera comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDR de cadena pesada pueden abreviarse como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera pueden abreviarse como LCDR1, Lc Dr 2 y LCDR3).
La expresión anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd con respecto a su epítopo diana aproximadamente de 10-9 M o inferior (por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M).
La expresión "anticuerpo biespecífico" incluye un anticuerpo capaz de unir selectivamente dos epítopos). Los anticuerpos biespecíficos comprenden generalmente dos brazos, uniéndose cada uno a un epítopo diferente (por ejemplo, dos cadenas pesadas con diferentes especificidades) tanto en dos moléculas diferentes (por ejemplo, epítopos diferentes en dos inmunógenos diferentes) como en la misma molécula (por ejemplo, epítopos diferentes en el mismo inmunógeno). Si un anticuerpo biespecífico puede unirse selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad del primer brazo de anticuerpo por el primer epítopo será generalmente al menos de uno a dos o de tres a cuatro o más órdenes de magnitud menor que la afinidad del primer brazo de anticuerpo por el segundo epítopo, y viceversa. Los epítopos que se unen específicamente por el anticuerpo biespecífico pueden estar en la misma diana o en una diana diferente (por ejemplo, en la misma o en una proteína diferente). Los anticuerpos biespecíficos ilustrativos incluyen los que tienen un primer brazo de anticuerpo específico para un antígeno tumoral y un segundo brazo de anticuerpo específico para un marcador citotóxico, por ejemplo, un receptor Fc (por
ejemplo, FcyRI, FcyRII, FcyRIII, etc.) o un marcador de linfocitos T (por ejemplo, CD3, CD28, etc.). En una realización de la presente invención, un brazo del anticuerpo biespecífico es específico de CD3. Además, un anticuerpo biespecífico con un primer brazo específico para un antígeno tumoral y un segundo brazo específico para una toxina pueden emparejarse de manera que liberen una toxina (por ejemplo, saporina, alcaloide de la vinca, etc.) a una célula tumoral. Otros anticuerpos biespecíficos ilustrativos incluyen aquellos con un primer brazo específico para un receptor de la activación (por ejemplo, receptores de los linfocitos B, FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, FcyRI, receptores de linfocitos T, etc.) y un segundo brazo específico para un receptor inhibitorio (por ejemplo, FcyRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a, etc.). Dichos anticuerpos biespecíficos pueden construirse para dolencias terapéuticas asociadas con la activación celular (por ejemplo, alergia y asma). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse, por ejemplo, combinando cadenas pesadas que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno. Por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias variables de cadena pesada que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno se pueden fusionar a secuencias de ácidos nucleicos que codifican la misma o diferentes regiones constantes de cadena pesada, y dichas secuencias se pueden expresar en una célula que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina. Un anticuerpo biespecífico típico tiene dos cadenas pesadas que tienen cada una tres cadenas CDR pesadas, seguido por un dominio Ch1 (extremo N a extremo C), una bisagra, un dominio Ch2, y un dominio Ch3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que no confiere especificidad de unión a epítopo pero que puede asociarse con cada cadena pesada, o que puede asociarse con cada cadena pesada y que puede unirse a uno o más epítopos, por las regiones de unión a epítopo de la cadena pesada, o que pueden asociarse con cada cadena pesada y permitir la unión de uno o ambas de las cadenas pesadas a uno o ambos epítopos. De manera similar, la expresión "anticuerpo multiespecífico" incluye un anticuerpo que puede unir selectivamente múltiples epítopos (por ejemplo, dos, tres, cuatro epítopos).
La expresión "región determinante de complementariedad", o el término "CDR", incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de los genes de la inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) aparecen entre dos regiones marco en una región variable de una cadena ligera o una cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Una CDR puede estar codificada por, por ejemplo, una secuencia de una línea germinal o una reordenada o no reordenada, y, por ejemplo, por un linfocito B no expuesto anteriormente o un linfocitos B maduro. Una CDR puede estar mutada somáticamente (por ejemplo, variar a partir de una secuencia codificada en una línea germinal de mamífero), humanizada, y/ modificada con sustituciones, adiciones, o deleciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), Las CDR pueden estar codificadas por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico no ordenada) pero son contiguas en una secuencia de ácido nucleico de un linfocito B, por ejemplo, como resultado del corte y empalme o de conectar las secuencias (por ejemplo, recombinación V-D-J para formar una cadena pesada CDR3).
La expresión " fragmento funcional" incluye fragmentos de proteínas de unión a antígeno tales como anticuerpos que se pueden expresar, secretar, y unirse específicamente a un epítopo con una Kd en el intervalo micromolar, nanomolar, o picomolar. El reconocimiento específico incluye tener una Kd que está al menos en el intervalo micromolar, el intervalo nanomolar, o el intervalo picomolar.
la expresión "cadena pesada", o "inmunoglobulina de cadena pesada" incluye una secuencia de cadena pesada de la inmunoglobulina, incluyendo la secuencia de región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, procedente de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres cadenas CDR pesadas y cuatro regiones FR, a menos que se especifique de otra manera. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR, y combinaciones de las mismas. Una cadena pesada típica tiene, siguiendo el dominio variable (desde el extremo N al extremo C), un dominio Ch1, una bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un epítopo (por ejemplo, reconocer el epítopo con una Kd en el intervalo micromolar, nanomolar, o picomolar), que es capaz de expresar y secretar a partir de una célula, y que comprende al menos una CDR. Un dominio variable de cadena pesada está codificado por una secuencia génica de región variable, que comprende generalmente segmentos de Vh, Dh, y Jh derivados de un repertorio de segmentos Vh, Dh, y Jh presentes en la línea germinal. Las secuencias, localizaciones y nomenclatura para los segmentos de cadenas pesadas V D, y J para diversos organismos se pueden encontrar en el sitio web para el International Immunogenetics Information System (base de datos IMGT).
La expresión "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos que se especifique de otra manera incluye las cadenas ligeras kappa y lambda y VpreB, así como cadenas ligeras surrogadas. Los dominios variables de cadenas ligeras incluyen normalmente tres regiones CDR de cadenas ligeras y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique de otra manera. En general, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino al extremo carboxilo, un dominio variable que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una región constante de cadena ligera. Un dominio variable de cadena ligera está codificado por una secuencia génica de región variable de cadena ligera, que comprende generalmente segmentos de Vl y Jl, derivados de un repertorio de segmentos V y J presentes en la línea germinal. Las secuencias, localizaciones y nomenclatura de los segmentos de cadena ligera V y J para diversos organismos se pueden encontrar en el sitio web del International Immunogenetics Information System (base de datos IMGT). Las cadenas ligeras incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente a ningún epítopo reconocido por la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos) en la que aparecen. Las cadenas ligeras incluyen también aquellas que se unen
y reconocen, o ayudan a la cadena pesada con la unión y el reconocimiento, uno o más epítopos se unen selectivamente por la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) en la que aparecen.
La expresión "proteína de unión a antígeno" como se usa en el presente documento incluye anticuerpos y diversas moléculas de origen natural y diseñadas capaces de unirse al antígeno de interés. Las mencionadas incluyen, por ejemplo, anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio único (derivados, por ejemplo, de camélidos y peces, etc.), anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), compuestos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMlP), dominios IgNAR variables de tiburón, etc. La proteína de unión a antígeno puede incluir también fragmentos de unión a antígeno tales como, por ejemplo, (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3), etc.
El término "célula" incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las de procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterianas (p. ej., cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células fúngicas, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insectos (p. ej., SF-9, SF-21, células de insectos infectadas por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células animales no humanas, células humanas, o fusiones de células tal como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunas realizaciones, la célula es eucariota y se selecciona entre las siguientes células: CHO (p. ej., CHO K1, CHO DXB-11, Veggie-CHO), COS (p. ej., COS-7), célula de la retina, Vero, CV1, de riñón (p. ej., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (p. ej., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, la célula comprende uno o más genes víricos, una célula de la retina que expresa un gen vírico (p. ej., una célula PER.C6™). En algunas realizaciones, la célula es una célula ES.
Una proteína CD3 humanizada significa una proteína CD3 en la que, en una realización, un dominio extracelular es de una secuencia humana. Los dominios transmembrana y citoplásmico pueden ser también humanos, pero son preferentemente secuencias endógenas no humanas. Una proteína CD3 incluye secuencias de diferentes especies, particularmente un dominio extracelular humano, y dominios transmembrana y citoplásmicos no humanos, puede denominarse también como una proteína CD3 quimérica.
Animales CD3 humanizados genéticamente modificados
En el presente documento se desvelan animales no humanos genéticamente modificados (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas) que comprenden en su genoma (por ejemplo, en el genoma de su línea germinal) una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3 humanizada (por ejemplo, una CD3e, CD3y, CD35 humanizadas, o una combinación de las mismas). la presente invención proporciona ratones genéticamente modificados que comprenden en su genoma secuencias de nucleótidos que codifican proteínas CD35 humanizadas, proteínas CD3y humanizadas y proteínas CD3e humanizadas. Por tanto, en algunas realizaciones de la invención, el ratón expresa un complejo CD3y§£ humanizado sobre la superficie de sus linfocitos T de tal manera que el CD3y§£ humanizado forma un complejo con el receptor de linfocitos T expresado sobre el mismo linfocito T.
la molécula CD3 es comúnmente una diana de agentes que tienen como objetivo modelar la inmunidad de los linfocitos T, y se han desarrollado para este fin algunos anticuerpos dirigidos contra CD3 (por ejemplo, muromonab-CD3 u OKT3). Los anticuerpos dirigidos contra CD3 tales como OKT3 se usan como agentes inmunosupresores (por ejemplo, en el rechazo al trasplante) pero se estudian también por su potencial terapéutico en enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, en la enfermedad de Crohn, diabetes de tipo I, colitis ulcerosa, etc.).
Adicionalmente, Se estudiaron también las moléculas CD3 como dianas para agentes biespecíficos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, debido a la capacidad de los anticuerpos biespecíficos contra CD3 de reclutar linfocitos T para una célula diana, por ejemplo, una célula que expresa un antígeno concreto de interés. Se describen anticuerpos biespecíficos dirigidos contra CD3 ilustrativos en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2014/0088295, y en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2015/0266966.
Durante la etapa de desarrollo del fármaco preclínica, los agentes candidatos se estudian normalmente basándose en su eficacia, toxicidad, y otras propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas. Los agentes candidatos, tales como anticuerpos, se dirigen normalmente a un antígeno humano --ya que la meta final de la investigación es desarrollar una terapia humana. Se llevaron a cabo muchos estudios preclínicos en animales grandes tales como primates ya que su fisiología y el metabolismo del fármaco son los más similares a los seres humanos. Se conocen varios anticuerpos desarrollados para CD3 (por ejemplo, OKT3) que no reaccionan en cruzado con una CD3 no humana, particularmente con una CD3 de primate. Para llevar a cabo investigaciones preclínicas eficaces que se refieran a la eficacia, toxicidad,
y otros parámetros de un fármaco candidato, en primer lugar, el fármaco candidato debe determinarse para reconocer la molécula CD3 de primate.
Sin embargo, un factor separado que complica el desarrollo de una terapia dirigida contra CD3 es que los grandes primates tales como chimpancés están en peligro y en muchos países se prohíben los chimpancés; aunque los estudios en otros primates, por ejemplo, los macacos (Macaca fascicularis), puede plantear preocupaciones éticas. Por ejemplo, Por todos los motivos anteriores, hasta la fecha el modelo de primate no es eficaz en tumores humanos. Por tanto, cualquier dato preliminar sobre un candidato terapéutico específico que se puede obtener en un modelo animal más pequeño, tal como un roedor, por ejemplo, un ratón, puede ser útil en determinar un progreso adicional de investigaciones preclínicas en grandes primates.
