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ES2833458T3 - Compuestos coagonistas de glucagón y de GLP-1 - Google Patents

Compuestos coagonistas de glucagón y de GLP-1 Download PDF

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ES2833458T3
ES2833458T3 ES16733268T ES16733268T ES2833458T3 ES 2833458 T3 ES2833458 T3 ES 2833458T3 ES 16733268 T ES16733268 T ES 16733268T ES 16733268 T ES16733268 T ES 16733268T ES 2833458 T3 ES2833458 T3 ES 2833458T3
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acid
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lys
ser
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English (en)
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Yanyun Chen
Adam Robert MEZO
Hongchang Qu
Francisco Alcides VALENZUELA
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Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
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Abstract

Un compuesto de la siguiente fórmula: His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu- Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly en el que Xaa2 es Aib; Xaa28 es Glu o Ser; la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24, en el que el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(γ-Glu)t, en el que t es 1 o 2; y el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos coagonistas de glucagón y de GLP-1
La presente invención pertenece al campo de la medicina. Más en particular, la presente invención pertenece al campo del tratamiento de la diabetes y la obesidad y se refiere a compuestos que agonizan tanto el receptor de glucagón (Gcg) como el receptor del péptido 1 de tipo glucagón (GLP-1). Específicamente, se proporcionan análogos de oxintomodulina/glucagón con modificaciones de aminoácidos introducidas para modular la actividad tanto del receptor de Gcg como del receptor de GLP-1.
En las últimas décadas la prevalencia de la diabetes ha seguido aumentando. La diabetes mellitus de tipo 2 (DT2) es la forma más común de diabetes y representa aproximadamente el 90 % de todas las diabetes. La DT2 se caracteriza por niveles altos de glucosa en sangre provocados por la resistencia a la insulina. El tratamiento habitual de la DT2 incluye la dieta y ejercicio junto con fármacos hipoglucemiantes orales e inyectables disponibles. No obstante, muchos pacientes con Dt 2 todavía no se controlan adecuadamente. La diabetes no controlada conduce a varias afecciones que afectan la morbilidad y la mortalidad de los pacientes. La principal causa de muerte de los pacientes diabéticos son las complicaciones cardiovasculares. Uno de los principales factores de riesgo de la diabetes de tipo 2 es la obesidad. La mayoría de los pacientes con DT2 (~ 90 %) tienen sobrepeso o son obesos. Está comprobado que una disminución de la adiposidad corporal conducirá a una mejora de las comorbilidades asociadas a la obesidad, incluida la hiperglucemia y los sucesos cardiovasculares. Por tanto, para un mejor tratamiento de la enfermedad se necesitan terapias eficaces para el control de la glucosa y la reducción de peso.
Se han propuesto varios péptidos derivados del pre-proglucagón y análogos del mismo como opciones terapéuticas para el tratamiento de la Dt 2 y la obesidad, en particular, Gcg, GLP-1 y oxintomodulina (OXM). El pre-proglucagón es un polipéptido precursor de 158 aminoácidos que se procesa diferencialmente en los tejidos para formar una serie de péptidos derivados del proglucagón estructuralmente relacionados, entre ellos el Gcg, el GLP-1, péptido 2 de tipo glucagón (GLP-2) y oxintomodulina (OXM). Estas moléculas están implicadas en una amplia diversidad de funciones fisiológicas, entre ellas la homeostasis de la glucosa, la secreción de insulina, el vaciamiento gástrico y el crecimiento intestinal, así como la regulación de la ingesta de alimentos.
Gcg es un péptido de 29 aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 53 a 81 del preproglucagón. OXM es un péptido de 37 aminoácidos y está compuesto por la secuencia completa de 29 aminoácidos de Gcg con una extensión de un octapéptido carboxi-terminal (aminoácidos 82 a 89 del pre-proglucagón y denominado "péptido intermedio 1" o IP-1). El principal fragmento biológicamente activo del GLP-1 (GLP-17-36) se produce como un péptido amidado C-terminal de 30 aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 98 a 127 del pre-proglucagón.
El Gcg ayuda a mantener el nivel de glucosa en sangre uniéndose a los receptores de Gcg en los hepatocitos, haciendo que el hígado libere glucosa - almacenada en forma de glucógeno - a través de la glucogenólisis. A medida que reservas se agotan, El Gcg estimula al hígado para que sintetice glucosa adicional mediante gluconeogénesis. Esta glucosa se libera en el torrente sanguíneo, previniendo el desarrollo de hipoglucemia.
El GLP-1 tiene distintas actividades biológicas en comparación con el Gcg. Sus acciones incluyen la estimulación de la síntesis y secreción de insulina, la inhibición de la secreción de Gcg y la inhibición de la ingesta de alimentos. Se ha demostrado que el GLP-1 reduce la hiperglucemia en diabéticos. Se han aprobado varios agonistas de GLP-1 para su uso en el tratamiento de la DT2 en seres humanos, entre ellos exenatida, liraglutida, lixisenatida, albiglutida y dulaglutida. Dichos agonistas de GLP-1 son eficaces en el control glucémico con efectos favorables sobre el peso, sin riesgo de hipoglucemia. Sin embargo, la pérdida de peso es modesta debido a los efectos secundarios gastrointestinales dependientes de la dosis.
La OXM se libera junto con el GLP-1 de las células L del intestino delgado en proporción a la ingestión de nutrientes. La OXM activa los receptores de Gcg y de GLP-1, con una potencia ligeramente mayor para el receptor de Gcg sobre el receptor de GLP-1. Es menos potente que el Gcg y el GLP-1 nativos en sus respectivos receptores. El Gcg humano también tiene la capacidad de activar ambos receptores, aunque con una fuerte preferencia por el receptor de Gcg sobre el receptor de GLP-1. GLP-1 no tiene la capacidad de activar los receptores de Gcg. La OXM está implicada en la regulación de la ingesta de alimentos y del peso corporal. Se ha demostrado que suprime el apetito e inhibe la ingesta de alimentos en los seres humanos. En un estudio de 4 semanas con sujetos con sobrepeso y obesidad, la administración subcutánea preprandial de OXM tres veces al día produjo una pérdida de peso de 2,3 kg en comparación con 0,5 kg en el grupo de placebo. En este ensayo, las náuseas, el efecto secundario más común asociado con la terapia basada en GLP-1 (como exenatida y liraglutida), fueron menos frecuente. En otro estudio más corto, se demostró que la OXM disminuye la ingesta calórica y aumenta el gasto calórico relacionado con la actividad en sujetos con sobrepeso y obesidad.
Estos datos sugieren que la OXM tiene el potencial de ser un agente contra la diabetes/obesidad bien tolerado. La OXM, sin embargo, presenta varios desafíos para el desarrollo de un agente terapéutico comercialmente viable. La OXM endógena se degrada rápidamente in vivo por la dipeptidil peptidasa IV y otras peptidasas, así como está sometida a un rápido aclaramiento renal debido a su pequeño tamaño. Por lo tanto, es conveniente identificar péptidos que activen los receptores de Gcg y de GLP-1 con una estabilidad metabólica mejorada y una tasa de aclaramiento reducida.
Se desvelan en la técnica péptidos de OXM con sustituciones de aminoácidos para mejorar la estabilidad y con modificaciones adicionales para ralentizar el aclaramiento, tales como PEGilación o lipidación. Se ha establecido que otros péptidos se unen y activan tanto el receptor de Gcg como al receptor de GLP-1 y suprimen la ganancia de peso corporal (ver, por ejemplo, los documentos WO 2011/075393 A2 y WO 2012/177444 A2).
A pesar de la disponibilidad de diversos péptidos que agonizan tanto los receptores de Gcg como de GLP-1, sigue existiendo la necesidad de compuestos más potentes, estables, de acción prolongada y/o bien tolerados que tengan una relación de actividad del receptor de Gcg (Gcg-R)/receptor de GLP-1 (GLP-1-R) que se haya optimizado de tal manera que la potencia y la actividad insulinotrópica de los compuestos proporcionen tratamientos eficaces para la diabetes, preferentemente DT2 y trastornos relacionados. En particular, sigue existiendo la necesidad de compuestos con una relación equilibrada de actividad coagonista de Gcg-R/GLP-1-R que reduzcan el peso corporal. Además, sigue existiendo la necesidad de proporcionar compuestos con una proporción equilibrada de actividad coagonista de Gcg-R/GLP-1-R que sustente la dosificación potencial diaria, quincenal, una vez a la semana o mensual en seres humanos. Por consiguiente, la presente invención busca proporcionar tratamientos eficaces para la diabetes, la obesidad, esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD, forma siglada de non-alcoholic fatty liver disease) y/o esteatohepatitis no alcohólica (NASH, forma siglada de non-alcoholic steatohepatitis).
En un aspecto, la presente solicitud proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (I):
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en el que
Xaa2 es Aib;
Xaa28 es Glu o Ser;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24, en el que el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t , en el que t es 1 o 2; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto, la presente solicitud proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (I):
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly en la que
Xaa2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24, en el que el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t , en el que t es 1 o 2; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto más, la presente solicitud proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (I):
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly en la que
Xaa2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24, en el que el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t , en el que t es 1 o 2; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, el engarce se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I:
H-{NH-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]m-O-(CH2)p-CO}n-OH (I)
en el que m es cualquier número entero de 1 a 12, n es cualquier número entero de 1 a 12, y p es 1 o 2;
(b) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), histidina (His), lisina (Lys), serina (Ser), treonina (Thr), citrulina (Cit), ornitina (Orn), sarcosina (Sar), glicina (Gly), ácido Y-amino butírico (Y-Abu) y ácido Y-glutámico (Y-Glu);
(c) un dipéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala, p-Ala-p-Ala, Glu-Glu, Gly-Gly, Leu-Leu, Ser-Ser, Thr-Thr, Y-Glu-Y-Glu, Glu-Y-Glu, Y-Glu-Glu, Y-Abu-Y-Abu, ácido 6-amino hexanoico-ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-amino valérico-ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanoico-ácido 7-amino heptanoico y ácido 8-amino octanoico-ácido 8-amino octanoico;
(d) un tripéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala-Ala, p-Ala-p-Ala-p-Ala, Glu-Glu-Glu, y-GIu-y-GIu-Y-Glu, Glu-Y-Glu-Y-Glu, Y-Glu-Y-Glu-Glu, Y-Glu-Glu-Y-Glu, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Glu, Glu-Gly-Gly, Gly-Glu-Gly, Gly-Gly-Y-Glu, Y-Glu-Gly-Gly, Gly-Y-Glu-Gly, Leu-Leu-Leu y Y-Abu-Y-Abu-Y-Abu; (e) un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (Gly-Gly-Ser)q (Gly-Gly-Gly-Ser)r y (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)r, (ácido 6-amino hexanoico)s, (ácido 5-amino valérico)s, (ácido 7-amino heptanoico)s y (ácido 8-amino octanoico)s , en que q es cualquier número entero de 2 a 5, r es cualquier número entero de 1 a 3 y s es cualquier número entero de 4 a 15; y
(f) un engarce conjugado en el que un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I como se define en (a) está conjugado con:
(i) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr, Cit, Orn, Sar, Gly, Y-Abu y Y-Glu;
(ii) un dipéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala, p-Ala-p-Ala, Glu-Glu, Gly-Gly, Leu-Leu, Ser-Ser, Thr-Thr, Y-Glu-Y-Glu, Glu-Y-Glu, Y-Glu-Glu, Y-Abu-Y-Abu, ácido 6-amino hexanoico-ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-amino valérico-ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanoico-ácido 7-amino heptanoico y ácido 8-amino octanoico-ácido 8-amino octanoico;
(iii) un tripéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala-Ala, p-Ala-p-Ala-p-Ala, Glu-Glu-Glu, y-GIu-y-Glu-Y-Glu, Glu-Y-Glu-Y-Glu, Y-Glu-Y-Glu-Glu, Y-Glu-Glu-Y-Glu, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Glu, Glu-Gly-Gly, Gly-Glu-Gly, Gly-Gly-Y-Glu, Y-Glu-Gly-Gly, Gly-Y-Glu-Gly, Leu-Leu-Leu y Y-Abu-Y-Abu-Y-Abu; o
(iv) un polipéptido seleccionado del grupo se selecciona del grupo que consiste en (Gly-Gly-Ser)q (Gly-Gly-Gly-Ser)r and (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)r, (ácido 6-amino hexanoico)s, (ácido 5-amino valérico)s, (ácido 7-amino heptanoico)s y (ácido 8-amino octanoico)s, en que q es cualquier número entero de 2 a 5, r es cualquier número entero de 1 a 3 y s es cualquier número entero de 4 a 15.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, el engarce es un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I:
H-{NH-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]m-O-(CH2)p-CO}n-OH (I)
en el que m es cualquier número entero de 1 a 12, n es cualquier número entero de 1 a 12, y p es 1 o 2.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, n es 1,2, 3, 4, 5 o 6 y m es 1, y p es 1 para el carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, n es 2, m es 1 y p es 1 para el carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, el engarce es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr, Cit, Orn, Sar, Gly, Y-Abu y y-GIu.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el aminoácido es y-GIu.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, el engarce es un dipéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala, p-Ala-p-Ala, Glu-Glu, Gly-Gly, Leu-Leu, Ser-Ser, Thr-Thr, Y-Glu-Y-Glu, Glu-Y-Glu, Y-Glu-Glu, Y-Abu-Y-Abu, ácido 6-amino hexanoico-ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-amino valérico-ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanoico-ácido 7-amino heptanoico y ácido 8-amino octanoico-ácido 8-amino octanoico.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el dipéptido es y-GIu-y-GIu.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, el engarce es un tripéptido, se selecciona del grupo que consiste en Ala-Ala-Ala, p-Ala-p-Ala-p-Ala, Glu-Glu-Glu, y-GIu-y-GIu-y-GIu, Glu-Y-Glu-Y-Glu, Y-Glu-Y-Glu-Glu, Y-Glu-Glu-Y-Glu, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Glu, Glu-Gly-Gly, Gly-Glu-Gly, Gly-Gly-Y-Glu, Y-Glu-Gly-Gly, Gly-Y-Glu-Gly, Leu-Leu-Leu y Y-Abu-Y-Abu-Y-Abu.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, el engarce es un polipéptido, se selecciona del grupo que consiste en (Gly-Gly-Ser)q (Gly-Gly-Gly-Ser)r and (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)r, (ácido 6-amino hexanoico)s, (ácido 5-amino valérico)s, (ácido 7-amino heptanoico)s y (ácido 8-amino octanoico)s , en que q es cualquier número entero de 2 a 5, r es cualquier número entero de 1 a 3 y s es cualquier número entero de 4 a 15.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, el engarce es un engarce conjugado, en el que un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I:
H-{NH-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]m-O-(CH2)p-CO}n-OH (I)
en el que m es cualquier número entero de 1 a 12, n es cualquier número entero de 1 a 12 y p es 1 o 2, se conjuga con:
(i) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys Ser, Thr, Cit, Orn, Sar, Gly, Y-Abu y y-GIu;
(ii) un dipéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala, p-Ala-p-Ala, Glu-Glu, Gly-Gly, Leu-Leu, Ser-Ser, Thr-Thr, y-GIu-y-GIu, Glu-Y-Glu, Y-Glu-Glu, Y-Abu-Y-Abu, ácido 6-amino hexanoico-ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-amino valérico-ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanoico-ácido 7-amino heptanoico y ácido 8-amino octanoico-ácido 8-amino octanoico;
(iii) un tripéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala-Ala, p-Ala-p-Ala-p-Ala, Glu-Glu-Glu, y-GIu-y-GIu-Y-Glu, Glu-Y-Glu-Y-Glu, Y-Glu-Y-Glu-Glu, Y-Glu-Glu-Y-Glu, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Glu, Glu-Gly-Gly, Gly-Glu-Gly, Gly-Gly-Y-Glu, Y-Glu-Gly-Gly, Gly-Y-Glu-Gly, Leu-Leu-Leu y Y-Abu-Y-Abu-Y-Abu; o
(iv) un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (Gly-Gly-Ser)q (Gly-Gly-Gly-Ser)r y (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)r, (ácido 6-amino hexanoico)s, (ácido 5-amino valérico)s, (ácido 7-amino heptanoico)s y (ácido 8-amino octanoico)s , en que q es cualquier número entero de 2 a 5, r es cualquier número entero de 1 a 3 y s es cualquier número entero de 4 a 15.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, n es 1,2, 3, 4, 5 o 6 y m es 1, y p es 1 para carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, n es 2, m es 1 y p es 1 para el carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el aminoácido es y-GIu.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el dipéptido es y-GIu-y-GIu.
