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ES2833773T3 - Proteínas de fusión que se unen a DR5 multivalentes y multiespecíficas - Google Patents

Proteínas de fusión que se unen a DR5 multivalentes y multiespecíficas Download PDF

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ES2833773T3
ES2833773T3 ES16825315T ES16825315T ES2833773T3 ES 2833773 T3 ES2833773 T3 ES 2833773T3 ES 16825315 T ES16825315 T ES 16825315T ES 16825315 T ES16825315 T ES 16825315T ES 2833773 T3 ES2833773 T3 ES 2833773T3
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amino acid
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dr5bd
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Kyle S Jones
Amir S Razai
Abrahim Hussain
Katelyn M Willis
Quinn Deveraux
Brendan P Eckelman
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Abstract

Un polipéptido aislado que se une al menos al receptor de muerte 5 (DR5) y comprende una pluralidad de dominios de unión a DR5 (DR5BD), en donde cada DR5BD es un VHH, en donde cada VHH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 87, 89 y 17-20.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión que se unen a DR5 multivalentes y multiespecíficas
Campo
La divulgación se refiere generalmente a moléculas que se acoplan específicamente con el receptor de muerte 5 (DR5), un miembro de la superfamilia de los receptores de TNF (TNFRSF). Más específicamente, la divulgación se refiere a moléculas multivalentes y multiespecíficas que se unen al menos a DR5.
Antecedentes
La superfamilia de los receptores del factor de necrosis tumoral consiste en diversos receptores de la superficie celular estructuralmente relacionados. La activación mediante ligandos multiméricos es una característica común de muchos de estos receptores. Muchos miembros del TNFRSF tienen utilidad terapéutica en numerosas patologías, si se activan apropiadamente. Lo más importante es que para agonizar apropiadamente esta familia de receptores a menudo se requiere un agrupamiento de mayor orden y los anticuerpos bivalentes convencionales no son ideales para ello. Por lo tanto, existe una necesidad terapéutica de moléculas agonistas más potentes de TNFRSF.
Sumario
La presente invención es como se define en las reivindicaciones. Este y otros aspectos de la presente divulgación se entenderán mejor por referencia a la siguiente descripción.
La divulgación proporciona polipéptidos de fusión multivalentes que se unen al menos al receptor de muerte 5 (DR5, también conocido como receptor TRAIL 2 (TRAILR2), o miembro de la superfamilia de los receptores del factor de necrosis tumoral 10B (TNFRSF10B)). Estos polipéptidos de fusión de unión a DR5 también se refieren en el presente documento como moléculas dirigidas a DR5. d R5 es un miembro de la superfamilia de los receptores de TNF (TNFRSF) y un receptor de la superficie celular de la superfamilia de los receptores de TNF que se une al ligando que induce apoptosis relacionada con TNF (TRAIL). TRAIL evolucionó para desempeñar funciones fundamentales en el desarrollo de mamíferos y defensa del huésped erradicando selectivamente las células no deseadas, infectadas y malignas de poblaciones celulares sanas. Al unirse a los miembros de la familia de receptores de TNF DR4 o DR5, TRAIL induce la muerte celular mediante apoptosis dependiente de caspasa. DR5 parece ser el receptor principal en las células tumorales que facilita la actividad influenciada por tumor observada de la vía TRAIL. DR5 se activa mediante el ligando natural TRAIL, que lleva tres receptores DR5 a gran proximidad, activando así la caspasa-8 intracelular e iniciando la activación de otras caspasas que inducen la muerte, tales como caspasas-9 y caspasas-3. Por tanto, el inicio de esta vía de muerte celular requiere el agrupamiento de receptores DR5 para una muerte celular eficaz.
Los anticuerpos convencionales dirigidos a miembros de la superfamilia de los receptores de TNF (TNFRSF) han demostrado que requieren reticulación exógena para lograr actividad agonista suficiente, según lo evidenciado por la necesidad de receptor Fc-gamma (FcyRs) para los anticuerpos de actividad para DR4, DR5, GITR y OX40 (Ichikawa et al 2001 al Nat. Med. 7, 954-960, Li et al 2008 Drug Dev. Res. 69, 69-82; Pukac et al 2005 Br. J. Cancer 92, 1430­ 1441; Yanda et al 2008 Ann. Oncol. 19, 1060-1067; Yang et al 2007 Cancer Lett. 251:146-157; Bulliard et al 2013 JEM 210(9): 1685; Bulliard et al 2014 Immunol and Cell Biol 92: 475-480). Además de la reticulación mediante FcyRs, otros agentes exógenos que incluyen la adición del ligando oligomérico o las entidades de unión al anticuerpo (p. ej., proteína A y anticuerpos secundarios) han demostrado que potencian el agrupamiento de anticuerpos anti-TNFRSF y la señalización corriente abajo. Por ejemplo, la actividad agonista in vitro del anticuerpo CD137, PF-05082566, requiere reticulación mediante un anticuerpo secundario (Fisher et al Cancer Immunol Immunother 201261:1721-1733). Estos hallazgos sugieren la necesidad de un agrupamiento de TNFRSF más allá de un dímero.
Los esfuerzos por explotar clínicamente la vía TRAIL para la terapia contra el cáncer dependían de una versión recombinante del ligando natural TRAIL y anticuerpos específicos para DR5. Los agonistas de anticuerpos dirigidos a DR5 requerían un agente de reticulación en experimentos in vitro preclínicos. Por ejemplo, la adición del ligando DR5 TRAIL potenció la capacidad de inducción de apoptosis de un anticuerpo anti-DR5, AMG655 (Graves et a l2014 Cancer Cell 26: 177-189). Los anticuerpos convencionales son bivalentes y capaces de agrupar solo dos receptores DR5 (uno por cada brazo FAB). Acorde con otros miembros de TNFRSF, el agrupamiento de dos receptores DR5 no es suficiente para mediar la señalización y activar la vía de muerte celular in vitro. Sorprendentemente, la administración in vivo de anticuerpos dirigidos a DR5 en modelos de ratón preclínicos de cánceres humanos demostró actividad significativa en una amplia variedad de tipos tumorales. Más tarde se demostró que esta actividad dependía de receptores FcgammaR (FcyR) de ratón. Los estudios clínicos en humanos no pudieron reproducir las respuestas potentes observadas en estos modelos de ratón preclínicos. Se plantea la hipótesis de que la falta de actividad en humanos se debe a una reticulación de anticuerpos insuficiente. Esto puede deberse a diferencias en IgG en suero, FcyR y o concentraciones de TRAIL entre ratones inmunodeficientes y pacientes humanos con cáncer.
La presente divulgación proporciona proteínas de fusión multivalentes que se dirigen a DR5 que son capaces de agonizar fuertemente la señalización de DR5 que media la muerte celular directa. Las proteínas de fusión de la presente divulgación pueden ser bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes o hexavalentes. De manera importante, las proteínas de fusión de la presente divulgación son capaces de provocar apoptosis de células que expresan DR5 de manera independiente de agentes de reticulación exógenos.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación incorporan un dominio de unión (DR5BD) que se une a DR5. En realizaciones preferidas, el DR5BD que se une a DR5 no se une a DR4, señuelo R1, señuelo R2, osteopontina, o cualquier otro miembro de TNFRSF. En realizaciones preferidas, el DR5BD que se une a DR5 se une a DR5 de humano y de mono cangrejero. En algunas realizaciones, el DR5BD que se une a DR5 bloquea la interacción de DR5 y su ligando TRAIL. En otras realizaciones, el DR5BD que se une a DR5 no bloquea la interacción de DR5 y su ligando TRAIL. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación incorpora múltiples DR5BD que se unen a DR5 que reconocen epítopos distintos en DR5. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación incorpora múltiples DR5BD que se unen a DR5, en donde algunos DR5BD bloquean la interacción entre DR5-TRAIL y otros no bloquean la interacción entre DR5-TRAIL. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 de la presente divulgación inducen la muerte celular directa de células tumorales. Las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 de la presente divulgación tienen utilidad en el tratamiento de tumores tanto de naturaleza hematológica como sólida.
La presente divulgación proporciona proteínas de fusión que se unen a DR5 multivalentes, que comprenden 2 o más dominios de unión a DR5 (DR5BD). En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación tienen utilidad en el tratamiento de neoplasias. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación se unen a DR5 expresado en una célula tumoral. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene dos o más DR5BD diferentes, donde cada DR5BD se une a DR5. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene múltiples copias de un DR5BD que se une a DR5. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene al menos dos copias de un DR5BD que se une a DR5. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene al menos tres copias de un DR5BD que se une a DR5. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene al menos cuatro copias de un DR5BD que se une a DR5. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene al menos cinco copias de un DR5BD que se une a DR5. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene al menos seis copias de un DR5BD que se une a DR5. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene seis o más copias de un DR5BD que se une a DR5.
Las proteínas de fusión que se unen a DR5 multivalentes de la presente divulgación son capaces de inducir la muerte celular directa de células dañadas, transformadas, infectadas con virus o neoplásicas sin la necesidad de agentes de reticulación exógenos. Asimismo, las proteínas de fusión que se unen a DR5 de la presente divulgación no inducen la muerte celular directa de células normales, no transformadas, no infectadas con virus o no neoplásicas. De manera importante, los DR5BD y las proteínas de fusión compuestas por los mismos de la presente divulgación han reducido o eliminado el reconocimiento mediante anticuerpos preexistentes dirigidos hacia anticuerpos de dominio simple presentes en algunos sujetos humanos.
TAS266 es un agente terapéutico a base de nanocuerpos que se dirigen a DR5 humanizado tetravalente, que muestra una capacidad superior de inducción de apoptosis en comparación con los anticuerpos bivalentes, sin la necesidad de reticulación adicional mediante FcyRs. (Huet, H.A., et al., Multivalent nanobodies targeting death receptor 5 elicit superior tumor cell killing through efficient caspase induction. mAbs Vol. 6, Iss. 6, 2014).
Se había previsto con anterioridad que aproximadamente la mitad de los sujetos humanos sanos tienen anticuerpos preexistentes que reconocen anticuerpos de dominio simple humanos, conocidos como autoanticuerpos anti-VH humanos (HAVH), que se dirigen a un epítopo dentro de los dominios VH humanos (Holland et al. J Clin Immunol (2013) 33: 1192-1203)). Por tanto, Se espera que los VHH derivados de camélidos humanizados también sean reconocidos por los autoanticuerpos HAVH ya que el epítopo diana parece ser críptico y estar ubicado dentro de las regiones marco conservadas de línea germinal humana. La interacción de autoanticuerpos HAVH (también denominados anticuerpos anti-fármaco (ADA) o anticuerpos anti-dominio simple (ASDA) en el presente documento) puede provocar un mayor agrupamiento y activación. De acuerdo con esta hipótesis, en un ensayo clínico en Fase I, la administración de TAS266 indujo niveles de AST y ALT elevados indicativos de hepatotoxicidad. Se produjeron niveles enzimáticos elevados en 3 de 4 pacientes, lo que conllevó a la finalización del ensayo con TAS266. Se indicó que los 3 pacientes que presentaron manifestaciones clínicas de hepatotoxicidad tenían ADA reexistente, lo que hizo sospechar a los investigadores del ensayo que ADA indujo el hiperagrupamiento del receptor DR5 provocando toxicidad. Se indicó que el paciente sin a Da no tuvo síntomas de toxicidad (Isaacs R, Bilic S, Kentsch K, Huet HA, Hofmann M, Rasco D, Kundamal N, Tang Z, Cooksey J, Mahipal A. Unexpected hepatotoxicity in a phase I study of TAS266, a novel tetravalent agonistic Nanobody® targeting the DR5 receptor. Papadopoulos KP1, Cancer Chemother Pharmacol. mayo de 2015;75(5):887-95. doi: 10.1007/s00280-015-2712-0. Epub 27 febrero de 2015). En respaldo de esta idea, se ha documentado adecuadamente que las formas agregadas de agonistas de DR5 inducen hepatotoxicidad mientras que las formas no agregadas no lo hacen (J Lemke, S von Karstedt, J Zinngrebe y H Walczak. Getting TRAIL back on track for cancer therapy. Cell Death and Differentiation (2014) 21, 1350-1364).
