ES2776029T3 - Terapias basadas en el control de la estabilidad y función de las células T reguladoras por medio de un eje neuropilina-1:semaforina - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo que inhibe la interacción entre (i) una semaforina transmembrana clase IV expresada en una célula y (ii) neuropolina-1 en una célula T reguladora, para usar en un método de tratamiento de cáncer en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapias basadas en el control de la estabilidad y función de las células T reguladoras por medio de un eje neuropilina-1 :semaforina

Declaración con respecto a la investigación financiada federalmente

El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invención en virtud de la financiación reservada de las subvenciones núms. AI091977, AI039480 y AI098383 procedentes de los Institutos Nacionales de Salud y la subvención CORE de ayuda CA21765 del Centro Integral para el Cáncer del NCI.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida al tratamiento del cáncer afectando a la estabilidad y función de las células T reguladoras por medio de un eje Neuropilina-1 :Semaforina.

Antecedentes de la invención

Las células T reguladoras (Tregs) juegan un papel crucial en la prevención de la autoinmunidad, limitando la inmunopatología y manteniendo la homeostasis inmune1. Sin embargo, también representan una barrera principal a la inmunidad anti-tumoral efectiva y la inmunidad esterilizante a las infecciones víricas crónicas. Esto resalta la capacidad de las Tregs para dar forma y controlar una amplia variedad de respuestas inmunes. Foxp3 es un regulador transcripcional maestro necesario para el desarrollo, mantenimiento y estabilidad de las Tregs23. Los ratones y humanos con Foxp3 no funcionales carecen de Tregs y desarrollan una condición autoinmune sistémica letal, denominada como Scurfy en ratones e IPEX en humanos, resaltando la importancia de las Tregs en el mantenimiento de la homeostasis inmune2,3. Además, un quinteto de factor de transcripción forma un interruptor genético redundante para “fijar” la firma transcripcional de Treg y mejorar su estabilidad4. Aunque algunos factores externos, tal como el factor de crecimiento transformante p (TGFp), se ha mostrado que mantienen y/o mejoran la estabilidad y la función de Foxp35, no se sabe si existen rutas o factores extrínsecos a la célula adicionales.

Las Tregs residentes en el tejido son algunas de las primeras células linfoides en responder a una infección o respuesta inflamatoria, limitando así la patología inmune6,7. Algunos entornos, tales como tumores e infecciones crónicas, pueden ser altamente inflamatorios y por consiguiente pueden necesitar mecanismos adicionales o programas genéticos para mejorar la estabilidad y función de las Tregs para limitar la enfermedad inflamatoria o autoinmune no prevista. Por consiguiente hay un considerable interés en la identificación de rutas moleculares que controlen la estabilidad y función de Treg ya que muchas enfermedades inmuno-mediadas se caracterizan por la función de Treg exacerbada o limitada, y la transferencia adoptiva de las Tregs para el tratamiento de una variedad de enfermedades se está siguiendo de forma activa en la clínica.

La estabilidad de Treg frente a la plasticidad ha sido un tópico de considerable debate reciente. Algunos estudios han definido papeles críticos para factores de transcripción específicos de la línea, tal como T-bet, IRF4 y STAT3, en la regulación de tipos específicos de respuestas de células T conducidas por los mismos factores de transcripción8-10. En contraste, otros han sugerido que una proporción demostrable de Tregs se diferencian en sitios inflamatorios en “ex-Tregs” y ganan función efectora11. Los factores extrínsecos a la célula y mecanismos moleculares por los que las Tregs alteran su perfil transcripcional para mantener su estabilidad, regular la inmunidad en sitios inflamatorios y controlar estos destinos celulares alternativos permanecen oscuros.

La neuropilina-1 (Nrp1; véase, p.ej., Núms. de Acceso a GenBank NM_008737 (ratón) y NG_030328 (humano) además de varias isoformas) es un co-receptor unido a membrana a un receptor de tirosina quinasa tanto para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) como para la semaforina clase III Sema3a (véase, por ejemplo, Catalano, J Immunol. 15 de noviembre de 2010; 185(10):6373). Nrp1 juega papeles versátiles en la guía del axón, angiogénesis, supervivencia celular, migración e invasión15. Nrp1 induce el colapso del cono de crecimiento del axón, evitando la infiltración en tejidos privilegiados y su supresión genética en ratones da por resultado mortalidad embrionaria16. También se ha mostrado que Nrp1 interactúa con el factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGFp) y el factor de crecimiento transformante beta (TGFp)1718. Se ha mostrado que Nrp1 se expresa altamente en Tregs19-21. Aunque se ha implicado un papel para Nrp1 en las células T22, no se ha identificado un papel para Nrp1 en Tregs y se ha sugerido que Nrp1 no se expresa en Tregs humanas25.

Compendio de la invención

Como se especifica en la sección de antecedentes, hay una gran necesidad en la técnica de identificar las rutas moleculares que controlan la estabilidad y función de Treg y usar este conocimiento para desarrollar nuevos compuestos terapéuticos para el tratamiento de cáncer, infecciones y diversas condiciones inflamatorias y autoinmunes. La presente descripción satisface esta y otras necesidades demostrando que la neuropilina-1 (Nrp1) restringida a células T reguladoras (Treg) interactúa con el ligando de superficie celular semaforina-4a (Sema4a) (p.ej., en células T convencionales (Tconv), células dendríticas convencionales (cDCs), y/o células dendríticas plasmacitoides (pDCs)) para potenciar la función de Treg y mejorar su supervivencia en sitios inflamatorios.

La invención se define por las reivindicaciones.

En un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo que inhibe la interacción entre (i) una semaforina transmembrana clase IV expresada en una célula y (ii) neuropilina-1 en un célula T reguladora, para usar en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo que inhibe la interacción entre (i) una semaforina transmembrana de clase IV expresada en una célula y (ii) neuropilina-1 en una célula T reguladora, para usar en un método de mejora de la eficacia de una vacuna para tratar o prevenir el cáncer en un sujeto. En una realización de este aspecto, el anticuerpo o fragmento se administra al sujeto antes de que la vacuna se administre al sujeto. En otra realización de este aspecto, el anticuerpo o fragmento se administra al sujeto junto con la vacuna.

El inhibidor del eje Nrp1 :semaforina transmembrana clase IV inhibe la interacción entre la semaforina transmembrana clase IV (p.ej. Sema4a) en una célula que expresa dicha semaforina transmembrana (p.ej., una célula T convencional (Tconv), una célula dendrítica convencional (cDC), o una célula dendrítica plasmacitoide (pDC)) y Nrp1 en la Treg. En una realización, el inhibidor del eje Nrp1 :semaforina no afecta a la interacción Nrp1-VEGF en dicha Treg. Dicha Treg está en un sujeto (p.ej., humano) y el inhibidor del eje Nrp1:semaforina se administra al sujeto. El sujeto tiene un cáncer (p.ej., melanoma o glioblastoma). El inhibidor del eje Nrp1 :semaforina es un anticuerpo (p.ej., un anticuerpo que no afecta a la interacción Nrp1-VEGF en dicha Treg).

La descripción describe también más generalmente un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto (p.ej., humano) que lo necesita, comprendiendo el método inhibir el eje neuropilina-1 (Nrp1):semaforina en las células T reguladoras (Tregs) del sujeto. Un método descrito comprende inhibir la interacción entre una semaforina transmembrana (p.ej., una semaforina clase IV tal como, p.ej., Sema4a) en células que expresan dicha semaforina transmembrana (p.ej., células T convencionales (Tconv), células dendríticas convencionales (cDCs), y/o células dendríticas plasmacitoides (pDCs)) y Nrp1 en las Tregs del sujeto. En una realización de la descripción general, la enfermedad es un cáncer (p.ej., melanoma o glioblastoma). En otra realización de la descripción general, la enfermedad es una infección en que las Tregs están bloqueando la inmunidad esterilizante (p.ej., una infección crónica). En una realización, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor del eje neuropilina-1 (Nrp1):semaforina en las Tregs del sujeto. En una realización, el inhibidor del eje Nrp1:semaforina es un anticuerpo (p.ej., un anticuerpo que no afecta a la interacción Nrp1-VEGF en las Tregs del sujeto). En otra realización descrita, el inhibidor del eje Nrp1 :semaforina es una molécula de semaforina (p.ej., una versión soluble de una proteína semaforina transmembrana [p.ej., una semaforina clase IV como, p.ej., Sema4a] o un fragmento o un derivado o un análogo del mismo [que incluye varias moléculas de fusión tal como, p.ej., un dominio extracelular Sema4a condensado a la región Fc de IgG1 en el extremo C], en el que dicha versión soluble de una proteína, fragmento, derivado o análogo de semaforina transmembrana es capaz de unirse con alta afinidad y especificidad a Nrp1 en las Tregs sin potenciar el eje Nrp1 :semaforina en dichas Tregs). En aún otra realización, el inhibidor del eje Nrp1 :semaforina es un dominio extracelular soluble de proteína Nrp1 o un fragmento o un derivado o un análogo del mismo, en el que dicho dominio extracelular soluble de proteína, fragmento, derivado o análogo de Nrp1 es capaz de unirse con alta afinidad y especificidad a una semaforina transmembrana (p.ej., una semaforina clase IV tal como, p.ej., Sema4a) evitando así que dicha semaforina transmembrana potencie el eje Nrp1 :semaforina en las Tregs del sujeto. En una realización adicional, el inhibidor del eje Nrp1:semaforina inhibe la expresión de proteína Nrp1 en las Tregs del sujeto (p.ej., es un ARNip o un oligonucleótido antisentido). En una realización adicional, el inhibidor del eje Nrp1 :semaforina evita que Nrp1 se una con su(s) ruta(s) de señalización corriente abajo. En una realización específica, el inhibidor del eje Nrp1 :semaforina inhibe una ruta de señalización entre el dominio citoplasmático de la proteína Nrp1 que comprende la secuencia de aminoácidos C-terminal SEA (motivo de unión al dominio PDZ C-terminal) y la proteína PTEN; dicho inhibidor puede ser, p.ej., un péptido o una molécula pequeña o un fragmento de proteína Nrp1 que comprende todo o parte de su dominio citoplasmático que comprende la secuencia de aminoácidos C-terminal SEA o un derivado o un análogo de la misma. En una realización específica, el inhibidor del eje Nrp1 :semaforina es una molécula pequeña. En otra realización, el método comprende además administrar al sujeto un tratamiento inmunomodulador adicional (p.ej., una vacuna terapéutica, un inhibidor de control o un activador). En aún otra realización, el método comprende además administrar al sujeto una quimioterapia o una terapia de radiación (para el tratamiento de cánceres) o administrar un antibiótico (para el tratamiento de infecciones).

En una parte separada de la descripción general, la descripción proporciona un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto (p.ej., humano) que lo necesita, comprendiendo el método activar el eje neuropilina-1 (Nrp1):semaforina en las células T reguladoras (Tregs) del sujeto. En una realización de la descripción general, el método comprende potenciar la interacción entre una semaforina transmembrana (p.ej., una semaforina clase IV tal como, p.ej., Sema4a) en células que expresan dicha semaforina transmembrana (p.ej., células T convencionales (Tconv), células dendríticas convencionales (cDCs), y/o células dendríticas plasmacitoides (pDCs)) y Nrp1 en las Tregs del sujeto. En una realización descrita, el sujeto tiene una enfermedad autoinmune o inflamatoria. En una realización, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista del eje neuropilina-1 (Nrp1):semaforina en las Tregs del sujeto. En una realización, el agonista del eje Nrp1 :semaforina es una molécula de semaforina (p.ej., una molécula de semaforina multimerizada y/o una molécula de semaforina inmovilizada en una superficie o una perla). En una realización, la molécula de semaforina es una semaforina clase IV (p.ej., Sema4a) o un fragmento o un derivado o un análogo de la misma. En una realización, el agonista del eje Nrp1 :semaforina es un anticuerpo. En otra realización, el agonista del eje Nrp1 :semaforina es una molécula pequeña. En aún otra realización, el agonista del eje Nrp1 :semaforina mejora la expresión de Nrp1 en las Tregs del sujeto. En una realización adicional, el agonista del eje Nrp1 :semaforina mejora la unión de Nrp1 con su(s) ruta(s) de señalización corriente abajo. En otra realización, el método comprende además administrar al sujeto otra terapia que mejora las Tregs o bloquea la inflamación.

Estos y otros aspectos de la presente invención y la descripción serán evidentes para los expertos en la técnica en la siguiente descripción, reivindicaciones y dibujos.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-E demuestran que la semaforina 4a potencia la función de células T reguladoras. A, ensayo de supresión Transwell de Tconv estimuladas con perlas cubiertas con anti-CD3/anti-CD28 en el pocillo inferior cuando las células T reguladoras (Tregs) se estimulan en el pocillo superior en presencia de los tipos de células indicados. Para algunas condiciones, la población de células de cocultivo se fijó antes de la estimulación de Treg. B, ensayo de supresión de Transwell en que se incluyeron anticuerpos de neutralización a semaforina-4a (Sema4a). C, Tconv CD4+ o CD8+ se transfectaron con un control o se transfectaron con ARNip desordenado o ARNip de Sema4a y después se evaluó el potencial de estimulación en un ensayo de supresión Transwell. D, ensayo de supresión Transwell en que se estimularon monocultivos de Treg con perlas cubiertas con IgG1 de ratón o Sema4a-Ig en el pocillo superior. E, ensayo de supresión Transwell en que se incluyeron células dendríticas fijas clasificadas ex vivo directo además de anticuerpos de neutralización a semaforina-4a (Sema4a). Los resultados representan la media de cinco [A, D] o tres [B, C, E] experimentos. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001 mediante la prueba t no pareada.

Las Figuras 2A-I demuestran que Nrp1 actúa como el ligando para semaforina-4a en Tregs. A, ensayo de supresión Transwell en que los cocultivos Tconv:Treg se estimularon en presencia de un anticuerpo anti-Nrp1 de neutralización o su control de isotipo. B, ensayo de supresión Transwell con Tregs Foxp3Cre o Nrp1,/,Foxp3Cre. C, ensayo de supresión Transwell usando Treg WT, IL-10-/- o Ebi3-/- en el pocillo superior cocultivado con perlas Sema4a-Ig y Tconv WT o dnTGFbRII en el pocillo inferior. D, ensayo de supresión Transwell usando Tregs cultivadas con perlas Sema4a-Ig en presencia o ausencia de anticuerpos de neutralización a IL-10 e IL-35. E, Tabulación del análisis citométrico de flujo de tinción de Anexina V y 7-AAD en Treg 48 horas después de la estimulación con perlas cubiertas con anti-CD3/CD28, IL-2, y perlas cubiertas con isotipo o Sema4a-Ig. F, expresión de NRP-1 en células Tconv o Treg humanas clasificadas a partir de sangre de cordón umbilical y cultivo con anti-CD3, anti-CD28, e IL-2 durante los tiempos indicados. G, ensayo de supresión Transwell en que se cultivaron Treg humanas amplificadas 8 días con perlas cubiertas con IgG o hSema4a-Ig, o con Teff humanas autólogas fijadas en presencia o ausencia de anticuerpos de bloqueo a NRP1. H, ensayo de unión basado en ELISA en que las placas cubiertas con mNrp1 recombinante se incubaron con Sema4a-Ig o IgG1 de ratón, en presencia de controles de isotipo, anti-Nrp1 o anti-Sema4a. Se detectó Sema4a-Ig o IgG1 de ratón usando un anticuerpo anti-isotipo. I, ensayo de supresión Transwell en que se estimularon cocultivos Tconv:Treg en presencia de un anticuerpo anti-Nrp1 de neutralización o su control de isotipo. Los resultados representan la media de tres [A, D-F, H, I] o cinco [B, C, G] experimentos. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001 mediante la prueba t no pareada.

Las Figuras 3A-C demuestran que las Tregs deficientes en Nrp1 previenen la enfermedad autoinmune de animales deficientes en Foxp3. A, curva de supervivencia de ratones macho Foxp3- que no recibieron inyección de 1x106 Treg Foxp3Cre o Nrp1f/fFoxp3Cre a los 1-2 días de edad. B, puntuaciones clínicas a las 5 semanas de ratones tratados como en A. C, puntuaciones histológicas del hígado, pulmón y pabellón de la oreja (combinados) de ratones tratados como en a. Los resultados representan tres experimentos independientes. **, p<0,01 mediante ANOVA unidireccional [A], **, p<0,001 mediante prueba t no pareada [B-C], ns, no significativo, p>0,05.

Las Figuras 4A-J demuestran que las Tregs deficientes en Nrp1 no logran suprimir las respuestas anti-tumorales o colitis altamente inflamatoria. A, curva de crecimiento tumoral (arriba) y gráfico de supervivencia (abajo) de ratones Foxp3Cre y Nrp1f/fFoxp3Cre que reciben 1,25x105 células de melanoma MC38 s.c. B, como en A, pero los ratones recibieron 1,25x105 timoma EL4 i.d. C, como en A, pero los ratones recibieron 1,25x105 de melanoma B16 i.d. D, conteos de metástasis pulmonar de ratones Foxp3Cre o Nrp1f/fFoxp3Cre inyectados con 2,5-10x105 células B16 i.v.

17-20 días antes. E, Tabulación del análisis citométrico de flujo de linfocitos que infiltran el tumor de ratones Foxp3Cre o Nrp1f/fFoxp3Cre inyectados i.d. con B16 18 días antes. F, Curva de crecimiento tumoral de ratones C57/BL6 que recibieron 1,25x105 de melanoma B16 i.d. Cuando los tumores fueron palpables (día 5, indicado por una flecha), los ratones comenzaron a recibir inyecciones de anti-Nrp1 o su control de isotipo (dosis inicial de 400 pg, 200 pg cada 3 días). G, Histología de intestino grueso de ratones Rag2-/- que habían o no habían recibido 4x105 células CD4+CD45RB+CD25- para inducir colitis, después se detectó PBS o 1x106 Tregs de Foxp3Cre o Nrp1f/fFoxp3Cre después de la colitis. H, expresión de Sema4a de diversas células inmunes en ndLN, dLN o TIL. I, Curva de crecimiento tumoral de ratones C57/BL6 que reciben 1,25x105 de melanoma B16 i.d. simultáneas con inyecciones de control de isotipo, anti-Sema4a, o anti-Nrp1 (100 pg) dos veces a la semana. J, Curva de crecimiento tumoral como en g excepto que los ratones recibieron Sema4a-Ig dos veces a la semana. Los resultados representan la media de cinco (A-C, I-J n=10-25 ratones), tres (D, E, F, H n=8-17 ratones), o cuatro (G) experimentos. *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, mediante (A-C, I-J) ^a N^oV^a unidireccional o (D-F, H) prueba t no pareada.

Figuras 5 A-D demuestran que la ligadura de Nrp1 por Sema4a promueve la estabilidad de Treg a través de la modulación de la señalización Akt-mTOR. A, análisis citométrico de flujo de la señalización Akt en Tregs Foxp3Cre o Nrp1,/,Foxp3Cre. Las Tregs purificadas por citometría de flujo se dejaron descansar o se estimularon con perlas anti-CD3/anti-CD28 toda la noche en presencia de perlas cubiertas con Sema4a-Ig o control de isotipo. B, análisis microscópico TIRF de activación de Akt en sinapsis inmunológicas (IS) de Tregs estimuladas 20 min en una bicapa lipídica cubierta con anticuerpos anti-TCR en presencia o ausencia de Sema4a-Ig. C, Análisis de inmunoprecipitación de Nrp1 que usa Tregs expandidas con PMA e ionomicina durante 3 días, seguido por una expansión de 5-7 días en 500 U/mL de rhIL-2, privadas de suero durante 3 h, después estimuladas como se indica durante 3 horas antes de IP. D, Ensayo de supresión Transwell usando Tregs Foxp3Cre o Ptenf/fFoxp3Cre. Los resultados son la media de tres (A, B, D) o representan al menos tres experimentos (C). *, p<0,05, ** p<0,01, mediante la prueba t no pareada.

Figuras 6A-D demuestran que la neuropilina frena la activación de Akt en IS por medio de PTEN. A, Tabulación de la ocurrencia de pAkt en IS de la Figura 5B. B, microscopía TIRF de activación en IS de Akt y pTyr en Treg Foxp3Cre o Nrp1f/fFoxp3Cre purificadas por citometría de flujo y después estimuladas en una bicapa lipídica que contiene anti-TCR e IgG o Sema4a-Ig. C, microscopía TIRF de reclutamiento en IS de neuropilina y activación de Akt en Treg Foxp3Cre o Ptenf/fFoxp3Cre purificadas por citometría de flujo y después estimuladas durante 20 minutos en una bicapa lipídica que contiene anti-TCR e IgG o Sema4a-Ig. D, Tabulación de ocurrencia de pAkt en IS de C. Los resultados son representativos de tres [A-B] o dos [C-D] experimentos independientes. *** p<0,001 mediante ANOVA unidireccional.

