ES2750007T3

ES2750007T3 - Regulación descendente de la expresión génica en plagas de insectos

Info

Publication number: ES2750007T3
Application number: ES11776169T
Authority: ES
Inventors: Thierry Bogaert; Romaan Raemaekers; Yann Naudet
Original assignee: Devgen NV
Current assignee: Devgen NV
Priority date: 2010-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: EP2633048B1; AU2011322510A1; AU2018200332B2; US20180148737A1; WO2012055982A3; CA2815116A1; BR112013009803A2; MX345738B; EP2633048A2; US9944948B2; AU2016208418A1; RU2013124054A; MX2013004358A; PH12013500702A1; CN107287235B; US20210254093A1; ZA201302739B; US20130291188A1; US10941415B2; WO2012055982A2

Abstract

Un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la absorción por una especie de plagas de insectos para regular de forma descendente la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos, en donde el gen diana (i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o que tienen una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan óptimamente, es al menos 85% idénticos a cualquiera de las SEQ ID NO 277, 138, 253 y 152 o (ii) es un ortólogo de plagas de insectos de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253 y 152, en donde los dos genes ortólogos son similares en secuencia en tal grado que cuando los dos genes son alineados y comparados de manera óptima, el ortólogo tiene una secuencia que es al menos 85% idéntica a cualquiera de las secuencias representadas por las SEQ ID NOs 277, 138, 253 y 152; en donde dicho ARN interferente comprende al menos un elemento silenciador, en el que el elemento silenciador es una región de ARN de doble cadena que comprende cadenas complementarias reasociadas, una de las cuales comprende una secuencia de al menos 21 nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro dicho gen diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Regulación descendente de la expresión génica en plagas de insectos

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al control genético de infestación por parte de especies de plagas de insectos, particularmente a la prevención y/o el control de infestación por parte de plagas de plantas. Más específicamente, la invención se refiere a la regulación descendente de la expresión de genes diana en especies de plagas de insectos por parte de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) interferente. También se proporcionan plantas transgénicas que (i) expresan o son capaces de expresar ARN interferentes de la invención y (ii) son resistentes a la infestación por parte de especies de plagas de insectos. También se describen composiciones que contienen las moléculas de ARN interferente de la invención para su uso en aplicaciones tópicas en plantas o en el entorno que las rodea.

Antecedentes de la invención

Existe abundancia de especies de plagas de insectos que pueden infectar o infestar una amplia variedad de entornos y organismos hospedadores. Plagas de insectos incluyen una diversidad de especies de los Órdenes de insectos Hemiptera (insectos verdaderos), Coleóptera (escarabajos), Siphonaptera (pulgas), Dichyoptera (cucarachas y mantis), Lepidoptera (polillas y mariposas), OrthopteraOrthoptera (p. ej., saltamontes) y Diptera (moscas verdaderas). La infestación por parte de plagas puede dar lugar a daños significativos. Las plagas de insectos que infestan especies de plantas son particularmente problemáticas en la agricultura, ya que pueden causar daños serios a cultivos y reducir significativamente las cosechas de las plantas. Una amplia gama de diferentes tipos de plantas son susceptibles a la infestación por parte de plagas, incluyendo cultivos comerciales tales como arroz, algodón, soja, patata y maíz.

Tradicionalmente, la infestación con plagas de insectos se ha prevenido o controlado mediante el uso de plaguicidas químicos. Sin embargo, estos productos químicos no siempre son adecuados para su uso en el tratamiento de cultivos, ya que pueden ser tóxicos para otras especies y pueden provocar daño significativo al medio ambiente. A lo largo de las décadas más recientes, los investigadores han desarrollado métodos más ecológicos para controlar la infestación por parte de plagas. Por ejemplo, se han utilizado microorganismos, tales como la bacteria Bacillus thuringiensis que expresan de forma natural proteínas tóxicas para las plagas de insectos. Los científicos también han aislado los genes que codifican estas proteínas insecticidas y los han utilizado para generar cultivos transgénicos resistentes a las plagas de insectos, p. ej., plantas de maíz y algodón genéticamente modificadas para producir proteínas de la familia Cry.

Si bien las toxinas bacterianas han sido sumamente exitosas para controlar ciertos tipos de plagas, no son eficaces contra todas las especies de plagas. Por lo tanto, los investigadores han buscado otros enfoques más específicos para el control de plagas y, en particular, para ARN interferente o el "silenciamiento génico" como un medio para controlar las plagas a nivel genético.

La interferencia de ARN o 'ARNi' es un proceso mediante el cual la expresión de genes en el contexto de una célula u organismo entero es regulado de forma descendente de una manera específica para la secuencia. La ARNi actualmente es una técnica bien establecida en la técnica de inhibición o regulación descendente de la expresión de genes en una amplia gama de organismos, incluyendo organismos de plagas, tales como hongos, nematodos e insectos. Además, estudios previos han demostrado que la regulación descendente de genes diana en especies de plagas de insectos puede utilizarse como medio para controlar la infestación por parte de plagas.

El documento WO2007/074405describe métodos para inhibir la expresión de genes diana en plagas de invertebrados, incluido el escarabajo de la patata de Colorado. El documento WO2005/110068 describe métodos para inhibir la expresión de genes diana en plagas de invertebrados, incluyendo en particular el gusano de la raíz del maíz occidental como un medio para controlar la infestación de insectos. Además, el documento WO2009/091864 describe composiciones y métodos para la supresión de genes diana de especies de plagas de insectos, incluidas las plagas del género Lygus.

Si bien el uso de ARNi para regular de forma descendente la expresión de genes en especies de plagas es bien conocido en la técnica, el éxito de esta técnica como medida para controlar las plagas depende de la selección de los genes diana más apropiados, concretamente aquellos en los que la pérdida de función provoca una alteración significativa en un proceso biológico esencial y/o la muerte del organismo. La presente invención, por tanto, está dirigida a la regulación descendente de genes diana particulares en plagas de insectos como medio para alcanzar una prevención y/o control más eficaces de la infestación por parte de plagas de insectos, particularmente de plantas.

Sumario de la invención

Los autores de la presente invención buscaron identificar medios mejorados para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas de insectos utilizando estrategias genéticas. En particular, investigaron el uso de la ARNi para regular de forma descendente genes de tal forma que se altere la capacidad de la plaga de insectos de sobrevivir, crecer, colonizar ambientes específicos y/o infestar organismos hospedadores y así limitar el daño causado por la plaga.

Se ha encontrado ahora que la regulación descendente mediada por ARNi de genes diana específicos, individualmente o en combinación, dentro de especies de plagas de insectos puede usarse como un medio eficaz para controlar la infestación de plagas.

En una realización, la presente invención se refiere a un ácido ribonucleico interferente (ARN o ARN de doble cadena) que inhibe o regula de forma descendente la expresión de un gen diana que codifica una proteína ribosomal de insectos L19 (p. ej., un ortólogo de insectos de la proteína CG2746 Dm).

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un ácido ribonucleico interferente (ARN o ARN de doble cadena) que funciona tras la absorción por una especie de plagas de insectos para regular de forma descendente la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos, en donde el gen diana

1. (i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o que tienen una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan óptimamente, es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos a cualquiera de las SEQ ID NO 277, 138, 253, 152 o

2. (ii) es un ortólogo de plagas de insectos de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, en donde los dos genes ortólogos son similares en secuencia en tal grado que cuando los dos genes son alineados y comparados de manera óptima, el ortólogo tiene una secuencia que es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias representadas por las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152;

en donde dicho ARN interferente comprende al menos un elemento silenciador, en el que el elemento silenciador es una región de ARN de doble cadena que comprende cadenas complementarias reasociadas, una de las cuales comprende una secuencia de al menos 21 nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro dicho gen diana.

En un aspecto particular de la invención, las moléculas de ARN interferente de la presente invención comprenden al menos una región bicatenaria, típicamente el elemento de silenciamiento del ARN interferente, que comprende una cadena de ARN codificante hibridada mediante formación de pares de bases complementarias a una cadena de ARN no codificante, donde la cadena codificante de la molécula de ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana.

En una realización, la presente invención se refiere a una molécula de ARN interferente que comprende al menos una región de doble cadena, típicamente el elemento de silenciamiento de la molécula de ARN interferente, que comprende una cadena de ARN sentido reasociada por apareamiento de bases complementaria a una cadena de ARN antisentido, en donde la cadena sentido de la molécula de ARNdc comprende una secuencia de al menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 9001000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos, es decir, al menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% complementarios a una secuencia de nucleótidos ubicados dentro del transcrito de ARN de un gen diana que codifica una proteína ribosómica de insecto L19 (p. ej., un ortólogo de insecto de la proteína CG2746 Dm).

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

1. (i) un polinucleótido que comprende al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152 o

2. (ii) un polinucleótido que consiste en al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152 o

3. (iii) un polinucleótido que comprende al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23 o 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representado en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, que, cuando las dos secuencias están óptimamente alineadas y comparadas, dicho polinucleótido es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntico a cualquiera de las SeQ ID NOs 277, 138, 253, 152 o

4. (iv) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23 o 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de un nucleótido representado en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, y en el que dicho fragmento o dicho complemento tiene una secuencia de nucleótidos que, cuando dicho fragmento se alinea de manera óptima y se compara con el fragmento correspondiente en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, dicha secuencia de nucleótidos es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a dicho fragmento correspondiente de cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152 o

5. (v) un polinucleótido que consiste en un fragmento de al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23 o 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de un nucleótido representado en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, y en el que dicho fragmento o dicho complemento tiene una secuencia de nucleótidos que, cuando dicho fragmento se alinea de manera óptima y se compara con el fragmento correspondiente en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, dicha secuencia de nucleótidos es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a dicho fragmento correspondiente de cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152

y

en donde dicho polinucleótido no tiene más de 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.

En un aspecto particular de la invención, el polinucleótido aislado es parte de una molécula de ARN interferente, típicamente parte del elemento silenciador, que comprende al menos una región de doble cadena que comprende una cadena de ARN sentido reasociada por apareamiento de bases complementarias a una cadena de ARN antisentido, en donde la cadena sentido de la molécula de ARNdc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana. Más particularmente, el polinucleótido aislado se clona en una construcción de ADN en una orientación sentido y antisentido, de modo que tras la transcripción del polinucleótido sentido y antisentido se forma una molécula de ARNdc, que funciona tras la absorción por una plaga para inhibir o regular de forma descendente la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga.

En una realización, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que se clona en una construcción de ADN en una orientación sentido y antisentido, de modo que tras la transcripción del polinucleótido sentido y antisentido se forma una molécula de ARNdc, que funciona tras la absorción por un insecto para inhibir o regular de forma descendente la expresión de un gen diana que codifica una proteína ribosómica de insecto L19 (p. ej., un ortólogo de insecto de la proteína CG2746 Dm).

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición para prevenir y/o controlar la infestación por plagas de insectos que comprende al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente y al menos un soporte, excipiente o diluyente, en donde el ARN interferente funciona tras la absorción por la plaga para regular de forma descendente la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga, en donde el gen diana

2. (ii) es un ortólogo de plagas de insectos de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, en donde los dos genes ortólogos son similares en secuencia en tal grado que cuando los dos genes son alineados y comparados de manera óptima, el ortólogo tiene una secuencia que es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias representadas por las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para la expresión de regulación de forma descendente de un gen diana en una especie de plaga de insectos, que comprende poner en contacto dicha especie de plaga de insectos con una cantidad eficaz de al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente o una cantidad efectiva de una composición que comprende al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente y al menos un soporte, excipiente o diluyente adecuado, en donde el ARN interferente funciona tras ser absorbido por la plaga para regular de forma descendente la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga, y en donde el gen diana 1. (i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o que tienen una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan óptimamente, es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos a cualquiera de las SEQ ID NO 277, 138, 253, 152 o

Preferiblemente, el método de la invención encuentra aplicación práctica en la prevención y/o el control de la infestación por plagas de insectos, en particular, el control de la infestación por plagas de plantas de cultivo, tales como, pero no limitadas a arroz, algodón, fresas, cultivos de semillas tales como alfalfa, soja, patata, tomate, canola, girasol, sorgo, mijo perla, maíz, berenjena, pimienta y tabaco. Además, el ARN interferente de la invención puede introducirse en las plantas a proteger mediante técnicas de ingeniería genética de rutina.

Por lo tanto, de acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método para generar una planta transgénica resistente a la infestación por una especie de plaga de insectos, que comprende:

1. (a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha especie de plaga de insectos, donde el gen diana

2. (b) regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada; y

3. (c) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión del ARN interferente de la construcción de ADN recombinante, siendo dicha planta, por tanto, resistente a dicha plaga en comparación con una planta sin transformar.

De acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona una planta transgénica, o material de reproducción o propagación para una planta transgénica o una célula vegetal transgénica cultivada, que expresa o es capaz de expresar al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la absorción por una especie de plaga de insectos para regular de forma descendente la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga, en donde el gen diana

1. (i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o que tienen una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan óptimamente, es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos a cualquiera de las SEQ ID NO 277, 138, 253, 152

En una realización, la presente invención se refiere a una planta transgénica o célula vegetal que comprende un ácido nucleico (ARN o ARN de doble cadena) interferente que es al menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% complementario a una parte de al menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 9001000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos o la totalidad de un ARNm que codifica una proteína ribosómica de insecto L19 (p. ej., un ortólogo de insecto de la proteína CG2746 Dm) y en donde el ácido nucleico interferente inhibe o interfiere con la traducción de dicho ARNm y en donde la planta o célula vegetal es resistente al insecto en comparación con una planta no transformada.

Breve descripción de las Tablas y las Figuras

Tabla 1 Secuencias de polinucleótidos de genes diana identificados en Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado, CPB).

Tabla 2 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado, CPB).

Tabla 3 Secuencias de polinucleótidos de genes diana identificados en Lygus hesperus.

Tabla 4 Secuencias de aminoácidos de genes diana identificados en Lygus hesperus.

Tabla 5 ARNdcs (cadena sentido representada por una secuencia de ADN equivalente) correspondiente a genes diana de Leptinotarsa decemlineata.

Tabla 6 ARNdcs (cadena sentido representada por una secuencia de ADN equivalente) correspondiente a genes diana de Lygus hesperus.

Tabla 7 Efectos de los ARNdcs derivados de diferentes genes diana en el tiempo necesario para matar el 50% (LT⁵⁰) de las larvas de CPB, expresados como relaciones frente al efecto de un ARNdc derivado del gen diana Ld248 de referencia (SEQ ID NO 40).

Tabla 8 Efectos de los ARNdcs derivados de diferentes genes diana en el tiempo necesario para matar el 50% (LT⁵⁰) de adultos de CPB, expresados como relaciones frente al efecto de un ARNdc derivado del gen diana Ld248 de referencia (SEQ iD NO 40).

Tabla 9 Efectos de los ARNdcs derivados de diferentes genes diana en la producción de huevos de CPB. Abreviaturas: EM, masas de huevo normales; SE, huevos individuales; YS, mancha amarilla; ninguno, sin huevos.

Tabla 10 Análisis de supervivencia de ARNdcs diana frente a ARNdcs de GFP en presencia de ARNt en un ensayo de alimentación de ninfas de Lygus hesperus. El test de Log-rank utilizado para someter a ensayo las diferencias entre las curvas de supervivencia del ARNdc diana (o solo la dieta) y el ARNdc de la g Fp generado utilizando estimaciones de Kaplan-Meier.

Tabla 11 Clasificación de diferentes genes diana de acuerdo con la potencia.

Tabla 12 Comparación de curvas de supervivencia de dianas de ensayo a 0,1, 0,05 o 0,025 |jg/|jL con ARNdc de la GFP a 0,1 jg /jL . Las estadísticas se realizaron sobre los datos representados gráficamente en la Figura 5. *** valor P < 0,001; ** 0,001 < valor P < 0,01; * 0,01 < valor P < 0,05; ns: no significativo, valor P > 0,05.

Tabla 13 Dianas de Lygus para los que se clonaron ADNcs de longitud completa.

Tabla 14 Secuencias de polinucleótidos de longitud completa de genes diana identificados en Lygus hesperus.

Tabla 15 Secuencias de aminoácidos correspondientes a ADNcs de longitud completa de genes diana identificados en Lygus hesperus.

Figura 1 Efectos de ARNdcs derivados de diferentes genes diana sobre la supervivencia y la aptitud de adultos de CPB. Para cada uno de los genes diana investigados, 10 escarabajos adultos jóvenes fueron alimentados individualmente con discos de hoja de patata tratados con ARNdc diana (un total de 10 jg de ARNdc) durante las primeras 24 horas y luego se colocaron juntos en el follaje de patata no tratado. Los números de insectos muertos o moribundos se evaluaron a lo largo de un período de 14 días. Los datos se presentan como porcentaje de mortalidad o morbilidad. ARNdc de la GFP (SEQ ID NO 245) se utilizó como control. ARNbc de Ld105 (SEQ ID NO 39), ARNbc de Ld248 (SEQ ID NO 40), ARNbc de Ld516 (SEQ ID NO 29), ARNbc de Ld511 (SEQ ID NO 36), ARNbc de Ld512 (SEQ ID NO 37), ARNbc de Ld513 (SEQ ID NO 22), ARNbc de Ld520 (SEQ ID NO 24), ARNbc de Ld537 (SEQ ID NO 25), ARNbc de Ld563 (SEQ ID NO 38), ARNbc de Ld579 (SEQ ID NO 30).