En un aspecto preferente de los compuestos de la presente invención, el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t , en el que t es 1 o 2.
Preferentemente, t es 1.
Además, preferentemente, t es 2.
En un aspecto aún más preferente de los compuestos de la presente invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, el ácido graso C14-C24 es un monoácido saturado o un diácido saturado.
Preferentemente, el ácido graso es un monoácido saturado o un diácido saturado seleccionado del grupo que consiste en ácido mirístico (ácido tetradecanoico) (monoácido C14), ácido tetradecanodioico (diácido C14), ácido palmítico (ácido hexadecanoico) (monoácido C16), ácido hexadecanodioico (diácido C16), ácido margárico (ácido heptadecanoico) (monoácido C17), ácido heptadecanodioico (diácido C17), ácido esteárico (ácido octadecanoico) (monoácido C18), ácido octadecanodioico (diácido C18), ácido nonadecílico (ácido nonadecanoico) (monoácido C19), ácido nonadecanodioico (diácido C19), ácido araquídico (ácido eicosanoico) (monoácido C20), ácido eicosanodioico (diácido C20), ácido heneicosílico (ácido heneicosanoico) (monoácido C21), ácido heneicosanodioico (diácido C21), ácido behénico (ácido docosanoico) (C22), ácido docosanodioico (diácido C22), ácido lignocérico (ácido tetracosanoico) (monoácido C24) y ácido tetracosanodioico (diácido C24).
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido mirístico
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido tetradecanodioico.
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido palmítico.
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido hexadecanodioico.
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido esteárico.
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido octadecanodioico.
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido nonadecanodioico.
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido araquídico.
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido eicosanodioico.
Aún más preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido docosanodioico.
En un aspecto aún más preferente de los compuestos de la presente invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, el aminoácido C-terminal está amidado.
En un aspecto adicional, la presente solicitud proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (I):
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)-CO-(CH2)i6 CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado (SEQ ID NO: 5), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto adicional, la presente solicitud proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (I):
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)-CO-(CH2)i8 CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado (SEQ ID NO: 6);
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto adicional, la presente solicitud proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (I):
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)2-CO-(CH2)i6 CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado (SEQ ID NO: 7);
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto adicional, la presente solicitud proporciona un compuesto de la siguiente fórmula (I):
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)2-CO-(CH2)i8 CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado (SEQ ID NO: 8);
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se desvela una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, y otros ingredientes terapéuticos.
Además, en el presente documento de desvela un procedimiento para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Aún más, en el presente documento se desvela un procedimiento de tratamiento de la obesidad en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Aún más, en el presente documento se desvela un procedimiento de tratamiento de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD) en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Aún más, en el presente documento se desvela un procedimiento de tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Aún más, en el presente documento se desvela un procedimiento para inducir una pérdida de peso no terapéutica en un sujeto que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Aún en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para su uso en terapia.
Aún en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para su uso en el tratamiento de la diabetes de tipo 2.
Aún en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para su uso en el tratamiento de la obesidad.
Aún en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para su uso en el tratamiento de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD).
Aún en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para su uso en el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
En el presente documento se desvela el uso de un compuesto de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 2.
En el presente documento se desvela además el uso de un compuesto de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad.
Aún más, en el presente documento se desvela el uso de un compuesto de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD).
Aún más, en el presente documento se desvela el uso de un compuesto de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
Aún en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un compuesto intermedio de la siguiente fórmula: His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib;
Xaa28 es Glu o Ser (SEQ ID NO: 9); y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Preferentemente, la presente invención proporciona un compuesto intermedio de la siguiente fórmula:
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado (SEQ ID NO: 10);
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Además, preferentemente, la presente invención proporciona un compuesto intermedio de la siguiente fórmula: His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado (SEQ ID NO: 11),
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Aún en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para la fabricación de un compuesto de la siguiente fórmula:
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib; y
Xaa28 es Glu o Ser;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24, en el que el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t , en el que t es 1 o 2; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de:
(i) modificar un compuesto intermedio de la siguiente fórmula:
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa2 es Aib;
Xaa28 es Glu o Ser; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado (SEQ ID NO: 9), mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys en la posición 20 del compuesto intermedio con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce, en el que el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t, en el que t es 1 o 2.
La Lys en la posición 20 del compuesto Intermedio se modifica mediante conjugación con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24.
En el presente documento se desvela un compuesto producido mediante el procedimiento descrito anteriormente.
Los compuestos de la presente invención tienen la capacidad de unirse y activar tanto el receptor de GLP-1 como el receptor de Gcg. Los compuestos de la presente invención tienen la capacidad de provocar una reducción en la ingesta de alimentos en sujetos obesos y con sobrepeso. Los compuestos de la invención tienen potencial para proporcionar un efecto de pérdida de peso superior frente a la OXM humana de tipo silvestre.
Los compuestos de la invención pueden mejorar la tolerancia a la glucosa y el lipidograma en sujetos con DT2 y/o alteraciones metabólicas relacionadas, y pueden hacerlo de forma más eficaz que la OXM humana de tipo silvestre
Una ventaja particular de los compuestos de la presente invención es que la frecuencia de los efectos secundarios, tales como náuseas, que se asocia comúnmente con la terapia con g LP-1, tal como exenatida y liraglutida, puede reducirse o eliminarse. Por tanto, los compuestos de la presente invención pueden tener efectos secundarios reducidos en comparación con la terapia con GLP-1.
Los compuestos de la presente invención comprenden un polipéptido conjugado con un ácido graso. Los ácidos grasos, a través de sus motivos de unión a la albúmina, pueden mejorar la farmacocinética de un péptido al extender la semivida plasmática y reducir la tasa de aclaramiento. Si bien se esperaría que los compuestos de la presente invención presentaran un perfil farmacocinético mejorado con respecto a la OXM humana de tipo silvestre, la magnitud de la mejora no es predecible. Los inventores han descubierto que la longitud, la composición y la posición del ácido graso y, opcionalmente, el engarce, en los compuestos de la presente invención, da como resultado compuestos con un perfil farmacocinético conveniente que sustente la dosificación diaria, quincenal, una vez a la semana o mensual.
Además del perfil farmacocinético mejorado, los presentes inventores han descubierto además que la longitud, la composición y la posición del ácido graso y, opcionalmente, el engarce, son cruciales para la optimización de la relación de la actividad coagonista de Gcg-R/GLP-1-R.
La OXM humana de tipo silvestre tiene eficacia y potencia completas en el GLP-1-R humano y el Gcg-R humano. La secuencia de aminoácidos de la OXM humana de tipo silvestre se proporciona a continuación: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (SEQ ID NO: 1)
Determinados compuestos de la presente invención tienen una relación equilibrada de actividad coagonista de Gcg-R/GLP-1-R. Actividad equilibrada de Gcg y GLP-1, como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto que tiene una afinidad por los receptores de Gcg y de GLP-1 en un ensayo de unión in vitro que está cercana a 1:1, tal como GLP-1/Gcg de 1:1, GLP-1/Gcg de 2:1, GLP-1/Gcg de 3:2, GLP-1/Gcg de 1:2 o GLP-1/Gcg de 2:3. La investigación realizada por los inventores reveló que la longitud, la composición y la posición del ácido graso son cruciales para lograr la relación equilibrada de actividad coagonista de Gcg-R/GLP-1-R, que es una característica de los compuestos de la presente invención, además de afectar la semivida plasmática, la estabilidad física, la solubilidad y la estabilidad in vivo de los compuestos de la presente invención.
Si bien la conjugación de un péptido con un ácido graso tiene ventajas con respecto a un perfil farmacocinético mejorado y/o una relación equilibrada de actividad coagonista de Gcg-R/GLP-1-R, también se esperaría que el compuesto pueda perder actividad ya que existe la posibilidad de interferencia con la interfaz de unión del receptor de Gcg o del receptor de GLP-1. Se ha descubierto, sin embargo, que la conjugación del resto de lisina en la posición 20 con un ácido graso conserva la actividad in vitro e in vivo en ambos receptores en mayor medida que cuando se conjugan con un ácido graso los aminoácidos de otras posiciones.
Adicionalmente, varias sustituciones de aminoácidos con respecto a la OXM humana de tipo silvestre en los compuestos reivindicados tienen la capacidad de potenciar la potencia en el Gcg-R y/o GLP-1-R, compensando de este modo la pérdida de potencia debida a la conjugación con el ácido graso al tiempo que se mantiene una relación adecuada de actividad coagonista de Gcg-R/GLP-1-R. Es importante señalar que una sustitución de un resto de aminoácido en una proteína particular puede afectar las características de las proteínas en su conjunto y que el efecto global puede ser beneficioso o perjudicial para la potencia farmacológica y/o la estabilidad farmacéutica. Determinadas sustituciones de aminoácidos pueden aumentar la potencia pero tienen un efecto perjudicial sobre la estabilidad de la molécula y viceversa. Las sustituciones de aminoácidos en los compuestos de la presente invención con respecto a la OXM humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) incluyen S2Aib, S16E, R17K, R18K, Q20K, D21E, Q24E, M27L, N28E orN28S y T29G. Además, la secuencia C-terminal de la OXM, KRNRNNIA, se ha reemplazado por una secuencia de terminal C GPSSG.
La sustitución de S2Aib protege al péptido de la degradación por peptidasas, en particular, la dipeptidil peptidasa IV. Las sustituciones S16E, R17K, R18K y Q20K tienen la capacidad de mejorar la potencia de los compuestos de la invención en ensayos in vitro y en modelos animales in vivo. Las sustituciones D21E y Q24E tienen la capacidad de mejorar la estabilidad de los compuestos de la invención y de modular la actividad in vitro. La sustitución M27L tiene la capacidad de proteger al péptido de la oxidación del resto de metionina. La sustitución N28E tiene la capacidad de mejorar la solubilidad de los compuestos que comprenden la sustitución. La sustitución N28S también tiene la capacidad de mejorar la solubilidad de los compuestos que comprenden esa sustitución, pero no en la misma medida que la sustitución N28E. Sin embargo, la solubilidad de los compuestos que comprenden una sustitución N28S puede mejorarse mediante la selección de un engarce apropiado. La sustitución del resto de asparagina en la posición 28 evita la posibilidad de que se produzca una desamidación en esta posición.
La eliminación de los restos de la secuencia C-terminal de la OXM, KRNRNNIA, puede mejorar la solubilidad, lo que puede atribuirse a la eliminación de los restos de arginina. Los inventores evaluaron compuestos que (i) no tienen secuencia C-terminal, (ii) compuestos con una secuencia C-terminal GPSSG y (iii) compuestos con una secuencia C-terminal GPSSGAPPPS. Sorprendentemente, se descubrió que determinados compuestos con una secuencia C-terminal de GPSSG presentaban una potencia in vivo mejorada en modelos animales con respecto a la OXM humana de tipo silvestre, a compuestos sin secuencia C-terminal y a compuestos con una secuencia C-terminal GPSSGAPPPS. La secuencia C-terminal GPSSG también mejoró la estabilidad y la solubilidad de los compuestos de acuerdo con la invención con respecto a la OXM humana de tipo silvestre y a compuestos sin secuencia C-terminal.