Figuras 7A-I demuestran que Treg que infiltra al tumor porta una firma similar a la ligadura Sema4a:Nrp1. A, activación Akt de Treg que infiltra al tumor. Los ratones Foxp3Cre o Nrp1f/fFoxp3Cre que portan tumor se sacrificaron en el día 12 y se cosecharon ndLN y TIL. Después de centrifugación por gradiente las células se fijaron inmediatamente y se tiñeron para activación de Akt. El histograma sombreado indica control de isotipo. Los resultados se tabulan por debajo de normalizado para la tinción de control de isotipo. Tinción de Helios (B), IRF4/RORYt (C), Ki67/BrdU (D), caspasa-3 escindida (E) Bcl2 (F) IL-10 (G) CD73 (H) y Lag-3 (I) de ndLN, dLN o TIL de ratones Foxp3Cre o Nrp1f/fFoxp3Cre que portan tumores. Para el análisis de Ki67/BrdU, los animales se inyectaron con BrdU 14 h antes de la cosecha. Para la tinción IL-10, las células se re-estimularon con PMA e ionomicina durante 16 h en presencia de un inhibidor de transporte de proteína. Los resultados representan la media de tres experimentos independientes. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 mediante prueba t pareada [A, n=7] o prueba t no pareada [B-I, n= 8-25].

Figura 8 muestra esquemáticamente como la neuropilina mantiene la estabilidad de Treg. Las Treg no tratadas anteriormente mantienen baja activación de Akt, que promueve su quiescencia a través de la actividad de factores como Foxos y KLF2 (izquierda). Tras la activación, las Tregs estimuladas en ausencia de Sema4a:Nrp1 tienen alta activación de Akt, que promueve la exclusión nuclear de Foxos, llevando a la pérdida de la estabilidad de Treg (centro). La ligadura de Nrp1 por medio de Sema4a frena la activación de Akt por medio de reclutamiento de PTEN, inhibiendo la exclusión nuclear de Foxos (derecha). Esto promueve un programa genético asociado con la estabilidad y función Treg aumentada.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en una observación inesperada de que que el ligando de superficie de la célula inmune semaforina-4a (Sema4a) en células T murinas y humanas convencionales y el receptor restringido a célula T reguladora (Treg) neuropilina-1 (Nrp1) interactúan para potenciar la función de Treg y potenciar su supervivencia. Los ratones con una supresión restringida a Treg de Nrp1 muestran tolerancia inducida por el tumor limitada, y por consiguiente resistencia sustancial a ciertos tumores, sin embargo no desarrollan ninguna manifestación autoinmune o inflamatoria. Como se especifica en la sección de ejemplos, debajo, el bloqueo de Nrp1 también tiene eficacia terapéutica frente a tumores pre-existentes. Nrp1 se recluta a la sinapsis inmunológica (IS) y reprime la actividad de Akt por medio de fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN) que facilita la translocación nuclear de Foxo. Esto induce un programa transcripcional que promueve la estabilidad, supervivencia y función de Treg mientras que reprime la inducción de factores de transcripción específicos del linaje. Por consiguiente, la ligación de Nrp1 refuerza la estabilidad y función de Treg en sitios altamente inflamatorios pero es prescindible para el mantenimiento de la homeostasis inmune, resaltando la inhibición del eje Nrp1-semaforina como una diana inmunoterapéutica en cáncer e infecciones, mientras su potenciación como una diana en el tratamiento de autoinmunidad e inflamación. El bloqueo de la interacción Nrp1-semaforina podría limitar la función de Treg en tumores pero no mejoraría en otra parte la actividad anti-tumoral sin efectos secundarios adversos. Esto puede proporcionar un tratamiento efectivo para el cáncer y la prevención en etapas muy tempranas de desarrollo tumoral y durante las etapas tardías, incluyendo metástasis. Enfoques similares podrían ser eficaces en cualquier otra enfermedad donde las Tregs plantean una barrera, (p.ej., infecciones crónicas en que las Tregs están bloqueando la inmunidad esterilizante, tal como, p.ej., infecciones HCV, HBV, HIV, etc.) y pueden mejorar la vacunación. Por otro lado, mejorar la interacción Nrp1-semaforina aumentaría la función de Treg en enfermedades donde fallan (p.ej., condiciones autoinmunes e inflamatorias). En conexión con la mejora de la interacción Nrp1-semaforina para aumentar la función de Treg, también se describe en la presente memoria el enfoque de aproximación adoptiva, en la que las Tregs del paciente se expanden ex vivo en presencia de un agonista de la interacción Nrp1 -semaforina y después se reintroducen en el mismo paciente o se administran a un paciente diferente.

Definiciones

Los términos “Treg” o “célula T reguladora” se refieren a células T CD4+ que suprime la proliferación de células T CD4+CD25- y CD8+ y/o la función efectora, o de otra forma modulan a la baja una respuesta inmune. Principalmente, las Treg pueden disminuir las respuestas inmunes mediadas por células asesinas naturales, células T asesinas naturales además de otras células inmunes. En una realización preferida, las Tregs de la invención son Foxp3+.

Los términos “función de célula T reguladora” o “una función de Treg” se usan de forma intercambiable para referirse a cualquier función biológica de una Treg que da por resultado una reducción en la proliferación de células T CD4+CD25- o CD8+ o una reducción en una respuesta inmune mediada por célula T efectora. La función de Treg puede medirse por medio de técnicas establecidas en la técnica. Ejemplos no limitantes de ensayos in vitro útiles para medir la función de Treg incluyen el ensayo de supresión Transwell descrito en la sección de ejemplos, debajo, además de, más generalmente, ensayos in vitro en que las células T convencionales (Tconv) diana y Tregs purificadas a partir de sangre periférica humana o sangre del cordón umbilical (o bazos o nódulos linfáticos murinos) se activan opcionalmente mediante perlas cubiertas con anti-CD3+ anti-CD28 (o células que presentan antígeno (APCs) tales como, p.ej., esplenocitos irradiados o células dendríticas purificadas (DCs) o PBMCs irradiadas) seguido por la detección in vitro de la proliferación de células T convencionales (p.ej., midiendo la incorporación de nucleótidos radioactivos (tal como, p.ej., [3H]-timidina) o nucleótidos fluorescentes, o mediante el kit de ensayo de proliferación celular MTT de Cayman Chemical, o monitorizando la dilución de un éster fluorocromo verde CFSE o tinte seminaftarodaflúor (SNARF-1) mediante citometría de flujo). Otros ensayos comunes miden las respuestas a citoquina de las células T. Los ensayos in vivo útiles de la función de Treg incluyen ensayos en modelos animales de enfermedades en que las Tregs juegan un papel importante, que incluye, p.ej., (1) modelo de homeostasis (que usa células T CD4+ que se expanden homeostáticamente no tratadas anteriormente como células diana que se suprimen principalmente por Tregs), (2) modelo de recuperación de la enfermedad del intestino inflamatorio (IBD) (que usan células T Th1 (Th17) como células diana que se suprimen principalmente mediante Tregs), (3) modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) (usando células T Th17 y Th1 como célula diana que se suprimen principalmente por Tregs), (4) modelo de melanoma B16 (supresión de inmunidad antitumoral) (usando células T CD8+ como células diana que se suprimen principalmente por Tregs), (5) supresión de la inflamación del colon en colitis de transferencia adoptiva en el que las células Tconv CD4+CD45RBhi no tratadas anteriormente se transfieren a ratones Rag1-/-, y (6) modelo de rescate de Foxp3-(usando linfocitos como células diana que se suprimen principalmente por Tregs). Según un protocolo, todos los modelos necesitan ratones para poblaciones de células T donantes además de ratones Rag1-/- o Foxp3- para receptores. Para más detalles en varios ensayos útiles véase, p.ej., Collison y Vignali, In Vitro Treg Suppression Assays, Capítulo 2 en Regulatory T Cells: Methods and Protocolos, Methods in Molecular Biology, Kassiotis y Liston eds., Springer, 2011,707:21-37; Workman et al., In Vivo Treg Suppression Assays, Capítulo 9 en Regulatory T Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Kassiotis y Liston Eds., Springer, 2011, 119-156; Takahashi et al., Int. Immunol., 1998, 10:1969-1980; Thornton et al., J. Exp. Med., 1998, 188:287-296; Collison et al., J. Immunol., 2009, 182 :6121-6128 ; Thornton y Shevach, J. Exp. Med., 1998, 188 :287-296 ; Asseman et al., J. Exp. Med., 1999, 190:995-1004; Dieckmann et al., J. Exp. Med., 2001, 193:1303-1310; Belkaid, Nature Reviews, 2007, 7:875-888; Tang y Bluestone, Nature Immunology, 2008, 9:239-244; Bettini y Vignali, Curr. Opin. Immunol., 2009, 21:612-618; Dannull et al., J Clin Invest, 2005, 115(12):3623-33; Tsaknaridis, et al., J. Neurosci Res., 2003, 74:296-308.

El término “eje neuropilina-1 (Nrp1):semaforina de una célula T reguladora (Treg)” como se usa en la presente memoria se refiere a la ruta de señalización iniciada por la semaforina (p.ej., una semaforina expresada por una célula tal como, p.ej., una célula T convencional, o una semaforina recombinante), ligadura de Nrp1, y la posterior señalización corriente abajo.

Los términos “antagonista” o “inhibidor” en conexión con el eje Nrp1:semaforina de Tregs se usan de forma intercambiable en la presente memoria y se refieren a cualquier agente que pueda (i) interferir con la ligadura productiva y/o reticulado de semaforina:Nrp1 o (ii) inhibir las consecuencias de la señalización corriente abajo inmediata de Nrp1 en las Tregs. La inhibición de la interacción de Nrp1 :semaforina en las Tregs puede evaluarse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, incluyendo el ensayo de supresión Transwell descrito en la sección de ejemplos, debajo.

Los términos “agonista” o “potenciador” en conexión con el eje Nrp1:semaforina de las Tregs se usan de forma intercambiable en la presente memoria y se refieren a cualquier agente que pueda (i) mejorar la interacción de Nrp1 :semaforina, o (ii) imitar la estimulación de semaforina y la señalización de Nrp1 de forma artificial a la Treg, o (iii) activar las consecuencias de señalización corriente abajo inmediata de Nrp1 en las Tregs. La mejora de la interacción de Nrp1:semaforina en las Tregs puede evaluarse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, incluyendo el ensayo de supresión Transwell descrito en la sección de ejemplos, debajo.

Para aplicaciones terapéuticas, los agonistas y antagonistas de la presente descripción pueden usarse como composiciones farmacéuticas y pueden combinarse opcionalmente con otros agonistas/antagonistas de la descripción u otras moléculas terapéuticas.

El término “una molécula de semaforina” como se usa en la presente memoria en conexión con agonistas del eje Nrp1:semaforina de Tregs incluye moléculas de semaforina transmembrana implicadas en la interacción con Nrp1 en Tregs (p.ej., Sema4a), varias versiones inmovilizadas en la superficie y en perlas de dichas moléculas, además de multímeros, derivados, mutantes, análogos y fragmentos de dichas moléculas que pueden usarse para mejorar una función o aumentar la estabilidad de las Tregs. Ejemplos no limitantes de dichas moléculas de semaforina agonistas se tratan en más detalle a continuación e incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de semaforina derivadas de IgM que arman complejos multiméricos incapaces de fijar complementos, que reticulan Nrp1 de forma soluble.

El término “una molécula de semaforina” como se usa en la presente memoria en conexión con inhibidores del eje Nrp1 :semaforina de Tregs incluye versiones solubles de moléculas de semaforina transmembrana implicadas en la interacción con Nrp1 en Tregs (p.ej., Sema4a) además de varios derivados, mutantes, análogos y fragmentos de dichas moléculas (que incluyen varias moléculas de fusión), que pueden usarse para inhibir una función o disminuir la estabilidad de las Tregs. Ejemplos no limitantes de dichas moléculas de semaforina inhibidoras se tratan en más detalle a continuación e incluyen, por ejemplo, varios fragmentos solubles de Sema4a y derivados o análogos de los mismos que superan a la Sema4a endógena para la unión a Nrp1. En una realización específica, la molécula de semaforina inhibidora es proteína de fusión Sema4a-Ig, que es una fusión (en el extremo C) entre el dominio extracelular de Sema4a (fragmento Met1 - His683 de núm. de acceso GenBank NP_038686) y la región Fc de IgG1 humana o murina.

El término “análogo” se refiere a una molécula que no es idéntica, pero tiene características funcionales o estructurales análogas. Por ejemplo, un análogo de polipéptido conserva la actividad biológica de un polipéptido que se da de forma natural correspondiente, mientras que tiene ciertas modificaciones bioquímicas que mejoran la función del análogo respecto a un polipéptido que se da de forma natural. Dichas modificaciones bioquímicas podrían aumentar la resistencia a la proteasa, permeabilidad de membrana, o vida media del análogo, sin alterar, por ejemplo la unión al ligando. Un análogo puede incluir un aminoácido no natural.

El término “inflamación” como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier respuesta inmune excesiva o indeseable. El término “enfermedad inflamatoria” como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier patología asociada con una respuesta inmune excesiva o indeseable.

El término “aproximadamente” significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se determina por un experto en la técnica, que dependerá en parte de cómo el valor se mide o determina, es decir, las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, “aproximadamente” puede significar dentro de una desviación estándar aceptable, por la práctica en la técnica. De forma alternativa, “aproximadamente” puede significar un intervalo de hasta ±20%, preferiblemente hasta ±10%, más preferiblemente hasta ±5%, y más preferiblemente aún hasta ±1% de un valor dado. De forma alternativa, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 2 veces, de un valor. Donde se describen valores particulares en la solicitud y reivindicaciones, a menos que se afirme otra cosa, el término “aproximadamente” está implícito y en este contexto significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.

En el contexto de la presente invención si es que está relacionado con cualquiera de las condiciones de enfermedad enumeradas en la presente memoria, los términos “tratar”, “tratamiento”, y similares significan mitigar o aliviar al menos un síntoma asociado con dicha condición, o ralentizar o invertir la progresión de dicha condición. En el significado de la presente invención, el término “tratar” también indica detener, retrasar el comienzo (es decir, el periodo anterior a la manifestación clínica de una enfermedad) y/o reducir el riesgo de desarrollar o empeorar una enfermedad. P.ej., en conexión con el cáncer el término “tratar” puede significar eliminar o reducir la carga tumoral de un paciente, o prevenir, retrasar o inhibir la metástasis, etc.

Como se usa en la presente memoria “terapéuticamente efectivo” aplicado a la dosis o cantidad se refiere a esa cantidad de un compuesto o composición farmacéutica que es suficiente para dar por resultado una actividad deseada tras la administración a un sujeto que lo necesite. En el contexto de la presente invención, el término “terapéuticamente efectivo” se refiere a esa cantidad de un compuesto (p.ej., un antagonista o agonista del eje Nrp1:semaforina de las Tregs) o composición farmacéutica que contiene dicho compuesto que es suficiente para retrasar la manifestación, detener la progresión, mitigar o aliviar al menos un síntoma de un trastorno tratado por los métodos de la presente invención. Notar que cuando una combinación de ingredientes activos se administra la cantidad efectiva de la combinación puede o no incluir cantidades de cada ingrediente que habrían sido efectivas si se administran de forma individual.

La frase “farmacéuticamente aceptable”, como se usa en conexión con las composiciones de la invención, se refiere a entidades moleculares y otros ingredientes de dichas composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente reacciones adversas cuando se administran a un mamífero (p.ej., un humano). Preferiblemente, como se usa en la presente memoria, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en mamíferos, y más particularmente en humanos.

Como se usa en la presente memoria, el término “sujeto” se refiere a cualquier mamífero. En una realización preferida, el sujeto es humano.

Como se usa en esta memoria y las reivindicaciones anexas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa.

De acuerdo con la presente invención puede emplearse biología molecular convencional, microbiología y técnicas de ADN recombinante dentro de las competencias de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, p.ej., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en la presente memoria “Sambrook et al., 1989”); ^dN^a Cloning: A practical Approach, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins eds. (1985»; Transcription and Translation (^b .D. Hames y S.J. Higgins, eds. (1984»; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986»; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986»; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); entre otros.

Métodos de la descripción

En una realización, la descripción proporciona un método para inhibir una función o disminuir la estabilidad de una Treg que comprende exponer dicha Treg a un inhibidor del eje Nrp1 :semaforina en dicha Treg. En una realización, dicho inhibidor del eje Nrp1 :semaforina inhibe la interacción entre una semaforina transmembrana (p.ej., semaforina clase IV tal como, p.ej., Sema4a) en célula T convencional y Nrp1 en la Treg. En una realización específica, el inhibidor del eje Nrp1:semaforina no afecta a la interacción Nrp1-VEGF en dicha Treg. El inhibidor del eje Nrp1:semaforina puede administrarse directamente a un sujeto (p.ej., humano), p.ej., un sujeto que padece un cáncer o una infección. En una realización relacionada, la descripción proporciona un método para tratar una enfermedad (p.ej., un cáncer o una infección) en un sujeto (p.ej., humano) que lo necesita, comprendiendo el método inhibir de forma selectiva el eje Nrp1 :semaforina en T regs del sujeto.

En una realización, los inhibidores del eje Nrp1 :semaforina útiles en los métodos de la descripción son anticuerpos. En una realización específica, dichos anticuerpos no afectan a la interacción Nrp1-VEGF o la interacción Nrp1-semaforina clase III en Tregs.

En otra realización, los inhibidores del eje Nrp1 :semaforina útiles en los métodos de la descripción son moléculas de semaforina (p.ej., una versión soluble de proteína sema4a o un fragmento o un derivado o un análogo de la misma). En aún otra realización, los inhibidores del eje Nrp1 :semaforina útiles en los métodos de la descripción son moléculas pequeñas.

La presente descripción también incluye inhibidores del eje Nrp1:semaforina en Tregs que inhiben la expresión de Nrp1 en Tregs, o localmente (p.ej., en tumores) inhiben la expresión de semaforina transmembrana en células que expresan dicha semaforina transmembrana (p.ej., células T convencionales (Tconv), células dendríticas convencionales (cDCs), y/o células dendríticas plasmacitoides (pDCs)), o evitar que Nrp1 se una con su(s) ruta(s) de señalización corriente abajo.

En una realización separada, la descripción proporciona un método para mejorar una función o aumentar la estabilidad de una Treg que comprende exponer dicha Treg a un agonista del eje Nrp1 :semaforina en dicha Treg. En una realización, dicho agonista del eje Nrp1 :semaforina mejora la interacción entre una semaforina transmembrana (p.ej., semaforina clase IV tal como, p.ej., Sema4a) en célula T convencional y Nrp1 en la Treg. En una realización, el agonista del eje Nrp1 :semaforina se administra a la Treg in vitro (p.ej., la Treg puede extraerse de un sujeto (p.ej., un humano que padece una enfermedad autoinmune o inflamatoria), expandirse ex vivo en presencia de un agonista de la interacción de Nrp1-semaforina y después re-introducirse al mismo sujeto o administrarse a un sujeto diferente). En otra realización, el agonista del eje Nrp1:semaforina puede administrarse directamente a un sujeto (p.ej., humano), p.ej., un sujeto que padece una enfermedad autoinmune o inflamatoria. En una realización relacionada, la descripción proporciona un método para tratar una enfermedad (p.ej., una enfermedad autoinmune o inflamatoria) en un sujeto (p.ej., humano) que lo necesita, comprendiendo el método activar de forma selectiva el eje Nrp1 :semaforina en T regs del sujeto.

En una realización, los agonistas del eje Nrp1 :semaforina útiles en los métodos de la descripción son moléculas de semaforina (p.ej., proteína Sema4a o un fragmento o un derivado o un análogo de la misma). Dichas moléculas de semaforina pueden, p.ej., multimerizarse y/o inmovilizarse en una superficie o una perla.

En otra realización, los agonistas del eje Nrp1 :semaforina útiles en los métodos de la descripción son anticuerpos. En aún otra realización, los agonistas del eje Nrp1 :semaforina útiles en los métodos de la descripción son moléculas pequeñas.

La presente descripción también incluye los agonistas del eje Nrp1:semaforina en las Tregs que mejoran la expresión de Nrp1 en las Tregs, o localmente (p.ej., en isletas pancreáticas para diabetes) mejoran la expresión de semaforina en células que expresan semaforina transmembrana (p.ej., células T convencionales (Tconv), células dendríticas convencionales (cDCs), y/o células dendríticas plasmacitoides (pDCs)), o mejoran la unión de Nrp1 con su(s) ruta(s) de señalización corriente abajo.

Los inhibidores y agonistas adicionales del eje Nrp1 :semaforina en Treg pueden identificarse usando varios métodos de cribado conocidos en la técnica (p.ej., usando moléculas diana inmovilizadas o fragmentos de las mismas).

Los inhibidores o agonistas de la descripción pueden usarse en métodos terapéuticos descritos anteriormente o pueden administrarse a un mamífero no humano para los propósitos de obtención de datos preclínicos. Mamíferos no humanos ejemplares a tratar incluyen primates no humanos, perros, gatos, roedores y otros mamíferos en que se realizan estudios preclínicos. Dichos mamíferos pueden ser modelos animales establecidos para una enfermedad a tratar o pueden usarse para estudiar la toxicidad del inhibidor o agonista de interés. En cada una de estas realizaciones, los estudios de escalado de dosis pueden realizarse en el mamífero.

Ejemplos no limitantes de cánceres tratables por el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención incluyen, por ejemplo, carcinomas, linfomas, sarcomas, blastomas y leucemias. Ejemplos específicos no limitantes, incluyen, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de vejiga, carcinoma de cabeza y cuello, carcinoma de tiroides, sarcoma de tejido blando, cáncer de ovario, melanoma primario o metastático, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, cáncer de cerebro, angiosarcoma, hemangiosarcoma, sarcoma óseo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, cáncer testicular, cáncer de útero, cáncer de cuello del útero, cáncer gastrointestinal, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, macroglobulinemia de Waldenstroom, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, carcinoma de pulmón, carcinoma epitelial, cáncer de cuello de útero, tumor testicular, glioma, glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, retinoblastoma, leucemia, neuroblastoma, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma de vejiga, linfoma, mieloma múltiple, carcinoma medular, linfoma de células B, linfoma de células T, mieloma, leucemia, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfocítica aguda, neoplasias hematopoyéticas, timoma, sarcoma, linfoma no de Hodgkins, linfoma de Hodgkins, cáncer de útero, carcinoma de células renales, hepatoma, etc.