Figura 2 Curvas de supervivencia para ninfas de Lygus hesperus expuestas a 0,5 jg / jL de ARNdc diana en presencia de 5 jg / jL de ARNt de levadura en un ensayo de alimentación. (a) Dianas Dianas Lh520 (SEQ ID NO 143), Lh423 (SEQ ID NO 152), Lh537 (SEQ ID NO 144), (b) : Dianas Lh504,2 (SEQ ID NO 142), Lh512 (SEQ ID NO 153), Lh334 (SEQ ID NO 145), (c) : Dianas Lh300,1 (SEQ ID NO 151), Lh327 (SEQ ID NO 146), Lh332 (SEQ ID NO 148), (d) : Lh237 (SEQ ID NO 149), Lh579 (SEQ ID NO 147), Lh261 (SEQ ID NO 150), Lh513 (SEQ ID NO 141). ARNbc de GFP más ARNt de levadura a las mismas concentraciones, respectivamente, y tratamientos de dieta solamente se utilizaron como controles. Ninfas jóvenes fueron expuestas cada una a 25 jL de una dieta de sacarosa al 15% con o sin componentes de ensayo incorporados durante tres días antes de transferirlas a una dieta Bioserv de 50 jL. La dieta compleja se actualizó el día 7. Para todos los tratamientos, n = 24.

Figura 3 Curvas de supervivencia para ninfas de Lygus hesperus expuestas a 0,5 pg/pL de ARNdc diana en presencia de 5 pg/pL de ARNt de levadura en un ensayo de alimentación., en donde las dianas se agrupan en A, B, C, D de acuerdo con la potencia. Configuración descrita como en la Figura 2.

Figura 4 Curvas de supervivencia a lo largo del tiempo de ninfas de Lygus hesperus expuestas a concentraciones más bajas (de 0,5 a 0,1 pg/pL) de ARNdc diana nuevo en presencia de ARN de transferencia de levadura (5 pg/pL) en bioensayos de alimentación. Cada uno de los tratamiento en un bioensayo consistía en 24 ninfas de un día de edad colocadas individualmente en cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Cada una de las ninfas se expuso a una bolsita de parafilm que contenía los ácidos ribonucleicos en una solución de sacarosa al 15% durante un tiempo de 3 días. En los días 3 y 7, las dietas fueron reemplazadas por una dieta reciente de cría (Bioserv). Los siguientes controles se incluyeron en los ensayos: ARNdc de la GFP y dieta solamente.

Figura 5 Curvas de supervivencia a lo largo del tiempo de ninfas de Lygus hesperus expuestas a concentraciones más bajas (de 0,1 a 0,025 pg/pL) de ARNdc diana nuevo en presencia de ARN de transferencia de levadura (5 pg/pL) en bioensayos de alimentación. Configuración descrita de manera similar en la Figura 4.

Figura 6 Curvas de supervivencia a lo largo del tiempo de ninfas de Lygus hesperus expuestas a 0,5 pg/pL de ARNdc diana en presencia de ARN de transferencia de levadura (5 pg/pL) en bioensayos de alimentación. ARNdc diana sometido a ensayo: Lh105,2 (SEQ ID NO 254), Lh248,2 (SEQ ID NO 255), Lh248,3 (SEQ ID NO 256), Lh327 (SEQ ID NO 146) y Lh300 (SEQ ID NO 151) Configuración descrita de manera similar en la Figura 4.

Figura 7 Representación esquemática del vector de expresión de plantas que alberga el casete ARNhp de Lygus hesperus. RB: límite derecho; LB: límite izquierdo; P35S: Promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor; T35S: terminador de 35S del virus del mosaico de la coliflor; TNOS: terminador de la nopalina sintasa; GFP: gen indicador fluorescente verde; NPT II: secuencia codificante del gen de la neomicina fosfotransferasa II; KmR: gen de resistencia a kanamicina; pBR322 ori: origen de replicación de pBR322; pBR322 bom: movilización de pBR322; pVS1 rep: replicón de pVS1; pVS1 sta: elemento de estabilidad de pVS1.

Figura 8: Configuración de ensayo de patata Lygus in planta Las flechas blancas indican los daños por los insectos.

Figura 9 Ensayos de alimentación de Lygusen patatas transgénicas, que expresan la horquilla Lh423. Tasa de supervivencia de ninfas de Lygus que se alimentan de patatas transgénicas que llevan la horquilla Lh423 (P006/XX) o una horquilla ^{G u S}(P001/XX). Patatas de tipo salvaje (WT) también se utilizaron como control.

Figura 10 Ensayos de alimentación de Lygusen patatas transgénicas positivas, que expresan la horquilla Lh423. Tasa de supervivencia de ninfas de Lygus que se alimentan de patatas transgénicas que llevan la horquilla Lh423 (P006/59, P006/29 y P006/22) o una horquilla GUS (P001/19, P001/28). Patatas de tipo salvaje (WT) también se utilizaron como control. Resultados del análisis estadístico, basados en el análisis de curva de supervivencia GraphPad. ***= P < 0,001; *= 0,01 < P < 0,05.

Descripción detallada de la invención

Los autores de la presente invención han descubierto que la regulación descendente de la expresión de genes diana particulares en especies de plagas de insectos mediante ARNi puede utilizarse para prevenir y/o controlar de modo eficaz la infestación por parte de dichas plagas de insectos. Como se utiliza en esta memoria, el término "control" de la infestación de plagas se refiere a cualquier efecto sobre una plaga que sirva para limitar y/o reducir el número de organismos de la plaga y/o el daño provocado por la plaga. Los genes diana preferidos son, por lo tanto, genes esenciales que controlan o regulan una o más funciones biológicas esenciales dentro de la plaga de insectos, por ejemplo, división celular, reproducción, metabolismo energético, digestión, función neurológica y similares. La regulación descendente de estos genes esenciales mediante técnicas de ARNi puede conducir a la muerte del insecto, o de otra forma retardar de modo significativo el crecimiento y desarrollo o deteriorar la capacidad de la plaga de colonizar un ambiente o infestar organismos hospedadores.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona un ácido ribonucleico (ARN o ARN de doble cadena) interferente que funciona tras la absorción por una especie de plagas de insectos para regular de forma descendente la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos.

Como se utiliza en esta memoria, un "gen diana" comprende cualquier gen en la plaga de insectos que se tiene la intención de regular de forma descendente. En una realización preferida, el gen diana se regula de forma descendente con el fin de controlar la infestación por parte de la plaga, por ejemplo, alterando un proceso biológico esencial de la plaga, o disminuyendo la patogenicidad de la plaga. Genes diana preferidos incluyen, por lo tanto, aunque sin limitación, aquellos que juegan papeles clave en la regulación de la alimentación, supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción, infestación e infectividad. De acuerdo con una realización, el gen diana es tal que cuando su expresión se regula de forma descendente o se inhibe, la plaga de insectos muere. De acuerdo con una realización, el gen diana es tal que cuando su expresión está regulada de forma descendente o es inhibida, se previene el crecimiento de la plaga o se retarda o atrofia o retrasa o impide la reproducción de la plaga. De acuerdo con otra realización de la invención, el gen diana es tal que cuando su expresión se regula de forma descendente o se inhibe, se reduce el daño causado por la plaga y/o la capacidad de la plaga de infectar o infestar ambientes, superficies y/o especies de plantas o cultivos; o la plaga deja de alimentarse de sus recursos alimenticios naturales tales como plantas y productos de las plantas. Los términos "infestar" e "infectar" o "infestación" e "infección" generalmente se utilizan indistintamente en todas partes.

Los genes diana pueden expresarse en todas o algunas de las células de la plaga de insectos. Además, los genes diana pueden expresarse solamente por la plaga de insectos en una etapa particular de su ciclo vital, por ejemplo, la fase de adulto maduro, la fase de ninfa o larva inmadura o la etapa de huevos.

En aspectos específicos, la presente divulgación proporciona genes diana que codifican proteínas implicadas en la función de un proteasoma (subunidad o partícula reguladora), proteína ribosomal, el transporte intracelular de proteínas, vesícula COPI (complejo de coen proteína), el proceso de modificación de proteínas, actividad del activador del citoesqueleto, ATPasa o GTPasa (especificado en las Tablas 7 y 8).

En realizaciones preferidas, la presente invención proporciona genes diana seleccionados del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o que tiene una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias están óptimamente alineado y se comparan, es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntico a cualquiera de las SEQ iD NOs 277, 138, 253, 152, o que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138 , 253, 152, o que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento de al menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o gen que es un ortólogo de plaga de insectos de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, en donde los dos genes ortólogos son similares en secuencia en un grado tal que cuando los dos genes están óptimamente alineados, y se comparan, el ortólogo tiene una secuencia que es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias representadas por las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152; y en donde la secuencia de nucleótidos de dicho gen no es más larga que 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "identidad de secuencia" se utiliza para describir la relación de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias alineadas óptimamente a lo largo de una ventana de comparación (un número definido de posiciones), en el que la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia para lograr un alineamiento óptimo. El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece una base de nucleótido o un residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones 'emparejadas', dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100. Para la comparación de dos secuencias alineadas de manera óptima, la ventana de comparación estará determinada por la longitud total de las regiones alineadas. Los métodos y programas informáticos para determinar la identidad de secuencia están disponibles en la técnica e incluyen el software Blast y el análisis GAP. Para ácidos nucleicos, el porcentaje de identidad se calcula preferiblemente mediante la herramienta de alineación BlastN, con la cual se calcula el porcentaje de identidad en la totalidad de la longitud de la secuencia de nucleótidos de consulta.

Una persona experta en la técnica reconocerá que pueden ser identificados homólogos u ortólogos (homólogos existentes en diferentes especies) de los genes diana representados por cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152. Estos homólogos y/u ortólogos de plagas también están dentro del alcance de la presente invención. Homólogos y/u ortólogos preferidos son genes de secuencia similar en un grado tal que cuando los dos genes están óptimamente alineados y son comparados, el homólogo y/u ortólogo tiene una secuencia que es al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% o 95 %, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99% idéntico a cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152.

Otros homólogos son genes que son alelos de un gen que comprende una secuencia como la representada por cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152. Homólogos preferidos son genes que comprende al menos un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en comparación con un gen que comprende una secuencia representada por cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152.

El 'ácido ribonucleico (ARN) interferente' de la presente invención abarca cualquier tipo de molécula de ARN capaz de regular de forma descendente o 'silenciar' la expresión de un gen diana, incluyendo, pero no limitado a detectar ARN sentido, ARN antisentido, ARN interferente corto (ARNic), microARN (ARNmi), ARN de doble cadena (ARNdc), ARN de horquilla corto (ARNsh) y similares. Métodos para evaluar moléculas funcionales de ARN interferente son bien conocidos en la técnica y se describen en otras partes de esta memoria.

Las moléculas de ARN interferente de la presente invención efectúan la regulación de forma descendente específica de las secuencias de la expresión de un gen diana mediante la unión a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana. La unión se produce como resultado del apareamiento de pares de bases entre regiones complementarias del ARN interferente y la secuencia de nucleótidos diana. Como se utiliza en esta memoria, la expresión "elemento silenciador" se refiere a la porción o región del ARN interferente que comprende o que consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria, o al menos parcialmente complementaria, a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana, y que funciona como la porción activa del ARN interferente para dirigir la regulación de forma descendente de la expresión de dicho gen diana. En una realización de la invención, el elemento silenciador comprende o consiste en una secuencia de al menos 21 nucleótidos contiguos, incluso más preferiblemente de al menos 22, 23, 24 o 25 nucleótidos contiguos complementarios a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana.

Como se utiliza en esta memoria, "expresión de un gen diana" se refiere a la transcripción y acumulación del transcrito de ARN codificado por un gen diana y/o la traducción del ARNm en proteína. La expresión 'regular de forma descendente' se refiere a cualquiera de los métodos conocidos en la técnica mediante los cuales las moléculas de ARN interferente reducen el nivel de transcripciones de ARN primario, ARNm o proteína producida a partir de un gen diana. En ciertas realizaciones, la regulación de forma descendente se refiere a una situación en la que el nivel de ARN o proteína producida a partir de un gen se reduce al menos un 10%, preferiblemente al menos un 33%, más preferiblemente al menos un 50%, aún más preferiblemente al menos un 80%. En realizaciones particularmente preferidas, la regulación de forma descendente se refiere a una reducción en el nivel de ARN o proteína producida a partir de un gen al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, y aún más preferiblemente al menos un 99% dentro de las células de la plaga de insectos en comparación con una plaga de insectos de control apropiada que, por ejemplo, no se ha expuesto a un ARN interferente o se ha expuesto a una molécula de ARN interferente de control. En la técnica se conocen bien los métodos para detectar reducciones en los niveles de ARN o proteína e incluyen hibridación en solución de ARN, hibridación de tipo Northern, transcripción inversa (p. ej., análisis por RT-PCR cuantitativa), análisis de micromatrices, unión de anticuerpos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y transferencia Western. En otra realización de la invención, la regulación de forma descendente se refiere a una reducción en los niveles de ARN o proteína suficiente para provocar un cambio detectable en un fenotipo de la plaga en comparación con un control de plaga apropiado, por ejemplo, muerte celular, detención del crecimiento o similares. La regulación de forma descendente puede medirse, por tanto, mediante análisis fenotípico de la plaga de insectos utilizando técnicas de rutina en la técnica.

En una realización preferida de la invención, el ARN interferente regula de forma descendente la expresión de genes por interferencia de ARN o ARNi. El ARNi es un proceso de regulación génica específica de secuencia típicamente mediada por moléculas de ARN de doble cadena tales como ARNs interferentes pequeños (ARNip). Los ARNip comprenden una cadena de ARN codificante reasociada por apareamiento de bases complementarias con una cadena de ARN no codificante. La cadena sentido o 'cadena guía' de la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos localizados dentro del transcrito de ARN del gen diana. La cadena codificante del ARNip es capaz, por lo tanto, de hibridar con el transcrito de ARN mediante apareamiento de pares de bases de Watson-Crick y de fijar como objetivo el ARN para su degradación dentro de un complejo celular conocido como el complejo del silenciamiento inducido por ARNi o RISC. Por tanto, en el contexto de las moléculas preferidas de ARN interferente de la presente invención, el elemento silenciador como se menciona en esta memoria puede ser una región de doble cadena que comprende cadenas complementarias reasociadas, de las cuales al menos una cadena comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es complementaria o al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana. En una realización, la región de doble cadena tiene una longitud de al menos 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 pares de bases.

También se contemplan dentro del alcance de la presente invención moléculas de ARN de doble cadena (ARNdc) más largas que comprenden uno o más elementos silenciadores de doble cadena funcionales como se describe en otras partes en esta memoria y capaces de lograr el silenciamiento de genes mediado por ARNi. Dichas moléculas de ARNdc más largas comprenden al menos 80, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000 o 1100 pares de bases. Estas moléculas de ARNdc pueden servir como precursores para las moléculas de ARNip activas que dirigen el transcrito de ARN al complejo RISC para la posterior degradación. Las moléculas de ARNdc presentes en el entorno que rodea a un organismo o las células del mismo pueden captarse por el organismo y procesarse por una enzima llamada Dicer para producir moléculas de ARNip. De forma alternativa, el ARNdc puede producirse in vivo, es decir, transcribirse de un polinucleótido o polinucleótidos que codifican el mismo, presente dentro de una célula, por ejemplo, una célula bacteriana o célula vegetal, y a continuación procesarse mediante Dicer dentro de la célula hospedadora o preferiblemente dentro de las células de la plaga de insectos tras la captación del precursor de ARNdc más largo. El ARNdc puede estar formado por dos cadenas de ARN (codificante y no codificante) separadas que hibridan en virtud de la formación de pares bases complementarios. Alternativamente, el ARNdc puede ser una cadena sencilla que es capaz de plegarse sobre sí mismo para formar un ARN de horquilla corto (ARNsh) o una estructura de tallo-bucle. En el caso de un ARNsh, la región de doble cadena o 'tallo' se forma a partir de dos regiones o segmentos del ARN que son repeticiones esencialmente invertidas entre sí y poseen una complementariedad suficiente para permitir la formación de una región de doble cadena. Uno o más elementos silenciadores de doble cadena funcionales pueden estar presentes en esta 'región de tallo' de la molécula. Las regiones de repetición invertidas están típicamente separadas por una región o segmento del ARN conocido como la región de 'bucle'. Esta región puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que confiera flexibilidad suficiente para permitir que se produzca el auto-apareamiento entre las regiones complementarias flanqueadoras del ARN. En general, la región de bucle es básicamente de cadena sencilla y actúa como un elemento separador entre las repeticiones invertidas.

