ES2774972T3 - Tratamiento de enfermedades oculares - Google Patents

Abstract

Un agente de unión a HPTPβ-ECD para su uso en la prevención de una enfermedad en el ojo de un sujeto, en el que el agente de unión a HPTPβ-ECD es un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC No. PTA-7580 o una forma humanizada del mismo, en el que la enfermedad se previene mediante la reducción de la neovascularización y la enfermedad se selecciona entre retinopatía proliferativa y degeneración macular relacionada con la edad.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de enfermedades oculares

Campo de la invención

Métodos para tratar enfermedades o afecciones oculares caracterizadas por neovascularizaciones tales como neovascularizaciones oculares, degeneraciones maculares relacionada con la edad, neovascularizaciones coroideas y retinopatías diabéticas.

El ojo comprende varias capas vasculares estructural y funcionalmente distintas, que suministran componentes oculares críticos para el mantenimiento de la visión. Estas abarcan a las vasculaturas retiniana y coroidea, que irrigan las porciones interna y externa de la retina, respectivamente, y la vasculatura limbal ubicada en la periferia de la córnea. Las lesiones y enfermedades que deterioran la estructura o función normal de estas capas vasculares se encuentran entre las principales causas de la discapacidad visual y la ceguera. Por ejemplo, la retinopatía diabética es la enfermedad más común que afecta la vasculatura retiniana, y es la principal causa de pérdida de visión entre la población en edad laboral en los Estados Unidos. La vascularización de la córnea secundaria frente a una lesión o enfermedad es otra categoría de enfermedad vascular ocular que puede conducir a un deterioro grave de la visión. La “degeneración macular” es un término médico general que se aplica a cualquiera de diversos síndromes patológicos que implican una pérdida o deterioro gradual de la vista debido a la degeneración celular y tisular de la región macular amarilla en el centro de la retina. La degeneración macular a menudo se caracteriza por alguna de los dos tipos, no exudativa (forma seca) o exudativa (forma húmeda). Aunque ambos tipos son bilaterales y progresivos, cada tipo puede reflejar diferentes procesos patológicos. La forma húmeda de la degeneración macular relacionada con la edad (AMD, por sus siglas en inglés) es la forma más común de neovascularización coroidea y una de las principales causas de la ceguera en los ancianos. La AMD afecta a millones de estadounidenses mayores de 60 años y es la principal causa de la nueva ceguera entre los ancianos.

La membrana neovascular coroidea (CNVM) es un problema relacionado con una amplia variedad de enfermedades de la retina, pero está más comúnmente relacionado con la degeneración macular relacionada con la edad. Con la CNVM, los vasos sanguíneos anormales derivados de la coroides (la capa de tejido rica en vasos sanguíneos justo debajo de la retina) crecen a través de las capas retinianas. Estos nuevos vasos son muy frágiles y se rompen fácilmente, haciendo que la sangre y los líquidos se acumulen dentro de las capas de la retina.

La diabetes (diabetes mellitus) es una enfermedad metabólica causada por la incapacidad del páncreas para producir insulina o usar la insulina que se produce. Los tipos más comunes de la diabetes son la diabetes tipo 1 (a menudo denominada diabetes mellitus de inicio juvenil) y la diabetes tipo 2 (a menudo denominada diabetes mellitus de inicio en adultos). La diabetes tipo 1 es el resultado de la incapacidad del cuerpo para producir insulina debido a la pérdida de células productoras de insulina, y actualmente requiere que el paciente se inyecte a sí mismo la insulina. La diabetes tipo 2 generalmente es el resultado de la resistencia a la insulina, una condición en la cual las células no usan la insulina adecuadamente. La diabetes tipo 2 también puede tener un componente de deficiencia de insulina.

La diabetes es directamente responsable de una gran cantidad de afecciones, incluidas algunas afecciones o enfermedades oculares, como la retinopatía diabética (DR) y el edema macular diabético (EMD), que son las principales causas de la pérdida de visión y la ceguera en la mayoría de los países desarrollados. El creciente número de personas con diabetes en todo el mundo sugiere que DR y DME continuarán contribuyendo de manera importante a la pérdida de visión y al deterioro funcional asociado en los años venideros.

La retinopatía diabética es una complicación de la diabetes que es consecuencia del daño a los vasos sanguíneos del tejido sensible a la luz en la parte posterior del ojo (retina). Al principio, la retinopatía diabética puede no causar síntomas o solo problemas leves de visión. Eventualmente, sin embargo, la retinopatía diabética puede provocar ceguera. La retinopatía diabética puede desarrollarse en cualquier persona que tenga diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2.

En sus etapas más tempranas, en la retinopatía no proliferativa, se producen microaneurismas en los capilares de la retina. A medida que la enfermedad progresa, más de estos vasos sanguíneos se dañan o bloquean y estas áreas de la retina envían señales al tejido regional para que crezcan nuevos vasos sanguíneos para nutrirlo. Esta etapa se llama retinopatía proliferativa. Los nuevos vasos sanguíneos crecen a lo largo de la retina y a lo largo de la superficie del gel transparente y vítreo que llena el interior del ojo.

Por sí mismos, estos vasos sanguíneos no causan ningún síntoma ni pérdida de visión. Sin embargo, poseen paredes delgadas y frágiles y, sin un tratamiento oportuno, pueden producirse derrames sanguíneos (sangre entera o algún componente de la misma), lo que puede provocar una pérdida severa de la visión e incluso la ceguera. Además, pueden filtrarse líquidos al centro de la mácula, la parte del ojo donde se produce una visión nítida y directa. El líquido y la proteína asociada comienzan a depositarse sobre la mácula o debajo de ésta, lo que hace que la visión central del paciente se distorsione. Esta condición se llama edema macular. Puede ocurrir en cualquier etapa de la retinopatía diabética, aunque es más probable que ocurra a medida que la enfermedad progresa. Alrededor de la mitad de las personas con retinopatía proliferativa también padecen edemas maculares.

La uveítis es una afección en la cual la úvea se inflama. El ojo tiene forma de una pelota de tenis, hueca por dentro con tres capas diferentes de tejido rodeando una cavidad central. La más externa es la esclerótica (capa blanca del ojo) y la más interna es la retina. La capa media entre la esclerótica y la retina se llama úvea. La úvea contiene muchos de los vasos sanguíneos que nutren el ojo. Las complicaciones de la uveítis incluyen glaucoma, cataratas o la formación de nuevos vasos sanguíneos (neovascularización).

Las intervenciones actualmente disponibles para la degeneración macular exudativa (forma húmeda), la retinopatía diabética, el edema macular diabético, la membrana neovascular coroidea, las complicaciones de la uveítis o el traumatismo ocular, incluyen terapias de fotocoagulación con láser, dosis bajas de radiación (teleterapia) y extirpación quirúrgica de las membranas neovasculares (vitrectomía ) Las terapias con láser han tenido un éxito limitado y las membranas neovasculares coroidales seleccionadas que inicialmente responden a las terapias con láser tienen altas tasas de recurrencia de la enfermedad. También existe una posible pérdida de visión como resultado de la aplicación de las terapias con láser. Las dosis bajas de radiación se han aplicado de manera ineficaz para inducir la regresión de la neovascularización coroidea. Recientemente, los antagonistas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ranibizumab y aflibercept, han sido aprobados para su uso en la degeneración macular relacionada con la edad, el edema macular diabético y la oclusión venosa retiniana (RVO). La (RVO) es la enfermedad vascular retiniana más común después de la retinopatía diabética. Dependiendo del área de drenaje venoso retiniano ocluido de forma efectiva, se clasifica grosso modo como oclusión venosa retiniana central (CRVO), oclusión venosa retiniana hemisférica (HRVO) u oclusión venosa retiniana ramificada (BRVO). Se ha observado que cada uno de estos tiene dos subtipos. La presentación de RVO en general es con pérdida visual indolora variable con cualquier combinación de hallazgos fundamentales que consisten en tortuosidad vascular retiniana, hemorragias retinianas (formas de manchas y llamas), manchas de algodón, hinchazón del disco óptico y edema macular. En una CRVO, las hemorragias retinianas se encontrarán en los cuatro cuadrantes del fondo, mientras que estas están restringidas al hemisferio fundamental superior o inferior en una HRVO. En una BRVO, las hemorragias se localizan en gran medida en el área drenada por lo ocluido en la vena retiniana.

Por lo tanto, existe una gran necesidad padecida y sustancial de métodos para tratar enfermedades del ojo que se caractericen por el desarrollo de una cierta neovascularización.

Compendio

Según la presente invención, se proporciona un agente de unión al dominio extracelular (ECD) HPTPp para su uso en la prevención de una enfermedad en el ojo de un sujeto en el que el agente es un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC N° PTA-7580 o su forma humanizada, donde la enfermedad se previene mediante la reducción de la neovascularización y la enfermedad se selecciona de la retinopatía proliferativa y la degeneración macular relacionada con la edad.

Las realizaciones preferidas se describen en las reivindicaciones adjuntas.

Se describen agentes que se unen a la porción extracelular e inhiben la proteína humana tirosina fosfatasa beta (HPTPp). También se describen métodos para tratar enfermedades o afecciones oculares caracterizadas por inestabilidad vascular, derrames vasculares y neovascularización como edema ocular, neovascularización ocular, edema macular diabético, degeneración macular relacionada con la edad, neovascularización coroidea, retinopatía diabética, oclusión venosa retiniana (central o ramificada), isquemia ocular, trauma ocular, edema inducido por cirugía y uveítis.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. El anticuerpo monoclonal R15E6 reconoce a HPTPp endógeno en las células endoteliales. (Panel A). Los lisados de células endoteliales se inmunoprecipitan con un anticuerpo de control (Carril 1), con R15E6 (Carril 2) o con una mezcla de anticuerpos anti-Tie2 y anti-VEGFR2 (Carril 3). Los inmunoprecipitados se resuelven mediante SDS-PAGE, se transfieren a una membrana de PVDF y se analizan mediante transferencia Western con una mezcla de anticuerpos R15E6, anti-Tie2 y anti-VEGFR2. Se observa una única banda principal de alto peso molecular consistente con HPTPp con R15E6 (Carril 2) y no con el anticuerpo de control (Carril 1) o la mezcla de anti-Tie2 y anti-VEGFR2 (Carril 3). (Panel B) Las células endoteliales se someten a análisis FACS con R15E6 (pico blanco) o un control sin anticuerpo primario (pico negro). El fuerte cambio en la fluorescencia indica que R15E6 se une a HPTPp en la superficie de las células endoteliales intactas.