Las infecciones tratables por los métodos de la presente descripción incluyen, sin limitación, cualquier infección (en particular, infecciones crónicas) en que las Tregs están bloqueando la inmunidad esterilizante y que pueden estar provocadas, por ejemplo, por una bacteria, parásito, virus, hongo o protozoo.

Ejemplos no limitantes de las enfermedades inflamatorias y autoinmunes tratables por los métodos de la presente descripción incluyen, p.ej., enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, diabetes, esclerosis múltiple, tal como, p.ej., enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, diabetes mellitus tipo 1, esclerosis múltiple, enfermedad de Graves, lupus eritomatoso, espondilitis anquilosante, soriasis, enfermedad de Behcet, enterocolitis autística, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, pénfigo vulgar, encefalomielitis diseminada aguda (ADEM), mielitis transversa cardiomiopatía autoinmune, enfermedad celíaca, dermatomiositis, granulomatosis de Wegener, alergia, asma, dermatitis de contacto (que incluye cualquier reacción a un compuesto químico hecho por el hombre), aterosclerosis (o cualquier otra condición inflamatoria que afecta al corazón o sistema vascular), etc.

Se contempla que cuando se usan para tratar varias enfermedades, los inhibidores o agonistas de la descripción pueden combinarse con otros agentes terapéuticos adecuados para las mismas o similares enfermedades. Además, dos o más inhibidores o agonistas de la descripción pueden co-administrarse también para generar efectos aditivos o sinérgicos. Cuando se co-administran con un segundo agente terapéutico, los inhibidores o agonistas de la descripción y el segundo agente terapéutico puede ser de forma simultánea o secuencial (en cualquier orden). Las dosis terapéuticamente efectivas adecuadas para cada agente pueden disminuirse debido a la acción aditiva o sinergia.

Los agonistas del eje Nrp1 :semaforina de la descripción pueden combinarse con otras terapias que mejoran las Tregs (p.ej., anti-CD3 no mitogénico), transferencia de Treg in vivo, o terapias que bloquean la inflamación (p.ej., por medio de bloqueo de IL1, INFa/p, IL6, TNF, IL13, IL23, etc.).

En una realización, los inhibidores del eje Nrp1 :semaforina en las Tregs descritos en la presente memoria son útiles para mejorar la eficacia de las vacuna dirigidas a infecciones o tumores. De forma similar a las vacunas frente a las infecciones que contienen células inactivas del agente infeccioso o un único o varios antígenos, las vacunas tumorales típicamente contienen células tumorales inactivas o antígenos tumorales que estimulan el sistema inmune de un paciente. El sistema inmune responde a esta estimulación generando células inmunorespondedoras que tienen como objetivo la infección o neoplasia. Como las Tregs actúan para suprimir dicha respuesta inmune, la inhibición de su función y estabilidad mediante los métodos de la descripción pueden llevar a la respuesta inmune mejorada a las vacunas.

Los inhibidores de Treg de la invención pueden administrarse a un sujeto o de forma simultánea con o antes de (p.ej., 1-14 días antes) administrarse un reactivo que actúa para obtener una respuesta inmune (p.ej., tratar el cáncer o una infección) al sujeto.

Los compuestos inhibidores de la invención pueden administrarse también en combinación con un anticuerpo antitumoral o un anticuerpo dirigido a un antígeno patogénico.

Los tratamientos inhibidores de la invención pueden combinarse con otros tratamientos inmunomoduladores tales como, p.ej., vacunas terapéuticas (que incluyen aunque no están limitadas a GVAX, vacunas basadas en DC, etc.), inhibidores de control (que incluyen aunque no están limitados a agentes que bloquean CTLA4, PD1, LAG3, TIM3, etc.) o activadores (que incluyen aunque no están limitados a agentes que mejoran 41BB, OX40, etc.). Los tratamientos inhibidores de la invención pueden combinarse también con otros tratamientos que poseen la capacidad de inhibir la función o estabilidad de Treg. Algunos ejemplos no limitantes de dichos inhibidores Treg adicionales incluyen ONTAK, HuMax-Tac, Zenapax y MDX-010.

Los anticuerpos y fragmentos terapéuticos de la invención pueden combinarse con inmunoterapias y terapias adicionales. Por ejemplo, cuando se usan para tratar el cáncer, los inhibidores de la invención pueden usarse en combinación con terapias para el cáncer convencionales, tales como, p.ej., cirugía, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de las mismas, dependiendo del tipo de tumor, condición del paciente, otros problemas de salud y una variedad de factores. En ciertos aspectos, otros agentes terapéuticos útiles para la combinación de terapia para el cáncer con los inhibidores de la invención incluyen agentes anti-angiogénicos. Muchos agentes anti-angiogénicos se han identificado y se conocen en la técnica, incluyendo, p.ej., TNP-470, factor plaquetario 4, trombospondina-1, inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMP1 y TIMP2), prolactina (fragmento de 16 Kd), angiostatina (fragmento de 38 Kd de plasminógeno), endostatina, receptor soluble bFGF, factor de crecimiento transformante beta, interferón alfa, receptores solubles de DKR y FLT-1, proteína relacionada con proliferina de la placenta, además de los enumerados por Carmeliet y Jain (2000). En una realización, los inhibidores de la invención pueden usarse en combinación con un antagonista VEGF o un antagonista del receptor de VEGF tal como anticuerpos anti-VEGF, variantes de VEGF, fragmentos solubles del receptor de VEGF, aptámeros capaces de bloquear VEGF o VEGFR, anticuerpos anti-VEGFR de neutralización, inhibidores de VEGFR tirosina quinasas y cualquier combinación de los mismos (p.ej., anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1, bevacizumab o ranibizumab).

Ejemplos no limitantes de compuestos quimioterapéuticos que pueden usarse en tratamientos de combinación de la presente invención incluyen, por ejemplo, aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, asparaginasa, bcg, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfano, campotecina, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucil, cisplatino, cladribina, clodronato, colchicina, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, dienestrol, dietilestilbestrol, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, estradiol, estramnustina, etopósido, exemestano, filgrastim, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, genisteina, goserelina, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, imatinib, interferón, irinotecano, ironotecano, letrozol, leucovorina, leuprolida, levamisol, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalano, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, nocodazol, octreotida, oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfimer, procarbazina, raltitrexed, rituximab, estreptozocina, suramina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, testosterona, tioguanina, tiotepa, dicloruro de titanoceno, topotecano, trastuzumab, tretinoína, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina.

Estos compuestos quimioterapéuticos pueden categorizarse por su mecanismo de acción en, por ejemplo, los siguientes grupos: anti-metabolitos/agentes anti-cancerígenos, tales como análogos de pirimidina (5-fluorouracilo, floxuridina, capecitabina, gemcitabina y citarabina) y análogos de purina, antagonistas de folato e inhibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos que incluyen productos naturales tales como alcaloides de vinca (vinblastina, vincristina y vinorelbina), disruptores del microtúbulo tal como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilones y navelbina, epidipodofilotoxinas (etopósido, tenipósido), agentes que dañan el ADN (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfano, camtotecina, carboplatino, clorambucil, cisplatino, ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, hexametilenaminaoxaliplatino, ifosfamida, melfalano, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, plicamicina, procarbazina, taxol, taxotere, tenipósido, trietilentiofosforamida y etopósido (VP16)); antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina, doxirubicina (adriamicina), idarubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) y mitomicina; enzimas (L-asparaginasa que metaboliza sistémicamente L-asparagina y priva a las células que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina); agentes antiplaquetarios; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tales como mostazas nitrogenadas (mecloretamina, ciclofosfamida y análogos, melfalano, clorambucil), etileniminas y metilmelaminas (hexametilmelamina y tiotepa), sulfonatos de alquilobusalfano, nitrosoureas (carmustina (BCNU) y análogos, estreptozocina), tracenos-dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitóticos tales como análogos de ácido fólico (metotrexato); complejos de coordinación de platino (cisplatino, carboplatino), procarbazina, hidroxiurea, mitotano, aminoglutetimida; hormonas, análogos de hormona (estrógeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inhibidores de aromatasa (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sales de heparina sintética y otros inhibidores de la trombina); agentes fibrinolíticos (tales como activador del plasminógeno tisular, estreptoquinasa y uroquinasa), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratorios; agentes antisecretores (breveldina); inmunosupresores (ciclosporina, tacrólimo (FK-506), sirólimo (rapamicina), azatioprina, micofenolato de mofetilo); compuestos anti-angiogénicos (p.ej., TNP-470, genisteina, bevacizumab) e inhibidores del factor de crecimiento (p.ej., inhibidores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)); bloqueante del receptor de angiotensina; dadores de óxido nítrico; oligonucleótidos anti-sentido; anticuerpos (trastuzumab); inhibidores del ciclo celular e inductores de la diferenciación (tretinoína); inhibidores de mTOR, inhibidores de topoisomerasa (doxorubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorubicina, dactinomicina, enipósido, epirubicina, etopósido, idarubicina y mitoxantrona, topotecano, irinotecano), corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilpednisolona, prednisona y prenisolona); inhibidores de la quinasa de transducción de señal del factor de crecimiento; inductores de disfunción mitocondrial y activadores de caspasa; y disruptores de cromatina.

Para el tratamiento de infecciones, la terapia combinada de la invención puede incluir co-administrar inhibidores de Treg de la invención con un antibiótico, un fármaco anti-fúngico, un fármaco antiviral, un fármaco anti-parasitario, un fármaco anti-protozoo o una combinación de los mismos.

Ejemplos no limitantes de antibióticos útiles incluyen lincosamidas (clindomicina); cloranfenicoles; tetraciclinas (tales como tetraciclina, clortetraciclina, demeclociclina, metaciclina, doxiciclina, minociclina); amonoglicósidos (tales como gentamicina, tobramicina, netilmicina, amicacina, kanamicina, estreptomicina, neomicina); beta-lactamas (tales como penicilinas, cefalosporinas, imipenem, aztreonam); vancomicinas; bacitracinas; macrólidos (eritromicinas), anfotericinas; sulfonamidas (tales como sulfanilamida, sulfametoxazol, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfisoxazol, sulfacitina, sulfadoxina, mafenida, ácido p-aminobenzoico, trimetoprim-sulfametoxazol); metenamina; nitrofurantoina; fenazopiridina; trimetoprim; rifampicinas; metronidazoles; cefazolinas; lincomicina; espectinomicina; mupirocinas; quinolonas (tales como ácido nalidíxico, cinoxacina, norfloxacina, ciprofloxacina, perfloxacina, ofloxacina, enoxacina, fleroxacina, levofloxacina); novobiocinas; polimixinas; gramicidinas; y antipseudomonales (tales como carbenicilina, carbenicilina indanilo, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina) o cualquier sal o variantes de los mismos. Véase también Physician’s Desk Reference, 59a edición, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington’s the Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, (2000), Lippincott Williams y Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15a edición (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J. Dichos antibióticos pueden obtenerse comercialmente, p.ej., de Daiichi Sankyo, Inc. (Parsipanny, N.J.), Merck (Whitehouse Station, N.J.), Pfizer (Nueva York, N.Y.), Glaxo Smith Kline (Research Triangle Park, N.C.), Johnson & Johnson (New Brunswick N.J.), AstraZeneca (Wilmington, Del.), Novartis (East Hanover, N.J.), y Sanofi-Aventis (Bridgewater, N.J.). El antibiótico usado dependerá del tipo de infección bacteriana.

Ejemplos no limitantes de agentes anti-fúngicos útiles incluyen imidazoles (tales como griseofulvina, miconazol, terbinafina, fluconazol, cetoconazol, voriconazol, e itraconizol); polienos (tales como anfotericina B y nistatina); flucitosinas; y candicidina o cualquier sal o variantes de los mismos. Véase también Physician’s Desk Reference, 59a edición (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, (2000), Lippincott Williams y Wilkins, Baltimore, Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15a edición, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway, N.J.

Ejemplos no limitantes de fármacos antivirales útiles incluyen interferón alfa, beta o gamma, didanosina, lamivudina, zanamavir, lopanivir, nelfinavir, efavirenz, indinavir, valaciclovir, zidovudina, amantadina, rimantidina, ribavirina, ganciclovir, foscarnet, y aciclovir o cualquier sal o variante de los mismos. Véase también Physician’s Desk Reference, 59a edición (2005), Thomson P D R, Montvale, N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington’s The Science and Practice of Pharmacy 20a edición, (2000), Lippincott Williams y Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15a edición (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J.

Ejemplos no limitantes de agentes anti-parasitarios útiles incluyen cloroquina, mefloquina, quinina, primaquina, atovaquona, sulfasoxina y pirimetamina o cualquier sal o variante de los mismos. Véase también Physician’s Desk Reference, 59a edición (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington’s The Science and Practice of Pharmacy 20a edición (2000), Lippincott Williams y Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15a edición (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J.

Ejemplos no limitantes de fármacos anti-protozoo útiles incluyen metronidazol, diloxanida, yodoquinol, trimetoprim, sufametoxazol, pentamidina, clindamicina, primaquina, pirimetamina y sulfadiazina o cualquier sal o variante de los mismos. Véase también Physician’s Desk Reference, 59a edición (2005), Thomson P D R, Montvale, N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington’s The Science and Practice of Pharmacy 20a edición, (2000), Lippincott William y Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15a edición (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J. Inhibidores y agonistas de anticuerpo

En conjunto con los métodos anteriores, la invención proporciona anticuerpos de anti-neuropilina aislados que inhiben la interacción Nrp1 :semaforina en las Tregs. La semaforina es semaforina clase IV (p.ej., Sema4a). En una realización, los anticuerpos no afectan a la interacción Nrp1-VEGF o la interacción Nrp1-semaforina clase III en las Tregs.

La descripción incluye los anticuerpos tanto anti-Nrp1 como anti-semaforina que interfieren con la interacción Nrp-1:semaforina en las Tregs. Ejemplos de anticuerpos útiles incluyen, por ejemplo, (i) anticuerpos que se dirigen específicamente a dominios “sema” y “PSI” de moléculas de semaforina, una región conservada de forma evolutiva en todas las moléculas de semaforina (véase, p.ej., Takamatsu y Kumanogoh, Trends Immunol., 2012, 33(3):127-135) además de (ii) anticuerpos que se dirigen al dominio de unión a semaforina en Nrp1 (más que al dominio de unión a VEGF) (véase, p.ej., Parker et al., J. Biol. Chem., 2012, 287(14):11082-11089).

Para ambos anticuerpos inhibidores de la invención y anticuerpos potenciadores de la descripción, también se proporcionan anticuerpos biespecíficos que, además de Nrp1, también reconocen una proteína específica de Treg y por lo tanto dirigen al anticuerpo específicamente a las Tregs. Por ejemplo, dichos anticuerpos biespecíficos, además de a Nrp1, pueden dirigirse a una proteína de superficie de las Tregs, que incluyen, por ejemplo, CD25, CD4, CD28, CD38, CD62L (selectina), ligando OX-40 (OX-40L), CTLA4, CCR4, CCR8, FOXP3, LAG3, CD103, receptor de TNF inducido por glucocorticoides (GITR), galectina-1, TNFR2, o TGFpR1.

Los anticuerpos para usar de acuerdo con la presente invención pueden ser monoclonales o policlonales como sea apropiado. Los fragmentos de anticuerpo pueden usarse también e incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab’, F(ab^’)2 o Fv. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena sencilla. Otras modificaciones y/o agentes adecuados serán evidentes para el experto en la técnica. Los anticuerpos quiméricos y humanizados están también en el alcance de la invención. Se espera que los anticuerpos quiméricos y humanizados sean menos inmunogénicos en un sujeto humano que el correspondiente anticuerpo no quimérico. Se ha descrito una variedad de enfoques para fabricar anticuerpos quiméricos, que comprenden por ejemplo una región variable no humana y una región constante humana. Véase, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81,6851 (1985); Takeda et al., Nature 314.452 (1985), Cabilly et al., Patente de EE.UU. núm. 4.816.567; Boss et al., Patente de EE.UU. 4.816.397; Tanaguchi et al., Publicación de Patente Europea EP 171496; Publicación de patente europea 0173494, Patente del Reino Unido GB 2177096B. Adicionalmente, un anticuerpo quimérico puede “humanizarse” más de manera que las partes de las regiones variables, especialmente las regiones estructurales conservadas del dominio de unión a antígeno, son de origen humano y solo las regiones hipervariables son de origen no humano. Dichas moléculas de inmunoglobulina alteradas pueden fabricarse mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica, (p.ej., Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)) y se fabrican preferiblemente según las enseñanzas de la Publicación PCT WO92/06193 o EP 0239400. Los anticuerpos humanizados pueden producirse comercialmente, por ejemplo, por Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretaña.

En ciertas realizaciones, también se proporcionan anticuerpos anti-idiotípicos. Los anticuerpos anti-idiotípicos reconocen determinantes antigénicos asociados con el sitio de unión al antígeno de otro anticuerpo. Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden prepararse contra un segundo anticuerpo inmunizando a un animal de la misma especie, y preferiblemente de la misma cepa, como el animal usado para producir el segundo anticuerpo. Véase, p.ej., Patente de EE.UU. núm. 4.699.880. En una realización, los anticuerpos se incrementan contra Nrp1 o semaforina o una porción de la misma, y estos anticuerpos se usan una a uno para producir un anticuerpo anti-idiotípico.

La presente descripción proporciona anticuerpos para direccionamiento tanto intracelular como extracelular. El direccionamiento intracelular puede conseguirse a través del uso de anticuerpos expresados de forma intracelular denominados como intracuerpos.

Cribar por anticuerpos adicionales que se unen a un epítopo particular en el antígeno de interés (p.ej., Nrp1 o Sema4a), un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988), puede realizarse. De forma alternativa, el mapeo del epítopo, p. ej., como se describe en Champe et al., (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394, puede realizarse para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.

Anticuerpos adicionales útiles en la presente invención pueden generarse también y seleccionarse usando un enfoque de visualización de fagos como se describe, p.ej. en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. núm.

2008/0213268.

Los anticuerpos de la invención pueden modificarse adicionalmente para generar mutantes de anticuerpo con propiedades físicas, químicas y o biológicas mejoradas sobre el anticuerpo parental. Cuando el ensayo usado es un ensayo de actividad biológica, el mutante de anticuerpo preferiblemente tiene una actividad biológica en el ensayo de elección (p.ej., medir una función o estabilidad de una Treg por medio del ensayo de supresión Transwell y sobre­ regulación de Bcl2 o Helios) que es al menos aproximadamente 10 veces mejor, preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces mejor, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces mejor, y a veces al menos aproximadamente 100 veces o 200 veces mejor, que la actividad biológica del anticuerpo parental en ese ensayo.

Para generar el mutante de anticuerpo, pueden introducirse una o más alteraciones de aminoácido (p.ej. sustituciones) en una o más de las regiones hipervariables del anticuerpo parental. De forma alternativa, o además, una o más alteraciones (p.ej., sustituciones) de residuos de la región estructural pueden introducirse en el anticuerpo parental donde estos dan por resultado una mejora en la afinidad de unión del mutante de anticuerpo por el antígeno de la segunda especie de mamífero. Ejemplos de residuos de la región estructural a modificar incluyen aquellos que se unen de forma no covalente al antígeno directamente (Amit et al. (1986) Science 233:747-753); interactúan con/ efectúan la conformación de una CDR (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917); y/o participan en la interfase V^l-V^h (documento EP 239400B1). En ciertas realizaciones, la modificación de uno o más de dichos residuos de la región estructural da por resultado una mejora de la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno de la segunda especie de mamífero. Por ejemplo, de aproximadamente uno a aproximadamente cinco residuos estructurales pueden alterarse en esta realización de la invención. A veces, esto puede ser suficiente para proporcionar un mutante de anticuerpo adecuado para usar en ensayos preclínicos, incluso donde ninguno de los residuos de la región hipervariable se ha alterado. Normalmente, sin embargo, el mutante de anticuerpo comprenderá alteración(ones) de la región hipervariable adicional(es). Los residuos de la región hipervariable que se alteran pueden cambiarse de forma aleatoria, especialmente donde la afinidad de unión de partida del anticuerpo parental es tal que dichos mutantes de anticuerpo producidos de forma aleatoria pueden cribarse fácilmente.

Un procedimiento útil para generar dichos mutantes de anticuerpo se denomina “mutagénesis de barrido de alanina” (Cunningham y Wells (1989) Science 244:1081-1085). Aquí, uno o más del (de los) residuo(s) de la región hipervariable se sustituye(n) por residuo(s) de alanina o polialanina para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno de la segunda especie de mamífero. Este(os) residuo(s) de la región hipervariable que demuestra(n) sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan después introduciendo mutaciones adicionales o distintas a o por los sitios de sustitución. Los ala-mutantes producidos de esta forma se criban por su actividad biológica como se describe en la presente memoria.

Los anticuerpos de la invención pueden prepararse por medios estándar.