Los estudios preclínicos en modelos animales pequeños, tales como ratones, se han llevado a cabo tradicionalmente usando fármacos surrogados. Por ejemplo, cuando un candidato clínico que se dirige a un antígeno humano específico está en desarrollo, se generan algunos datos preclínicos en un ratón utilizando una molécula, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno o un anticuerpo, que se dirige específicamente a un homólogo de ratón del antígeno de interés. La información acerca de la eficacia, diversos regímenes de dosificación, la toxicidad y los efectos secundarios, y otros aspectos de la administración de fármacos se recaban a partir de dichos estudios de fármacos surrogados. Sin embargo, dichos hallazgos están limitados debido a que no es el fármaco real el que está en desarrollo o su diana humana la que se está estudiando.
Por tanto, el modelo animal pequeño más útil para llevar a cabo estudios preclínicos preliminares es un animal no humano, por ejemplo, un roedor, que expresa una proteína CD3 humana o humanizada, y permite el ensayo de fármacos candidatos dirigidos contra CD3 que también reacciona en cruzado con el macaco c D3, permitiendo estudios preclínicos de primates posteriores. La presente invención proporciona dicho modelo de ratón intrincado.
Por tanto, Se proporciona en el presente documento un animal no humano genéticamente modificado que comprende en su genoma una(s) secuencia(s) de ácido(s) nucleico(s) que codifica un dominio extracelular de una proteína CD3 humana. En algunos ejemplos, la proteína CD3 se selecciona entre el grupo que consiste en CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, y una combinación de las mismas. En algunos ejemplos, la proteína c D3 se selecciona entre el grupo que consiste en CD3y, CD38, CD3e, y una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la proteína CD3 comprende las cadenas polipeptídicas CD3y, CD38, y CD3e. Por tanto, el ratón genéticamente modificado comprende en su genoma de una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican un dominio extracelular de una CD3y humana, un dominio extracelular de una CD38 humana, y un dominio extracelular de una CD3e humana. En algunas de dichas realizaciones, los dominios extracelulares de c D3y, CD38, y CD3e puede estar codificado por un único ácido nucleico. En algunas realizaciones, los dominios extracelulares de CD3y, CD38, y CD3e humanas están codificados por ácidos nucleicos separados.
En algunas realizaciones, el ratón descrito en el presente documento retiene promotores de CD3 no humanos endógenos y/o elementos reguladores (por ejemplo, promotores CD3y, CD38, y/o CD3e y/o elementos reguladores). En otras realizaciones, el ratón comprende promotores de CD3 humanos y elementos reguladores.
Aunque se ha postulado que la mayoría de anticuerpos generados contra CD3 reconoce epítopos CD3e (véase, Tunnacliffe et al. (1989) International Immunology, 1(5):546-50), existen numerosos agentes que pueden reconocer otras subunidades CD3 (e.g., CD3y o CD38) o requiere el ensamblaje del complejo CD3 para la unión. Por tanto, el ratón genéticamente modificado comprende en su genoma una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican un dominio extracelular de una CD3y humana, un dominio extracelular de una CD38 humana, y un dominio extracelular de una CD3e humana, proporciona una ventaja ya que puede acomodar un agente que uniría cualquiera de las subunidades CD3 o el complejo CD3.
Se presentan proteínas CD3 ilustrativas en el alineamiento en la FIG. 4. Se puede encontrar una secuencia de proteína CD3e de ratón en el número de registro del GenBank NP_031674 y la s Eq ID NO: 27, aunque se puede encontrar una secuencia de proteína CD3e humana en el número de registro GenBank NP_000724 y la SEQ ID NO: 28. Se puede encontrar una secuencia de proteína CD38 de ratón en el número de registro del GenBank NP_038515 y la SEQ ID NO: 29, aunque se puede encontrar una secuencia de proteína CDS humana en el número de registro del GenBank NP_000723 y la SEQ ID NO: 30. Se puede encontrar una secuencia de proteína CD3y de ratón en el número de registro del GenBank NP_033980 y la SEQ ID NO: 31, aunque se puede encontrar una secuencia de proteína CD3y humana en el número de registro GenBank NP_000064 y la SEQ ID NO: 32.
En la invención, la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifican un dominio extracelular de una CD3 humana, por ejemplo, un dominio extracelular de una CD3y humana, una CD35 humana, y una CD3e humana, están localizadas en un locus CD3 endógeno de ratón. En otras palabras, dicho ácido nucleico modifica el locus CD3 endógeno para codificar el polipéptido CD3 humano. En algunas realizaciones de la invención, el ratón no comprende un dominio extracelular funcional de la proteína CD3 de ratón correspondiente debido a que la modificación genética del locus endógeno de tal manera que no se exprese el dominio extracelular funcional. En algunas realizaciones de la invención, la(s) secuencia(s) de ácido(s) nucleico(s) que codifica un dominio extracelular de una CD3 humana sustituye las secuencia(s) de ácido(s) nucleico(s) correspondientes que codifican la CD3 de un ratón endógeno. Por tanto, en
algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de CD3y humana sustituye la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de CD3y endógena de ratón, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de una CD38 humana sustituye la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de CD38 endógena de ratón y la secuencia que codifica el dominio extracelular de una CD3e humana sustituye la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de CD3e endógena de ratón. En algunas realizaciones, la sustitución no comprende la sustitución de una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de señalización endógena. En otra realización, la sustitución comprende la sustitución de una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señalización endógena con la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señalización humana.
En algunos aspectos de la invención, el dominio extracelular comprende la región de la(s) proteína(s) que no es un dominio transmembrana o un dominio citoplásmico, por ejemplo, la región de la proteína que aparece sobre la superficie de la célula y que, en parte, cuando se ensambla en un complejo interactúa con los dominios extracelulares de otros componentes del complejo de señalización de TCR, por ejemplo, los dominios extracelulares TCR alfa y beta. En diversas realizaciones descritas en el presente documento, el dominio extracelular se refiere al dominio de la proteína expresado sobre la superficie celular y, a menos que se indique lo contrario, no incluye la secuencia de señalización que se escinde proteolíticamente normalmente antes de agotar la expresión superficial. En algunas realizaciones de la invención, el dominio extracelular de CD3e comprende los aminoácidos 17-130 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 24 (se muestra por separado como SEQ ID NO: 33). En algunas de dichas realizaciones, el animal comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia e señalización de CD3e endógena, por ejemplo, la secuencia de señalización en los aminoácidos 1-16 de la SEQ ID NO: 24. En otras realizaciones de la invención, el animal comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señalización de CD3e humana. En algunas realizaciones de la invención, el dominio extracelular de CD38 comprende los aminoácidos 19-105 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 25 (se muestra por separado como SEQ ID NO: 34). En algunas de dichas realizaciones, el ratón comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de señalización de CD38 endógena, por ejemplo, la secuencia de señalización en los aminoácidos 1-18 de la SEQ ID NO: 25. En otras realizaciones de la invención, el ratón comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de señalización de la CD38 humana. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de CD3y comprende los aminoácidos 20-116 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 26 (se muestra por separado como SEQ ID NO: 35). En algunas de dichas realizaciones, el ratón comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de señalización de CD3y endógena, por ejemplo, la secuencia de señalización en los aminoácidos 1-19 de la SEQ ID NO: 26. En otras realizaciones de la invención, el ratón comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de señalización de la CD3y humana.
En algunos aspectos de la invención, el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína CD3 endógena, por ejemplo, la proteína CD3 endógena correspondiente. Por tanto, en una realización, el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de la proteína CD3 humana unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína CD3 endógena de ratón correspondiente de tal manera que la proteína quimérica que comprende el dominio extracelular de la proteína CD3 humana y se expresan los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína CD3 endógena de ratón correspondiente. Por tanto, en un aspecto, el animal comprende en un locus CD3 endógeno una(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifica un dominio extracelular de una proteína CD3 humana unida operativamente a una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3 endógena de ratón. En una realización, el ratón comprende en un locus CD3e endógeno de ratón una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una CD3e humana unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de una CD3e endógena de ratón, en un locus CD38 endógeno una secuencia de ácido nucleico codifica un dominio extracelular de una CD38 humana unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de una CD38 endógena de ratón, y en un locus CD3y endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una CD3y humana unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios transmembrana y citoplásmico de una CD3y endógena de ratón. El uso de proteínas CD3 quiméricas con un dominio extracelular humano y dominios transmembrana y citoplásmico endógenos permite la interacción de fármacos con especificidad por la c D3 humana pero puede permitir también recapitular la interacción con el receptor de linfocitos T endógeno y sus componentes de transducción de la señal en comparación con una proteína CD3 completamente humana.
El ratón expresa dominios extracelulares de la proteína CD3 humana. En algunos aspectos, el ratón expresa un dominio extracelular de CD3e humana que se muestra en la SEQ ID NO: 33. En algunos aspectos, el ratón expresa un dominio extracelular de CD38 humana que se muestra en la SEQ ID NO: 34. En algunos aspectos, el ratón expresa un dominio extracelular de CD3y humana que se muestra en la SEQ ID NO: 35.
El animal no humano es un ratón.
En una realización, el ratón es de una cepa C57BL seleccionada entre C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Ka-LwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En otra realización, el ratón es una variedad 129 seleccionada entre el grupo que consiste en una variedad que es 129P1,
129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festing et al. (1999) Revised nomenclatura for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, véase también, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). En una realización específica, el ratón genéticamente modificado es una mezcla de una cepa 129 anteriormente mencionada y una cepa C57BL/6 anteriormente mencionada. En otra realización específica, el ratón es una mezcla de las cepas 129 anteriormente mencionadas, o una mezcla de las cepas BL/6 anteriormente mencionadas. En una realización específica, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otra realización, el ratón es una cepa BALB, por ejemplo, cepa BALB/c. En otra realización más, el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa anteriormente mencionada.
El animal no humano es un ratón. Por tanto, el animal genéticamente modificado es un ratón que comprende en un locus CD3 endógeno de ratón una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una proteína CD3 humana. El ratón comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio extracelular de una CD3e humana, una secuencia de ácido nucleico de un dominio extracelular de una CD38 humana y una secuencia de ácido nucleico de un dominio extracelular de un CD3y humana. En algunas realizaciones de la invención, el dominio extracelular de la CD3e humana comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 33, el dominio extracelular de la CD38 humana comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 34, y el dominio extracelular de la CD3y humana comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, el ratón comprende la(s) secuencia(s) que codifican la(s) secuencia(s) de señalización de CD3 endógeno de ratón. En otras realizaciones, el ratón comprende la(s) secuencia(s) que codifica(n) la(s) secuencia(s) de señalización de CD3 humanas.
El ratón de la invención expresa la(s) proteína(s) CD3 humanizadas. El ratón expresa las proteínas CD3e humanizadas, proteínas CD38 humanizadas y proteínas CD3y humanizadas. En algunas realizaciones de la invención, el ratón expresa un dominio extracelular de CD3e humana y los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3e endógena de ratón, un dominio extracelular de CD38 humana y los dominios transmembrana y citoplásmico de CD38 endógena de ratón, y un dominio extracelular de CD3y humana y los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3y endógena de ratón. En algunas de dichas realizaciones, el ratón expresa proteínas CD3 humanizadas en donde las proteínas CD3 humanizadas son las CD3e humanizadas que se muestran en la SEQ ID NO: 24, las CD38 humanizadas que se muestran en la SEQ ID NO: 25 y la CD3y humanizada que se muestra en la SEQ ID NO: 26.