Fig. 2. El anticuerpo monoclonal R15E6 mejora la activación del receptor Tie2 en HUVEC. La activación de Tie2 se mide en células endoteliales humanas como se describe en el Ejemplo 4. La dosis de R15E6 mejora de forma dependiente la activación de Tie2 tanto basal como inducida por Ang1.

La Fig. 3 es una representación gráfica del área media de la neovascularización coroidea en ratones C57BL/6 14 días después de la lesión por láser en ojos tratados con inyección intravítrea de 1 gg o 2 gg de un anticuerpo de dominio extracelular anti-VE-PTP en un ojo versus tratamiento similar del otro ojo con control.

La Fig. 4 muestra el área media (mm2) de la neovascularización retiniana en ratones C57BL/6 el día P17 después de la contención en una atmósfera de oxígeno al 75% de P5 a P12 y la inyección intravítrea de un anticuerpo de dominio extracelular anti-VE-PTP en P12 una vez los ratones fueron devueltos a la atmósfera ambiente.

La Fig. 5 muestra micrografías fluorescentes representativas de retinas de ratón en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno después de la inyección intravítrea del vehículo o de 2 gg de un anticuerpo de dominio extracelular anti-VE-PTP.

La Fig. 6 muestra el área media (mm2) de la neovascularización retiniana en ratones C57BL/6 el día P17 después de la contención en una atmósfera de oxígeno al 75% de P5 a P12 seguido de retorno a una atmósfera ambiente en P12 con administración subcutánea de 1 mg / kg de un anticuerpo de dominio extracelular anti-VE-PTP en los días P12, 14 y 16.

La Fig. 7 muestra el área media (mm2) de la neovascularización retiniana en ratones C57BL/6 el día P17 después de la contención en una atmósfera de oxígeno al 75% de P5 a P12 seguido de la vuelta a una atmósfera ambiente en P12 con administración subcutánea de 2 mg / kg de un anticuerpo de dominio extracelular anti-VE-PTP en los días P12, 14 y 16.

Descripción detallada

Definiciones generales

En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos y expresiones que serán definidas con los siguientes significados:

La expresión "agente de unión a HPTPp-ECD" y "agente de unión específico" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una molécula que se une específicamente a la porción extracelular de HPTPp, y sus variantes y derivados, como se define en el presente documento y que inhibe la actividad desfosforilasa Tie2 de HPTPp.

"Agente", tal y como se usa en el presente documento, se refiere a un "agente de unión a HPTPp", a menos que se indique lo contrario.

"Se une específicamente a HPTPp-ECD" se refiere a la capacidad de un agente de unión específico de la presente invención para reconocer y unirse a un epítopo del dominio extracelular de HPTPp con mayor afinidad que a otras moléculas relacionadas y / o no relacionadas. Los agentes de unión específicos se unen preferentemente a HPTPp en una mezcla compleja de proteínas y / o macromoléculas. El agente de unión específico es preferiblemente selectivo para HPTPp. "Selectivo" significa que el agente tiene una actividad significativamente mayor hacia HPTPp en comparación con otras moléculas relacionadas y / o no relacionadas, y no que esté completamente inactivo con respecto a otras moléculas. Por ejemplo, un agente selectivo puede mostrar una selectividad de 10 veces, 100 veces o 1000 veces hacia HPTPp respecto a otras moléculas relacionadas o no relacionadas.

La expresión "anticuerpos anti-HPTPp-ECD" se refiere a anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen al dominio extracelular de HPTPp. Los anticuerpos anti-HPTPp-ECD son un tipo de agente de unión a HPTPp-ECD como se define en el presente documento.

El término "VE-PTP" se refiere al ortólogo de ratón de HPTPp.

Todos los porcentajes, relaciones y proporciones en este documento están en peso, a menos que se especifique lo contrario. Todas las temperaturas están en grados Celsius (°C), a menos que se especifique lo contrario.

Los intervalos se pueden expresar en este documento como de un valor particular respecto a otro valor particular, los puntos finales se incluyen en el intervalo. Por ejemplo, para el intervalo de "1 mg a 50 mg" se incluyen los valores específicos de 1 mg y 50 mg. El antecedente "aproximadamente" indica que los valores son aproximados. Por ejemplo, para el intervalo de "aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg" indica que los valores son valores aproximados. Además, cuando se expresa dicho intervalo, el intervalo incluye el intervalo “de 1 mg a 50 mg”. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final, como independientemente del otro punto final. Por ejemplo, el intervalo “de 1 mg a 50 mg” incluye el intervalo “de 30 mg a 40 mg. ”

"Cantidad efectiva" significa una cantidad de un agente activo o combinación de agentes efectivos para mejorar o prevenir los síntomas, o prolongar la supervivencia del paciente que está siendo tratado. Una cantidad efectiva puede variar según los factores conocidos en la técnica, tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del ser humano o animal que se está tratando. Aunque se pueden describir regímenes de dosificación particulares en los ejemplos de la presente, cualquier persona experta en la técnica apreciaría que el régimen de dosificación se puede alterar para proporcionar una respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas pueden administrarse diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Además, las composiciones de esta descripción se pueden administrar con la frecuencia necesaria para lograr una cantidad terapéutica. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de las capacidades de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en este documento.

Como se usa en el presente documento, el término "inhibir" o "inhibir" se refiere a una reducción de actividad estadísticamente significativa y medible, preferiblemente una reducción de al menos aproximadamente un 10% frente al control, más preferiblemente una reducción de aproximadamente un 50% o más, aún más preferiblemente un reducción de aproximadamente un 80% o más.

Como se usa en el presente documento, el término "aumento" o "incremento" se refiere a un aumento de actividad estadísticamente significativo y medible, preferiblemente un aumento de al menos aproximadamente un 10% frente al control, más preferiblemente un aumento de aproximadamente un 50% o más, aún más preferiblemente un aumento de aproximadamente un 80% o más.

"HPTP beta" o "HPTPp" se usan indistintamente en el presente documento y son abreviaturas para la proteína humana tirosina fosfatasa beta.

Como se usa en este documento, "sujeto" significa un individuo. Por lo tanto, el "sujeto" puede incluir animales domésticos (p. ej., gatos, perros, etc.), ganado (p. ej., vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de laboratorio (p. ej., ratón, conejo, rata, conejillo de indias, etc.) y aves. "Sujeto" también puede incluir un mamífero, como un primate o un ser humano. "Sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en este documento. Preferiblemente el sujeto es un ser humano.

Por "reducir" u otras expresiones, como "que reduce" o "reducción", se entiende la disminución de un evento o característica (por ejemplo, derrame vascular). Se entiende que suele estar relacionado con algún valor estándar o esperado, en otras palabras, es relativo, pero que no siempre es necesario hacer referencia al valor estándar o relativo.

Los términos "tratamiento", "que trata", "tratar" y similares, se refieren a obtener un efecto farmacológico y / o fisiológico deseado, como mitigar una enfermedad o trastorno en un huésped y / o reducir, inhibir o eliminar una determinada característica o evento asociado con un trastorno (p. ej., un edema ocular). Por lo tanto, el término "tratamiento" incluye prevenir que aparezca un trastorno en un huésped, particularmente cuando el huésped está predispuesto a adquirir la enfermedad, pero aún no se le ha diagnosticado la enfermedad; inhibiendo el trastorno y / o aliviando o revertiendo el trastorno. En la medida en que los métodos de la presente invención están dirigidos a prevenir trastornos, se entiende que el término "prevenir" no requiere que el estado de la enfermedad sea completamente curado. Más bien, como se usa en el presente documento, el término prevención se refiere a la capacidad del experto en la técnica en identificar una población que sea susceptible a trastornos, de modo que la administración de los compuestos de la presente invención pueda ocurrir antes del inicio de la enfermedad. El término no implica que el estado de la enfermedad se evite por completo.

A menos que se especifique lo contrario, la retinopatía diabética incluye todas las etapas de la retinopatía no proliferativa y la retinopatía proliferativa.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, la palabra "comprender" y otras formas de la palabra, como "que comprende" y "comprende", significa, entre otras, y no pretende excluir, por ejemplo, otros aditivos, componentes, números enteros o etapas.

Como se usa en la descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una/un” y “la/el” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una composición" incluye una composición o mezclas de dos o más de tales composiciones.

“Opcional” u “opcionalmente” significa que el evento o circunstancia que se describe posteriormente puede o no acontecer y que la descripción incluye casos en los que el evento o la circunstancia aparece y casos en los que no. "Se une específicamente a HPTPp" se refiere a la capacidad de un agente de la presente invención para reconocer y unirse a un epítopo del dominio extracelular de HPTPp con mayor afinidad que a las otras moléculas relacionadas y / o no relacionadas. El agente es preferiblemente selectivo para HPTPp. "Específico" significa que el agente tiene una actividad significativamente mayor hacia HPTPp en comparación con otras moléculas relacionadas y / o no relacionadas, no es que esté completamente inactivo con respecto a otras moléculas. Por ejemplo, un agente selectivo puede mostrar una selectividad de 10 veces, 100 veces o 1000 veces hacia HPTPp que a otra molécula relacionada o no relacionada.

El término "epítopo" se refiere a cualquier porción de cualquier molécula capaz de ser reconocida y unida por un agente en una o más de las regiones de unión al antígeno del agente. Los epítopos generalmente consisten en agrupaciones de superficie distintas y reconocibles, tales como aminoácidos, azúcares, lípidos, fosforilo o sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y / o características de carga específicas. Los epítopos, tal como se usan en el presente documento, pueden ser conformacionales o lineales.

"Pepticuerpo" es una molécula que comprende un dominio Fc de anticuerpo unido al menos a un péptido. La producción de pepticuerpos se describe generalmente en el documento WO2002 / 24782.

"Fragmento" se refiere a una porción de un agente. Un fragmento puede retener la actividad biológica deseada del agente y puede considerarse como un agente en sí mismo. Por ejemplo, una proteína truncada en la que se elimina el terminal amino y / o el terminal carboxi y / o un residuo de aminoácido interno es un fragmento de la proteína y un Fab de una molécula de inmunoglobulina es un fragmento de la inmunoglobulina. Dichos fragmentos también pueden conectarse a otra molécula por medio de una conexión directa (por ejemplo, un péptido o enlace disulfuro) o por medio de un enlazador.