Para la preparación de antígeno de inmunización, y la producción de anticuerpo policlonal y monoclonal véase, p.ej., Kohler et al., Nature 256:495-497 (1975) y Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266:550-552 (1977); Koprowski et al., Patente de e E.Uu . núm. 4.172.124; Harlow y Lane “Antibodies: A Laboratory Manual”, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., 1988); y “Current Protocols In Molecular Biology”, (Ausubel et al., Eds.; John Wiley & Sons: Nueva York, N.Y., 1991); Kozbar et al., Immunology Today 4:72 (1983)), Cole et al., “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy” (Alan R. Liss, Inc. págs. 77-96 (1985)). Las células producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden seleccionarse mediante un ensayo adecuado (p.ej., ELISA).

Los anticuerpos de la invención pueden producirse también de forma recombinante, usando técnicas bien conocidas. Véase, p.ej., Cabilly et al., Patente de EE.UU. núm. 4.816.567; Winter, Patente de EE.UU. núm.

5.225.539. Un ácido nucleico que codifica un antígeno deseado puede aislarse o sintetizarse usando procedimientos convencionales e insertarse en un vector replicable para clonado adicional o para expresión.

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio y aislarse y purificarse adicionalmente usando técnicas conocidas tales como, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad. La cromatografía de afinidad de Proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas ^y1, ^y2 o ^y4 humanas (Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13). La cromatografía de afinidad de proteína G puede usarse para isotipos de ratón y para y3 humano (Guss et al. (1986) EMBO J. 5:15671575).

Las diversas porciones de anticuerpos quiméricos, humanizados, primatizados (injertados en CDR), o anticuerpos de cadena sencilla injertados en CDR, que comprenden partes derivadas de diferentes especies, los anticuerpos pueden unirse químicamente por técnicas convencionales, o pueden prepararse como una proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican una cadena quimérica o humanizada pueden expresarse para producir una proteína contigua. Véase, p.ej., Cabilly et al., Patente de EE.UU. núm. 4.816.567; Cabilly et al., Patente Europea núm. 0.125.023 B1, Boss et al., Patente de EE.Uu . núm. 4.816.397; Boss et al., Patente Europea núm. 0.120.694 B1; Neuberger et al., documento WO 86/01533; Neurberger et al., Patente Europea núm. 0.194.276 B1; Winter, Patente de EE.UU. núm. 5.225.539; y Winter, Patente Europea núm.

0.239.400 B1. Véase también, Newman et al., BioTechnology 10:1455-1460 (1992), con relación a un anticuerpo primatizado y Ladner et al., Patente de EE.UU. núm. 4.946.778 y Bird et al., Science 242:423-426 (1988)), con relación a anticuerpos de cadena sencilla. Las secuencias de ácido nucleico (p.ej., ADN) que codifican para regiones variables humanizadas pueden construirse usando métodos de mutagénesis por PCR para alterar las secuencias de ADN que codifican una cadena humana o humanizada, tal como una plantilla de ADN de una región variable humanizada anteriormente (véase, p.ej., Kamman et al., Nucl. Acids Res., 17:5404 (1989)); Sato et al., Cancer Research 53:851-856 (1993); Daugherty et al., Nucleic Acid Res. 19(9):2471-2476 (1991); y Lewis y Crowe, Gene 101:297-302 (1991)). Usando estos y otros métodos adecuados, las variantes también pueden producirse fácilmente. En una realización las regiones variables clonadas pueden mutagenizarse, y pueden seleccionarse secuencias que codifican variantes con la especificidad deseada (p.ej., de una biblioteca de fagos; véase, p.ej., Krebber et al, Patente de EE.UU. núm. 5.514.548; y Hoogenboom et al., documento WO 93/06213).

Además, pueden producirse también fragmentos funcionales de anticuerpos, que incluyen fragmentos de anticuerpos quiméricos, humanizados, primatizados o de cadena sencilla. Los fragmentos funcionales de los anticuerpos de estudio conservan al menos una función de unión y/o función de modulación del anticuerpo de longitud completa de los que se derivan. Fragmentos de anticuerpo útiles incluyen, aunque no están limitados a fragmentos Fv, Fab, Fab’ y F(ab’)². Dichos fragmentos pueden producirse mediante escisión enzimática o mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, la escisión de papaína o pepsina puede generar fragmentos Fab o F(ab’)² , respectivamente. Los anticuerpos pueden producirse también en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpo en que uno o más codones de parada se han introducidos corriente arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una parte de cadena pesada F(ab^{’ )2} puede diseñarse para incluir secuencias de ADN que codifican el domino CH1 y la región bisagra de la cadena pesada.

Otros métodos adecuados de producción o aislamiento de anticuerpos de la especificidad necesaria pueden usarse, que incluyen, por ejemplo, métodos que seleccionan anticuerpo recombinante de una biblioteca, o que dependen de la inmunización de animales transgénicos (p.ej., ratones) capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos. Véase, p.ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555 (1993); Jakobovits et al. Nature 362 :255-258 (1993); Lonberg et al., Patente de EE.UU. núm. 5.545.806, Surani et al., Patente de EE.UU. núm.

5.545.807, Cabilly et al., Patente de EE.UU. núm. 4.816.567; Cabilly et al., Patente Europea núm. 0.125.023 B1; Queen et al., Patente Europea núm. 0.451.216 B1; Boss et al., Patente de EE.UU. núm. 4.816.397; Boss et al., Patente Europea núm. 0.120.694 E1; Neuberger et al., documento WO 86/01533; Neuberger et al., Patente europea núm. 0.194.276 B1, Winter, Patente de EE.UU núm. 5.225.539; Winter, Patente europea núm. 0.239.400 B1 ; y Padlan et al., Solicitud de patente europea núm. 0.519.596 A1. Véase, también, Ladner et al., Patente de EE.UU. núm. 4.946.778; Huston, Patente de EE.UU. núm. 5.476.786; y Bird et al., Science 242:423-426 (1988).

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos pueden estar marcados o no marcados y usarse para propósitos diagnósticos. Típicamente, los ensayos diagnósticos implican detectar la formación de un complejo que resulta de la unión de un anticuerpo a su diana. Los anticuerpos pueden marcarse directamente con, por ejemplo, un radionúclido, un fluoróforo, una enzima, un sustrato enzimático, un cofactor enzimático, un inhibidor enzimático, y un ligando (p.ej., biotina o un hapteno). Se conocen numerosos inmunoensayos apropiados por los expertos (véase, p.ej., las Patentes de EE.UU. núms. 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654 y 4.098.876).

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la invención pueden prepararse mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil-parabenos tales como metil o propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelatos tal como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tal como sodio; complejos metálicos (p.ej. complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEENTM, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la invención pueden contener también uno o más compuestos activos adicionales cuando sea necesario para tratar la indicación particular, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de forma adversa los unos a los otros. Varios agentes activos pueden estar presentes en combinación en cantidades que sean efectivas para el propósito previsto. Ejemplos no limitantes de posibles compuestos activos adicionales incluyen, p.ej., IL2 y TGFp además de varios agentes enumerados en la discusión de tratamientos de combinación, arriba.

Los ingredientes activos pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de distribución de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).

También pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos conformados, p.ej., películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente de EE.UU. núm. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo no degradable, ácido láctico-ácido glicólico degradable tales como el LUPROⁿ DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras los polímeros tal como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos más cortos de tiempo. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37°C, dando por resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden concebirse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es la formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio tiodisulfuro, la estabilización puede alcanzarse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

Para el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo de la invención dependerá del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo puede administrarse al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. El progreso de la terapia de la invención puede monitorizarse fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

La administración de anticuerpos de la invención puede realizarse mediante cualquier ruta adecuada, incluyendo administración sistémica además de administración directamente al sitio de la enfermedad (p.ej., al sitio del tumor primario o infección crónica).

Inhibidores y agonistas de proteína/péptido de la descripción

Como se especifica anteriormente, los inhibidores del eje Nrp1 :semaforina útiles en los métodos de la descripción incluyen varias moléculas de semaforina, tal como, por ejemplo, versiones solubles de proteínas de semaforina transmembrana (p.ej., Sema4a) además de varios fragmentos, derivados y análogos inhibidores de las mismas. También se incluyen en la presente descripción dominios extracelulares solubles de Nrp1 que pueden funcionar como inhibidores competitivos del eje Nrp1 :semaforina además de varios fragmentos, derivados y análogos inhibidores de los mismos. En una realización específica, la molécula de semaforina inhibidora es la proteína de fusión Sema4a-Ig, que es una fusión (en el extremo C) entre el dominio extracelular de Sema4a (fragmento Met1-His683 de núm. de acceso GenBank NP_038686) y la región Fc de IgG1 humana o murina. En una realización específica, la molécula de semaforina inhibidora es un fragmento de proteína Nrp1 (o un derivado o un análogo de la misma) que comprende todo o parte del dominio citoplasmático de Nrp1 que comprende la secuencia de aminoácidos C-terminal SEA, cuya molécula inhibe una ruta de señalización entre el dominio citoplasmático de la proteína Nrp1 y la proteína PTEN.

Como se trata adicionalmente anteriormente, los agonistas del eje Nrp1 :semaforina útiles en los métodos de la descripción también incluyen varias moléculas de semaforina, que incluyen proteínas de semaforina de longitud completa (p.ej., proteína Sema4a) además de fragmentos agonistas, derivados y análogos de los mismos. Dichas moléculas de semaforina agonistas pueden estar, p.ej., multimerizadas (p.ej., usando proteínas de fusión IgM) y/o inmovilizadas en una superficie o una perla.

Las versiones inhibidoras solubles de proteínas de semaforina transmembrana incluyen, por ejemplo, sus dominios extracelulares completos (p.ej., el dominio extracelular completo de Sema4a) o partes de unión a Nrp1 de dichos dominios extracelulares (p.ej., condensados a un dominio Fc) que son capaces de unirse con alta afinidad y especificidad a Nrp1 sin potenciar el eje Nrp1 :semaforina en las Tregs. En algunas realizaciones, dichas versiones inhibidoras de proteínas de semaforina transmembrana no afectan a la interacción Nrp1-VEGF en las Tregs. Las versiones inhibidoras solubles de dominios extracelulares de Nrp1 incluyen, por ejemplo, el dominio extracelular entero de Nrp1 o partes de unión a Sema4a de dicho dominio extracelular (p.ej., condensado a un dominio Fc) que son capaces de unirse con alta afinidad y especificidad a Sema4a sin potenciar el eje Nrp1 :semaforina en las Tregs. La efectividad de las moléculas o fragmentos de semaforina o versiones inhibidoras solubles de dominios extracelulares de Nrp1 para inhibir el eje Nrp1 :semaforina en las Tregs puede probarse usando ensayos conocidos en la técnica y aquellos resumidos en la sección de ejemplos, específicamente el ensayo de supresión T ranswell. Las proteínas y fragmentos de semaforina pueden producirse de forma recombinante a partir de los fragmentos correspondientes de los ácidos nucleicos usando varios sistemas de expresión bien conocidos en la técnica y una variedad de sistemas huésped son adecuados para la producción, incluyendo bacterias (p.ej., E. coli), levadura (p.ej., Saccharomyces cerevisiae), células de insecto (p.ej., Sf9) y de mamífero (p.ej., CHO, COS-7). Muchos vectores de expresión se han desarrollado y están disponibles para cada uno de estos huéspedes. Los vectores y procedimientos para la clonación y expresión se tratan, por ejemplo, en Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987)) y en Ausubel et al., 1995. Los vectores de expresión estándar útiles en la actual descripción se conocen bien en la técnica e incluyen (aunque no están limitados a) plásmidos, cósmidos, vectores de fago, vectores virales y cromosomas artificiales de levadura. Las secuencias del vector pueden contener un origen de replicación para la propagación en Escherichia coli (E. coli); el origen de replicación SV40; un gen de resistencia a la ampicilina, neomicina o puromicina para la selección en células huésped; y/o genes (p.ej., gen dihidrofolato reductasa) que amplifican el marcador seleccionable dominante más del gen de interés.

En algunas realizaciones, la secuencia de ADN se clona en un vector para crear una proteína de fusión. El compañero de fusión puede funcionar para permitir que la proteína de fusión se visualice o detecte. Por ejemplo, el compañero de fusión puede contener un epítopo que se reconoce por un anticuerpo, un dominio que se une a un péptido o ácido nucleico, o un péptido que es más fácilmente detectable. Los compañeros de fusión incluyen, aunque no están limitados a, HA, myc, His6, proteína fluorescente verde (GFP), glutatión-S-transferasa (GST), proteína A de Staphylococcus aureus, dos dominios sintéticos de unión a IgG (ZZ) de proteína A, proteína F de membrana externa, p-galactosidasa (lacZ), y varios productos de bacteriófago A y bacteriófago T7. A partir de las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria, es evidente que otras proteínas pueden usarse como compañeros de fusión. Para facilitar el aislamiento de la secuencia GNAL de la proteína de fusión, los aminoácidos susceptibles de escisión química (p.ej., CNBr) o escisión enzimática (p.ej., V8 proteasa, tripsina) pueden usarse para hacer puente entre la proteína GNAL y el compañero de fusión.

Preferiblemente, el vector de expresión de la descripción contiene una secuencia promotora. Los promotores adecuados, que incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles, están ampliamente disponibles y se conocen bien en la técnica. Los promotores usados normalmente para la expresión en bacterias incluyen los promotores de los fagos T7, T3, T5 y SP6, y los operones trp, lpp y lac. Los promotores híbridos (véase, Patente de EE.UU. núm. 4.551.433), tal como tac y trc, también pueden usarse. Ejemplos de plásmidos para la expresión en bacterias incluyen los vectores de expresión pET pET3a, pET 11a, pET 12a-c y pET 15b (véase la Patente de EE.UU. núm. 4.952.496; disponible de Novagen, Madison, Wis.). Pueden usarse vectores de bajo número de copias (p.ej., pPD100) para la sobreproducción eficiente de péptidos nocivos para el huésped E. coli (Dersch et al., FEMS Microbiol. Lett. 123:19, 1994). Los huéspedes bacterianos para los vectores de expresión T7 pueden contener copias de cromosoma de ADN que codifican la ARN polimerasa de T7 unida de forma operable a un promotor inducible (p.ej., promotor lacUV; véase, la Patente de EE.UU. núm. 4.952.496, tal como se encuentra en las cepas de E. coli HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) y BL21(DE3). La ARN polimerasa T7 puede estar también presente en plásmidos compatibles con el vector de expresión T7. La polimerasa puede estar bajo el control de un promotor y represor lambda (p.ej., pGP1-2; Tabor y Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:1074, 1985).

Otros promotores que pueden usarse para controlar la expresión incluyen, aunque no están limitados a, promotor de citomegalovirus (CMV) (Patentes de E^e .UU. núms. 5.385.839 y 5.168.062), la región promotora temprana de SV40 (Benoist y Chambon, Nature 1981,290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3’ del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., Cell 1980, 22:787-797), el promotor de timidina quinasa del herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1981) 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneina (Brinster et al., Nature 1982; 296:3942); vectores de expresión procariótica tal como el promotor p-lactamasa (Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:3727-3731), o el promotor tac (DeBoer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1983; 80:21-25); véase además “Useful proteins from recombinant bacteria” en Scientific American 1980; 242:74-94. Aún otros promotores útiles que pueden usarse incluyen elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor Ga14, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa), promotor PGK (fosfoglicerol quinasa), promotor de fosfatasa alcalina; y regiones de control de transcripción que muestran especificidad tisular hematopoyética, en particular: región de control del gen beta-globina que está activo en células mieloides (Mogram et al., Nature 1985; 315:338-340; Kollias et al., Cell 1986; 46:89-94), promotores del factor de diferenciación de células madre hematopoyéticas, promotor del receptor de eritropoyetina (Maouche et al., Blood 1991; 15:2557), etc.

Otras secuencias reguladoras pueden incluirse también en vectores de expresión de la descripción. Dichas secuencias incluyen un potenciador, sitio de unión al ribosoma, secuencia de señal de terminación de la transcripción, secuencia de señal de secreción, origen de replicación, marcador seleccionable, y similares. Las secuencias reguladoras se unen de forma operable unas con otras para permitir la transcripción y posterior traducción.

La presencia de un codón particular puede tener un efecto adverso en la expresión en un huésped particular, por lo tanto, una secuencia de ácido nucleico puede optimizarse para un sistema huésped particular, tal como células procariotas o eucariotas. Los métodos para alterar las secuencias de nucleótidos para aliviar el problema de uso de codón se conocen bien por los expertos en la técnica (véase, p.ej., Kane, Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6: 494; Makrides, Microbiol. Rev. (1996) 60:512; y Brown (Ed.), Molecular Biology LabFax, BlOS Scientific Publishers, Ltd. (1991), que proporciona una Tabla de Uso de Codones en la página 245 a la página 253).

Formas solubles de la proteína pueden obtenerse recogiendo fluido de cultivo, o cuerpos de inclusión solubilizantes, p.ej., por tratamiento con detergente, y si se desea sonicación u otros procesos mecánicos, como se describe anteriormente. La proteína solubilizada o soluble puede aislarse usando diversas técnicas, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), isoelectroenfoque, electroforesis en gel en 2 dimensiones, cromatografía (p.ej., intercambio de iones, afinidad, inmunoafinidad y cromatografía de columna por tamaño), centrifugado, solubilidad diferencial, inmunoprecipitación o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.

De forma alternativa, las proteínas o fragmentos de semaforina de la descripción pueden sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas en la técnica tales como, p.ej., química f-Moc o t-Boc en fase sólida de Merrifield convencional. Para métodos de síntesis peptídica véase también Bodansky, “Principies of Peptide Synthesis”, (Springer Verlag, Berlín (1993)) y Grant (ed.), “Synthetic Peptides: A User’s Guide”, (W.H. Freeman and Company, Nueva York (1992)). Además, los sintetizadores peptídicos automatizados están disponibles comercialmente (p.ej., Advanced ChemTech Modelo 396; Milligen/Biosearch 9600).

En ciertas realizaciones, la presente descripción contempla hacer variantes funcionales de moléculas de semaforina modificando su estructura para mejorar la eficacia o estabilidad terapéutica (p.ej. vida útil ex vivo y resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Los polipéptidos modificados pueden producirse, por ejemplo, por sustitución, supresión o adición de aminoácidos. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o una sustitución similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente (p.ej., mutaciones conservativas) no tendrán un gran efecto en la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar en una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Para métodos adicionales, véase, p.ej., Levin et al., Nature, 2012, 484(7395):529-533.

La presente descripción contempla además un método para generar conjuntos de mutantes combinatorios de los polipéptidos de semaforina, además de mutantes de truncado y secuencias variantes funcionales cribando las bibliotecas combinatorias. Hay muchas formas por las que una biblioteca de homólogos potenciales puede generarse a partir de una secuencia de oligonucleótido degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador de ADN automático, y los genes sintéticos pueden ligarse entonces a un gen apropiado para la expresión. Un conjunto degenerado de genes proporciona, en una mezcla, todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias polipeptídicas solubles potenciales. La síntesis de oligonucleótidos degenerados se conoce bien en la técnica (véase, p.ej., Narang, Tetrahedron 39:3 (1983); Itakura et al., “Recombinant DNA” (Proc. 3a Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. A G Walton, Ámsterdam: Elsevier págs.

273-289 (1981)); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984); Itakura et al., Science 198:1056 (1984); e Ike et al., Nucleic Acid Res. 11:477 (1983). Dichas técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas (véase, p.ej., Scott et al., Science 249:386-390 (1990); Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 89:2429-2433 (1992); Devlin et al., Science 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6378-6382 (1990); y Patentes de EE.UU. núms. 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).

De forma alternativa, pueden utilizarse otras formas de mutagénesis para generar una biblioteca combinatoria, que incluyen mutagénesis de barrido de alanina y similares (Ruf et al., Biochemistry 33:1565-1572 (1994); Wang et al., J. Biol. Chem. 269:3095-3099 (1994); Balint et al., Gene 137:109-118 (1993); Grodberg et al., Eur. J. Biochem.

218 :597-601 (1993) ; Nagashima et al., J. Biol. Chem. 268:2888-2892 (1993); Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838 (1991); y Cunningham et al., Science 244:1081-1085 (1989)), mutagénesis de barrido de conector (Gustin et al., Virology 193:653-660 (1993); Brown et al., Mol. Cell Biol. 12:2644-2652 (1992); y McKnight et al., Science 232:316 (1982)); mutagénesis de saturación (Meyers et al., Science 232:613 (1986)); por mutagénesis de PCR (Leung et al., Methods Cell. Mol. Biol. 1:11-19 (1989)); o mutagénesis aleatoria, que incluye mutagénesis química (Miller et al., “A Short Course in Bacterial Genetics” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1992); y Greener et al. Strategies in Mol. Biol. 7:32-34 (1994)). La mutagénesis de barrido de conector, particularmente en un conjunto combinatorio, es un método atractivo para identificar las formas truncadas (bioactivas) del polipéptido de estudio.

Un amplio intervalo de técnicas se conoce en la técnica para cribar productos génicos de bibliotecas combinatorias hechas por mutaciones y truncamientos puntuales, y para cribar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una cierta propiedad. Dichas técnicas pueden adaptarse para el cribado rápido de las bibliotecas génicas generadas por la mutagénesis combinatoria de los polipéptidos de semaforina de estudio. Las técnicas más ampliamente usadas para cribar grandes bibliotecas génicas típicamente comprenden clonar la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformar las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresar los genes combinatorios bajo condiciones en que la detección de una actividad deseada facilita relativamente el fácil aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Algunos de los ensayos ilustrativos descritos en la presente memoria (p.ej., en la sección de ejemplos, posterior) están dispuestos para el análisis de alto rendimiento como sea necesario para cribar grandes números de secuencias degeneradas creadas mediante técnicas de mutagénesis combinatoria.