El documento WO 2011/098520 A1 se refiere a "polipéptidos que se unen a DR5 agonistas" que incluyen un nanocuerpo de DR5 tetravalente, TAS266.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene al menos un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene dos o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene tres o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene cuatro o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene cinco o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15. 91. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene seis o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene al menos un DR5BD que comprende una región determinante de complementariedad 1 (CDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181 y 188; una región determinante de complementariedad 2 (CDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene dos o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134. 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene tres o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131­ 133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene cuatro o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una c DR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene cinco o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189, y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene seis o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene al menos un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91 y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene dos o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91 y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene tres o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91 y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene cuatro o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91 y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene cinco o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91 y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene seis o más copias de un DR5BD que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91 y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene al menos un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181 y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190; y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene dos o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190; y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene tres o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190; y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene cuatro o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190; y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene cinco o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161, 165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190; y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127. En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene seis o más copias de un DR5BD que comprende una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 31, 128, 134, 138, 141, 142, 159, 162, 163, 168, 173, 176, 178, 181, y 188; una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 28, 129, 131-133, 135, 137, 139, 143, 160, 164, 166, 167, 169, 171, 172, 174, 177, 179, 182, 184, 185, y 189; y una CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 130, 136, 140, 144-158, 161,165, 170, 175, 180, 183, 186, 187, y 190; y al menos un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 92-124. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 92-118. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 119­ 124.
Las proteínas de fusión de la presente divulgación son capaces de proporcionar un mayor agrupamiento de miembros de TNFRSF en comparación con los anticuerpos bivalentes no reticulados. El mayor agrupamiento de miembros de TNFRSF mediados por las proteínas de fusión de la presente divulgación induce una mayor señalización dependiente de TNFRSF en comparación con los anticuerpos bivalentes no reticulados. En la mayoría de las realizaciones, la proteína de fusión incorporará más de 2 DR5BD, por ejemplo, tres, cuatro, cinco o seis. En algunas realizaciones, la proteína de fusión incorporará DR5BD y un dominio de unión dirigido hacia un antígeno miembro no TNFRSF. En estas realizaciones, la interacción del antígeno no TNFRSF es capaz de proporcionar la función de reticulación adicional y se logra la activación de TNFRSF con solo uno o dos DR5BD. En estas realizaciones, la proteína de fusión es multiespecífica, con unión a dos antígenos distintos. En otras realizaciones, la proteína de fusión incorpora tres o más DR5BD y un dominio de unión dirigido hacia un antígeno distinto de DR5, donde la interacción con esta dosis de antígeno adicional no potencia el agrupamiento de DR5 más allá de lo que se logra con la porción que contiene DR5BD solo, pero en su lugar proporciona una ventaja de biodistribución, enfocando la actividad agonista de DR5 de la proteína de fusión en un sitio específico dentro de un sujeto. Por ejemplo, una proteína de fusión que se une a DR5 tetravalente de la presente divulgación puede incluir un dominio de unión al antígeno adicional que enfoca la actividad en un sitio específico, pero no potencia la actividad agonista más allá de lo que se logra con una proteína de fusión que se une a DR5 tetravalente que carece de este dominio de unión al antígeno adicional.
En algunas realizaciones, los DR5BD de la presente divulgación se derivan de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que incluyen scFv, Fabs, anticuerpos de dominio único (sdAb), Vnar, o VHHs. En realizaciones preferidas, los DR5BD son sdAb humanos o humanizados. Los fragmentos sdAb, pueden derivarse de VHH, Vnar, dominios VH o VK modificados. Los VHH pueden ser generados a partir de anticuerpos solo de cadena pesada de camélidos. Los Vnar pueden ser generados a partir de anticuerpos solo de cadena pesada de peces cartilaginosos. Se han implementado varios métodos para generar sdAb monoméricos a partir de dominios VH y VK convencionalmente heterodiméricos, que incluyen ingeniería de interfaz y selección de familias de línea germinal específicas. En otras realizaciones, los DR5BD se derivan de proteínas de andamio no anticuerpo, por ejemplo, pero no se limitan a, proteínas de repetición de anquirina diseñadas (darpins), avímero, anticalina/lipocalinas, centirinas y finómeros.
Generalmente, las proteínas de fusión de la presente divulgación consisten en al menos dos o más DR5BD vinculados operativamente mediante un polipéptido enlazador. La utilización de fragmentos sdAb como el DR5BD específico dentro de la fusión, la presente divulgación tiene el beneficio de evitar el problema de mal apareamiento de cadena pesada:cadena ligera común en muchos enfoques de anticuerpos bi/multiespecíficos. Asimismo, las proteínas de fusión de la presente divulgación evitan el uso de enlazadores largos necesarios para muchos anticuerpos biespecíficos.
En algunas realizaciones, todos los DR5BD de la proteína de fusión reconocen el mismo epítopo en DR5. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la presente divulgación pueden incorporar 2, 3, 4, 5 o 6 DR5BD con especificidades de reconocimiento distintas hacia varios epítopos en DR5. En estas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación que contienen múltiples DR5BD que se dirigen a distintas regiones de DR5. En algunas realizaciones, los DR5BD pueden reconocer diferentes epítopos en DR5 o reconocer epítopos en DR5 y un antígeno distinto. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona proteínas de fusión multiespecíficas que incorporan DR5BD que se unen a DR5 y al menos a un segundo antígeno.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación está compuesta por un único polipéptido. En otras realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación está compuesta por más de un polipéptido. Por ejemplo, en donde se incorpora un dominio de heterodimerización en la proteína de fusión para construir una proteína de fusión asimétrica. Por ejemplo, si se incorpora una región Fc de inmunoglobulina en la proteína de fusión, el dominio CH3 se puede utilizar como dominio de homodimerización, o la región de interfaz de dímero CH3 puede mutarse para permitir la heterodimerización.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene los extremos opuestos de DR5BD. Por ejemplo, los DR5BD se ubican tanto en la porción del extremo amino-terminal (extremo N-terminal) de la proteína de fusión como la porción de extremo carboxi-terminal (extremo C-terminal) de la proteína de fusión. En otras realizaciones, todos los DR5BD residen en el mismo extremo de la proteína de fusión. Por ejemplo, los DR5BD residen en las porciones de extremo amino- o carboxilo-terminal de la proteína de fusión.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene una región Fc de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina es un isotipo IgG seleccionado entre el grupo que consiste en subclases de isotipo IgG1, isotipo IgG2, isotipo IgG3 e isotipo IgG4.
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la misma es un isotipo IgG. Por ejemplo, la región Fc de inmunoglobulina de la proteína de fusión es de isotipo IgG1 humana, que tiene una secuencia de aminoácidos:
p ap e |l l ]g¡gps VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TC WVDVSHE DPEVKFNWYV
DGVEVHNAKT KPR.EEQY0ST YRVvSVLTVI, HQDWLNGKEY KCKVSNKA.LP
APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
ENESNGQPEN NYKTT PPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRNQQ GNVFSCSVMH
EALHNHYTQK SLSLSPGK ( i ■EQ ID NO: I )
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la misma comprende una secuencia de polipéptidos de IgG1 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG1 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, numeración de Kabat) para evitar la glicosilación de la proteína de fusión, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se modifica en el aminoácido Leu235 (con recuadro, numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor Fc, p. ej., Leu235Glu (L235E) o Leu235Ala (L235A). En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se modifica en el aminoácido Leu234 (con recuadro, numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor Fc, p. ej., Leu234Ala (L234A). En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se altera en ambos aminoácidos 234 y 235, p. ej., Leu234Ala y Leu235Ala (L234A/L235A) o Leu234Val y Leu235Ala (L234V/L235A). En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se altera en Gly235 para reducir la unión del receptor Fc. Por ejemplo, en donde Gly235 se elimina de la proteína de fusión. En algunas realizaciones, la región Fc de IgG1 humana se modifica en el aminoácido Gly236 para potenciar la interacción con CD32A, p. ej., Gly236Ala (G236A). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG1 humana carece de Lys447 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se altera en una o más de las siguientes posiciones para reducir la unión del receptor Fc: Leu 234 (L234), Leu235 (L235), Asp265 (D265), Asp270 (D270), Ser298 (S298), Asn297 (N297), Asn325 (N325) o Ala327 (A327). Por ejemplo, Leu 234Ala (L234A), Leu235Ala (L235A), Asp265Asn (D265N), Asp270Asn (D270N), Ser298Asn (S298N), Asn297Ala (N297A), Asn325Glu (N325E) o Ala327Ser (A327S). En realizaciones preferidas, las modificaciones dentro de la región Fc reducen la unión a receptores Fc-receptores gamma, mientras que tienen un impacto mínimo en la unión al receptor Fc neonatal (FcRn).
En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión carece de un aminoácido en una o más de las siguientes posiciones para reducir la unión del receptor Fc: Glu233 (E233), Leu234 (L234), o Leu235 (L235). En estas realizaciones, la eliminación de Fc de estos tres aminoácidos reduce la unión de la proteína de complemento C1q.
PAPGGPSVFL FPPKPKDTLM IS R TP EVTC V W DVSHEDPE VKFNWYVDGV
EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK v s ísí k a l p a p i
EKTISKAKG Q PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKG F YPSDIAVEW E
SNGQPENNYK T T P P VI, D S DG S F FL Y S KL T V DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL
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En algunas realizaciones, la proteína de fusión o un fragmento inmunológicamente activo de la misma comprende una secuencia de polipéptidos de IgG2 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %), 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la proteína de fusión es de isotipo IgG2 humana, que tiene una secuencia de aminoácidos:
PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQF@STF RWSVLTWH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 3}
En algunas realizaciones, la proteína de fusión o un fragmento inmunológicamente activo de la misma comprende una secuencia de polipéptidos de IgG2 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG2 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, para evitar la glicosilación del anticuerpo, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG2 humana carece de Lys447 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la proteína de fusión es de isotipo IgG3 humana, que tiene una secuencia de aminoácidos:
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDV SHE DPEVQFKWYV
DGVEVHNAKT KPREEQYjÑjST FRWSVLTVL HQDWLNCíKEY KCKVSNKALP
APIEKTISKT KGQPREPQVY TL PPSREEMT KNQVSLT‘CLV KGFYPSDIAV
EWESSGQPEN NYNTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSF-WQQ GNIFSCSVMH
C AL®■]@FTQK 3LSLSPGK (SEQ ID NO: 4;
En algunas realizaciones, el anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia de polipéptidos de IgG3 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG3 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG3 humana se modifica en el aminoácido 435 para extender la semivida, p. ej., Arg435His (R435H). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG3 humana carece de Lys447 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la proteína de fusión es de isotipo IgG4 humana, que tiene una secuencia de aminoácidos:
Figure imgf000008_0006
En algunas realizaciones, el anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia de polipéptidos de IgG4 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %), 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
En algunas realizaciones, la región Fc de inmunoglobulina o un fragmento inmunológicamente activo de la proteína de fusión es de isotipo IgG4 humana, que tiene una secuencia de aminoácidos:
PAPELLGGPS
Figure imgf000008_0001
DPEVQFNWYV
DGVEVHNAKT
Figure imgf000008_0002
KCKVSNKGLP
SSIEKTISKA
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KGFYPSDIAV
EWESNGQPEN
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GNVFSCSVMH
EALHNHYTQK
Figure imgf000008_0005
En algunas realizaciones, el anticuerpo o un fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia de polipéptidos de IgG4 humana que es al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127.
En otras realizaciones, la región Fc de IgG4 humana se modifica en el aminoácido 235 para alterar las interacciones del receptor Fc, p. ej., Leu235Glu (L235E). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (con recuadro, numeración de Kabat) para evitar la glicosilación del anticuerpo, p. ej., Asn297Ala (N297A) o Asn297Asp (N297D). En algunas realizaciones, la región Fc de IgG4 humana carece de Lys447 (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana se modifica para potenciar la unión a FcRn. Los ejemplos de mutaciones de Fc que potencian la unión a FcRn son Met252Tyr, Scr254Thr, Thr256Glu (M252Y, S254t , T256E, respectivamente) (numeración de Kabat, Dall'Acqua et al 2006, J. Biol Chem Vol. 281(33) 23514-23524), Met428Leu y Asn434Ser (M428L, N434S) (Zalevsky et al 2010 Nature Biotech, Vol. 28(2) 157-159), o Met252Ile, Thr256Asp, Met428Leu (M252I, T256D, M428L, respectivamente), (EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,).