"Proteína" se usa en este documento de manera intercambiable con péptido y polipéptido.

Los péptidos de la presente invención incluyen, entre otros, secuencias de aminoácidos que tienen de aproximadamente 3 a aproximadamente 75 aminoácidos, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 aminoácidos, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 aminoácidos. Los péptidos pueden ser secuencias de aminoácidos naturales o artificiales.

Se puede obtener una proteína de la invención por métodos reconocidos en la técnica, por ejemplo, usando técnicas estándar de síntesis directa de péptidos, tales como a través de una síntesis en fase sólida. Si la secuencia del gen es conocida o puede deducirse, entonces la proteína puede producirse mediante métodos recombinantes estándar. Las proteínas pueden aislarse o purificarse en una variedad de formas conocidas por los expertos en la materia. Los métodos de purificación estándar incluyen precipitación con sales, técnicas electroforéticas, cromatográficas y similares.

Los agentes pueden estar conjugados de forma covalente o no covalente a un vehículo. El término "vehículo" se refiere a una molécula que evita la degradación y / o aumenta la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad o aumenta la actividad biológica del agente. Los vehículos ejemplares incluyen, entre otros, dominios Fc de inmunoglobulinas y polímeros, por ejemplo: polietilenglicol (PEG), polilisina, dextrano, un lípido, un grupo colesterol (como un esteroide); un carbohidrato u oligosacárido; o cualquier proteína o péptido natural o sintético que se una a un receptor de rescate.

Los "derivados" incluyen aquellos agentes de unión que se han modificado químicamente de alguna manera distinta a partir de las variantes de inserción, deleción o sustitución. Por ejemplo, en el que el agente de unión es una proteína, el terminal carboxilo puede estar terminado con un grupo amino, tal como NH².

En algunas realizaciones, una o más moléculas están unidas para formar el agente. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden estar conectados por un enlazador. En general, la estructura química del enlazador no es crítica ya que sirve principalmente como un espacio. En un ejemplo, el enlazador está hecho de aminoácidos unidos entre sí por medio de enlaces peptídicos. En otro ejemplo, el enlazador es un enlazador no peptídico tal como un grupo alquilo C¹-C⁶ que no obstaculiza estéricamente. En otra realización, el enlazador es un enlazador PEG. Se apreciará además que el enlazador se puede insertar en varios lugares de la molécula.

Las variantes de un agente están incluidas dentro del alcance de la presente invención. "Variante" o "Variantes", como se usa en el presente documento, significa un agente que tiene una secuencia de proteínas o nucleótidos que es sustancialmente similar a la secuencia de proteínas o nucleótidos del agente no variante y que comparte una actividad similar del agente no variante. Una secuencia de proteínas o nucleótidos puede alterarse de varias maneras para producir una variante abarcada por la presente invención, que incluye sustituciones, deleciones, truncamientos, inserciones y otras modificaciones. Los métodos para tales manipulaciones son reconocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (y actualizaciones) Ausubel et al., Eds (1996), John Wiley and Sons, New York: Methods in Molecular Biology, Vol. 182, In vitro Mutagenesis Protocols, 2a edición, Barman Ed. (2002), Humana Press, y las referencias allí citadas. Por ejemplo, las variantes incluyen péptidos y polipéptidos en los que los residuos de aminoácidos se insertan, eliminan y / o sustituyen en la secuencia de aminoácidos conocida para el agente de unión. En un ejemplo, la sustitución del aminoácido es conservadora porque altera mínimamente las propiedades bioquímicas de la variante. En otras realizaciones, la variante puede ser un fragmento activo de una proteína de longitud completa, una proteína modificada químicamente, una proteína modificada mediante la adición de marcadores de epítopo o afinidad, o restos de marcado fluorescente u otros, ya sea por tratamientos enzimáticos in vivo o in vitro de la proteína, por modificación química, o por la síntesis de la proteína usando aminoácidos modificados.

También se contemplan en el presente documento proteínas de fusión. Usando métodos conocidos, los expertos en la materia podrían preparar proteínas de fusión de las proteínas de la descripción; que, si bien son diferentes de la forma nativa, pueden ser útiles. Por ejemplo, la pareja de fusión puede ser una secuencia de polipéptidos de señal (o líder) que dirija, de forma co-transduccional o post-transduccional, la transferencia de la proteína desde su sitio de síntesis a otro sitio (por ejemplo, el líder del factor alfa de levadura). Alternativamente, se puede agregar para facilitar la purificación o identificación de la proteína de la descripción (por ejemplo, poli-His, péptido Flag o proteínas fluorescentes).

Se pueden usar técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en este documento. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica y como se describe en las diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en el presente documento son las conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica y los procedimientos y técnicas de laboratorio. Se pueden utilizar técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, administración y tratamiento de pacientes.

Listado de secuencias

Tabla 1

Agentes de unión a HPTPp-ECD

Los agentes útiles en la presente descripción incluyen, entre otros, anticuerpos, proteínas, darpinas, péptidos, aptámeros, adnectinas, pepticuerpos o ácidos nucleicos que se unen específicamente a la porción extracelular de HPTPp e inhiben al menos una actividad fosfatasa de HPTPp. Como se usa en el presente documento, "actividad de fosfatasa" incluye actividad enzimática y actividad biológica donde la actividad biológica se mide evaluando la fosforilación de Tie2.

Los agentes útiles en la presente descripción incluyen además: anticuerpos, o sus fragmentos de unión al antígeno que se unen a la porción extracelular de HPTPp, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno inhibe al menos una actividad de fosfatasa de HPTPp. Estos agentes incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales. Un agente puede ser un fragmento de un anticuerpo, en el que el fragmento comprende las regiones variables de la cadena pesada y ligera, o el fragmento es un F(ab')², o el fragmento es un dímero o trímero de un Fab, Fv, scFv, o un día-, tria- o tetra-cuerpo derivado del anticuerpo.

Por ejemplo, el agente puede ser, sin limitación, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a la porción extracelular de HPTPp; o, en particular, un anticuerpo que se une a una repetición FN3 de HPTPp o, más específicamente, un anticuerpo que se une a la primera repetición FN3 de HPTPp.

Los agentes incluyen además: el anticuerpo monoclonal R15E6 que se describe en la patente de EE.UU. No.

7.973.142 o el miembro de familia WO2007/116360 A2, que se incorpora por la presente en su totalidad. (El hibridoma de ratón, las células de bazo Balbc (células B) que pueden usarse para producir el anticuerpo se depositan en la American Type Culture Collection (ATCC), PO Box 1549, Manassas, Virginia 20108 EE. UU. el 4 de mayo de 2006, denominado ATCC No. PTA-7580) (denominado en el presente documento R15E6)), anticuerpos que tienen las mismas, o sustancialmente las mismas, características biológicas de R15E6; fragmentos de anticuerpo de R15E6, donde el fragmento comprende las regiones variables de la cadena pesada y ligera; un F(ab^')2 de R15E6; dímeros o trímeros de un Fab, Fv, scFv; y dia-, tria- o tetra-cuerpos derivados de R15E6.

En particular, un agente adecuado para usar en la presente invención es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, variante o sus derivados, ya sea solo o en combinación con otras secuencias de aminoácidos, proporcionadas por técnicas conocidas. Dichas técnicas incluyen, entre otras, la escisión enzimática, escisión química, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes. La invención abarca además agentes derivados, p. ej. pepticuerpos.

Por lo tanto, una realización de un agente de unión a HPTPp-ECD es el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC No. PTA-7580. En otra realización más, el agente de unión a HPTPp-ECD es un fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC No. PTA-7580. En otra realización más, el agente de unión a HPTPp-ECD es un anticuerpo que tiene las mismas, o sustancialmente las mismas, características biológicas que el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC No. PTA-7580 o su fragmento de unión a antígeno.

Cualquiera de las realizaciones o ejemplos de los agentes de unión a HPTPp-ECD descritos en la presente solicitud pueden conjugarse covalentemente o no covalentemente a un vehículo. El término "vehículo" se refiere a una molécula que afecta a una propiedad biológica de un agente. Por ejemplo, el vehículo puede evitar la degradación y / o aumentar la vida media, la absorción, reducir la toxicidad, reducir la inmunogenicidad o aumentar la actividad biológica del agente. Los vehículos ejemplares incluyen, entre otros, dominios Fc de inmunoglobulinas; polímeros, por ejemplo: polietilenglicol (PEG), polilisina, dextrano; lípidos; grupos de colesterol (como un esteroide); carbohidratos, dendrímeros, oligosacáridos o péptidos que se unen a un receptor de rescate. En algunas realizaciones, el vehículo es polietilenglicol (PEG). En otras realizaciones, el vehículo es polilisina. En otras realizaciones más, el vehículo es dextrano. En otras realizaciones más, el vehículo es un lípido.

Uniones de polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol, como se describen en las patentes de EE.UU. Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; y 4.179.337, que se incorporan en este documento en su totalidad. Aún otros polímeros útiles conocidos en la técnica incluyen monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno / óxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de estos polímeros. Particularmente preferidos son los pepticuerpos modificados covalentemente con subunidades de polietilenglicol (PEG). Los polímeros solubles en agua pueden unirse en posiciones específicas, por ejemplo, en el extremo amino de los pepticuerpos, o unirse aleatoriamente a una o más cadenas laterales del polipéptido. El uso de PEG para mejorar la capacidad terapéutica de los agentes, p. ej. los pepticuerpos, y para anticuerpos humanizados en particular, se describen en la patente de EE.UU. N° 6.133.426. La invención también contempla derivatizar la porción de péptido y / o vehículo de los agentes. Tales derivados pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica y similares de los agentes. Los restos pueden eliminar o atenuar alternativamente cualquier efecto secundario indeseable de los agentes y similares.

El término "anticuerpo" (Ab), tal y como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo, anticuerpos de llama y camello, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, regiones variables y / o fragmentos de región constante, siempre que exhiban una actividad biológica deseada, por ejemplo, actividad de unión a antígeno. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa indistintamente con "anticuerpo" en el presente documento.

Un "fragmento de unión a antígeno", tal y como se usa en el presente documento, es un fragmento de un agente que se une a una porción de HPTPp e inhibe la actividad de HPTPp.

Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que ha sido identificado, y / o separado, y / o recuperado de su entorno natural.

La unidad básica de anticuerpos de cuatro cadenas es una glucoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consta de 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional llamado cadena J, y por lo tanto, contienen 10 sitios de unión al antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes que comprendan 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J). En el caso de las IgG, la unidad de cuatro cadenas consiste generalmente en aproximadamente 150 kilo Daltons (kDa). Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena H tiene en el extremo N, un dominio variable (V^h) seguido de tres dominios constantes (C^h) para cada una de las cadenas alfa y gamma y cuatro dominios C^h para los isotipos mu y épsilon. Cada cadena L tiene en el extremo N, un dominio variable (V^l) seguido de un dominio constante (C^l) en su otro extremo. El V^l está alineado con el V^h y el C^l está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (Cm). Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. El emparejamiento de un V^h con un V^l forma un único sitio de unión al antígeno. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton y Lange, 1994, página 71 y Capítulo 6.

La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (C^h), las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas como alfa, delta, epsilon, gamma y mu, respectivamente. Las clases gamma y alfa se dividen además en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores en la secuencia y función de C^h, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

Los miembros de la familia Camelidae, por ejemplo, llama, camello y dromedarios, contienen un tipo único de anticuerpo, que carecen de cadenas ligeras y carecen aún más del dominio C^h1 (Muyldermans, S., Rev. Mol. Biotechnol., Vol. 74, pp. 277-302 (2001)). La región variable de estos anticuerpos de cadena pesada se denomina V^hh o VHH, y constituye el fragmento de unión a antígeno intacto más pequeño disponible (15 kDa) derivado de una inmunoglobulina funcional.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media la unión al antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular con respecto a su antígeno. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente en el intervalo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables llamados regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad llamadas "regiones hipervariables" que tienen cada una de 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FR, adoptando en gran medida una configuración de hoja p, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de hoja p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

La expresión "región hipervariable", cuando se usa en el presente documento, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la V^l, y alrededor de 1 -35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la V^h; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y / o los residuos de un "bucle hipervariable".

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único epítopo, es decir, un único determinante antigénico. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin ser contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridoma o pueden elaborarse usando métodos de ADN recombinante en células bacterianas, eucariotas de animales o plantas (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fago, usando las técnicas disponibles, por ejemplo, Clackson et al., Nature, vol. 352, pp. 624-628 (1991).

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen anticuerpos "quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y / o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idéntica(s) u homóloga(s) a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (véase la patente de EE.UU. 4.816.567, y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, pp. 6851-6855 (1984)).

Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo multimérico, preferiblemente la región variable o de unión al antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')², dímeros y trímeros de conjugados Fab, Fv, scFv, minicuerpos; dia-, tria- y tetracuerpos; anticuerpos lineales (Ver Hudson et al., Nature Med. Vol. 9, pp. 129-134 (2003)).

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de unión al antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno ligero en asociación estrecha y no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácidos para la unión al antígeno y confieren especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno y, por lo tanto, se incluyen en la definición de Fv.

Un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) es una proteína de fusión de las regiones variables de las cadenas pesadas (V^h) y ligeras (V^l) de las inmunoglobulinas, conectadas con un péptido enlazador corto de diez a aproximadamente 25 aminoácidos. El enlazador generalmente es rico en glicina para mejorar su flexibilidad, así como en serina o en treonina para mejorar su solubilidad, y puede conectar el extremo N de la V^h con el extremo C de la V^l, y viceversa. Esta proteína retiene la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del enlazador.

Los fragmentos variables divalentes (o bivalentes) de cadena sencilla (di-scFvs, bi-scFvs) se pueden diseñar uniendo dos scFvs. Esto se puede hacer produciendo una sola cadena peptídica con dos regiones V^h y dos regiones V^l, produciendo scFvs en tándem. Otra posibilidad es la creación de scFv con péptidos enlazadores que son demasiado cortos para que las dos regiones variables se plieguen (aproximadamente cinco aminoácidos), lo que obliga a los scFv a dimerizarse. Este tipo se conoce como diacuerpos. Se ha demostrado que los diacuerpos tienen constantes de disociación hasta 40 veces más bajas que los scFv correspondientes, lo que significa que tienen una afinidad mucho mayor con su diana. En consecuencia, los medicamentos basados en diacuerpos podrían dosificarse a una concentración mucho más baja que otros anticuerpos terapéuticos y son capaces de atacar altamente específicamente los tumores in vivo. Los enlazadores aún más cortos (uno o dos aminoácidos) conducen a la formación de trímeros, llamados triacuerpos o tricuerpos. Los tetracuerpos son conocidos y se ha demostrado que exhiben una afinidad aún mayor por sus objetivos que los diacuerpos.

La expresión "anticuerpo humanizado" o "anticuerpo humano" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en las que al menos una porción de la secuencia V^h y / o V^l ha sido modificada para que sea más "humana", es decir, más similar a las secuencias variables de la línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR, en el que las secuencias de CDR humanas se introducen en secuencias de V^h y V^l no humanas para reemplazar las secuencias de CDR no humanas correspondientes. Los expertos en la técnica conocen los medios para fabricar anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 4.816.567 y 5.225.539). Un método para fabricar anticuerpos humanos emplea el uso de animales transgénicos, como ratones transgénicos. Estos animales transgénicos contienen una parte sustancial del genoma productor de anticuerpos humanos insertado en su propio genoma y la producción de anticuerpos endógenos propios del animal se vuelve deficiente en la producción de anticuerpos. Los métodos para fabricar tales animales transgénicos son conocidos en la técnica. Tales animales transgénicos se pueden preparar usando la tecnología XenoMouse® o usando un enfoque de "minilocus". Los métodos para hacer XenoMice® se describen en la patente de EE.UU. Nos. 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598 y 6.075.181. Los métodos para hacer animales transgénicos usando el enfoque de "minilocus" se describen en las patentes de EE.UU. Nos. 5.545.807, 5.545.806, 5.625.825 y WO 93/12227.

La humanización de un anticuerpo no humano se ha convertido en rutina en los últimos años, y en este momento pertenece al conocimiento común de cualquier experto en la materia. Varias compañías brindan servicios para fabricar anticuerpos humanizados, por ejemplo, Xoma, Aries, Medarex, PDL y Cambridge Antibody Technologies. Los protocolos de humanización se describen ampliamente en la bibliografía técnica, por ejemplo, Kipriyanov y Le Gall, Molecular Biotechnol, vol. 26, págs. 39-60 (2004), Humana Press, Totowa, N.J .; Lo, Methods Mol. Biol., Vol.

248, págs. 135-159 (2004), Humana Press, Totowa, N.J .; Wu y col., J. Mol. Biol. Vol. 294, pp. 151-162 (1999).

En ciertas realizaciones, los anticuerpos útiles en la presente descripción pueden expresarse en líneas celulares distintas de las líneas celulares de hibridoma. Pueden usarse secuencias que codifican anticuerpos particulares para la transformación de una célula huésped de mamífero adecuada mediante métodos conocidos para introducir polinucleótidos en una célula huésped, que incluyen, por ejemplo, empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula huésped con el virus (o vector), o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica en las patentes de EE.UU. Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. El procedimiento de transformación utilizado puede depender del huésped a transformar. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de un polinucleótido o varios polinucleótido en liposomas, mezcla de ácidos nucleicos con lípidos cargados positivamente y microinyección directa del ADN en los núcleos.

Se insertan en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligamiento estándar una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada, una región variable de cadena pesada, una región constante de cadena ligera o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo, o un fragmento del mismo en una combinación adecuada si se desea. La región constante de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo se puede unir al extremo C de la región variable apropiada y se liga a un vector de expresión. El vector se selecciona típicamente para que sea funcional en la célula huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped de modo que pueda producirse la amplificación del gen y / o la expresión del gen). Para una revisión de los vectores de expresión, véase Methods Enzymol., Vol.

185, (Goeddel, ed.), 1990, Academic Press.

Identificación de agentes de unión específicos

Los agentes de unión a HPTPp-ECD adecuados pueden identificarse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los agentes candidatos pueden seleccionarse para la unión a HPTPp, y seleccionarse según su actividad. En general, los agentes candidatos serán seleccionados primero para la unión y, aquellos que muestren una unión selectiva, serán seleccionados para determinar la capacidad de inhibir la desfosforilación mediada por HPTPp de Tie2. Sin embargo, en algunos casos, los agentes candidatos pueden seleccionarse primero in vivo para determinar la actividad.

Determinación de la actividad de unión

La selección de un ensayo adecuado para su uso en la identificación de un agente de unión específico depende de la naturaleza del agente candidato a cribar. Cualquier experto en la materia podría elegir los ensayos apropiados para el agente candidato particular.

Por ejemplo, cuando los candidatos son anticuerpos o pepticuerpos, que comprenden una fracción Fc, el análisis FACS como se describe en el Ejemplo 3B permite seleccionar el agente candidato en función de su capacidad para unirse a las células, que expresan HPTPp. La célula puede expresar de manera endógena HPTPp o puede ser modificada genéticamente para expresar HPTPp.

Para otros agentes candidatos tales como aptámeros, se conocen otras técnicas en la técnica. Por ejemplo, los aptámeros que se unen específicamente a HPTPp pueden seleccionarse utilizando una técnica conocida como SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) que selecciona aptámeros específicos a través de rondas repetidas de selección in vitro.

Determinación de la actividad inhibidora por Transferencia Western

Como se ejemplifica en el Ejemplo 4, en un ensayo adecuado, se cultivan HUVEC en medios sin suero en presencia o ausencia de diversas concentraciones del agente candidato y se preparan los lisados de las células, se inmunoprecipitan con un anticuerpo Tie2, se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfieren a una membrana de PVDF. Las proteínas inmunoprecipitadas unidas a la membrana se transfieren en serie con un anticuerpo antifosfotirosina para cuantificar la fosforilación de Tie2 seguido de un anticuerpo Tie2 para cuantificar el Tie2 total. La fosforilación de Tie2 se expresa como la relación de la señal anti-fosfotirosina sobre la señal de Tie2 total. Mayores niveles de la señal anti-fosfotirosina indican una mayor inhibición de HPTPp por el agente candidato.