En ciertas realizaciones, las moléculas de semaforina útiles de la descripción son pequeñas moléculas tales como un péptido y un peptidomimético. Como se usa en la presente memoria, el término “peptidomimético” incluye péptidos modificados químicamente y moléculas tipo péptido que contienen aminoácidos que no se dan de forma natural, peptoides y similares. Los peptidomiméticos proporcionan varias ventajas sobre un péptido, que incluyen estabilidad mejorada cuando se administra a un sujeto. Los métodos para identificar un peptidomimético son bien conocidos en la técnica e incluyen el cribado de bases de datos que contienen bibliotecas de peptidomiméticos potenciales. Por ejemplo, la base de datos estructural de Cambridge contiene una colección de más de 300.000 compuestos que tienen estructuras cristalinas conocidas (Allen et al., Acta Crystallogr. Section B 35:2331 (1979)). Donde no está disponible la estructura cristalina de una molécula diana, puede generarse una estructura usando, por ejemplo, el programa CONCORD (Rusinko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 29:251 (1989)). Otra base de datos, el Directorio de Compuestos Químicos Disponibles (Molecular Design Limited, Informations Systems; San Leandro Calif.) contiene aproximadamente 100.000 compuestos que están disponibles comercialmente y también pueden buscarse para identificar peptidomiméticos potenciales de los polipéptidos de semaforina.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos de semaforina inhibidores y agonistas de la descripción pueden además comprender modificaciones post-traduccionales. Dichas modificaciones incluyen, aunque no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como resultado, los polipéptidos solubles modificados pueden contener elementos no aminoácidos, tales como polietilenglicoles, lípidos, poli- o monosacárido, y fosfatos. Los efectos de dichos elementos no aminoácidos en la funcionalidad de un polipéptido pueden probarse usando los ensayos funcionales descritos en la presente memoria.

En ciertos aspectos, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos de semaforina de la descripción incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una parte del polipéptido de semaforina y uno o más dominios de fusión. Ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusión incluyen, aunque no están limitados a, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), proteína de unión a la maltosa (MBP), que son particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión por cromatografía de afinidad.

Para el propósito de purificación por afinidad, pueden usarse matrices relevantes para cromatografía de afinidad, tales como resinas conjugadas con glutatión, amilasa, y níquel o cobalto. Otro dominio de fusión bien conocido en la técnica es proteína fluorescente verde (GFP). Los dominios de fusión también incluyen “etiquetas de epítopo”, que son normalmente secuencias peptídicas cortas para las que está disponible un anticuerpo específico. Etiquetas de epítopo bien conocidas para las que están fácilmente disponibles anticuerpos monoclonales específicos incluyen FLAG, hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, y etiquetas c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de escisión de proteasa, tal como para Factor Xa o trombina, que permite a la proteasa pertinente digerir parcialmente las proteínas de fusión y liberar así las proteínas recombinantes de ellas. Las proteínas liberadas pueden aislarse entonces del dominio de fusión por la posterior separación cromatográfica. En ciertas realizaciones, los polipéptidos solubles contienen una o más modificaciones que son capaces de estabilizar los polipéptidos. Por ejemplo, dichas modificaciones mejoran la vida media in vivo (p.ej., circulatoria) de los polipéptidos solubles.

En una realización, una proteína semaforina aislada o purificada puede inmovilizarse en una matriz de afinidad adecuada o soporte sólido mediante técnicas estándar, tal como reticulado químico (p.ej., directo o a través de una o más moléculas conectoras), o por medio de un anticuerpo surgido contra la proteína o una etiqueta de afinidad o por medio de un ligando para una etiqueta de afinidad. El soporte sólido puede ser cualquier fase sólida o matriz adecuada, tal como una perla, la pared de una placa u otra superficie adecuada (p.ej., un pocillo de una placa de microvaloración), vidrio poroso en columna (CPG) o un alfiler que puede sumergirse en una disolución, tal como en un pocillo. De forma conveniente el soporte puede estar hecho de p.ej., vidrio, sílice, látex, plástico o cualquier material polimérico. El soporte puede estar hecho también de un material biodegradable. La superficie de soporte puede ser hidrófoba o hidrófila. El soporte puede tener de forma adecuada una superficie funcionalizada. Véase, p.ej., Patentes de EE.UU. núms. 4.336.173; 4.459.378; 4.654.267. Un soporte particulado (p.ej., perlas o partículas) pueden ser sustancialmente esféricas. Un ejemplo de un soporte particulado es partículas monodispersas, es decir, que son sustancialmente uniformes en tamaño (p.ej., tamaño que tiene una desviación estándar de diámetro de menos de 5%). Eso tiene la ventaja de que proporcionan reproducibilidad de reacción muy uniforme. Las perlas de polímero no magnético pueden ser también aplicables. Esas están disponibles a partir de un amplio intervalo de fabricantes, p.ej., Dynal Particles AS, Qiagen, Amersham Biosciences, Serotec, Seradyne, Merck, Nippon Paint, Chemagen, Promega, Prolabo, Polysciences, Agowa, y Bangs Laboratories. Otro ejemplo de un soporte adecuado es perlas o partículas magnéticas. Las perlas y partículas magnéticas pueden ser de forma adecuada paramagnéticas o superparamagnéticas. Las perlas y partículas superparamagnéticas se describen p.ej. en el documento EP 0106873. Las perlas y partículas magnéticas están disponibles de varios fabricantes, p.ej., Dynal Biotech ASA.

Las moléculas de semaforina de la descripción (p.ej., moléculas agonistas) pueden también unirse, de forma covalente o no covalente a uno o más dominio(s) de multimerización tales como, p.ej., IgG o estreptavidina. Los multímeros basados en moléculas orgánicas útiles incluyen estructuras cíclicas funcionalizadas tales como anillos de benceno y dextrano. Véase, p.ej., la patente de EE.UU. núm. 5.635.363, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. núm. 2004209295, Publicaciones PCT núms. WO 02/072631 y WO 99/42597. La unión a dominios de multimerización puede ser por medio de enlaces covalentes o no covalentes, p.ej., mediante reacciones químicas entre grupos reactivos del dominio de multimerización (p.ej., funcionalidades de vinilsulfona en un polímero de dextrano) y grupos reactivos en la proteína semaforina (p.ej. grupos amino en la superficie de la proteína), o mediante interacción no covalente entre una parte de la proteína semaforina (p.ej., un componente peptídico biotinilado) y el dominio de multimerización (p.ej., cuatro sitios de unión para biotina en la proteína tetramérica de estreptavidina). Las reacciones químicas apropiadas para el acoplamiento covalente de semaforinas y el (los) dominio(s) de multimerización incluyen sustitución nucleófila mediante la activación de electrófilos (p.ej., acilación tal como formación de amida, formación de pirazolona, formación de isoxazolona; alquilación; vinilación; formación de disulfuro), adición a enlaces múltiples carbono-hetero (p.ej. formación de alqueno por reacción de fosfonatos con aldehídos o cetonas; arilación; alquilación de arenos/hetarenos por reacción con alquilboronatos o enoléteres), sustitución nucleófila usando la activación de nucleófilos (p.ej. condensaciones; alquilación de haluros alifáticos o tosilatos con enoléteres o enaminas), y cicloadiciones. Las moléculas apropiadas, capaces de proporcionar interacciones no covalentes entre el uno o más dominio(s) de multimerización y la proteína de semaforina, implican los siguientes pares de moléculas y moléculas: estreptavidina/biotina, avidina/biotina, anticuerpo/antígeno, ADN/ADN, ADN/APN, ADN/ARN, APN/A^pN, ANB/ADN, cremallera de leucina, p.ej. Fos/Jun, proteína dimérica de IgG, proteína multivalente IgM, hélices en espiral-enrolladas de ácido/base, quelato/quelato unido a ion metálico, estreptavidina (SA) y avidina y derivados de los mismos, biotina, inmunoglobulinas, anticuerpos (monoclonal, policlonal y recombinante), fragmentos de anticuerpo y derivados de los mismos, dominio de cremallera de leucina de AP-1 (jun y fos), hexa-his (resto quelato metálico), afinidad de glutatión por hexa-hat GST (glutatión S-transferasa), péptido de unión a calmodulina (CBP), estrep-etiqueta, dominio de unión a celulosa, proteína de unión a maltosa, etiqueta S-Péptido, etiqueta de unión a quitina, epítopos inmuno-reactivos, etiquetas de epítopo, etiqueta E2, etiqueta de epítopo HA, epítopo Myc, epítopo FLAG, epítopos AU1 y AU5, epítopo Glu-Glu, epítopo KT3, epítopo IRS, epítopo de etiqueta B, epítopo de proteína quinasa-C, epítopo de VSV, lectinas que median la unión a una diversidad de compuestos, que incluyen carbohidratos, lípidos y proteínas, p.ej. Con A (Canavalia ensiformis) o WGA (aglutinina de germen de trigo) y tetranectina o proteína A o G (afinidad al anticuerpo). Las combinaciones de dichas entidades de unión están comprendidas también. En particular, cuando se etiqueta el complejo MHC, el (los) dominio(s) de multimerización puede(n) ser una “anti-etiqueta”. Por “anti-etiqueta” se entiende un anticuerpo de unión a la etiqueta y cualquier otra molécula capaz de unirse a dicha etiqueta. Para técnicas de multimerización, véase también Mekhaiel et al., Scientific Reports, 2011, 1:124.

Inhibidores y agonistas de molécula pequeña de la descripción

La presente descripción también incluye inhibidores y agonistas de molécula pequeña del eje Nrp1 :semaforina en las Tregs. Las moléculas pequeñas son un grupo diverso de sustancias sintéticas y naturales que tienen generalmente bajos pesos moleculares (preferiblemente menos que aproximadamente 2000 Daltons, menos que aproximadamente 1000 Daltons, o menos que aproximadamente 500 Daltons). Las moléculas pequeñas, sin limitación, pueden ser, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, ácidos peptidonucleicos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas (que contienen carbono) o inorgánicas y pueden ser sintéticas o darse de forma natural o estar opcionalmente derivatizadas. Dichas moléculas pequeñas pueden ser unas sustancias terapéuticamente distribuibles o pueden derivatizarse más para facilitar la distribución o direccionamiento. Pueden aislarse de fuentes naturales (por ejemplo, plantas, hongos, microbios y similares) o aislarse de bibliotecas químicas aleatorias o combinatorias de compuestos sintéticos o naturales, o sintetizarse. Véase Werner et al., (2006) Brief Funct. Genomic Proteomic 5(1):32-6. Se conocen en la técnica muchas bibliotecas aleatorias o combinatorias que pueden usarse. Numerosos medios se usan actualmente para la síntesis aleatoria y dirigida de compuestos basados en sacáridos, péptidos y ácidos nucleicos. Las bibliotecas de compuestos sintéticos están disponibles comercialmente de Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, RU), Comgenex (Princeton, N.J.), Brandon Associates (Merrimack, N.H.), y Microsource (New Milford, Conn.). Una biblioteca química rara está disponible de Aldrich (Milwaukee, Wis.). De forma alternativa, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles de p.ej. Pan Laboratories (Bothell, Wash.) o MycoSearch (N.C.) o son fácilmente reproducibles. Adicionalmente, las bibliotecas y compuestos naturales y producidos de forma sintética se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales (Blondelle et al., (1996) Tib Tech 14:60).

Los métodos para preparar bibliotecas de moléculas se conocen bien en la técnica y muchas bibliotecas están disponibles comercialmente. Las bibliotecas de interés en la descripción incluyen bibliotecas peptídicas, bibliotecas de oligonucleótidos aleatorizados, bibliotecas combinatorias orgánicas sintéticas, y similares. Las bibliotecas de péptidos degenerados pueden prepararse fácilmente en disolución, en forma inmovilizada como bibliotecas de visualización de péptidos de flagelos bacterianos o como bibliotecas de visualización de fagos. Los ligandos peptídicos pueden seleccionarse de bibliotecas combinatorias de péptidos que contienen al menos un aminoácido. Las bibliotecas pueden ser sintetizados de peptoides y restos sintéticos no peptídicos. Dichas bibliotecas pueden sintetizarse adicionalmente para que contengan restos sintéticos no peptídicos, que están menos sometidos a degradación enzimática en comparación con sus homólogos que se dan de forma natural. Las bibliotecas también pretenden incluir por ejemplo aunque no estén limitadas a bibliotecas de péptido en plásmido, bibliotecas de polisoma, bibliotecas de aptámeros, bibliotecas de péptidos sintéticos, bibliotecas de moléculas pequeñas sintéticas y bibliotecas químicas. Las bibliotecas pueden comprender además estructura de carbono cíclica o heterocíclica y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales identificados anteriormente.

Ejemplos de bibliotecas sintetizadas químicamente se describen en Fodor et al., (1991) Science 251:767-773; Houghten et al., (1991) Nature 354:84-86; Lam et al., (1991) Nature 354:82-84; Medynski, (1994) BioTechnology 12:709-710, Gallop et al., (1994) J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; Ohlmeyer et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., (1992) Biotechniques 13:412; Jayawickreme et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 90:11708-11712; Publicación PCT núm. WO 93/20242, fechada el 14 de octubre de 1993; y Brenner et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383.

Ejemplos de bibliotecas de visualización de fagos se describen en Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Devlin et al., (1990) Science, 249:404-406; Christian, et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:711-718; Lenstra, (1992) J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kay et al., (1993) Gene 128:59-65; y Publicación PCT núm. WO 94/18318.

El cribado de las bibliotecas puede conseguirse por cualquier variedad de métodos conocidos normalmente. Véase, por ejemplo, las siguientes referencias, que describen el cribado de bibliotecas peptídicas: Parmley y Smith (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott y Smith, (1990) Science 249:386-390; Fowlkes et al., (1992) BioTechniques 13:422-427; Oldenburg et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yu et al., (1994) Cell 76:933-945; Staudt et al., (1988) Science 241:577-580; Bock et al., (1992) Nature 355:564-566; Tuerk et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellington et al., (1992) Nature 355:850-852; Patentes de EE.UU. núms. 5.096.815; 5.223.409 y 5.198.346, todas de Ladner et al.; Rebar et al., (1993) Science 263:671-673; y Publicación PCT WO 94/18318.

La identificación y cribado de agonistas y antagonistas del eje Nrp1 :semaforina pueden facilitarse adicionalmente determinando características estructurales de las proteínas implicadas, p.ej., usando cristalografía de rayos X, difracción de neutrones, espectrometría de resonancia magnética nuclear y otras técnicas para la determinación de la estructura. Estas técnicas proporcionan el diseño racional o identificación de agonistas y antagonistas.

Compuestos que afectan a la expresión de Nrp1 o semaforina o los sucesos moleculares corriente abajo en Tregs. Como se especifica anteriormente, la presente descripción también incluye inhibidores del eje Nrp1 :semaforina en las Tregs que inhiben la expresión de Nrp1 en Tregs, o localmente (p.ej., en tumores) inhiben la expresión de semaforina en células T convencionales, o evitan que Nrp1 se una con su(s) ruta(s) de señalización corriente abajo. La presente descripción también incluye los agonistas del eje Nrp1:semaforina en Tregs que mejoran la expresión de Nrp1 en Tregs, o localmente (p.ej., en isletas pancreáticas para la diabetes) mejoran la expresión de semaforina en células T convencionales, o mejoran la unión de Nrp1 con su(s) ruta(s) de señalización corriente abajo.

Ejemplos no limitantes de inhibidores de expresión útiles incluyen, p.ej., ARN de interferencia (p.ej., ARNip), ARNbc, ADNs transcritos por ARN polimerasa III, ribozimas, y ácidos nucleicos antisentido. Ejemplos no limitantes de mejora de expresión incluyen, p.ej., transferencia génica retroviral, transferencia génica lentiviral, sobreexpresión usando plásmidos y transfección.

Los oligonucleótidos antisentido, incluyendo moléculas de ADN, ARN y ADN/ARN antisentido, actúan para bloquear directamente la traducción de ARNm mediante la unión a ARNm objetivo y evitando la traducción de proteínas. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido de al menos aproximadamente 15 bases y complementarias a regiones únicas de la secuencia de ADN diana pueden sintetizarse, p.ej., mediante técnicas de fosfodiéster convencionales (Dallas et al., (2006) Med. Sci. Monit. 12(4):RA67-74; Kalota et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:173-96; Lutzelburger et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:243-59).

El ARNip comprende una estructura de doble hebra que contiene típicamente 15 a 50 pares de bases y preferiblemente 21 a 25 pares de bases y que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica o casi idéntica a un gen o ARN diana expresado en la célula. Los polinucleótidos antisentido incluyen, aunque no están limitados a: morfolinos, 2’-O-metilpolinucleótidos, ADN, ARN y similares.

Los ADNs transcritos por ARN polimerasa III contienen promotores, tales como el promotor U6. Estos ADNs pueden transcribirse para producir ARNs en horquilla pequeños en la célula que pueden funcionar como ARNip o ARNs lineales que pueden funcionar como ARN antisentido. El inhibidor puede polimerizarse in vitro, ser ARN recombinante, contener secuencias quiméricas, o derivados de estos grupos. El inhibidor puede contener ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos sintéticos, o cualquier combinación adecuada de manera que el ARN y/o gen diana se inhibe. Además, estas formas de ácido nucleico pueden ser de cadena sencilla, doble, triple o cuádruple. (Véase por ejemplo Bass (2001) Nature, 411,428 429; Elbashir et al., (2001) Nature, 411, 494498; y las Publicaciones PCT núms. WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 00/01846, WO 01/29058, WO 99/07409, WO 00/44914).

Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica de ARN. El mecanismo de acción del ribozima implica la hibridación específica de la secuencia de la molécula de ribozima al ARN diana complementario, seguido por escisión endonucleolítica. Las moléculas de ribozima con motivo de cabeza de martillo diseñadas que catalizan específicamente y eficientemente la escisión endonucleolítica de secuencias de ARNm están también dentro del alcance de la presente descripción. La exploración de las moléculas diana para localizar sitios de escisión de ribozima que incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC identifica inicialmente los sitios de escisión por ribozima específicos en cualquier diana de ARN potencial. Una vez identificadas, las secuencias de ARN cortas de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión pueden evaluarse por características estructurales predichas tal como la estructura secundaria que puede dar la secuencia de oligonucleótidos inadecuada. La idoneidad de dianas candidato puede evaluarse también probando su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios usando, p.ej., ensayos de protección de ribonucleasa.

Los inhibidores de expresión de la presente descripción pueden prepararse por métodos conocidos. Estos incluyen técnicas para la síntesis química tales como, p.ej., por síntesis química de fosfoamita en fase sólida. De forma alternativa, las moléculas de ARN antisentido pueden generarse por transcripción in vitro o in vio de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN. Dichas secuencias de ADN pueden incorporarse en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados tales como los promotores de T7 o SP6 polimerasa. Véase, p.ej., Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986.

Varias modificaciones a los oligonucléotidos de la presente descripción pueden introducirse como un medio de aumentar la estabilidad intracelular y la vida media. Las posibles modificaciones incluyen aunque no están limitadas a la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos a los extremos 5’ y/o 3’ de la molécula, o el uso de fosforotioato o 2’-O-metilo más que uniones fosfodiesterasa en el esqueleto del oligonucleótidos.

Se hacen fácilmente secuencias de ácido nucleico aptámeros que se unen a una amplia variedad de moléculas diana. Las secuencias de ácido nucleico aptámero de la descripción pueden estar comprendidas completamente por ARN o parcialmente de ARN, o completamente o parcialmente de ADN y/u otros análogos de nucleótidos. Los aptámeros se desarrollan típicamente para unir ligandos particulares empleando técnicas de selección conocidas in vivo o in vitro (lo más típicamente, in vitro) conocidas como SELEX (Evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial). Los métodos de fabricación de aptámeros se describen en, por ejemplo, Ellington y Szostak (1990) Nature 346:818, Tuerk y Gold (1990) Science 249:505, Patente de Ee .UU. núm. 5.582.981; Publicación PCT núm. WO 00/20040; Patente de EE.UU. núm. 5.270.163; Lorsch y Szostak (1994) Biochem.

33:973; Mannironi et al., (1997) Biochem. 36:9726; Blind (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610; Huizenga y Szostak (1995) Biochem. 34:656-665; Publicaciones PCT núms. WO 99/54506, WO 99/27133 y WO 97/42317; y Patente de EE.UU. núm. 5.756.291.

En una realización específica, el inhibidor del eje Nrp1 :semaforina inhibe una ruta de señalización entre el dominio citoplasmático de la proteína Nrp1 que comprende la secuencia de aminoácidos C-terminal SEA (motivo de unión al dominio PDZ C-terminal) y proteína PTEN; dicho inhibidor puede ser, p.ej., un péptido o una molécula pequeña o un fragmento de proteína Nrp1 que comprende todo o parte de su dominio citoplasmático que comprende la secuencia de aminoácidos C-terminal SEA o un derivado o un análogo del mismo.

Métodos para administrar composiciones que comprenden inhibidores o agonistas

En ciertas realizaciones, los inhibidores y agonistas se formulan en composiciones farmacéuticas con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los compuestos pueden formularse para la administración en cualquier forma conveniente para usar en medicina humana o veterinaria. Agentes humectantes, emulgentes y lubricantes, tales como laurilsulfato sódico y estearato de magnesio, además de agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, conservantes y antioxidantes, pueden también estar presentes en las composiciones. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquier método bien conocido en la técnica. La cantidad de ingredientes activos que pueden combinarse con el material de transporte para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del huésped a tratar y el modo particular de administración. La cantidad de ingredientes activos que pueden combinarse con un material de transporte para producir una única forma de dosificación será generalmente esa cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico.