Todas las moléculas de ARN interferente de la invención producen la regulación de forma descendente específica de las secuencias de expresión de un gen diana mediante la unión a una secuencia de nucleótidos diana dentro del gen diana. La unión se produce como resultado de la formación de pares de bases complementarias entre el elemento silenciador del ARN interferente y la secuencia de nucleótidos diana. En una realización de la presente invención, la secuencia de nucleótidos diana comprende una secuencia de nucleótidos representada por el transcrito de ARN del gen diana, o un fragmento del mismo, en donde el fragmento es preferiblemente de al menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000 o 1100 nucleótidos. En una realización preferida de la presente invención, la secuencia de nucleótidos diana comprende una secuencia de nucleótidos equivalente al transcrito de ARN codificado por cualquiera de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en (i) un polinucleótido que comprende al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152 o ( ii) un polinucleótido que consiste en al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152,

o (iii) un polinucleótido que comprende al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23 o 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan óptimamente, dicho polinucleótido es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntico a cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152 o (iv) un polinucleótido que comprende un fragmento de al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23 o 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de un nucleótido como se representa en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, y en donde dicho fragmento o dicho complemento tiene una secuencia de nucleótidos que, cuando dicho fragmento es óptimamente alineado y comparado con el fragmento correspondiente en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, dicha secuencia de nucleótidos es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a dicho fragmento correspondiente de cualquiera de SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152. . En una realización más preferida de lo anterior, dicho polinucleótido no es más largo que 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.

Preferiblemente, las moléculas de ARN interferente de la presente invención comprenden al menos una región de doble cadena, típicamente el elemento silenciador del ARN interferente, que comprende una cadena de ARN sentido reasociada mediante apareamiento de pares de bases antisentido a una cadena de ARN no codificante, en donde la cadena codificante de la molécula de ARNdc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana.

El elemento silenciador, o al menos una cadena del mismo, en donde el elemento silenciador es de doble cadena, puede ser totalmente complementario o parcialmente complementario a la secuencia de nucleótidos diana del gen diana. Como se utiliza en esta memoria, la expresión "totalmente complementario" significa que todas las bases de la secuencia de nucleótidos del elemento silenciador son complementarias o "coinciden" con las bases de la secuencia de nucleótidos diana. La expresión "al menos parcialmente complementario" significa que hay menos del 100% de coincidencia entre las bases del elemento silenciador y las bases de la secuencia de nucleótidos diana. El experto en la materia comprenderá que el elemento silenciador necesita ser solo al menos parcialmente complementario a la secuencia de nucleótidos diana para mediar la regulación por disminución de la expresión del gen diana. En la técnica existe constancia de que las secuencias de ARN con inserciones, eliminación y emparejamientos erróneos con respecto a la secuencia diana pueden seguir siendo eficaces para la ARNi. De acuerdo con la presente invención, se prefiere que el elemento silenciador y la secuencia de nucleótidos diana del gen diana compartan al menos un 85% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 90% o 95% de identidad de secuencia, o más preferiblemente al menos un 97% o 98% de identidad de secuencia y aún más preferiblemente al menos un 99% de identidad de secuencia. De forma alternativa, el elemento silenciador puede comprender 1, 2 o 3 emparejamientos incorrectos en comparación con la secuencia de nucleótidos diana en cada extensión de 24 nucleótidos parcialmente complementarios.

El experto en la materia apreciará que el grado de complementariedad compartido entre el elemento silenciador y la secuencia de nucleótidos diana puede variar dependiendo del gen diana a regularse de forma descendente o dependiendo de la especie de plaga de insectos cuya expresión de genes se tiene que controlar.

En otra realización de la presente invención, el elemento silenciador comprende una secuencia de nucleótidos que es el ARN equivalente de cualquiera de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en un polinucleótido que comprende al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o (ii) a polinucleótido que comprende al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23 o 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan de manera óptima, dicho polinucleótido es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntico a cualquiera de las SeQ ID NOs 277, 138, 253, 152, en donde dicho polinucleótido no es más largo de 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos. Se apreciará que en dichas realizaciones el elemento silenciador puede comprender o consistir en una región de ARN de doble cadena que comprende cadenas complementarias reasociadas, de las cuales una cadena, la cadena codificante, comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana.

La secuencia de nucleótidos diana se puede seleccionar de cualquier región o secuencia de nucleótidos adecuada del gen diana o transcrito de ARN de la misma. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos diana puede ubicarse dentro de la 5'UTR o 3'UTR del gen objetivo o del transcrito de ARN o dentro de las regiones exónicas o intrónicas del gen.

El experto en la materia conocerá métodos para identificar las secuencias de nucleótidos diana más adecuadas dentro del contexto del gen diana completo. Por ejemplo, pueden sintetizarse y evaluarse múltiples elementos silenciadores que fijan como objetivo diferentes regiones del gen diana. Como alternativa, se puede utilizar la digestión del transcrito de ARN con enzimas tales como ARNasa H para determinar sitios en el ARN que se encuentran en una conformación susceptible al silenciamiento génico. Los sitios diana también pueden identificarse utilizando estrategias in silico, por ejemplo, el uso de algoritmos informáticos diseñados para predecir la eficacia del silenciamiento génico en función del direccionamiento a diferentes sitios dentro del gen completo.

Los ARN interferentes de la presente invención pueden comprender un elemento silenciador o múltiples elementos silenciadores, en donde cada uno de los elementos silenciadores comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana y que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando por disminución la expresión de dicho gen diana. Construcciones de ARN concatemérico de este tipo se describen en el documento WO2006/046148 como se incorpora en esta memoria como referencia. En el contexto de la presente invención, el término "múltiple" significa al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, etc. y hasta al menos 10, 15, 20 o al menos 30. En una realización, el ARN interferente comprende copias múltiples de un único elemento silenciador, es decir, repeticiones de un elemento silenciador que se une a una secuencia de nucleótidos diana particular dentro de un gen diana específico. En otra realización, los elementos silenciadores dentro del ARN interferente comprenden o consisten en diferentes secuencias de nucleótidos complementarias a diferentes secuencias de nucleótidos diana. Debe estar claro que las combinaciones de múltiples copias del mismo elemento silenciador combinadas con elementos silenciadores que se unen a secuencias de nucleótidos diana diferentes se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Las diferentes secuencias de nucleótidos diana pueden originarse a partir de un solo gen diana en una especie de plaga de insectos para alcanzar una regulación de forma descendente mejorada de un gen diana específico en una especie de plaga de insectos. En ese caso, los elementos silenciadores pueden combinarse en el ARN interferente en el orden original en el que las secuencias de nucleótidos diana se encuentran en el gen diana, o los elementos silenciadores pueden mezclarse y combinarse aleatoriamente en cualquier orden de importancia en el contexto del ARN interferente en comparación con el orden de las secuencias de nucleótidos diana en el gen diana.

De forma alternativa, las diferentes secuencias de nucleótidos diana representan un solo gen diana pero se originan de diferentes especies de plagas de insectos.

De forma alternativa, las diferentes secuencias de nucleótidos diana pueden originarse de diferentes genes diana. Si el ARN interferente es para utilizarse en la prevención y/o el control de infestación por parte de plagas, se prefiere que los diferentes genes diana se seleccionen del grupo de genes que regulan las funciones biológicas esenciales de las especies de plagas de insectos, incluyendo, aunque sin limitación, supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción y patogenicidad. Los genes diana pueden regular las mismas o diferentes rutas biológicas o procesos. En una realización, al menos uno de los elementos silenciadores comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana en el que el gen diana se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o que tienen una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan de manera óptima, es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntico a cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o (ii) es un ortólogo de plaga de insectos de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, en donde los dos genes ortólogos son similares en secuencia en tal grado que cuando los dos genes se alinean y comparan de manera óptima, el ortólogo tiene una secuencia que es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias representadas por SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos del gen diana no es más larga de 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.

En una realización adicional de la invención, los diferentes genes diana de los diferentes elementos silenciadores se originan de la misma especie de plaga de insectos. Esta estrategia está diseñada para lograr un ataque mejorado contra una sola especie de plaga de insectos. En particular, los diferentes genes diana pueden expresarse de manera diferencial en las diferentes etapas del ciclo de vida del insecto, por ejemplo, las fases de adulto maduro, larva inmadura y huevo. El ARN interferente de la invención puede utilizarse, por lo tanto, para prevenir y/o controlar la infestación de plagas de insectos en más de una fase del ciclo de vida del insecto.

En una realización alternativa de la invención, los diferentes genes diana de los diferentes elementos silenciadores se originan de diferentes especies de plagas de insectos. El ARN interferente de la invención, por tanto, puede utilizarse para prevenir y/o controlar una infestación por parte de más de una especie de plaga de insectos simultáneamente.

Los elementos silenciadores pueden disponerse como una región contigua del ARN interferente o pueden separarse mediante la presencia de secuencias conectoras. La secuencia conectora puede comprender una secuencia de nucleótidos aleatoria corta que no sea complementaria a ninguna secuencia de nucleótidos diana o genes diana. En una realización, el conector es una secuencia de ARN que es autoescindible de manera condicional, preferentemente un conector sensible al pH o un conector sensible a la hidrofobicidad. En una realización, el conector comprende una secuencia de nucleótidos equivalente a una secuencia intrónica. Las secuencias conectoras de la presente invención pueden tener una longitud de aproximadamente 1 par de bases a aproximadamente 10.000 pares de bases, siempre que el conector no altere la capacidad del ARN interferente de reducir la expresión del gen o los genes diana.

Además del o los elementos silenciadores y cualquier secuencia conectora, el ARN interferente de la invención puede comprender al menos una secuencia polinucleotídica adicional. En diferentes realizaciones de la invención, la secuencia adicional se selecciona de (i) una secuencia capaz de proteger el ARN interferente del procesamiento del ARN, (ii) una secuencia que afecta a la estabilidad del ARN interferente, (iii) una secuencia que permite la unión a la proteína, por ejemplo, para facilitar la captación del ARN interferente por parte de las células de la especie de la plaga de insectos, (iv) una secuencia que facilita la producción a gran escala del ARN interferente, (v) una secuencia que es un aptámero que se une a un receptor o a una molécula en la superficie de las células de la plaga de insectos para facilitar la captación, o (v) una secuencia que cataliza el procesamiento del ARN interferente dentro de las células de la plaga de insectos y mejora de esta forma la eficacia del ARN interferente. Estructuras para potenciar la estabilidad de moléculas de ARN son bien conocidas en la técnica y se describen adicionalmente en el documento WO2006/046148.

La longitud del ARN interferente de la invención necesita ser suficiente para la captación por parte de las células de una especie de plaga de insectos y la regulación descendente de genes diana dentro de la plaga como se describe en otras partes de esta memoria. Sin embargo, el límite superior de longitud puede depender de (i) la necesidad de que el ^aRⁿinterferente sea captado por las células de la plaga y (ii) la necesidad de que el ARN interferente sea procesado en las células de la plaga para mediar el silenciamiento de genes mediante la ruta de ARNi. La longitud también puede determinarse por el método de producción y la formulación para la liberación del ARN interferente a células. Preferiblemente, el ARN interferente de la presente invención será entre 21 y 10.000 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre 50 y 5000 nucleótidos o entre 100 y 2500 nucleótidos, más preferiblemente entre 80 y 2000 nucleótidos de longitud.

El ARN interferente puede contener bases de ADN, bases no naturales o uniones del esqueleto o modificaciones del esqueleto de azúcar-fosfato no naturales, por ejemplo, para mejorar la estabilidad durante el almacenamiento o mejorar la resistencia a la degradación por parte de las nucleasas. Además, el experto en la materia puede producir el ARN interferente química o enzimáticamente mediante reacciones manuales o automatizadas. Como alternativa, el ARN interferente se puede transcribir a partir de un polinucleótido que lo codifique. Por lo tanto, en esta memoria se proporciona un polinucleótido aislado que codifica cualquiera de los ARN interferentes de la presente invención.

También se proporciona en esta memoria un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en (i) un polinucleótido que comprende al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o (ii) un polinucleótido que consiste en al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o (iii) un polinucleótido que comprende al menos 21, preferiblemente al menos 22, 23 o 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 o 1115 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos tal como se representa en cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, que, cuando dos secuencias están alineadas y comparadas de manera óptima, dicho polinucleótido es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntico a cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, y en donde dicho polinucleótido no es más largo que 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.

En realizaciones preferidas, el polinucleótido aislado es parte de una molécula de ARN interferente, típicamente parte del elemento silenciador, que comprende al menos una región de doble cadena que comprende una cadena de ARN codificante hibridada por apareamiento de pares de bases complementarias a una cadena de ARN no codificante, en donde la cadena codificante de la molécula de ARNdc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana. La cadena codificante del ARNdc, por lo tanto, es capaz de reasociarse con el transcrito de ARN y de fijar como objetivo el ARN para su degradación dentro del complejo silenciador inducido por ARNi o RISC.

Los polinucleótidos de la invención pueden insertarse mediante técnicas de clonación molecular de rutina en vectores o construcciones de ADN conocidos en la técnica. Por lo tanto, de acuerdo con una realización, se proporciona una construcción de ADN que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención. Preferiblemente, en esta memoria se proporciona una construcción de a Dn que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los ARNs interferentes de la presente invención. La construcción de ADN puede ser un vector de ADN recombinante, por ejemplo, un vector o plásmido bacteriano o de levadura. En una realización preferida de la invención, la construcción de ADN es una construcción de expresión y el polinucleótido se encuentra unido de forma funcional a al menos una secuencia reguladora capaz de dirigir la expresión de la secuencia polinucleotídica. La expresión 'secuencia reguladora' debe tomarse en un contexto amplio y pretende referirse a cualquier secuencia de nucleótidos capaz de efectuar la expresión de polinucleótidos a los que está operativamente unida, incluidos, pero no limitados a promotores, potenciadores y otros elementos activadores transcripcionales de origen natural o sintéticos. La secuencia reguladora puede ubicarse en el extremo 5' o 3' de la secuencia de polinucleótidos. La expresión 'operativamente unido' se refiere a un enlace funcional entre la secuencia reguladora y la secuencia polinucleotídica, de modo que la secuencia reguladora impulsa la expresión del polinucleótido. Los elementos unidos de forma funcional pueden ser contiguos o no contiguos.

Preferiblemente, la secuencia reguladora es un promotor que se selecciona del grupo que comprende, aunque sin limitación, promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores específicos de tejido y promotores específicos de etapa de crecimiento/desarrollo. En una realización, el polinucleótido se coloca bajo el control de un promotor constitutivo fuerte tal como cualquiera seleccionado del grupo que comprende el promotor CaMV35S, promotor CaMV35S doble, promotor de ubiquitina, promotor de actina, promotor de rubisco, promotor GOS2, promotor 34S del virus del mosaico de la escrofularia. En otra realización, la secuencia reguladora es un promotor de plantas para su uso en la regulación de la expresión del polinucleótido en plantas. Los promotores de plantas, en particular, los promotores específicos de tejido vegetal abarcados por el alcance de la presente invención se describen más detalladamente en otras partes de esta memoria.

Opcionalmente, una o más secuencias de terminación de transcripción pueden incorporarse en la construcción de expresión de la invención. La expresión 'secuencia de terminación de la transcripción' abarca una secuencia de control al final de una unidad transcripcional, que señala la terminación de la transcripción, el procesamiento 3' y la poli-adenilación de una transcripción primaria. Secuencias reguladoras adicionales incluyen, pero no se limitan a potenciadores de la traducción o la transcripción, pueden incorporarse en la construcción de expresión, por ejemplo, como con el promotor CaMV35S doble potenciado.

La presente invención también abarca un método para generar cualquiera de los ARNs interferentes de la invención, que comprende las etapas de (i) poner en contacto un polinucleótido que codifica dicho ARN interferente o una construcción de ADN que comprende el mismo con componentes libres de células; o (ii) introducir (p. ej., por transformación, transfección o inyección) un polinucleótido que codifica dicho ARN interferente o una construcción de ADN que comprende el mismo en una célula. Por consiguiente, también se proporciona en esta memoria una célula huésped que comprende cualquiera de los ARNs interferentes de la presente invención, cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención o una construcción de ADN que comprende los mismos. La célula hospedadora puede ser una célula procariota incluyendo, aunque sin limitación, células bacterianas gram-positivas y gram-negativas, o una célula eucariota incluyendo, aunque sin limitación, células de levadura o células vegetales. Preferiblemente, dicha célula hospedadora es una célula bacteriana o una célula vegetal. La célula bacteriana se puede elegir del grupo que comprende, pero no se limita a, células Gram positivas y Gram negativas que comprenden Escherichia spp. (p. ej., E. coli), Bacillus spp. (p. ej., B. thuringiensis), Rhizobium spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Pseudomonas spp. and Agrobacterium spp. El polinucleótido o construcción de ADN de la invención puede existir o mantenerse en la célula hospedadora como un elemento extracromosómico o puede incorporarse de forma estable en el genoma de la célula hospedadora. Las características de interés particular en la selección de una célula hospedadora para los propósitos de la presente invención incluyen la facilidad con la que el polinucleótido o la construcción de ADN que codifica el ARN interferente puede introducirse en el hospedador, la disponibilidad de los sistemas de expresión compatibles, la eficacia de la expresión y la estabilidad del ARN interferente en el hospedador.