Los agentes candidatos que pueden seleccionarse incluyen, entre otros, bibliotecas de agentes conocidos, incluidos productos naturales, como extractos de plantas o animales, moléculas biológicamente activas que incluyen proteínas, péptidos que incluyen entre otros miembros de bibliotecas de péptidos aleatorios y biblioteca molecular derivada de química combinatoria hecha de aminoácidos de configuración D o L, anticuerpos que incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, humanos, de cadena única, fragmentos de la biblioteca de expresión de Fab, F(ab⁾² y Fab y sus fragmentos de unión a epítopos.

Como se usa en el presente documento, los "fragmentos de anticuerpos" incluyen, entre otros, un F(ab')², un dímero o trímero de un Fab, Fv, scFv o un dia-, tria- o tetra-cuerpo derivado de un anticuerpo.

Métodos

Se describen métodos para el tratamiento de enfermedades o afecciones oculares, especialmente retinopatías, edema ocular y neovascularización ocular. Los ejemplos no limitantes de estas enfermedades o afecciones incluyen edema macular diabético, degeneración macular relacionada con la edad (forma húmeda), neovascularización coroidea, retinopatía diabética, isquemia ocular, uveítis, oclusión venosa retiniana (central o ramificada), trauma ocular, edema inducido por cirugía, neovascularización inducida por cirugía, edema macular cistoide, isquemia ocular, uveítis, etc. Estas enfermedades o afecciones se caracterizan por cambios en la vasculatura ocular ya sea progresiva o no progresiva, y ya sea como resultado de una enfermedad o afección aguda, o como una enfermedad o afección crónica.

Un aspecto de los métodos descritos se refiere a enfermedades que son consecuencia directa o indirecta de la diabetes, entre otras, edema macular diabético y retinopatía diabética. La vasculatura ocular del diabético se vuelve inestable con el tiempo y conduce a afecciones como la retinopatía no proliferativa, el edema macular y la retinopatía proliferativa. A medida que el líquido se filtra hacia el centro de la mácula, la parte del ojo donde se produce una visión nítida y clara, la acumulación de líquido y la proteína asociada comienzan a depositarse sobre la mácula o debajo de ésta. Esto da como resultado una inflamación que perturba la visión central del sujeto. Esta condición se conoce como "edema macular. Otra condición que puede ocurrir es la retinopatía no proliferativa en la cual los cambios vasculares, como los microaneurismas, pueden aparecer fuera de la región macular del ojo.

Estas condiciones pueden o no progresar a retinopatía proliferativa diabética que se caracteriza por la neovascularización. Estos nuevos vasos sanguíneos son frágiles y susceptibles de sangrar. El resultado es la cicatrización de la retina, así como la oclusión o el bloqueo total de la vía de luz a través del ojo debido a la formación excesiva de nuevos vasos sanguíneos. Típicamente, los sujetos que tienen un edema macular diabético padecen una etapa no proliferativa en la retinopatía diabética; sin embargo, no es raro que los sujetos solo comiencen a manifestar el edema macular al comienzo de la etapa proliferativa.

La retinopatía diabética, si no se trata, puede conducir a la ceguera. De hecho, la retinopatía diabética es la principal causa de ceguera en las poblaciones en edad laboral.

Por lo tanto, los métodos descritos se refieren a la prevención, tratamiento, control, disminución y / o minimización de la neovascularización ocular en un sujeto con diabetes o un sujeto diagnosticado con diabetes. Además, los sujetos que tienen diabetes o los sujetos diagnosticados con diabetes pueden ser alertados o informados sobre los riesgos de desarrollar ceguera relacionada con la diabetes, por lo tanto, los métodos actuales pueden usarse para prevenir o retrasar la aparición de retinopatía no proliferativa en sujetos que se sabe que están en riesgo. Del mismo modo, pueden usarse métodos actuales para tratar a sujetos que tienen o están siendo diagnosticados con retinopatía diabética no proliferativa para prevenir la progresión de la afección.

Los métodos descritos se refieren a prevenir o controlar la neovascularización ocular o tratar una enfermedad o afección que está relacionada con el inicio de la neovascularización ocular mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Un aspecto de este método se refiere al tratamiento o a la prevención de la neovascularización ocular mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Un ejemplo de este aspecto se refiere a un método para tratar la neovascularización ocular que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles.

Por lo tanto, un ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir la neovascularización ocular en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir la neovascularización ocular en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Otra realización más de la presente descripción es el uso de un agente de unión a HPTPp-ECD en el tratamiento de la neovascularización ocular.

Los métodos descritos también se refieren a la prevención o el control del edema ocular o el tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con la aparición del edema ocular mediante la administración a un sujeto de un agente de unión a HPTPp-ECD.

Un aspecto de este método se refiere al tratamiento o la prevención del edema ocular mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Un ejemplo de este aspecto se refiere a un método para tratar el edema ocular que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende:

a. una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

b. uno o más vehículos o excipientes compatibles.

Por lo tanto, una realización de la presente descripción es un método para tratar o prevenir el edema ocular en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir el edema ocular en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende el agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Un ejemplo de la presente descripción es el uso de un agente de unión a HPTPp-ECD en el tratamiento del edema ocular.

Otro método descrito se refiere a prevenir o controlar el edema retiniano o la neovascularización retiniana, o tratar una enfermedad o afección relacionada con el inicio del edema retiniano o la neovascularización retiniana, mediante la administración a un sujeto de un agente de unión a HPTPp-ECD. Un aspecto de este método se refiere al tratamiento o la prevención del edema retiniano o la neovascularización retiniana mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Un ejemplo de este aspecto se refiere a un método para tratar el edema retiniano o la neovascularización retiniana que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles.

Por lo tanto, un ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir el edema retiniano en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro ejemplo es un método para tratar o prevenir la neovascularización retiniana que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Un ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir el edema retiniano en un sujeto, administrando una composición que comprende una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Otra realización es un método para tratar o prevenir la neovascularización de la retina mediante la administración de una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Otro ejemplo es el uso de un agente de unión a HPTPp-ECD en el tratamiento del edema retiniano. Otro ejemplo adicional es el uso de un agente de unión a HPTPp-ECD en el tratamiento de la neovascularización retiniana.

Otro método descrito se refiere al tratamiento, la prevención o el control de la retinopatía diabética, o al tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con el inicio de la retinopatía diabética mediante la administración a un sujeto de un agente de unión a HPTPp-ECD.

Un aspecto de este método se refiere al tratamiento o a la prevención de la retinopatía diabética mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Un ejemplo de este aspecto se refiere a un método para tratar la retinopatía diabética que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles.

Por lo tanto, un ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir la retinopatía diabética en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir la retinopatía diabética en un sujeto administrando una composición que comprende una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Otra realización más de la presente descripción es el uso de un agente de unión a HPTPp-ECD en el tratamiento de la retinopatía diabética.

Un método más descrito se refiere a un método para tratar o prevenir la retinopatía no proliferativa que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Otra descripción de este aspecto se refiere a un método para tratar o prevenir la retinopatía no proliferativa que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Por lo tanto, un ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir la retinopatía no proliferativa en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir la retinopatía no proliferativa en un sujeto, administrando una composición que comprende una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Otro ejemplo más de la presente descripción es el uso de un agente de unión a HPTPp-ECD en el tratamiento de la retinopatía no proliferativa.

Otro método más descrito se refiere a prevenir o controlar el edema macular diabético, o tratar una enfermedad o afección que esté relacionada con la aparición del edema macular diabético mediante la administración a un sujeto de un agente de unión a HPTPp-ECD.

Un aspecto de este método se refiere al tratamiento o la prevención del edema macular diabético mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Un ejemplo de este aspecto se refiere a un método para tratar el edema macular diabético que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende: a) una cantidad eficaz de uno o más de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y b) uno o más vehículos o excipientes compatibles.

Por lo tanto, un ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir el edema macular diabético en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir el edema macular diabético en un sujeto administrando una composición que comprende una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Otro ejemplo más de la presente descripción es el uso de un agente de unión a HPTPp-ECD en el tratamiento del edema macular diabético.

Otro ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir el edema de degeneración macular en forma húmeda relacionado con la edad en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro ejemplo de la presente descripción es un método para tratar o prevenir el edema de degeneración macular en forma húmeda relacionado con la edad en un sujeto administrando una composición que comprende una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Otro ejemplo más de la presente descripción es el uso de un agente de unión a HPTPp-ECD en el tratamiento del edema de degeneración macular en forma húmeda relacionado con la edad.

Otro ejemplo es un método para tratar, prevenir o controlar la neovascularización coroidea y la neovascularización inducida por cirugía administrando a un sujeto una cantidad efectiva de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro ejemplo es un método para tratar, prevenir o controlar la neovascularización coroidea y la neovascularización inducida por cirugía administrando al sujeto una composición que comprenda una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos o excipientes compatibles. Otro ejemplo más de la presente descripción es el uso de un agente de unión a HPTPp-ECD en el tratamiento de la neovascularización coroidea y la neovascularización inducida por cirugía.

Otro ejemplo es una composición para tratar o prevenir un trastorno ocular que comprende un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Otro ejemplo más es una composición para tratar o prevenir un trastorno ocular que comprende un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y una o más composiciones portadoras farmacéuticamente aceptables en las que el trastorno ocular es la neovascularización ocular, la neovascularización retiniana, la degeneración macular relacionada con la edad y la neovascularización inducida por cirugía.

En algunos ejemplos, el agente de unión a HPTPp-ECD o su sal farmacéuticamente aceptable se usa para tratar un trastorno ocular. En algunos ejemplos, el agente de unión a HPTPp-ECD o su sal farmacéuticamente aceptable se usa para tratar un trastorno ocular, en el que el trastorno ocular es la neovascularización ocular, neovascularización retiniana, la degeneración macular relacionada con la edad, neovascularización coroidea y la neovascularización inducida por cirugía.

En otros ejemplos más, el agente de unión a HPTPp-ECD o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo se usa para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno ocular. En algunas realizaciones, el trastorno ocular es la neovascularización ocular, neovascularización retiniana, degeneración macular relacionada con la edad, neovascularización coroidea y la neovascularización inducida por cirugía.