En general, las formulaciones pueden prepararse con un vehículo líquido, o un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y después, si fuera necesario, dando forma al producto.

Las formulaciones para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, bolsitas, píldoras, comprimidos, polvos, gránulos o como una disolución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, y similares, cada una conteniendo una cantidad predeterminada de uno o más ingredientes activos.

En formas de dosificación sólida para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), uno o más ingredientes activos pueden mezclarse con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tal como citrato sódico o fosfato dicálcico, y/o cualquiera de lo siguiente: (1) cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa, y/o goma arábiga; (3) humectantes, tal como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tales como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato sódico; (5) agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tal como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tal como caolín y arcilla bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato cálcico, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato sódico y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas pueden comprender además agentes tamponantes. Las composiciones sólidas de un tipo similar pueden emplearse también como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, además de polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Las suspensiones, además de uno o más ingredientes activos, pueden contener agentes de suspensión tal como alcoholes de isoestearilo etoxilado, polioxietilensorbitol, y ásteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Las composiciones de la invención pueden además administrarse tópicamente, o a la piel o a las membranas mucosas. Esto ofrece la mayor oportunidad para la distribución directa con la menor posibilidad de inducir efectos secundarios. Las formulaciones tópicas pueden incluir además uno o más de la amplia variedad de agentes conocidos por ser efectivos como potenciadores de la penetración a la piel o al estrato corneo. Ejemplos de estos son 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona, dimetilacetamida, dimetilformamida, propilenglicol, alcohol de metilo o isopropilo, dimetilsulfóxido y azona. Pueden además incluirse agentes adicionales para hacer la formulación cosmáticamente aceptable. Ejemplos de estos son grasas, ceras, aceites, tintes, fragancias, conservantes, estabilizantes y agentes de superficie activa. Los agentes queratolíticos tales como los conocidos en la técnica pueden incluirse también. Ejemplos son ácido salicílico y azufre.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdármica incluyen polvos, aerosoles, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches e inhalantes. Los agentes terapéuticos de estudio pueden mezclarse en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampón o propelente que pueda necesitarse. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un agente polipeptídico de estudio, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.

Los polvos y aerosoles pueden contener, además de uno o más ingredientes activos, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio, y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles pueden contener adicionalmente propelentes habituales, tal como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos no sustituidos volátiles, tales como butano y propano.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden comprender uno o más ingredientes activos en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones, acuosas o no acuosas isotónicas estériles, farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de usar, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos, solutos que dan la formulación isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspensión o espesamiento. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la descripción incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones pueden contener también conservantes, agentes humectantes, agentes emulgentes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico y similares. Puede ser también deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede provocarse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tal como monoestearato de aluminio y gelatina.

Las formas de depósito inyectable pueden hacerse formando matrices de microencapsular de uno o más ingredientes activos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación de ingrediente activo a polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberación de antagonista. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito se preparan también atrapando a los antagonistas en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.

Las formulaciones para administración intravaginal o rectal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más ingredientes activos con uno o más excipientes o vehículos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera de supositorio o un salicilato, y que es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a temperatura corporal y, por lo tanto, fundirá en el recto o cavidad vaginal y liberará el compuesto activo.

Ejemplos

La presente invención se describe también y se demuestra por medio de los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Ratones. Se compraron ratones C57/BL6 y dnTGFpRIl de the Jackson Laboratories. Los ratones Foxp3YFP'lCre, Foxp3' y Foxp3DTR-gfp se obtuvieron de A.Y. Rudensky (HHMI/Universidad de Washington; véase Rubtsov et al., Immunity, 2008, 28:546-558; Fontenot et al., Nat. Immunol., 2003, 4(4):330-336; Kim et al., Nat Immunol., 2007, 8(2):191-197). Los ratones Il10'/' se obtuvieron de T. Geiger (Hospital de investigación infantil St. Jude; véase Selvaraj y Geiger, J. Immunol., 2008, 180(5):2830-2838). Los ratones Nrp1f/f se obtuvieron de D. Cheresh (UCSD; véase Acevedo et al., Blood, 2008, 111(5):2674-2680). Los ratones Foxp3- x CD45.1 se criaron a partir de cruces heterocigóticos. Los experimentos animales se realizaron en instalaciones libres de patógenos específicos, acreditadas por la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio, en el Centro de Recursos Animales de St. Jude. Los protocolos animales se aprobaron por el Comité de Uso y Cuidado Animal de St. Jude.

Anticuerpos de Nrp1 y semaforina. Se compró Sema-3a de ratón, Nrp1 de ratón y Sema4a-Ig humano de R&D Biosystems. Dos diferentes anticuerpos de bloqueo de Nrp1 se usaron en los experimentos: (i) R&D AF566 son anticuerpos policlonales purificados por afinidad de ratón/rata anti-Nrp1 (IgG de cabra), y (ii) anticuerpos monoclonales anti-Nrp1 (IgG2a de rata), proporcionados por R&D Biosystems (R&D Systems, clon 761704, MAB59941). Los siguientes anticuerpos para semaforina-4a (Sema4a) se usaron: clon 5E3 de MBL International y anticuerpos monoclonales de R&D Biosystems (clon 757129) (véase, p.ej., las Figuras 1E, 2H, 4I). El anticuerpo de tinción de Sema4a se compró de MBL International (clon 5E3), y se conjugó con biotina o Alexa Fluor 647 en las instalaciones. La mayoría de anticuerpos citométricos de flujo se compraron de BioLegend. Anti-Foxp3 y anti-Eomes se compraron de eBioscience. El anticuerpo KLF2 se compró de Millipore. Los anticuerpos fosfo-Akt (S473), fosfo-S6K1 (T421/S424), Foxo3a, y pan Akt se compraron de Cell Signaling Technologies. El anticuerpo PTEN-HRP se compró de Santa Cruz Biotechnology.

ARN de interferencia. El ARNip de control (Catálogo núm. 4390843) y las reservas de ARNip de Sema4a (Catálogo núm. 4390771, ARNip núm. s73547) se compraron de Life Technologies y se resuspendieron según las instrucciones del fabricante. Las células T convencionales CD4+ y CD8+ se clasificaron magnéticamente por selección negativa y se transfectaron por Amaxa (Lonza) con 300 pMol de ARNip y 2 Mg de plásmido de control pMaxGFP, se dejaron toda la noche en medio nucleofector Amaxa. Las células se clasificaron después en base a la expresión de GFP, CD25 y CD45RB y se cocultivaron con células Treg en el pocillo superior de un ensayo de supresión Transwell.

Plásmidos. Nrp1.mCherry se obtuvo de Addgene y se usó como una plantilla para generar constructos de sobreexpresión retroviral. Nrp1WT se generó añadiendo la secuencia de señal nativa y se clonó en pMICherry. Nrp1ñSEA se generó a partir del constructo WT, suprimiendo el motivo SEA terminal por mutación del codón de serina a un codón de parada. AktWT, AktDN (K179M sin actividad quinasa dominante negativo como se describe por Franke et al., Cell, 1995, 81:727-736), y el vector vacío pBabe se obtuvieron de D.R. Green (descrito en Morgenstern JP, Land H., 1990, Nucleic Acids Research 18(12):3587-96).

Poblaciones de células T humanas. Las muestras de cordón umbilical humano se proporcionaron por B. Triplett, M. Howard y M. McKenna en el Banco de sangre del cordón de San Luis, y se obtuvieron de la vena umbilical inmediatamente después de la expulsión vaginal con el consentimiento informado de la madre y aprobado por el Consejo de revisión institucional (IRB) del banco de sangre de cordón de San Luis. El uso de investigación se aprobó por el IRB de St. Jude.

Supresión Transwell. 1,25 x 104 Treg purificadas por FACS (CD45RBto Foxp3YFP-lCre+) se estimularon en la cámara superior de un Millipore Millicell 96 (0,4 Mm de tamaño de poro) en presencia de Tconv clasificadas (CD45RBhi CD25-CD4+ o CD8+), células B (B220+) o Treg en una relación 1:4, perlas de látex conjugadas con Sema4a-Ig o IgG (relación 1:1), perlas de látex conjugadas (compradas de Life Technologies) con anti-CD3 (145.2C11) y anti-CD28 (37.51) (obtenidas de BioLegend) (relación 1:1), y/o anticuerpos de neutralización. En algunos experimentos, las células co-cultivadas del pocillo superior se fijaron con PFA al 2% durante 15 minutos y se lavaron extensamente antes de co-cultivar con Treg. 2,5 x 104 Treg purificadas se estimularon en el pocillo inferior con perlas anti-CD3/anti-CD28 a una relación 1:1. Las células se cultivaron durante 72 horas y se pulsaron con 3[H]-timidina durante las 8 horas finales. Las cámaras inferiores se cosecharon y se leyeron con un contador beta.

Para estudios humanos, las Tconv (CD4+CD25-) de sangre de cordón umbilical clasificadas y Treg (CD4+CD25+) se activaron con 3 Mg/mL de anti-CD3 unido a la placa (clon OKT3, Biolegend), 2 Mg/mL de anti-CD28 soluble (clon CD28.1, Biolegend), y 100 U/mL de rhIL-2 (Farmacia de St. Jude) durante 7-9 días. Después de cosechar y lavar, las Treg se estimularon a una relación de 1:200 con Tconv autólogas fijas o perlas de látex recubiertas con IgG/Sema4a-Ig en el pocillo superior de una placa transwell. 2,5 x 104 Tconv se estimularon en el pocillo inferior a una relación 1:1 con perlas de látex recubiertas con OKT3/CD28.1. Las células se cultivaron durante 5 días y se pulsaron con 3[H]-timidina durante las 8 horas finales. Las cámaras inferiores se cosecharon y leyeron con un contador beta.

“Porcentaje de supresión transwell” se define como 100 - 100 x [(CPM de un pocillo particular)/(CPM promedio de células no suprimidas)] para normalizar los experimentos.

Proteínas de fusión. La secuencia que codifica los dominios extracelulares de Sema4a o Nrp1 se clonó dentro del marco a pX-Ig para crear un constructo de proteína de fusión Fc-IgG1 de ratón de Sema4a o Nrp1 (Sema4a-Ig o Nrp1 -Ig). Las células B J558L se electroporaron con este constructo, y se seleccionaron clones de alta producción por clasificación de célula sencilla. Los clones de alta producción se sembraron en Biorreactores Sartorious y se cosecharon para la purificación y concentración de proteína G. Se conjugaron perlas de 4 pm de látex de sulfato (Life Technologies) con control de isotipo (IgG1 de ratón, MOPC21, R&D Biosystems) o Sema4a-Ig toda la noche con 3 pg de proteína por perla, se bloqueó con FBS al 10% y se almacenó en medio. Sema-3a-Fc de ratón, Sema4a-Fc, Nrp1 de ratón y Sema4a-Fc humano se compraron de R&D Systems.

Ensayos de unión. Las placas de alta unión a proteína se recubrieron con 500 ng/mL de Nrp1 murina recombinante (R&D Systems) toda la noche en PBS. Después de un bloque de 1-2 h en BSA al 1% en PBS a temperatura ambiente, las placas recubiertas se incubaron con diversas concentraciones de Sema4a-Ig o IgG1 de ratón durante 2-4 horas en presencia de anticuerpos de anti-Sema4a, anti-Nrp1 o control de isotipo. Las placas se lavaron después con PBS 0,05% de TWEEN-20 10 veces y se incubaron con 500 ng/mL de anticuerpo IgG1 anti-ratón biotinilado (BD Biosciences) para unir la proteína de fusión (o control IgG1 de ratón). Después de 7 lavados, se añadió estreptavidina-HRP (GE Healthcare) a 500 ng/mL para detectar el anticuerpo biotinilado. Después de otros 7 lavados, se añadió sustrato TMB (Thermo Scientific) y se paró con H²SO⁴1N.

Para la unión VEGF, se siguió el mismo protocolo, excepto que en vez de usarse Sema4a-Ig, se usó VEGF165 (R&D Systems) a 50 ng/mL en PBS y se detectó con 500 ng/mL de anti-VEGF-biotina (R&D Systems) seguido por SA-HRP para la detección. Por comparaciones a lo largo de los miembros de la familia Sema, las placas se recubrieron con concentraciones variables de Sema3a-Fc, Sema4d-Fc, Sema4a-Ig, o control de isotipo toda la noche. Se añadió Nrp1 -Ig biotinilado y se incubó durante 3 horas, y se usó SA-HRP para la detección.

Análisis de ARNm. Se extrajo ARN de células lisadas en reactivo TRIzol (Life Technologies) y se transcribieron de forma inversa con el kit de Transcripción inversa de alta capacidad (Applied Biosystems). El PCR a tiempo real se realizó usando cebadores y sondas y mezcla maestra TaqMan o química verde SYBR (Applied Biosystems).

Rescate de autoinmunidad deficiente de Foxp3. Ratones hembra CD45.1 x Foxp3+/~ se cruzaron con ratones macho CD45.1 en reproducciones medidas. La progenie macho se genotipó en el nacimiento para el estatus Foxp3-. 1x106 Tregs CD45.2+ Foxp3Cre o Nrp1f/fFoxp3Cre purificadas, purificadas por citometría de flujo, se inyectaron de forma intraperitoneal en cachorros macho Foxp3- dentro de los 3 días después del nacimiento. Los ratones se monitorizaron para el fenotipo scurfy (piel escamosa, inflamación de ojos, fenotipo enano, y falta de movilidad). Para algunos experimentos, todos los ratones se sacrificaron a las 5 semanas para el análisis histológico del pabellón de la oreja, hígado y pulmón.

Modelos tumorales. Los ratones Foxp3Cre, Nrp1f/fFoxp3Cre o Foxp3DTRgfp se inyectaron con melanoma B16.F10 (1,25 x 105 células i.d.), EL4 timoma (1,25x105 células i.d.) o carcinoma de colon MC38 (2,5x105 células s.c.). Los tumores de midieron de forma regular con calibres digitales y el volumen tumoral se calculó. Los tumores y nódulos linfáticos se cosecharon para el análisis. Se prepararon TILs usando un gradiente Percoll de muestras tumorales después de alteración mecánica. Para estudios de metástasis, se inyectó B16.F10 de forma intravenosa en varias dosis. Después de 17-20 días, los pulmones se cosecharon, se inflaron con H²O² , y se contaron las metástasis. Los experimentos B16 terapéuticos se realizaron inyectando 1,25x105 células de melanoma B16 i.d. y esperando hasta que los tumores fueron palpables (5 días). En el día 5, los ratones empezaron a recibir inyecciones intraperitoneales o de IgG2a de rata o anti-Nrp1 (R&D Systems, clon 761704) (400 pg de dosis inicial y 200 pg cada tres días).

Colitis experimental. Ratones RAG2-/- de 6 a 8 semanas de edad se inyectaron de forma intraperitoneal con 4x105 células Tconv CD45RBhi CD25- marcadas congénitamente. 21 a 28 días después (cuando la mayoría de los ratones habían perdido el 5% de peso corporal y tenían síntomas de colitis), 1x106 Treg Foxp3Cre o Nrp1f/fFoxp3Cre se inyectaron de forma intraperitoneal. El peso corporal se midió diariamente, y 28 días después del rescate con Treg, las secciones se tiñeron para la histología.

Análisis de señalización. Para citometría de flujo, las Treg se estimularon con perlas cubiertas con anti-CD3e/anti-CD28 y células T convencionales purificadas o perlas Sema4a-Ig durante varias veces, después se fijaron con PFA al 1% durante 15 minutos a 37°C. Las células se permeabilizaron entonces en MeOH al 90% enfriado con hielo durante 20 min a -20°C. Después de lavado extensivo en PBS, las células se bloquearon con suero de ratón normal al 10% en PBS durante 10 minutos a TA. Las células se tiñeron entonces con anticuerpos en BSA al 1% en PBS (pAkt (T308), pAkt (S473)) durante 1 horas a TA en la oscuridad. Finalmente, las células se tiñeron con anticuerpos secundarios apropiados durante 30 minutos a TA en la oscuridad, después se lavaron y se analizaron. Para análisis de inmunotransferencia, las Treg se expandieron con 1 ng/mL de forbol-13-miristol acetato y 10 ng/mL de ionomicina con 500 U de rhIL-2 durante 3 días, después se lavaron extensamente con medio y se expandieron a volumen 10X en 500 U de rhIL-2. Después de un descanso de una noche sin IL-2, las Treg se estimularon con anti-CD3 unido a la placa, anti-CD28 soluble y Sema4a-Ig unido a la perla durante 3 horas, después se lisaron en tampón de lisis celular completo (NP40 al 1%, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, TWEEN-20) durante 15 min en hielo. En algunos experimentos, 3x106 Treg se lisaron en un volumen mayor, y se incubaron lisatos aclarados con perlas de proteína G durante 3 horas para “pre-aclarar” el lisato. Nrp1 se inmunoprecipitó usando un anticuerpo anti-Nrp1 policlonal (R&D AF566) toda la noche seguido por 3 horas de incubación con perlas de proteína G. Las perlas se lavaron con tampón de lisis antes de la elución y reducción antes de la inmunotransferencia. Brevemente, los precipitados o lisatos de entrada se incubaron a 100°C con 2-mercapto-etanol y tampón de muestra 4X LDS (Life Technologies), después se cargaron en geles Bis-Tris NuPAGE al 4-12% (Life Technologies), y se trataron durante 1 hora a 200 V. Los geles separados se electrotransfirieron a membranas PVDF usando el Sistema de inmunotransferencia en gel Criterion (Biorad), y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con BSA al 3% en TBS suplementado con 0,1% de TWEEN20. Las membranas bloqueadas se incubaron toda la noche con anti-PTEN directamente conjugado a HRP, se lavaron tres veces con TBS-TWEEN, y se formaron imágenes usando Western Lightning ECL.

Transducción retroviral. Se transfectaron células 293T con plásmidos de empaquetamiento pPAM-EQ y pVSV-G con varios constructos retrovirales para transducir células productoras retrovirales GPE86. Las células Treg se purificaron por citometría de flujo. Las Treg se activaron y se ciclaron con PMA e ionomicina en presencia de 500 U/mL de rhIL-2 durante 24 h en placas de fondo plano de 96 pocillos a 5x104 por pocillo en 100 gL. Los sobrenadantes virales se concentraron usando concentradores MWCO de 100 kDa (Millipore) 10 veces y se añadieron en igual volumen para ciclar células Treg en presencia de 500 U/mL de rhIL-2 y 6 gg/mL de polibreno y se centrifugaron a 2500 rpm durante 60 min a 37 grados, después se incubaron durante 24 h. El proceso de spinducción se repitió dos veces cada 24 h, eliminando 100 gL de sobrenadante de las Treg cultivadas cada día para mantener el volumen de cultivo a 200 gL por pocillo. Las células Treg se lavaron entonces en medio y se clasificaron en base a la expresión de proteína fluorescente o se seleccionaron con 1 gg/mL de puromicina y se expandieron más en IL-2. La tinción de proteína fluorescente o epítopo intracelular (anti-HA, Sigma) se confirmó antes del uso. Los ensayos funcionales se realizaron después de 24 h de descanso sin IL-2.

Microscopía. La iluminación TIRF de activación de IS se realizó como se describe anteriormente50. Brevemente, se prepararon bicapas lipídicas que contenían anti-TCR y un anticuerpo de captura de IgG1 anti-ratón cargado con Sema4a-Ig o control de isotipo. Las células Treg se estimularon en la bicapa durante 20 minutos, después se fijaron, permeabilizaron y tiñeron por fosfo-Akt (S473), fosfotirosina global (4G10) o Nrp1. “Porcentaje de grupos pAkt+TCR” representa la relación de sinapsis positivas de Akt fosforilado (S473) al número total de sinapsis formadas como lectura por la agrupación TCR. Foxo3a se desarrolló en Treg recién aisladas sin estimular en medio toda la noche o estimuladas con anti-CD3/anti-CD28 inmovilizadas en presencia o ausencia de Sema4a-Ig inmovilizado o su control de isotipo. Las células se cosecharon, se fijaron en PFA al 1%, y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% en TBS. Después de bloquear con suero de ratón normal, las células se tiñeron con anti-Foxo3a (Cell Signaling Technologies) toda la noche en BSA al 1% tamponado con Tris. Después de varios lavados, las células se tiñeron con IgG anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 647 (Life Technologies), y después se lavaron varias veces. Las células se cargaron entonces con DAPI y faloidina-Alexa Fluor 546 o 488 antes de la microscopía. Campos aleatorios de 10-30 células se visualizaron usando microscopía confocal de barrido láser de disco giratorio. Se generaron máscaras ciegas usando faloidina y tinción DAPI para determinar el volumen citoplasmático y nuclear, respectivamente, y solo entonces se visualizó la tinción Foxo3a. Los volúmenes nuclear y citoplasmático de fluorescencia de Foxo3a de 20-30 montones se calcularon usando software Slidebook (3i, Inc.) en unidades de fluorescencia arbitraria y se analizaron en Graphpad Prism.