En algunos aspectos de la invención, el ratón genéticamente modificado es un ratón inmunocompetente. En algunas realizaciones de la invención, la introducción de proteína(s) CD3 no afecta la función del sistema inmunitario del ratón. En algunas realizaciones de la invención, el ratón comprende una relación de linfocitos T y B normal. En algunas realizaciones de la invención, el ratón es capaz de montar una respuesta inmunitaria a la infección del ratón. En algunos aspectos, el ratón muestra una relación celular CD4+ a CD8+ similar en el timo en comparación con un ratón de tipo silvestre, por ejemplo, un ratón que no se ha modificado genéticamente para expresar proteína(s) CD3 humanizada(s). En algunas realizaciones de la invención, la relación celular CD4+ a CD8+ en el timo que está dentro del 30 %, por ejemplo, dentro del 20 %, por ejemplo, dentro del 15 %, por ejemplo, dentro del 12 %, por ejemplo, dentro del 10 %, por ejemplo, dentro del 5 %, por ejemplo, dentro del 2 %, de la relación celular CD4+ a CD8+ de un ratón que no está genéticamente modificado para expresar proteína(s) CD3. En algunos aspectos, el ratón muestra porcentajes de linfocitos T y B similares en el bazo, los ganglios linfáticos, y la sangre periférica como un ratón de tipo silvestre, por ejemplo, un ratón que no está genéticamente modificado para expresar proteína(s) CD3 humanizadas. En algunos aspectos, el ratón muestra cantidades similares en circulación de glóbulos blancos, linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos como un ratón de tipo silvestre, por ejemplo, un ratón que no está genéticamente modificado para expresar proteína(s) CD3 humanizadas.
También se proporcionan en el presente documento métodos para producir ratones genéticamente modificados descritos en el presente documento. En algunos ejemplos, el método de preparar un ratón genéticamente modificado en donde el animal expresa una proteína CD3 humanizada comprende introducir en el locus CD3 endógeno de un animal no humano una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una proteína CD3 humana, en donde la proteína CD3 humana se selecciona del grupo que consiste en CD3e, CD38, CD3y, CD3Z, y una combinación de las mismas. Si se introducen múltiples proteínas CD3 humanas, se pueden introducir juntas en un único ácido nucleico (como en los Ejemplos presentes) o por separado. si es de esta última forma, una única línea de células (por ejemplo, la línea de células ES) puede experimentar sucesivas modificaciones hasta que las modificadas incluyan los ácidos nucleicos que codifican las CD3 humanas deseadas. En una realización, el animal no comprende un dominio extracelular funcional de la(s) proteína(s) CD3 no humanas correspondientes. El ratón comprende en un locus CD3 endógeno de ratón una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de CD3e humana, un dominio extracelular de CD38 humana y un dominio extracelular de CD3y humana. En algunas realizaciones, el dominio extracelular de una CD3e humana se muestra en la SEQ ID NO: 33, el dominio extracelular de una CD38 humana se muestra en la SEQ ID NO: 34, y el dominio extracelular de una CD3y humana se muestra en la SEQ ID NO: 35. En una realización, el animal no comprende un dominio extracelular funcional de la(s) proteína(s) CD3 no humanas correspondientes.
En algunas realizaciones, el método de preparar un ratón genéticamente modificado comprende sustituir en el locus CD3 endógeno una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de una(s) proteína(s) CD3 de ratón
con una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de una(s) proteína(s) CD3 humana(s) correspondiente(s). En una realización, el animal retiene los dominios transmembrana y citoplásmico de la(s) proteína(s) CD3 de ratón. En algunas realizaciones, la sustitución da como resultado una(s) proteína(s) quimérica(s) que comprende un dominio extracelular de una(s) proteína(s) CD3 humanas y los dominios transmembrana y citoplásmico de la(s) proteína(s) CD3 endógena(s) de ratón correspondiente(s).
El(los) ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) la(s) proteína(s) CD3 humana(s) se introducen normalmente en una célula, y un ratón se propaga a partir de la célula. En algunas realizaciones, el método de sustitución utiliza una construcción de direccionamiento preparada utilizando la tecnología VELOCIGENE®, introduciendo la construcción en células ES, e introduciendo los clones de células ES dirigidos en un embrión de ratón utilizando la tecnología VELOCIMOUSE®, como se describe en los Ejemplos.
En una realización, en donde el método comprende la sustitución de la secuencia de nucleótido que codifica el dominio extracelular de una CD3e endógena de ratón con la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de una proteína CD3e humana, el método comprende una sustitución de la secuencia parcial de los exones 2 a 4 que codifican el gen CD3e endógeno de ratón con la secuencia parcial de los exones 2 a 5 que codifican el gen c D3e humano. En una realización, en donde el método comprende la sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de CD38 endógena de ratón con la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de una CD38 humana, el método comprende una sustitución de la secuencia parcial de los exones 2 a 3 que codifican CD38 de ratón con la secuencia parcial de los exones 2 a 3 que codifican el gen CD38 humano. En una realización, en donde el método comprende una sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de la CD3y endógena de ratón con la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de la CD3y humana, el método comprende la sustitución de la secuencia parcial de los exones 2 a 4 que codifican la CD3y de ratón con la secuencia parcial de los exones 2 a 4 que codifican el gen CD3y humano. En una realización de la invención, la sustitución comprende la sustitución de la secuencia de CD3e, CD3s y CD3y. En dicha realización, la sustitución puede llevarse a cabo creando un vector de direccionamiento grande que incorpora la modificación genética secuencias en los tres loci y a continuación la introducción del vector de direccionamiento grande en las células ES de ratón para generar un ratón, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1.
Por tanto, se divulga en el presente documento un vector de direccionamiento grande para generar un animal genéticamente modificado de la invención. En un ejemplo, el vector de direccionamiento grande comprende brazos de homología en 5' y 3' de ratón; un fragmento de ADN que comprende el gen CD3e que comprende una sustitución de la secuencia parcial de los exones 2 a 4 que codifican CD3e de ratón por la secuencia parcial de los exones 2 a 5 que codifican c D3e humana; un fragmento de ADN que comprende el gen CD38 que comprende una sustitución de la secuencia parcial de los exones 2 a 3 que codifican CD38 de ratón por la secuencia parcial de los exones 2 a 3 que codifican CD38 humana; un fragmento de ADN que comprende el gen CD3y que comprende una sustitución de la secuencia parcial de los exones 2 a 4 que codifican CD3y de ratón por la secuencia parcial de los exones 2 a 4 que codifican CD3y humana; y un casete de selección.
Un casete de selección es una secuencia de nucleótidos insertada en una construcción de direccionamiento para facilitar la selección de células (por ejemplo, células bacterianas, células ES) que han integrado la construcción de interés. Se conocen en la técnica numerosos casetes de selección casetes de selección adecuados (Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC, etc.). Además, un casete de selección puede estar flanqueado por sitios de recombinación, que permiten la deleción del casete de selección tras el tratamiento con enzimas recombinasas. Los sitios de recombinación comúnmente utilizados son loxP y Frt, reconocidos por las enzimas Cre y Flp, respectivamente, pero se conocen otros en la técnica. Un casete de selección puede localizarse en cualquier lugar de la construcción fuera de la región codificante de. En un ejemplo, el casete de selección se inserta en la dirección de la secuencia insertada en CD3e humana.
Tras completar el direccionamiento del gen, las células ES o los ratones genéticamente modificados se cribaron para confirmar la incorporación correcta de la secuencia de nucleótidos exógena de interés o la expresión del polipéptido exógeno. Los expertos en la materia conocen numerosas técnicas que incluyen (aunque no de forma limitativa) transferencia Southern, PCR larga, PCR cuantitativa (por ejemplo, la PCR en tiempo real usando TAQMAN®), hibridación in situ con fluorescencia, transferencia Northern, citometría de flujo, análisis por transferencia Western, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, etc. En un ejemplo, los animales no humanos (por ejemplo, ratones) que soportan la modificación genética de interés pueden identificarse mediante cribado para la pérdida de alelos del ratón y/o la ganancia de alelos humanos utilizando una modificación del ensayo de alelos descrito en Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Los expertos en la materia conocen otros ensayos que identifican una secuencia de nucleótidos o aminoácidos específica en los animales modificados genéticamente.
Los heterocigotos resultantes de los métodos anteriores se pueden reproducir para generar homocigotos.
Se divulga un método para producir una molécula CD3 quimérica humana/no humana, que comprende expresar en una única célula una proteína CD3 quimérica de una construcción de nucleótidos como se describe en el presente documento. En un ejemplo, la construcción de nucleótidos es un vector vírico; en un ejemplo específico, el vector vírico
es un vector lentivírico. En un ejemplo, la célula se selecciona entre una CHO, COS, 293, HeLa, y una célula de la retina que expresa una secuencia de ácido nucleico vírica (por ejemplo, una célula PERC.6™).
Se divulga una célula que expresa una proteína CD3 humana/no humana quimérica. En un ejemplo, la célula comprende un vector de expresión que comprende una secuencia CCD3 quimérica como se describe en el presente documento. En un ejemplo, la célula se selecciona entre CHO, COS, 293, HeLa, y una célula de la retina que expresa una secuencia de ácido nucleico vírica (por ejemplo, una célula PERC.6™).
Se divulga también una molécula CD3 quimérica generada por un ratón como se describe en el presente documento, en donde, en un ejemplo, la molécula CD3 quimérica comprende una secuencia de aminoácidos de todo o sustancialmente todo un dominio extracelular de una proteína CD3 humana, y al menos dominios transmembrana y citoplásmico procedentes de una proteína CD3 no humana, por ejemplo, una proteína CD3 de ratón.
Además de un ratón diseñado mediante ingeniería genética para un embrión no humano (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un embrión de ratón o rata) como se divulga también, en donde el embrión comprende una célula ES donante que se deriva de un animal no humano (por ejemplo, un ejemplo, roedor, por ejemplo, un ratón o una rata) como se describe en el presente documento. En un ejemplo, el embrión comprende una célula donante ES que comprende el gen CD3 quimérico y las células embrionarias del hospedador.
también se divulga un tejido, en donde el tejido se deriva de un animal no humano (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata) como se describe en el presente documento, y expresa la proteína c D3 quimérica.
Además, se divulga una célula no humana aislada de un animal no humano como se describe en el presente documento. En un ejemplo, la célula es una célula ES. En un ejemplo, la célula es un linfocito T. En un ejemplo, la célula es un linfocito T CD8+. En otro ejemplo, la célula es un linfocito T CD4+.
En algunos ejemplos, se divulgan también en el presente documento loci genéticos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la(s) proteína(s) CD3 humanizadas descritas en el presente documento.
Modelo de ratón para ensayar terapias humanas
En algunos aspectos, se proporciona en el presente documento un modelo de ratón para ensayar agentes terapéuticos dirigidos a CD3 ("dirigidos contra CD3") de acuerdo con la reivindicación 8. En algunas realizaciones, se proporciona en el presente documento un modelo de ratón para ensayar proteínas de unión a antígeno dirigidas contra CD3. En algunas realizaciones, se proporciona en el presente documento un modelo de ratón para ensayar anticuerpo dirigidos contra CD3. En algunas de dichas realizaciones, se proporciona un modelo de ratón para ensayar anticuerpos multiespecíficos dirigidos contra CD3, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno biespecíficas o anticuerpos biespecíficos dirigidos contra CD3. Como tal, una proteína de unión a antígeno multiespecífica dirigida contra CD3, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno biespecífica dirigida contra CD3, se dirige o se une específicamente a dicha proteína CD3 humanizada y al menos un antígeno diferente de interés. En diversos aspectos, el modelo de ratón para ensayar proteínas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas contra CD3 en donde la proteína de unión a antígeno tiene capacidad de unión a ambos CD3 y el antígeno de interés comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3 humanizada, en donde la proteína CD3 humanizada comprende CD3e, CD35, CD3y, y una combinación de las mismas, y una célula que expresa o comprende el antígeno de interés. El ratón comprende un linfocito T que expresa dicha(s) proteína(s) CD3 humanizadas.