En algunas realizaciones, cuando la proteína de fusión de la divulgación incluye un polipéptido Fc, el polipéptido Fc se muta o modifica. En estas realizaciones, el polipéptido Fc mutado o modificado incluye las siguientes mutaciones: Met252Tyr y Met428Leu o Met252Tyr y Met428Val (M252Y, M428L, o M252Y, M428V) utilizando el sistema de numeración de Kabat.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana se modifica para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), p. ej., las modificaciones de aminoácidos descritas en Natsume et al., 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5: Moore et al., 2010 mAbs, 2(2): 181-189; Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields et al., 2001 JBC, 276(9): 6591-6604; Stavenhagen et al, 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; Revisado en Kaneko y Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1 ):1-11. Los ejemplos de mutaciones que potencian la ADCC incluyen la modificación en Ser239 e lle332, por ejemplo, Ser239Asp e lle332Glu (S239d , I332E). Los ejemplos de mutaciones que potencian la CDC incluyen las modificaciones en Lys326 y Glu333. En algunas realizaciones, la región Fc se modifica en una o ambas de estas posiciones, por ejemplo, Lys326Ala y/o Glu333Ala (K326A y E333A) utilizando el sistema de numeración de Kabat.
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana se modifica para inducir la heterodimerización. Por ejemplo, con una modificación de aminoácidos dentro del dominio CH3 en Thr366, que cuando se reemplaza con un aminoácido más voluminoso, p. ej., Try (T366W), es capaz de emparejarse preferentemente con un segundo dominio CH3 que tiene modificaciones de aminoácidos con aminoácidos menos voluminosos en las posiciones Thr366, Leu368 y Tyr407, p. ej., Ser, Ala y Val, respectivamente (T366S/L368A/Y407V). La heterodimerización mediante modificaciones en CH3 puede estabilizarse además por la introducción de un enlace disulfuro, por ejemplo, cambiando Ser354 por Cys (S354C) y Y349 por Cys (Y349C) en dominios CH3 opuestos (Revisado en Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15).
En algunas realizaciones, la región Fc de IgG humana se modifica para evitar la dimerización. En estas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación son monoméricas. Por ejemplo, la modificación en el residuo Thr366 por un residuo cargado, p. ej., Thr366Lys, Thr366Arg, Thr366Asp, o Thr366Glu (T366K, T366R, T366D o T366E, respectivamente), evita la dimerización CH3-CH3.
En algunas realizaciones, la región Fc de la proteína de fusión se altera en una o más de las siguientes posiciones para reducir la unión del receptor Fc: Leu 234 (L234), Leu235 (L235), Asp265 (D265), Asp270 (D270), Ser298 (S298), Asn297 (N297), Asn325 (N-325) o Ala327 (A327). Por ejemplo, Leu 234Ala (L234A), Leu235Ala. (L235A), Asp265Asn (D265N), Asp270Asn (D270N), Ser298Asn (S298N), Asn297Ala (N297A), Asn325Glu (N325E) o Ala327Ser (A327S). En realizaciones preferidas, las modificaciones dentro de la región Fc reducen la unión a receptores Fc-receptores gamma, mientras que tienen un impacto mínimo en la unión al receptor Fc neonatal (FcRn).
En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene un polipéptido derivado de una región bisagra de inmunoglobulina. La región bisagra puede seleccionarse entre cualquiera de las subclases de IgG humana. Por ejemplo, la proteína de fusión puede contener una bisagra de IgG1 modificada que tienen la secuencia de EPKSSDKTHTCPPC (SEQ ID n O: 6), donde en el Cys220 que forma un disulfuro con la cisteína de extremo C-terminal de la cadena ligera se muta en serina, p. ej., Cys220Ser (C220S). En otras realizaciones, la proteína de fusión contiene una bisagra truncada que tienen una secuencia DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 7).
En algunas realizaciones, la proteína de fusión tiene una bisagra modificada de IgG4, que se modifica para evitar o reducir el intercambio de cadena, p. ej., Ser228Pro (S228P), que tiene la secuencia ESkYg PPCPPC (SEQ ID NO: 8). En algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene polipéptidos enlazadores. En otras realizaciones, la proteína de fusión contiene polipéptidos enlazadores y bisagra.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación carecen de o tienen una cantidad reducida de fucosa unida a la cadena glicano enlazada a N en N297. Hay numerosas maneras para evitar la fucosilación, que incluyen, pero no se limitan a, la producción en una línea celular deficiente de FUT8; la adición de inhibidores al medio de cultivo celular de mamífero, por ejemplo, castanospermina; e ingeniería metabólica de la línea celular de producción.
En algunas realizaciones, el DR5BD se modifica para eliminar el reconocimiento mediante anticuerpos preexistentes encontrados en humanos. En algunas realizaciones, los anticuerpos de dominio simple de la presente divulgación se modifican mediante mutación de la posición Leu11, por ejemplo, Leu11 Glu (L11E) o Leu11Lys (L11K). En otras realizaciones, los anticuerpos de dominio simple de la presente divulgación se modifican mediante cambios en la región de extremo carboxi-terminal, por ejemplo, la secuencia de extremo consiste en GQGTLVTVKPGG (SEQ ID NO: 9) o GQGTLVTVEPGG (SEQ ID NO: 10) o una modificación de las mismas. En algunas realizaciones, los anticuerpos de dominio simple de la presente divulgación se modifican mediante mutación de la posición 11 y mediante cambios en la región de extremo carboxi-terminal.
En algunas realizaciones, los DR5BD de las proteínas de fusión de la presente divulgación se unen operativamente mediante enlazadores de aminoácidos. En algunas realizaciones, estos enlazadores están compuestos predominantemente por los aminoácidos glicina y serina, indicados como enlazadores GS en el presente documento. Los enlazadores GS de las proteínas de fusión de la presente divulgación pueden tener varias longitudes, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el enlazador GS comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en GGSGGS, es decir, (GGS)2 (SEQ ID NO: 11); GGSGGSGGS, es decir, (GGS)3 (SEQ ID NO: 12); GGSGGSGGSGGS, es decir, (GGS)4 (SEQ ID NO: 13); y GGSGGSGGSGGSGGS, es decir, (GGS)5 (SEQ ID NO: 14).
En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a TINFRSF multivalente es tetravalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a TNFRSF tetravalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano que se une al menos a DR5.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a TINFRSF multivalente es tetravalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a TNFRSF tetravalente tiene la siguiente estructura: DR5BD-enlazador-DR5BD-enlazador-bisagra-Fc, donde el DR5BD es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a TNFRSF multivalente es hexavalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a TNFRSF hexavalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano que se une al menos a DR5.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a TNFRSF multivalente es hexavalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a TNFRSF hexavalente tiene la siguiente estructura: DR5BD-enlazador-DR5BD-enlazador-DR5BD-enlazador-bisagra-Fc, donde el DR5BD es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión multivalentes que se dirigen a DR5 de la presente divulgación se unen operativamente mediante enlazadores de aminoácidos. En algunas realizaciones, estos enlazadores están compuestos predominantemente por los aminoácidos glicina y serina, indicados como enlazadores GS en el presente documento. Los enlazadores GS de las proteínas de fusión de la presente divulgación pueden tener varias longitudes, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, el enlazador GS comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en GGSGGS, es decir, (GGS)2 (SEQ ID NO: 11); GGSGGSGGS, es decir, (GGS)3 (SEQ ID NO: 12); GGSGGSGGSGGS, es decir, (GGS)4 (SEQ ID NO: 13); y GGSGGSGGSGGSGGS, es decir, (GGS)5 (SEQ ID NO: 14).
En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a DR5 multivalente es tetravalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a DR5 tetravalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano. En algunas realizaciones, la secuencia de VHH se selecciona entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a DR5 tetravalente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 92-118.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a DR5 multivalente es hexavalente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a DR5 hexavalente tiene la siguiente estructura: VHH-enlazador-VHH-enlazador-VHH-enlazador-bisagra-Fc, donde el VHH es una secuencia de VHH humanizado o completamente humano. En algunas realizaciones, la secuencia de VHH se selecciona entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-91. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que se une a DR5 hexavalente comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 119-124.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un diagrama esquemático de proteínas de fusión multivalentes y multiespecíficas a modo de ejemplo de la presente divulgación.
Las Figuras 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F y 2G son una serie de gráficas que demuestran la unión de VHH de DR5 representativas o variantes humanizadas de las mismas a DR5 humano (Figuras 2A, 2B, 2E, 2F y 2G) y DR5 cyno (Figuras 2C y 2D). Las Figuras 2A, 2B, 2E, 2F y 2G demuestran la unión de algunos VHH y la unión de VHH humanizados a DR5 humano según lo evaluado mediante citometría de flujo en células CHO que expresan DR5. Las Figuras 2C y 2D demuestran la unión de VHH y la unión de VHH humanizados a DR5 cyno según lo evaluado mediante ELISA utilizando DR5 cyno recombinante. En las Figuras 2A, B, C, D y E, las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 utilizadas fueron bivalentes, y los formatos utilizados fueron VHH-Fc o hzVHH-Fc humanizado (hz). En las Figuras 2F y 2G, se utilizaron proteínas de fusión Fc que se dirigen a DR5 tetravalentes humanizadas (VHH-enlazador-VHH-Fc).
Las Figuras 3A, 3B y 3C son una serie de gráficas que demuestran la capacidad de inducción de apoptosis directa de las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 de la presente divulgación. En todos los ensayos, se utilizaron las células Colo205 y el VHH que se dirige a DR5 presentó un formato de H10 como (A) H10-Fc (bivalente), (B) H10-enlazador-H10-Fc (tetravalente), o (C) H10-enlazador-H10-enlazador-H10-Fc (hexavalente). La Figura 3A es una gráfica que demuestra la mejora de la capacidad de inducción de la apoptosis de una proteína de fusión que se dirige a DR5 bivalente cuando se utiliza un agente de reticulación. La Figura 3B es una gráfica que demuestra la mejora de la capacidad de inducción de la apoptosis de una proteína de fusión que se dirige a DR5 tetravalente en comparación con una proteína de fusión que se dirige a DR5 bivalente. La Figura 3C es una gráfica que demuestra la mejora de la capacidad de inducción de la apoptosis de una proteína de fusión que se dirige a DR5 tetravalente y, además, hexavalente, en comparación con una proteína de fusión que se dirige a DR5 bivalente y TRAIL. La Figura 4A es una gráfica que demuestra la capacidad de una proteína de fusión que se dirige a DR5 hexavalente para inducir la apoptosis de la línea celular resistente Panc-1. Colo205 se muestra para comparación. Se muestra VHH que se dirige a DR5 H10.
La Figura 4B es una gráfica que demuestra la mejora de la sensibilidad de Panc-1 a una proteína de fusión que se dirige a DR5 tetravalente cuando se añade doxorrubicina. El VHH que se dirige a DR5 mostrado es F03 humanizado (hzF03), que presenta un formato como hzF03-enlazador-hzF03-Fc.
La Figura 5 es una gráfica que demuestra la actividad antitumoral de las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 tetravalentes de la presente divulgación en un modelo de xenoinjerto de tumor murino con células Colo-205. Se administró una dosis de las proteínas de fusión a 1 mg/kg por semana durante 4 semanas mediante administración IV. La dosificación comenzó cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 300 mm3
Las Figuras 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6F, 6G, 6H, 6I y 6J) son una serie de gráficas que demuestran la capacidad de inducción de muerte celular directa de algunas de las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 tetravalentes de la presente divulgación en comparación con TAS266 (un nanocuerpo de DR5 tetravalente descrito en la publicación PCT N.° WO 2011/098520A1) en varias líneas celulares de cáncer (Figuras 6A y 6B) Colo-205, Panc-1 (Figuras 6C y 6J), JL-1 (Figura 6D), HCT-116 (Figura 6E), NCI-H28 (Figura 6F), NCI-H460 (Figura 6G), HT-29 (Figura 6H), y MSTO-211H (Figura 6I). En las Figuras 6A-6D, el VHH que se dirige a DR5 es una variante humanizada de 1F5 (hz1F5) que presenta un formato hzVHH-enlazador-hzVHH-Fc. En las Figuras 6E-6J, el VHH que se dirige a DR5 es una variante humanizada de 1F2 (hz1F2) o 2C6 (hz2C6) que presenta un formato como hzVHH-enlazadorhzVHH-variantes Fc.