Dosificación

Las dosis efectivas y los programas para administrar el agente de unión a HPTPp-ECD pueden determinarse empíricamente, y hacer que tales determinaciones estén dentro de la competencia de la técnica. Los expertos en la materia entenderán que la dosis del agente que debe administrarse variará dependiendo, por ejemplo, del sujeto que recibirá el agente, la vía de administración, el tipo particular de agente utilizado y otros medicamentos que se administren al sujeto. Por ejemplo, se encuentra orientación en la selección de dosis apropiadas para anticuerpos en la bibliografía sobre usos terapéuticos de anticuerpos, por ejemplo, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., Eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) cap. 22 y pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., Eds., Raven Press, Nueva York (1977) pp. 365-389. Una dosis típica del agente usado solo puede variar de aproximadamente 0,01 mg / kg hasta 500 mg / kg de peso corporal o más por día, o de aproximadamente 0,01 mg / kg a aproximadamente 50 mg / kg, o de 0,1 mg / kg a aproximadamente 50 mg / kg, o de aproximadamente 0,1 mg / kg hasta aproximadamente 10 mg / kg, o de aproximadamente 0,2 mg / kg a aproximadamente 1 mg / kg, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

Un ejemplo se refiere a un método para tratar la neovascularización ocular que comprende administrar a un sujeto de aproximadamente 0,01 mg / kg a aproximadamente 50 mg / kg de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otra iteración de este ejemplo se refiere a la administración a un sujeto de aproximadamente 0,1 mg / kg a aproximadamente 10 mg / kg en peso del sujeto a tratar, un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Una iteración más de este ejemplo se refiere a un método para tratar o prevenir enfermedades o afecciones relacionadas con la neovascularización ocular que comprende administrar a un sujeto de aproximadamente 1 mg / kg a aproximadamente 10 mg / kg en peso del sujeto un agente de unión a HPTPp-ECD o su sal farmacéuticamente aceptable. Todavía otra iteración de este ejemplo se refiere a un método para tratar o prevenir enfermedades o afecciones relacionadas con la neovascularización ocular que comprende administrar a un sujeto de aproximadamente 5 mg / kg a aproximadamente 10 mg / kg en peso del sujeto un agente de unión de HPTPp-ECD o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Una iteración más de este ejemplo se refiere a un método para tratar o prevenir enfermedades o afecciones relacionadas con la neovascularización ocular que comprende administrar a un sujeto de aproximadamente 1 mg / kg a aproximadamente 5 mg / kg en peso del sujeto un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Otra iteración más de este ejemplo se refiere a un método para tratar o prevenir enfermedades o afecciones relacionadas con la neovascularización ocular que comprende administrar a un sujeto de aproximadamente 3 mg / kg a aproximadamente 7 mg / kg en peso del sujeto un agente de unión a HPTPp-ECD o su sal farmacéuticamente aceptable.

Los programas de dosificación para la administración de un agente de unión a HPTPp-ECD incluyen, entre otros, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, tres veces, dos veces al mes, una vez al mes y una vez cada dos meses.

Además se describen métodos para tratar o prevenir una o más de las enfermedades o afecciones descritas anteriormente en este documento relacionadas con el edema ocular y / o la neovascularización que son el resultado de la administración de otro agente farmacéuticamente activo. Como tal, este aspecto se refiere a un método que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende: a) una cantidad eficaz de un agente de unión a HPTPp-ECD o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; b) uno o más agentes farmacéuticamente activos adicionales; y c) uno o más vehículos o excipientes compatibles.

Los métodos de la presente invención pueden combinarse con un estándar de cuidados, que incluye, entre otros, un tratamiento láser.

Los ejemplos no limitantes de agentes farmacéuticamente activos adecuados para la combinación con un agente de unión a HPTPp-ECD incluyen agentes antiinfecciosos, es decir, aminoglucósidos, antivirales, antimicrobianos, anticolinérgicos / antiespasmóticos, agentes antidiabéticos, agentes antihipertensivos, antineoplásicos, agentes cardiovasculares, agentes del sistema nervioso central, modificadores de la coagulación, hormonas, agentes inmunológicos, agentes inmunosupresores, preparaciones oftálmicas y similares.

El método descrito también se refiere a la administración de los agentes y composiciones descritos. La administración puede ser sistémica por vía subcutánea o administración i.v.; o el inhibidor de HPTP-p se administrará directamente al ojo, por ejemplo, local. Los métodos locales de administración incluyen, por ejemplo, gotas para los ojos, inyecciones o implantes subconjuntivales, inyecciones o implantes intravítreos, inyecciones o implantes sub-Tenon, incorporación en soluciones de irrigación quirúrgica, etc.

Los métodos descritos se refieren a la administración de un agente de unión a HPTPp-ECD como parte de una composición farmacéutica. Las composiciones adecuadas para la administración local son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Publ. 2005/0059639). En diversos ejemplos, las composiciones de la invención pueden comprender un líquido que comprenda un agente activo en solución, en suspensión, o ambos. Como se usa en este documento, las composiciones líquidas incluyen geles. En un ejemplo, la composición líquida es acuosa. Alternativamente, la composición puede tomar la forma de una pomada. En otro ejemplo, la composición es una composición acuosa gelificable in situ. Dicha composición puede comprender un agente gelificante en una concentración eficaz para promover la gelificación en contacto con el ojo o fluido lagrimal en el exterior del ojo. Las composiciones acuosas de la invención tienen pH y osmolalidad compatibles oftálmicamente. La composición puede comprender una formulación de depósito oftálmico que comprende un agente activo para la administración subconjuntival. Las micropartículas que comprenden el agente activo pueden incrustarse en un polímero biocompatible farmacéuticamente aceptable o un agente de encapsulación de lípidos. Las formulaciones de depósito pueden adaptarse para liberar todo o sustancialmente todo el material activo durante un período prolongado de tiempo. La matriz polimérica o lipídica, si está presente, puede adaptarse para degradarse lo suficiente como para ser transportada desde el sitio de administración después de la liberación de todo o sustancialmente todo el agente activo. La formulación de depósito puede ser una formulación líquida que comprenda un polímero farmacéuticamente aceptable y un agente activo disuelto o disperso. Tras la inyección, el polímero forma un depósito en el sitio de las inyecciones, por ejemplo, gelificando o precipitando. La composición puede comprender un artículo sólido que puede insertarse en una ubicación adecuada en el ojo, tal como entre el ojo y el párpado o en el saco conjuntival, donde el artículo libere el agente activo. Los artículos sólidos adecuados para la implantación en el ojo de tal manera generalmente comprenden polímeros y pueden ser bioerosionables o no bioerosionables. En un ejemplo de los métodos descritos, un sujeto humano con al menos un ojo con discapacidad visual se trata con 2-4000 gg de un agente de unión a HPTPp-ECD mediante inyección intravítrea. La mejora de los síntomas clínicos se controla mediante uno o más métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, oftalmoscopia indirecta, fotografía de fondo de ojo, angiopatía por fluoresceína, electrorretinografía, examen del ojo externo, biomicroscopia con lámpara de hendidura, tonometría de aplanamiento, paquimetría, tomografía de coherencia óptica y autorrefunción. Las dosis posteriores se pueden administrar semanal o mensualmente, por ejemplo, con una frecuencia de 2 a 8 semanas o de 1 a 12 meses de diferencia.

Los métodos descritos incluyen la administración de los agentes divulgados en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" significa un material que no es biológico o de otra manera indeseable, es decir, el material puede administrarse a un sujeto sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la formulación farmacéutica en la que está contenido. El portador se seleccionaría naturalmente para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como es bien sabido por cualquier experto en la materia. En otro aspecto, muchos de los agentes descritos pueden usarse profilácticamente, es decir, como un agente preventivo, puro o con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones líquidas iónicas descritas en el presente documento pueden formularse convenientemente en composiciones farmacéuticas compuestas de líquido iónico puro o en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Gennaro, AR. Ed., Mack Publishing, Easton Pa.

(1990), que describe vehículos típicos y métodos convencionales de preparación de composiciones farmacéuticas que pueden usarse junto con la preparación de formulaciones de los agentes descritos en este documento y que se incorpora por referencia en este documento. Tales portadores farmacéuticos, más típicamente, serían portadores estándar para la administración de composiciones a humanos y no humanos, incluyendo soluciones tales como agua estéril, solución salina y soluciones tamponadas a pH fisiológico. Se pueden administrar otros agentes de acuerdo con los procedimientos estándar utilizados por los expertos en la materia. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más ingredientes activos adicionales tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos y similares.

Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y más preferiblemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación sostenida tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen los agentes descritos, matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, liposomas, micropartículas o microcápsulas. Será evidente para los expertos en la materia que ciertos vehículos pueden ser más preferibles dependiendo, por ejemplo, de la ruta de administración y la concentración de la composición que se administre. Se pueden administrar otros agentes de acuerdo con los procedimientos estándar utilizados por los expertos en la materia.

Las formulaciones farmacéuticas pueden incluir vehículos adicionales, así como espesantes, diluyentes, tampones, conservantes, agentes tensioactivos y similares, además de los agentes descritos en este documento. Las formulaciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más ingredientes activos adicionales tales como agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, anestésicos y similares.

Para los fines de la presente divulgación, los términos "excipiente" y "vehículo" se usan indistintamente a lo largo de la descripción de la presente divulgación y dichos términos se definen en el presente documento como "ingredientes que se usan en la práctica de formular una composición farmacéutica segura y efectiva”.

El formulador comprenderá que los excipientes se usan principalmente para servir en la entrega de un producto farmacéutico seguro, estable y funcional, que sirva no solo como parte del vehículo general para la entrega sino también como un medio para lograr una absorción efectiva por parte del receptor del ingrediente activo. Un excipiente puede desempeñar un papel tan simple y directo como ser un relleno inerte, o un excipiente como se usa en el presente documento puede ser parte de un sistema estabilizador del pH. El formulador también puede aprovechar el hecho de que los agentes de la presente invención tengan una potencia celular mejorada y propiedades farmacocinéticas.

Los agentes descritos también pueden estar presentes en líquidos, emulsiones o suspensiones para el suministro de agentes terapéuticos activos. Las composiciones líquidas farmacéuticamente administrables pueden, por ejemplo, prepararse disolviendo, dispersando, etc., un agente activo como se describe en este documento y adyuvantes farmacéuticos opcionales en un excipiente, tal como, por ejemplo, agua, dextrosa acuosa salina, glicerol, etanol y otros, para formar una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica que se administrará también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, acetato de trietanolamina de sodio, oleato de trietanolamina, etc. Los métodos reales de preparación de tales formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en esta técnica, por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences, mencionado anteriormente.