En una realización, el ensayo de la proteína de unión a antígeno monoespecífica o biespecífica implica llevar a cabo un ensayo o un estudio que permita la determinación del efecto de la proteína de unión a antígeno sobre el linfocito T que expresa dicha proteína CD3 humanizada. En otra realización, el ensayo de la proteína de unión a antígeno biespecífica implica llevar a cabo un ensayo o estudio que permite la determinación del efecto de la proteína de unión a antígeno en ambos linfocitos T que expresan dicha proteína CD3 humanizada y la célula que expresa o comprende el antígeno de interés, o la interacción entre dicho linfocito T que expresa CD3 y la célula que expresa o comprende el antígeno de interés. En una realización, el ensayo de la proteína de unión a antígeno monoespecífica o biespecífica implica llevar a cabo un ensayo o estudio que permita la determinación del efecto de los linfocitos T que expresan dicha proteína CD3 humanizada sobre la célula que expresa o comprende dicho antígeno de interés. En una realización, dichas medidas de ensayo, por ejemplo, el número de células que expresan el antígeno de interés, respuesta inmunitaria, interacciones celulares, citotoxicidad celular, liberación de citoquinas, activación celular, proliferación celular, crecimiento o regresión tumoral, cambios en la patología, o similares. Diversos ensayos incluyen, aunque no de forma limitativa las mediciones de la citotoxicidad dirigida al complemento (CDC), citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), proliferación de PBMC, activación de CD69, análisis histológico del tejido, análisis del tejido y de los biomarcadores celulares (por ejemplo, se pueden extraer células o tejido del ratón para el fin de los ensayos, o analizarse mediante radiografía, IRM, PET, SPECT, BLI, y modalidades de adquisición de imágenes basadas en fluorescencia).
En algunas realizaciones de la invención, en dicho modelo de ratón, el antígeno de interés se ha introducido en dicho ratón. El antígeno de interés se puede introducir mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la materia.
Algunos métodos no limitantes incluyen la transgénesis, inyección, infección, trasplante de tejido o de células. El antígeno de interés o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento que es reconocido por la proteína de unión a antígeno que se está ensayando) puede dirigirse a, o expresarse por, tipos celulares concretos. En algunas realizaciones, el antígeno de interés es un antígeno humanizado de interés codificado por el genoma de ratón.
El antígeno de interés puede ser una proteína unida a membrana de tal manera que se expresa solo sobre la superficie de la célula. Como alternativa, el antígeno de interés o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento que es reconocido por la proteína de unión a antígeno que se está ensayando) puede presentarse sobre la superficie celular complejado con otra proteína o resto. Algunos antígenos de la superficie celular pueden asociarse con otras proteínas como complejos correceptores, o unirse o tener afinidad con moléculas extracelulares. Por tanto, se puede utilizar el modelo de ratón para ensayar moléculas de unión a antígeno biespecíficas que interactúan con linfocitos T en diversos sistemas celulares.
el ratón expresa los dominios extracelulares CD3e, CD38 y CD3y humanos. En una realización, el ratón expresa el dominio transmembrana y citoplásmico de ratón de CD3e, CD38 y CD3y; en una realización, los dominios transmembrana y citoplásmico son dominios endógenos de ratón. En una realización, el modelo de ratón expresa CD3e, CD38 y CD3y, comprendiendo cada uno un dominio extracelular humano y de ratón, por ejemplo, los dominios transmembrana y citoplásmico de un ratón endógeno.
La proteína de unión a antígeno se une a CD3 y al antígeno de interés en el modelo de ratón. En una realización, el antígeno de interés es un antígeno humano. En una realización, el antígeno de interés es un antígeno de primate, por ejemplo, un antígeno de macaco. En una realización, la proteína de unión a antígeno tiene capacidad de unión al mismo antígeno de interés de origen humano y de ratón. En una realización, la proteína de unión a antígeno tiene capacidad de unión a una CD3 humana y de mono.
En una realización, el modelo de ratón comprende un xenoinjerto de un tumor que expresa el antígeno de interés. En una realización, la célula que expresa o que comprende el antígeno de interés en dicho ratón es una célula inmortalizada, tal como una célula tumoral. Por tanto, el modelo de ratón se utiliza para ensayar la actividad de las proteínas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas contra CD3 en el bloqueo o que afectan la célula tumoral que expresa el antígeno de interés.
Por tanto, en la realización de la invención, en donde la célula que expresa o que comprende el antígeno de interés es una célula tumoral, el antígeno de interés puede ser un antígeno asociado a tumor (TAA). Se relacionan diversos antígenos tumorales en la base de datos de antígenos tumorales definidos por linfocitos T (van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013). Los antígenos asociados a tumores ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa ALK, proteínas BAGE, BIRC5 (survivina), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR variante III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, proteínas GAGE, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, LMP2 derivada de VEB, L1CAM, proteínas MAGE, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLACI, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, nuevo antígeno de Thompson, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1. En un ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3 del presente documento, el antígeno de interés puede ser CD20, por ejemplo, CD20 humano o humanizado.
En otra realización de la invención, el modelo de ratón se usa para determinar si un candidato de una proteína de unión a antígeno biespecífica es capaz de bloquear o afectar a un antígeno de interés que es un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa. En una realización de la invención, el ratón se infecta con un agente infeccioso. En una realización de la invención, el antígeno asociado a la enfermedad infecciosa es un antígeno vírico. En un aspecto, el antígeno vírico se selecciona entre el grupo que consiste en VIH, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, virus del herpes (por ejemplo, VHS-1, VHS-2, CMV, VHA-6, VVZ, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, h TlV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC, virus del ébola, y antígeno del virus de la encefalitis arbovírica.
En otra realización de la invención, en donde el antígeno de interés es un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa, el antígeno de interés es un antígeno bacteriano. En algunos aspectos de la invención, el antígeno bacteriano se selecciona del grupo que consiste en clamidia, rickettsia, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos, gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospira, y antígeno bacteriano de la enfermedad de Lyme.
En algunos aspectos de la invención, la proteína de unión a antígeno biespecífica basada en CD3 es una proteína de unión a antígeno basada en CD3. En una realización, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En algunas realizaciones de la invención, el modelo de ratón es un modelo de ratón inmunocompetente. En algunas realizaciones de la invención, el modelo de ratón permite ensayar la eficacia y/o la toxicidad de la proteína de unión a antígeno de interés. Las medidas de la eficacia dependerán del antígeno de interés que está dirigido por el agente biespecífico. En algunas realizaciones, la medida de la eficacia es la destrucción de linfocitos T de la célula que expresa el antígeno. En otras realizaciones, la medida de la eficacia es la neutralización del virus. En otra realización, la medida de la eficacia puede ser la viabilidad del animal. En otra realización más, la medida de la eficacia puede ser la eliminación de las células que expresan el antígeno de interés, la proliferación de linfocitos T, la producción de citoquinas (por ejemplo, IFNg, TNFa, IL-1, IL-2, IL-10, IL4, IL-6, granzima, perforina, etc.)
En algunas realizaciones de la invención, la toxicidad en el animal puede medirse como un evento adverso en el animal, por ejemplo, el cambio en el peso corporal, apetito, cambios digestivos, cambios en los recuentos de células de la sangre, esplenomegalia, cambios histológicos de los órganos, cambio en función de la enzima hepática, cambios en el análisis de orina, toxicidad orgánica, hemorragia, deshidratación, pérdida de pelo y suciedad, u otros signos de morbilidad. Una medida puede ser la determinación de la reactividad cruzada de la proteína de unión a antígeno con antígenos irrelevantes, que, en una realización, puede detectarse mediante histología de órganos, específicamente, la detección de la proteína de unión a antígeno en tejidos o tipos de células que no son conocidos por expresar el antígeno de interés.
Uso de animales no humanos genéticamente modificados
La invención proporciona también diversos métodos de utilizar los ratones genéticamente modificados descritos en el presente documento.
En una realización, se proporciona en el presente documento para cribar fármacos candidatos terapéuticos que se dirigen a un antígeno de interés que comprende (a) proporcionar o recibir un ratón genéticamente modificado que comprende en su locus CD3 endógeno de ratón una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de una CD3e, CD38 y CD3y humana, (b) introducir en dicho ratón genéticamente modificado un antígeno de interés, (c) poner en contacto dicho ratón con un fármaco candidato de interés, en donde el fármaco candidato se dirige contra la CD3 humana y el antígeno de interés, y (d) determinar si el fármaco candidato es eficaz en la prevención, la reducción o la eliminación de células caracterizadas por la presencia o la expresión del antígeno de interés. en el ratón expresa una proteína CD3 humanizada funcional, sobre la superficie de sus linfocitos T. el ratón genéticamente modificado comprende en el locus CD3 endógeno de ratón una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular de CD3e humana, un dominio extracelular de CD38 humana y un dominio extracelular de CD3y humana. En una realización del método que se describe en el presente documento, el ratón no comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular funcional de las proteínas de ratón correspondientes. En algunas realizaciones del método, el(los) dominio(s) extracelular(es) de la(s) proteína(s) CD3 humana(s) está(n) unido(s) operativamente al(a los) dominio(s) transmembrana y citoplásmico de la(s) proteína(s) CD3 endógenas(s) de ratón correspondiente(s). En diversas de dichas realizaciones no limitantes de los métodos, el dominio extracelular de una CD3e humana se muestra en la SEQ ID NO: 33, el dominio extracelular de CD38 humana se muestra en la SEQ ID NO: 34, y el dominio extracelular de CD3y humana se muestra en la SEQ ID NO: 35. En diversas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el ratón puede expresar una proteína CD3e humanizada que se muestra en la SEQ ID NO: 24, Una proteína CD38 humanizada que se muestra en la SEQ ID NO: 25 y la CD3y humanizada que se muestra en la SEQ ID NO: 26.
En varias realizaciones del método descrito en el presente documento, la introducción del antígeno de interés en el ratón genéticamente modificado descrito en el presente documento puede llevarse a cabo mediante cualesquiera métodos conocidos por el experto en la materia, que pueden incluir, sin limitación, la transgénesis, inyección, infección, trasplante de tejido o de células. Como tal, se puede conseguir la introducción expresando en el ratón el antígeno de interés, que puede comprender modificar genéticamente dicho ratón para expresar el antígeno de interés. Como alternativa, la introducción puede comprender introducir en dicho ratón una célula que exprese el antígeno de interés, por ejemplo, como en el trasplante de una célula o tejidos. La introducción puede comprender también infectar dicho ratón con el antígeno de interés, por ejemplo, como en una infección bacteriana o vírica. En una realización, el antígeno de interés puede ser un antígeno de interés humano. En otra realización, puede ser un antígeno bacteriano o vírico de interés.
El antígeno de interés puede ser un antígeno asociado a tumor, como se ha descrito en detalle anteriormente. el antígeno de interés puede ser un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, un antígeno bacteriano o vírico, como se ha descrito en detalle anteriormente.
En algunas realizaciones de los métodos de cribado de un fármaco candidato terapéutico, el fármaco candidato puede ser una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. En diversos aspectos, dicho fármaco candidato tiene capacidad de unión a la CD3 humana y al antígeno de interés. el antígeno de interés puede ser un antígeno humano. el antígeno de interés puede ser un antígeno de primate, por ejemplo, un antígeno de mono. Por tanto, el fármaco candidato usado para el cribado puede tener capacidad de unión al antígeno humano y a un antígeno de primate correspondiente, además de unirse a CD3 humana. el fármaco candidato puede ser también capaz de unirse a una CD3 de primate, por ejemplo, de mono. Por tanto, el fármaco candidato puede
tener capacidad de unión a una CD3 de humano y de primate, por ejemplo, de mono; y también, en una realización, ser capaz de unirse a un antígeno humano de interés. En otra realización, el antígeno de interés puede ser un antígeno bacteriano o vírico, y el fármaco candidato puede tener capacidad de unión a la CD3 humana y de primate, por ejemplo, CD3 de mono, y el antígeno bacteriano o vírico de interés.
