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ES2739623T3 - Sistemas y composiciones para diagnosticar el esófago de Barrett y métodos para usarlos - Google Patents

Sistemas y composiciones para diagnosticar el esófago de Barrett y métodos para usarlos Download PDF

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ES2739623T3
ES2739623T3 ES12757085T ES12757085T ES2739623T3 ES 2739623 T3 ES2739623 T3 ES 2739623T3 ES 12757085 T ES12757085 T ES 12757085T ES 12757085 T ES12757085 T ES 12757085T ES 2739623 T3 ES2739623 T3 ES 2739623T3
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membrane
biomarkers
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ES12757085T
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Rebecca Thorne
Bruce Campbell
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Cernostics Inc
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Cernostics Inc
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Abstract

Un método para determinar el riesgo de progresión del esófago de Barrett en un sujeto, que comprende: a) detectar un subconjunto de biomarcadores en una muestra del sujeto, en donde dos o más biomarcadores en dicho subconjunto se seleccionan del grupo que consiste en p53, HIF-1alfa, beta-catenina y COX-2; y b) determinar al menos una o más características descriptivas asociadas con cada uno de dichos dos o más biomarcadores, en donde las características descriptivas se seleccionan de: percentil 1, 5, 95, 99 de la intensidad media de p53 en células; percentil 95, 99 de la intensidad media de p53 en ácidos nucleicos; percentil 95, 99 de la intensidad media del p53 en citoplasma; percentil 1 de la relación entre citoplasma:membrana nuclear de p53; percentil 50, 99 de la intensidad media de HIF-1alfa en ácidos nucleicos; percentil 99 de la intensidad media del HIF-1alfa en citoplasma; percentil 50, 99 de la intensidad media de HIF-1alfa en células; percentil 1 de la membrana de HIF-1alfa; percentil 5 de la relación entre citoplasma:membrana plasmática de HIF-1alfa; percentil 1, 5 de la intensidad media de beta-catenina en células; percentil 1, 5 de la intensidad media de beta-catenina en ácidos nucleicos; percentil 1, 5 de la intensidad media de beta-catenina en citoplasma; percentil 5 de la relación entre célula:citoplasma de la beta-catenina; percentil 50, 95, 99 de la relación membrana plasmática:núcleo de COX-2; percentil 50, 95, 99 de la relación membrana:núcleo de COX-2; percentil 1, 5, 50 de la relación citoplasma:membrana plasmática de COX-2; percentil 5 de la relación célula:citoplasma de COX-2; y en donde la característica descriptiva y su presencia, ausencia, ubicación, relación o cantidad determina un valor numérico, en relación con un control, donde el valor numérico para cada característica descriptiva y su presencia, ausencia, ubicación, relación o cantidad se proporciona en la Tabla 4 o Tabla 5 como Efecto; combinando los valores numéricos determinados de cada uno de los dos o más biomarcadores seleccionados a través de una función de interpretación o algoritmo para determinar una puntuación de riesgo que se correlaciona con el riesgo de progresión del esófago de Barrett en el sujeto, en donde la puntuación de riesgo es una puntuación de 1-100, donde 1 indica el menor riesgo de progresión y 100 indica el mayor riesgo de progresión del esófago de Barrett en el sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas y composiciones para diagnosticar el esófago de Barrett y métodos para usarlos
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un método para determinar el riesgo de progresión del esófago de Barrett (BE) en un sujeto y al uso de un kit en el método.
Antecedentes de la invención
El esófago de Barrett es una consecuencia de la enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE) y afecta aproximadamente a 3 millones de pacientes en los Estados Unidos, habiendo 86.000 casos nuevos que se diagnostican cada año. Aldulaimi et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. Septiembre, 2005; 17(9): 943-50, describen que el diagnóstico por esófago de Barrett predispone a los pacientes a desarrollar adenocarcinoma esofágico con un riesgo calculado de 30 a 125 veces más, en comparación con los pacientes sin diagnóstico. El adenocarcinoma esofágico se desarrolla en una secuencia definida de cambios que va desde una displasia benigna a una displasia de bajo grado, una displasia de alto grado y un cáncer maligno.
Los pacientes con esófago de Barrett se someten a exámenes de detección con cierta frecuencia (desde cada 3 meses a cada 3 años, según la etapa de la enfermedad) mediante endoscopia y se realizan biopsias para determinar la histopatología. Las biopsias se analizan mediante análisis microscópico manual con hematoxilina tradicional y tinción con eosina de cortes de tejido. El diagnóstico del esófago de Barrett se basa en criterios histológicos establecidos y en un conjunto mínimo de biomarcadores medidos individualmente para detectar anomalías.