Por tanto, los compuestos de la presente invención contienen sustituciones de aminoácidos que, por separada o juntas, no solo tienen la capacidad de mejorar la potencia, sino también tienen la capacidad de proporcionar características de estabilidad física y de solubilidad mejoradas y una estabilidad in vivo aumentada.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el ácido graso C14-C24 está conjugado con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral de lisina a través de un engarce, en el que el engarce se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I:
H-{NH-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]m-O-(CH2)p-CO}n-OH (I)
en el que m es cualquier número entero de 1 a 12, n es cualquier número entero de 1 a 12, y p es 1 o 2;
(b) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Pro, Ser, Thr, Cit, Orn, Sar, Gly, Y-Abu y y-GIu;
(c) un dipéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala, p-Ala-p-Ala, Glu-Glu, Gly-Gly, Leu-Leu, Pro-Pro, Ser-Ser, Thr-Thr, y-GIu-y-GIu, Glu-Y-Glu, Y-Glu-Glu, Y-Abu-Y-Abu, ácido 6-amino hexanoico-ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-amino valérico-ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanoico-ácido 7-amino heptanoico y ácido 8-amino octanoico-ácido 8-amino octanoico;
(d) un tripéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala-Ala, p-Ala-p-Ala-p-Ala, Glu-Glu-Glu, y-GIu-y-GIu-Y-Glu, Glu-Y-Glu-Y-Glu, Y-Glu-Y-Glu-Glu, Y-Glu-Glu-Y-Glu, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Glu, Glu-Gly-Gly, Gly-Glu-Gly, Gly-Gly-Y-Glu, Y-Glu-Gly-Gly, Gly-Y-Glu-Gly, Leu-Leu-Leu, Pro-Pro-Pro y Y-Abu-Y-Abu-Y-Abu;
(e) un polipéptido seleccionado del grupo se selecciona del grupo que consiste en (Gly-Gly-Ser)q (Gly-Gly-Gly-Ser)r y (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)r, (ácido 6-amino hexanoico)s , (ácido 5-amino valérico)s , (ácido 7-amino heptanoico)s y (ácido 8-amino octanoico)s, en que q es cualquier número entero de 2 a 5, r es cualquier número entero de 1 a 3 y s es cualquier número entero de 4 a 15; y
(f) un engarce conjugado en el que un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I como se define en (a) está conjugado con:
(i) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Pro, Ser, Thr, Cit, Orn, Sar, Gly, Y-Abu y y-GIu;
(ii) un dipéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala, p-Ala-p-Ala, Glu-Glu, Gly-Gly, Leu-Leu, Pro­ Pro, Ser-Ser, Thr-Thr, y-GIu-y-GIu, Glu-Y-Glu, Y-Glu-Glu, Y-Abu-Y-Abu, ácido 6-amino hexanoico-ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-amino valérico-ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanoico-ácido 7-amino heptanoico y ácido 8-amino octanoico-ácido 8-amino octanoico;
(iii) un tripéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala-Ala, p-Ala-p-Ala-p-Ala, Glu-Glu-Glu, y-GIu-y-Glu-Y-Glu, Glu-Y-Glu-Y-Glu, Y-Glu-Y-Glu-Glu, Y-Glu-Glu-Y-Glu, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Glu, Glu-Gly-Gly, Gly-Glu-Gly, Gly-Gly-Y-Glu, Y-Glu-Gly-Gly, Gly-Y-Glu-Gly, Leu-Leu-Leu, Pro-Pro-Pro y Y-Abu-Y-Abu-Y-Abu; o
(iv) un polipéptido seleccionado del grupo se selecciona del grupo que consiste en (Gly-Gly-Ser)q (Gly-Gly-Gly-Ser)r and (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)r, (ácido 6-amino hexanoico)s, (ácido 5-amino valérico)s, (ácido 7-amino heptanoico)s y (ácido 8-amino octanoico)s, en que q es cualquier número entero de 2 a 5, r es cualquier número entero de 1 a 3 y s es cualquier número entero de 4 a 15.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce es un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I, o un engarce conjugado en el que un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I está conjugado con un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido o un polipéptido, como se define anteriormente, en la que n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, m es 1 y p es 1.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce es un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I, o un engarce conjugado en el que un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I está conjugado con un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido o un polipéptido, como se define anteriormente, en la que n es 2, m es 1 y p es 1.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce de carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I, o el engarce conjugado en el que un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I está conjugado con un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido o un polipéptido, como se define anteriormente, comprende una pequeña fracción de polietilenglicol (PEG) que comprende una estructura [-O-CH2-CH2-]m, en la que m es cualquier número entero de 1 a 12, (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12). Estos pequeños PEG se denominan en el presente documento "mini-PEG". En aspectos preferentes, el mini-PEG tiene una estructura de Fórmula I:
H-{NH-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]m-O-(CH2)p-CO}n-OH (I)
en el que m es cualquier número entero de 1 a 12, n es cualquier número entero de 1 a 12 y p es 1 o 2. Preferentemente, el mini-PEG tiene una estructura de Fórmula I, en la que n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, m es 1 y p es 1. Además, preferentemente, el miniPEG tiene una estructura de Fórmula I en la que n es 1, m es 1 y p es 1. Los reactivos adecuados para su uso en la acilación de un aminoácido con un mini-PEG están disponibles en el mercado de empresas proveedoras, tales como Peptides International (Louisville, KY) y ChemPep, Inc. (Wellington, FL). Además, en el presente documento se describen técnicas adecuadas para acilar un aminoácido con un mini-PEG (véanse los Ejemplos 1-4).
El mini-PEG de Fórmula I es un miniPEG funcionalizado que comprende un grupo funcional amina y un grupo funcional carboxilo. El grupo funcional carboxilo reacciona con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral de lisina para formar un enlace amida. El grupo funcional amina reacciona con un grupo carboxilo del ácido graso. La lisina en la posición 20 del péptido de la SEQ ID NO: 2 se conjuga así con un ácido graso C14-C24 a través del mini-PEG de Fórmula I.
Como alternativa, para determinados compuestos desvelados en el presente documento, cuando el mini-PEG de Fórmula I es parte de un engarce conjugado (es decir, un mini-PEG de Fórmula I conjugado con un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido o un polipéptido, como se define anteriormente), el grupo funcional amina del mini-PEG de Fórmula I reacciona con un grupo funcional del aminoácido, dipéptido, tripéptido o polipéptido. Otro grupo funcional del aminoácido, dipéptido, tripéptido o polipéptido reacciona con un grupo carboxilo del ácido graso. La lisina en la posición 20 del péptido de la SEQ ID NO: 2 se conjuga así con el ácido graso C14-C24 a través del engarce conjugado como se define anteriormente.
La naturaleza hidrófila del mini-PEG de Fórmula I sirve para aumentar la solubilidad de los compuestos de la invención que comprenden un engarce que comprende un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I o un engarce conjugado en el que un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I se conjuga con un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido o un polipéptido, como se ha definido.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, los engarces preferentes que comprenden un mini-PEG de Fórmula I incluyen, pero sin limitación, ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetilo)2 y ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce también puede ser un único aminoácido posicionado entre el grupo épsilon-amino de la cadena lateral de lisina y el ácido graso C14-C24. En algunos aspectos preferentes, el aminoácido es un aminoácido hidrófilo. Los aminoácidos adecuados incluyen Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Pro, Ser, Thr, Cit, Orn, Sar, Gly, Y-Abu y Y-Glu.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el aminoácido es Y-Glu.
Como alternativa, para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce es un dipéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala, p-Ala-p-Ala, Glu-Glu, Gly-Gly, Leu-Leu, Pro-Pro, Ser-Ser, Thr-Thr, Y-Glu-Y-Glu, Glu-Y-Glu, Y-Glu-Glu, Y-Abu-Y-Abu, ácido 6-amino hexanoico-ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-amino valérico-ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanoico-ácido 7-amino heptanoico y ácido 8-amino octanoico-ácido 8-amino octanoico.
Además, alternativamente, para determinados compuestos desvelados en el presente documento, cada aminoácido del dipéptido puede ser igual o diferente del otro aminoácido del dipéptido, y puede seleccionarse independientemente del grupo que consiste en Ala, p-Ala, Glu, Gly, Leu, Pro, Ser, Thr, Y-Glu, Y-Abu, ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanoico y ácido 8-amino octanoico.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce es Y-Glu-Y-Glu.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce es un tripéptido en el que los aminoácidos del tripéptido se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: Ala, p-Ala, Glu, Gly, Leu, Pro, Ser, Thr, ácido Y-amino butírico (Y-Abu), ácido Y-glutámico (Y-Glu), ácido 6-amino hexanoico, ácido 5-amino valérico, ácido 7-amino heptanoico, y ácido 8-amino octanoico.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce es un tripéptido seleccionado del grupo que consiste en Ala-Ala-Ala, p-Ala-p-Ala-p-Ala, Glu-Glu-Glu, Y-Glu-Y-Glu-Y-Glu, Glu-Y-Glu-Y-Glu, Y-Glu-Y-Glu-Glu, Y-Glu-Glu-Y-Glu, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Ser-Gly, Gly-Gly-Glu, Glu-Gly-Gly, Gly-Glu-Gly, Gly-Gly-Y-Glu, Y-Glu-Gly-Gly, Gly-Y-Glu-Gly, Leu-Leu-Leu, Pro-Pro-Pro y Y-Abu-Y-Abu-Y-Abu.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (Gly-Gly-Ser)q (Gly-Gly-Gly-Ser)r y (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)r, (ácido 6-amino hexanoico)s , (ácido 5-amino valérico)s, (ácido 7-amino heptanoico)s y (ácido 8-amino octanoico)s , en que q es cualquier número entero de 2 a 5, r es cualquier número entero de 1 a 3 y s es cualquier número entero de 4 a 15.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, el engarce es un engarce conjugado en el que un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I:
H-{NH-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]m-O-(CH2)p-CO}n-OH (I)
en el que m es cualquier número entero de 1 a 12, n es cualquier número entero de 1 a 12 y p es 1 o 2, está conjugado con un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido o un polipéptido, como se define anteriormente.
En un aspecto preferente, el carboxilato de amino polietilenglicol del engarce conjugado es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetilo)2.
En un aspecto más preferente, el engarce comprende ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t (también denominado (AEEA)2--(Y-Glu)t ), en el que t es 1 o 2. El ácido graso y el ácido gamma-glutámico en el engarce actúan como aglutinantes de albúmina y proporcionan el potencial para generar compuestos de acción prolongada in vivo. En los aspectos más preferentes, los compuestos de la presente invención comprenden una lisina en la posición 20 que está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de la lisina con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t-CO-(CH2)d-CO2H, en el que t es 1 o 2 y d es 16 o 18.
Como se muestra en las estructuras químicas del Ejemplo 1-4, la primera unidad de [2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetilo está unida al grupo épsilon-amino de la cadena lateral de la lisina. La segunda unidad de [2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetilo se une luego al grupo amino de la primera unidad de [2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetilo. A continuación, la primera unidad de Y-Glu está unida al grupo amino de la segunda unidad de [2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetilo a través del grupo Y-carboxilo de la cadena lateral. Cuando t = 2, la segunda unidad de Y-Glu está unida al grupo a-amino de la primera unidad de Y-Glu a través del grupo Y-carboxilo de la cadena lateral. Finalmente, el ácido graso está unido al grupo aamino de la primera (cuando t = 1) o segunda (cuando t = 2) unidad de Y-Glu.
Para determinados compuestos desvelados en el presente documento, cuando el engarce es un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido, o un polipéptido, como se define anteriormente, es preferente que el aminoácido, o al menos un aminoácido del dipéptido, tripéptido o polipéptido, sea un aminoácido hidrófilo.
De forma similar, para determinados compuestos desvelados en el presente documento, cuando el engarce es un engarce conjugado en el que un carboxilato de amino polietilenglicol de Fórmula I:
H-{NH-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]m-O-(CH2)p-CO}n-OH (II)
en el que m es cualquier número entero de 1 a 12, n es cualquier número entero de 1 a 12, y p es 1 o 2; está conjugado con un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido o un polipéptido, como se define anteriormente, es preferente que el aminoácido/al menos un aminoácido del aminoácido/dipéptido/tripéptido/polipéptido sea un aminoácido hidrófilo.
Los aminoácidos adecuados incluyen, pero sin limitación, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Pro, Ser, Thr, Cit, Orn, Sar, Gly, Y-Abu y Y-Glu.
Los presentes inventores descubrieron que la presencia de uno o más aminoácidos hidrófilos en el engarce compensa una pérdida de solubilidad que normalmente se puede esperar que se produzca como consecuencia de una sustitución de aminoácido en el péptido de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, en la realización en la que el engarce comprende ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t , en el que t es 1 o 2, Xaa28 del péptido de la SEQ ID NO: 1 puede ser serina o ácido glutámico. La selección de ácido glutámico en la posición 28 del péptido de la SEQ ID NO: 2 mejora la solubilidad de tales compuestos. Se podría esperar que la selección de serina en la posición 28 del péptido de la SEQ ID NO: 2 redujera la solubilidad de tales compuestos con respecto a los compuestos que difieren solo por tener un resto de ácido glutámico en la posición 28. Sin embargo, un segundo aminoácido y-GIu en el engarce descrito anteriormente (es decir, t es 2) compensa esta reducción esperada en la solubilidad.
Los compuestos de la presente invención utilizan un ácido graso C14-C24 conjugado químicamente con el grupo épsilon amino de una cadena lateral de lisina mediante un enlace directo o mediante un engarce. La expresión "ácido graso C14-C24" como se usa en el presente documento significa un ácido carboxílico con entre 14 y 24 átomos de carbono. El ácido graso C14-C24 adecuado para su uso en el presente documento puede ser un monoácido saturado o un diácido saturado. Por "saturado" se entiende que el ácido graso no contiene dobles o triples enlaces carbonocarbono.
Los ejemplos de ácidos grasos C14-C24 saturados específicos que son adecuados para los compuestos y los usos de los mismos desvelados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, ácido mirístico (ácido tetradecanoico) (monoácido C14), ácido tetradecanodioico (diácido C14), ácido palmítico (ácido hexadecanoico) (monoácido C16), ácido hexadecanodioico (diácido C16), ácido margárico (ácido heptadecanoico) (monoácido C17), ácido heptadecanodioico (diácido C17), ácido esteárico (ácido octadecanoico) (monoácido C18), ácido octadecanodioico (diácido C18), ácido nonadecílico (ácido nonadecanoico) (monoácido C19), ácido nonadecanodioico (diácido C19), ácido araquídico (ácido eicosanoico) (monoácido C20), ácido eicosanodioico (diácido C20), ácido heneicosílico (ácido heneicosanoico) (monoácido C21), ácido heneicosanodioico (diácido C21), ácido behénico (ácido docosanoico) (C22), ácido docosanodioico (diácido C22), ácido lignocérico (ácido tetracosanoico) (monoácido C24), ácido tetracosanodioico (diácido C24), incluyendo derivados ramificados y sustituidos de los mismos.
En aspectos preferentes de los compuestos desvelados en el presente documento, el ácido graso C14-C24 se selecciona del grupo que consiste en un monoácido C14 saturado, un diácido C14 saturado, un monoácido C16 saturado, un diácido C16 saturado, un monoácido C18 saturado, un diácido C18 saturado, un diácido C19 saturado, un monoácido C20 saturado, un diácido C20 saturado, un diácido C22 saturado, y derivados ramificados y sustituidos de los mismos.
En aspectos más preferentes de los compuestos de la presente invención, el ácido graso C14-C24 se selecciona del grupo que consiste en un ácido mirístico, ácido tetradecanodioico, ácido palmítico, ácido hexadecanodioico, ácido esteárico, ácido octadecanodioico, ácido nonadecanodioico, ácido araquídico, ácido eicosanodioico y ácido docosanodioico.
Preferentemente, el ácido graso C14-C24 es ácido octadecanodioico o ácido eicosanodioico.