En algunos aspectos, el candidato terapéutico es un anticuerpo, que es un anticuerpo humano. En otros aspectos, puede ser un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el candidato terapéutico puede ser un anticuerpo generado en ratones VELOCIMMUNE® (patente de Estados Unidos n.° 8.502.018, por tanto, el anticuerpo candidato inicial puede comprender una región variable humana y una región constante de ratón. La región constante de ratón del anticuerpo candidato puede rediseñarse para ser de origen humano expresando la región variable humana seleccionada en ratones VELOCIMMUNE® en enlace operativo con una región constante humana.
En varias realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el candidato terapéutico es capaz de reducir, eliminar, o prevenir una enfermedad. En una realización, la enfermedad es un tumor, y el candidato terapéutico es capaz de reducir, eliminar o prevenir el crecimiento del tumor en comparación con un agente que no se dirige al antígeno de interés. En dicha realización del método, la determinación de si el fármaco candidato es eficaz en la prevención, la reducción o la eliminación de células caracterizadas por la presencia o expresión del antígeno de interés puede llevarse a cabo usando un ensayo de volumen tumoral, un ensayo de destrucción de células tumorales, inducción de marcadores apoptóticos en tumores, reducción del crecimiento de vasos sanguíneos en tumores, infiltración de células inmunitarias en tumores, etc. En otra realización, la enfermedad es una enfermedad infecciosa, y el candidato terapéutico es capaz de reducir, eliminar, o prevenir una infección bacteriana o vírica en comparación con un agente que no se dirige al antígeno de interés. En dicha realización del método, la determinación de si el fármaco candidato es eficaz en la prevención, reducción o eliminación de células caracterizadas por la presencia o expresión del antígeno de interés puede llevarse a cabo usando una medida de los títulos bacterianos o víricos, la inducción de marcadores apoptóticos en células infectadas, etc.
se divulgan también otros métodos de uso de los ratones CD3 humanizados de la presente invención. Por ejemplo, el animal no humano, por ejemplo, un ratón CD3 humanizado, divulgado en el presente documento se puede usar para estudiar el mecanismo de acción del fármaco. Antes del desarrollo del presente animal, era difícil estudiar el mecanismo de acción del fármaco ya que dichos estudios no se llevaban a cabo normalmente en seres humanos y primates, y se requiere a menudo un modelo animal inmunocompetente. La comprensión del mecanismo de acción del fármaco puede conducir al desarrollo de mejores anticuerpos. En diversas realizaciones de la invención, el ratón CD3 humanizado es un ratón inmunocompetente. Por ejemplo, el ratón CD3 humanizado de la invención, lo que comprende un sistema inmunitario normal sano con un desarrollo intacto y un complemento completo de todos los tipos de células inmunitarias y unas rutas de señalización inmunitaria intactas, pueden usarse para estudiar los efectos de diversos candidatos terapéuticos sobre tipos de células específicos, citoquinas, quimioquinas, etc. A continuación, el ratón puede utilizarse para responder preguntas mecanicistas que se refieren a la función del fármaco candidato.
Además, el ratón CD3 humanizado se puede utilizar en métodos que implican ensayar el efecto de los fármacos candidatos dirigidos contra CD3 biespecíficos sobre los injertos tumorales. Los modelos de ratón anteriormente desarrollados eran modelos de ratón inmunocomprometidos para permitir el injerto tumoral humano adecuado. El ratón CD3 humanizado es completamente inmunocompetente y permite la introducción y el crecimiento de células tumorales que expresan el antígeno de interés, de tal manera que afectan por completo la respuesta inmunitaria que se puede estudiar, incluyendo aunque no de forma limitativa responder preguntas mecanicistas, preguntas sobre toxicidad temprana, preguntas sobre eficacia temprana, etc.
En otras realizaciones más, el ratón CD3 humanizado se puede utilizar para estudiar los efectos de la combinación de terapias farmacológicas en modelos animales, específicamente la combinación de terapias farmacológicas, por ejemplo, cuando un fármaco es una proteína de unión a antígeno que se une a CD3 y otro fármaco es un agente que se ha homologado anteriormente para una indicación concreta. Se pueden abordar preguntas específicas relacionadas con la dosificación de los fármacos y sus efectos en un modelo animal antes de cualquier ensayo humano.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de describir para los expertos en la materia como preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores de la presente invención consideran como su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Los Ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales que serían bien conocidos por los expertos en la materia (técnicas de clonación molecular, etc.). A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura se indica en grados Celsius, y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.
Ejemplo 1. Construcción del locus CD3 humanizado
Ejemplo 1,1. Construcción de CD3y5e humanizado
El locus CD3 de ratón se humanizó mediante la construcción de un único vector de direccionamiento a partir de ADN (BAC) de cromosoma artificial bacteriano humano y de ratón utilizando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659). Se modificó el ADN del clon BAC bMQ-425K11de ratón mediante recombinación homóloga para sustituir el ADN genómico que codifica parte de los genes CD3s, CD35 y CD3y (genes CD3 de ratón localizados en estrecha proximidad entre sí en el cromosoma 9) con las porciones de los genes CD3s, Cd35 y CD3y derivados de BAC RP11-414G21 humano (los genes CD3 humanos se localizan en estrecha proximidad entre sí en el cromosoma 11), respectivamente.
Específicamente, Para generar los ratones CD3y5e humanizados, se modificó en primer lugar el ratón BAC sustituyendo 714 pb de la secuencia Cd3d de ratón (que corresponde a la secuencia parcial del gen Cd3d de ratón que codifica los exones 2-3) por 939 pb de la secuencia CD3D humana (que corresponde a la secuencia parcial del gen CD3D humano que codifica los exones 2-3) en un único evento director utilizando un vector de direccionamiento que comprende un casete Spec que utiliza brazos de homología de ratón.
Un ratón BAC que comprende una sustitución de la secuencia parcial del gen CD3d de ratón que codifica los exones 2-3 por la secuencia humana correspondiente se modificó posteriormente mediante la sustitución de 1.738 pb de la secuencia Cd3g de ratón (que corresponde a la secuencia parcial del gen Cd3 g de ratón que codifica los exones 2 4) por 1.639 pb de la secuencia CD3G humana (que corresponde a la secuencia parcial del gen Cd3 g humano que codifica los exones 2-4) también en un único evento de direccionamiento usando otro vector que contiene un casete Spec y los brazos de homología de ratón.
Por último, el BAC que comprende la sustitución de los genes CD3d y CD3g de ratón por los genes humanos correspondientes se modificó adicionalmente sustituyendo 6.213 pb de la secuencia CD3e de ratón con 6.817 pb de la secuencia humana (que corresponde a la sustitución de la secuencia parcial del gen CD3e de ratón que codifica los exones 2 a 4 con la secuencia parcial del gen CD3E humano que codifica los exones 2 a 5). Se insertó un casete de neomicina floxado de 4.996 pb en la dirección 5' de la secuencia CD3E humana inactivada.
El vector de direccionamiento grande humanizado resultante para la inserción en células ES se representa en la FIG.
2A, indicando A, B, C, D, E, F, y G diversas uniones de casetes de ratón/humano o casetes de ratón/NEO o casetes humano/NEO. Las secuencias en las uniones se representan en la Tabla 1 siguiente.
Tabla 1. Secuencias de unión del vector de direccionamiento rande
(continuación)
Se usó el ADN dirigido a BAC para electroporar células ES de ratón que comprenden una deleción en el locus CD3 de ratón para crear células ES modificadas para generar ratones que expresan CD3s, CD35 y CD3y sobre la superficie de sus linfocitos T. Se identificaron células ES que contenían inserciones de las secuencias CD3s, CD35 y CD3y mediante un ensayo TAQMAN™ cuantitativo (véase, por ejemplo, Lie y Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48. Se diseñaron conjuntos y sondas específicos de cebadores para detectar la inserción de secuencias humanas (ganancia de alelos, GOA) y la deleción de secuencias de ratones (pérdida de alelos, LOA). La Tabla 2 identifica los nombres y localizaciones de cada uno de los cebadores/sondas usadas en los ensayos de la PCR cuantitativa.
Las células ES dirigidas anteriormente descritas se utilizaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.294.754 y Poueymirou et al. (2007) los ratones de la generación F0 que se derivaron esencialmente de forma completa del gen donante dirigido a las células ES lo que permite los análisis fenotípicos inmediatos Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (ratones F0 completamente derivados de la célula ES donante) que soportaban independientemente genes CD3 humanizados se identificaron mediante genotipación usando una modificación del ensayo de alelos (véase anteriormente) que detecta la presencia de las secuencias únicas del gen CD3 humano.
El casete de selección puede eliminarse mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, las células ES que soportan el locus CD3 humanizado pueden transfectarse con una construcción que expresa Cre a fin de retirar el casete floxado. El casete de selección puede retirarse opcionalmente reproduciéndolo en ratones que expresan Cre recombinasa. Opcionalmente, el casete de selección es retenido en los ratones. La unión ratón/humana del alelo CD3e humanizado tras la retirada del casete de selección (representado como A-B en la FIG. 2B), se presenta en la Tabla 3 siguiente. Las secuencias de unión restantes son las mismas que en el vector de direccionamiento y se presentan en la Tabla 1 anterior.
Tabla 3. Secuencias de unión del alelo humanizado
la secuencia de las proteínas CD3e CD38, y CD3y humanizadas resultantes, se representa en la FIG 3 y se incluye en el listado de secuencias. Adicionalmente, el alineamiento de las secuencias de ratón-humana y de las uniones en 5' y 3' de la secuencia humana insertada se muestran en la FIG. 4 como * y **, respectivamente. Números de registro de proteínas del GenBank para proteínas CD3e, CD38 y CD3y se resumen a continuación en la Tabla 4.
Tabla 4 Números de re istro de roteínas del GenBank
Ejemplo 2. Caracterización de Ratones CD3 Humanizados
Ejemplo 2.1. Desarrollo de células inmunitarias en ratones CD3 humanizados
Se evaluó el desarrollo de células inmunitarias en el timo y la periferia de ratones con una CD3eSy humana usando el análisis de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y el recuento diferencial de células. Se recogieron ganglios del timo, bazo y linfáticos de las cohortes de ratones de tipo silvestre (WT, CD3y§£ no humanos), heterocigóticos (Het, un alelo hCD3Y§£) y homocigóticos (Ho, dos alelos hCD3Y§£). Se obtuvo sangre periférica mediante punción cardíaca o sangrado retroorbital en tubos Microtainer revestidos con EDTA (BD). Se prepararon suspensiones de células individuales a partir del bazo, LN y timo usando perturbación mecánica, y se retiraron glóbulos rojos del bazo, timo y sangre completa mediante lisis con un tampón de lisis AKC. Se incubaron las células durante
10 minutos a temperatura ambiente con anticuerpos purificados para CD16/CD32 (FcBlock)para bloquear la unión no específica mediante receptores Fc, y a continuación se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con un cóctel de anticuerpos conjugados directamente a marcadores de linfocitos T y B. Las células se lavaron dos veces con PBS frío que contenía b Sa al 1 %, se resuspendieron en tampón y se analizaron mediante citometría de flujo en un citómetro de flujo FACSCanto II™ (BD Biosciences). Se identificaron los timocitos en primer lugar mediante clasificación por dispersión hacia adelante y lateral, y clasificando a continuación la población de B220. En la periferia, Se identificaron los linfocitos T como CD45+/TCRb+/B220-, y se identificaron los linfocitos B como CD45+/TCRb-/B220+. Se obtuvieron los recuentos absolutos en un Analizador hematológico Hemavet 950FS.