Matriz Affymetrix y análisis. Las Treg Foxp3Cre o Nrp1,/,Foxp3Cre se clasificaron por citometría de flujo al 99,0% de pureza a partir de ratones de 6-8 semanas de edad, y se estimularon 48 horas con anti-CD3 unido a la placa, anti-CD28, 100 U/mL de rhIL-2, y perlas de látex cubiertas con isotipo o Sema4a-Ig. Las células se cosecharon, se lavaron tres veces con PBS y se lisaron en reactivo TRIzol (Life Technologies). La calidad se confirmó por espectrofotometría UV y por análisis en un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). El ARN total (100 ng) se procesó y se marcó en el Centro Hartwell para Biotecnología y Bioinformática según el protocolo Affymetrix 3’ IVT Express y se presentó en una matriz GeneChip 430 PM de alto rendimiento de ratón. El dato de señal se resumió en RMA, se visualizó, se comprobó en la calidad mediante análisis de componentes principales (PCA) (Partek Genomics Suite 6.6 San Luis MO, EE.UU.). Se aplicó la corrección del lote según se necesitó para corregir diferencias en experimentos completamente replicados analizados en distintas fechas. Para comparar las células Tconv a Tregs restantes y varianza desigual se aplicó la prueba t a cada conjunto de sondas y la relación log2 se calculó. Este mismo análisis se usó para comparar células Tconv a células Treg activas. Para comparar el efecto del tratamiento de Sema4a en células Treg de tipo salvaje al efecto del tratamiento sema en células deficientes en Nrp1 se aplicó una interacción ANOVA bidireccional de tratamiento y genotipo a cada conjunto de sondas y el valor q de Storey se encontró para corregir múltiples comparaciones. La media categórica de cada conjunto de sondas se encontró, se transformó a un valor Z, se agrupó jerárquicamente y se visualizó por mapa de calor en Spotfire Decision Site 9.1 (Tibco, Somerville MA, EE.UU.) (Figura 1A). El mapa de calor en la Figura 11B estaba compuesto de genes nombrados en la parte de arriba que tenían la FDR de interacción de valor p pasada al 10%, tenían una expresión de media mínima de 6 en una clase y una diferencia de relación logarítmica del valor absoluto mínimo de al menos 0,5. Los gráficos de volcán se generaron usando STATA/SE 11.1 (College Station TX, EE.UU.). Para todos los gráficos de volcán se eliminaron los genes sin símbolos o nombres oficiales. Es estos gráficos la puntuación se refiere al valor p transformado a -log en base 10. Para los genes del gráfico de volcán en interacción se aplicó una métrica para la distancia desde el origen para colorear según un código el gráfico |(valor/10+ |diferencia de relación logarítmica|)/2| >0,5. Las pruebas estadísticas y correcciones por comparación múltiple se realizaron usando Partek Genomics Suite 6.6 (San Luis, MO, EE.UU.). Las secuencias se recuperaron para los conjuntos de sondas que tenían al menos una diferencia de 3 veces entre las células Tconv y Treg activas y un valor p de 0,01 y estas secuencias se probaron después con software SignalP 3.0 para identificar los dominios transmembrana.

Resultados

Semaforina 4a es un ligando expresado en Tconv que estimula la actividad Treg

Los actuales inventores y colaboradores han sugerido previamente que el perfil transcripcional y funcional de Tregs estimuladas en presencia o ausencia de células T CD4+ convencionales (Tconv) co-cultivadas es marcadamente diferente1213. Las Tregs pueden solo suprimir Tconv a través de una membrana Transwell permeable cuando están en contacto directo con Tconv situadas en la cámara superior (denominada en la presente memoria como supresión Transwell), sugiriendo un mecanismo dependiente del contacto que mejora la función de Treg12. Los actuales inventores buscaron determinar las señales que inducen esta actividad de Treg distinta y el perfil transcripcional. Hipotetizaron que las Tregs no podían “auto-estimularse” sugiriendo que el ligando que media esta actividad puede expresarse mediante Tconv pero no por Tregs. De hecho, las Treg estimuladas solas o en co-cultivo con vida adicional o T regs Foxp3+ fijas o células B B220+ no podían mediar la supresión a través de una membrana T ranswell en un ensayo de supresión Transwell de Tconv estimuladas con perlas cubiertas con anti-CD3/anti-CD28 en el pocillo inferior cuando las células T reguladoras (Tregs) se estimulaban en el pocillo superior (Fig. 1A). En contraste, las Tregs co-cultivadas con células T CD4+ o CD8+ fijas podían potenciar la supresión Transwell, sugiriendo que el ligando se expresó en la superficie celular12. La expresión génica se comparó entre Treg activas y restantes y células Tconv CD4+ usando análisis Affymetrix de poblaciones Tconv y Treg clasificadas a partir de ratones Foxp3.GFP e incubadas juntas o de forma separada con APC radiado en presencia o ausencia de anticuerpo anti-CD3 (después de 48 horas, el ARN extraído de las células re-clasificadas en base a la expresión de CD4 y GFP se sometió al análisis Affymetrix). Esta lista fue curada para enfocarse en el gen que codifica las proteínas expresadas en la superficie celular que se expresaron predominantemente por Tconv. A partir de esta lista, los tres genes principales, Sema4a (semaforina-4a), Tgfbr3 (factor de crecimiento transformante, beta receptor III) e Itgb3 (integrina beta 3; CD61), se seleccionaron para el estudio adicional en base a estudios anteriores que implican sus papeles en la inmuno-regulación y confirmación de su expresión diferencial en células Tconv CD4+ frente a Tregs y células B B220+ por qPCR. Mientras Sema4a y Tgfbr3 se mejoraron también en células T CD8+, Itgb3 no lo hizo. Los inventores entonces buscaron identificar una línea celular que podría usarse para evaluar la capacidad de estas moléculas para potenciar la función de Treg. Se encontró que los fibroblastos 3T3 expresaban altas cantidades de Tgfbr3 e Itgb3 pero no podían mediar la estimulación de Treg. En contraste las células 3T3 no expresaban Sema4a. Tomados juntos, estos datos sugieren que Sema4a, que se ha mostrado que modula la actividad del axón y la regulación inmune14, justificaba una investigación adicional.

Se usaron cuatro enfoques para determinar si Sema4a era necesaria y suficiente para potenciar la función Treg.

Primero, se observó la inhibición dependiente de la dosis de la estimulación de Treg mediante Tconv en un ensayo de supresión Transwell con un mAb de bloqueo de Sema4a (clon 5E3, MBL International) (Fig. 1B). Segundo, el silenciamiento de ARNip de la expresión de Sema4a en células Tconv CD4+ y CD8+ limitó su capacidad para estimular la supresión de Treg. Esto se determinó (i) en un ensayo de supresión Transwell después de que Tconv CD4+ o CD8+ se transfectaron con un control o se transfectaron con ARNip desordenado o ARNip de Sema4a y (ii) después de que células T CD4+ y CD8+ enriquecidas usando separación magnética negativa y nucleofectadas con ARNip desordenado 200 pM (Controlip) o una agrupación de 3 ARNip de direccionamiento a Sema4a (Life Technologies núm. de catálogo 4390771, ARNip núm. s73547) (Sema4aip) se re-clasificaran y estimularan 16 horas después de la transfección con anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 horas seguido por extracción de ARN y realización de pPCR para ARNm de Sema4a (Fig. 1C).

Tercero, mientras las variantes con pérdida de Sema4a del hibridoma de células T 3A9 no lograron estimular la función de Treg en un ensayo Transwell, los clones de Sema4a+ o transfectantes de Sema4a de la variante con pérdida de Sema4a potenciaron la supresión de Treg (Fig. 4). Los transfectantes 3T3 de Sema4a (transducidos con un retrovirus que expresa un constructo de sobreexpresión de Sema4a), pero no las células de control con vector vacío también potenciaron la supresión Transwell de Treg.

Cuarto, una proteína de fusión Sema4a-Ig murina, pero no un control de isotipo IgG1, recubierta en las perlas fue suficiente para inducir una potente supresión Transwell en un grado equivalente a las células Tconv (Fig. 1D).

Además, un anticuerpo anti-Sema4a mostró inhibición dependiente de la dosis de la potenciación de Treg (Fig. 1E). Se evaluó entonces si otras células inmunes expresaban Sema4a. Mientras que las células T CD4+ y CD8+ presentaban baja pero demostrable expresión de Sema4a, las células dendríticas CD11c+ del nódulo linfático (DCs) y las células asesinas naturales DX5+ parecían expresar altos niveles de Sema4a (como se determinó en preparaciones de bazo/nódulo linfático periféricas teñidas con anti-Sema4a y analizadas por citometría de flujo). De forma interesante, las DCs CD11c+ del nódulo linfático podrían potenciar la supresión de Treg de manera dependiente de Sema4a (Fig. 1E).

Después se determinó si Sema4a era suficiente para potenciar la función de Treg. Los transfectantes 3T3 de Sema4a, pero no las células de control de vector vacío, podían potenciar la supresión Transwell de Treg. De forma importante, una proteína de fusión Sema4a-Ig murina, pero no un control de isotipo de IgG1, cubierta en perlas fue suficiente para inducir la supresión Transwell en un grado equivalente a las células Tconv (Fig. 1D).

De forma colectiva, estos datos sugieren que Sema4a es necesario y suficiente para potenciar la función Treg in vitro.

Nrp-1 es un receptor de Sema4a necesario para estimular la función y supervivencia de T reg

La neuropilina-1 (Nrp-1) es un co-receptor para una semaforina clase III, Sema3a, con papeles clave en el control de la guía axonal15. Nrp1 induce el colapso de cono de crecimiento del axón, evitando la infiltración en tejidos privilegiados y la supresión genética en ratones da por resultado la mortalidad embrionaria16. Se ha mostrado también que Nrp1 interactúa con el factor de crecimiento endotelial-vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGFp) y factor de crecimiento transformante beta (TGFp)17-18. Se ha mostrado que Nrp1 se expresa en alto grado en Tregs y es un marcador útil, especialmente en Treg “naturales” derivadas tímicamente (como se determina por análisis de citometría de flujo de la expresión de Foxp3 y neuropilina en células T CD4+ en ratones Foxp3Cre y Nrp1f/fFoxp3Cre)19-21. Aunque se ha implicado un papel para Nrp1 en las células T22, no se ha identificado un papel para Nrp1 en las Tregs.

Los actuales inventores postularon que Nrp1 puede ser el receptor para Sema4a que media la potenciación funcional de Treg. Primero, un mAb específico de Nrp1 podría bloquear la estimulación de Treg in vitro (Fig. 2A). La interacción directa entre Sema4a y Nrp1 se verificó en un ensayo ELISA con Nrp1 recombinante, purificado y Sema4a (Fig. 2H). De forma importante, se observó la inhibición dependiente de la dosis con mAbs de Nrp1 y Sema4a que alteran la interacción Nrp1 :Sema, pero no la Nrp1 :VEGF (Fig. 2H). Segundo, las Tregs deficientes en Nrp1, generadas cruzando ratones Nrp1f/f y Foxp3Cre-YFP (en adelante denominados como Nrp1f/fFoxp3Cre)17-23, carecían de expresión de Nrp1 en la superficie celular y no lograron mediar la supresión Transwell después del co­ cultivo con células Tconv o perlas cubiertas con Sema4a-Ig (Fig. 2B). Sin embargo, las Tregs deficientes en Nrp1 retuvieron la capacidad de mediar la supresión dependiente del contacto (como se determina por el ensayo de supresión clásico en que se cocultivaron Tregs tipo salvaje o deficientes en neuropilina a diferentes concentraciones en presencia de perlas cubiertas con anti-CD3/anti-CD28). De forma importante, la interacción directa entre Sema4a y Nrp1 se verificó por tinción citométrica de flujo de Tregs Foxp3Cre, pero no Nrp1f/fFoxp3Cre, con Sema4a-Ig marcado con fluorocromo y en un ensayo ELISA con Nrp1 recombinante purificado y Sema4a, que parecía equivalente a su ligando conocido Sema3a. Mientras estos datos demuestran claramente que Sema4a puede unirse a Nrp1 y estimular la función de Treg, es posible que otros miembros de la familia de semaforina pudieran también servir para esta función. Segundo, un mAb específico de Nrp1 bloqueó la supresión Transwell de Treg in vitro (Fig. 2I).

Los actuales inventores y colaboradores han mostrado anteriormente que las Tregs median la supresión Transwell por medio de IL-10 e IL-35 pero no TGFp12. En la presente memoria, dos enfoques experimentales se usaron para determinar si los mecanismos usados por las Tregs estimuladas por células Tconv y Sema4a para suprimir eran sinónimos. Primero, las Tregs estimuladas en presencia de perlas cubiertas con Sema4a-Ig en la cámara superior de una placa Transwell eran igualmente capaces de suprimir células Tconv tipo salvaje (WT) y dnTGFpRII, que son insensibles a TGFp24, en la cámara inferior sugiriendo que TGFp no es necesario (Fig. 2C). En contraste, las Tregs Il10'/' y Ebi3~/~, que son incapaces de secretar IL-10 e IL-35 respectivamente, fueron incapaces de suprimir las Tconv WT a través de un Transwell (Fig. 2C). Segundo, los mAbs de neutralización de IL-10 e IL-35 evitaron la supresión Transwell mediada por Tregs WT (Fig. 2D). Aunque la ligadura Sema4a:Nrp1 pareció mejorar la función de Treg, los inventores razonaron que podría también mejorar la supervivencia y/o estabilidad de Treg in vitro. De hecho, la estimulación de Sema4a redujo la cantidad de muerte celular como se determinó por tinción con Anexina V y 7-AAD de una manera dependiente de Nrp1 (Fig. 2E). El análisis qPCR posterior de Tregs tipo salvaje y deficientes en Nrp1 cultivadas en presencia de isotipo o Sema4a-Ig durante 72 h con anti-CD3, anti-CD28 e IL-2 y la tinción de citoquina intracelular para IL-10 de células estimuladas en presencia de isotipo o Sema4a-Ig durante 72 h con anti-CD3, anti-CD28 e IL-2 (Brefeldina A añadida durante las últimas 8 horas de estimulación) reveló que los niveles de ARNm de IL-10 no se aumentaron por la ligadura con Sema4a-Nrp1 y el porcentaje de Tregs IL-10+ por ICS no se aumentó. Aun así, como se determina por IL-10 ELISA e IL-35 IP/IB a partir de los sobrenadantes de células, tanto IL-10 como IL-35 se elevaron en cultivos cuando las Tregs tipo salvaje pero no las deficientes en Nrp1 se estimularon con anti-CD3, anti-CD28 y Sema4a-Ig. Tomados juntos, estos datos sugieren que la ligadura de Nrp1 por Sema4a potencia la supresión dependiente de IL-10/IL-35 y mejora la supervivencia y longevidad de Treg in vitro.

Aunque se ha sugerido que NRP1 no se expresa en Tregs humanas25, este no se ha evaluado de forma rigurosa en Tregs activas o funcionalmente supresoras. Como las Tregs humanas pueden necesitar activación para obtener la máxima función supresora1226, los actuales inventores razonaron que NRP1 puede expresarse solo en Tregs funcionalmente supresoras. De acuerdo con estudios anteriores25, las células Tregs y Tconv de la sangre del cordón umbilical restantes no expresaron NRP1 (Fig. 2F). Aunque la activación con anti-CD3, anti-CD28 e IL-2 indujo la expresión de NRP1 temprana mediante ambas poblaciones de células T, las Tregs mostraron una expresión estable a largo plazo de NRP1. Se evaluó entonces si un eje NRP1-SEMA4A podría potenciar la función de Treg humanas. Como se muestra anteriormente26, Tconv puede potenciar la supresión de Treg humanas a través de una membrana Transwell permeable (Fig. 2G). De forma importante, esta actividad supresora se bloqueó mediante mAbs anti-NRP1, mientras que SEMA4A humano inmovilizado fue suficiente para potenciar la función de Treg humanas en ausencia de Tconv (Fig. 2G). Estos datos apoyan la posibilidad de que la misma ruta esté activa en Tregs murinas y humanas.

Las Tregs deficientes en Nrp1 mantienen la homeostasis inmune

Dado que la alteración en el eje Nrp1:Sema4a disminuye la actividad de Treg in vitro, los actuales inventores propusieron que la función de Treg podría estar comprometida in vivo, particularmente en sitios altamente inflamatorios. Los ratones deficientes en Foxp3 desarrollan una fuerte condición autoinmune, reminiscente de la enfermedad humana IPEX. Esta se caracteriza por infiltración inmune masiva e inflamación tisular que es letal en 3­ 6 semanas227. Por consiguiente la alteración de la función de Treg in vivo podría llevar al desarrollo de una enfermedad inflamatoria. Los ratones Nrp1f/fFoxp3Cre y sus controles de Foxp3Cre de crías normales emparejadas por edad y sexo se observaron durante 10 meses y se realizó un análisis histológico detallado de todos los órganos que son objetivos típicamente en ratones deficientes en Treg. Un análisis ciego demostró que los ratones Nrp1f/fFoxp3Cre estaban dentro de los límites normales en todos los respectos incluyendo la apariencia exterior, y los análisis histológicos de piel, pulmón, hígado, intestinos, páncreas, riñón, glándulas salivales y bazo. No se observaron alteraciones en el tamaño, porcentaje o fenotipo de subpoblaciones de células T, como se determina por análisis citométrico de flujo. Por consiguiente, no pudo detectarse ninguna alteración en la homeostasis inmune, desarrollo de enfermedad inflamatoria o autoinmunidad en ratones maduros con una supresión restringida de Nrp1 en Tregs.

El fenotipo autoinmune de ratones deficientes en Foxp3 puede retrasarse sustancialmente mediante la transferencia adoptiva de Tregs en ratones de 2 días de edad, que puede persistir durante varios meses antes de que los ratones sucumban a la enfermedad227. El comienzo de la enfermedad, prevalencia, puntuaciones clínicas e histológicas (del hígado, pulmón y pabellón de la oreja) fueron todos idénticos entre receptores de Treg Foxp3Cre y Nrp1f/ffoxp3Cre (Fig. 3). De forma colectiva, estos datos indican que la expresión de Nrp1 en Tregs es prescindible para el mantenimiento de la homeostasis inmune y la prevención de enfermedad inflamatoria y autoinmune que se desarrollaría normalmente en ausencia de Tregs.

Las Tregs deficientes en Nrp1 fallan en medios inflamatorios

Las Tregs representan una barrera principal para la inmunidad anti-tumoral efectiva en muchos cánceres2829. El agotamiento de Treg, por medio del tratamiento anti-CD25 o el uso de ratones Foxp3DTR-gfp (en que las Treg Foxp3+ expresan el receptor de toxina de difteria, permitiendo su agotamiento condicional por administración de DT), se ha mostrado que mejora en gran medida la inmunidad anti-tumoral3031. Sin embargo, el agotamiento de Tregs también da por resultado la masiva linfoproliferación y enfermedad autoinmune similar a la vista en ratones deficientes en Foxp332. Como los tumores representan un entorno altamente inflamatorio, se evaluó la capacidad de las Tregs deficientes en Nrp1 para mediar en la tolerancia inducida por el tumor y evitar la inmunidad anti-tumoral efectiva. Se usaron tres modelos de tumor trasplantable: MC38 (una línea de carcinoma de colon inmunogénico), EL4 (un timoma moderadamente inmunogénico) y B16 (un melanoma pobremente inmunogénico)3334. Aunque la pérdida completa de Treg por el tratamiento de DT de los ratones Foxp3DTR-gfp inoculados con el tumor dio por resultado el aclaramiento del tumor, los ratones sucumbieron a la mortalidad mediada autoinmune alrededor de tres semanas después del tratamiento de DT (Fig. 4A-C).

El crecimiento tumoral en ratones Nrp1f/fFoxp3Cre y sus controles de crías normales Foxp3Cre se evaluó después. Se observó crecimiento tumoral MC38 significativamente retrasado en ratones Nrp1f/fFoxp3Cre, a pesar de la ausencia de cualquier remisión completa (CR) (Fig. 4A). En contraste, se observó CR en ~40% de ratones Nrp1f/fFoxp3Cre inoculados con EL4 con el crecimiento tumoral reducido en gran medida en casi todos los ratones (Fig. 4B). Sorprendentemente, se observó CR en dos tercios de los ratones Nrp1f/fFoxp3Cre inoculados con B16, con crecimiento tumoral reducido en los ratones restantes (Fig. 4C). Usando el modelo B16 metastático de pulmón, los animales Foxp3Cre desarrollaron un aumento dependiente de la dosis en el número de metástasis mientras que los ratones Nrp1f/fFoxp3Cre mostraron un aclaramiento casi completo, incluso a altas dosis de tumor (Fig. 4D). El análisis de linfocitos de infiltración en el tumor B16 (TILs) en la piel mostró que mientras que ambas poblaciones de Treg podían infiltrarse en los tumores, las Treg deficientes en Nrp1 tenían una capacidad limitada para suprimir la proliferación de células T CD8+ efectoras y la producción de citoquinas, particularmente en el subconjunto IFNY+TNFa+IL-2+ altamente tumoricida (Fig. 4E)35. Por consiguiente, el programa conducido por la señalización de Nrp1 en Tregs es importante de forma crítica para suprimir la inmunidad anti-tumoral.