La construcción de ADN de la invención puede incluir, además, un origen de replicación que se requiere para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de célula específica o célula hospedadora. Un ejemplo es cuando se requiere que una construcción de expresión se mantenga en una célula bacteriana como elemento genético extracromosómico o episómico (p. ej., un plásmido o molécula de cósmido) en una célula. Orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan a f1 -ori, pBR322 ori (pMB1) y colE1 ori.

La construcción recombinante puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se utiliza en esta memoria, la expresión 'gen marcador seleccionable' incluye cualquier gen, que confiere un fenotipo en una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células, que se transfectan o transforman con una construcción de expresión de la invención. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen genes de resistencia contra ampicilina (Ampr), tetraciclina (Tcr), kanamicina (Kanr), fosfinotricina y cloranfenicol (CAT). Otros genes marcadores adecuados proporcionan un rasgo metabólico, por ejemplo manA. También pueden utilizarse genes marcadores visuales e incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa (GUS), luciferasa y proteína verde fluorescente (GFP).

En situaciones en donde el ARN interferente se expresa dentro de una célula hospedadora y/o se utiliza para prevenir y/o controlar la infestación de plagas de un organismo hospedador, se prefiere que el ARN interferente no presente efectos significativos 'desviados', es decir, el ARN interferente no afecta la expresión de genes dentro del hospedador. Preferiblemente, el elemento silenciador no exhibe complementariedad significativa con secuencias de nucleótidos que no sean la secuencia de nucleótidos diana pretendida del gen diana. En una realización de la invención, el elemento silenciador muestra menos de un 30%, más preferiblemente menos de un 20%, más preferiblemente menos de un 10% y aún más preferiblemente menos de un 5% de identidad de secuencia con cualquier gen de la célula u organismo hospedador. Si los datos de la secuencia genómica están disponibles para el organismo hospedador, es posible verificar de forma cruzada la identidad con el elemento silenciador utilizando herramientas bioinformáticas convencionales. En una realización, no hay identidad de secuencia entre el elemento silenciador y un gen de la célula hospedadora u organismo hospedador en una región de 17, más preferiblemente en una región de 18 o 19 y aún más preferiblemente en una región de 20 o 21 nucleótidos contiguos.

Cualquiera de las moléculas de ARN interferente o construcciones de ADN que codifican la molécula de ARN interferente o las células hospedadoras que comprenden la molécula de ARN interferente tal como se describe en esta memoria pueden utilizarse para la prevención y/o el control de la infestación de plagas de insectos. Como tal, las construcciones de ARNs interferentes o de ADN o las células hospedadoras que las comprenden pueden denominarse plaguicidas o insecticidas. Preferiblemente, las moléculas de ARN interferentes y/o construcciones de ADN o células hospedadoras de la presente invención se utilizan para tratar plantas como un medio para prevenir y/o controlar la infestación de plagas de las mismas. En particular, las moléculas de ARN interferente y/o las construcciones de ADN o las células hospedadoras pueden proporcionarse como un kit con el fin de prevenir y/o controlar la infestación de plagas, preferiblemente la infestación de plagas de plantas.

Además, de acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona en esta memoria una composición para prevenir y/o controlar la infestación por plagas de insectos que comprende al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente y al menos un soporte, excipiente o diluyente adecuado, en donde el ARN interferente funciona tras la absorción por la plaga para regular de forma descendente la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga. El ARN interferente puede ser cualquiera de los divulgados en otra parte en esta memoria. Preferiblemente, el ARN interferente comprende o consiste en al menos un elemento silenciador y dicho elemento silenciador es una región de ARN de doble cadena que comprende cadenas complementarias reasociadas, una cadena de las cuales (la cadena sentido) comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana. El 'gen diana' puede ser cualquiera de los genes diana de plagas tal como se describe en otra parte de esta memoria, incluidos, pero no limitados a genes implicados en la regulación de la supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción y patogenicidad de plagas. Como alternativa, la composición comprende al menos una célula hospedadora que comprende al menos una molécula de ARN interferente o construcción de ADN que la codifica y, opcionalmente, al menos un soporte, excipiente o diluyente adecuado, en donde el ARN interferente funciona, tras la captación de la célula hospedadora por la plaga de insectos, regulando por disminución la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga.

En la aplicación práctica de la invención, la composición puede utilizarse para prevenir y/o controlar cualquier plaga de insectos pertenecientes a los órdenes Coleóptera, Lepidoptera, Diptera, Dichyoptera, Orthoptera, Hemiptera y Siphonaptera. La composición, por lo tanto, puede estar en cualquier forma adecuada para su aplicación a plagas de insectos o para su aplicación a sustratos y/u organismos, en particular plagas, susceptibles a infestación por dicha plaga de insectos. En una realización, la composición es para su uso en la prevención y/o control de infestación por parte de plagas de plantas o material de propagación o reproductor de plantas y, por tanto, está dirigida a especies de plagas de insectos que infestan plantas. La composición de la presente invención es particularmente efectiva cuando la plaga de insectos pertenece a la categoría de insectos 'masticadores' que causan daños considerables a las plantas al comer tejidos vegetales tales como raíces, hojas, flores, brotes, ramitas y similares. Ejemplos de esta gran categoría de insectos incluye escarabajos y sus larvas. En una realización preferida de la invención, la plaga de insectos se selecciona del género Leptinotarsa. Más preferiblemente, la especie diana de plaga de insectos es Leptinotarsa decemlineata.

La composición de la presente invención también es eficaz contra especies de insectos que perforan y/o chupan los fluidos de las células y tejidos de plantas. Por lo tanto, en una realización preferida de la invención, la plaga de insectos se selecciona del género Lygus. Preferiblemente, la especie de plaga de insectos diana se selecciona del grupo que comprende Lygus adspersus, Lygus alashanensis, Lygus borealis, Lygus elisus, Lygus gemellatus, Lygus hesperus, Lygus lineolaris o Lygus rugulipennis. Más preferiblemente, la especie diana de plaga de insectos es Lygus hesperus. La composición de la invención puede utilizarse para controlar plagas de insectos en todas las etapas de su ciclo vital, por ejemplo, la etapa de adulto maduro, la etapa larvaria y la de huevo.

En el contexto de la composición de la invención, el ARN interferente puede producirse a partir de una construcción de ADN, en particular una construcción de expresión como se describe en otra parte en esta memoria, que comprende un polinucleótido que la codifica. Además, el ARN interferente puede producirse dentro de una célula u organismo hospedador diseñado para expresar dicho ARN interferente a partir de un polinucleótido que lo codifica. Organismos hospedadores adecuados para su uso en las composiciones de la presente invención incluyen, pero no se limitan a microorganismos que se sabe que colonizan el entorno en y/o alrededor de plantas o cultivos de interés, es decir, plantas o cultivos susceptibles a la infestación por especies de plagas de insectos. Dichos microorganismos incluyen, aunque sin limitación, aquellos que ocupan el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de la planta). Estos microorganismos se seleccionan para que puedan competir satisfactoriamente con cualquier organismo de tipo silvestre presente en el entorno de la planta. Microorganismos adecuados para su uso como hospedadores incluyen diversas especies de bacterias, algas y hongos. Queda claro que los microorganismos elegidos no deben ser tóxicos para las plantas.

Los organismos hospedadores que no colonizan de forma natural las plantas y/o su entorno también están dentro del alcance de la presente invención. En una realización, el ARN interferente se fermenta en un hospedador bacteriano, y las bacterias muertas resultantes se procesan y utilizan como un aerosol insecticida de la misma manera que las cepas de Bacillus thuringiensis se han usado como insecticida para una aplicación de aerosol.

Cuando la composición de la invención es para su uso en la prevención y/o control de la infestación por parte de plagas de una planta, la composición puede contener un soporte agronómicamente adecuado. Dicho soporte puede ser cualquier material que la planta a tratar pueda tolerar, que no cause daños excesivos al medio ambiente u otros organismos del mismo y que permita que el ARN interferente permanezca eficaz contra la especie de insecto que es plaga. En particular, las composiciones de la invención pueden formularse para su suministro a plantas de acuerdo con prácticas agrícolas rutinarias usadas en la industria de bioinsecticidas. La composición puede contener además componentes que pueden realizar otras funciones incluyendo, aunque sin limitación, (i) potenciar o promover la captación del ARN interferente por las células de la plaga y (ii) estabilizar los componentes activos de la composición. Ejemplos específicos de dichos componentes adicionales contenidos en la composición que comprende el ARN interferente, son ARNt de levadura o ARN total de levadura.

Las composiciones pueden formularse para aplicación directa o como una concentración de una composición principal que requiere dilución antes de su uso. Como alternativa, la composición puede suministrarse como un kit que comprende el ARN interferente o la célula hospedadora que comprende o expresa el mismo en un recipiente y el diluyente o vehículo adecuado para el ARN o la célula hospedadora en un recipiente diferente. En la aplicación práctica de la invención, la composición puede aplicarse a una planta o cualquier parte de una planta en cualquier fase del desarrollo de la planta. En una realización, la composición se aplica a las partes aéreas de una planta, por ejemplo, durante el cultivo de cultivos de plantas en un campo. En una realización adicional, la composición se aplica a las semillas de una planta mientras están en almacenamiento o una vez se han sembrado en el suelo. Generalmente es importante obtener un buen control de las plagas en las primeras etapas de crecimiento de la planta, ya que ese es el momento en que la planta puede verse más gravemente dañada por las especies que son plagas.

La composición puede aplicarse al entorno de una plaga de insectos por diversas técnicas incluyendo, aunque sin limitación, pulverización, atomizado, espolvoreo, dispersión, inundación, recubrimiento de semillas, tratamiento de semillas, introducción en el suelo e introducción en el agua de riego. En el tratamiento de plantas susceptibles a infestación por parte de plagas, la composición puede suministrarse a la planta o parte de una planta antes de que aparezca la plaga (con fines de prevención), o una vez han empezado a aparecer signos de infestación por parte de la plaga (con fines de control de plagas).

En una realización adicional de la invención, la composición se formula para que contenga al menos un agente agronómico adicional, por ejemplo, un herbicida o un plaguicida adicional. Como se utiliza en esta memoria, un 'segundo plaguicida' o 'plaguicida adicional' se refiere a un plaguicida distinto de la primera molécula de ARN interferente original de la composición. Como alternativa, la composición de la invención puede suministrarse en combinación con al menos otro agente agronómico, por ejemplo, un herbicida o un segundo plaguicida. En una realización, la composición se proporciona en combinación con un herbicida seleccionado de cualquiera conocido en la técnica, por ejemplo, glifosato, imidazolinona, sulfonilurea y bromoxinil. En una realización adicional, la composición se proporciona en combinación con al menos un plaguicida adicional. El plaguicida adicional puede seleccionarse de cualquier plaguicida conocido en la técnica y/o puede comprender un ácido ribonucleico interferente que funcione, tras la captación por una plaga, regulando por disminución la expresión de un gen diana en dicha especie que es plaga. En una realización, la plaga diana es una especie de insecto que es plaga y el ARN interferente se selecciona de cualquiera de los ARN interferentes como se describe en este documento. En una realización adicional, el plaguicida adicional comprende un ARN interferente que funciona regulando por disminución la expresión de un gen conocido en cualquier especie diana que sea plaga, sin limitarse a plagas de insectos. La molécula de ARN interferente original de la composición y el segundo plaguicida o plaguicidas adicionales puede tener como diana la misma especie de insecto que es plaga o pueden estar destinados a tener como diana diferentes especies de insectos que son plaga. Por ejemplo, el ARN interferente original y el segundo plaguicida puede tener como diana diferentes especies de plagas de insectos o puede tener como diana diferentes familias o clases de organismos que son plaga, por ejemplo, hongos o nematodos o insectos. Será evidente para los expertos en la materia la manera en que ensayar combinaciones de moléculas de ARN interferente y otros agentes agronómicos para obtener efectos sinérgicos. En una realización preferida, la composición contiene una primera molécula de ARN interferente descrita en otra parte en este documento y uno o más plaguicidas adicionales, cada uno tóxico para la misma plaga de insectos, donde el uno o más plaguicidas adicionales se seleccionan de una patatina, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis, una proteína insecticida de Xenorhabdus, una proteína insecticida de Photorhabdus, una proteína insecticida de Bacillus laterosporous, una proteína insecticida de Bacillus spaericus y una lignina, y donde la proteína insecticida de Bacillus thuringiensis se selecciona del grupo que consiste en una Cry1Ab, una Cry1C, una Cry2Aa, una Cry3, una TIC851, una CryET70, una Cry22, una VIP, una TIC901, una TIC1201, una TIC407, una TIC417, una proteína insecticida binaria seleccionada de CryET33 y CryET34, CryET80 y CryET76, TIC100 y TIC101, y PS149B1, y quimeras insecticidas de cualquiera de las proteínas insecticidas precedentes.

Los diferentes componentes de las combinaciones descritas en este documento pueden administrarse, por ejemplo, a un organismo hospedador susceptible a infestación por plagas, en cualquier orden. Los componentes pueden suministrarse simultánea o secuencialmente al área u organismo a tratar.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona en esta memoria un método para la expresión de regulación descendente de un gen diana en una especie de plaga de insectos, que comprende poner en contacto dicha especie de plaga de insectos con una cantidad eficaz de al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente, en donde el ARN interferente funciona tras ser absorbido por la plaga para regular de forma descendente la expresión de un gen diana dentro de dicha plaga.

El gen diana puede ser cualquiera de los genes de plagas tal como se describe en otra parte en esta memoria. En particular, el gen diana se puede seleccionar del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o que tienen una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan óptimamente, es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos a cualquiera de las SEQ ID NO 277, 138, 253, 152.

El gen diana puede ser también un ortólogo de plagas de insectos de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, en donde los dos genes ortólogos son similares en secuencia en tal grado que cuando los dos genes son alineados y comparados de manera óptima, el ortólogo tiene una secuencia que es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias representadas por las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana no es más larga de 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos.

El ARN interferente para su uso en el presente método puede ser cualquiera de las moléculas de ARN interferente tal como se describe en otra parte en esta memoria. En una realización, el ARN interferente media en la regulación descendente de la expresión génica mediante el proceso de interferencia de ARN o ARNi, y el ARN interferente se selecciona del grupo de moléculas reguladoras de ARN capaces de efectuar ARNi o 'silenciamiento génico' que incluye, pero no se limita a ARNs interferentes cortos (ARNip), microARN (miARN), ARN de doble cadena (ARNdc) y ARN en horquilla (ARNsh).

En realizaciones preferidas, las moléculas de ARN interferente para uso en el presente método comprenden al menos un elemento silenciador, en el que el elemento silenciador es una región de ARN de doble cadena que comprende una cadena de ARN sentido reasociada por apareamiento de bases complementario a una cadena de ARN antisentido, en donde la cadena sentido de la molécula de ARNdc comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos ubicada dentro del transcrito de ARN del gen diana. La cadena codificante del ARNdc, por lo tanto, es capaz de reasociarse con el transcrito de ARN y de fijar como objetivo el ARN para su degradación dentro del complejo de silenciamiento inducido por ARNi o RISC.

En el presente método, la plaga de insectos se trata con al menos un ARN interferente. En una realización del método, las especies de plagas de insectos pueden ponerse en contacto con múltiples moléculas de ARN interferente. Cuando la plaga se pone en contacto con múltiples ARNs interferentes, los diferentes ARNs pueden funcionar para regular de forma descendente el mismo gen diana o diferentes genes diana.

El ARN interferente para ser suministrado a las especies de plagas de insectos se pueden formular como una composición que comprende al menos un soporte, excipiente o diluyente adecuado. Además, el ARN interferente puede transcribirse desde un polinucleótido que codifica el mismo o una construcción de ADN que comprende dicho polinucleótido. En una realización, el ARN interferente se expresa dentro de una célula u organismo hospedador que incluye un hospedador procariota o eucariota. La célula u organismo hospedador puede ser un hospedador susceptible a la infestación por una plaga de insectos en la que el ARN interferente funciona para regular de forma descendente la expresión de un gen diana en dicha plaga. En una realización preferida, el organismo hospedador es una planta susceptible a la infestación por la especie de plaga de insectos diana.