Los presentes inventores han descubierto que la posición del ácido graso es crucial para conseguir un compuesto con la relación deseada de actividad coagonista de Gcg-R/GLP-1-R. La longitud y composición del ácido graso afecta la semivida plasmática del compuesto, la potencia del compuesto en modelos animales in vivo y también afecta la solubilidad y estabilidad del compuesto. La conjugación del péptido definido en la SEQ ID NO: 2 con un monoácido o diácido graso saturado C14-C24 da como resultado compuestos que presentan una semivida plasmática conveniente, una potencia conveniente en modelos animales in vivo y también poseen las características deseadas de solubilidad y estabilidad. El ácido mirístico, ácido tetradecanodioico, ácido palmítico, ácido hexadecanodioico, ácido esteárico, ácido octadecanodioico, ácido nonadecanodioico, ácido araquídico, ácido eicosanodioico y ácido docosanodioico son ácidos grasos particularmente preferentes.
En particular, la conjugación del péptido definido en la SEQ ID NO: 2 en el resto de lisina en la posición 20 con ácido octadecanodioico o ácido eicosanodioico da como resultado compuestos que: (i) tienen la capacidad de lograr las relaciones deseadas de actividad coagonista de Gcg-R/GLP-1-R, (ii) tienen la capacidad de mejorar la potencia en modelos animales in vivo y/o (iii) tienen la capacidad de mejorar la estabilidad física y las características de solubilidad.
Los compuestos de la invención se formulan preferentemente como composiciones farmacéuticas administradas por vías parenterales (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o transdérmica).
Los compuestos de la presente invención se administrarán normalmente por vía parenteral. La administración parenteral incluye, por ejemplo, administración sistémica, tal como por inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea, intradérmica o intraperitoneal. La vía de administración preferente es la inyección subcutánea. Un compuesto de la presente invención se administra al sujeto junto con un transportador, diluyente o excipiente farmacéutico aceptable como parte de una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes de tipo 2, la obesidad, la NAFLD y/o la NASH. La composición farmacéutica puede ser una solución o suspensión, tal como una en que un compuesto de la presente invención forma un complejo con un catión metálico divalente tal como zinc. Un compuesto de la presente invención también se puede formular en una formulación sólida tal como mediante liofilización o secado por pulverización, que luego se reconstituye en una solución diluyente adecuada antes de la administración. Los transportadores farmacéuticos adecuados pueden contener ingredientes inertes que no interactúan con el péptido o derivado del péptido. Los transportadores farmacéuticos adecuados para la administración parenteral incluyen, por ejemplo, agua estéril, solución salina fisiológica, solución salina bacteriostática (solución salina que contiene aproximadamente el 0,9 % mg/ml de alcohol bencílico), solución salina tamponada con fosfato, la solución de Hank, lactato de Ringer y similares. Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, trehalosa, sorbitol y manitol, y conservantes tales como fenol y m-cresol.
Pueden emplearse técnicas convencionales de formulación farmacéutica, tales como las descritas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21a Edición, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006). Los compuestos de la presente invención pueden formularse alternativamente para la administración a través de vía boca, oral, transdérmica, nasal o pulmonar.
Los compuestos de la presente invención pueden reaccionar con cualquiera de varios ácidos orgánicos e inorgánicos para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables y la metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P. Stahl y col. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2da edición revisada (Wiley-VCH, 2011). Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención incluyen sales de trifluoroacetato, clorhidrato y de acetato.
Los compuestos de la presente invención se pueden emplear para tratar la diabetes, en concreto la diabetes de tipo 2. Los sujetos adicionales que pueden beneficiarse del tratamiento con los compuestos de la presente invención, incluyen los que presentan intolerancia a la glucosa o alteración de la glucosa en ayunas, sujetos cuyo peso corporal es aproximadamente el 25 % o más superior al peso corporal normal para la altura y la constitución física del sujeto, sujetos que tienen uno o más padres con diabetes de tipo 2, sujetos que han tenido diabetes gestacional y sujetos con trastornos metabólicos tales como los que son el resultado de una secreción de insulina endógena disminuida. Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse para prevenir que los sujetos con intolerancia a la glucosa progresen a diabetes de tipo 2, prevenir el deterioro de las células p del páncreas, inducir la proliferación de células p, mejorar la función de las células p, activar las células p latentes, impulsar la diferenciación de células en células p, estimular la replicación de las células p e inhibir la apoptosis de las células p. Otras enfermedades y afecciones que pueden tratarse o prevenirse utilizando compuestos de la invención en los procedimientos de la invención incluyen: diabetes hereditaria juvenil de tipo 2 (MODY, forma siglada de maturity-onset diabetes of the young) (Herman, y col., Diabetes 43:40, 1994); diabetes autoinmunitaria latente del adulto (LADA, forma siglada de latent autoimmune diabetes adult) (Zimmet, y col., Diabetes Med. 11:299, 1994); intolerancia a la glucosa (IGT, florma siglada de impaired glucose tolerance) (Comité de expertos en clasificación de la diabetes mellitus, Diabetes Care 22 (Sup. 1):S5, 1999); alteración de la glucosa en ayunas (IFG, forma siglada de impaired fasting glucose) (Charles, y col., Diabetes 40:796, 1991); diabetes gestacional (Metzger, Diabetes, 40:197, 1991); síndrome metabólico, dislipidemia, hiperglucemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia y resistencia a la insulina.
Los compuestos de la invención también pueden usarse en procedimientos de la invención para tratar causas secundarias de diabetes (Comité de expertos en clasificación de la diabetes mellitus, Diabetes Care 22 (Sup. 1): S5, 1999). Dichas causas secundarias incluyen exceso de glucocorticoides, exceso de hormona del crecimiento, feocromocitoma y diabetes farmacógena. Los fármacos que pueden inducir diabetes incluyen, pero sin limitación, piriminilo, ácido nicotínico, glucocorticoides, fenitoína, hormona tiroidea, agentes p-adrenérgicos, interferón a y fármacos utilizados para tratar la infección por VIH.
Los compuestos de la presente invención pueden ser eficaces en la supresión de la ingesta de alimentos y el tratamiento de la obesidad.
Una "cantidad eficaz" de un compuesto de la presente invención es la cantidad que da como resultado un efecto terapéutico y/o un profiláctico deseado sin provocar efectos secundarios inaceptables cuando se administra a un sujeto. Un "efecto terapéutico deseado" incluye uno o más de los siguientes: 1) una mejora del síntoma (o síntomas) asociado con la enfermedad o afección; 2) un retraso en la aparición de síntomas asociados con la enfermedad o afección; 3) mayor longevidad en comparación con la ausencia del tratamiento; y 4) mayor calidad de vida en comparación con la ausencia del tratamiento. Por ejemplo, una "cantidad eficaz" de un compuesto de la presente invención para el tratamiento de la DT2 es la cantidad que daría como resultado un mayor control de la concentración de glucosa en sangre que en ausencia de tratamiento, dando como resultado un retraso en la aparición de complicaciones diabéticas tales como la retinopatía, la neuropatía o la nefropatía. Una "cantidad eficaz" de un compuesto de la presente invención para la prevención de la diabetes de tipo 2, por ejemplo, en sujetos con intolerancia a la glucosa o alteración de la glucosa en ayunas, es la cantidad que retrasaría, en comparación con la ausencia de tratamiento, la aparición de niveles elevados de glucosa en sangre que precisan un tratamiento con fármacos antihiperglucémicos tales como las sulfonilureas, las tiazolidinedionas, la insulina y/o las biguanidinas.
Una "cantidad eficaz" de un compuesto de la presente invención administrada a un sujeto también dependerá del tipo y gravedad de la enfermedad y de las características del sujeto, tales como la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal y la tolerancia a los fármacos. La dosis de un compuesto de la presente invención eficaz para normalizar la glucosa en sangre de un sujeto dependerá de varios factores, entre los que se incluyen, sin limitación, el sexo, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la incapacidad para regular la glucosa en sangre, la vía de administración y la biodisponibilidad, el perfil farmacocinético del péptido, la potencia y la formulación.
Determinados compuestos de la presente invención son generalmente eficaces sobre un amplio intervalo de dosificación. Por ejemplo, las dosificaciones para la dosificación una vez a la semana pueden estar dentro del intervalo de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 30 mg por persona por semana. Determinados compuestos de la presente invención pueden dosificarse diariamente. De manera adicional, determinados compuestos de la presente invención pueden dosificarse de forma quincenal, semanal o mensual.
Un "sujeto" es un mamífero, preferentemente un ser humano, pero también puede ser un animal, incluidos los animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, oveja, cerdos, caballos y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares).
Como se usa en el presente documento, las expresiones "que trata" o "tratar" incluyen restringir, ralentizar, detener o invertir la progresión o la gravedad de un síntoma o trastorno existente.
La expresión "semivida plasmática" se refiere al tiempo necesario para que la mitad de los compuestos pertinentes se eliminen del plasma. Una expresión utilizada alternativamente es "semitiempo de eliminación". La expresión "extendida" o "más larga" utilizado en el contexto de la semivida plasmática o la semivida de eliminación indica que hay un aumento significativo en la semivida de un compuesto de la presente invención con respecto a la molécula de referencia ( por ejemplo, forma del péptido no conjugada con ácido graso, OXM humana de tipo silvestre o semaglutida) según se determina en condiciones comparables.
El aclaramiento es una medida de la capacidad del organismo para eliminar un fármaco de la circulación. A medida que el aclaramiento disminuye debido, por ejemplo, a modificaciones de un fármaco, se espera que aumente la semivida. Sin embargo, esta relación recíproca es exacta solo cuando no hay cambio en el volumen de distribución. Una relación aproximada útil entre la semivida semilogarítmica terminal (T1/2), el aclaramiento (C) y el volumen de distribución (V) vienen dados por la ecuación: T1/2 “ 0,693 (V/C). El aclaramiento no indica la cantidad de fármaco que se está eliminando, sino más bien el volumen de líquido biológico, tal como sangre o plasma, que debería liberarse por completo del fármaco para dar cuenta de la eliminación. El aclaramiento se expresa como volumen por unidad de tiempo.
Como se usa en el presente documento, el término "hidrófilo" se refiere a la propiedad de poder absorber fácilmente la humedad y tener grupos fuertemente polares que interactúan fácilmente con el agua.
Como se usa en el presente documento, "semaglutida" se refiere a un análogo de GLP-1 sintetizado químicamente que tiene la estructura principal peptídica y la estructura global del compuesto de la que se encuentra en el número de registro CAS 910463-68-2.
Las secuencias de aminoácidos de la presente invención contienen los códigos convencionales de una sola letra o de tres letras para los veinte aminoácidos de origen natural. De manera adicional, "Aib" es ácido alfa amino isobutírico, "Abu" es ácido amino butírico, "Orn" es ornitina, "Cit" es citrulina y "Sar" es sarcosina.
Como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácido C-terminal" se refiere al último aminoácido en la secuencia de un péptido que contiene un grupo carboxilo libre. El aminoácido C-terminal de los compuestos de la presente invención es Gly en la posición 34.
La presente invención también abarca nuevos productos intermedios y procedimientos útiles para la síntesis de compuestos de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Los intermedios y compuestos de la presente invención pueden prepararse por una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. En particular, el procedimiento que utiliza síntesis química se ilustra en los siguientes Ejemplos. Las etapas sintéticas concretas para cada una de las rutas descritas pueden combinarse de distintos modos para preparar compuestos de la presente invención o sales de los mismos. Los reactivos y los materiales de partida están fácilmente disponibles para un experto en la materia.
Ejemplo 1
HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLEGGPSSG
en la que Xaa2 es Aib;
la K en la posición 20 está químicamente modificada a través de conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(YGlu)1-CO-(CH2)16-CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado como una amida primaria C-terminal (SEQ ID NO: 5).
Figure imgf000015_0001
El diagrama anterior representa la estructura del compuesto de la SEQ ID NO: 5 (en lo sucesivo denominado "Compuesto 1") utilizando el código de aminoácidos convencional de una sola letra con la excepción de los restos Aib2 y K20, en que las estructuras de estos aminoácidos se han ampliado.
El componente peptídico del Compuesto 1 se sintetiza mediante síntesis automatizada en fase sólida utilizando química de fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc)/terc-butilo (t-Bu) en un sintetizador múltiple de péptidos de 12 canales Symphony (Protein Technologies, Inc. Tucson, AZ).
La resina de síntesis consiste en poliestireno reticulado DVB al 1 % (resina de baja carga Fmoc-Rink-MBHA, malla 100-200, EMD Millipore, Temecula, CA) en una sustitución de 0,3-0,4 meq/g. Los grupos protectores de cadena lateral convencionales son los siguientes: terc-butiloxicarbonilo (Boc) para Trp y Lys; terc-butil éster (OtBu) para Asp y Glu; tBu para Ser, Thr y Tyr; y trifenilmetilo (Trt) para Gln; se utilizó N-a-Fmoc-N-£-4-metiltritil-L-lisina (Fmoc-Lys(Mtt)-OH) para la lisina en la posición 20 de la SEQ ID NO: 3 y se utilizó Wc,,W(¡m)-d¡-Boc-L-h¡st¡d¡na (Boc-His(Boc)-OH) para la histidina en la posición 1. Los grupos Fmoc se eliminaron antes de cada etapa de acoplamiento (2 x 7 minutos) utilizando piperidina al 20 % en dimetilformamida (DMF). Todos los acoplamientos de aminoácidos convencionales se realizan durante 1 hora, utilizando una proporción equimolar de aminoácido Fmoc (EMD Millipore, Temecula, CA), diisopropilcarbodiimida (DIC) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y Oxyma (Oxyma Pure, Iris Biotech, Marktredwitz, Alemania), con un exceso molar de 9 veces sobre la carga de péptido teórica y con una concentración final de 0,18 M en DMF.
Dos excepciones son el resto de glutamina en la posición 3 de la SEQ ID NO: 5, que está doblemente acoplado (2 x 1 hora), y el resto de histidina en la posición 1 de la SEQ ID NO: 5, que se acopló a un exceso molar de 6 veces utilizando 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) en lugar de Oxyma durante 18 horas. Una vez finalizada la síntesis del péptido lineal, la resina se transfirió a una jeringa de polipropileno sinterizada desechable de 25 ml (Torviq, Niles, MI) equipada con grifo de cierre de politetrafluoroetileno (PTFE) (Biotage, Charlotte, NC) y el grupo protector 4-metiltritilo (Mtt) en la lisina en la posición 20 de la SEQ ID NO: 5 se eliminó selectivamente de la resina peptídica utilizando tres tratamientos con hexafluoroisopropanol al 20 % (Oakwood Chemicals, West Columbia, SC) en DCM (2 x 10 minutos y 1 x 45 minutos) para exponer la amina épsilon libre de la lisina en la posición 20 y dejarla disponible para una reacción posterior.