Los actuales inventores también buscaron determinar que células expresaban Sema4a en el microentorno del tumor. Sorprendentemente, DCs convencionales (cDCs), células Tconv CD8+, células NK, y a un menor grado células Tconv CD4+ reducen la expresión superficial Sema4a en el TIL en comparación con los nódulos linfáticos drenantes y no drenantes (Fig. 4H). En su lugar, la mayoría de células que infiltran el tumor Sema4ahi (~57%) fueron células dendríticas plasmacitoides PDCA1+B220+CD11c+ (pDCs) (Fig. 4H). Aunque sorprendente, este descubrimiento era consecuente con la bibliografía anterior que sugería que las pDCs pueden ser tolerogénicas, y el agotamiento de pDCs dio por resultado inmunidad antitumoral aumentada (Demoulin et al., J Leukoc Biol 93, 343-352 (2013); Faget et al., Cancer Res 72, 6130-6141 (2012); Sawant et al., J Immunol 189, 4258-4265, (2012)). De hecho, en los ensayos de supresión Transwell que usan Treg cocultivadas con pDCs clasificadas a partir de preparaciones de bazo y nódulo linfático, activadas toda la noche con oligonucleótidos CpG, y fijadas brevemente en PFA al 1% seguido por lavado exhaustivo, las pDCs podían potenciar la función de Treg en los ensayos de supresión Transwell de una manera dependiente de Sema4a.

Estudios anteriores han mostrado que los dominios Nrp1 que se unen a semaforinas son áreas distintas de las que se unen a VEGF40. Para proporcionar soporte adicional para un eje Sema4a-Nrp1 que media la tolerancia del tumor inducida por Treg, los actuales inventores utilizaron mAbs específicos de Sema4a y Nrp1 que alteran la interacción Nrp1-Sema4a pero no la de Nrp1-VEGF. Específicamente, los ensayos de unión basados en ELISA se realizaron usando placas cubiertas con 500 ng/mL de mNrp1 recombinante incubado con o (i) anti-Nrp1 o IgG 1 de ratón en presencia de 50 ng/mL de VEGF165 (detectado usando biotina anti-VEGF) o (ii) Sema4a-Ig o IgG 1 de ratón, en presencia de controles de isotipo, anti-Nrp1, o anti-Sema4a (Sema4a-Ig o IgG 1 de ratón se detectaron usando un anticuerpo anti-isotipo). Los ratones C57/BL6 de tipo salvaje inoculados con melanoma B16 y que se les dan inyecciones dos veces a la semana de mAbs de bloqueo de Nrp1 o Sema4a (100 pg; R&D Systems, clon 757129) mostraron un crecimiento tumoral significativamente reducido en comparación con aquellos a los que se daba control de isotipo (Fig. 4I). De forma importante, el efecto de los mAbs de bloqueo de Nrp1 y Sema4a fue esencialmente idéntico. Además, la utilización de Sema4a-Ig como un antagonista soluble in vivo también dio por resultado un crecimiento tumoral significativamente reducido (Fig. 4J), asociado con aumentos similares en la infiltración tumoral de células T CD8+. Para determinar si el bloqueo de Nrp1 podría tener utilidad terapéutica, se trataron ratones C57/BL6 que portan un tumor B16 con dosis mayores (400 pg de dosis inicial, 200 pg dos veces a la semana) de mAb de bloqueo de Nrp1. Sorprendentemente, el crecimiento tumoral se redujo con este tratamiento de modalidad sencilla, con C^r en algunos ratones (Fig. 4F).

La función de Treg dependiente de Nrp1 podría ser también importante en términos generales en la supresión de respuestas en otros entornos establecidos, altamente inflamatorios. La transferencia adoptiva de células Tconv CD4+CD45RBhi no tratadas anteriormente en ratones Rag1-/- induce colitis altamente inflamatoria, similar a la enfermedad de intestino inflamatorio humano (IBD), que puede rescatarse mediante posterior transferencia de Tregs purificadas1336. De hecho, la inyección de células Tconv en ratones Rag1-/- dio por resultado una significativa pérdida de peso y patología inmune, que podría rescatarse por Treg Foxp3Cre (Fig. 4G). Sin embargo, las Tregs deficientes en Nrp1 no lograron mejorar la colitis, dando por resultado una significativa pérdida de peso y patología inmune. Por consiguiente, la función de Treg mediada por Nrp1 se necesita para curar una enfermedad inflamatoria establecida, tal como la colitis.

La ligadura de Nrp1 impide que Akt-mTOR por medio de PTEN inicie la estabilización de Treg mediada por Foxo

Aunque la señalización corriente abajo de Nrp1 en líneas tumorales, neuronas y endotelio se ha estudiado después de la ligadura por VEGF o semaforinas de clase III15-17, la ruta de señalización de Nrp1 inducida por unas semaforinas de clase IV en Tregs ha estado desconocida. De forma interesante, se ha mostrado que Nrp1 modula la actividad de Akt (proteína quinasa B) en algunos sistemas3738. Como se ha mostrado que la actividad de Akt-mTOR es perjudicial para la función de Treg3940, los actuales inventores hipotetizaron que la ligadura de Nrp1 podría inhibir la activación de Akt. Las Tregs Foxp3Cre y Nrp1f/fFoxp3Cre se estimularon en presencia de perlas cubiertas con Sema4a-Ig o IgG y la activación de Akt-mTOR se evaluó por citometría de flujo. La ligadura de Nrp1 limitó la fosforilación de Akt S473 además de la fosforilación de S6K1 T389 en Tregs, que se necesitan para su activación (Fig. 5A). La fosforilación de Akt se examinó también en la sinapsis inmunológica (IS) usando microscopía fluorescente de reflexión interna total (TIRF). Las Tregs Foxp3Cre y Nrp1f/fFoxp3Cre se estimularon con una bicapa lipídica que contenía mAb anti-TCR y o Sema4a-Ig o un control de isotipo de IgG. Un fuerte reclutamiento de Nrp1 a la IS se observó cuando Sema4a estaba presente que coincidió con una pérdida de actividad de Akt dependiente de Nrp1 a pesar de la tinción de fosfotirosina global equivalente en la IS (Fig. 5B y 6A-B).

Para determinar si la inactivación de Akt fue suficiente para la potenciación de Treg, las Tregs se transdujeron con retrovirus que codifica las Akt de tipo salvaje (WT) o sin actividad quinasa dominante negativa (DN). Las Tregs transducidas con Akt DN, pero no WT, podían mediar la supresión Transwell en un grado comparable con el inducido por Sema4a-Ig, sugiriendo que la actividad Akt-mTOR reprimida corriente abajo de Nrp1 es la ruta dominante que conduce la potenciación de Treg.

Nrp1 tiene un pequeño dominio citoplasmático con un motivo de unión a dominio PDZ C-terminal (secuencia de aminoácidos: SEA) (Pellet-Many et al., Biochem J 411, 211-226 (2008)). Los actuales inventores hipotetizaron que este dominio se necesita para la pérdida de pAkt dependiente de Sema4a en la IS. Las Tregs deficientes en neuropilina se transdujeron con retrovirus que codificaba Nrp1 WT o un mutante de Nrp1 deficiente en el motivo de unión al dominio PDZ. De forma interesante, la pérdida del motivo de unión al dominio PDZ abolió completamente la capacidad de Nrp1 para inhibir la activación de Akt en la IS después de la ligadura de Sema4a (Fig.), sugiriendo que este motivo está reclutando un inhibidor molecular de la señalización de Akt.

Se ha mostrado que el homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN) inhibe la activación de Akt41. Mientras PTEN parece ser prescindible para la supresión de Treg dependiente de contacto42, los actuales inventores hipotetizaron que PTEN puede contribuir a la inactivación de Akt mediada por Nrp1. La asociación de PTEN constitutiva, de bajo nivel, con Nrp1 se observó en Tregs en reposo y activas, que se mejoró sustancialmente por la ligadura de Sema4a (Fig. 5C). Además, las Treg deficientes en PTEN fueron incapaces de mediar la supresión Transwell inducida por Tconv y Sema4a-Ig (Fig. 5D). Por último, las Tregs deficientes en PTEN no lograron inhibir la activación de Akt en la IS a pesar del fuerte reclutamiento de Nrp1 por Sema4a (como se determinó por microscopía TIRF del reclutamiento en IS de neuropilina y activación de Akt en Treg Foxp3Cre o Ptenf/fFoxp3Cre purificadas por citometría de flujo y después estimuladas durante 20 minutos en una bicapa lipídica que contenía anti-TCR y o IgG o Sema4a-Ig; véase la Fig. 6C-D). Estos datos sugieren que PTEN se necesita para la represión mediada por Nrp1 de la activación de Akt en la IS y la potenciación funcional de Treg.

La actividad Akt puede obstaculizar el programa supresor de Treg en parte regulando la localización nuclear de los miembros de la familia del factor de transcripción Foxo, ya que la fosforilación mediada por Akt promueve su exclusión nuclear por medio de unión 14-3-343-45. Foxos juega un papel clave en el control del desarrollo y función de Treg regulando la expresión de Foxp3, promoviendo una cohorte de genes asociados a Treg y limitando la expresión de los factores de transcripción específicos del linaje de células T y las moléculas efectoras. Como se esperaba, las Treg no estimuladas muestran tinción Foxo nuclear, mientras que las Treg activas excluyen a Foxo del núcleo. En contraste, la inclusión de Sema4a-Ig inhibió la exclusión nuclear Foxo.

Para determinar el programa transcripcional que promueve la potenciación de Treg mediada por Nrp1, se realizó el perfil de expresión génica en Tregs Foxp3Cre y Nrp1f/fFoxp3Cre estimuladas en presencia de perlas cubiertas de Sema4a-Ig o IgG1 in vitro. Específicamente, las células T CD45RlC) Foxp3 (YFP)+ CD4+ Foxp3Cre y Nrp1f/fFoxp3Cre se estimularon durante 48 horas con anti-CD3, anti-CD28, 100 U/mL de rhIL-2, e IgG1 inmovilizado o Sema4a-Ig. El ARN extraído de estas células se sometió a análisis de perfil génico Affymetrix. Los datos de la micromatriz se sometieron entonces al análisis de Análisis de enriquecimiento del conjunto génico (GSEA) usando MSigDB que proporciona el valor de enriquecimiento (ES), valor de enriquecimiento normalizado (NES) y la Tasa de descubrimientos falsos (FDR) para conjuntos génicos dados. Además, se realizó el análisis DAVID de ontología génica para genes afectados por Sema4a en Treg Foxp3Cre pero no en Treg Nrp1f/fFoxp3Cre.

En general, los cambios transcripcionales asociados con la ligadura de Nrp1 en Tregs son coherentes con la estabilidad fenotípica mejorada. El Análisis de enriquecimiento del conjunto génico (GSEA) y el análisis de Ontología Génica DAVID revelaron varias rutas aumentadas por la ligadura de Sema4a, incluyendo la homeostasis de células T y señalización de IL-7, genes disminuidos en IL-2, genes reactivos con CD28, genes relacionados con la diferenciación de las células T, y varios conjuntos de genes asociados con fenotipos de enfermedad (Tablas 1 y 3). El análisis estadístico de los genes más aumentados reveló aquellos asociados con la homeostasis, especialmente diana de Foxo Klf246, además de varios factores de transcripción, moléculas de la superficie celular, y el antiapoptótico Bcl2 (Tabla 3). Además, comparando perfiles de expresión génica de Tconv y Tregs recién aisladas de ratones Foxp3Cre, se obtuvo una firma de Treg controlada internamente que era coherente con las presentadas anteriormente5. Varios genes de firma de Treg estaban aumentados, incluyendo Helios (Ikzf2), Gpr83, Nt5e y Socs2. Un subconjunto se confirmó por qPCR (Ikzf2, Socs2, Bcl2, Nt5e, Klf2, Gpr83) y citometría de flujo (KLF2, Helios, Bcl2, CD62L, CD127, CD73).

De forma interesante, la señalización de Nrp1 induce la disminución de varios factores de transcripción específicos del linaje de células T (Irf4, Rorg, Eomes) y sus dianas (Il4, Il5, Il17a) (Tabla 3). Además, algunos reguladores de señalización celular (Nedd4, Rgs16, Serpine2) y el inhibidor de control Lag3 estaban también disminuidos. La disminución por regulación de Irf4, Irf8, Rorc y Rgs16 se confirmó por qPCR. En general, el perfil transcripcional inducido por la señalización de Nrp1 puede promover la estabilidad, quiescencia y supervivencia de Treg, mientras que inhibe programas de conducirían o promoverían la diferenciación terminal de Treg. Es también notable que parece haber un considerable solapamiento entre el programa transcripcional mediado por Nrp1 y las Foxos45.

Las proteínas Foxo pueden promover la transcripción de varios genes, que estaban también aumentados por la estimulación de Sema4a (Tabla ³ )4547. Un gen de particular interés es Klf2, que estaba aumentado en respuesta a Nrp1 y promueve la expresión de genes asociados con la supervivencia, longevidad y memoria de células T, tal como CD62L (Sell) y CD127/IL-7Ra (Il7ra)47. De hecho, la estimulación de Treg en presencia de Sema4a limitó su disminución por regulación inducida por activación sugiriendo que el eje Foxo/KLF2 está activo en Treg estimulada por medio de Nrp1.

La señalización de Nrp1 también induce la disminución por regulación de varios conjuntos génicos definidos por GSEA, que incluyen dianas IRF4, tránscritos de citoquina (Il4, Il5, Il17a), genes disminuidos Foxp3 y genes aumentados IL-2, entre otros (Tabla 2). Los genes diana validados por qPCR o análisis de proteína incluyen varios factores de transcripción específicos del linaje de células T (Irf4, Rorc, Eomes), reguladores de la señalización celular (Rgs16) y el receptor inhibidor Lag3. En general, el perfil transcripcional inducido por la señalización de Nrp1 puede promover la estabilidad, quiescencia y supervivencia de Treg, mientras que inhiben programas que conducirían o promoverían la diferenciación terminal de Treg y la apoptosis.

Para determinar si la señalización y los sucesos transcripcionales observados in vitro eran fisiológicamente relevantes, se evaluaron las observaciones clave en Tregs que se infiltran en el tumor. Sin embargo, debería notarse que solo un subconjunto de ratones Nrp1f/fFoxp3Cre desarrollan tumores después de la inyección de B16 y por consiguiente los tumores muestreados representarían aquellos donde la consecuencia de pérdida de Nrp1 en Tregs fue menos fundamental. Primero, los nódulos linfáticos no drenantes y TIL se cosecharon de ratones Foxp3Cre y Nrp1f/fFoxp3Cre que portaban tumor y se ensayaron para la activación de Akt ex vivo. Mientras los LN no drenantes mostraron una activación de Akt relativamente alta en Treg, las Treg Foxp3Cre que se infiltran en el tumor presentaron menor activación de Akt (Fig. 7A). De forma importante, la modulación de la actividad de Akt en el microentorno del tumor se perdió en las Tregs Nrp1f/fFoxp3Cre que soportaban la modulación conducida por Nrp1 de las Tregs in vivo. Segundo, las dianas de proteína de la señalización de Nrp1 en TIL se examinaron, se compararon con otros compartimientos linfoides, y se encontró que Helios estaba aumentado en las Tregs intratumorales, mientras que IRF4 y RORYt estaban disminuidos in vivo de una manera dependiente de Nrp1 (Fig. 7B-C). En tercer lugar, este programa conducido por Nrp1 dio por resultado la proliferación de Treg intra-tumorales aumentada y apoptosis reducida, como se evaluó por la expresión de Ki67 y la incorporación de BrdU (Fig. 7E), y la tinción de caspasa 3 escindida mejorada (Fig. 7D-E). La supervivencia de Treg dependiente de Nrp1 mejorada observada correlacionaba con la expresión mejorada del factor anti-apoptótico Bcl2 (Fig. 7F). Finalmente, se examinó el impacto de estos cambios en los mecanismos supresores de Treg intratumoral. Aunque los niveles de ARNm de IL-10 no se alteraron, hubo una mejora dependiente de Nrp1 de las Treg IL-10+ intratumorales (Fig. 7G). Además, hubo también un mantenimiento dependiente de Nrp1 de la molécula CD73 productora de adenosina extracelular y el inhibidor de control LAG-3 (Fig. 7H). Por consiguiente, la señalización de Nrp1 proporciona un interruptor crítico que impone la estabilidad de Treg en los entornos inflamatorios.

Discusión

Los datos proporcionados en la presente memoria demuestran que la potenciación dependiente del contacto celular de la función de Treg está mediada por medio de la ligadura de Nrp1 mediada por Sema4a por medio de un eje PTEN:Akt:Foxo (Fig. 8). Particularmente, Nrp1 parece ser uno de un número limitado de receptores de la superficie celular (p.ej., PD-148 y CTLA-449) que se ha sugerido que limitan la actividad de Akt en las células T. Mientras Nrp1 bajo ciertas circunstancias pueden modular o incluso activar la señalización de Akt (Banerjee et al., Biochemistry 47, 3345-3351 (2008); Cao et al., Cancer Res 68, 8667-8672 (2008); Fukasawa et al., Cancer Biol Ther 6, 1173-1180 (2007); Kim et al., J Immunol 177, 5727-5735 (2006)), el contexto específico en que Nrp1 funciona en las Tregs (p.ej., reclutamiento a la IS, tipo celular único, ligando soluble frente a transmembrana) puede proporcionar un entorno distinto que facilita el reclutamiento de PTEN y la pérdida de actividad Akt. Esta ruta mejora la función de Treg indirectamente imponiendo la estabilidad y promoviendo la supervivencia, que es más evidente en sitios inflamatorios tales como en tumores y mucosa intestinal colítica. La cuestión de la estabilidad/plasticidad de Treg ha sido bastante polémica, y los estímulos extrínsecos a la célula y mecanismos que mantienen la estabilidad de Treg permanecen difíciles de conseguir8-11. Dado que los miembros de la familia Foxo mejoran la función de Foxp3 y promueven la homeostasis y función de Treg45, es digno de atención que la señalización de Nrp1 contrarresta el impacto negativo de Akt en la localización nuclear de Foxo. De hecho, hay un solapamiento sustancial entre los perfiles transcripcionales inducidos por Foxo y la señalización de Nrp145. También es interesante que la señalización de Nrp1 modula la expresión de varios KLFs (Klf2, Klf1), que se conocen por estar implicados en la quiescencia celular46. Se ha mostrado también recientemente que un quinteto de factor de transcripción “cierra” la firma transcripcional de Treg4. De forma interesante, algunos de estos factores de transcripción se modulan por señalización Nrp1 (p.ej. Ikzf2, Irf4, Gatal), sugiriendo que la ligadura de Nrp1 mediada por Sema4a puede constituir un regulador extrínseco a la célula de este programa. De forma colectiva, las observaciones proporcionadas en la presente memoria sugieren que el eje Sema4a:Nrp1 se necesita para mantener la estabilidad de Treg en sitios inflamatorios. Además, es posible que la ruta de Nrp1 :Sema4a pueda perturbarse bajo ciertas circunstancias patológicas o genéticas que podrían también proporcionar una base para las percepciones aparentemente contradictorias de la estabilidad de Treg frente a plasticidad en una variedad de estados normales y enfermos. Dado que se ha mostrado que las células T CD4+ y CD8+ de memoria expresan Npr1, es posible que la activación de AktmTOR impedida pueda facilitar el mantenimiento del fenotipo de célula T de memoria (Powell et al., Annu Rev Immunol 30, 39-68 (2012)).

Como las Tregs representan una barrera principal para la inmunidad anti-tumoral efectiva en muchos cánceres2829, una cuestión actual de importancia clínica es si es posible limitar la función de Treg en los tumores mientras se previenen los sucesos adversos inflamatorios o autoinmunes. Es también intrigante que una fuente dominante de Sema4a en los estudios tumorales descritos en la presente memoria sea el DC plasmacitoide. La presente identificación del eje Nrp1:Sema4a como una ruta fundamental necesaria para la estabilidad de Treg en sitios inflamatorios tumorales pero no para el mantenimiento homeostático periférico sugiere, por primera vez, que el bloqueo de Sema4a:Nrp1 por medio de anticuerpos o antagonistas solubles podría ser una estrategia terapéutica viable para limitar la tolerancia inducida por el tumor sin provocar la autoinmunidad.

Referencias

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo que inhibe la interacción entre (i) una semaforina transmembrana clase IV expresada en una célula y (ii) neuropolina-1 en una célula T reguladora, para usar en un método de tratamiento de cáncer en un sujeto.

2. El anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno para usar según la reivindicación 1, en el que la homeostasis inmune se mantiene en el sujeto.

3. El anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el sujeto es humano.

4. El anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según cualquier reivindicación precedente, en el que la semaforina transmembrana clase IV es Sema4a.

5. El anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno para usar según cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno no afecta a la interacción neuropilina-1 :VEGF en las Tregs del sujeto.

6. El anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno para usar según cualquier reivindicación precedente, en el que la semaforina transmembrana clase IV se expresa por una célula T convencional, una célula dendrítica convencional o una célula dendrítica plasmacitoide.

7. Un anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo que inhibe la interacción entre (i) una semaforina transmembrana clase IV expresada en una célula y (ii) neuropilina-1 en una célula T reguladora, para usar en un método de mejora de la eficacia de una vacuna para tratar o prevenir el cáncer en un sujeto, opcionalmente en el que el anticuerpo de anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno no afecta a la interacción de neuropilina-1 :VEGF en las Tregs del sujeto.

8. Un anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según la reivindicación 7, en el que la eficacia de la vacuna en un sujeto se mejora mientras se mantiene la homeostasis inmune.

9. El anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno para usar según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el anticuerpo o fragmento se administra al sujeto antes de que se administre la vacuna al sujeto, o se administra al sujeto junto con la vacuna.

10. El anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo humanizado.

11. El anticuerpo anti-neuropilina-1 o fragmento de unión al antígeno del mismo para usar según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la semaforina transmembrana clase IV es Sema4a.