Como se usa en el contexto del presente método, la expresión 'poner en contacto' se refiere a cualquier medio por el que las especies de plagas de insectos o una célula de los mismos están expuestos al ARN interferente y que permite la captación del ARN interferente por las células de la plaga. Por lo tanto, "poner en contacto" abarca, por ejemplo, los procesos de transformación celular, microinyección y alimentación. Estas técnicas pueden llevarse a cabo con respecto a células aisladas cultivadas in vitro o células dentro del cuerpo intacto de las especies de plagas de insectos. Cuando la plaga de insectos intacta se pone en contacto con el ARN interferente del método, el ARN puede microinyectarse en un espacio extracelular y posteriormente ser absorbido por las células del cuerpo mediante procesos naturales tales como la endocitosis o la transcitosis. En una realización preferida de la invención, el ARN interferente se proporciona a la plaga en forma de o incluido en el alimento para ser ingerido por la plaga. Una vez ingerido, el ARN interferente puede pasar del tracto digestivo del insecto a las células del cuerpo por procesos naturales tales como la endocitosis o la transcitosis. En una realización, la plaga de insectos se expone a una planta que ha sido tratada con un ARN interferente o una composición que lo comprende, y el ARN interferente se absorbe a medida que la plaga se alimenta del tejido vegetal. El ARN interferente puede estar presente en la superficie de una planta o una parte de la misma o puede estar presente intracelularmente en la planta o en el tejido vegetal comido por la plaga de insectos.

En el contexto de un método para la expresión de regulación descendente de un gen diana en una especie de plagas de insectos, la expresión 'cantidad eficaz' debería tomarse para dar a entender la cantidad o la concentración de ARN interferente requerida para la expresión de regulación descendente del gen diana en al menos 10% o 20%, preferiblemente en al menos 33%, más preferiblemente en al menos 50%, aún más preferiblemente en al menos 80% o 90%. En realizaciones particularmente preferidas, una 'cantidad efectiva' es la cantidad o concentración requerida para regular de forma descendente la expresión del gen diana en al menos 60%, 70% u 80%, preferiblemente en al menos 90%, más preferiblemente en al menos 95%, y lo más preferiblemente en al menos 99% con respecto a la expresión en ausencia de un ARN interferente o en presencia de un ARN de control. Como se describe en otra parte de esta memoria, la regulación descendente de la expresión génica puede medirse mediante una reducción en los niveles del transcrito de ARN o de la proteína finalmente producida a partir del gen diana. Niveles de ARN y/o de proteína se pueden medir utilizando técnicas de rutina en la técnica.

En esta memoria también se proporciona un método para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas, que comprende poner en contacto una especie de plaga de insectos con una cantidad eficaz de al menos un ARN en donde el ARN funciona tras ser captado por dicha plaga para regular de forma descendente la expresión de un gen diana esencial de la plaga. El gen diana esencial puede ser cualquier gen de la plaga implicado en la regulación de un proceso biológico esencial necesario para que la plaga inicie o mantenga la infestación incluyendo, aunque sin limitación, supervivencia, crecimiento, desarrollo, reproducción y patogenicidad. En particular, el gen diana puede ser cualquier gen de la plaga como se describe en otras partes de esta memoria. Además, en esta memoria se proporciona un método para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas de insectos en un campo de plantas de cultivo, comprendiendo dicho método expresar en dichas plantas una cantidad eficaz de un ARN interferente como se describe en esta memoria.

Cuando el método es para el control de la infestación de la plaga, la expresión 'cantidad eficaz' se extiende a la cantidad o concentración de ARN interferente necesaria para producir un efecto fenotípico de la plaga de tal manera que el número de organismos de plagas que infestan un organismo hospedador se reduce y/o la cantidad de daño provocado por la plaga se reduce. En una realización, el efecto fenotípico es la muerte de la plaga y el ARN interferente se utiliza para alcanzar al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% de mortalidad de la plaga en comparación con plagas de insectos de control. En una realización adicional, los efectos fenotípicos incluyen, pero no se limitan a atrofia en el crecimiento de la plaga, cese de la alimentación y puesta de huevos reducida. Las cantidades totales de organismos de la plaga que infestan un organismo hospedador pueden reducirse, por tanto, al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% en comparación con plagas de control. De forma alternativa, el daño provocado por la plaga de insectos pude reducirse al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% en comparación con plagas de insectos de control. Por lo tanto, el método de la invención puede utilizarse para alcanzar al menos un 20%, 30%, 40%, preferiblemente al menos un 50%, 60%, 70%, más preferiblemente al menos un 80% o 90% de control de la plaga. Como se usa en esta memoria, 'plagas de control' son plagas no contactadas con ningún agente plaguicida, o plagas contactadas con un ARN interferente dirigido a un gen no esencial, es decir, un gen no requerido para el inicio o mantenimiento de la infestación de plagas o plagas contactadas con un ARN interferente un gen no encontrado y/o no expresado en dicha plaga.

Métodos para regular de forma descendente la expresión de un gen diana en una especie de plaga de insectos pueden utilizarse para prevenir y/o controlar la infestación de plagas en un sustrato o material particular susceptible a la infestación por dicha plaga de insectos. En una realización, el método se utiliza para tratar cualquier planta susceptible a la infestación por dicha plaga. Plantas de interés para su uso de acuerdo con los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a arroz, patata, algodón, tomate, canola, soja, girasol, sorgo, mijo perla, maíz, cultivos de semillas tales como alfalfa, fresas, berenjenas, pimienta y tabaco.

Además, se proporciona en esta memoria un método para aumentar el rendimiento de un cultivo de plantas, que comprende poner en contacto dichas plantas con una cantidad eficaz de un ARN interferente que funciona tras la absorción por una especie de plagas de insectos para regular de forma descendente la expresión de un gen diana en dicha plaga, en donde la regulación descendente del gen diana afecta a una función biológica esencial de la plaga requerida para el inicio y/o el mantenimiento de la infestación, de modo que el daño provocado al cultivo de la planta se reduce en comparación con los cultivos no tratados.

Las plantas o cultivos de plantas a ser tratados de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden ser tratados externamente con un ARN interferente o la composición que comprende el mismo. Por ejemplo, el ARN interferente o las células hospedadoras que comprenden o expresan el mismo pueden aplicarse a la superficie de la planta o al entorno de la planta mediante procesos que incluyen, pero no se limitan a pulverización, atomización, espolvoreo, dispersión, vertido, recubrimiento de semillas, tratamiento de semillas, introducción en el suelo e introducción en agua de riego. En una realización, la planta a tratar se manipula para que exprese el ARN interferente de forma intracelular mediante la transcripción de un polinucleótido incorporado en la misma. A medida que la plaga se alimenta de los tejidos de la planta, las células que contienen el ARN interferente se descompondrán dentro del tracto digestivo del insecto y, por lo tanto, el ARN interferente se distribuirá dentro del cuerpo del insecto, lo que dará como resultado la regulación descendente de los genes diana.

Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para generar una planta transgénica resistente a la infestación por parte de una especie de plaga de insectos que comprende las etapas de (a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando de forma descendente la expresión de un gen diana en dicha especie de plaga de insectos, (b) regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada; y (c) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión del ARN interferente a partir de la construcción de ADN recombinante, siendo así dicha planta resistente a dicha plaga en comparación con una planta sin transformar.

El ARN interferente expresado por la planta o parte de la misma puede ser cualquiera de los descritos en otras partes de esta memoria. Preferiblemente, el ARN interferente comprende o consiste en al menos un elemento silenciador y dicho elemento silenciador es una región de ARN de doble cadena que comprende cadenas complementarias reasociadas, una cadena de las cuales (la cadena sentido) comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana. Cuando parte del ARN interferente es de doble cadena, las dos cadenas de la molécula pueden expresarse a partir de al menos dos polinucleótidos separados o pueden estar codificadas por un único polinucleótido que codifica un ARN interferente con, por ejemplo, una estructura de tallo-bucle tal como se describe en otra parte en esta memoria.

El ARN interferente expresado por la planta o parte de la misma puede fijar como objetivo cualquiera de los genes descritos en otras partes de esta memoria. En particular, el gen diana se puede seleccionar del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o que tienen una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan óptimamente, es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idénticos a cualquiera de las SEQ ID NO 277, 138, 253, 152. El gen diana puede ser también un ortólogo de plagas de insectos de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, en donde los dos genes ortólogos son similares en secuencia en tal grado que cuando los dos genes son alineados y comparados de manera óptima, el ortólogo tiene una secuencia que es al menos 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias representadas por las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana no es más larga de 5000, 4000, 3000, 2000 o 1500 nucleótidos. Además, es importante que el ARN interferente no altere la expresión de ningún gen del hospedador vegetal.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión 'planta transgénica' o 'célula de planta transgénica' se refiere a cualquier planta o célula vegetal que ha sido diseñada genéticamente o es descendiente de una planta que ha sido manipulada genéticamente para llevar una secuencia de polinucleótido exógeno. 'Exógeno' se refiere al hecho de que el polinucleótido se origina desde fuera de la célula vegetal. Típicamente, el polinucleótido exógeno no es nativo de la planta transgénica, es decir, no se encuentra de forma natural dentro del genoma de la planta.

Como se utiliza en esta memoria, el término 'transformación' se refiere a la introducción de moléculas de polinucleótido exógeno en una planta o una célula de la misma. En la técnica se conocen técnicas para introducir polinucleótidos en plantas. En una realización de la presente invención, las plantas se 'transforman de manera estable' con una construcción de polinucleótidos o ADN que comprende la misma, es decir, la construcción de polinucleótidos o ADN introducida en la célula vegetal se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la progenie de la misma. Los protocolos de transformación para introducir polinucleótidos o construcciones de ADN en las células vegetales pueden variar dependiendo del tipo de planta en cuestión. Métodos de transformación adecuados incluyen, pero no se limitan a microinyección, electroporación, transformación mediada por Agrobacterium y aceleración de partículas balísticas. En la técnica también se conocen métodos para la inserción fijada como objetivo de un polinucleótido o construcción de ADN en una ubicación específica en el genoma de la planta utilizando sistemas de recombinación específica del sitio.

La construcción de ADN que comprende el polinucleótido que codifica la molécula activa de ARN interferente puede ser cualquier vector adecuado para la transformación de células vegetales. Vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a plásmidos bacterianos, por ejemplo, el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, y sistemas de vectores virales. La construcción de ADN introducida en las células de una planta no debe ser dañina ni tóxica para la planta y/o no debe ser dañina ni tóxica para ningún organismo más alto en la cadena alimenticia que se alimente de dichas plantas.

En una realización, la construcción de ADN es una construcción de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un ARN interferente unido operativamente a una secuencia reguladora capaz de impulsar la expresión de la secuencia de polinucleótidos en plantas tales como cualquiera seleccionada del grupo que comprende el promotor CaMV35S, el promotor CaMV35S duplicado, el promotor ubiquitina, el promotor actina, el promotor rubisco, el promotor GOS2, el promotor del virus del mosaico Figwort 34S y el promotor CaMV35S doblemente mejorado. Preferiblemente, la secuencia reguladora es un promotor de plantas que se selecciona de los conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, puede preferirse que la planta produzca moléculas de ARN interferente únicamente en las partes de la planta que entrarán en contacto con y/o se verán dañadas por la especie de plaga de insectos, por ejemplo, las partes aéreas de la planta, las raíces, etc. Este efecto puede conseguirse mediante el uso de promotores de plantas específicos de tejido incluyendo, aunque sin limitación, promotores específicos de las hojas, promotores específicos de la raíz, promotores específicos del tallo, promotores específicos de la flor y promotores específicos del fruto conocidos en la técnica. Ejemplos adecuados de un promotor específico de raíz son los promotores PsMTA y de la quitinasa de Clase III. Ejemplos de promotores específicos de tejido fotosintético o específicos de hoja y tallo que también son fotoactivados son promotores de dos proteínas de unión a clorofila (cab1 y cab2) de remolacha azucarera, ribulosa-bisfosfato carboxilasa (Rubisco), codificada por rbcS, las subunidades A (gapA) y B (gapB) de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de cloroplastos, promotor del gen de Solanum tuberosum que codifica la proteína específica para hojas y tallos (ST-LS1), genes inducibles por defensa y regulados por el tallo, tales como los promotores JAS, promotores específicos de flor tales como el promotor de la chalcona sintasa y promotores específicos de frutos tales como el RJ39 de la fresa.

En otras realizaciones, puede preferirse que la planta produzca moléculas de ARN interferente solamente en una etapa particular de su crecimiento. Este efecto puede alcanzarse mediante el uso de promotores específicos del desarrollo de plantas que dirigen la expresión solamente durante ciertos periodos del desarrollo de la planta. En particular, es importante proteger a las plantas de la infestación por parte de plagas durante las etapas más tempranas del crecimiento de las plantas o durante la floración (por ejemplo, en el caso del arroz) o durante la fructificación o maduración del fruto o el llenado de la semilla, ya que estos son los momentos en los que la planta puede verse más severamente dañada.

La construcción de ADN para su uso en la transformación de una planta de acuerdo con el presente método puede comprender más de un polinucleótido que codifica una molécula de ARN interferente de la presente invención. En una realización, los diferentes polinucleótidos pueden codificar moléculas de ARN interferente dirigidas a diferentes secuencias de nucleótidos dentro del mismo gen diana. En una realización adicional, los diferentes polinucleótidos pueden codificar moléculas de ARN interferente dirigidas a diferentes secuencias de nucleótidos dentro de diferentes genes diana, donde los diferentes genes diana se originan de la misma o diferentes especies de plaga de insectos. Cuando la construcción de ADN codifica más de un ARN interferente, estos ARN pueden expresarse de forma diferencial dentro de diferentes tejidos de la planta, ya que se encuentran bajo el control de diferentes secuencias promotoras específicas de tejido, como se describe en otras partes de este documento. En una realización, la planta se manipula para que exprese un ARN interferente en las hojas que regula por disminución la expresión de un gen diana en un insecto que se alimenta de las hojas, y para expresar adicionalmente un ARN interferente en las raíces que regula de forma descendente la expresión de un gen diana en un insecto que coloniza el suelo y se alimenta de las raíces de la planta.

La construcción de ADN puede comprender también al menos otro polinucleótido de interés, por ejemplo un polinucleótido que codifica una molécula de ARN reguladora adicional, un polinucleótido que codifica una proteína tóxica para las especies de plagas de insectos y/o un polinucleótido que codifica una proteína que confiere resistencia a los herbicidas.

De acuerdo con el presente método, una planta se regenera a partir de una célula vegetal transformada utilizando técnicas conocidas en la técnica. Una de dichas técnicas comprende la digestión enzimática de la pared celular vegetal para producir un protoplasto vegetal, que posteriormente puede sufrir múltiples rondas de división y diferenciación celular para producir una planta adulta. Las plantas adultas generadas de esa forma pueden evaluarse posteriormente para determinar su resistencia a la infestación por parte de plagas. "Resistente", como se utiliza en esta memoria, debe interpretarse ampliamente y se refiere a la capacidad de la planta para defenderse del ataque de una plaga que generalmente es capaz de infligir daño o pérdida a la planta. Resistente puede significar que la planta ya no es susceptible a la infestación por parte de plagas o que cualquier síntoma de enfermedad que resulte de la infestación por parte de plagas se reduce al menos aproximadamente un 20%, preferiblemente al menos un 30%, 40% o 50%, más preferiblemente al menos un 60%, 70% o 80% y aún más preferiblemente al menos un 90%. Técnicas para medir la resistencia de una planta a las especies de plagas de insectos se conocen comúnmente en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, medir a lo largo del tiempo el diámetro medio de la lesión, la biomasa de la plaga y/o el porcentaje general de tejidos vegetales en descomposición.

En una realización, el presente método para producir una planta transgénica también incluye la etapa de generar descendencia o descendientes de la planta transgénica y evaluar la resistencia de la descendencia a la plaga de insectos. Pueden producirse dos o más generaciones para asegurarse de que la expresión del rasgo de resistencia se mantiene y hereda de forma estable. Las semillas también pueden cosecharse de la planta transgénica progenitora y/o su descendencia para evaluar la resistencia a una plaga de insectos.

Los métodos de la invención pueden utilizarse para generar plantas transgénicas 'apiladas' que son resistentes a las especies de plagas de insectos y que poseen opcionalmente al menos otro rasgo deseable. Como se utiliza en esta memoria, una planta transgénica 'apilada' se refiere a una planta que lleva más de una secuencia de polinucleótidos exógenos. La expresión 'más de uno' se refiere a la posibilidad de que una planta lleve al menos 2, al menos 3, al menos 4 polinucleótidos exógenos. En una realización, la célula vegetal transformada con la construcción de ADN que codifica el ARN interferente que fija como objetivo un gen de la plaga se puede haber manipulado genéticamente previamente para portar un polinucleótido exógeno separado. De forma alternativa, el método para generar una planta transgénica a partir de una célula vegetal como se describe en esta memoria puede comprender un protocolo de transformación conjunta cuando la construcción de ADN que codifica un ARN interferente de la invención se proporciona a una célula vegetal simultánea o secuencialmente con un polinucleótido exógeno separado.