Kits

También se describen kits que comprenden los agentes y las composiciones que se administrarán a un humano, mamífero o célula. Los kits pueden comprender una o más dosis unitarias envasadas de una composición que comprenda uno o más agentes para ser entregados a un ser humano, mamífero o célula. Las ampollas de dosificación unitaria o los envases multidosis, en los que los agentes que se van a suministrar se envasan antes de su uso, pueden comprender un envase herméticamente cerrado que encierra una dosis unitaria de la composición, o dosis unitarias múltiples. Los agentes se pueden empaquetar como una formulación estéril, y el recipiente herméticamente sellado está diseñado para preservar la esterilidad de la formulación hasta su uso.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Producción de proteína de dominio extracelular HPTPp

El ADNc de HPTPp de longitud completa (SEQ ID NO: 1) se clona de una biblioteca placentaria humana de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Origene). Un ADNc que codifica todo el dominio extracelular soluble (ECD) de HPTPp se clona por PCR a partir del ADNc de longitud completa que codifica los aminoácidos 1-1621 con un C-terminal His-His-His-His-His-His-Gly (6His-Gly) (SEQ ID N.°: 3). El ADNc resultante se clona en vectores de expresión de mamíferos para la expresión transitoria (pShuttle-CMV) o estable (pcDNA3.1 (-)) en células HEK293.

Para obtener HPTPp ECD purificada (pED), las células HEK293 transfectadas con un vector de expresión de pECD se incuban en suero sin OptiMEM (Gibco) durante 24 horas en condiciones normales de crecimiento. Los medios acondicionados se recuperan, se centrifugan para eliminar los desechos, y se agrega 1 ml de agarosa Ni-NTA lavada (Qiagen) (500 pL de material empaquetado) a cada 10 pL de medio retirado y se deja agitar suavemente durante la noche a 4°C. Al día siguiente, la mezcla se carga en una columna y se lava con 20 volúmenes de lecho de NaH2PO450 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8. La proteína de dominio extracelular HPTPp purificada (SEQ ID NO: 4) luego se eluye con 200 pL / elución en NaH2PO450 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, pH 8. Las fracciones se analizan para determinar el contenido de proteína usando electroforesis en gel de SDS-poliacrilimida de desnaturalización reductora y se detectan mediante tinción con plata (Invitrogen) y se confirman por espectrometría de masas.

Ejemplo 2

Generación de anticuerpos monoclonales contra el dominio extracelular de HPTPp

La proteína de dominio extracelular HPTPp purificada se produce, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Para la producción del inmunógeno de dominio extracelular HPTPp, la proteína de dominio 6-His extracelular HPTPp purificada se conjuga con tiroglobulina porcina (Sigma) usando química de acoplamiento EDC (Hockfield, S. et al., (1993) Cold Spring Habor Laboratory Press. Vol. 1 pp. 111-201, Immunocytochemistry). El conjugado resultante de dominio extracelular HPTPp-tiroglobulina se dializa contra PBS, pH 7,4. Los ratones adultos Balb / c se inmunizan luego por vía subcutánea con el conjugado (100-200 pg) y se completa el adyuvante de Freund en una mezcla 1:1. Después de 2-3 semanas, a los ratones se les inyecta intraperitonealmente o subcutáneamente con adyuvante de Freund incompleto y el conjugado en una mezcla 1:1. La inyección se repite a las 4-6 semanas. Se recolectan sueros de ratones 7 días después de la tercera inyección y se analiza su inmunorreactividad frente al antígeno de dominio extracelular HPTPp mediante ELISA y transferencia Western. Los ratones que muestran una buena respuesta al antígeno se estimulan con una única inyección intra-bazo con 50 pl de proteína de dominio extracelular HPTPp purificada mezclada 1:1 con hidróxido de aluminio usando una aguja extra larga de calibre 31 (Goding, JW, (1996) Monoclonal Antibodies: Principles and Practices. Third Edition, Academic Press Limited. pág. 145). Brevemente, los ratones se anestesian con 2,5% de avertina, y se crea una incisión de 1 centímetro en la piel y la pared oblicua izquierda del cuerpo. La mezcla de antígeno se administra insertando la aguja desde la porción posterior a la porción anterior del bazo en una inyección longitudinal. La pared del cuerpo se sutura y la piel se sella con dos pequeños clips metálicos. Los ratones son monitoreados para una recuperación segura. Cuatro días después de la cirugía, se extrae el bazo del ratón y se preparan suspensiones de células individuales para fusión con células de mieloma de ratón para la creación de líneas celulares de hibridoma (Spitz, M., (1986) Methods In Enzymology, vol. 121. Eds. John J, Lagone y Helen Van Vunakis. páginas. 33-41 (Academic Press, Nueva York, N.Y.)). Los hibridomas resultantes se cultivan en medio modificado de Dulbecco (Gibco) suplementado con suero de ternera fetal al 15% (Hyclone) e hipoxatina, aminopterina y timidina.

La detección de hibridomas positivos comienza 8 días después de la fusión y continúa durante 15 días. Los hibridomas que producen anticuerpos del dominio extracelular anti-HPTPp se identifican por ELISA en dos conjuntos de placas de 96 pocillos: una recubierta con el dominio extracelular HPTPp marcada con histidina y otra recubierta con una proteína MurA bacteriana marcada con histidina como control negativo. El anticuerpo secundario es un IgG anti-ratón de burro marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immunoresearch). La inmunorreactividad se controla en los pocillos utilizando el desarrollo del color iniciado por tabletas ABTS disueltas en tampón TBS, pH 7,5. Las mezclas de reacción de HRP individuales se terminan agregando 100 microlitros de SDS al 1% y leyendo la absorbancia a 405 nm con un espectrofotómetro. Los hibridomas que producen anticuerpos que interactúan con el dominio extracelular HPTPp-6His, y no con la proteína murA-6His, se usan para posteriores análisis. Las diluciones limitantes (0,8 células por pocillo) se realizan dos veces en clones positivos en placas de 96 pocillos, con la clonalidad definida con más del 99% de los pocillos con reactividad positiva. Los isotipos de anticuerpos se determinan utilizando la tecnología iso-strip (Roche). Para obtener anticuerpos purificados para una evaluación posterior, los sobrenadantes de cultivo de tejidos se purifican por afinidad usando una columna de proteína A o proteína G.

Se aislaron cinco anticuerpos monoclonales inmunorreactivos respecto a la proteína HPTPp-ECD y se les dio la siguiente nomenclatura, R15E6, R12A7, R3A2, R11C3, R15G2 y R5A8. Sobre la base de su reacción con la proteína HPTPp-ECD en ELISA y en transferencias Western, se seleccionó R15E6 para otros estudios.

Ejemplo 3

El anticuerpo monoclonal R15E6

El anticuerpo monoclonal R15E6 se identificó y caracterizó como se describe en el Ejemplo 2 de la presente solicitud y en la patente de EE.UU. No. 7.973.142; el procedimiento y los resultados se resumen a continuación.

A. R15E6 se une a HPTPp endógeno como lo demuestra la inmunoprecipitación.

Materiales: células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), medios EGM y solución neutralizadora de tripsina de Cambrex; OPTIMEM I (Gibco), albúmina de suero bovino (BSA; Santa Cruz), solución salina tamponada con fosfato (PBS; Gibco), factores de crecimiento que incluyen angiopoyetina 1 (Ang1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (R&D Systems), anticuerpo monoclonal Tie2 (Duke University / P & G^p), anticuerpo policlonal del receptor ^v E^g F 2 (VEGFR2) (Whitaker et. al), proteína A / G agarosa (Santa Cruz), sistema de electroforesis / transferencia de gel prefabricado con Tris-Glicina (6-8%) (Invitrogen), membranas de PVDF (Invitrogen), tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM, NaCl 137 mM, glicerol al 10%, tritón-X-100 al 1%, EDTA 2 mM, NaOH 1 mM, NaF 1 mM, P^m S^f 1 mM, 1 gg / ml de leupeptina, 1 gg / ml de pepstatina).

Método: Se pretrataron HUVEC durante 30 minutos con anticuerpo (en OPTIMEM) u OPTIMEM I solo. Después de la eliminación del pretratamiento, las células se trataron con Ang1 (100 ng / ml) durante 6 minutos en PBS BSA al 0,2% y se lisaron en tampón de lisis. Los lisados se procesaron directamente en un gel de Tris-Glicina o se inmunoprecipitaron con 2-5 gg / ml de anticuerpo Tie-2 o 10 gg / ml de anticuerpo R15E6 y proteína A / G agarosa. Las muestras inmunoprecipitadas se enjuagaron una vez con tampón de lisis y se hirvieron durante 5 minutos en 1 x tampón de muestra. Las muestras se resolvieron en un gel de Tris-Glicina, se transfirieron a una membrana de PVDF y se detectaron mediante transferencia Western usando los anticuerpos indicados (pTYR Ab (PY99, Santa Cruz), Tie-2, VEGFR2 y / o R15E6).

Resultados: Mediante transferencia de IP / Western, R15E6 reconoce una banda principal de alto peso molecular consistente con el tamaño de HPTPp (Figura 1, Panel A, Carril 2). Las bandas de menor peso molecular y menos intensas probablemente representan formas precursoras menos glicosiladas de HPTPp. Una inmunoprecipitación (IP) con control, IgG no inmune no muestra bandas en el rango de peso molecular de HPTPp (FIG. 1, Panel A, Carril 1), y una combinación de Tie2 / VEGFR2 IP muestra bandas del peso molecular esperado (FIG .1, Panel A, Carril 3). Este resultado demuestra que R15E6 reconoce y es específico para HPTPp.

B. R15E6 se une a HPTPp endógeno como lo demuestra el análisis FACS

Materiales: HUVEC, medios EGM y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; Anticuerpo secundario marcado con Alexfluor 488 de Molecular Probes; Solución salina equilibrada de Hanks (Gibco); Citómetro de flujo FACSCAN y software CellQuest de Becton Dickenson.