Ejemplos de publicaciones que describen biomarcadores epiteliales que tienen importancia diagnóstica y/o pronóstica en el esófago de Barrett (BE) y que se detectan/analizan utilizando la tinción inmunohistoquímica tradicional con puntuación manual son:
El documento WO 2007/045896; Allameh A et al: "Immunohistochemical analysis of selected molecular markers in esophagus precancerous, adenocarcinoma and squamous cell carcinoma in Iranian subjects", Cancer Epidemiology, vol. 33, no. 1, 1 de julio de 2009, páginas 79-84; Kyrgidis A et al: "New Molecular Concepts of Barrett's Esophagus: Clinical Implications and Biomarkers", Journal of Surgical Research, vol. 125, no. 2, 15 de mayo de 2005, páginas 189-212; Herman van Dekken et al.: "Immunohistochemical Evaluation of a Panel of Tumor Cell markers during Malignant Progression in Barrett Esophagus", American Journal of Clinical Pathology, vol. 130, no. 5, 14 de octubre de 2008, páginas 745-753; y Hormi-Carver K et al: "Molecular Markers and Genetics in Cancer Development", Surgical Oncology Clinics of North America, vol. 18, no. 3, 1 de julio de 2009, páginas 453-467.
El procedimiento de selección tiene muchas limitaciones. Por ejemplo, el diagnóstico de esófago de Barrett se puede caracterizar en diferentes estadios, como la displasia de bajo grado, displasia de alto grado y atipia reactiva. Estas "etapas" de BE comparten características histológicas y son difíciles de distinguir utilizando el análisis actual basado en H&E. Con frecuencia, el diagnóstico da como resultado un diagnóstico erróneo “indeterminado/indefinido”, un retraso en el diagnóstico o un tratamiento inadecuado. Además, la forma actual de análisis histológico es insuficiente para diagnosticar con precisión las diversas etapas de la enfermedad de BE y para predecir la progresión a etapas más altas de la enfermedad.
Existe la necesidad de características informáticas/descriptivas de patología de BE para integrar datos de biomarcadores, datos morfológicos en torno a una muestra de tejido y datos clínicos en los índices de toma de decisiones. También es necesario realizar pruebas diagnósticas, pronósticas y predictivas más precisas para guiar el control clínico y la prevención de formas malignas de cáncer gastrointestinal. Existe la necesidad de una mayor vigilancia y estratificación de la estadificación de BE y la predicción de tratamientos efectivos o la prevención del cáncer maligno en sí. La invención se refiere a un sistema, un aparato, una composición, un dispositivo y un método para usar éste y extraer información específica de biomarcadores a partir de muestras celulares para mejorar la precisión del diagnóstico, permitir predicciones de la progresión de la enfermedad y del desarrollo del cáncer, predecir la capacidad de respuesta ante las Intervenciones terapéuticas, y mejorar el control del BE o cualquier cáncer derivado de tejidos diagnosticado como el BE.
Compendio de la invención
La invención se refiere a un método para determinar el riesgo de progresión del esófago de Barrett en un sujeto, que comprende:
a) detectar un subconjunto de biomarcadores en una muestra del sujeto, en donde dos o más biomarcadores en dicho subconjunto se seleccionan del grupo que consiste en p53, HIF-1 alfa, beta-catenina y COX-2; y
b) determinar al menos una o más características descriptivas asociadas con cada uno de dichos dos o más biomarcadores, en donde las características descriptivas se seleccionan de:
percentil 1, 5, 95, 99 de la intensidad media de p53 en células; percentil 95, 99 de la intensidad media de p53 en ácidos nucleicos; percentil 95, 99 de la intensidad media del p53 en citoplasma; percentil 1 de la relación entre citoplasma:membrana nuclear de p53;
percentil 50, 99 de la intensidad media de HIF-1 alfa en ácidos nucleicos; percentil 99 de la intensidad media del HIF-1 alfa en citoplasma; percentil 50, 99 de la intensidad media de HIF-1 alfa en células; percentil 1 de la membrana de HIF-1 alfa; percentil 5 de la relación entre citoplasma:membrana plasmática de HIF-1 alfa;
percentil 1, 5 de la intensidad media de beta-catenina en células; percentil 1, 5 de la intensidad media de beta-catenina en ácidos nucleicos; percentil 1, 5 de la intensidad media de beta-catenina en citoplasma; percentil 5 de la relación entre célula:citoplasma de la beta-catenina;
percentil 50, 95, 99 de la relación membrana plasmática:núcleo de COX-2; percentil 50, 95, 99 de la relación membrana:núcleo de COX-2; percentil 1, 5, 50 de la relación citoplasma:membrana plasmática de COX-2; percentil 5 de la relación célula:citoplasma de COX-2;
y en el que la característica descriptiva y su presencia, ausencia, ubicación, proporción o cantidad determina un valor numérico, relativo a un control, donde el valor numérico para cada característica descriptiva y su presencia, ausencia, ubicación, proporción o cantidad se proporciona en la Tabla 4 o Tabla 5 como Efecto; combinando los valores numéricos determinados de cada uno de los dos o más biomarcadores seleccionados a través de una función de interpretación o algoritmo para determinar una puntuación de riesgo que se correlaciona con el riesgo de progresión del esófago de Barrett en el sujeto, en donde la puntuación de riesgo es una puntuación de 1-100, en la que 1 indica el menor riesgo de progresión y 100 indica el mayor riesgo de progresión del esófago de Barrett en el sujeto.