La unión posterior de la fracción de engarce de ácido graso se logra mediante la realización de dos acoplamientos sucesivos de ácido [2-(2-(Fmoc-amino)etoxi)etoxi] acético (Fmoc-AEEA-OH) (ChemPep, Inc. Wellington, FL; exceso de 3 veces de aminoácido (AA):1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo [4,5-b]piridinio-3-óxido hexafluorofosfato (HATU): W,A/-diisopropiletilamina (DIPEA) [1:1:5 mol/mol] durante un tiempo de acoplamiento de 3 horas), seguido del acoplamiento del Fmoc-a-t-butil éster de ácido glutámico (Fmoc-Glu-OtBu) (Ark Pharm, Inc. Libertyville IL, exceso de 3 veces de AA:HATU:DIPEA [1:1:5 mol/mol] durante un tiempo de acoplamiento de 3 horas). En cada caso, la fracción Fmoc se elimina como se describe anteriormente. Finalmente, se acopla ácido mono-OtBu-octadecanodioico (WuXi AppTec, Shanghai, China) a la resina durante 18 horas utilizando un exceso de 3 veces de ácido:HATU:DIPEA (1:1:5 mol/mol).
Una vez finalizada la síntesis, la resina peptídica se lava con diclorometano (DCM), éter dietílico y se seca exhaustivamente al aire aplicando succión al vacío a la jeringa durante 5 minutos. La resina seca se trata con un cóctel de escisión (ácido trifluoroacético (TFA): anisol: agua: triisopropilsilano, 88:5:5:2 v/v) durante 2 horas a temperatura ambiente, para liberar el péptido del soporte sólido y eliminar todos los grupos protectores de la cadena lateral. La resina se retira por filtración, se lava dos veces con TFA puro y los filtrados combinados se tratan con éter dietílico frío para precipitar el péptido en bruto. A continuación se centrífuga la suspensión de péptido/éter a 4000 rpm para formar un sedimento sólido, se decanta el sobrenadante y el sedimento sólido se tritura con éter dos veces más y se seca al vacío. El péptido crudo se solubiliza en acetonitriloal 20 %/agua y se purifica por RP-HPLC (forma siglada de reverse phase high performance liquid chromatography, cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa) en una columna preparativa C8 (Luna 21 x 250 mm, Fenomenex, Torrance, CA) con gradientes lineales de acetonitrilo y agua utilizando tres sistemas de tampón distintos:
1) acetato de amonio 0,1 M en agua, pH 5,0;
2 ) TFA al 0,1 % en agua; y
3) ácido acético al 5 % en agua.
La liofilización posterior del agrupamiento de productos principales final produce la sal de acetato de péptido liofilizada.
En una síntesis realizada esencialmente como se describe anteriormente, la pureza del Compuesto 1 se evalúa utilizando RP-HPLC analítica y se encuentra que es > 97 %.
El peso molecular se determina mediante EM con electronebulización analítica. Se calcula que el peso molecular del Compuesto 1 es de 4535,0 Daltons, mientras que se determinó que el peso molecular promedio desconvolucionado observado es de 4535,0 Daltons, y se observaron los siguientes iones: 1512,3 (M+3H), 1134,3 (M+4H), 908 (M+5H).
Ejemplo 2
HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLEGGPSSG
en la que Xaa2 es Aib;
la K en la posición 20 está químicamente modificada a través de conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(YGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado como una amida primaria C-terminal (SEQ ID NO: 6).
Figure imgf000016_0001
El diagrama anterior representa la estructura del compuesto de la SEQ ID NO: 6 (en lo sucesivo denominado "Compuesto 2") utilizando el código de aminoácidos convencional de una sola letra con la excepción de los restos Aib2 y K20, en que las estructuras de estos aminoácidos se han ampliado.
El compuesto 2 se sintetiza como en el ejemplo 1, excepto que el ácido mono-OtBu-eicosanodioico (WuXi AppTec, Shanghai, China) se acopla a la resina durante 18 horas utilizando un exceso de 3 veces de AA:HATU:DIPEA (1:1:5 mol/mol), en lugar de ácido mono-OtBu-octadecanodioico como en el Ejemplo 1.
Se calcula que el peso molecular del Compuesto 2 es de 4563,1 Daltons, mientras que se determina que el peso molecular promedio desconvolucionado observado es de 4562,9 Daltons, y se observaron los siguientes iones: 1521,7 (M+3H), 1141,3 (M+4H), 913,5 (M+5H).
Ejemplo 3
HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLSGGPSSG
en la que Xaa2 es Aib;
la K en la posición 20 está químicamente modificada a través de conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(YGlu)2-CO-(CH2)16-CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado como una amida primaria C-terminal (SEQ ID NO: 7).
Figure imgf000016_0002
El diagrama anterior representa la estructura del compuesto de la SEQ ID NO: 7 (en lo sucesivo denominado "Compuesto 3") utilizando el código de aminoácidos convencional de una sola letra con la excepción de los restos Aib2 y K20, en que las estructuras de estos aminoácidos se han ampliado.
El compuesto 3 se sintetiza como en el ejemplo 1, excepto que se añadió una fracción de Fmoc-Glu-OtBu adicional en el ciclo de síntesis del engarce.
Se calcula que el peso molecular del Compuesto 3 es de 4622,1 Daltons, mientras que se determinó que el peso molecular promedio desconvolucionado observado es de 4621,9 Daltons, y se observaron los siguientes iones: 1541,3 (M+3H), 1156,2 (M+4H), 925,2 (M+5H).
Ejemplo 4
HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLSGGPSSG
en la que Xaa2 es Aib;
la K en la posición 20 está químicamente modificada a través de conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(YGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado como una amida primaria C-terminal (SEQ ID NO: 8).
Figure imgf000017_0001
El diagrama anterior representa la estructura del compuesto de la SEQ ID NO: 8 (en lo sucesivo denominado "Compuesto 4") utilizando el código de aminoácidos convencional de una sola letra con la excepción de los restos Aib2 y K20, en que las estructuras de estos aminoácidos se han ampliado.
El compuesto 4 se sintetiza como en el ejemplo 1, excepto que el ácido mono-OtBu-eicosanodioico (WuXi AppTec, Shanghai, China) se acopla a la resina durante 18 horas utilizando un exceso de 3 veces de AA:HATU:DIPEA (1:1:5 mol/mol), en lugar del ácido mono-OtBu-octadecanodioico utilizado en el Ejemplo 1. Además, se añadió una fracción de Fmoc-Glu-OtBu de aminoácido adicional en el ciclo de síntesis del engarce.
Se calcula que el peso molecular del péptido es de 4650,1 Daltons, mientras que se determina que el peso molecular promedio desconvolucionado observado es de 4650,1 Daltons, y se observaron los siguientes iones: 1550,7 (M+3H), 1163,3 (M+4H), 930,8 (M+5H).
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS
Viscosidad
La viscosidad de los compuestos de la presente invención se mide en un viscosímetro mVroc de Rheosense con los siguientes ajustes:
(a) Tamaño de la jeringa: Jeringa de 500 pl
(b) Caudal: Caudal de 100 pl/min
(c) Temperatura promedio: 25 °C
(d) Velocidad de cizalla: 1934 s-1
Se pesa el polvo seco (compuesto), se disuelve en agua como un precipitado turbio, y se titula a aproximadamente pH 8,0 con NaOH I N. La solución se trata con ultrasonidos y se agita manualmente hasta que el péptido está en solución. Las muestras se esterilizan por filtración (filtros de PVDF de 0,22 pm). A continuación, las muestras se analizan mediante UV-Vis para evaluar las concentraciones de la solución madre. Las soluciones se diluyen hasta la concentración final utilizando m-cresol 3x en tampón Tris 10 mM pH 8,0 hasta concentraciones finales de péptido de aproximadamente 10 mg/ml peso en Tris 10 mM m-cresol 3 mg/ml a pH 8,0. Las muestras se filtraron a través de filtros de 0,22 pm inmediatamente antes del análisis de viscosidad. Se extraen 25 pl de muestra para verificar la concentración mediante RP-HPLC antes y después del análisis.
Las muestras de control de agua y tampón se miden antes y después de analizar cada muestra. El instrumento se lava con tampón (3x) entre análisis de cada muestra. Las muestras se cargan en jeringas individuales y se analizan. La primera medición no se incluye en el cálculo final para permitir el equilibrio con el sistema. A continuación, las muestras se analizan por triplicado (n=3).
La viscosidad de los Compuestos 1-4 se midió esencialmente como se describe en este ensayo. Los datos de viscosidad para los Compuestos 1-4 se resumen en la Tabla 1.
T l 1: D vi i r l m 1-4
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Solubilidad
La solubilidad de los compuestos de la presente invención se mide en un HPLC Agilent 1100, un HPLC Agilent 1200 y un Nanodrop 2000. Se utilizan las siguientes columnas de HPLC:
(a) RP-HPLC: Waters Symmetry Shield C18, 3,6 um, 4.6 x 100 mm
(b) HPLC-SEC: Tosoh Biosciences, TSK2000swxl 7,8 cm x 30 mm
Todas las concentraciones de péptidos se preparan a 10 mg/ml de la siguiente manera:
(a) Tris 10 mM pH 8,0 m-cresol 3 mg/ml
(b) Tris 10 mM pH 8,0 m-cresol 3 mg/ml NaCl 150 mM
(c) Tris 10 mM pH 8,0 m-cresol 3 mg/ml Tween-20 0,02 %
(d) PBS pH 7,4
Se concentran 5 ml de péptido 10 mg/ml disuelto en Tris 10 mM a pH 8,0 hasta aproximadamente 20 mg/ml, utilizando dispositivos de MWCO (MWCO, forma siglada de molecular weight cutoff, límite de peso molecular) de 3 kDa Amiconultra. La solución se filtra utilizando filtros de 0,22 pM (membrana PVDF) de Millivex y la concentración final se mide con el espectrómetro NanoDrop. Esta solución madre se utiliza para formular las condiciones finales indicadas anteriormente utilizando soluciones madre de m-cresol 3x, NaCl 10x y Tween-20 100x. Además, se prepara una solución de PBS de 10 mg/ml disolviendo directamente a 5 mg/ml y concentrando utilizando dispositivos de MWCO de 3 kDa de Amicon-ultra.
Cada solución se coloca en un frigorífico a 4 °C durante 1 semana, con análisis por RP-HPLC para evaluar la concentración y de HPLC-SEC (forma siglada de reverse phase high performance liquid chromatography-size exclusión chromatography, cromatografía de líquidos de alto rendimiento con cromatografía por exclusión de tamaño) para evaluar la formación de especies de HMW (forma siglada de high molecular weight, alto peso molecular). Los análisis se finalizaron en la semana T-0 y la semana T-1.
La solubilidad de los Compuestos 1-4 se midió esencialmente como se describe en este ensayo. Los datos de solubilidad para los Compuestos 1-4 se resumen en las Tablas 2(a)-(d).
T l 2 : D l ili r l m 1
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T l 2 : D l ili r l m 4
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FUNCION IN VITRO
Afinidad de unión de los Compuestos 1-4 para el receptor de Gcg humano (hGcg-R) y el receptor de GLP-1 humano (hGLP-1-R) recombinantes
Se realizaron ensayos de unión por competición de radioligando utilizando procedimientos de ensayo de centelleo por proximidad (SPA) y membranas preparadas a partir de células 293HEK transfectadas de manera estable que sobreexpresan hGcg-R o hGLP-1-R, para determinar las constantes de disociación en equilibrio (Ki) para los Compuestos 1-4. Los protocolos experimentales y los resultados se describen a continuación.
Ensayo de unión de hGLP-1R
El ensayo de unión al receptor de GLP-1 utiliza hGLP-1-R clonado (Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196(1): 141-6, 1993) aislado de células 293HEK que sobreexpresan hGLP-1R recombinante. El ADNc de hGLP-1R se subclona en el plásmido de expresión phD (Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. y Yan, S.B. Bio/Technology 5:1189-1192, 1987). Este ADN plasmídico se transfecta en células 293HEK y se selecciona con higromicina 200 pg/ml.
Las membranas plasmáticas en bruto se preparan utilizando células de cultivo adherente. Las células se lisan en hielo en tampón hipotónico que contiene Tris HC1 50 mM, pH 7,5 e inhibidores de proteasas Roche Complete™ con EDTA. La suspensión celular se rompe utilizando un homogeneizador Potter-Elvehjem de vidrio equipado con una mano de mortero de Teflon®, con 25 golpes. El homogeneizado se centrifuga a 4 °C a 1100 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se recoge y reserva en hielo mientras que el sedimento se resuspende en tampón hipotónico y se rehomogeneiza. La mezcla se centrifuga a 1100 x g durante 10 minutos. El segundo sobrenadante se combina con el primer sobrenadante y se centrifuga a 35000 x g durante 1 hora a 4 °C. El sedimento de membranas se resuspende en tampón de homogeneización que contiene inhibidores de proteasas, se congela rápidamente en nitrógeno líquido y almacenado en alícuotas en un congelador a -80 °C hasta su uso.
El GLP-1 se somete a radioyodación mediante el procedimiento de I-125-lactoperoxidasa y se purifica mediante HPLC de fase inversa en Perkin-Elmer (NEX308). La actividad específica es de 2200 Ci/mmol. La determinación de Kd se realiza mediante competición homóloga en lugar de unión por saturación debido al alto contenido de propanol en el material de 1-125 GLP-1. La Kd se estima en 1.24 nM y se utiliza para calcular los valores de Ki para todos los compuestos analizados.
El ensayo de unión al receptor se lleva a cabo utilizando un formato de ensayo de centelleo de proximidad (SPA, forma siglada de scintillation proximity assay) con perlas de aglutinina de germen de trigo (AGT) (Perkin Elmer). El tampón de unión contiene ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES) 25 mM, pH 7,4, CaCl 2,5 mM2, MgCl 1 mM2, bacitracina al 0,1 % (p/v) (Affymetrix), monolaurato de polioxietilensorbitán (t W e EN®-20) al 0,003 % (p/v) e inhibidores de proteasas Roche Complete™ sin EDTA. El GLP-1 se disuelve en DMSO a 0,339 mg/ml (0,1 mM) y se almacena congelado a -20 °C en alícuotas de 100 pl. La alícuota de GLP-1 se diluye y se utiliza en ensayos de unión en un plazo de una hora. El análogo peptídico se disuelve en dimetilsulfóxido (DMSo ) y se diluye en serie 3 veces en DMSO al 100 %. A continuación, se transfieren 5 |jl de compuesto diluido en serie o DMSO a placas de ensayo de fondo transparente Corning® 3632 que contienen 45 j l de tampón de unión de ensayo o control de GLP-1 sin marcar (unión no específica (UNE) a 0,25 jM final). A continuación, se añaden 50 j l de membranas de hGLP-1R (0,5 jg/pocillo), 50 j l de 1-125 GLP-1 (0,15 nM final) y 50 j l de perlas de AGT (150 jg/pocillo), las placas se sellan y mezclan en un agitador de placas (ajuste a 6) durante 1 minuto. Las placas se leen con un contador de centelleo PerkinElmer Trilux MicroBeta® después de 12 horas de tiempo de sedimentación a temperatura ambiente.