La Figura 7A es una gráfica que demuestra las diferencias en el reconocimiento de autoanticuerpos de TAS266, (un nanocuerpo de DR5 tetravalente descrito en la publicación PCT N.° WO 2011/098520A1) y 1F5 tetravalente humanizado (Tet-hz1F5v5) de la presente divulgación. Esta gráfica representa los resultados del suero de 45 donantes humanos. Los autoanticuerpos que contienen una cadena ligera kappa o lambda se detectaron en ensayos separados utilizando los anticuerpos secundarios conjugados con HRP kappa lg anti-humana o lambda Ig anti-humana. Los datos se normalizan respecto al control positivo de un anticuerpo IgG que tiene una cadena ligera lambda o kappa, respectivamente. TAS266 muestra reconocimiento de autoanticuerpos significativo, mientras que el reconocimiento de autoanticuerpos de Tet-hz1F5v5 se reduce al del antecedente de control de IgG.
La Figura 7B es una gráfica que demuestra que el suero combinado de múltiples donantes humanos (IVIG, Gamunex®-C, Grifols) contiene algunos anticuerpos IgG que reconocen anticuerpos de dominio simple (sdAb) que incluyen TAS266.
La Figura 7C es una gráfica que demuestra que el reconocimiento de TAS266 mediante autoanticuerpos dentro de IVIG induce la apoptosis de hepatocitos humanos primarios.
Las Figuras 8A y 8B son una serie de gráficas que demuestran la hepatotoxicidad dependiente del reconocimiento de autoanticuerpos de TAS266, pero no de Tet-hz1F5v5, en HepRG™, las células hepáticas terminalmente diferenciadas derivadas de una línea celular progenitora hepática. En la Figura 8A, la apoptosis se controló utilizando un sustrato fluorogénico específico de caspasa-3/7 con un generador de imágenes de células vivas IncuCyte Zoom (Essen Biosciences), los datos mostrados es a las 48 horas. En la Figura 8B, la apoptosis se controló después de las 48 horas utilizando un ensayo de CellTiter Glo (Promega). Se utilizó IVIG (Gamunex®-C, Grifols), un agrupamiento de anticuerpos que contiene autoanticuerpos dirigidos a sdAb.
Las Figuras 9A, 9B, 9C, y 9D son una serie de gráficas que demuestran la hepatotoxicidad dependiente del reconocimiento de autoanticuerpos de TAS266, pero no las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 tetravalentes de la presente divulgación. Las células HepRG™ se utilizaron como sustituto para hepatocitos humanos. Se utilizó IVIG (Gamunex®-C, Grifols), un agrupamiento de anticuerpos que contiene autoanticuerpos dirigidos a sdAb. Las Figuras 9A y 9C representan ensayos independientes de 48 horas y demuestran que TAS266 induce la hepatotoxicidad cuando se reticula mediante autoanticuerpos. Se observó hepatotoxicidad moderada cuando se añadió un anticuerpo secundario Fc anti-humano de reticulación a las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 tetravalentes de la presente divulgación, hz1F5, hz1F2 o hz2C6, que presenta un formato como hzVHH-enlazadorhzVHH-Fc. La viabilidad celular se midió mediante CellTiter Glo (Promega). La Figura 9D representa la reducción de hepatotoxicidad dependiente del reconocimiento de autoanticuerpos de TAS266 cuando se modifica en las posiciones de aminoácidos Leu11 y la región de extremo C-terminal de cada uno de los cuatro sdAb de DR5 (FTX-TAS266, SEQ ID NO: 126). Estos datos demuestran que la hepatotoxicidad de FIX-266 en presencia de IVIG se reduce a la de TAS266 en ausencia de IVIG. La viabilidad celular HepRG se midió mediante CellTiter Glo (Promega). La Figura 9B representa la cinética de la hepatotoxicidad dependiente del reconocimiento de autoanticuerpos de TAS266 así como la hepatotoxicidad dependiente de reticulación de anticuerpos secundarios de Tet-hz1F5v6. La apoptosis se controló durante un periodo de 46 horas utilizando un sustrato fluorogénico específico de caspasa-3/7 con un generador de imágenes de células vivas IncuCyte Zoom (Essen Biosciences). Las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 tetravalentes de la presente divulgación no inducen la hepatotoxicidad en presencia o ausencia de anticuerpos que contienen autoanticuerpos dirigidos a sdAb.
Descripción detallada
La divulgación proporciona moléculas que se acoplan específicamente con el receptor de muerte 5 (DR5), un miembro de la superfamilia de los receptores de TNF (TNFRSF). Más específicamente, esta divulgación se refiere a moléculas multivalentes que se unen al menos a DR5. Estas proteínas de fusión que se unen a TNFRSF multivalentes comprenden dos o más dominios de unión d TNFRSF (DR5BD), donde al menos un DR5BD se une a DR5. Estas moléculas se refieren en el presente documento como moléculas que se dirige a DR5.
Las moléculas que se dirigen a DR5 incluyen al menos una copia de una secuencia de anticuerpos de dominio simple (sdAb) que se une específicamente a DR5. En algunas realizaciones, las moléculas que se dirigen a DR5 incluyen dos o más copias de un sdAb que se une específicamente a DR5, por ejemplo, tres o más, cuatro o más, cinco o más, o seis o más copias de un sdAb que se une específicamente a DR5.
Un anticuerpo de dominio simple (sdAb) es un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio de anticuerpo variable monomérico simple que es capaz de unirse de manera selectiva a un antígeno específico. Con un peso molecular de solo 12-15 kDa, los anticuerpos de dominio simple son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kDa) que están compuestos por dos cadenas de proteínas pesadas y dos cadenas ligeras e incluso más pequeños que los fragmentos Fab (~50 kDa, una cadena ligera y media cadena pesada) y fragmentos variables de cadena simple (~25 kDa, dos dominios variables, uno de una cadena ligera y uno de una cadena pesada).
Los anticuerpos de dominio simple son anticuerpos cuyas regiones de determinación de complementariedad forman parte de un polipéptido de dominio simple. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos desprovistos naturalmente de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio simple derivados de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, anticuerpos modificados y andamios de dominio simple diferentes de los derivados de anticuerpos. Los anticuerpos de dominio simple pueden derivarse de cualquier especie incluyendo, pero sin limitación, ratón, ser humano, camello, llama, cabra, conejo y/o bovino. En algunas realizaciones, un anticuerpo de dominio simple como se utiliza en el presente documento es un anticuerpo de dominio simple de origen natural conocido como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. Con fines de claridad, este dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada desprovisto naturalmente de cadena ligera se conoce en el presente documento como VHH para distinguirlo del VH convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula de VHH se puede derivar de anticuerpos que surgen en la especie Camelidae, por ejemplo, en camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies, además de Camelidae, pueden producir anticuerpos de cadena pesada desprovistos naturalmente de cadena ligera; tales VHH están dentro del alcance de la divulgación.
Un anticuerpo de dominio simple puede obtenerse mediante inmunización de dromedarios, camellos, llamas, alpacas o tiburones con el antígeno deseado y el posterior aislamiento del ARNm que codifica anticuerpos de cadena pesada. Mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa, se produce una biblioteca de genes de anticuerpos de dominio simple que contienen varios millones de clones. Las técnicas de identificación sistemática como expresión en fagos y expresión en ribosomas ayudan a identificar los clones que se unen al antígeno. (Véase, por ejemplo, Arbabi Ghahroudi, M.; Desmyter, A.; et al. (1997). "Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies". FEBS Letters 414 (3): 521-526).
Un método distinto utiliza bibliotecas de genes de animales que no se han inmunizado con antelación. Dichas bibliotecas de genes sin tratamiento usualmente contienen solo anticuerpos con baja afinidad con el antígeno deseado, haciendo que sea necesario aplicar maduración por afinidad mediante mutagénesis aleatoria como etapa adicional. (Saerens, D.; et al. (2008). "Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics". Current Opinion in Pharmacology 8 (5): 600-608).
Cuando se han identificado los clones más potentes, se optimiza su secuencia de ADN, por ejemplo, para mejorar su estabilidad hacia las enzimas. Otro objetivo es la humanización para evitar las reacciones inmunológicas del organismo humano contra el anticuerpo. La humanización está exenta de problemas debido a la homología entre los fragmentos de VHH de camélido y VH humano. (Véase, por ejemplo, Saerens, et al., (2008). "Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics". Current Opinion in Pharmacology 8 (5): 600-608). La etapa final es la traducción del anticuerpo de dominio simple optimizado en E. coli, Saccharomyces cerevisiae u otros organismos adecuados.
Los fragmentos de anticuerpo de dominio simple también se derivan de anticuerpos convencionales. En algunas realizaciones, los anticuerpos de dominio simple pueden obtenerse de IgG murino y humana común con cuatro cadenas. (Holt, L. J.; et al. (2003). "Domain antibodies: proteins for therapy". Trends in Biotechnology 21 (11): 484­ 490). El proceso es similar, que comprende bibliotecas de genes de donantes inmunizados o sin tratamiento y técnicas de expresión para la identificación de los antígenos más específicos. Un problema con este enfoque es que la región que se une a IgG común consiste en dos dominios (VH y VL), que tienden a dimerizarse o agregarse debido a su lipofilicidad. La monomerización se logra habitualmente reemplazando los aminoácidos lipófilos por hidrófilos, pero a menudo conlleva a una pérdida de afinidad con el antígeno. (Véase, por ejemplo, Borrebaeck, C. A. K.; Ohlin, M. (2002). "Antibody evolution beyond Nature". Nature Biotechnology 20 (12): 1189-90). Si puede conservarse la afinidad, los anticuerpos de dominio simple pueden producirse del mismo modo en E. coli, S. cerevisiae u otros organismos.
Los anticuerpos de dominio simple monovalentes pueden convertirse en multivalentes mediante diversos métodos. Por ejemplo, el ADNc que codifica un primer sdAb puede fusionarse genéticamente con una secuencia de ADN que codifica un enlazador seguida de un segundo ADNc que codifica un sdAb etc. Como alternativa, el ADNc que codifica un sdAb puede fusionarse con el ADNc que codifica una segunda proteína o fragmento de la misma que se multimeriza naturalmente o se modifica para multimerizarse. Por ejemplo, la fusión de un sdAb con una región Fc de IgG dimerizará el sdAb. Cuando una construcción que codifica sdAb en tándem se vincula a una construcción que codifica Fc, la proteína de fusión resultante, una vez expresada, será tetravalente. Cuando una construcción que codifica tres sdAb se vincula a una construcción que codifica Fc, la proteína de fusión resultante, una vez expresada, será hexavalente. La divulgación contempla el uso de los dominios de multimerización adicionales, que incluyen dominios de homotrimerización y heterotrimerización de colágeno, dominios de cremallera de leucina, dominios de tetramerización de p53, secuencias de péptidos heterodiméricos c-Jun:Fos, proteína de matriz oligomérica de cartílago (COMP48), adiponectina trimérica, proteína D tensioactiva trimérica y/o tetrámero de acetilcolinesterasa sináptica.
Direccionamiento al receptor de muerte 5 (TRIAL-R2, TNFRSF10B)
El ligando inductor de la apoptosis relacionada con el TNF (TRAIL) evolucionó para desempeñar funciones fundamentales en el desarrollo de mamíferos y defensa del huésped erradicando selectivamente las células no deseadas, infectadas y malignas de poblaciones celulares sanas. Al unirse a los miembros de la familia de receptores de TNF DR4 o DR5, TRAIL induce la muerte celular mediante apoptosis dependiente de caspasa. DR5 (TNFRSF10B) parece ser el receptor principal en las células tumorales que facilita la actividad influenciada por tumor observada de la vía TRAIL. DR5 se activa mediante el ligando natural TRAIL, que lleva tres receptores DR5 a gran proximidad, activando así la caspasa-8 intracelular e iniciando la activación de otras caspasas que inducen la muerte, tales como caspasas-9 y caspasas-3. Por tanto, el inicio de esta vía de muerte celular requiere el agrupamiento de receptores DR5 para una muerte celular eficaz.