Como se demostró en las FIGS. 5A y 5B, los ratones CD3y§£ humanizados parecieron tener un desarrollo de timocitos normal y relaciones de linfocitos T y linfocitos B normales en el timo, la sangre periférica, y el bazo. Adicionalmente, Los porcentajes de linfocitos T y linfocitos B parecieron normales en los ganglios linfáticos, y los recuentos celulares absolutos de los ganglios del bazo y linfáticos (no se muestran los datos) estuvieron dentro del intervalo normal. las cantidades de linfocitos CD4 y CD8 en la sangre fueron similares entre los ratones WT, Het, y Ho. Los glóbulos blancos en circulación, linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos, y basófilos parecieron todos dentro del intervalo normal (no se muestran los datos). Por tanto, se observó el desarrollo de células inmunitarias normales en los ratones CD3eSy humanizados.
A fin de determinar si los ratones CD3eSy humanizados presentaron un repertorio de linfocitos T Vp CD4+ y CD8+ policlonal, se aislaron esplenocitos de cuatro ratones del control emparejados por cepa y cinco ratones humanizados y se examinaron para la utilización de TCR Vp. Se extrajeron los bazos y se prepararon esplenocitos individuales como se ha descrito anteriormente. Se incubaron las células durante 1o minutos a temperatura ambiente con anticuerpos purificados para CD16/CD32 (FcBlock; Biolegend) para bloquear la unión no específica mediante receptores Fc, y a continuación se resuspendió en un cóctel de anticuerpos conjugados directamente a CD4 de ratón (Biolegend)y a CD8 de ratón (Biolegend). Los anticuerpos conjugados directamente al TCR Vp se añadieron a continuación a los pocillos individuales y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Se lavaron las células con PBS frío y se incubaron con un colorante de viabilidad para tinción de células muertas (LIVE/DEAD Fixable Aqua, Life Technologies) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las células con PBS frío que contenía FBS al 2 %, a continuación se resuspendieron en tampón y se fijaron con tampón de estabilización BD antes de analizarse mediante citometría de flujo en un citómetro de flujo LSR Fortessa™ (BD Biosciences). Se identificaron los linfocitos T CD4 y CD8 en primer lugar mediante clasificación por dispersión hacia adelante y lateral, y a continuación, clasificando la población viva. A continuación se examinaron los linfocitos T CD4 (CD4+CD8-) y los linfocitos T CD8 (CD4-CD8+) para la utilización de TCR Vp.
Como puede verse a partir de la FIGURA 5C, el repertorio Vp usado por los linfocitos T CD4 y CD8 en los ratones CD3eSy humanizados muestra policlonalidad, con una utilización no significativamente diferente de los ratones del control emparejados por cepa.
Ejemplo 2.2. Respuesta de los linfocitos T a la infección en ratones CD3 humanizados
Para determinar si los ratones CD3 humanizados (ratones CD3y§£ humanizados) presentaron una respuesta normal a la infección, se ensayó la capacidad de los ratones humanizados de clarificar el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV). LCMV es un virus trópico de ratón, donde el desarrollo de la infección depende de la cepa vírica. La infección con la cepa Armstrong da como resultado una infección aguda, donde los ratones pueden desarrollar rápidamente una respuesta de linfocitos T contra el virus y clarificar la infección en aproximadamente una semana. Por otro lado, El clon 13 del virus no se puede clarificar, y los linfocitos T llegan a "agotarse" y se establece una infección crónica. Ya que las infecciones crónicas y agudas dependen de la actividad de los linfocitos T, LCMV es un modelo ideal para ensayar la función de los linfocitos T.
Se infectaron ratones CD3 humanizados o ratones del control emparejados por cepa de 6-8 semanas con 2x105 uff de la cepa Armstrong por vía i.p. y/o 2x106 uff del clon 13 por vía i.v. para la infección del clon 13, dos semanas después de la infección se extrajeron los bazos y se midieron los títulos víricos mediante el ensayo de placas. Los títulos víricos fueron similares en los ratones del control y los ratones huCD3 (FIG. 6A), indicando que la humanización de CD3 no tiene un efecto sobre el fenotipo agotado de los linfocitos T, ya que los linfocitos T pueden controlar el virus a niveles similares en ambas cepas de ratones. Para la infección por la cepa Armstrong, dos semanas después de la infección de la cepa Amstrong inicial, se estimularon los ratones con el clon 13 y dos semanas después de la estimulación del clon 13 se midieron los títulos víricos en los bazos. No se detectó virus tanto en los ratones del control como en los ratones CD3 humanizados (FIG. 6B). Los datos sugieren que se clarificó la infección por Armstrong aguda. Además, esto demuestra que la memoria de los linfocitos T que se estimuló a partir de la infección por Armstrong fue suficiente para proteger a los ratones de la infección del clon 13 posterior en ambas cepas de ratones.
Ejemplo 3. Ratones CD3 humanizados como un modelo para ensayar candidatos terapéuticos basados en anticuerpos dirigidos contra CD3
Ejemplo 3.1. CD3 de ratón humanizada para ensayar la reactividad cruzada del macaco mediante los anticuerpos dirigidos contra CD3 humana
Se ensayó la capacidad de diferentes anticuerpos dirigidos contra CD3 restringidos a ser humano o reactivos en cruzado con macaco de unirse a esplenocitos procedentes de ratones de tipo silvestre (WT) o ratones CD3y§£ humanizados (Ho = homocigóticos, Het = heterocigóticos ) usando el análisis de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
Se incubaron esplenocitos aislados recientemente (2x105 por pocillo) con anticuerpos dirigidos contra CD3 (15 ug/ml) durante 30 minutos a 4 °C. Durante la incubación, se lavaron las células dos veces y se añadieron anticuerpos secundarios adecuados (por ejemplo, anticuerpo PE dirigido contra IgG humana con etiqueta fluorescente y anticuerpos conjugados directamente con marcadores de linfocitos T) y se incubaron durante 30 minutos más a 4 °C, a continuación se lavaron dos veces. Se usaron los anticuerpos siguientes: ah/mfCD3-2 y ah/mfCD3-1 son dos anticuerpos que reconocen la CD3 humana y de mono; ahCD3-2 y ahCD3-1 son dos anticuerpos que reconocen solo la CD3 humana, amCD3-2C11 es un anticuerpo que reconoce solo la CD3 de ratón, la IgG humana del control es un anticuerpo del control sin relacionar y el 2o es un anticuerpo secundario solo del control. Las células se lavaron dos veces con PBS frío que contenía BSA al 1 %, se resuspendieron en tampón y se analizaron mediante citometría de flujo en un citómetro de flujo FACSCanto II™ (Bd Biosciences). Se identificaron los linfocitos T como cD45+/TCRb+/B220-. Se usaron anticuerpos dirigidos contra mCD3-2C11 diseñados para contener hIgGI para identificar linfocitos T en esplenocitos de ratón WT.
Como se demuestra en la FIG. 7, los anticuerpos dirigidos contra CD3 que reconocieron solo la CD3 humana fueron capaces de unirse a CD3 sobre la superficie de los esplenocitos procedentes de ratones CD3y§£ humanizados; de manera similar, los anticuerpos dirigidos contra CD3 que reconocieron solo la CD3 humana y de mono fueron capaces de unirse a CD3 sobre la superficie de los ratones CD3y§£ humanizados. Por tanto, los ratones humanizados para las tres CD3e, CD38 y CD3y son relevantes para los estudios preclínicos en fase temprana de fármacos candidatos basados en CD3 que puede continuarse por estudios de eficacia y toxicidad basados en macacos.
Ejemplo 3.2. Activación de linfocitos T en ratones CD3 humanizados
Se ensayó la capacidad de los anticuerpos dirigidos contra CD3 humana de estimular una respuesta inmunitaria en ratones CD3 humanizados. Ratones humanizados para CD3y§£ (n de 2/grupo), se inyectaron intraperitonealmente con 10 ug de anticuerpos dirigidos contra CD3 restringidos a seres humanos o reactivos en cruzado con macacos (todos hIgGI). Para obtener los niveles de composiciones celulares y citoquinas en plasma, la sangre se extrajo en tubos Microtainer revestidos con EDTA (BD) desde el seno retroorbital comenzando 2 horas después de la inyección. Se evaluó el número de linfocitos T y linfocitos B periféricos mediante FACS. En resumen, se incubaron 50 ul de sangre completa durante 30 minutos a 4 °C cóctel de anticuerpos conjugados directamente a marcadores de linfocitos T y linfocitos B. Se retiraron los glóbulos rojos mediante lisis con tampón de lisis AKC, y las células etiquetadas se lavaron una vez con PBS frío que contenía BSA al 1 %. Después del lavado, las células se resuspendieron en tampón frío y se analizaron mediante citometría de flujo en un citómetro de flujo FACSCANTO 11 ™ (BD Biosciences). Se identificaron los linfocitos T como CD45+/TCRb+/B220- vivos, y se identificaron los linfocitos B como CD45+/TCRb-/B220+. Se determinaron los recuentos de células absolutos añadiendo una cantidad conocida de perlas de recuento absoluto CountBright TM. Se evaluaron los niveles de citoquinas en plasma usando un Kit Mouse ProInflammatory 7-Plex Ultra-Sensitive Kit (Meso-Scale Discovery) a partir de sangre obtenida 2 horas después de la inyección.
Como se demuestra en la FIG. 8A, la inyección de 10 ug de anticuerpos dirigidos contra CD3 indujo un agotamiento transitorio de linfocitos T y B, que se restauró en última instancia en el día 4 tras el tratamiento inicial con anticuerpos. Adicionalmente, la inyección de anticuerpos dirigidos contra CD3(anticuerpos dirigidos contra CD3 que reconocen solo la CD3 humana (ahCD3-1 y ahCD3-3) y anticuerpos dirigidos contra CD3 que reconocen la CD3 humana y de mono (ah/mfCD3-1 y ah/mfCD3-2)) indujo la producción de citoquinas en ratones CD3y§£ humanizados (Fig. 8B).
Además, Se evaluó la capacidad de los anticuerpos dirigidos contra CD3 humana, los anticuerpos dirigidos contra CD3 humana/de macaco o los anticuerpos dirigidos contra la de ratón para inducir la proliferación de esplenocitos obtenidos de ratones CD3y§£ de tipo silvestre o humanizados utilizando la cuantificación catalizada por ATP (CellTiter Glo®). La activación de los esplenocitos de ratón da como resultado la liberación de citoquinas, que activan la proliferación celular. Se adquirieron los datos de proliferación utilizando el siguiente protocolo: se añadieron esplenocitos (5x105/pocillo) derivados de ratones de tipo silvestre (WT) o ratones CD3y§£ homocigóticos humanizados (hCD3Y8£Ho) a placas de 96 pocillo que se habían revestido durante la noche a 4 °C con cantidades decrecientes de anticuerpos dirigidos contra CD3, reactivos en cruzado con macaco, o específicos de murino. se añadieron 500 ng/ml de anticuerpos dirigidos contra CD28 de ratón a los cultivos y se incubaron las placas durante 72 h a 37 °C. Tras la incubación, se añadió CellTiter Glo® y se midió la luminiscencia usando un lector de placas multietiqueta VICTOR X5 (PerkinElmer). Se determinó la CE50 de viabilidad celular (cuantificación catalizada por ATP) usando Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Los valores se calcularon utilizando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros.