En algunas realizaciones de la invención, el método comprende además detectar al menos uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en AMACR, CD1a, CD45RO, CD68, CK-20, Ki-67, NF-kB, y p16, en donde las características descriptivas se seleccionan de:
percentil 99 de la proporción de células:núcleos plasmáticos de AMACR; percentil 50 de la relación membrana AMACR:p16 núcleo; percentil 50 de la relación membrana:núcleo AMACR; percentil 1, 5, 50 de intensidad media de las células AMACR; percentil 1 y 5 de la relación de citoplasma AMACR:membrana plasmática p16; percentil 5, 50 y 99 de intensidad media de núcleos de AMACR; percentil 1 de la relación de citoplasma:membrana plasmática de AMACR;
percentil 1, 5, 50, 95, 99 de intensidad media celular CD1a; percentil 1, 5, 50, 95 de intensidad media citoplasmática CD1a; percentil 1, 5, 50, 95, 99 de intensidad media de los núcleos CD1a; percentil 1 y 5 de citoplasma CD1a:membrana CD45RO; percentil 1 de relación de citoplasma CD1a:membrana plasmática;
percentil 1 de relación citoplasma CD45RO: membrana Half1alfa; percentil 99 de relación de membrana CD45RO: núcleo HIF1alfa; percentil 5 de relación citoplasma CD45RO: membrana plasmática HIF1alfa;
percentil 99 de intensidad media en núcleos de CD68; 0,99 de intensidad media en citoplasma de CD68; percentil 99 de intensidad media celular de CD68; percentil 1 y 5 de relación de citoplasma CD68: membrana; percentil 50 y 5 de relación de citoplasma CD68: membrana plasmática COX2; percentil 1 y 5 de relación de citoplasma y membrana plasmática de CD68;
percentil 99 y 1 de relación de citoplasma CK20: membrana nuclear Ki67; percentil 99 y 95 de relación de membrana plasmática CK20: núcleo Ki67; percentil 95 de relación de citoplasma CK20: membrana nuclear Ki67; percentil 99 de intensidad media de Ki-67 en núcleos; percentil 50 de relación de membrana nuclear Ki-67: núcleos de beta-catenina; percentil 50 y 99 de relación de membrana nuclear Ki-67: núcleo total; percentil 1 de relación de citoplasma Ki-67: membrana nuclear; percentil 95 de relación de membrana nuclear Ki67: núcleo;
percentil 1 y 5 de relación de citoplasma NF-kB: membrana CD68; percentil 1 y 5 de relación de citoplasma NF-kB: membrana plasmática CD68; percentil 1, 50 y 95 de relación de citoplasma NF-kB: membrana plasmática; percentil 5 de relación de citoplasma NF-kB: membrana; percentil 50 de relación de membrana NF-kB: núcleo CD68; y percentil 1, 5 y 50 de intensidad media de p16 en células; percentil 5 de relación de citoplasma p16: membrana; percentil 1 y 5 de relación de citoplasma p16: membrana plasmática; percentil 95 de relación de membrana plasmática p16: núcleo; percentil 5, 50 y 99 de intensidad media de p16 en núcleos; percentil 95 de membrana plasmática p16: p53 en núcleo; percentil 50 de intensidad media de p16 en células; percentil 50 de intensidad media de p16 en citoplasma; percentil 1 de relación de p16 en citoplasma: p53 en membrana nuclear; percentil 50 de relación de p16 en membrana plasmática: núcleo; percentil 50 de relación de p16 en membrana plasmática: p53 en núcleo; percentil 99 de relación de p16 en plasma: p53 en núcleo.