Los esfuerzos por explotar clínicamente la vía TRAIL para la terapia contra el cáncer dependían de una versión recombinante del ligando natural TRAIL y anticuerpos específicos para DR5. Los agonistas de anticuerpos dirigidos a DR5 requerían un agente de reticulación en experimentos in vitro preclínicos. Esto se debe al hecho de que los anticuerpos convencionales generaban agrupamiento de solo dos receptores DR5 (uno por cada cadena pesada y ligera). Dos receptores DR5 son insuficientes para activar la vía de la muerte celular, por tanto, es necesario un agente de reticulación. Sorprendentemente, la administración in vivo de anticuerpos dirigidos a DR5 en modelos de ratón preclínicos de cánceres humanos demostró actividad significativa en una amplia variedad de tipos tumorales. Más tarde se demostró que esta actividad dependía de receptores FcgammaR (FcyR) de ratón. Los estudios clínicos en humanos no pudieron reproducir las respuestas potentes observadas en estos modelos de ratón preclínicos. Se plantea la hipótesis de que la falta de actividad en humanos se debe a una reticulación de anticuerpos insuficiente. Esto puede deberse a diferencias en IgG en suero, FcgammaR (FcyR) y o concentraciones de TRAIL entre ratones inmunodeficientes y pacientes humanos con cáncer.
La presente divulgación proporciona proteínas de fusión multivalentes que se dirigen a DR5 que son capaces de agonizar fuertemente la señalización de DR5 que media la muerte celular directa. Las proteínas de fusión de la presente divulgación pueden ser trivalentes, tetravalentes, pentavalentes o hexavalentes. De manera importante, las proteínas de fusión de la presente divulgación son capaces de provocar apoptosis de células que expresan DR5 de manera independiente de agentes de reticulación exógenos.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente divulgación incorporan un DR5BD que se une a DR5. En realizaciones preferidas, el DR5BD que se une a DR5 no se une a DR4, señuelo R1, señuelo R2, osteopontina, o cualquier otro miembro de TNFRSF. En realizaciones preferidas, el DR5BD que se une a DR5 se une a DR5 de humano y de mono cangrejero. En algunas realizaciones, el DR5BD que se une a DR5 bloquea la interacción de DR5 y su ligando TRAIL. En otras realizaciones, el DR5BD que se une a d R5 no bloquea la interacción de DR5 y su ligando TRAIL. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación incorpora múltiples DR5BD que se unen a DR5 que reconocen epítopos distintos en DR5. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la presente divulgación incorpora múltiples DR5BD que se unen a DR5, en donde algunos DR5BD bloquean la interacción entre DR5-TRAIL y otros no bloquean la interacción entre DR5-TRAIL. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 de la presente divulgación inducen la muerte celular directa de células tumorales. Las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 de la presente divulgación tienen utilidad en el tratamiento de tumores de tanto naturaleza hematológica como sólida.
sdAb que se unen a DR5 a modo de ejemplo
A continuación se muestran secuencias de VHH DR5 (derivadas de llama) y humanizadas, y las secuencias de CDR se muestran debajo de cada secuencia. En algunas realizaciones, el sdAb que se une a DR5 se fusiona con una región Fc de IgG y, en estas realizaciones, la proteína de fusión es bivalente, teniendo dos dominios de unión a DR5 por molécula. En algunas realizaciones, dos sdAb que se unen a DR5 (2x) se fusionan con una región Fc de IgG y, en estas realizaciones, la proteína de fusión es tetravalente, teniendo cuatro dominios de unión a DR5 por molécula. En algunas realizaciones, tres sdAb que se unen a DR5 (3x) se fusionan con una región Fc de IgG y, en estas realizaciones, la proteína de fusión es hexavalente, teniendo seis dominios de unión a DR5 por molécula.
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EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRTFTNYAMSWFRQAPGKGLEFVSAINWSGDSTYYA
ESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCASAESFS RGGLPYGMNYWGQGTLVTV
KPGG (SEQ ID NO: 66)
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H10
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hzH10v1opt
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hzH10-DS
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hzH10v8opt
Figure imgf000027_0003
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hzH10opt
Figure imgf000027_0004
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hzH10v10opt
Figure imgf000027_0005
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H11
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LEYVSAIRWNEGDTYYA
Figure imgf000028_0002
DQYVYWGQGTLVTVSS
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hzH11v2
Figure imgf000028_0003
CDR1: SGRTLSAYLM (SEQ ID NO: 188)
CDR2: RIRWNEGDTY (SEQ ID NO: 189)
CDR3: AARSIFNPSDQYVYW (SEQ ID NO: 190)
1F10
Figure imgf000028_0004
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hz1F10
Figure imgf000028_0005
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CDR2: AISRSGDNIY (SEQ ID NO: 143)
CDR3: AVESQPTYSGGVYYPRYGMDVW (SEQ ID NO: 147)
hz1F10v2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGREFVSAISRSGDNIYYA DSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVE SQ PTYSGGVYY PRYGMDVWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 84)
CDR1: SGSTFSSLDMGW (SEQ ID NO: 142)
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CDR3: AVESQPTYSGGVYYPRYGMDVW (SEQ ID NO: 147)
x_1F5-DS
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMSWFRQAPGKGLEFVCAIYWSGGTVYYA ESVKGRFTCSRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVK PGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMSWFRQAPGKGLEFVCAIYWS GGTVYYAESVKGRFTCSRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQ GTLVTVKPGGGG (SEQ ID NO: 92)
x_1F5
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMSWFRQAPGKGLEFVSAIYWSGGTVYYA
ESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVK
PGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMSWFRQAPGKGLEFVSAIYWS
GGTVYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQ GTLVTVKPGGGG (SEQ ID NO: 93)
x_1F5_gs6
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGREFVSAISRSGDNIYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDSQPTYSGGVYYPRYGMDVWGQGT LVTVSGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGREFVS AISRSGDNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMMSLRAEDTAVYYCAVDSQPTYSGGVYY PRYGMDVWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 94)
x_1F5_gs12
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMSWFRQAPGKGLEFVSAIYWSGGTVYYA DSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVS SGGGSGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMSWFRQA.PGKGLEFV
SAXYWSGGTVYYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWK YDYWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 95)
x_1F5_gs15
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMSWFRQAPGKGLEFVSAIYWSGGTVYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVS SGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMSWFRQAPGKGL E FVSAIYWSGGTVYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVTI R.GAATQ TWKYD YWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 96)
x_hz1F2v2-gs6
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGREFVSAISRSGDNIYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDSQPTYSGGVYYPRYGMDVWGQGT LVTVSGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGREFVS AISRSGDNIYYADSVKGRFTI3RDNSKNTLYLQMN3LRAEDTAVYYCAVDSQPTYSGGVYY PRYGMDVWGQGTLV TV S SAGGGG (SEQ ID N O : 97 }
x_hz1F2v2-gs9
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGREFVSAISRSGDNIYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDSQPTYSGGVYYPRYGMDVWGQGT LVTVSSGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLFLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGRE FVSAI SRSGDNIY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQjMNSLRAE DTAVY YCAVDSQPTYSGG VYYPRYGMDVWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 98)
x_hz1F2v2-gs12
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGST FSSLDMGWFRQAPGKGREFVSAISRSGDNIYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDSQPTYSGGVYYPRYGMDVWGQGT LVTVSSGGG5GGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGK GRE FVSAISRSGDNIYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAVDSQPTY SGGVYYPRYGMDVWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 99)
x_hz1F2v2-gs15
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMSWFRQAPGKGLEFVSAISRSGDNIYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDTAVYYCAVDSQPTYSGGVYYPRYGMDVWGQGT
LVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMSWFRQA PG KGLEFVSAIS RSGDNIYYADSVKGRFTISRDNS KNTLY LQMNSLRAEDTAVY YCAVDSQ PTY SGGVYY PRYGMDVWGQGT LVTVS SAGGGG (SEQ ID NO: 100)
x_hzB04v1-gs6
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRAFSNYAMSWFRQAPGKGLEFVSAINWNGENRYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALSFRLGGEPYGDAYWGQGTLVTV
3GSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRAFSNYAMSWFRQAPGKGLEFV3AINW NGENRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALS FRLGGE PYGDAYW GQGTLVTVSSAGGGG (SEO ID NO: 101)
x_hzB04v1-gs12
EVQLLE3GGGLVQPGGSLRLSCAASGRAFSNYAMSWFRQAPGKGLEFVSAINWNGENRYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALSFRLGGEPYGDAYWGQGTLVTV
3SGGGSGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRAFSNYAMSWFRQAPGKGLEF VSAIMWNGENRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALSFRLGGEP YGDAYWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 102}
x_hzB04v1-gs15
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRAFSNYAMSWFRQAPGKGLEFVSAINWNGENRYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALSFRLGGEPYGDAYWGQGTLVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRAFSNYAMSWFRQAPGKG LEFVSAINWNGENRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAALSFRLG GEPYGDAYWGQGTLVTVS SAGGGG (SEQ ID NO: 103)
x_F03v2-gs6
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMGWFRQAPGKEREFVSASVWNNGGNYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCWARTPETPITSARGANYWGQGTLVT VSGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMGWFRQAPGKEREFVSASV WNNGGNY YADSVKGRFTISRDNS KNTLY LQMNSLRAEDTAVY YCWART PETPITSARGAN YWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 104)
x_F03v1-gs6
SVQLLESGGGKVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMSWFRQAPGKGLEFVSASVWNNGGNYYA DSVKGR FT ISRDN SKNTLY LQMNSLRAE DTAVY YCWART PETP ITSARGANYWGQGTLVT VSGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMSWFRQAPGKGLEFVSASV WNNGGNYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMIsISLRAEDTAVYYCWARTPETPITSARGAtJ YWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 105)
x_F03v1-gs9
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMSWFRQAPGKGLEFVSASVWNNGGNYYA D3VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YC W A A T PETPITSARGANYWGQGTLVT VSSGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMSWFRQAPGKGLEFVS ASVWNNGGNYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCWARTPETPITSAR GANYWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 106)
x_F03v1-gs12
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMSWFRQAPGKGLEFVSASVWNNGGNYYA DSVKGR FTIS RDN SKNT LYLQMNSL RAE DTAVY YC W A R T PETPITSARGANYWGQGTLVT VSSGGGSGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMSWFRQAPGKGLE FVSASVWNNGGNYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCWARTPETPIT SARGANYWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 107)
x_F03v1-gs15
EVQLLESGGGKVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMSWFRQAPGKGLEFV3ASVWNNGGNYYA DSVKGR FTISRDNS KNTLY LQMNSLRAE DTAVY YCW A R T PETPITSARGANYWGQGTLVT VSGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMSWFRQAPGKGLEFVSASV WNNGGNY YADS VKGRFTIS RDNS KNT LYLQMN SLRAE DTAVY YC W A R T PETPITSAP.GAN YWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 108)
x_hzH10v2-gs6
EVQIjLESGGGLVQPGGSLRLSCAASVST FGTSPVGWFRQAPGKE ElEFVSAIRWDGVGAY YA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCALPRRGDSELPSTVKEYGYWGQGTLV TVSGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASVSTFGTSPVGWFRQAPGKEREFVSAI RWDGVGAYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCALPRRGDSELPSTVKE YGYWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 109)
x_hzH10v2-gs15
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASVSTFGTSPVGWFRQAPGKEREFVSAIRWDGVGAYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCALPRRGDSELPSTVKEYGYWGQGTLV TVSSGGGGSGGGGSGGGG5EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASVSTFGTSPVGWFRQAPG KEREFVSAIRWDGVGAYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCALPRRGD SELPSTVKEYGYWGQGTLVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 110)
x_hz1F5v3_gs6
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFVSAIYWSGGTVFYA ESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVK PGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFVSAIYWS GGTV FYAH!SVKGR FTISRDNAKNTVY LQMS SLRAE DTAVY YCAVTIRGAATQTWKY DYWGQ GTLVTVKPGGGGDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 111}
x_hz1F5v4_gs6
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFLAVIYWSGGTVFYA ESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYY CAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVK PGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGG SLRLSCAASGLT FPNYGMGWFRQAPGKERE FLAVIYWS GGTVFYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQ GTLVTVKPGGGGDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 112)