Como se demuestra en la FIG. 9, los esplenocitos de ratones CD3y§£ humanizados se indujeron para proliferar con anticuerpos que reaccionan en cruzado con CD3 de macaco.
En la FIG. 10 se presenta un sumario de diversas propiedades de ratones WT y CD3y§£. Tal como se puede observar,
Claims (17)
1. Un ratón genéticamente modificado, que comprende
en un locus CD3e endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3e quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de una proteína CD3e humana unida operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3e de ratón,
en un locus CD38 endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD38 quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD38 humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD38 de ratón, y
en un locus CD3y endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3y quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD3y humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3y de ratón,
en donde el ratón expresa sobre la superficie de sus linfocitos T un complejo CD3 humanizado funcional que comprende las proteínas CD3e, CD38 y CD3y quiméricas humanas/ratón y en donde los loci CD3e, CD38 y c D3y endógenos de ratón están modificados genéticamente para no expresar dominios extracelulares funcionales de las proteínas CD3e, CD38 y CD3y endógenas de ratón.
2. Un embriocitoblasto (ES) de ratón genéticamente modificado que comprende
en un locus CD3e endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3e quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de una proteína CD3e humana unida operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3e de ratón,
en un locus CD38 endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD38 quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD38 humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD38 de ratón, y
en un locus CD3y endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3y quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD3y humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3y de ratón.
3. El ratón de la reivindicación 1 o la célula ES de ratón de la reivindicación 2,
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD3e quimérica sustituye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD3e endógena de ratón correspondiente,
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD38 quimérica sustituye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD38 endógena de ratón correspondiente, y
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD3y quimérica sustituye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD3y endógena de ratón correspondiente.
4. El ratón o la célula ES de ratón de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el dominio extracelular de la proteína CD3e humana comprende la secuencia de SEQ ID NO: 33, el dominio extracelular de la proteína CD38 humana comprende la secuencia de SEQ ID NO: 34, y el dominio extracelular de la proteína CD3y humana comprende la secuencia de SEQ ID NO: 35.
5. El ratón o la célula ES de ratón de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es heterocigótico para los loci CD3 endógenos de ratón modificados.
6. El ratón o la célula ES de ratón de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es homocigótico para los loci CD3 endógenos de ratón modificados.
7. Un método para generar un ratón genéticamente modificado como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:
a) introducir en el genoma de embriocitoblasto del ratón (ES)
en un locus CD3e endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3e quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD3e humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3e de ratón,
en un locus CD35 endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD35 quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD35 humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD35 de ratón, y
en un locus CD3y endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3y quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD3y humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3y de ratón; y
b) generar el ratón genéticamente modificado a partir de la célula, opcionalmente, en donde la célula es una célula ES individual, y la célula ES individual se introduce en un embrión de ratón para generar un ratón.
8. Un método para generar una célula ES de ratón genéticamente modificada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2-6, que comprende:
introducir en el genoma de la célula ES
en un locus CD3e endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3e quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD3e humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3e de ratón,
en un locus CD35 endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD35 quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD35 humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD35 de ratón, y
en un locus CD3y endógeno de ratón, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína CD3y quimérica humana/ratón que comprende un dominio extracelular de CD3y humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de CD3y de ratón.
9. El método de las reivindicaciones 7 u 8,
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD3e quimérica sustituye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD3e endógena de ratón correspondiente,
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD35 quimérica sustituye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD35 endógena de ratón correspondiente, y
en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD3y quimérica sustituye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína CD3y endógena de ratón correspondiente.
10. Un modelo de ratón para ensayar una proteína de unión a antígeno biespecífica basada en CD3, en donde la proteína de unión a antígeno tiene capacidad de unión a CD3 y a un antígeno no de ratón de interés, que comprende:
a) un ratón cuyo genoma está genéticamente modificado de tal manera que expresa sobre la superficie de sus linfocitos T un complejo CD3 humanizado funcional que comprende las proteínas CD3e, CD35 y c D3y quiméricas humanas/ratón,
en donde la proteína CD3e quimérica humana/ratón comprende un dominio extracelular de una proteína CD3e humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de una proteína CD3e de ratón, en donde la proteína CD35 quimérica humana/ratón comprende un dominio extracelular de una proteína CD35 humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de una proteína CD38 de ratón, y en donde la proteína CD3y quimérica humana/ratón comprende un dominio extracelular de una proteína CD3y humana unido operativamente a los dominios transmembrana y citoplásmico de una proteína CD3y de ratón, y b) una célula que expresa o comprende el antígeno no de ratón de interés, opcionalmente, en donde el antígeno de interés es un antígeno humano de interés.
11. Un método para cribar una proteína de unión a antígeno que se une a CD3 humana y un antígeno de interés, comprendiendo el método:
a. Introducir el antígeno de interés en un ratón genéticamente modificado como se define en una de las reivindicaciones 1 y 3-6 o generado de acuerdo con el método de las reivindicaciones 7 o 9,
b. poner en contacto el ratón con una proteína de unión a antígeno, y
c. determinar si la proteína de unión a antígeno es eficaz en la activación de linfocitos T de ratón que expresan el complejo CD3 funcional.
12. El método de la reivindicación 11, en donde la etapa de introducción comprende modificar genéticamente el ratón para expresar el antígeno de interés; infectar el ratón con el antígeno de interés, llevar a cabo opcionalmente la infección vírica o bacteriana; y/o introducir en dicho ratón una célula que expresa el antígeno de interés.
13. El modelo de ratón o el método de las reivindicaciones 10 o 12, en donde la célula es una célula tumoral o una célula bacteriana.
14. El modelo de ratón o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en donde el ratón es un ratón inmunocompetente.
15. El modelo de ratón o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en donde el antígeno de interés es
(a) un antígeno asociado a tumor, que se puede seleccionar opcionalmente entre el grupo que consiste en ALK, proteínas BAGE, BIRC5 (survivina), BIRC7, CA9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, CEACAM3, CEACAM5, CLEC12A, EGFR, EGFR variante III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, EPCAM, EPHA2, EPHA3, FCRL5, FLT3, FOLR1, proteínas GAGE, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, LMP2 derivada de VEB, L1CAM, proteínas MAGE, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), OX40, PAP, PAX3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, nuevo antígeno de Thompson, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1 y WT1 humana,
(b) un antígeno de una enfermedad infecciosa, que opcionalmente puede ser un antígeno vírico, tal como VIH; hepatitis A; hepatitis B; hepatitis C; virus del herpes tal como VHS-1, Vh S-2, CMV, VHA-6, VVZ y virus de Epstein-Barr; adenovirus; virus de la gripe; flavivirus; ecovirus; rinovirus; virus coxsackie; coronavirus; virus respiratorio sincitial; virus de las paperas; rotavirus; virus del sarampión; virus de la rubeola; parvovirus; virus vaccinia; HTLV; virus del dengue; virus del papiloma; virus de molusco; poliovirus; virus de la rabia; virus JC; virus del ébola; y antígeno vírico de la encefalitis arbovírica; o
(c) un antígeno bacteriano, que opcionalmente puede ser clamidia, rickettsia, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos, gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospira, y antígeno bacteriano de la enfermedad de Lyme.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en donde la proteína de unión a antígeno es
a) un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o una proteína de unión a antígeno biespecífica, y/o
b) es capaz de reconocer una proteína CD3 de mono.
17. El método de la reivindicación 13, en donde la proteína de unión a antígeno es
a) capaz de reducir, eliminar o prevenir el crecimiento tumoral en comparación con un agente que no se dirige al antígeno de interés y en donde la etapa de determinar opcionalmente comprende un ensayo del volumen tumoral o un ensayo de destrucción de células tumorales mediado por linfocitos T, o
b) capaz de reducir, eliminar o prevenir una infección bacteriana o vírica en comparación con un agente que no se dirige al antígeno de interés y en donde la etapa de determinar opcionalmente comprende la medición de los títulos víricos o bacterianos.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462083653P | 2014-11-24 | 2014-11-24 | |
US201562106999P | 2015-01-23 | 2015-01-23 | |
PCT/US2015/062229 WO2016085889A1 (en) | 2014-11-24 | 2015-11-23 | Non-human animals expressing humanized cd3 complex |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2844000T3 true ES2844000T3 (es) | 2021-07-21 |
Family
ID=54849703
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES15808501T Active ES2844000T3 (es) | 2014-11-24 | 2015-11-23 | Animales no humanos que expresan el complejo CD3 humanizado |
ES20160251T Active ES2923775T3 (es) | 2014-11-24 | 2015-11-23 | Animales no humanos que expresan el complejo CD3 humanizado |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES20160251T Active ES2923775T3 (es) | 2014-11-24 | 2015-11-23 | Animales no humanos que expresan el complejo CD3 humanizado |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US20170164588A1 (es) |
EP (3) | EP4088572A1 (es) |
JP (5) | JP7018314B2 (es) |
KR (2) | KR102659123B1 (es) |
CN (2) | CN113016720B (es) |
AU (2) | AU2015353705C9 (es) |
BR (1) | BR112017010793A2 (es) |
CA (1) | CA2967823A1 (es) |
CY (1) | CY1123714T1 (es) |
DK (2) | DK3223605T3 (es) |
ES (2) | ES2844000T3 (es) |
HR (2) | HRP20220904T1 (es) |
HU (2) | HUE059417T2 (es) |
IL (2) | IL286414B2 (es) |
LT (2) | LT3689140T (es) |
MA (1) | MA50679A (es) |
MX (1) | MX2017006802A (es) |
PL (2) | PL3223605T3 (es) |
PT (2) | PT3689140T (es) |
RS (2) | RS63410B1 (es) |
RU (2) | RU2020122439A (es) |