Método: Los HUVEC se tratan con tripsina, se tratan con solución neutralizante de tripsina y se enjuagan con HBSS. El anticuerpo R15E6 (0,6 gg) se agrega a 250.000 células en 50 gl de HBSS y se incuba en hielo durante 20 minutos. Las células se enjuagaron con 1 ml de HBSS seguido de la adición de 2 gg de anticuerpo secundario conjugado fluorescente durante 20 minutos en hielo. Las células fueron enjuagadas y resuspendidas en 1 ml de HBSS y luego analizadas en el citómetro de flujo FACSCAN con el software CellQuest. Las células de control se trataron solo con anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia.

Resultados: Mediante análisis FACS, HUVEC intactos, R15E6 provoca un fuerte cambio (> 90% de las células) en la señal de fluorescencia en comparación con el anticuerpo secundario solo (Figura 1, Panel B). Este resultado indica que R15E6 se une a HPTPp endógeno presentado en la superficie de las células endoteliales intactas.

Ejemplo 4

R15E6 mejora la activación de Tie2

R15E6 mejora la fosforilación de Tie2 en ausencia y presencia de la angiopoyetina 1 (Ang1), el ligando Tie2.

Métodos: Los HUVEC se cultivan en medio sin suero como se describió anteriormente en presencia o ausencia de diversas concentraciones de R15E6 y con o sin Ang1 añadido. Los lisados se preparan, se inmunoprecipitan con un anticuerpo Tie2, se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfieren a una membrana de PVDF. Las proteínas inmunoprecipitadas unidas a la membrana se transfieren en serie con un anticuerpo antifosfotirosina para cuantificar la fosforilación de Tie2 seguido de un anticuerpo Tie2 para cuantificar Tie2 total. La fosforilación de Tie2 se expresa como la relación de la señal de antifosfotirosina respecto a la señal de Tie2 total. Resultados: R15E6 mejora la fosforilación de Tie2 tanto en ausencia como en presencia de Ang1 (figura 2). Este resultado indica que la unión de R15E6 a HPTPp en la superficie de las células endoteliales modula su función biológica dando como resultado una mejor activación de Tie2 en ausencia o presencia de ligando.

Ejemplo 5

Generación de anticuerpos de dominio extracelular anti-VE-PTP

A. Producción de proteína de dominio extracelular VE-PTP de ratón (VE-PTP-ECD)

VE-PTP-ECD puede ser producido por cualquier método adecuado. Tales métodos son reconocidos en la técnica. Por ejemplo, VE-PTP-ECD puede producirse usando un método similar al Ejemplo 1 de la presente descripción donde se usa ADNc de VE-PTP-^eC^d en lugar de ADNc que codifica HPTPp-ECD. La SEQ ID NO: 7 proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica VE-PTP-ECD. La SEQ ID NO: 8 proporciona la secuencia de aminoácidos de VE-PTP-ECD.

B. Generación de anticuerpos contra VE-PTP ECD

Los anticuerpos anti-VE-PTP se generan fácilmente mediante métodos que son reconocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos anti VE-PTP pueden generarse usando el método del Ejemplo 2 de la presente descripción sustituyendo VE-PTP-ECD por el dominio extracelular HPTPp e inmunizando ratas con la proteína resultante. El Dr. D. Vestweber (mAb 109) proporcionó amablemente el anticuerpo VE-PTP antirratón de rata utilizado en los presentes estudios. El anticuerpo se generó como se describe en Baumer S. et al., Blood, 2006; 107: 4754-4762. Brevemente, el anticuerpo se generó inmunizando ratas con una proteína de fusión VE-PTP-Fc. La inmunización, la fusión de hibridoma y el cribado se realizaron como se describe en Gotsch U., et al., J Cell Sci. 1997, Vol. 110, pp.

583-588 y Bosse R. y Vestweber D., Eur J. Immunol. 1994, Vol. 24, pp. 3019-3024.

La proteína de fusión se construyó de manera que las primeras 8 repeticiones de tipo III de fibronectina que terminaban con el aminoácido prolina en la posición 732 de VE-PTP se fusionaron en marco con la parte Fc de IgG1 humana (comenzando con el aminoácido prolina en la posición 239). Esta construcción clonada en pcDNA3 (Invitrogen) se transfectó de forma estable en células CHO, y la proteína de fusión se purificó mediante purificación por afinidad de proteína A Sepharose.

Ejemplo 6

Inyecciones intravítreas de un anticuerpo ECD anti-VE-PTP

Modelo de neovascularización coroidea inducida por láser: se considera que el modelo de neovascularización coroidea representa un modelo de degeneración macular neovascular relacionada con la edad. Se generó NV coroidal como se describió anteriormente. Ver Tobe T, et al., Am. J. Pathol. 1998, Vol. 153, pp. 1641-1646. Los ratones adultos C57BL/6 tuvieron una ruptura inducida por láser de la membrana de Bruch en tres ubicaciones en cada ojo y luego se les inyectaron intravitrealmente 1 pL de 1 o 2 pg de un anticuerpo VE-PTP-ECD (IgG2a) en un ojo y vehículo (5% de dextrosa) en el otro ojo. Estos tratamientos se repitieron el día 7. Catorce días después del láser, los ratones se perfundieron con dextrano marcado con fluoresceína (2 x 106 de MW promedio, Sigma, St. Louis, MO) y se evaluó el grado de neovascularización en monturas planas coroidales mediante microscopía de fluorescencia. El área de CNV en cada sitio de ruptura de la membrana de Bruch se midió mediante análisis de imagen por un observador enmascarado con respecto al grupo de tratamiento. El área de CNV es el promedio de los tres sitios de ruptura en un ojo. Como se muestra en la FIG. 3, el tratamiento con el anticuerpo VE-PTP-ECD redujo significativamente la neovascularización coroidea en dosis de 1 y 2 pg versus el tratamiento con vehículo control. Ejemplo 7

Retinopatía Isquémica Inducida por Oxígeno

Se considera que el modelo de retinopatía isquémica inducida por oxígeno representa un modelo de retinopatía diabética proliferativa. La retinopatía isquémica se produjo en ratones C57BL/6 mediante un método descrito por Smith, L. E. H., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 101-111 (1994). Los ratones C57BL/6 en el día 7 postnatal (P7) y sus madres fueron colocados en una cámara hermética y expuestos a hiperoxia (75 ± 3% de oxígeno) durante cinco días. El oxígeno se monitorizó continuamente con un controlador de oxígeno modelo 110 PROOX (Reming Bioinstruments Co., Redfield, N.Y.). En P12, los ratones se devolvieron a una atmósfera ambiente y, bajo un microscopio de disección, se utilizó un sistema de microinyección con bomba de Harvard y pipetas de vidrio extraídas para administrar una inyección intravítrea de 1 pl de 1 o 2 pg de un anticuerpo VE-PTP-ECD en uno ojo y vehículo fueron inyectados en el otro ojo. El P17, el área de NV en la superficie de la retina se midió el P17 como se describió anteriormente. Ver Shen J, et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007, Vol. 48, pp. 4335-4341. En resumen, a los ratones se les administró una inyección intraocular de 1 pl que contenía 0,5 pg de anticuerpo PECAM de rata anti-ratón (Pharmingen, San José, CA). Doce horas después, los ratones fueron sacrificados, los ojos fijados en formol al 10%. Las retinas se diseccionaron, se incubaron durante 40 minutos en 1:500 de IgG anti-rata de cabra conjugada con Alexa488 (Invitrogen, Carlsbad, California), se lavaron y se montaron completamente. Un observador enmascarado con respecto al grupo de tratamiento examinó los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia Nikon y midió el área de NV por retina mediante análisis de imagen computarizado utilizando el software ImagePro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Md.). La Fig. 4 muestra que el tratamiento con el anticuerpo VE-PTP-ECD redujo significativamente la neovascularización retiniana en dosis de 1 y 2 pg versus el tratamiento con vehículo control. La Fig. 5 muestra montajes completos retinianos representativos de un ratón tratado con vehículo frente a un ratón tratado con 2 pg del anticuerpo VE-PTP-ECD. Ejemplo 8

Inyección subcutánea de un anticuerpo VE-PTP-ECD

El modelo de retinopatía isquémica inducida por oxígeno se realizó como se describe en el Ejemplo 7 (contención en una atmósfera de oxígeno al 75% de P5 a P12) para la dosificación intravítrea, excepto que el anticuerpo VE-PTP-ECD (1 mg / kg) se dosificó por vía subcutánea el P12 cuando los ratones regresaron a una atmósfera ambiente y nuevamente en los días P14 y P16 (tres dosis totales). La neovascularización se evaluó como se describe anteriormente el día (P17). La Fig. 6 muestra que la dosificación subcutánea del anticuerpo VE-PTP-ECD reduce el área de neovascularización retiniana.

Ejemplo 9

El experimento descrito en el Ejemplo 8 se repitió a una dosis subcutánea de 2 mg / kg. (FIG. 7)

Si bien se describen diversas realizaciones de esta descripción, es evidente que los ejemplos básicos pueden modificarse para proporcionar otras realizaciones que utilicen o abarquen el agente de unión a HPTPp-ECD, los métodos y los procesos de esta invención.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un agente de unión a HPTPp-ECD para su uso en la prevención de una enfermedad en el ojo de un sujeto, en el que el agente de unión a HPTPp-ECD es un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma ATCC No. PTA-7580 o una forma humanizada del mismo, en el que la enfermedad se previene mediante la reducción de la neovascularización y la enfermedad se selecciona entre retinopatía proliferativa y degeneración macular relacionada con la edad.

2. El agente de unión a HPTPp-ECD para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la retinopatía proliferativa es la retinopatía proliferativa diabética.

3. El agente de unión a HPTPp-ECD para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la retinopatía proliferativa se previene mediante la reducción de la neovascularización retiniana.

4. El agente de unión a HPTPp-ECD para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la degeneración macular relacionada con la edad se evita mediante la reducción de la neovascularización coroidea.

5. El agente de unión a HPTPp-ECD para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente de unión a HPTPp-ECD está conjugado a un vehículo.

6. El agente de unión a HPTPp-ECD para su uso según la reivindicación 5, en el que el vehículo es PEG.

7. El agente de unión a HPTPp-ECD para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el agente de unión a HPTPp-ECD es para la administración por inyección intraocular.

8. El agente de unión a HPTPp-ECD para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el agente de unión a HPTPp-ECD es para la administración por inyección subcutánea.

9. El agente de unión a HPTPp-ECD para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el agente de unión a HPTPp-ECD es para la administración por inyección intravenosa.