x_hz1F5v5_gs6
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSGAASGLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFVSAIYWSGGTVYYA ESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVK PGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFVSAIYWS GGTVYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRAE DTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQ GTLVTVKPGGGGDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 113}
x_hz1F5v6_gs6
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFLAVIYWSGGTVYYA ESVKGRFTIS RDMAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVK PGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFLAVIYWS
GGTVYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQ GTLVTVKPGGGGDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 114)
x_hz1F5v7_gs6
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPMYGMGWFRQAPGKEREFVSAIYWSGGTVYYA ESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMS SLRAE DTAVY YCAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVK PGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFVSAIYWS GGTVYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQ GTLVTVKPGGGGDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 115)
x_hz1F5v8_gs6
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAA5GLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFLAVIYWSGGTVYYA ESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQGTLVTVK PGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGLTFPNYGMGWFRQAPGKEREFLAVIYWS GGTVYYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAVTIRGAATQTWKYDYWGQ GTLVTVKPGGGGDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 116)
x_hzC06v2_gs6
Figure imgf000034_0001
x_hzC06v2_gs9
Figure imgf000034_0002
x hzF03
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISMYAMSWFRQAPGKGLEFVSASWNNGGNYYA DSVKGR FTISRDNS KNTLY LQMN SLRAE DTAVY YGWART PETPITSARGANYWGQGTLVT
VSSGGGG3GGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSISNYAMSWFRQAPGK GLEFVSASVWNNGGNYYADSVKGRFTIS RDNSKNT LYLQMNS LRAEDTAVYYCVVART PET PITSARGANYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GRSISNYAMSWFRQAPGKGLE FVSAS VWNNCíGNYY ADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCVVART PET PIT SARCANYWGQGT LVTVSSAGGGG (SEQ ID NO: 119) x H10-DS
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASVST FGTSPVGWFRQñ PGKEREFVCAIRWEGVGAYYA ESVKGRFTCSRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCALPRRGDSELPSTVKEYGYWGQGTLV TVKPGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASVSTFGTSPVGWFRQAPGKEREFVCAI RWEGVGAYYAESVKGRFTCSRDNAKNTLYLQM3SLRAEDTAVYYCALPRRGDSELPSTVKE YGYWGQGTLVTVKPGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASVSTFGTSPVGWFRQAP GKEREFVCAI RWEGVGAYYASSVKGRFTCSRDNAKNTLYLQMSSLPAEDTAVYYCALPRRG DSELPSTVKEYGYWGQGTLVTVKPGGGG (SEQ ID NO: 120)
x H10
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASVSTFGTSPVGWFRQAPGKEREFVSAIRWEGVGAYYA ESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCALPRRGDSELPSTVKEYGYWGQGTLV TVKPGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASVSTFGTSPVGWFRQAPGKEREFVSAI RWEGVGAYYAESVKGRFTISRDNAKKTLYLQMSSLRAEDTAVYYC.ALPRRGDSELPSTVKE YGYWGQGTLVTVKPGGSGGS EVQLLE SGGGEVQ PGGSLRL SCAASVST FGTS PVGW FRQAP GKERE FVSAIRWEGVGAYYAESVKGR FTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCALPRRG DSELPSTVKEYGYWGQGTLVTVKPGGGG (SEQ ID NO: 121)
x 1F2-DS
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGREFVCAISRSGDNIYYA ESVKGR FTCSRDNAKNTLY LQMS SLRAEIOTAVY YCAVESQPT YSGGVYY PRYGMDVWGQGT LVTVKPGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGREFVC AISRSGDNIYYAESVKGRFTCSRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVESQPTYSGGVYY PRYGMDVWGQGTLVTVKPGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWF RQAPGKGREFVCAISRSGDNIYYAESVKGRFTCSRDMAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAV ESQPTYSGGVYYPRYGMDVWGQGTLVTVKPGGGG (SEQ ID NO: 122)
x 1F2
EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGRE1 FVSAISR3GDNIYYA ESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVESQPTYSGGVYYPRYGMDVWGQGT LVTVKPGGSGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSTFSSLDMGWFRQAPGKGREFVS AISRSGDNIYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAVESQPTYSGGVYY PRYGMDVWGQGT LVTVKPGGSGGSEVQLLESGGGEVQ PGGSLRLSCAASGST FSSLDMGW F RQAPGKGRE FVSAI SRSGDNIYY AES VKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLRAE DTAVYYCAV ESQPTYSGGVYYPRYGMDVWGQGTLVTVKPGGGG (SEQ ID NO: 123)
x_H10-gs15
QVQLVQSGGGLVQAGGSLTLSCAASVSTFGTSPVGWFRQAPGKBREFVSAIRWDGVGAYYA
DSVRGRFKNSKDKAKRTAYLQMNRLKPEDTAVYYCALPRRGDSELPSTVKEYGYWGQGTQV
t vssg gggs ggggs gggg sqvq lvqsg gglv qaggs ltls caas vstfg tspv gwfrg apg
KEREFVSAIRWDGVGAYYADSVRGRFKNSKDNAKRTAYLQMNRLKPEDTAVYYCALPRRGD
SELPSTVKEYGYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGLVQAGGSLTLSCA
ASVSTFGTSPVGWFRQAPGKERE F'v'SAIRWDGVGAYYADSVRGR FKMSKDNAKRTAYLQMK
RL KPEDTAVY YCAL PRRGDSE LP STVKE YGYWGQGTQVTVS SAGGGG (SEQ ID NO:
124)
TAS266/11 H6_hu_tetramer
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTFDKINNMGWYRQAPGKQRDLVAQITPGGITDYAD
SVKGRFTISR DNSKNTLY LQMNSLRPEDTAVYYCNAEILKRAYIDVYVNYWGQGT LVTVS S
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAA5G
T FDKINNMGWYRQAPGKQRDLVAQITPGGITDYADSVKGRFTIS RDNS KNT LYL,QMNSLRP
3DTAVYYCNAEILKRAYIDVYVNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
GGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGTFDKINNMGWYRQAPGKQRDLVAQIT
PGGITDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCNAEILKRAYIDVYVNYWG
QGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGS
L RLSCAA SGT FDKINNMGW YRQAPGKQ RDLVAQIT PGG ITDY ADSVKGR FTISRDN3 KNTL
YLQMNSLRPEDTAVYYCNAEILKRAYIDVYVNYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 125)
FIX-TAS266
EVQLLESGGGEVQPGG SLRLSCAASGT FDKINNMG WY RQAPGKQ RDL VAQ ITPGGITDYA.D
SV KGRFTIS RDNSKNTL YLQMN SLP.PEDTAVYY CNAEI LKRAYIDVY VNYWGQGTLVTVKP
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASG
TFDKINNMGWYRQAPGKQRDL'VAQITPGGITDYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRP
EDTAVYY CNAEILKRAYIDVYVNYWGQGTLVTVKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
GGGSGGGGSEVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGTFDKINNMGWYRQAPGKQRDLVAQIT
PGG ITDY ADSVKGR FT ISRDN SKNT LYLQMN SL RPEDT AQVYYCNAE ILKRA YIDVY VNY WG
QGTLVTVKPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGEVQPGGS
LRLSCAASGT FDK.INNMGWYRQAPGKQRDLVAQITPGG ITDY’ADSVKGRFT ISRDNSKNTL
YLQMNS LRPEDTAVY YCNAEIL KRAYIDVYVNYWGQGTLVTVKPGG (SEQ ID NO:
126 )
Las proteínas que se dirigen a DR5 descritas en el presente documento son útiles en varias indicaciones terapéuticas, de diagnóstico y profilácticas. Por ejemplo, las proteínas que se dirigen a DR5 son útiles en el tratamiento de varias enfermedades y trastornos en un sujeto. En algunas realizaciones, las proteínas que se dirigen a DR5 son útiles en el tratamiento, alivio de un síntoma, mejora y/o retraso del avance de una enfermedad o trastorno en un sujeto que padece o que se identificó que está en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno inflamatorio. En algunas realizaciones, las proteínas que se dirigen a DR5 son útiles en el tratamiento, alivio de un síntoma, y/o retraso del avance de un cáncer u otra afección neoplásica. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino/cervical, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de testículos, cáncer esofágico, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de célula germinal, cáncer de huesos, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de piel, neoplasia del sistema nervioso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma, mesotelioma, leucemia, linfoma, mieloma y cáncer relacionado con un virus. En determinadas realizaciones, el cáncer es un cáncer metastásico, cáncer refractario o cáncer recurrente. En algunas realizaciones, las proteínas que se dirigen a DR5 son útiles en la reducción o eliminación de la cantidad de células T reguladoras en un tumor de un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, las proteínas que se dirigen a DR5 son útiles en la estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunas realizaciones, las proteínas que se dirigen a DR5 son útiles en el tratamiento, alivio de un síntoma, mejora y/o retraso del avance de una enfermedad o trastorno autoinmunitario. En algunas realizaciones, las proteínas que se dirigen a DR5 son útiles en el tratamiento, alivio de un síntoma, mejora y/o retraso del avance de infecciones virales, bacterianas y parasitarias.
Las formulaciones terapéuticas de la divulgación, que incluyen una molécula que se dirige a DR5 de la divulgación, se utilizan para tratar o aliviar un síntoma asociado con una enfermedad o trastorno asociado con actividad y/o expresión aberrante de DR5 en un sujeto. Se lleva a cabo un régimen terapéutico mediante la identificación de un sujeto, p. ej., un paciente humano que padece (o está en riesgo de desarrollar) una enfermedad o trastorno asociado con actividad y/o expresión aberrante de DR5 utilizando métodos convencionales, que incluyen cualquiera de varios procedimientos clínicos y/o de laboratorio. El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios. El término sujeto incluye seres humanos y otros mamíferos.
La eficacia del tratamiento se determina junto con cualquier método conocido para el diagnóstico o el tratamiento de la enfermedad o trastorno particular asociado con actividad y/o expresión aberrante de DR5. El alivio de uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno asociado con actividad y/o expresión aberrante de DR5 indica que la molécula que se dirige a DR5 confiere un beneficio clínico.
Los usos terapéuticos de las moléculas que se dirigen a DR5 de la divulgación también pueden incluir la administración de uno o más agentes adicionales.
En algunas realizaciones, la molécula que se dirige a DR5 se administra durante y/o después del tratamiento en combinación con uno o más agentes adicionales. En algunas realizaciones, la molécula que se dirige a DR5 y el agente adicional se formulan en una única composición terapéutica, y la molécula que se dirige a DR5 y el agente adicional se administran de manera simultánea. Como alternativa, la molécula que se dirige a DR5 y el agente adicional están separados entre sí, p. ej., cada uno se formula en una composición terapéutica separada, y la molécula que se dirige a DR5 y el agente adicional se administran de manera simultánea, o la molécula que se dirige a DR5 y el agente adicional se administran en momentos distintos durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, la molécula que se dirige a DR5 se administra antes de la administración del agente adicional, la molécula que se dirige a DR5 se administra después de la administración del agente adicional, o la molécula que se dirige a DR5 y el agente adicional se administran de manera alterna. Tal como se describe en el presente documento, la molécula que se dirige a DR5 y el agente adicional se administran en dosis únicas o en múltiples dosis.
En algunas realizaciones, la molécula que se dirige a DR5 y el(los) agente(s) adicional(es) se administran de manera simultánea. Por ejemplo, la molécula que se dirige a DR5 y el(los) agente(s) adicional(es) pueden formularse en una única composición o pueden administrarse como dos o más composiciones separadas. En algunas realizaciones, la molécula que se dirige a DR5 y el(los) agente(s) adicional(es) se administran de manera secuencial, o la molécula que se dirige a DR5 y el agente adicional se administran en momentos distintos durante un régimen de tratamiento.
Los métodos para la identificación selectiva de las moléculas que se dirigen a DR5 que poseen la especificidad deseada incluyen, pero sin limitación, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos enzimáticos, citometría de flujo y otras técnicas mediadas inmunológicamente conocidas en la técnica.
La divulgación proporciona además secuencias de ácido nucleico y, particularmente, secuencias de ADN que codifican las presentes proteínas de fusión. Preferentemente, la secuencia de ADN es transportada por un vector adecuado para la replicación extracromosómica, tal como un fago, virus, plásmido, fagémido, cósmido, YAC o episoma. En particular, un vector de ADN que codifica una proteína de fusión deseada puede utilizarse para facilitar los métodos de preparación de las moléculas que se dirigen a DR5 descritas en el presente documento y para obtener cantidades significativas de la proteína de fusión. La secuencia de ADN puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación de la proteína insertada. Puede utilizarse una serie de sistemas huésped-vector para expresar la secuencia de codificación de proteína. Estos incluyen sistemas de células de mamífero infectados con virus (p. ej., virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectados con virus (p. ej., baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura, o bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN cósmido. Dependiendo del sistema de huésped-vector utilizado, puede utilizarse uno cualquiera de una serie de elementos de transcripción y traducción adecuados.