En algunas realizaciones de la invención, el sujeto tiene un mayor riesgo de progresión a una displasia de bajo grado, displasia de alto grado o cáncer de esófago.
En algunas realizaciones de la invención, se diagnostica al sujeto sin displasia, atipia reactiva, indefinido para displasia, displasia de bajo grado o displasia de alto grado.
En algunas realizaciones de la invención, el método comprende además detectar el subconjunto de biomarcadores utilizando sondas que se unen específicamente a cada uno de dichos biomarcadores.
En algunas realizaciones de la invención, el método comprende además determinar al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o 60 características descriptivas de la Tabla 4.
En algunas realizaciones de la invención, el método comprende además determinar al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80 o 89 características descriptivas de la Tabla 5.
En algunas realizaciones de la invención, la muestra comprende un raspado, biopsia o resección quirúrgica de células y/o tejido del sujeto.
En algunas realizaciones de la invención, las características descriptivas se identifican en compartimentos subcelulares y/o tisulares.
En algunas realizaciones de la invención, la muestra está a temperatura ambiente o congelada; opcionalmente, en el que la muestra se obtiene recientemente, se fija con formalina, se fija con alcohol o se inserta en parafina.
En algunas realizaciones de la invención, las sondas son fluorescentes y/o comprenden un marcador fluorescente, preferiblemente en el que cada sonda está marcada con un fluoróforo diferente.
En algunas realizaciones de la invención, el subconjunto de biomarcadores comprende al menos 3 biomarcadores y en el que los 3 biomarcadores son un biomarcador epitelial, un biomarcador inmune y/o un biomarcador estromal; opcionalmente detectando además un biomarcador de células madre.
En algunas realizaciones de la invención, la detección de 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 8 o más, o 12 o más biomarcadores se determina simultáneamente.
En algunas realizaciones de la invención, el sujeto es un ser humano.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un kit en el método anterior para determinar el riesgo de progresión del esófago de Barrett en un sujeto, cuyo kit comprende una o más sondas que son capaces de detectar al menos dos o más biomarcadores del grupo que consta de p53, HIP-1 alfa, beta-catenina y COX-2 e instrucciones para usar las sondas para determinar una o más características descriptivas para generar una puntuación de riesgo a partir de una muestra celular y/o de tejido de un sujeto.
En algunas realizaciones del uso del kit, el puntaje es predictivo del resultado clínico del esófago de Barrett en el sujeto.
En algunas realizaciones del uso del kit, la puntuación predice el diagnóstico de la subclase de esófago de Barrett en el sujeto.
En algunas realizaciones del uso del kit, las sondas comprenden sondas de anticuerpos que se unen específicamente a dichos biomarcadores.
En algunas realizaciones del uso del kit, las sondas son fluorescentes y/o comprenden un marcador fluorescente. En algunas realizaciones del uso del kit, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80 o 89 características descriptivas son de la Tabla 4 o Tabla 5.
Breve descripción de los dibujos
Lo anterior será evidente a partir de la siguiente descripción más particular de las realizaciones ejemplares de la invención, como se ilustra en los dibujos adjuntos, en los que los caracteres de referencia similares se refieren a las mismas partes en las diferentes vistas. Los dibujos no son necesariamente a escala, sino que se hace hincapié en ilustrar las realizaciones de la presente invención.
La figura 1 representa un marcaje fluorescente multiplexado y una imagen digital de biomarcadores en secciones de diversos tejidos, incluido el tejido de las amígdalas.
La figura 2 representa un marcaje fluorescente multiplexado e imágenes digitales de núcleos y biomarcadores en secciones de biopsias de esófago de Barrett displásicas.
La figura 3 representa el análisis de imágenes digitales para segmentar núcleos (máscaras de núcleos de color gris oscuro) y células como objetos individuales (máscaras de células de color gris oscuro) y para identificar las células positivas a Ki-67 (máscaras blancas) y las células negativas a Ki-67 (máscaras de color gris oscuro) dentro de una muestra de tejido.
La figura 4 muestra imágenes de fluorescencia digital de una sección de tejido de una biopsia de un esófago de Barrett con displasia de alto grado teñida con el biomarcador Subpanel 1.
A: marcaje Hoechst (núcleos), B: Ki-67-Alexa Fluor 488, C: CK-20-Alexa Fluor 555, D: Beta-catenina-Alexa Fluor 647.
La figura 5 muestra imágenes de fluorescencia digital de adenocarcinoma esofágico en un fondo de una sección de tejido de una biopsia de esófago de Barrett teñida con biomarcador Subpanel 2. A: marcaje de Hoechst (núcleos), B: p16-Alexa Fluor 488, C: AMACR-Alexa Fluor 555, D: p53-Alexa Fluor 647.