Los polinucleótidos exógenos que porta una planta transgénica apilada de la invención pueden expresarse en las mismas partes de la planta o pueden expresarse de forma diferencial en virtud del hecho de que la expresión de cada uno está controlada por un promotor específico de tejido diferente.

En una realización, el polinucleótido exógeno o gen heterólogo que confiere un rasgo deseable adicional codifica otro ARN interferente dirigido la misma o diferentes especies de plaga de insectos. En una realización adicional, el gen heterólogo codifica una proteína dañina o tóxica para una especie de plaga de insectos de plantas, por ejemplo una proteína insecticida seleccionada del grupo que incluye, pero no se limita a CrylAb, CrylC, Cry2Aa, Cry3, CryET70, Cry22, CryET33, CryET34, CryET80, CryET76, TIC100, TIC101, TIC851, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, PS149B1 y proteínas insecticidas VIP. En aún una realización adicional, el gen heterólogo codifica una proteína que confiere resistencia a los herbicidas. Ejemplos de genes que confieren resistencia a herbicidas incluyen Bar, EPSPS que confiere resistencia a glifosato, ALS que confiere resistencia a imidazolinona y sulfonilurea y bxn que confiere resistencia a bromoxinilo.

En esta memoria también se proporciona un método para producir semillas híbridas a partir de cualquiera de las plantas transgénicas generadas mediante los métodos de la presente invención, comprendiendo dicho método las etapas de (i) plantar la semilla obtenida de una primera planta endogámica y la semilla obtenida de una segunda planta endogámica, en donde al menos una de las plantas endogámicas es una planta transgénica resistente a la infestación por parte de plagas, (ii) cultivar las semillas en plantas que dan flores, (iii) evitar la autopolinización de al menos una de la primera o segunda planta adulta, (iv) permitir que ocurra la polinización cruzada entre la primera y la segunda planta; y (v) cosechar las semillas que resultan de la polinización cruzada. La semilla híbrida producida mediante este método y las plantas híbridas producidas mediante el cultivo de dicha semilla se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las plantas híbridas producidas mediante este método típicamente serán genéticamente uniformes y probablemente exhiban heterosis o vigor híbrido. Por tanto, pueden generarse cultivos con el potencial de aumentar el rendimiento mediante dicho método.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan plantas transgénicas resistentes a la infestación por especies de plagas de insectos. En particular, en esta memoria se proporcionan plantas transgénicas que expresan o son capaces de expresar al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la captación por parte de una especie de plaga de insectos regulando de forma descendente la expresión de un gen diana tal como se describe en otras partes de esta memoria dentro de dicha plaga. El ARN interferente puede ser cualquiera de los divulgados en otra parte en esta memoria. Preferiblemente, el ARN interferente comprende o consiste en al menos un elemento silenciador y dicho elemento silenciador es una región de ARN de doble cadena que comprende cadenas complementarias reasociadas, una hebra de las cuales (la hebra sentido) comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro de un gen diana. La regulación descendente de un gen diana de plaga puede utilizarse para interrumpir un proceso o función biológica esencial en la plaga, en donde 'esencial' se refiere al hecho de que el proceso o la función es necesario para iniciar o mantener la infestación de plagas.

Como se utiliza en esta memoria, el término 'planta' puede incluir cualquier material de reproducción o propagación para una planta. Las referencias a una planta también pueden incluir células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos vegetales, callos vegetales, acúmulos vegetales y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces y similares. La descendencia, las variantes y los mutantes de cualquiera de las plantas transgénicas descritas en esta memoria se encuentran dentro del alcance de la presente invención. También se incluyen las semillas de cualquiera de dichas plantas transgénicas.

Incluidas en el grupo de plantas transgénicas de la presente invención se encuentran las plantas transgénicas producidas por cualquiera de los métodos descritos en esta memoria. Por tanto, en una realización de la invención las plantas transgénicas comprenden rasgos transgénicos acumulados que portan un primer polinucleótido exógeno que confiere resistencia a plagas y al menos otro polinucleótido exógeno o gen heterólogo que confiere un rasgo deseado adicional de la planta. Los genes heterólogos adicionales pueden comprender genes que codifican agentes plaguicidas adicionales, genes que codifican proteínas tóxicas o dañinas para especies de plagas de insectos y/o genes que codifican proteínas que confieren resistencia a herbicidas como se describe en otras partes de esta memoria.

En esta memoria también se proporciona el uso del ácido ribonucleico (ARN) interferente como se describe en esta memoria o la construcción de ADN como se describe en esta memoria para prevenir y/o controlar la infestación por parte de plagas de insectos, preferiblemente infestación por parte de plagas de insectos de plantas.

La invención se comprenderá además con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1 Identificación de genes diana en especies de plagas de insectos

1.1 Clonación de secuencias parciales de los genes de Leptinotarsa decemlineata

Se aislaron ácidos nucleicos de las células intestinales de escarabajo de la patata, CPB, (Leptinotarsa decemlineata) larvas) y se preparó una colección de ADNc. Los ADNc intestinales se clonaron en el vector pGN49A (como se describe en el documento WO01/88121 de modo que estaban flanqueados por promotores T7 químicamente inducibles, orientados en sentido opuesto en cada uno de los extremos del dúplex de ADNc. Las construcciones del vector recombinante se transformaron en células de la cepa de Escherichia coli AB301-105 (DE3). Posteriormente se diluyeron las células transformadas y se sembraron en placa para obtener colonias individuales o clones. Los clones se revisaron para asegurarse de que la redundancia de clones para la colección no excediera de 5%. Se generaron entre 3000 y 4000 clones.

1.2 Ensayo del efecto de las moléculas de ARNdc expresadas bacterianamente en la supervivencia de larvas de Leptinotarsa decemlineata

Placas de múltiples pocillos se precargaron con medio LB (caldo de Luria) y cada uno de los pocillos se inoculó con un clon independiente de las células bacterianas transformadas tomadas de la colección de ADNc de CPB. Las bacterias se cultivaron a 28°C con agitación a 280 rpm, seguido de una etapa de inducción química a 37°C. Después de la centrifugación, el sedimento bacteriano resultante se lavó con agua y se sometió a un tratamiento térmico para inactivar las bacterias.

Las suspensiones bacterianas se sometieron a ensayo para determinar sus efectos sobre la supervivencia de larvas de CPB utilizando un ensayo de alimentación artificial basado en la dieta. Una suspensión bacteriana producida a partir de un solo clon bacteriano se aplicó por vía tópica a una dieta artificial sólida en los pocillos de una placa multipocillo y la dieta se secó en un armario de flujo laminar. Los efectos de cada uno de los clones se sometieron a ensayo por triplicado. Posteriormente, se añadió una sola larva de CPB de 2a fase a cada uno de los pocillos. Las placas se almacenaron en una cámara de cría de insectos a 25 ± 2°C, 60 ± 5% de humedad relativa, con un fotoperíodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Células bacterianas transformadas con un vector vacío, pGN29 (documento WO01/88121), se utilizaron como controles. La supervivencia de las larvas de CPB en cada uno de los pocillos se evaluó el día 14.

Un cierto número de clones bacterianos exhibió una alta potencia contra las larvas de CPB, lo que indica que los ADNc que codifican los ARNs de doble cadena contenidos en ellos son esenciales para la supervivencia de las plagas y, por lo tanto, representan genes diana de interés para el control de plagas. Por lo tanto, las secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes de estos genes diana se determinaron y se proporcionan en las Tablas 1 y 2, respectivamente.

Tabla 1

Tabla 2

1.3 Diseño de cebadores degenerados para clonar secuencias ortólogas de Lygus hesperus

Se realizó una búsqueda de proteínas (blastp) para cada uno de los genes diana de interés buscando bases de datos de proteínas no redundantes de artrópodos utilizando la secuencia de proteínas correspondiente a cada una de las dianas de Leptinotarsa decemlineata. Se realizó una selección de hasta veinte secuencias de proteínas a partir de los mejores éxitos que representaban una diversidad de especies de insectos.

Estas secuencias se procesaron primero en bloques utilizando el programa "Blockmaker" (http://bioinfo.weizmann.ac.il/blockmkr-bin/makeblocks.pl) que generó múltiples alineamientos de secuencia y análisis de las secuencias de proteínas para regiones de conservación.

Los bloques de secuencias de aminoácidos conservadas se presentaron a CodeHop (http://blocks.fhcrc.org/codehop.html). A partir de la salida de cebadores degenerados, se produjo una selección de hasta diez cebadores hacia adelante y diez hacia atrás para cada una de las dianas.

1.4 Clonación de secuencias parciales de los genes de Lygus hesperus mediante PCR familiar

ARN intacto de alta calidad se aisló de ninfas de Lygus hesperus. del 1° instar Cualquier ADN genómico presente en la preparación de ARN se separó mediante tratamiento con DNasa. El ADNc se generó utilizando transcriptasa inversa. Para aislar secuencias de ADNc que comprenden un segmento de los genes Lh513, Lh504,2, Lh520, Lh537, Lh334, Lh327, Lh579, Lh332, Lh237, Lh261, Lh300,1, Lh423, Lh512, Lh105 y Lh248, se realizó una serie de reacciones PCR con cebadores degenerados.

Los fragmentos de PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron y secuenciaron. Las secuencias de los productos de PCR resultantes están representadas por las respectivas SEQ ID NO como se proporcionan en la Tabla 3 y se denominan secuencias parciales. Las secuencias de aminoácidos parciales correspondientes están representadas por las respectivas SEQ ID NOs como se proporcionan en la Tabla 4.

Tabla 3

Tabla 4

1.5 Clonación de ADNc de longitud completa mediante RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc)

Con el fin de clonar ADNc de longitud completa, a partir de un clon conocido de fragmento interno de las dianas más potentes, se utilizó el kit RACE 5'/3' (Roche, Cat. n.° 1734792; basado en Sambrook, J. y Russell, D.M). Se siguió el protocolo estándar, descrito en el Instruction Manual. Brevemente, para un RACE 5', se diseñó un cebador antisentido específico para la secuencia diana en la secuencia conocida y se utilizó para una síntesis de ADNc de primera cadena, utilizando ARN de Lygus como molde. Se añadió una cola al ADNc de la primera cadena y se utilizó como ancla para la síntesis de la segunda cadena y amplificación de una porción del extremo desconocida del transcrito. Para un RACE 3', se utilizó un cebador de anclaje oligo dT para la síntesis de ADNc de la primera cadena. Para las RACEs 5' y 3' se utilizaron cebadores anidados, específicos para la secuencia diana en una segunda reacción PCR. Los fragmentos de PCR se analizaron sobre gel de agarosa, se purificaron, se clonaron y se secuenciaron para confirmación.

Las secuencias de ADNc de longitud completa correspondientes a las dianas de Lygus enumeradas en la Tabla 13 se ensamblaron en VectorNTI, un paquete de software de análisis de secuencia completamente integrado para el análisis de secuencia de ADN (Invitrogen). Las secuencias de nucleótidos resultantes de los conjuntos se proporcionan en la Tabla 14 y las secuencias de aminoácidos correspondientes se proporcionan en la Tabla 15.

Tabla 13

Tabla 14

Tabla 15

Ejemplo 2 Producción In vitro de ARNs de doble cadena para silenciamiento qénico

2.1 Producción de ARNdc correspondientes a las secuencias parciales de los genes diana de Leptinotarsa decemlineata y Lygus hesperus

Se sintetizó ARN de doble cadena en cantidades de miligramos. Primero se generaron mediante PCR dos moldes separados de promotor de polimerasa de ARN 5' T7 (un molde codificante y un molde no codificante). Se diseñaron y se llevaron a cabo PCR para producir polinucleótidos de molde codificante y no codificante, que tenía cada uno el promotor T7 en una orientación diferente con respecto a la secuencia diana a transcribir.

Para cada uno de los genes diana, el molde codificante se generó usando un cebador directo T7 específico de diana y un cebador inverso específico de diana. Los moldes no codificantes se generaron utilizando los cebadores directos específicos de diana y los cebadores inversos T7 específicos de diana. Las secuencias de los cebadores respectivos para amplificar los moldes sentido y antisentido mediante PCR para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 5 (para los ADNc de Leptinotarsa decemlineata) y en la Tabla 6 (para los ADNc de Lygus hesperus). Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron. Los moldes T7 codificante y no codificante resultantes se mezclaron y se transcribieron mediante la adición de la ARN polimerasa T7. Los ARN de cadena sencilla producidos mediante transcripción a partir de los moldes se dejaron reasociar, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron mediante precipitación. La cadena sentido del ARNdc resultante producido a partir de cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 5 (para Leptinotarsa decemlineata) y en la Tabla 6 (para Lygus hesperus).

Tabla 5

Tabla 6

Ejemplo 3 Expresión de regulación descendente de genes diana en Leptinotarsa decemlineata como medio para lograr el control de plagas

3.1 Ensayo de moléculas de ARNdc sintetizadas in vitro para determinar la actividad contra las larvas de Leptinotarsa decemlineata

Los ARNdc sintetizados In vitro transcritos a partir de polinucleótidos del molde derivados de genes diana identificados de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1 se sometieron a ensayo para determinar los efectos sobre la supervivencia de las larvas de CPB utilizando ensayos de alimentación. Brevemente, los ensayos basados en la dieta artificial se llevaron a cabo de la siguiente manera. A cada uno de los pocillos de una placa de 48 pocillos se añadieron 0,5 ml de dieta artificial pre-tratada por aplicación tópica de 1000 ng/cm²de ARNdc sintético en 25 pL. Se añadió una sola larva L2 a cada uno de los pocillos. Los ARNdc derivados de una variedad de genes diana se sometieron a ensayo utilizando este método y se analizaron 24 larvas para cada ARNdc. El número total de larvas supervivientes se contó a intervalos regulares de hasta 14 días después del inicio de la alimentación. El tiempo necesario para que cada uno de los ARNdc matara el 50% de las larvas tratadas (LT⁵⁰) se calculó para cada uno de los genes diana investigados y se comparó con el LT⁵⁰para un gen diana de referencia (Ld248) descrito previamente en el documento WO2007/074405. Los resultados se presentan en la Tabla 7.

Tabla 7

A partir de estos resultados, se puede concluir que los ARNdc que fijan como objetivo a los genes CPB identificados en el Ejemplo 1 son más potentes o al menos tan potentes como genes diana CPB de referencia que han sido reseñados previamente en el documento WO2007/074405 es decir, en la mayoría de los casos, las larvas de CPB 'tiempo de matar' fueron más cortas que las de las dianas de referencia Ld105 y Ld248 (como se describió anteriormente en el documento WO2007/074405: Ld105 = [Diana ID NO LD010], Ld248 = [Diana ID NO LD027]). La eficacia contra las larvas de CPB después del consumo de ARNdc difirió dependiendo de la naturaleza del gen diana.

3.2 Ensayo de moléculas de ARNdc sintetizadas in vitro para determinar la actividad contra adultos de Leptinotarsa decemlineata

Los datos proporcionados más adelante ejemplifican los hallazgos que los ARNdc ingeridos producidos a partir de polinucleótidos molde derivados de una diversidad de genes diana de CPB afectaron negativamente la supervivencia, el estado físico, el comportamiento de alimentación, el comportamiento de apareamiento, la producción de huevos y la generación de descendientes de adultos de CPB.

Se sometieron a ensayo diversas dianas de genes seleccionadas de la colección de expresión de ADNc del intestino de las larvas y, como se muestra anteriormente en el Ejemplo 3.1, para ser efectivos con el propósito de matar las larvas de CPB, con el fin de evaluar los efectos de la regulación descendente del gen en escarabajos adultos. Las dianas de genes identificadas como importantes tanto en larvas de CPB como en escarabajos adultos son de particular interés, ya que pueden utilizarse para controlar y/o prevenir la infestación de plagas de insectos en diferentes fases del ciclo de vida de un insecto.

Brevemente, un ensayo en discos de hoja para testar los efectos de moléculas de ARNdc derivadas de diversos genes diana, contra escarabajos adultos, se estableció de la siguiente manera. Se colocó un disco de hoja de patata, diámetro 1,5 cm, tratado con 5 pg de ARNdc objetivo sintetizado in vitro en 20 pL, en un pocillo de una placa de 6 pocillos junto con un adulto de CPB de una semana de edad. Después de algunas horas, una vez que el insecto había consumido por completo el disco de la hoja, se presentó al adulto otro disco de la hoja tratado con 5 pg de ARNdc diana sintetizado in vitro. Para cada uno de los ARNdc a ensayar, un total de diez escarabajos adultos jóvenes (una mezcla de machos y hembras) fueron expuestos a los discos de las hojas tratadas. Al día siguiente, después de que el segundo disco de hoja tratado se había consumido por completo, los diez adultos en cada uno de los grupos de tratamiento se agruparon en la misma caja y se alimentaron con abundante follaje de patata sin tratar. Los escarabajos adultos alimentados con ARNdc derivado del gen GFP se utilizaron como controles en este ensayo. Los números de insectos adultos supervivientes y/o moribundos fueron contados a intervalos regulares desde el día 4 hasta 14 días después del comienzo del ensayo de alimentación. Los adultos de CPB se clasificaron como moribundos si parecían enfermos y con menos movilidad que los adultos sanos y no podían enderezarse por sí mismos cuando se colocaban boca arriba durante más de un minuto. Los efectos sobre la alimentación, el apareamiento, la producción de huevos y la eclosión también se evaluaron a intervalos regulares desde el día 4. Mortalidad y morbilidad

El porcentaje de adultos CPB moribundos y/o muertos evaluados durante un período de 14 días para cada gen diana sometidos a ensayo se muestran en la Figura 1. Además, se calculó el tiempo necesario para alcanzar el 50% de mortalidad de los escarabajos adultos (LT⁵⁰) en cada uno de los grupos de tratamiento y los resultados mostrados en la Tabla 8 se presentan como una relación basada en el LT⁵⁰calculado para un gen diana de referencia descrito previamente en el documento WO2007/074405.