La divulgación también proporciona métodos de producción de una molécula que se dirige a DR5 mediante el cultivo de una célula en condiciones que dan lugar a la expresión del polipéptido, en donde la célula comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula que se dirige a DR5 descrita en el presente documento, y/o vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La divulgación proporciona métodos de producción de una molécula que se dirige a DR5 mediante el cultivo de una célula en condiciones que dan lugar a la expresión de la molécula que se dirige a DR5, en donde la célula comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula que se dirige a DR5 descrita en el presente documento, y/o vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas.
Las proteínas de fusión de la divulgación (también referidas en el presente documento como "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de las mismas, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración. Dichas composiciones normalmente comprenden la proteína de fusión y un transportador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Se describen transportadores adecuados en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia convencional en el campo. Los ejemplos preferidos de tales transportadores o diluyentes incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa, y seroalbúmina humana al 5 %. También pueden utilizarse liposomas y vehículos no acuosos, tales como aceites fijos. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
Una composición farmacéutica de la divulgación se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, p. ej., intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (p. ej., inhalación), transdérmica (es decir, tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en los casos donde sean hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los transportadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL" (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición ha de ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y ha de preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El transportador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.
Las composiciones orales incluyen en general un diluyente inerte o un transportador comestible. Pueden atraparse en cápsulas de gelatina o compactarse formando comprimidos. Con el fin de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un transportador fluido para su uso como enjuague bucal, en donde el compuesto en el transportador líquido se aplica por vía oral y se usa como enjuague y se expectora o ingiere. Pueden incluirse como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un agente disgregante, tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de una pulverización de aerosol a partir de un recipiente o dispensador a presión que contiene un propulsor adecuado, p. ej., un gas, tal como dióxido de carbono o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes se conocen en general en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce en general en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (p. ej., con bases para supositorios convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal.
En una realización, los compuestos activos se preparan con transportadores que protegerán al compuesto contra su rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para preparar dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente a través de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposómicas como transportadores farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosificación unitaria usada en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosis unitaria de la divulgación está dictada por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se vaya a lograr y de las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un kit, recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits de diagnóstico con instrucciones de uso.
A menos que se definan de otra manera, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente divulgación tendrán los significados comúnmente entendidos por los expertos en la materia. Además, a no ser que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química de proteínas y oligo o polinucleótidos y de hibridación descritas en el presente documento son las conocidas y utilizadas comúnmente por los expertos en la materia. Se usan técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (p. ej., electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se lleva a cabo comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden llevarse a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica que se describen en el presente documento son los conocidos y frecuentemente usados en la técnica. Se usan técnicas convencionales para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes. El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
Tal como se utiliza de acuerdo con la presente divulgación, los siguientes términos, salvo que se indique lo contrario, se entenderán como que tienen los siguientes significados:
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "proteína de fusión que se dirige a" y "anticuerpo" pueden ser sinónimos. Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) a un antígeno. Por "se une específicamente" o "inmunorreacciona con" o "dirigido contra" se refiere a que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une con una afinidad mucho menor (Kd > 10-6). Los anticuerpos incluyen, pero sin limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, dAb (anticuerpo de dominio), monocatenarios, Fab, fragmentos Fab, y F(ab')2 , Fv, scFvs, una biblioteca de expresión de Fab, y fragmentos de anticuerpo de dominio simple (sdAb), por ejemplo Vh H, Vn a r , Vh o Vk modificado.
La unidad estructural básica del anticuerpo es conocida por comprender un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Determinadas clases también presentan subclases (también conocidas como isotipos), tal como IgG1, IgG2 y otras. Es más, en seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
La expresión, "anticuerpo monoclonal" (mAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contiene solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un único producto génico de cadena ligera y un único producto génico de cadena pesada. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los mAb contienen un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única con respecto a este.
La expresión "sitio de unión al antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") del extremo N-terminal de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, referidas como "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco conservadas", o "FRs". Por tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre y adyacentes a regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen una con respecto a la otra en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria de la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se refieren como "regiones de determinación de complementariedad", o "CDRs". La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)) o Chothia y Lesk J, Mol. Biol.
196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
Las porciones de fragmentos de anticuerpo de dominio simple (sdAb) de las proteínas de fusión de la presente divulgación se refieren de manera intercambiable en el presente documento como polipéptidos de direccionamiento en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a/mediante una inmunoglobulina o fragmento de la misma, o un receptor de células T. El término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a/mediante una inmunoglobulina o un receptor de células T. Los determinantes epitópicos habitualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o glucídicas y, habitualmente, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 pM; p. ej., < 100 nM, preferentemente < 10 nM y más preferentemente < 1 nM.
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "unión inmunológica", "propiedades de unión inmunológica" y "unión específica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La potencia o afinidad de las interacciones de unión inmunológica pueden expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en donde una Kd más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de los polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos implica medir las tasas del complejo formación y disociación de sitio de unión al antígeno/antígeno, en donde dichas tasas dependen de las concentraciones de los compañeros complejos, la afinidad de la interacción, y los parámetros geométricos que influyen de igual manera en la tasa en ambas direcciones. Por tanto, tanto la "constante de asociación" (kon) como la constante de disociación" (koff) pueden determinarse mediante el cálculo de las concentraciones y las tasas de asociación y disociación reales. (Véase, Nature 361:186-87 (1993)). La relación de koff/kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd, (Véase, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente divulgación se une específicamente a un antígeno, cuando la constante de unión en equilibrio (Kd) es <1 pM, preferentemente < 100 nM, más preferentemente < 10 nM, y lo más preferentemente < 100 pM a aproximadamente 1 pM, según lo medido mediante ensayos tales como ensayos de unión a radioligandos, resonancia de plasmón superficial (SPR), ensayo de unión por citometría de flujo, o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina, valina, glutamatoaspartato, y asparagina-glutamina.
Tal como se analiza en el presente documento, se contempla que las pequeñas variaciones en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina están comprendidas por la presente divulgación, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos 75 %, más preferentemente al menos 80 %, 90 %, 95 % y lo más preferentemente 99 %. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato, (2) aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxialifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (ii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tenga un efecto principal sobre la unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio marco conservado. Se puede determinar sin inconvenientes si el cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional mediante la evaluación de la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen en detalle en el presente documento. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se pueden preparar sin inconvenientes por los expertos en la técnica. Los extremos amino y carboxi preferidos de los fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Preferentemente, se usan métodos de comparación informatizados para identificar motivos de secuencia o dominios de configuración de proteínas predichos que se produzcan en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Por tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencias y conformaciones estructurales que pueden utilizarse para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la divulgación.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia que no sea la secuencia de péptidos de origen natural. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de uno o varios aminoácidos (preferentemente, sustituciones de aminoácidos conservadoras) en la secuencia de origen natural (preferentemente, en la porción del polipéptido fuera del(de los) dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservadora normalmente puede no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (p. ej., un reemplazo de aminoácidos no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia original o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia original). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354:105 (1991).
La expresión "fragmento polipeptídico", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos tienen normalmente al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos 14 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos 20 aminoácidos de longitud, habitualmente al menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferentemente al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos compuestos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con respecto a una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene unión específica a DR5, en condiciones de unión adecuadas. Normalmente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución (o adición o eliminación) de aminoácidos conservadora con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos tienen normalmente al menos 20 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y a menudo pueden tener una longitud igual a la de un polipéptido de origen natural de longitud completa.
Los análogos peptídicos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan "miméticos peptídicos" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Normalmente, dichos compuestos se desarrollan con la ayuda de modelado molecular computarizado. Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o una actividad farmacológica), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado entre el grupo que consiste en: --CH2NH--, --CH2S-, --CH2-CH2--, --CH=CH--(cis y trans), --COCH2--, CH(OH)CH2--, y -CH2SO--, mediante métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un aminoácido D del mismo tipo (p. ej., D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar péptidos más estables. Asimismo, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica pueden generarse mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); por ejemplo, mediante la adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan al péptido.
El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, y/o un extracto hecho de materiales biológicos.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "etiqueta" o "etiquetado" se refiere a la incorporación de un marcador detectable, p. ej., mediante incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de restos de biotina que puede detectarse mediante avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o el marcador también puede ser terapéutico. Se conocen en la técnica y pueden usarse diversos métodos de etiquetado de polipéptidos y glucoproteínas. Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p. ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), etiquetas enzimáticas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo). En algunas realizaciones, las etiquetas se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. La expresión "agente farmacéutico o fármaco", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "que trata", "tratamiento", y similares se refieren a reducir y/o mejorar un trastorno y/o síntomas asociados con el mismo. Por "aliviar" y/o "alivio" se refiere a disminuir, suprimir, atenuar, menguar, detener y/o estabilizar el desarrollo o el avance de una enfermedad tal como, por ejemplo, un cáncer. Se apreciará que, aunque no se excluye, tratar un trastorno o afección no requiere que el trastorno, afección o síntomas asociados con los mismos se eliminen por completo.
En esta divulgación, "comprende", "que comprende(n)", "que contiene(n)", "que tiene(n)", y similares pueden tener el significado atribuido a los mismos en la ley de patentes de EE.UU., y pueden significar "incluye", "que incluye(n)" y similares; las expresiones "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente" análogamente tiene el significado atribuido en la ley de patentes de Estados Unidos y la expresión es abierta, permitiendo la presencia de más de lo que se enumera siempre que las características básicas o novedosas de lo que se enumera no se cambien por la presencia de más de lo que se enumera, pero excluye las realizaciones de la técnica anterior.
Por "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad necesaria para mejorar los síntomas de una enfermedad con respecto a un paciente no tratado. La cantidad eficaz de compuesto(s) activo(s) utilizado(s) para llevar a la práctica la presente divulgación para tratamiento terapéutico de una enfermedad varía dependiendo de la manera de administración, la edad, el peso corporal y el estado de salud general del sujeto. Por último, el médico o veterinario responsable decidirá la cantidad apropiada y el régimen de dosificación. Tal cantidad es la referida como una "cantidad eficaz".
Por "sujeto" se refiere un individuo, incluyendo, pero no se limita a, un ser humano o un mamífero no humano, tal como bovino, equino, canino, roedor, ovino, primate, camélido o felino.
El término "administrar", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier modo de transferencia, suministro, introducción o transporte de un agente terapéutico a un sujeto que necesite un tratamiento con dicho agente. Dichos modos incluyen, pero sin limitación, administración oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, intranasal y subcutánea.
Por "fragmento" se entiende una porción de un polipéptido o molécula de ácido nucleico. Esta porción contiene, preferentemente, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %), 70 %, 80 % o 90 % de la longitud total del polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos o aminoácidos.
Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son una forma abreviada de todos los valores comprendidos en el intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números, o subintervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50.
Salvo que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto, tal como se usa en el presente documento, se entiende que los términos "un, "una", y "el/la" son singular o plural. Salvo que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto, tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término "o" es inclusivo.
Salvo que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto, tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término "aproximadamente" está dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones típicas de la media. Aproximadamente puede entenderse dentro de 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 % o 0,01 % del valor establecido. Salvo que sea evidente por el contexto, todos los valores numéricos proporcionados en el presente documento están modificados por el término "aproximadamente".
Ejemplos
Ejemplo 1: Ensayos de unión
La unión de proteínas de fusión que se dirigen a se evaluó mediante citometría de flujo, usando una línea celular CHO transfectada de manera estable con ADNc que codifica DR5 de longitud completa o líneas celulares de cáncer que expresan de manera endógena DR5. Se incubó una serie de titulación de la proteína de fusión con las líneas celulares que expresan DR5 (aprox. 2,5-5x104 células/pocillo) durante 30 minutos a 4°C en tampón FACS (PBS 1 % ASB 0,1 % NaN3 pH 7,4) en placas de 96 pocillos. Tras 3 etapas de lavado en tampón FACS, se añadió un anticuerpo secundario específico Fcy anti-humano conjugado con APC (Jackson ImmunoResearch) y se incubó durante 30 minutos a 4 °C. Tras tres etapas de lavado adicionales en tampón FACS, se detectó el anticuerpo unido mediante citometría de flujo (IQue Intellicyte). La unión de las proteínas de fusión a DR5 de mono cangrejero (cynoDR5) se determinó mediante ELISA, en donde se inmovilizó una proteína recombinante que corresponde al dominio extracelular de muerte (ECD) de cynoDR5 fusionado con una región Fc murina (mFc) en placas de 96 pocillos Medisorp (Nunc). Tras las etapas de bloqueo y lavado suficientes, las proteínas de fusión unidas se detectaron usando un anticuerpo secundario específico de Fcy anti-humano conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) y reactivo de TMB y lectura de absorbancia a A650nm.