Los resultados se calculan como un porcentaje de la unión específica de I-125-GLP-1 en presencia del compuesto. La concentración CI50 absoluta del compuesto se obtiene mediante regresión no lineal del porcentaje de unión específica de I-125-GLP-1 frente a la concentración de compuesto añadida. La concentración CI50 se convierte en Ki utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff (Cheng, Y., Prusoff, W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, (1973)).
Las Ki de los compuestos 1-4, de Gcg humano y de GLP-1(7-3 6)NH2 humano en el hGLP-1-R se muestran a continuación en la Tabla 3. El número de repeticiones (n) se indica entre paréntesis. Un calificador (>) indica que el % de inhibición no alcanzó el 50% y el Ki calculado se obtiene utilizando la concentración más alta analizada. n=1/n indica que los promedios no se calculan cuando todos los valores tienen un signo > y el valor mostrado es el valor calculado más alto.
Tabla 3: K de los Com uestos 1-4 de Gc humano de GLP-17-36 NH2 humano en el hGLP-1-R
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Ensayo de unión a hGcg-R
El ensayo de unión al receptor de Gcg utiliza hGcg-R clonado (Lok, S, y col., Gene 140 (2), 203-209 (1994) aislado de células 293HEK que sobreexpresan el hGcg-R recombinante. El ADNc de hGcg-R se subclona en el plásmido de expresión phD (Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., y col., Bio/Technology 5: 1189-1192 (1987)). Este ADN plasmídico se transfecta en células 293HEK y se selecciona con higromicina 200 jg/ml.
Las membranas plasmáticas en bruto se preparan utilizando células de cultivo adherente. Las células se lisan en hielo en tampón hipotónico que contiene Tris HCI 50 mM, pH 7,5 e inhibidores de proteasas Roche Complete™ con EDTA. La suspensión celular se rompe utilizando un homogeneizador Potter-Elvehjem de vidrio equipado con una mano de mortero de Teflon®, con 25 golpes. El homogeneizado se centrifuga a 4 °C a 1100 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se recoge y reserva en hielo mientras que el sedimento se resuspende en tampón hipotónico y se rehomogeneiza. La mezcla se centrifuga a 1100 x g durante 10 minutos. El segundo sobrenadante se combina con el primer sobrenadante y se centrifuga a 35000 x g durante 1 hora a 4 °C. El sedimento de membranas se resuspende en tampón de homogeneización que contiene inhibidores de proteasas, se congela rápidamente en nitrógeno líquido y almacenado en alícuotas en un congelador a -80 °C hasta su uso.
El Gcg se somete a radioyodación mediante procedimiento de I-125-lactoperoxidasa y se purifica mediante HPLC de fase inversa en Perkin-Elmer (NEX207). La actividad específica es de 2200 Ci/mmol. La determinación de Kose realiza mediante competición homóloga en lugar de unión por saturación debido al alto contenido de propanol en el material de 1-125 Gcg. La Kd se estima en 3.92 nM y se utiliza para calcular los valores de Ki para todos los compuestos analizados.
El ensayo de unión al receptor se lleva a cabo utilizando un formato de ensayo de centelleo de proximidad (SPA, forma siglada de scintillation proximity assay) con perlas de aglutinina de germen de trigo (AGT) (Perkin Elmer). El tampón de unión contiene HEPES 25 mM, pH 7,4, CaCl 2,5 mM2, MgCl 1 mM2, bacitracina al 0,1 % (p/v) (Affymetrix), monolaurato de polioxietilensorbitán (TWEEN®-20) al 0,003 % (p/v) e inhibidores de proteasas Roche Complete™ sin EDTA. El Gcg se disuelve en DMSO a 3,48 mg/ml (1 mM) y se almacena congelado a -20 °C en alícuotas de 100 jl. La alícuota de Gcg se diluye y se utiliza en ensayos de unión en un plazo de una hora. El análogo peptídico se disuelve en DMSO y se diluye en serie 3 veces en DMSO al 100 %. A continuación, se transfieren 5 j l de compuesto diluido en serie o DMSO a placas de ensayo de fondo transparente Corning® 3632 que contienen 45 j l de tampón de unión de ensayo o control de Gcg sin marcar UNE a 1 jM final). A continuación, se añaden 50 j l de membranas de hGcg-R (0,5 jg/pocillo), 50 j l de 1-125 Gcg (0,15 nM final en la reacción) y 50 j l de perlas de AGT (150 jg/pocillo), se sellan las placas y se mezclan en un agitador de placas (ajuste a 6) durante 1 minuto. Las placas se leen con un contador de centelleo PerkinElmer Trilux MicroBeta® después de 12 horas de tiempo de sedimentación a temperatura ambiente.
Los resultados se calculan como un porcentaje de la unión específica de I-125-Gcg en presencia del compuesto. La concentración CI50 absoluta del compuesto se obtiene mediante regresión no lineal del porcentaje de unión específica de I-125-Gcg frente a la concentración de compuesto añadida. La concentración CI50 se convierte en Ki utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff) Cheng, Y., Prusoff, W. H., Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108, (1973)). Las Ki de los compuestos 1-4, de Gcg humano y de GLP-1(7-36)NH2 humano en el hGcg-R se muestran a continuación en la Tabla 4. El número de repeticiones (n) se indica entre paréntesis. Un calificador (>) indica que el % de inhibición no alcanzó el 50 % y el Ki calculado se obtiene utilizando la concentración más alta analizada. n=1/2 indica que los promedios no se calculan cuando todos los valores tienen un signo > y el valor del resultado mostrado es el valor calculado más alto.
Tabla 4: K de los Com uestos 1-4 de Gc humano de GLP-17-36 NH2 humano en el hGcg-R
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Ensayos funcionales de hGLP-1-R y hGcg-R
La actividad funcional se determina en las líneas celulares clonales HEK-293 que expresan hGLP-1-R y hGcg-R. Los protocolos experimentales y los resultados se describen a continuación.
Cada línea celular que sobreexpresa el receptor se trata con péptido en DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco, Gibco n.° de cat. 31053) complementado con GlutaMAX™ 1X (dipéptido L-alanil-L-glutamina en NaCl al 0,85 %, Gibco n.° de cat. 35050), SFB al 0,25 % (suero fetal bovino dializado, Gibco n.° de cat. 26400), fracción V de BSA al 0,05 % (fracción V de albúmina bovina, Gibco n.° de cat. 15260), IBMX (3-isobutil-1-metilxantina) 250 pM y HEPES [N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) 20 mM, HyClone n.° de cat. SH30237.01] en un volumen de ensayo de 40 pl. Después de una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente, el aumento resultante en el AMPc intracelular (adenosín monofosfato 3',5'-cíclico) se determina cuantitativamente utilizando el kit de ensayo CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF (62AM4PEJ). Los niveles de AMPc dentro de la célula se detectan añadiendo el conjugado AMPc-d2 en tampón de lisis celular (20 pl) seguido del anticuerpo anti-AMPc-Eu3+-Criptato, también en tampón de lisis celular (20 pl). El ensayo competitivo resultante se incuba durante al menos 60 min a temperatura ambiente, a continuación se detecta utilizando un instrumento PerkinElmer Envision® con excitación a 320 nm y emisión a 665 nm y 620 nm. Las unidades de Envision (emisión a 665 nm/620 nm*10.000) son inversamente proporcionales a la cantidad de cAMP presente y se convierten a cAMP nM por pocillo utilizando una curva patrón de cAMP. La cantidad de AMPc generado (nM) en cada pocillo se convierte en un porcentaje de la respuesta máxima observada con GLP-1(7-36)NH2 humano 10 nM o Gcg humano 10 nM.
Se obtienen un valor de CE50 relativo y un porcentaje máximo (Emáx) mediante análisis de regresión no lineal utilizando el porcentaje de respuesta máxima frente a la concentración de péptido añadido, ajustado a una ecuación logística de cuatro parámetros (Genedata Screener®).
Los datos funcionales para los Compuestos 1-4, GLP-1(7-36)NH2 humano, Gcg humano y OXM humana de tipo silvestre se muestran a continuación en la Tabla 5. Las medias para la CE50 se expresan como medias geométricas ± error típico de la media (ETM), indicándose el número de repeticiones (n) indicado entre paréntesis. Las medias para Emáx se expresan como la media aritmética ± error típico. n D significa que no se detectó actividad agonista. Todos los valores mostrados son hasta tres (3) cifras significativas.
Tabla 5: Potencia funcional (CE50) y eficacia (Emáx) para los Compuestos 1-4, GLP-1(7-36) NH2 humano, Gcg humano OXM humana de ti o silvestre
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continuación
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Activación funcional de GLP-1-R de rata en la línea celular INS1 832-3 de insulinoma
Se utiliza una línea de células beta pancreáticas de rata, células INS1 832-3, para determinar la actividad funcional de los Compuestos 1-4 para estimular la producción de AMPc en los receptores GLP-1 endógenos. Las células se mantienen en medio RPMI 1640 (HyClone, n.° de cat. SH30027) complementado con suero fetal bovino al 10%, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 2mM, 2-Mercaptoetanol 50 pM y penicilina 100 U/ml/estreptomicina 100 pg/ml en un incubador a 37 °C, con CO2 al 5 % y se pasan dos veces por semana.
La realización del ensayo precisa el desprendimiento de las células de los matraces de cultivo utilizando Enzyme Free Cell Stripper y la sedimentación mediante centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sedimento celular se resuspende en la solución salina equilibrada de Earle (EBSS) complementada con glucosa 11,2 mM y BSA al 0,1 %. Se colocan 40 pl de suspensión celular a una densidad de 1x106/ml en placas negras de media área de 96 pocillos (Costar 3875) y se incuban en una incubadora a 37 °C, con CO2 al 5 % durante 2 horas para la recuperación y la inanición. Se preparan diluciones en serie de los compuestos de prueba a 100X la concentración de prueba final en DMSO al 100 % y se diluye adicionalmente 20 veces en EBSS complementado con glucosa 11,2 mM, BSA al 0,1 % e IBMX 1,25 mM (Sigma 1-7816). Después de 2 horas de inanición, las células se tratan con compuesto añadiendo 10 pl de diluciones de compuesto 5X en las placas de células (n = 2) y se incuban en una incubadora a 37 °C, con CO2 al 5 % durante 30 minutos.
La concentración de AMPc se mide utilizando un kit de ensayo de AMPc de HTRF (Cisbio): se añade a las células de la placa conjugado de cAMP-d2 en tampón de lisis celular (20 pl) seguido del anticuerpo anti-cAMP-Eu3+-Criptato, también en tampón de lisis celular (20 pl). El ensayo competitivo resultante se incuba durante al menos 60 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se detecta utilizando un instrumento PerkinElmer Envision® con excitación a 320 nm y emisión a 665 nm y 620 nm. Las unidades de Envision (emisión a 665 nm/620 nm*10.000) son inversamente proporcionales a la cantidad de cAMP presente y se convierten a cAMP nM por pocillo utilizando una curva patrón de cAMP.
La concentración de AMPc en cada pocillo (nM) se calculó utilizando una curva patrón de AMPc y se convirtió a un porcentaje de la respuesta máxima observada con el péptido GLP-1 nativo a 300 nM para el ajuste de la curva.
Se obtienen un valor de CE50 relativo y un porcentaje máximo (Emáx %) mediante análisis de regresión no lineal utilizando el porcentaje de respuesta máxima frente a la concentración de péptido añadido, ajustado a una ecuación logística de cuatro parámetros (programa informático GraphPad Prism (versión 6.05)). El ensayo se realiza con placas por duplicado. El número de repeticiones (n) se indica entre paréntesis.
La CE50 y la Emáx % para OXM humana de tipo silvestre, semaglutida y los Compuestos 1 y 2 se calcularon esencialmente como se describe anteriormente. Los datos de CE50 y % Emáx para estos compuestos se proporcionan en la Tabla 6. Adicionalmente, Los Compuestos 1 y 2 aumentaron la producción de AMPc de una manera dependiente de la dosis (datos no mostrados).
Tabla 6: CE50 de OXM humana de tipo silvestre, semaglutida y Compuestos 1 y 2 en el GLP-1-R de rata en la línea celular de insulinoma INS1 832-3
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Activación funcional de hGcg-R en hepatocitos humanos primarios
Se utilizan hepatocitos humanos primarios para determinar la actividad funcional de los compuestos sobre la estimulación de la producción de AMPc en los receptores de Gcg endógenos.
Los viales de hepatocitos primarios humanos se encuentran congelados en un tanque de nitrógeno líquido. Tras retirarlos, los viales se descongelan inmediatamente en un baño de agua a una temperatura de 37 °C. Después, la suspensión celular se transfiere a 50 ml de CHRM (medio de recuperación de hepatocitos crioconservados de Gibco/life Technologies n.° de cat. CM7000).
La suspensión de células se centrifuga a 1.000 x g durante 10 min. Los sedimentos celulares se resuspenden en 5 ml de medio de siembra en placas después de retirar el CHRM por aspiración. El medio de siembra en placas se prepara añadiendo el contenido completo de los CM3000 Supplement Packs a 500 ml de medio Williams (Gibco/life Technologies), seguido de esterilización por filtración a través de una membrana de 0,22 pm.
La densidad celular se recuenta con un hemocitómetro, añadiendo 100 pl de suspensión celular a 100 pl de azul tripán (HyClone Trypan Blue al 0,04 %, número de catálogo SV30084.01). La suspensión celular se diluye adicionalmente en el medio de siembra en placas hasta la densidad celular final de 0,8 x 106 células por ml. Se añaden 65 ml de medio de siembra en placas a cada pocillo de la placa de 96 pocillos recubierta con colágeno (Corning BioCoat, número de catálogo 354649, Número de lote 22314033). A continuación, se añaden 65 ml de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de 96 pocillos recubierta con colágeno hasta una densidad celular final de 50.000 células por pocillo. La placa de células se incuba en una incubadora a 37 °C, con CO2 al 5 % durante 3-4 horas.
Después de 3-4 horas de incubación, el medio se aspira y se reemplaza con 100 ml de medio de mantenimiento. El medio de mantenimiento se prepara añadiendo el contenido completo de los CM4000 Supplement Packs a 500 ml de medio Williams (Gibco/life Technologies), seguido de esterilización por filtración a través de una membrana de 0,22 pm. La placa de células se devuelve a la incubadora a 37 °C, con CO2 al 5 % durante una noche, en preparación para el ensayo de AMPc.
En la preparación para el ensayo, los compuestos 1 y 2, y la OXM humana de tipo silvestre se someten a una dilución en serie con factor 3 en el tampón de ensayo de compuestos (HBSS que contiene HEPES 20 mM y SFB inactivado por calor al 1 %) en 10 concentraciones.