Tabla 8

A partir de estos resultados, se puede concluir que los ARNdc que fijan como objetivo una diversidad de genes CPB identificados en el Ejemplo 1 son más potentes o al menos tan potentes como genes diana CPB de referencia que han sido reseñados previamente en el documento WO2007/074405 es decir, en la mayoría de los casos, los adultos de CPB 'tiempo de matar' fueron más cortos que los de las dianas de referencia Ld105 y Ld248 (como se describió anteriormente en el documento WO2007/074405: Ld105 = [Diana ID NO LD010], Ld248 = [Diana ID NO LD027]). La eficacia contra los adultos de CPB después del consumo de ARNdc difirió dependiendo de la naturaleza del gen fijado como objetivo.

Inhibición de la alimentación

Para todos los genes diana de interés, se observó el cese completo de la alimentación por parte de adultos de CPB desde el día 5 en adelante del ensayo (4 días después de que el follaje de patata tratado se reemplazara por follaje de patata no tratado). Control de adultos de CPB alimentados de manera normal durante todo el ensayo.

Apareamiento, producción de huevos y eclosión de huevos.

El apareamiento, la producción de huevos y la eclosión de los huevos se evaluaron a lo largo del tiempo de 14 días del ensayo. Los resultados se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9

Desde el día 5 en adelante, no se observó apareamiento en adultos de CPB en los grupos tratados, sin embargo, el apareamiento de adultos de CPB en el grupo de control de GFP fue normal.

El día 4, se observaron masas de huevo normales (con 20-30 huevos por masa de huevo) en grupos tratados con ARNdc que fijan como objetivo Ld105, Ld248, Ld516, Ld579 y GFP. (Estas masas de huevo se colocaron entre los días 1 y 3 del ensayo). Sin embargo, para los grupos tratados con ARNdc que fijan como objetivo Ld511, Ld512, Ld513 y Ld537, se encontró una mezcla de masas de huevo normales y huevos individuales. No se observaron masas de huevo normales en el grupo de CPB tratado con ARNdc que fija como objetivo Ld520; solo se observaron huevos individuales.

Los huevos identificados en el día 4 se recogieron y se evaluaron tanto la frecuencia de eclosión como la supervivencia de las larvas. En todos los grupos de tratamiento para los que se recogieron masas de huevos normales, la eclosión fue del 100%, excepto para el grupo Ld537, en el que solo el 50% de los huevos en la masa de huevos recolectados pasaron a eclosionar. Todas las larvas de estas masas de huevos se desarrollaron normalmente.

Para los grupos en los que Ld511 y Ld537 eran los genes diana de interés, menos del 10% de los huevos individuales eclosionaron y estas larvas murieron en el espacio de los 7 días posteriores a la eclosión. Para los grupos en los que los genes diana eran Ld512, Ld520 y Ld513, la frecuencia de eclosión fue del 30%, 70% y 100%, respectivamente.

En el día 5, no se observaron masas de huevo en ninguno de los grupos de tratamiento excepto para el control de GFP. Sin embargo, los huevos individuales estaban presentes en los grupos en los que los genes diana eran Ld105, Ld516, Ld512, Ld537, Ld563 y Ld579. Se observó una mancha amarilla (indicativa de ausencia de huevos intactos) en las cámaras de alimentación de insectos en los grupos tratados con ARNdc que fijan como objetivo Ld248 y Ld511. En los grupos para los que Ld513 y Ld520 eran los genes diana, no se descubrieron huevos.

Los huevos identificados en el día 5 se recogieron y se evaluaron tanto la frecuencia de eclosión como la supervivencia de las larvas. Para los grupos con genes diana Ld512, Ld516 y Ld563, la eclosión fue de entre 20 y 50%, pero todas las larvas del grupo Ld563 murieron dentro de los 7 días posteriores a la eclosión. Para el grupo con Ld579 como diana del gen, todos los huevos eclosionaron y las larvas se desarrollaron normalmente.

El día 6, solo se identificaron huevos individuales en los grupos de tratamiento en los que los genes diana eran Ld512 y Ld579. Se observó una mancha amarilla en el grupo diana Ld248. No hubo huevos en ninguno de los otros grupos de tratamiento. Desde el día 7 en adelante, ninguno de los escarabajos adultos tratados puso huevos. Sin embargo, las hembras de control tratadas con ARNdc de GFP continuaron depositando masas de huevo normales durante todo el ensayo.

E je m p lo 4 E xp re s ió n d e re g u lac ió n d e s c e n d e n te d e g e n e s d ia n a en Lygus hesperus p o r in g es tió n d e A R N d c c o m o m e d io p ara lo g ra r el co n tro l d e p lagas

4.1 M o d ific a c ió n d e l e n s a y o d e a lim e n ta c ió n d e Lygus hesperus p ara p e rm itir una a b s o rc ió n m ás e fe c tiv a d e las m o lé c u la s d e A R N d c

Aunque la dieta de cría de BioServ utilizada para mantener los cultivos de Lygus durante muchas generaciones es eficaz, esta dieta puede no ser apropiada para analizar moléculas de ARNdc candidatas en un ensayo de alimentación. La dieta oligídica incluye ingredientes que no están definidos químicamente y, por lo tanto, algunos componentes pueden interactuar posiblemente con las moléculas a suministrar a las ninfas. Por lo tanto, el ensayo de alimentación de Lygus se ha modificado de manera que consta de dos fases: una exposición inicial de ninfas de instar temprano a moléculas de ARNdc en una dieta simplificada (solo sacarosa al 15%) durante tres días, seguido de la transferencia de las ninfas a una dieta oligídica normal de Lygus para el resto del ensayo.

4.2 E fec to s d e d iv e rs o s A R N d c m ás A R N t d e le v a d u ra s o b re la s u p e rv iv e n c ia d e Lygus hesperus

Ninfas de Lygus hesperus se expusieron a 0,5 pg/pL de ARNdc derivado de un cierto número de genes diana de Lygus hesperus tal como se describe en esta memoria en presencia de 5 pg/pL de ARNt de levadura (Sigma) en un ensayo de alimentación (Figura 2). Los controles son ARNdc de GFP más ARNt de levadura en las mismas concentraciones, respectivamente, y tratamientos de dieta solamente. Ninfas jóvenes fueron expuestas cada una a 25 pL de una dieta de sacarosa al 15% con o sin componentes de ensayo incorporados durante tres días antes de transferirlas a una dieta (Bioserv) compleja de 50 pL. La dieta compleja se actualizó el día 7.

En este ensayo, el ARNdc ingerido de todas las dianas sometidas a ensayo en combinación con ARNt condujo a una alta mortalidad de las ninfas de L. hesperus en comparación con el ARNdc de GFP o los tratamientos solo de control de dieta (Tabla 10).

T a b la 10

Una tabla que clasifica las dianas de acuerdo con la potencia se realiza en base a los resultados de este ensayo de ARNi por alimentación (Tabla 11 y Figura 3).

T a b la 11

En otro ensayo de ARNi por alimentación en las mismas condiciones descritas aquí anteriormente, los autores de la invención sometieron a ensayo los efectos del ARNdc diana de Lh105 y Lh248 sobre la supervivencia de la ninfa de Lygus hesperus. El ARN de doble cadena de las dianas Lh105 y Lh248 a 0,5 pg/pL en presencia de 5 pg/pL de ARNt condujo a una letalidad ninfal significativa de L. hesperusen el día 10 en un ensayo de alimentación (83% para Lh105.2 ARNdc y 58% para ARNdc de Lh248.2 y 71% para ARNdc de Lh248.3) (Figura 6). En el mismo ensayo, los ARNdc de Lh327 y Lh300 mostraron solo 4% y 13% de supervivientes, respectivamente, al final del bioensayo (Figura 6).

4.3 Relación dosis-respuesta a lo largo del tiempo del ARNdc diana contra las ninfas de Lygus hesperus en los ensayos por alimentación de ARNi

La relación dosis-respuesta se estudió para determinar la susceptibilidad de las ninfas de L. hesperus a disminuir las concentraciones de ARNdc de las dianas de ensayo en los ensayos por alimentación de ARNi. Los datos se representan gráficamente en las Figuras 4 y 5. Las curvas de supervivencia estimadas de Kaplan-Meier de las dianas de ensayo a las bajas concentraciones de 0,1, 0,05 y 0,025 pg/pL se compararon con las del control de ARNdc de GFP a 0,1 pg/pL utilizando el ensayo log rank (Tabla 12).

Tabla 12

^{T o d a s la s d ia n a s s o m e t id a s a e n s a y o fu e ro n tó x ic a s p a ra la s n in fa s d e} L. hesperus ^{a c o n c e n tra c io n e s ta n b a ja s}c o m o 0,1 p g /p L . El A R N d c d e L h 423 d ia n a a e s ta c o n c e n tra c ió n p ro p o rc io n ó u n a s u p e rv iv e n c ia d e n in fa s d e l0 % h a c ia e l f in a l d e lo s b io e n s a y o s . A la c o n c e n tra c ió n m á s b a ja p ro b a d a , e s d e c ir , 0 ,025 p g /p L , e l L h 423 d ia n a a ú n m o s tró u n a c a íd a s ig n if ic a t iv a e n la s u p e rv iv e n c ia e n c o m p a ra c ió n c o n G F P . L o s A R N d e d o b le c a d e n a d e la s d ia n a s L h 300.1 y L h 327 ta m b ié n d e m o s tra ro n u n a a lta p o te n c ia a b a ja s c o n c e n tra c io n e s c o n c a íd a s s ig n if ic a t iv a s en la s u p e rv iv e n c ia a 0 ,05 p g /p L .

Ejemplo 5 Generación de plantas resistentes a especies de plagas de insectos

5.1 Ensamblaje de vectores de expresión de plantas que comprenden una secuencia de horquilla de Lygus hesperus o una secuencia de horquilla de Leptinotarsa decemlineata para la transformación de patata o algodón

D a d o q u e e l m e c a n is m o d e in te r fe re n c ia d e A R N o p e ra a t ra v é s d e fra g m e n to s d e A R N d c , la s s e c u e n c ia s de p o lin u c le ó t id o s d ia n a s e c lo n a ro n e n o r ie n ta c ió n a n t is e n t id o y s e n tid o , s e p a ra d a s p o r un in tró n (S E Q ID N O 250 ), p a ra fo rm a r u n a c o n s tru c c ió n d e h o rq u il la d e A R N d c . L a s c o n s tru c c io n e s d e h o rq u il la d e A R N d c q u e c o d if ic a n la ^{m o lé c u la d e A R N d c d e} L. hesperus ^{d e r iv a d a d e lo s g e n e s d ia n a c o m o s e m e n c io n a e n e s ta m e m o r ia se}s u b c lo n a ro n e n un v e c to r d e e x p re s ió n d e p la n ta s . D e m a n e ra s im ila r , u n a c o n s tru c c ió n d e c o n tro l d e h o rq u illa A R N d c d e G U S , e n d o n d e la s e c u e n c ia d e p o lin u c le ó t id o s s e n t id o q u e c o d if ic a G U S (S E Q ID N O 272 ) s e c lo n ó en o r ie n ta c ió n a n t i-s e n t id o y s e n tid o , s e p a ra d a p o r e l m is m o in tró n (S E Q ID N O 250 ), s e s u b c lo n ó en un v e c to r d e e x p re s ió n d e p la n ta .

El v e c to r d e e x p re s ió n d e p la n ta s c o m p re n d e ta m b ié n e le m e n to s n e c e s a r io s p a ra e l m a n te n im ie n to de l p lá s m id o en u n a c é lu la b a c te r ia n a . L a c o n s tru c c ió n d e la h o rq u il la d e A R N d c s e e n c u e n tra e n tre el b o rd e iz q u ie rd o (L B ) y el b o rd e d e re c h o (R B ), 3 ' a g u a s a b a jo d e l p ro m o to r d e l v iru s d e l m o s a ic o d e la c o lif lo r 35 S (P 35 S ) y 5 ' a g u a s a rr ib a de l te rm in a d o r T N O S . S e s u b c lo n ó un c a s e te d e e x p re s ió n d e in fo rm a d o r d e G F P q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e G F P f la n q u e a d a p o r e l p ro m o to r y e l te rm in a d o r P 35 S e n el v e c to r d e tra n s fo rm a c ió n d e p la n ta q u e a lb e rg a e l c a s e te d e ^{h o rq u il la d e} L. hesperus. ^{U n c a s e te d e e x p re s ió n d e N P T II q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e N P T II f la n q u e a d a p o r el}p ro m o to r y te rm in a d o r P 35 S s e u t iliz a p a ra s e le c c io n a r la s p la n ta s q u e s e h a n tra n s fo rm a d o e f ic a z m e n te . U n e n s a m b la je c o r re c to d e lo s f ra g m e n to s g e n é t ic o s e n e l v e c to r d e e x p re s ió n d e p la n ta s s e c o n f irm ó m e d ia n te s e c u e n c ia c ió n (F ig u ra 7 ).

^{L o s v e c to re s d e e x p re s ió n d e p la n ta s q u e c o m p re n d e n la s h o rq u il la s d ia n a d e} L. hesperus ^{in d iv id u a le s s e tra n s fo rm a ro n p o s te r io rm e n te e n} Agrobacterium tumefaciens. ^{P a ra to d o s lo s g e n e s d ia n a d e} L. hesperus m e n c io n a d o s e n e s ta m e m o r ia , lo s f ra g m e n to s p u e d e n s e le c c io n a rs e y c lo n a rs e c o m o h o rq u il la s d e u n a m a n e ra s im ila r .

5.2 Transformación de la patata con un vector de expresión de planta que comprende una secuencia de horquilla de Lygus hesperus o secuencia de horquilla de Leptinotarsa decemlineata y el ensayo de las plantas de patata transformadas para resistencia frente a L. hesperus o Leptinotarsa decemlineata

El e je m p lo q u e s e p ro p o rc io n a a c o n t in u a c ió n e s u n a e je m p lo d e l h a lla z g o d e q u e la s p la n ta s d e p a ta ta t ra n s g é n ic a q u e e x p re s a n lo s A R N d e h o rq u il la e s p e c íf ic o s d e g e n e s d ia n a a fe c ta n a d v e rs a m e n te a la s u p e rv iv e n c ia y /o el d e s a rro llo d e la s e s p e c ie s d e p la g a s d e in s e c to s .

Alimentación de ARNi de Lygus hesperus in planta

Transformación de patata

P la n ta s d e p a ta ta t ra n s fo rm a d a s d e fo rm a e s ta b le s e o b tu v ie ro n u s a n d o un p ro to c o lo a d a p ta d o re c ib id o p o r J u lie G ilb e r t e n e l P ro y e c to d e G e n o m a d e P a ta ta N S F ( h t tp : / /w w w .p o ta to g e n o m e .o rg /n s f5 ). L o s e x p la n te s d e e n tre n u d o s d e l ta llo d e la 'L ín e a V ' d e p a ta ta (o b te n id a o r ig in a lm e n te de l L a b o ra to r io d e F ito m e jo ra m ie n to e n P R I W a g e n in g e n , ^{P a ís e s B a jo s ) q u e s e d e r iv a b a d e l d ip lo id e s u s c e p tib le} Solanum tuberosum ^{6487 -9 s e u t il iz ó c o m o m a te r ia l de p a rt id a p a ra la t ra n s fo rm a c ió n . L o s e x p la n te s d e r iv a d o s} in vitro ^{s e in o c u la ro n co n} Agrobacterium tumefaciens C 58 C 1 R ifR q u e c o n te n ía la s c o n s tru c c io n e s d e h o rq u illa . D e s p u é s d e t re s d ía s d e c o c u lt iv o , lo s e x p la n te s se c o lo c a ro n e n un m e d io s e le c t iv o q u e c o n te n ía 100 m g /l d e k a n a m ic in a y 300 m g /l d e t im e n t in a . D e s p u é s d e 6 s e m a n a s t ra s la t ra n s fo rm a c ió n , lo s p r im e ro s b ro te s p u ta t iv o s s e re t ira ro n y s e a r ra ig a ro n e n un m e d io s e le c t iv o . L o s b ro te s q u e s e o r ig in a n d e d ife re n te s e x p la n te s s e tra ta ro n c o m o e v e n to s in d e p e n d ie n te s , lo s b ro te s q u e s e o r ig in a n d e l m is m o c a llo s e d e n o m in a ro n 'h e rm a n o s ' h a s ta q u e s u e s ta d o c lo n a l p u d ie ra v e r i f ic a rs e m e d ia n te tra n s fe re n c ia S o u th e rn , y lo s c o r te s n o d a le s d e un b ro te s e d e n o m in a ro n 'c lo n e s '.