Ejemplo 2: Ensayos de apoptosis
Se determinó la destrucción directa de las células mediada por anticuerpos mediante la medición de la cantidad de ATP presente tras un período de tratamiento de 16-48 h usando CellTiter-Glo® (Promega G7572). Se sembraron células de cáncer a 1,5-3x104 células/pocillo a 7x104 células/pocillo en placas tratadas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos. Un método alternativo para medir la muerte celular es teñir de forma fluorescente las células usando un reactivo para apoptosis con caspasa-3/7 de IncuCyte™ (Essen BioScience 4440) durante el tratamiento con anticuerpos y cuantificar las células fluorescentes usando un sistema IncuCyte® ZOOM, en algunas realizaciones, la proteína de fusión contiene un polipéptido. Las líneas celulares usadas incluyen Colo-205 (ATCC® CCL-222™), Panc-1 (ATCC® CRL-1469™), HCT-116 (ATCC® CCL-247™), JL-1 (DSMZ ACC 596), NCI-H28 (ATCC® CRL-5820™), NCI-H460 (ATCC® HTB-177™), HT-29 (ATCC® HTB-38™). MSTO-211H (ATCC® CRL-2081 ™). En algunos experimentos, se utilizó un anticuerpo secundario específico para Fcy de IgG anti-humano (Jackson ImmunoResearch) para reticular y agrupar además las proteínas de fusión que se dirigen a DR5 de la presente divulgación. En otros experimentos, se utilizaron 6 pM de doxiciclina para sensibilizar las células a la apoptosis mediada por DR5.
Ejemplo 3: sdAb que reconocen autoanticuerpos preexistentes
Se midieron los anti-VH humanos (HAVH) preexistentes en plasma humano o IVIG (IgG purificada de plasma humano combinado, nombre comercial Gamunex®-C) mediante ELISA. Se recubrieron artículos de prueba (TAS266, proteínas de fusión o anticuerpos terapéuticos) en una placa ELISA en PBS, la placa se bloqueó mediante ASB al 3 % en PBS, acto seguido, el plasma humano o IVIG (como una fuente de HAVH de origen natural) se diluyó en PBS 0,1 % de polisorbato-20 (PBST) y se permitió que se uniera a la placa. Después de lavar la placa con PBST, se detectaron anticuerpos de plasma unidos (HAVH) mediante anticuerpos secundarios de cadena anti-ligera (anti-IgKappa o anti-IgLambda humano) conjugados con HRP, y se desarrollaron con sustrato TMB. Esta estrategia de detección de HAVH mediante el anticuerpo secundario de cadena anti-ligera es compatible con los artículos de prueba que carecen de cadenas ligeras, que incluye TAS266, así como los sdAb multivalentes descritos, y facilita la detección de HAVH de cualquier isotipo. Los anticuerpos terapéuticos de control con cadenas ligeras kappa o lambda se recubrieron y utilizaron como puntos de datos de referencia de unión al 100 % para normalizar los datos, y sirvieron como IgG de control para el anticuerpo secundario opuesto.
Ejemplo 4: Ensayos de hepatotoxicidad
Se utilizaron hepatocitos humanos primarios o HepRG™ (Thermo Fisher Scientific) y células hepáticas terminalmente diferenciadas derivadas de una línea celular progenitora hepática para evaluar la apoptosis de hepatocitos mediada por agonistas de DR5. Todos los ensayos se llevaron a cabo de manera similar a los ensayos de apoptosis utilizando líneas celulares de cáncer (Ejemplo 2). Se utilizó IgG humana combinada de múltiples donantes, IVIG (Gamunex®-C, Grifols), como fuente de anticuerpos dirigidos a sdAb naturales, también denominados autoanticuerpos anti-VH humanos (HAVH). En algunos experimentos, se tituló o se utilizó IVIG en una concentración fija. En algunos ensayos, se incluyó FIX-TAS266, que es una versión modificada de TAS266 que se modifica para evitar el reconocimiento mediante autoanticuerpos de HAVH. FIX-2TAS66 incluye modificaciones en Leu11 y la región de extremo C-terminal de cada uno de los cuatro sdAbs DR5 de TAS266.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido aislado que se une al menos al receptor de muerte 5 (DR5) y comprende una pluralidad de dominios de unión a DR5 (DR5BD), en donde cada DR5BD es un VHH, en donde cada VHH comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 87, 89 y 17-20.
2. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido aislado es monoespecífico.
3. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido aislado es multiespecífico o biespecífico; o en donde el polipéptido comprende al menos un segundo dominio de unión (BD2) que se une a un segundo antígeno.
4. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en donde la pluralidad de DR5BD comprende al menos dos DR5BD, al menos cuatro DR5BD, o al menos seis DR5BD.
5. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en donde cada uno de los DR5BD en la pluralidad de DR5BD comprende la misma secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 87, 89 y 17-20.
6. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en donde: el polipéptido aislado comprende un polipéptido de región Fc de inmunoglobulina; y/o la inmunoglobulina es un polipéptido de región Fc de IgG1, un polipéptido de región Fc de IgG2, un polipéptido de región Fc de IgG3 o un polipéptido de región Fc de IgG4.
7. El polipéptido aislado de la reivindicación 6, en donde el polipéptido de región Fc de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5 o 127.
8. El polipéptido aislado de la reivindicación 6, en donde el polipéptido de región Fc de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
9. El polipéptido aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el VHH es un VHH humanizado.
10. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido es tetravalente y comprende la estructura: DR5BD-enlazador-DR5BD-enlazador-bisagra-Fc, en donde el DR5BD es una secuencia de VHH humanizado.
11. El polipéptido aislado de la reivindicación 10, en donde el polipéptido comprende dos copias de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87.
12. El polipéptido aislado de la reivindicación 10, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 113 y 115.
13. El polipéptido aislado de la reivindicación 10, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 113.
14. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en donde el polipéptido es hexavalente y comprende la estructura: DR5BD-enlazador-DR5BD-enlazador-DR5BD-enlazador-bisagra-Fc, en donde el DR5BD es una secuencia de VHH humanizado.
15. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en el tratamiento de neoplasias, en donde la neoplasia es preferentemente un cáncer.
16. El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 15 para uso en la modulación de las células inmunitarias para mejorar la destrucción de un tumor.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018191438A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
CA3086653A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg Tumor necrosis factor (tnf) receptor superfamily (tnfrsf) receptor-activating antibody fusion proteins with fcyr-independent agonistic activity (tnfrsf receptor-activating antibody fusion proteins with fcyr-independ ent agonistic activity; traaffiaa)
CN110305210B (zh) * 2018-03-27 2023-02-28 信达生物制药(苏州)有限公司 新型抗体分子、其制备方法及其用途
WO2020047705A1 (zh) * 2018-09-03 2020-03-12 安菲尼生命科技有限公司 Dr5单域抗体及其用途
TW202245839A (zh) * 2021-02-19 2022-12-01 美商英伊布里克斯公司 Dr5結合多肽之調配物
KR20250004725A (ko) * 2022-04-08 2025-01-08 인히브릭스 바이오사이언스, 인크. Dr5 효능제 및 plk1 억제제 또는 cdk 억제제 조합 요법
KR20250017229A (ko) * 2022-05-23 2025-02-04 인히브릭스 바이오사이언스, 인크. Dr5 효능제 및 iap 길항제 조합 요법
WO2024069180A2 (en) 2022-09-28 2024-04-04 LiliumX Ltd. Multivalent proteins and screening methods
WO2025006846A2 (en) * 2023-06-29 2025-01-02 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-trailr2 antigen-binding proteins and uses thereof

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69131017T2 (de) * 1990-12-20 1999-07-15 Ixsys, Inc., San Diego, Calif. Optimierung von bindenden proteinen
US20020147140A1 (en) 2000-01-31 2002-10-10 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
KR20070010046A (ko) * 2004-04-06 2007-01-19 제넨테크, 인크. Ｄｒ5 항체 및 그의 용도
MX2007008017A (es) 2004-12-31 2007-09-12 Genentech Inc Polipeptidos que se ligan a br3 y usos de los mismos.
US20090075832A1 (en) 2005-02-24 2009-03-19 Cemines, Inc Compositions and Methods for Classifying Biological Samples
WO2007022416A2 (en) 2005-08-18 2007-02-22 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Single chain antibodies against beta-amyloid peptide
EA013878B1 (ru) 2005-12-06 2010-08-30 Домантис Лимитед Лиганды, имеющие специфичность связывания в отношении рецептора эпидермального фактора роста (egfr) и/или сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf), и способы их применения
CA2950465A1 (en) 2006-02-20 2007-08-30 Phylogica Limited Method of constructing and screening libraries of peptide structures
JP2008133206A (ja) 2006-11-28 2008-06-12 Yokohama City Univ 緑膿菌に対して感染防御能を誘導できる医薬組成物
NZ586357A (en) 2007-11-30 2012-10-26 Kalobios Pharmaceuticals Inc Antibodies to the pcrv antigen of pseudomonas aeruginosa
CN102112155B (zh) * 2008-06-05 2016-08-10 埃博灵克斯股份有限公司 针对病毒包膜蛋白的氨基酸序列和用于治疗病毒疾病的包含其的多肽
WO2010030182A2 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 Bac Ip B.V. Antigen-binding proteins that inhibit superantigens for the treatment of skin diseases
EP2408475B1 (en) 2009-03-18 2017-11-15 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and use thereof to induce immune responses against pseudomonas aeruginosa
WO2010115141A2 (en) 2009-04-02 2010-10-07 New York University System and uses for generating databases of protein secondary structures involved in inter-chain protein interactions
CN101717775B (zh) * 2009-11-13 2012-01-04 厦门大学 抗人死亡受体5的单链抗体基因
WO2011073180A1 (en) 2009-12-14 2011-06-23 Ablynx N.V. Single variable domain antibodies against ox40l, constructs and therapeutic use
US9120855B2 (en) * 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
WO2011134060A1 (en) 2010-04-27 2011-11-03 National Research Council Of Canada Anti-icam-1 single domain antibody and uses thereof
WO2012041800A1 (en) * 2010-09-27 2012-04-05 Morphosys Ag Anti-cd38 antibody and lenalidomide or bortezomib for the treatment of multiple myeloma and nhl
WO2012055030A1 (en) 2010-10-25 2012-05-03 National Research Council Of Canada Clostridium difficile-specific antibodies and uses thereof
CA2822684A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Intercell Austria Ag Oprf/i agents and their use in hospitalized and other patients
AU2012296961B2 (en) * 2011-08-17 2017-02-16 Glaxo Group Limited Modified proteins and peptides
SMT202000091T1 (it) 2011-10-13 2020-05-08 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidi anticorpali che antagonizzano cd40l
WO2013070565A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
JP6170940B2 (ja) 2011-12-20 2017-07-26 アダエラータ、リミテッド パートナーシップＡｄａｅｒａｔａ， Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ Ｐｃｓｋ９の阻害剤としての単一ドメイン抗体
EP2820043B1 (en) 2012-03-02 2020-01-15 Ablynx N.V. Biparatopic pseudomonas aeruginosa pcrv binding single variable domain antibodies
US20130302250A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 The University Court Of The University Of Aberdeen Single domain binding molecule
EP2684896A1 (en) 2012-07-09 2014-01-15 International-Drug-Development-Biotech Anti-DR5 family antibodies, bispecific or multivalent anti-DR5 family antibodies and methods of use thereof
CN104781277A (zh) 2012-09-13 2015-07-15 诺华股份有限公司 具有末端修饰的抗原结合分子
CN104995209A (zh) 2012-11-06 2015-10-21 米迪缪尼有限公司 使用抗假单胞菌Psl和PcrV结合分子的联合治疗
CN102924600B (zh) * 2012-11-14 2013-10-30 河南大学 死亡受体5激动性多价抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
EP3004170A1 (en) 2013-05-28 2016-04-13 VIB vzw Single domain antibodies against sod1 and their use in medicine
US10266601B2 (en) * 2014-01-10 2019-04-23 Teikyo Heisei University Recombinant obligate anaerobic gram-positive bacteria

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PL3322734T3 (pl) 2021-05-04
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