La placa de células se retira de la incubadora y el medio se retira mediante aspiración suave sin alterar la monocapa celular. Las células se tratan añadiendo 40 pl del tampón de ensayo celular y 40 pl de solución de prueba (es decir, el Compuesto 1, el Compuesto 2 u OXM humana de tipo silvestre diluidos en tampón de ensayo de compuestos) en las placas de células e incubando a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave.
La concentración de AMPc se mide utilizando un kit de ensayo de AMPc de HTRF (Cisbio): se añade a las células de la placa conjugado de cAMP-d2 en tampón de lisis celular (40 pl) seguido del anticuerpo anti-cAMP-Eu3+-Criptato, también en tampón de lisis celular (40 pl). El ensayo competitivo resultante se incuba durante al menos 60 minutos a temperatura ambiente, a continuación se detecta utilizando un instrumento PerkinElmer Envision® con excitación a 320 nm y emisión a 665 nm y 620 nm. Las unidades de Envision (emisión a 665 nm/620 nm*10.000) son inversamente proporcionales a la cantidad de cAMP presente y se convierten a cAMP nM por pocillo utilizando una curva patrón de cAMP.
La concentración de AMPc en cada pocillo (nM) se calcula utilizando una curva patrón de AMPc y se convirtió a un porcentaje de la respuesta máxima observada con un análogo de Gcg conjugado con un ácido graso C18 saturado (diácido) para el ajuste de la curva.
Se obtienen un valor de CE50 relativo y un porcentaje máximo (Emáx %) mediante análisis de regresión no lineal utilizando el porcentaje de respuesta máxima frente a la concentración de péptido añadido, ajustado a una ecuación logística de cuatro parámetros (programa informático GraphPad Prism (versión 6.05)).
La CE50 y la Emáx % para los Compuestos 1 y 2, y la OXM humana de tipo silvestre se calcularon esencialmente como se describe anteriormente. Los datos de CE50 y % Emáx para estos compuestos se proporcionan en la Tabla 7. Adicionalmente, Los Compuestos 1 y 2 aumentaron la producción de AMPc de una manera dependiente de la dosis (datos no mostrados). El número de repeticiones (n) se indica entre paréntesis.
Tabla 7: CE50 de los Compuestos 1 y 2, y OXM humana de tipo silvestre en el hGcg-R en hepatocitos humanos rimarios
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FARMACOCINÉTICA
Farmacocinética en macacos cangrejeros
Las propiedades farmacocinéticas in vivo de los compuestos de la presente invención se demuestran utilizando macacos cangrejeros.
Los compuestos se administran mediante una única dosis intravenosa o subcutánea de 50 nmoles/kg o 250 nmoles/kg. Se recoge sangre de cada animal a las 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 240, 288, 208, 480, 576 y 672 horas posdosificación.
Las concentraciones plasmáticas de los compuestos se determinan mediante un procedimiento de LC/MS (forma siglada de liquid chromatography-mass spectrometry, cromatografía de líquidos con espectrómetro de masas). En resumen, un compuesto de la presente invención se extrae de plasma de mono al 100 % (25 j l ) utilizando acetonitrilo. Se forman dos capas distintas tras la centrifugación con el compuesto ubicado en la capa líquida. Se transfirió una alícuota de 80 j l del sobrenadante a una placa de 96 pocillos, se diluyó con 150 j l de agua y 25 j l de ácido fórmico. La muestra diluida (10 j l) se inyectó en una columna Supelco Analytical Discovery BIO Wide Pore C5-3, 5 cm X 1 mm, de 3 jm . El efluente de la columna se dirige a un espectrómetro de masas Thermo Q-Exactive para su detección y cuantificación.
En experimentos realizados esencialmente como se describe para este ensayo, se administró a macacos cangrejeros una única dosis subcutánea (50 nmoles/kg) del Compuesto 1 en Tris HCl 40 mM (pH 8,0) a un volumen de 0,20 ml/kg. Se extrajo sangre de cada animal a las 2 (solo i.v.), 7, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 192, 240, 336, 480, 576, y 672 horas posdosis.
Se les administró a otros macacos cangrejeros una dosis única intravenosa (50 nmoles/kg) o subcutánea (50 o 250 nmoles/kg) del Compuesto 2 en Tris HCl 40 mM (pH 8,0) a un volumen de 0,20 ml/kg. Se extrajo sangre de cada animal a las 2 (solo i.v.), 7, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 192, 240, 336, 480, 576, y 672 horas posdosis.
Los datos del Compuesto 1 se proporcionan en la Tabla 9 y los datos del Compuesto 2 se proporcionan en la Tabla 10.
El Compuesto 1 alcanzó las concentraciones plasmáticas máximas medias aproximadamente 12 horas después de la dosis subcutánea de 50 nmol/kg. La semivida media es de 57 horas y el aclaramiento medio es de 2,16 ml/hora/kg (Tabla 8).
El Compuesto 2 alcanzó las concentraciones plasmáticas máximas medias aproximadamente 24 horas después de la dosis subcutánea de 50 nmol/kg. La semivida media es de 122 horas y el aclaramiento medio es de 0,55 ml/hora/kg (Tabla 9).
Tabla 8: Parámetros farmacocinéticos individuales y medios después de una única dosis subcutánea de nm lk ^ m 1 m n r r m h
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Tabla 9: Parámetros farmacocinéticos individuales y medios del Compuesto 2 después de una única dosis intravenosa o subcutánea a macacos can re eros machos
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continuación
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ESTUDIOS/N VIVO
Prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT, forma siglada de oral glucose tolerance test) en ratones DIO (forma siglada de diet-induced obese, obeso inducido por la dieta)
El modelo de ratón obeso inducido por dieta (DIO) es un modelo de resistencia a la insulina. En este estudio se utilizan ratones (C57BL/6) DIO macho de cinco a seis meses de Taconic Biosciences. Los animales se alojan individualmente en una instalación de temperatura controlada (24 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (las luces se encienden a las 06:00) y acceso libre a alimentos y agua. El período de aclimatación a la instalación es de dos semanas. El día antes del estudio, los animales se distribuyen al azar en grupos según su peso corporal. Esa misma tarde, los animales se mantienen en ayunas en jaulas limpias y se les administra una dosis de vehículo (Tris-HCl 40 mM, pH 8,0) o de los artículos de prueba mediante inyección subcutánea. La mañana siguiente, 16 horas después de la inyección del péptido, se obtienen los pesos corporales en ayunas para calcular las dosis de glucosa. Se toman muestras de sangre para medir el tiempo cero de glucosa. A continuación, se administra a los animales glucosa (2 g/kg) por sonda gástrica oral. Se obtuvieron dos lecturas de glucosa mediante glucómetros a los 15, 30, 60 y 120 minutos después de la glucosa oral. Se informa el promedio de dos lecturas de glucosa en cada punto temporal y se calcula un área bajo la curva. Los datos estadísticos se analizaron utilizando ANOVA con la comparación de Dunnett mediante JMP 6; la significación se indica en p < 0,05 frente al vehículo.
En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el compuesto 2 mostró una disminución de glucosa dependiente de la dosis durante la prueba de tolerancia, y el ABC de glucosa disminuyó en las tres dosis analizados de 1, 3 y 10 nmol/kg (Tabla 10).
Tabla 10: ABC de glucosa de ratones DIO macho tratados con el Compuesto 2 y semaglutida en respuesta a una OGTT 2 /k
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OGTT en ratones DIO tratados con estreptozotocina (STZ)
El modelo de ratón tratado con STZ es un modelo de diabetes temprana. En este estudio se utilizan ratones (C57BL/6) DIO macho de cinco a seis meses de Taconic Biosciences. Los animales se alojan individualmente en una instalación de temperatura controlada (24 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (las luces se encienden a las 6:00) y acceso libre a alimentos y agua. Después de dos semanas de aclimatación en la instalación, los ratones se inyectan por vía intraperitoneal con 50 mg/kg de STZ los martes y viernes. Dos semanas posinyección, los animales con niveles de glucosa entre 180-300 mg/dl a las 09:00 se seleccionan para el estudio de OGTt . El día antes del estudio, los animales se distribuyen al azar en grupos según el peso corporal y sus niveles de glucosa. Los animales se tratan con vehículo o los artículos de prueba mediante inyección subcutánea justo antes de retirar los alimentos durante la noche (16:00). A las 08:00 de la mañana siguiente, 16 horas después de la inyección del compuesto, se toman muestras de sangre para medir el tiempo cero de glucosa. Los animales reciben una dosis oral de glucosa de 2 g/kg. La glucosa se mide 15, 30, 60 y 120 minutos después de la exposición oral a glucosa. Los datos estadísticos se analizan utilizando ANOVA con la comparación de Dunnett mediante JMP 6. La significación se indica en p < 0,05 frente al vehículo.
En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, El Compuesto 2 mostró una disminución dependiente de la dosis en la fluctuación de glucosa durante la prueba de tolerancia. El ABC de glucosa disminuyó en las tres dosis analizadas de 1, 3 y 10 nmol/kg (Tabla 11).
Tabla 11: ABC de glucosa de ratones STZ macho tratados con el Compuesto 2 y semaglutida en respuesta a una OGTT 2 /k
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Control de la glucemia en ratones DIO
En este estudio se utilizan ratones (C57BL/6) DIO macho de cinco a seis meses de Taconic Biosciences. Los animales se alojan individualmente en una instalación de temperatura controlada (24 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (las luces se encienden a las 6:00) y acceso libre a alimentos y agua. Después de dos semanas de aclimatación en la instalación, los ratones se distribuyen al azar en grupos de tratamiento (n=7/grupo) en función de su peso corporal y glucosa en sangre. Se inyecta a los ratones por vía subcutánea una vez con vehículo o compuestos (25 nmol/kg). Se controla la glucosa en sangre a las 2 y 8 horas posinyección y después una vez al día a las 08:00 durante 4 días. Las OGTT se realizan a las 44 y 78 horas después de la inyección del péptido. Los datos estadísticos se analizan utilizando ANOVA con la comparación de Dunnett mediante JMP 6. La significación se indica en p < 0,05 frente al vehículo.
En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, Hasta 96 horas posinyección los ratones tratados con el Compuesto 2 y el Compuesto 4 tenían una glucosa más baja que los controles de vehículo. Cuando se realizó la OGTT, los ratones tratados con el Compuesto 2 y el Compuesto 4 tuvieron fluctuaciones de glucosa más bajas después de una exposición a glucosa oral en ambos puntos temporales.
El Compuesto 1 y el Compuesto 3 disminuyeron la glucosa en sangre durante hasta 72 horas (Tabla 12). Los ratones tratados con el Compuesto 1 y el Compuesto 3 tuvieron fluctuaciones de glucosa más bajas después de una exposición a glucosa oral, a las 44 horas posinyección del péptido (Tabla 13).
Tabla 12: Glucemia medida a las 2, 8, 24, 48, 72 y 96 horas posinyección en ratones DIO macho
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Tratamiento crónico en ratones DIO
Los efectos sobre la ingesta de alimentos y el peso/grasa corporal se evalúan en ratones DIO. En este estudio se utilizan ratones (C57BL/6) DIO de cinco a seis meses de Taconic Biosciences. Los animales se alojan individualmente en una instalación de temperatura controlada (24 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (las luces se encienden a las 6:00) y acceso libre a alimentos y agua. Los ratones se aclimatan a la instalación durante dos semanas. El día antes de que comience el estudio, la masa de grasa se mide por resonancia magnética nuclear (RMN) utilizando un instrumento Echo Medical System (Houston, Tejas). Los ratones se distribuyeron al azar en grupos de tratamiento (N = 7/grupo) en función del peso corporal y la masa de grasa, de modo que cada grupo tenía un peso corporal medio inicial y una de masa grasa similares. Se administra vehículo (Tris-HCl 40 mM, pH 8,0), compuestos de prueba o un control positivo de semaglutida mediante inyección subcutánea (s.c.) a ratones ad disponían de agua y alimentos a voluntad entre las 8-10 de la mañana, cada tres días durante 15 días. Las inyecciones s.c. se realizan los días 1, 4, 7, 10 y 13. El peso corporal y la ingesta de alimentos se miden justo antes de cada inyección durante todo el estudio. Los cambios porcentuales en el peso corporal se calculan de la siguiente manera:
100 x (Peso corporal final del animal — Peso corporal inicial del animal)
Peso corporal inicial del animal
Al finalizar el estudio, la masa de grasa total se mide de nuevo mediante RMN. Los datos estadísticos se analizan utilizando ANOVA con la comparación de Dunnett mediante JMP 6. La significación se indica en p < 0,05 frente al vehículo.
En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, Los Compuestos 1-4 reducen la ingesta de alimentos y el peso/grasa corporal como se muestra a continuación en la Tabla 14:
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Tratamiento agudo en ratones DIO
Para investigar las rutas metabólicas implicadas con el tratamiento de los compuestos de la presente invención, independientemente de la pérdida de peso, los compuestos se prueban en ratones (C57BL/6) DIO de forma aguda. Los ratones utilizados tienen de tres a cuatro meses de edad y se encuentran con una dieta alta en grasas durante al menos 4 semanas. Los animales se alojan individualmente en una instalación de temperatura controlada (24 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (las luces se encienden a las 6:00) y acceso libre a alimentos y agua. El vehículo o los compuestos de prueba se administraron a los ratones mediante inyección subcutánea a las 16:00 el día anterior al día del estudio. Los animales se sacrificaron 16 horas después para recoger sangre mediante punción cardiaca. Los datos estadísticos se analizan utilizando ANOVA con la comparación de Dunnett para JMP-6. La significación se indica en p < 0,05 frente al vehículo.
En experimentos realizados esencialmente como se describe en el ensayo, los Compuestos 1-3 disminuyen los niveles de colesterol sérico y de PCSK9, y aumentan los niveles de FGF-21 como se muestra en la Tabla 15. Por el contrario, el tratamiento con semaglutida no disminuye los niveles séricos de colesterol y PCSK9 ni aumenta los niveles de FGF-21. La ingesta de alimentos se redujo a un nivel similar en todos los grupos de tratamiento, lo que puede indicar que los cambios en el colesterol, PCSK9 y FGF-21 son independientes de la ingesta de alimentos.