E l e s ta d o tra n s g é n ic o d e lo s b ro te s d e e n ra iz a m ie n to s e v e r i f ic ó m e d ia n te f lu o re s c e n c ia p o r G F P y m e d ia n te P C R m á s /m e n o s p a ra la s e c u e n c ia d ia n a in s e rta d a . L o s b ro te s p o s it iv o s s e p ro p a g a ro n c lo n a lm e n te en c u lt iv o d e te jid o s ^{p a ra a s e g u ra r q u e h u b ie ra s u f ic ie n te s ré p lic a s d is p o n ib le s p a ra lo s e n s a y o s} Lygus hesperus ^o Leptinotarsa decemlineata. ^{E s to s b ro te s s e m a n tu v ie ro n e n m e d io d e c u lt iv o d e te j id o s p a ra u n a m a y o r f le x ib i l id a d p a ra s o m e te r a e n s a y o la re s is te n c ia a la s n in fa s /a d u lto s d e} Lygus ^{o la rv a s /a d u lto s d e} L. decemlineata. ^{L a s p r im e ra s p la n ta s}e s tu v ie ro n d is p o n ib le s p a ra p ru e b a s c a to rc e s e m a n a s t ra s la t ra n s fo rm a c ió n .

Bioensavo

S ig u ie n d o lo s re s u lta d o s p o s it iv o s o b te n id o s e n lo s e x p e r im e n to s d e a lim e n ta c ió n d e A R N d c s e in ic ia ro n ^{e x p e r im e n to s} in planta ^{d e p ru e b a d e p r in c ip io .}

L a s p lá n tu la s s e a n a liz a ro n m e d ia n te P C R p a ra c o n f irm a r la in te g ra c ió n d e l A D N -T y la p re s e n c ia d e la h o rq u illa , a n te s d e q u e s e p ro p a g a ra . S e p ro d u je ro n e x p la n te s en e x c e s o c o n el f in d e o b te n e r a l m e n o s 30 e v e n to s in d e p e n d ie n te s p a ra c a d a c o n s tru c c ió n .

^{El e n s a y o} in planta ^{p a ra} Lygus hesperus ^{s e d e s a rro lló c o n p lá n tu la s d e p a ta ta} in vitro, ^{q u e s u fr ie ro n la s u p e rv iv e n c ia d e l in s e c to p o r lo m e n o s d u ra n te 8 d ía s , m a n te n ie n d o b a ja m o r ta lid a d d e fo n d o . L a s n in fa s d e} L. hesperus s o b re v iv ie ro n y s e a lim e n ta ro n d e p lá n tu la s d e p a ta ta d e t ip o s ilv e s tre . E s to fu e re s p a ld a d o p o r e l d a ñ o v is u a l p ro v o c a d o p o r lo s in s e c to s q u e s e o b s e rv ó e n la s h o ja s y lo s b ro te s (F ig u ra 8).

^{E n e l e n s a y o ,} L. hesperus ^{s e a l im e n tó c o n p a ta ta tra n s g é n ic a , e x p re s a n d o A R N d c d e h o rq u il la d ir ig id a a la s d ia n a s d e} L. hesperus ^{id e n t if ic a d a s e n e s ta m e m o r ia . S e g e n e ra ro n p lá s m id o s q u e c o n t ie n e n c o n s tru c c io n e s d e h o rq u il la y}un c o n tro l d e G U S .

P la n ta s d e p a ta ta t r a n s g é n ic a s jó v e n e s s e m a n tu v ie ro n e n m e d io d e c u lt iv o d e te j id o s e n u n a c á m a ra d e s a la d e c re c im ie n to d e p la n ta s co n la s s ig u ie n te s c o n d ic io n e s : 25 ± 1 °C , 50 ± 5 % d e h u m e d a d re la t iv a , 16 :8 h o ra s d e fo to p e r ío d o d e lu z :o s c u r id a d .

P o r c o n s tru c c ió n , s e g e n e ró un c ie r to n ú m e ro d e e v e n to s , en e s te c a s o 30 (P 006 /X X ) , c o n un n ú m e ro a d e c u a d o d e ^{c lo n e s (m á s d e 20 ) p o r e v e n to . S e c o lo c ó un c ie r to n ú m e ro d e n in fa s /a d u lto s jó v e n e s d e} Lygus ^{e n la s p la n ta s d e}p a ta ta jó v e n e s e n ja u la d a s in d iv id u a lm e n te (p o r e je m p lo , e n la fa s e d e 4 a 5 h o ja s d e s p le g a d a s ) y s e d e ja ro n d u ra n te ^{a l m e n o s s ie te d ía s . L a re s is te n c ia a} Lygus hesperus ^{s e e v a lu ó re g u la rm e n te d u ra n te e l p e r ío d o de l e n s a y o en}té rm in o s d e re d u c c ió n d e la s u p e rv iv e n c ia d e n in fa s /a d u lto s , re tra s o e n e l d e s a rro llo y re tra s o e n el c re c im ie n to , y /o d is m in u c ió n d e l d a ñ o a la a lim e n ta c ió n d e la s p la n ta s . L a F IG U R A 9 m u e s tra e s p e c íf ic a m e n te la s u p e rv iv e n c ia d e ^{n in fa s d e} L. hesperus. ^{L o s e v e n to s tra n s g é n ic o s s e c o m p a ra ro n co n lo s e v e n to s tra n s fo rm a d o s c o n h o rq u il la G U S}d e c o n tro l (P 001 /X X ) y la s p a ta ta s d e t ip o s ilv e s tre (F ig u ra 9 y F ig u ra 10).

U n b io e n s a y o p a ra s o m e te r a e n s a y o p la n ta s tra n s g é n ic a s , t ra n s fo rm a d a s c o n c o n s tru c c io n e s d e h o rq u illa ^{e s p e c íf ic a s p a ra} L. decemlineata ^{, e n c u a n to a la re s is te n c ia c o n tra la rv a s o a d u lto s d e} L. decemlineata ^{s e re a liz a d e la m is m a m a n e ra q u e s e d e s c r ib e p a ra} L. hesperus.

5.3 Transformación de algodón con un vector de expresión de planta que comprende una secuencia de horquilla de Lygus hesperus y el ensayo del material de callo de algodón transformado o plantas para la resistencia hacia L. hesperus

El e je m p lo q u e s e p ro p o rc io n a a c o n t in u a c ió n e s u n a e je m p lo de l h a lla z g o d e q u e la s p la n ta s o c a llo d e a lg o d ó n t r a n s g é n ic o q u e e x p re s a n lo s A R N d e h o rq u il la e s p e c íf ic o s d e g e n e s d ia n a a fe c ta n a d v e rs a m e n te a la s u p e rv iv e n c ia y /o e l d e s a rro llo d e la s e s p e c ie s d e p la g a s d e in s e c to s .

Transformación de algodón

L a s e m illa C o k e r 312 s e e s te r il iz a s u p e r f ic ia lm e n te u t i l iz a n d o p r im e ro un la v a d o d u ra n te 5 m in u to s e n e ta n o l a l 70 % y lu e g o a g ita n d o e n u n a s o lu c ió n d e b la n q u e o al 20 % (C h lo ro x C o . U S A , c lo ro d is p o n ib le a l 1 % ) m á s 10 g o ta s de l d e te rg e n te n o ió n ic o , T w e e n ® 20 , p o r litro . L a s e m illa s e e n ju a g a lu e g o 3 v e c e s e n a g u a d e s t ila d a e s té r il a n te s de s e c a rs e m e d ia n te tra n s fe re n c ia p o r a d s o rc ió n e n p a p e le s d e f i lt r o e s té r ile s . L a s e m illa e s té r il s e g e rm in a e n m e d io d e G e rm in a c ió n d e S e m illa s (S G ) d u ra n te 4 -6 d ía s , y e n e s te p u n to lo s h ip o c o ti lo s s e re c o le c ta n y s e c o r ta n en tra m o s d e 0 ,5 cm lis to s p a ra la in o c u la c ió n d e A g ro b a c te r iu m . L a s s e c c io n e s d e c o r te s e c o lo c a n e n p a p e le s d e f i lt ro e s té r ile s s u p e rp o n ie n d o un m e d io b a s a d o e n M u ra s h ig e y S k o o g q u e no c o n t ie n e f ito h o rm o n a s . L o s e x p la n te s s e in c u b a n e n un c ic lo d e 16 :8 h o ra s d ía :n o c h e a 28 °C /- 2 °C d u ra n te 3 d ía s a n te s d e la in o c u la c ió n .

^{P a ra la in o c u la c ió n , s e c u lt iv a d u ra n te to d a la n o c h e un c u lt iv o d e L B líq u id o d e} Agrobacterium tumefaciens ^{(10 m l),}c e p a G V 3101 (p M P 90 ) G e n tR o c e p a L B A 4404 q u e c o n t ie n e la d ia n a d e h o rq u il la d e A R N s e le c c io n a d a y un c a s e te de selección de plantas que codifica resistencia a higromicina, y se utilizan 5 ml para inocular un cultivo de 100 ml la noche antes de la inoculación. El cultivo se centrifuga, se resuspende y se diluye hasta una OD600 de 0,15 en el medio de dilución bacteriano.

Los segmentos de hipocótilos se inoculan con la suspensión de Agrobacterium durante 5 minutos. Después de esto, los explantes se transfieren por adsorción a un papel de filtro estéril para quitar el exceso de suspensión bacteriana. Los explantes se inoculan en la oscuridad sobre Medio de Co-cultivo de Algodón (CCM) durante 48 horas. Los explantes se colocan luego en medio de inducción selectiva de callos (SCIM) que contiene 10 mg/l de higromicina y 500 mg/l de cefotaxima y que incluye las fitohormonas ácido 2,4-diclorofenoxiacético (0,1 pg/ml) y kinetina (0,1 pg/ml). Después de 4-6 semanas, se observan los primeros callos resistentes, y estos pueden retirarse a SCIM fresco y amplificarse adicionalmente para evaluación molecular y bioensayos de insectos. Las placas se renuevan cada 4-6 semanas para mantener los nutrientes y la selección de antibióticos.

Los callos que muestran proporcionar un resultado positivo en el bioensayo de alimentación de insectos se eligen para la regeneración y el callo se transfiere a medio no selectivo para la maduración de los embriones somáticos, la fórmula se basa en la publicación de Trolinder y Goodin, 1986. Una vez que los embriones han alcanzado 4 mm de longitud y han diferenciado los cotiledones y las radículas (2-3 meses después de la transferencia a medio de maduración), pueden transferirse a medio de enraizamiento de elongación. Este consiste en vermiculita esterilizada en grandes tubos de ensayo impregnada con un medio líquido basado en Stewart y Hsu (1977) enriquecido con cinetina, ácido giberélico ambos añadidos a la concentración final de 0,1 mg/l. Los embriones se incuban a 28°C en un ciclo de 16:8 día/noche, y una vez que alcanzan la fase de 2-3 hojas, las plántulas se pueden endurecer en macetas de vermiculita encerradas en un propagador para mantener la humedad. Una vez que las plantas están completamente endurecidas (fase de 4-6 hojas verdaderas) se pueden traspasar a maceta en una mezcla de turba:marga 50:50 y crecer en un ciclo de luz 14:10 a 30/20°C día/noche.

Bioensavo

Ninfas de Lygus se colocan en una placa de Petri que contiene tejido de callo de algodón no diferenciado que expresa ARN de horquilla diana. Por construcción, se genera un cierto número de callos de algodón transformados y se evalúan en un bioensayo de alimentación para supervivencia reducida de ninfas/adultos y/o desarrollo retrasado y crecimiento atrofiado. Los callos transgénicos que no expresan el fragmento del gen del ARN de horquilla diana de Lygus sirven como control negativo. Asimismo, las plantas de algodón regeneradas jóvenes de callos transgénicos se cultivan en suelo en una cámara de cultivo de plantas con las siguientes condiciones: 30/20°C día/noche, 50 ± 5% de humedad relativa, 14:10 horas de fotoperíodo de luz:oscuridad. Por construcción, se generan varios eventos (por ejemplo, veinte). Se colocó un cierto número de ninfas/adultos jóvenes de Lygus en las plantas jóvenes enjauladas individualmente (por ejemplo, en la fase de 4-5 hojas desplegadas) y se dejan durante al menos siete días antes de evaluar la resistencia a Lygus hesperus en términos de supervivencia reducida de ninfas/adultos, retraso en el desarrollo y retraso en el crecimiento, y/o disminución del daño a la alimentación de las plantas. Plantas de algodón no transformadas con el fragmento de gen de ARN de horquilla diana de Lygussirven como control negativo.

Claims

R E IV IN D IC A C IO N E S

^1.Un ácido ribonucleico (ARN) interferente que funciona tras la absorción por una especie de plagas de insectos para regular de forma descendente la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos, en donde el gen diana

(i) se selecciona del grupo de genes que tienen una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253, 152, o que tienen una secuencia de nucleótidos que, cuando las dos secuencias se alinean y comparan óptimamente, es al menos 85% idénticos a cualquiera de las SEQ ID NO 277, 138, 253 y 152 o

(ii) es un ortólogo de plagas de insectos de un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NOs 277, 138, 253 y 152, en donde los dos genes ortólogos son similares en secuencia en tal grado que cuando los dos genes son alineados y comparados de manera óptima, el ortólogo tiene una secuencia que es al menos 85% idéntica a cualquiera de las secuencias representadas por las SEQ ID NOs 277, 138, 253 y 152;

en donde dicho ARN interferente comprende al menos un elemento silenciador, en el que el elemento silenciador es una región de ARN de doble cadena que comprende cadenas complementarias reasociadas, una de las cuales comprende una secuencia de al menos 21 nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos diana dentro dicho gen diana.

^2.El ARN interferente de la reivindicación 1, en donde la especie de plaga de insectos es una plaga de plantas.

^3.El ARN interferente de la reivindicación 2, en donde la plaga de plantas se selecciona del género Lygus.

^4.El ARN interferente de la reivindicación 3, en donde la especie de plaga de plantas es Lygus hesperus.

^5.Un polinucleótido aislado que codifica el ARN interferente de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Una construcción de ADN que comprende la secuencia de polinucleótidos de la reivindicación 5.

^7.La construcción de ADN de la reivindicación 6, en donde la construcción es una construcción de expresión y en donde la secuencia polinucleotídica está operativamente unida a al menos una secuencia reguladora capaz de impulsar la expresión de la secuencia polinucleotídica.

8. Una célula hospedadora que comprende un ARN interferente de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el polinucleótido de la reivindicación 5 o la construcción de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 6-7.

^9.La célula hospedadora de la reivindicación 8, en donde la célula hospedadora es una célula procariota o eucariota.

^10.La célula hospedadora de la reivindicación 9, en donde la célula hospedadora es una célula bacteriana o una célula vegetal.

^11.Una composición para prevenir y/o controlar la infestación de plagas de insectos que comprende al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y al menos un soporte, excipiente o diluyente adecuado.

^12.La composición de la reivindicación 11, que comprende una célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde el ARN se expresa dentro de dicha célula hospedadora.

^13.Uso de un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, una célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12 para prevenir y/o controlar la infestación de plagas.

^14.Uso de un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, una célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12 como plaguicida para una planta o para material de propagación o reproductivo de una planta.

^15.Un método para regular de forma descendente la expresión de un gen diana en una especie de plaga de insectos, que comprende poner en contacto dicha especie de plaga con una cantidad efectiva de al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una cantidad efectiva de una composición de acuerdo con la reivindicación 11 o 12.

^16.El método de la reivindicación 15, en el que la regulación descendente de la expresión de un gen diana en una especie de plaga de insectos se utiliza para prevenir y/o controlar la infestación de plagas.

^17.Un método para generar una planta transgénica resistente a la infestación por parte de una especie de plaga de insectos que comprende:

(a) transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4;

(b) regenerar una planta a partir de la célula vegetal transformada; y

(c) cultivar la planta transformada en condiciones adecuadas para la expresión del ARN interferente de la construcción de ADN recombinante, siendo dicha planta, por tanto, resistente a dicha plaga en comparación con una planta sin transformar.

^18.Una planta transgénica producida por el método de la reivindicación 17, en donde dicha planta expresa al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

^19.Una planta transgénica, o material de reproducción o propagación para una planta transgénica o una célula vegetal transgénica cultivada, que expresa al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

^20.Semilla, producida a partir de la planta transgénica de la reivindicación 18 o 19, en donde dicha semilla expresa al menos un ácido ribonucleico (ARN) interferente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.