SG (1) | SG11201703800PA (es) |
SI (2) | SI3223605T1 (es) |
SM (2) | SMT202100181T1 (es) |
WO (1) | WO2016085889A1 (es) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK3223605T3 (da) * | 2014-11-24 | 2020-11-16 | Regeneron Pharma | Ikke-humane dyr, der eksprimerer humaniseret cd3-kompleks |
KR102313073B1 (ko) | 2014-12-05 | 2021-10-18 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 분화 클러스터 47 유전자를 가진 비인간 동물 |
BR112017011982A2 (pt) | 2014-12-09 | 2018-01-16 | Regeneron Pharma | roedor, polipeptídeo pd-l1, célula ou tecido isolado de roedor, célula-tronco embrionária de roedor, embrião de roedor, e, métodos para produção de um roedor, para reduzir o crescimento do tumor em um roedor, para matar células tumorais em um roedor, para avaliar as propriedades farmacocinéticas de um fármaco e para avaliar a eficácia de um fármaco. |
EP3320773B9 (en) * | 2015-07-10 | 2023-10-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Mouse having human cd3 gene substituted for endogenous cd3 gene |
LT3376857T (lt) | 2015-11-20 | 2021-06-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Gyvūnai, ne žmonės, turintys humanizuotą limfocitų aktyvavimo geną |
ES2886958T3 (es) | 2016-02-29 | 2021-12-21 | Regeneron Pharma | Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado |
WO2018038046A1 (ja) | 2016-08-22 | 2018-03-01 | 中外製薬株式会社 | ヒトgpc3ポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物 |
EP3644722B1 (en) * | 2017-06-27 | 2024-12-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodents comprising a humanized asgr1 locus |
CN111386039B (zh) | 2017-09-29 | 2023-02-28 | 瑞泽恩制药公司 | 经基因修饰的啮齿动物基因组 |
AU2018375796B2 (en) | 2017-11-30 | 2024-11-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized TRKB locus |
WO2019114768A1 (en) | 2017-12-12 | 2019-06-20 | Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. | GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC CD3e |
WO2019190990A1 (en) | 2018-03-26 | 2019-10-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized rodents for testing therapeutic agents |
US10463029B1 (en) * | 2018-06-07 | 2019-11-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of steel syndrome |
ES2983967T3 (es) | 2018-07-16 | 2024-10-28 | Regeneron Pharma | Modelos de roedores de enfermedad DITRA y usos de estos |
CN109355309B (zh) * | 2018-10-18 | 2021-02-05 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种cd3e基因修饰人源化动物模型的构建方法 |
CN112300265B (zh) * | 2019-07-29 | 2022-09-27 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | Il33基因人源化的非人动物的构建方法和应用 |
WO2021197448A1 (en) * | 2020-04-01 | 2021-10-07 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd38 |
EP4139347A4 (en) * | 2020-04-24 | 2024-06-05 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | ANTI-CD3 ANTIBODIES AND USES THEREOF |
WO2022099032A1 (en) * | 2020-11-06 | 2022-05-12 | Bioventures, Llc | T cells and bifunctional protein against human papillomavirus |
CN112458117B (zh) * | 2021-02-02 | 2021-05-04 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | Cd155基因人源化的非人动物的构建方法及应用 |
CN114621971A (zh) * | 2021-02-19 | 2022-06-14 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 经遗传修饰的非人动物及其构建方法和应用 |
WO2024173830A2 (en) | 2023-02-17 | 2024-08-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Induced nk cells responsive to cd3/taa bispecific antibodies |
Family Cites Families (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0517895B1 (en) * | 1990-12-14 | 1996-11-20 | Cell Genesys, Inc. | Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
FR2827302B1 (fr) * | 2001-07-13 | 2003-10-10 | Genoway | Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations |
CA2474486C (en) | 2002-01-23 | 2013-05-14 | The University Of Utah Research Foundation | Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases |
EP1344824A1 (en) * | 2002-03-11 | 2003-09-17 | Institut de la Santé et de la Recherche Médicale | Mutated gene coding for a LAT protein and the biological applications thereof |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
UA94211C2 (ru) * | 2004-06-03 | 2011-04-26 | Новиммюн С.А. | Выделенное полностью человеческое моноклональное cd3 антитело |
SI1802193T1 (sl) | 2004-10-19 | 2014-08-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Postopek za generiranje miši, homozigotne za genetsko modifikacijo |
WO2008119565A2 (en) * | 2007-04-03 | 2008-10-09 | Micromet Ag | Cross-species-specific binding domain |
MX2009010611A (es) * | 2007-04-03 | 2010-03-26 | Micromet Ag | Enlazadores biespecificos, especificos para especies. |
FI2155783T4 (fi) | 2007-04-03 | 2022-12-15 | Lajien välisesti spesifinen cd3-epsilon-sitoutumisdomeeni | |
US8632768B2 (en) * | 2008-05-30 | 2014-01-21 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Human facilitating cells |
RU2547600C2 (ru) * | 2008-10-01 | 2015-04-10 | Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх | Pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, эндосиалинxcd3, epcamxcd3, igf-1rxcd3 или fap-альфаxcd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью |
EP2389443B1 (en) * | 2009-01-23 | 2018-11-14 | Roger Williams Hospital | Retroviral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same |
RU2425880C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Способ получения трансгенных мышей |
US20120117671A1 (en) | 2009-07-31 | 2012-05-10 | Hiroyuki Yoneyama | Steatohepatitis-liver cancer model animal |
US8883496B2 (en) * | 2009-12-21 | 2014-11-11 | Regeneron Phamaceuticals, Inc. | Humanized FcgR mice |
US20110165161A1 (en) * | 2009-12-23 | 2011-07-07 | Shih-Yao Lin | Anti-epcam antibodies that induce apoptosis of cancer cells and methods using same |
EP4052572A1 (en) | 2011-10-28 | 2022-09-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice expressing chimeric major histocompatibility complex (mhc) ii molecules |
KR102234632B1 (ko) | 2011-10-28 | 2021-04-02 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 사람화된 il-6 및 il-6 수용체 |
MY178723A (en) | 2011-10-28 | 2020-10-20 | Regeneron Pharma | Genetically modified major histocompatibility complex mice |
ES2858978T3 (es) * | 2011-10-28 | 2021-09-30 | Regeneron Pharma | Ratones con receptores de linfocitos T genéticamente modificados |
WO2014028776A1 (en) * | 2012-08-15 | 2014-02-20 | Zyngenia, Inc. | Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof |
CA2882684A1 (en) * | 2012-08-21 | 2014-02-27 | Glaxo Group Limited | Compositions comprising a single variable domain and camostat mesylate (cm) |
EP2896291B1 (en) | 2012-09-13 | 2019-03-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Gene knock-in non-human animal |
JOP20200236A1 (ar) | 2012-09-21 | 2017-06-16 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها |
RU2015117393A (ru) * | 2012-10-08 | 2016-12-10 | Роше Гликарт Аг | Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения |
PT2914102T (pt) | 2012-11-05 | 2018-01-15 | Univ Yale | Animais não-humanos geneticamente modificados e métodos de utilização dos mesmos |
TWI682941B (zh) | 2013-02-01 | 2020-01-21 | 美商再生元醫藥公司 | 含嵌合恆定區之抗體 |
CN105164153B (zh) | 2013-02-20 | 2020-04-24 | 瑞泽恩制药公司 | 人源化的t细胞共受体的小鼠 |
SI2958937T1 (sl) | 2013-02-22 | 2018-12-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Miš, ki izraža humanizirani poglavitni histokompatibilnostni kompleks |
US20150342163A1 (en) | 2013-02-22 | 2015-12-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex mice |
CN103509122B (zh) * | 2013-09-23 | 2015-04-15 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种cd3抗原及其制备方法和用途 |
CN108441497B (zh) | 2013-09-23 | 2021-10-29 | 瑞泽恩制药公司 | 具有人源化信号调节蛋白基因的非人动物 |
JP6505689B2 (ja) | 2013-11-19 | 2019-04-24 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | ヒト化b細胞活性化因子遺伝子を有する非ヒト動物 |
TWI754319B (zh) | 2014-03-19 | 2022-02-01 | 美商再生元醫藥公司 | 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物 |
SG11201604886WA (en) | 2014-04-08 | 2016-07-28 | Regeneron Pharma | Non-human animals having humanized fc-gamma receptors |
NO2785538T3 (es) | 2014-05-07 | 2018-08-04 | ||
EP3145307B1 (en) | 2014-05-19 | 2019-02-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified non-human animals expressing human epo |
EP3683238A1 (en) | 2014-06-19 | 2020-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized programmed cell death 1 gene |
DK3223605T3 (da) | 2014-11-24 | 2020-11-16 | Regeneron Pharma | Ikke-humane dyr, der eksprimerer humaniseret cd3-kompleks |
-
2015
- 2015-11-23 DK DK15808501.9T patent/DK3223605T3/da active
- 2015-11-23 MX MX2017006802A patent/MX2017006802A/es unknown
- 2015-11-23 US US14/949,834 patent/US20170164588A1/en not_active Abandoned
- 2015-11-23 RU RU2020122439A patent/RU2020122439A/ru unknown
- 2015-11-23 IL IL286414A patent/IL286414B2/en unknown
- 2015-11-23 HR HRP20220904TT patent/HRP20220904T1/hr unknown
- 2015-11-23 RS RS20220700A patent/RS63410B1/sr unknown
- 2015-11-23 SI SI201531467T patent/SI3223605T1/sl unknown
- 2015-11-23 ES ES15808501T patent/ES2844000T3/es active Active
- 2015-11-23 PL PL15808501T patent/PL3223605T3/pl unknown
- 2015-11-23 MA MA050679A patent/MA50679A/fr unknown
- 2015-11-23 EP EP22172593.0A patent/EP4088572A1/en active Pending
- 2015-11-23 BR BR112017010793A patent/BR112017010793A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-11-23 RU RU2017122038A patent/RU2726446C2/ru active
- 2015-11-23 ES ES20160251T patent/ES2923775T3/es active Active
- 2015-11-23 SM SM20210181T patent/SMT202100181T1/it unknown
- 2015-11-23 HU HUE20160251A patent/HUE059417T2/hu unknown
- 2015-11-23 AU AU2015353705A patent/AU2015353705C9/en active Active
- 2015-11-23 CN CN202110123143.1A patent/CN113016720B/zh active Active
- 2015-11-23 CN CN201580063680.4A patent/CN107105633B/zh active Active
- 2015-11-23 EP EP15808501.9A patent/EP3223605B9/en active Active
- 2015-11-23 LT LTEP20160251.3T patent/LT3689140T/lt unknown
- 2015-11-23 DK DK20160251.3T patent/DK3689140T3/da active
- 2015-11-23 PT PT201602513T patent/PT3689140T/pt unknown
- 2015-11-23 JP JP2017527713A patent/JP7018314B2/ja active Active
- 2015-11-23 HU HUE15808501A patent/HUE052603T2/hu unknown
- 2015-11-23 SI SI201531868T patent/SI3689140T1/sl unknown
- 2015-11-23 PL PL20160251.3T patent/PL3689140T3/pl unknown
- 2015-11-23 SM SM20220438T patent/SMT202200438T1/it unknown
- 2015-11-23 KR KR1020177013951A patent/KR102659123B1/ko active IP Right Grant
- 2015-11-23 KR KR1020247012549A patent/KR20240055876A/ko active Search and Examination
- 2015-11-23 SG SG11201703800PA patent/SG11201703800PA/en unknown
- 2015-11-23 WO PCT/US2015/062229 patent/WO2016085889A1/en active Application Filing
- 2015-11-23 PT PT158085019T patent/PT3223605T/pt unknown
- 2015-11-23 RS RS20201402A patent/RS61080B1/sr unknown
- 2015-11-23 LT LTEP15808501.9T patent/LT3223605T/lt unknown
- 2015-11-23 CA CA2967823A patent/CA2967823A1/en active Pending
- 2015-11-23 EP EP20160251.3A patent/EP3689140B1/en active Active
-
2017
- 2017-05-10 IL IL252202A patent/IL252202B/en unknown
-
2020
- 2020-05-11 US US16/872,226 patent/US10932455B2/en active Active
- 2020-12-03 JP JP2020200811A patent/JP7269214B2/ja active Active
- 2020-12-03 HR HRP20201938TT patent/HRP20201938T1/hr unknown
- 2020-12-10 US US17/118,241 patent/US11937587B2/en active Active
- 2020-12-29 CY CY20201101221T patent/CY1123714T1/el unknown
-
2022
- 2022-03-08 JP JP2022035102A patent/JP7524240B2/ja active Active
- 2022-04-20 AU AU2022202578A patent/AU2022202578A1/en active Pending
-
2023
- 2023-06-01 JP JP2023090885A patent/JP7591094B2/ja active Active
-
2024
- 2024-02-15 US US18/442,444 patent/US20240306616A1/en active Pending
- 2024-07-01 JP JP2024106288A patent/JP2024114974A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2844000T3 (es) | Animales no humanos que expresan el complejo CD3 humanizado | |
ES2849349T3 (es) | Anticuerpos de cadena ligera modificados mediante ingeniería con histidina y roedores modificados genéticamente para la generación de los mismos | |
DK2840892T3 (en) | Non-human animals with modified heavy chain immunoglobulin sequences | |
ES2738679T3 (es) | Anticuerpos de cadena ligera diseñados genéticamente con histidina y animales no humanos modificados genéticamente para generar los mismos | |
US20240423176A1 (en) | Full-length human ace2 mouse model susceptible to emerging coronaviruses |