Tabla 15: Efectos a udos sobre los niveles de PCSK9 colesterol FGF-21
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Efectos sobre el gasto calórico en ratones DIO
En este estudio se utilizan ratones DIO (C57BL/6) macho de siete a ocho meses de edad que pesan 45-50 g para evaluar el efecto de los compuestos de la presente invención sobre el metabolismo energético. Los animales se alojan individualmente en una instalación de temperatura controlada (24 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (las luces se encienden a las 22:00) y acceso libre a alimentos (TD95217)(Teklad) y agua. Después de 2 semanas de aclimatación en la instalación, los ratones se distribuyeron al azar en los grupos de tratamiento (N=6/grupo) en función del peso corporal de modo que cada grupo tenga un peso corporal medio inicial similar. Los animales se colocan en un calorímetro PhenoMaster/labMaster (TSE Systems, Chesterfield, MO) durante 8 días de aclimatación. Se administra por vía subcutánea vehículo (tampón Tris HCl 40 mM a pH 8,0, 10 ml/kg), artículo de prueba (15 nmol/kg) 0 semaglutida (60 nmol/kg) a ratones DIO alimentados a demanda, 30-90 minutos antes del inicio del ciclo de oscuridad cada tres días durante 15 días.
El cociente de calor y respiración (RER, forma siglada de respiratory exchange ratio, relación de intercambio respiratorio) se mide mediante calorimetría indirecta como se describe, utilizando un sistema de calorimetría de circuito abierto. RER es la relación del volumen de CO2 producido (VCO2) con respecto al volumen de O2 consumido (VO2). El calor se calcula teniendo en cuenta el peso corporal magro. El gasto calórico es en kcal/kg/3 días y se expresa como media ± ETM de 6 ratones por grupo. La significación estadística se evalúa mediante ANOVA bidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey.
En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, los ratones tratados con los Compuestos 1 y 2 aumentaron su tasa metabólica a partir de la semana 2 y mantuvieron el efecto durante todo el período de tratamiento, como se muestra en la Tabla 16. Sin embargo, la semaglutida no tuvo ningún efecto sobre la tasa metabólica. Este aumento en la tasa metabólica puede contribuir a la pérdida de peso adicional observada con la administración de los Compuestos 1 y 2, en comparación con la administración de semaglutida.
Tabla 16: Efecto del tratamiento crónico con el Compuesto 1, el Compuesto 2 o semaglutida sobre la tasa metabólica en ratones DIO
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continuación
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SECUENCIAS DE AMINOACIDOS
SEQ ID NO: 1 (OXM humana)
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA)
SEQ ID NO: 2 (Secuencia artificial)
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly (HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLXaa28GGPSSG)
en la que Xaa2 es Aib;
Xaa28 es Glu (E) o Ser (S);
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de (i) un enlace directo o (ii) un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24; y el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado.
SEQ ID NO: 3 (Secuencia artificial)
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly (HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLEGGPSSG)
en la que Xaa2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de (i) un enlace directo o (ii) un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24; y el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado.
SEQ ID NO: 4 (Secuencia artificial)
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly (HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLSGGPSSG)
en la que Xaa2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de (i) un enlace directo o (ii) un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24; y el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado.
SEQ ID NO: 5 (Secuencia artificial)
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly (HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLEGGPSSG)
en la que Xaa2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)-CO-(CH2)i 6 CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado.
SEQ ID NO: 6 (Secuencia artificial)
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly (HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLEGGPSSG)
en la que Xaa2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)-CO-(CH2)i s CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado.
SEQ ID NO: 7 (Secuencia artificial)
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly (HXaa2QGTFTSDYSKYLDEKKAKEFVEWLLSGGPSSG)

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de la siguiente fórmula:
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en el que
Xaa2 es Aib;
Xaa28 es Glu o Ser;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24, en el que el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t, en el que t es 1 o 2;
y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que Xaa28 es Glu.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que Xaa28 es Ser.
4. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que t es 1.
5. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que t es 2.
6. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el ácido graso C14-C24 es un monoácido saturado o un diácido saturado.
7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el ácido graso es un monoácido saturado o un diácido saturado seleccionado del grupo que consiste en ácido mirístico (ácido tetradecanoico)(monoácido C14), ácido tetradecanodioico (diácido C14), ácido palmítico (ácido hexadecanoico)(monoácido C16), ácido hexadecanodioico (diácido C16), ácido margárico (ácido heptadecanoico)(monoácido C17), ácido heptadecanodioico (diácido C17)., ácido esteárico (ácido octadecanoico)(monoácido C18), ácido octadecanodioico (diácido C18), ácido nonadecílico (ácido nonadecanoico)(monoácido C19), ácido nonadecanodioico (diácido C19), ácido araquídico (ácido eicosanoico)(monoácido C20), ácido eicosanodioico (diácido C20), ácido heneicosílico (ácido heneicosanoico)(monoácido C21), ácido heneicosanodioico (diácido C21), ácido behénico (ácido docosanoico)(C22), ácido docosanodioico (diácido C22), ácido lignocérico (ácido tetracosanoico)(monoácido C24) y ácido tetracosanodioico (diácido C24).
8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el ácido graso C14-C24 es ácido octadecanodioico.
9. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el ácido graso C14-C24 es ácido eicosanodioico.
10. Un compuesto de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el aminoácido C-terminal está amidado.
11. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y 10, en el que el compuesto es de la siguiente fórmula: His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)-CO-(CH2)16CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado (SEQ ID NO: 5),
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y 10, en el que el compuesto es de la siguiente fórmula: His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)2-CO-(CH2)16CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado (SEQ ID NO: 7);
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
13. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y 9-10, en el que el compuesto es de la siguiente fórmula: His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)-CO-(CH2)18CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado (SEQ ID NO: 6);
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
14. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y 9-10, en el que el compuesto es de la siguiente fórmula: His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Ser-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa 2 es Aib;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)2-CO-(CH2)18CO2H; y
el aminoácido C-terminal está amidado (SEQ ID NO: 8);
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
15. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.
17. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de la diabetes de tipo 2.
18. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de la obesidad.
19. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD).
20. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
21. Un compuesto intermedio de la siguiente fórmula:
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly
en la que Xaa2 es Aib;
Xaa28 es Glu o Ser; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado (SEQ ID NO: 9),
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
22. Un compuesto intermedio de acuerdo con la reivindicación 21, en el que Xaa28 es Glu.
23. Un compuesto intermedio de acuerdo con la reivindicación 21, en el que Xaa28 es Ser.
24. Un procedimiento para la fabricación de un compuesto de la siguiente fórmula: His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly en la que
Xaa2 es Aib;
Xaa28 es Glu o Ser;
la Lys en la posición 20 está químicamente modificada mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys con un ácido graso C14-C24 a través de un engarce entre la Lys en la posición 20 y el ácido graso C14-C24,
en el que el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t, en el que t es 1 o 2; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de:
(i) modificar un compuesto intermedio de la siguiente fórmula:
His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Glu-Lys-Lys-Ala-Lys-Glu-Phe-Val-Glu-Trp Leu-Leu-Xaa28-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly en la que
Xaa2 es Aib;
Xaa28 es Glu o Ser; y
el aminoácido C-terminal está opcionalmente amidado (SEQ ID NO: 9) mediante conjugación del grupo épsilon-amino de la cadena lateral de Lys en la posición 20 del compuesto intermedio con un ácido graso C 14-C24 a través de un engarce, en el que el engarce es ([2-(2-aminoetoxi)-etoxi]-acetil)2-(Y-Glu)t, en el que t es 1 o 2.
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI700291B (zh) * 2015-06-22 2020-08-01 美國禮來大藥廠 升糖素及glp-1共激動劑化合物
AU2016378739A1 (en) 2015-12-23 2018-07-05 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating metabolic disorders using binding proteins for gastric inhibitory peptide receptor (GIPR) in combination with GLP-1 agonists
JOP20170153A1 (ar) * 2016-07-15 2019-01-30 Lilly Co Eli نظائر urocortin-2 جديدة معدلة بحمض دهني لعلاج داء السكري وأمراض الكلى المزمنة
CN108299553B (zh) * 2017-01-13 2021-07-16 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 胃泌酸调节素修饰物
JOP20190177A1 (ar) * 2017-01-17 2019-07-16 Amgen Inc طريقة لعلاج أو تحسين اضطرابات أيضية باستخدام مساعدات مستقبل glp-1 مقترنة بمناهضات لمستقبل ببتيد مثبط معوي (gipr)
CA3075670C (en) * 2017-09-19 2022-05-31 Immunwork Inc. Pharmaceutical constructs with enhanced binding affinity with albumin
CN111278853B (zh) * 2017-11-06 2022-06-21 深圳市图微安创科技开发有限公司 基于胃泌酸调节素类似物glp-1r/gcgr双靶点激动剂多肽治疗胆汁性肝硬化
TWI809515B (zh) * 2017-12-21 2023-07-21 美商美國禮來大藥廠 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途
TWI767095B (zh) * 2017-12-21 2022-06-11 美商美國禮來大藥廠 腸促胰島素(incretin)類似物及其用途
WO2019140025A1 (en) * 2018-01-12 2019-07-18 Eli Lilly And Company Combination therapy
KR102779458B1 (ko) * 2018-11-12 2025-03-12 톈진 인스티튜트 오브 파마슈티컬 리서치 씨오., 엘티디. 글루카곤 유도 펩티드 및 이의 용도
CN111171135B (zh) * 2018-11-12 2023-04-07 天津药物研究院有限公司 具有双重受体激动作用的胰高血糖素衍生肽及其用途
CN111423506B (zh) * 2019-11-08 2023-06-27 成都奥达生物科技有限公司 一种glp-1化合物
CN115298207A (zh) * 2020-01-23 2022-11-04 伊莱利利公司 Gip/glp1共激动剂化合物
CN113336840B (zh) * 2020-03-02 2022-09-23 武汉帕肽生物医药有限责任公司 订书肽、其制备方法和用途
JP7526804B2 (ja) * 2020-03-11 2024-08-01 エニジェン カンパニー リミテッド 新規化合物を含む抗糖尿病及び抗肥満用組成物
CN113493504B (zh) * 2020-03-18 2024-02-27 深圳纳福生物医药有限公司 GIP-Exendin-4嵌合肽的分子改构及其二聚体在治疗糖尿病中的应用
WO2021205388A2 (en) * 2020-04-10 2021-10-14 Fresenius Kabi Oncology Limited An improved process for the preparation of semaglutide side chain
WO2021221482A1 (ko) 2020-04-29 2021-11-04 주식회사 원진바이오테크놀로지 신규한 단백질 결합체, 및 이의 비알콜성 지방간염, 비만 및 당뇨 질환의 예방 또는 치료 용도
AR122579A1 (es) 2020-06-12 2022-09-21 Lilly Co Eli Proceso para preparar un agonista dual glp-1 / glucagón
MX2023000698A (es) * 2020-07-15 2023-04-18 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Uso terapeutico del derivado de glucagon o conjugado del mismo para enfermedades hepaticas.
KR20230124035A (ko) * 2020-12-22 2023-08-24 일라이 릴리 앤드 캄파니 치료 펩티드 제제
CN112898405B (zh) * 2021-01-22 2023-02-28 深圳市图微安创科技开发有限公司 多肽化合物及其在预防或治疗糖尿病或糖尿病并发症中的应用
CN116410297A (zh) * 2021-07-19 2023-07-11 内蒙古博睿精创科技有限公司 长效glp-1多肽类似物及其制备方法和应用
WO2023016346A1 (zh) * 2021-08-10 2023-02-16 南京明德新药研发有限公司 含内酰胺桥的多肽化合物
KR20230037391A (ko) * 2021-09-09 2023-03-16 애니젠 주식회사 신규한 화합물을 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 조성물
PE20242116A1 (es) * 2021-11-19 2024-10-28 Soter Biopharma Pte Ltd Polipeptidos que contienen grapas y su aplicacion
TW202404996A (zh) * 2022-04-04 2024-02-01 美商美國禮來大藥廠 製備glp-1/升糖素雙重促效劑之方法
CN116970064A (zh) * 2022-04-29 2023-10-31 苏州星洲生物科技有限公司 Glp-1/gcg受体共激动剂、包含其的药物组合物及其用途
WO2023231730A2 (zh) * 2022-06-01 2023-12-07 信达生物制药(苏州)有限公司 使用mazdutide的治疗方法
CN119630415A (zh) 2022-06-01 2025-03-14 伊莱利利公司 使用gcg/glp1共激动剂用于治疗的方法
CN115536739B (zh) * 2022-07-04 2023-04-14 北京惠之衡生物科技有限公司 一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物的制备方法
CN117586373A (zh) * 2022-08-10 2024-02-23 成都奥达生物科技有限公司 一种长效双激动剂化合物
AU2023333905A1 (en) 2022-08-29 2025-03-20 Eli Lilly And Company Compositions for oral delivery
WO2024077149A2 (en) * 2022-10-05 2024-04-11 Eli Lilly And Company Peptides for incretin synthesis
WO2024112617A2 (en) * 2022-11-21 2024-05-30 Eli Lilly And Company Process for preparing a gip/glp1 dual agonist
WO2024163535A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Eli Lilly And Company Gip/glp1/gcg tri-receptor agonists and uses thereof
WO2024252366A1 (en) * 2023-06-09 2024-12-12 Sun Pharmaceutical Industries Limited Glp-1/gip dual, glp-1/gcg dual and glp-1/gip/gcg triple receptor agonists

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1137667T3 (da) * 1998-12-07 2005-02-14 Sod Conseils Rech Applic GLP-1-analoger
CA2852177A1 (en) * 2008-06-17 2009-12-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
EA019203B9 (ru) * 2008-06-17 2014-03-31 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Коагонисты глюкагонового рецептора/glp-1-рецептора
WO2011075393A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
JO2976B1 (en) 2009-12-22 2016-03-15 ايلي ليلي اند كومباني Axentomodulin polypeptide
RU2012136450A (ru) * 2010-01-27 2014-03-10 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Конъюгаты антагонист глюкагона - агонист gip и композиции для лечения метаболических расстройств и ожирения
AU2012273365A1 (en) 2011-06-22 2014-01-16 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
US9944687B2 (en) * 2011-07-04 2018-04-17 Imperial Innovations Limited Compounds and their effects on feeding behaviour
JP6324315B2 (ja) * 2011-11-17 2018-05-16 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ グルココルチコイド受容体の活性を示すグルカゴンスーパーファミリーのペプチド
EP2895506A1 (en) * 2012-09-17 2015-07-22 Imperial Innovations Limited Peptide analogues of glucagon and glp1
TWI608013B (zh) 2012-09-17 2017-12-11 西蘭製藥公司 升糖素類似物
UA116217C2 (uk) * 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
US20160058881A1 (en) * 2013-03-15 2016-03-03 Indiana University Research And Technology Corporation Prodrugs with prolonged action
TWI700291B (zh) * 2015-06-22 2020-08-01 美國禮來大藥廠 升糖素及glp-1共激動劑化合物

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MD3310371T2 (ro) 2020-12-31
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IL294099A (en) 2022-08-01
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