La figura 6 representa imágenes de fluorescencia digital de una sección de tejido de una biopsia de esófago de Barrett con displasia de bajo grado teñida con biomarcador Subpanel 3. A: marcaje de Hoechst (núcleo), B: CD68-Alexa Fluor 488, C: NF-KB-Alexa Fluor 555, D: COX-2-Alexa Fluor 647.
La figura 7 muestra imágenes de fluorescencia digital de una sección de tejido de biopsia de esófago de Barrett sin displasia teñida con biomarcador Subpanel 4. A: marcaje de Hoechst (núcleos), B: HIF1-alfa-Alexa Fluor 488, C: CD45RO-Alexa Fluor 555, D: CD1a-Alexa Fluor 647.
La figura 8 muestra imágenes de fluorescencia digital de una sección de tejido de una biopsia de esófago de Barrett con displasia de alto grado teñida con biomarcador Subpanel 5. A: marcaje Hoechst (núcleos), B: HER2/neu-Alexa Fluor 488, C: CK-20-Alexa Fluor 555, D: CDX-2-Alexa Fluor 647.
La figura 9 muestra un panel para la segmentación de imágenes de tejidos digitales y la extracción de datos.
La figura 10 muestra imágenes de biomarcadores de fluorescencia de cuatro canales y segmentación de imágenes para biomarcadores cuantitativos y análisis de morfología.
La figura 11 representa las características del operador del receptor Diagrama de curvas y Diagrama de caja para el clasificador predictivo multivariado para estratificar los no progresores de los progresores frente a HGD/EAC.
La figura 12 muestra las características del operador del receptor Diagrama de curvas y Diagrama de caja para el ejemplo de características predictivas univariadas para estratificar los no progresores de los progresores frente a HGD/EAC.
Descripción detallada de la invención
A continuación se proporciona una descripción de realizaciones ejemplares de la invención.
Se utilizan varios términos relacionados con los métodos y otros aspectos de la presente invención a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones. Dichos términos deben entenderse desde su significado corriente en la técnica, a menos que se indique lo contrario. Otros términos definidos específicamente deben interpretarse de manera consecuente con la definición que se proporciona en este documento.
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen los referentes al plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
El término "aproximadamente", como se usa en este documento cuando se refiere a un valor medible, como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, o ± 0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos. Como se usa en este documento, los términos "aumentar" y "disminuir" significan, respectivamente, causar un aumento o disminución estadísticamente significativa (es decir, p <0,15) de al menos 1%, 2% o 5%.
Como se usa en este documento, la recitación de un rango numérico para una variable pretende transmitir que la invención se puede poner en práctica con una variable igual a cualquiera de los valores dentro de ese intervalo. Por lo tanto, para una variable que es intrínsecamente discreta, la variable es igual a cualquier valor entero dentro del intervalo numérico, incluidos los puntos finales del intervalo. De manera similar, para una variable que es inherentemente continua, la variable es igual a cualquier valor real dentro del intervalo numérico, incluidos los puntos finales del intervalo. Como ejemplo, y sin limitación, una variable que se describe con valores entre 0 y 2 toma los valores 0, 1 o 2 si la variable es intrínsecamente discreta, y toma los valores 0,0, 0,1, 0,01, 0,001, 10'12, 10-11, 10'10, 10 -s, 10 '8, 10'7, 10'6, 10'5, 10'4 o cualquier otro valor real > 0 y < 2, si la variable es inherentemente continua.
Como se usa en este documento, a menos que se indique específicamente lo contrario, la palabra "o" se usa en el sentido inclusivo de "y/o" y no el sentido exclusivo de "o".
El término "aminoácido" se refiere a una molécula que contiene un grupo amino y un grupo carboxilo unidos a un carbono que se denomina carbono a. Los aminoácidos adecuados incluyen, sin limitación, tanto isómeros D como L de los aminoácidos naturales, así como los aminoácidos no naturales preparados por síntesis orgánica u otras rutas metabólicas. En algunas realizaciones, un solo "aminoácido" puede tener múltiples restos de cadena lateral, según esté disponible por una estructura alifática o aromática ampliada. A menos que el contexto indique específicamente lo contrario, el término aminoácido, como se usa en el presente documento, pretende incluir análogos de aminoácidos, aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
El término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina o fragmento de la misma que tiene una estructura específica que interactúa o se une específicamente con una molécula que comprende un antígeno. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" incluye ampliamente anticuerpos de longitud completa y puede incluir ciertos fragmentos de anticuerpos de los mismos. También se incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos multivalentes y monovalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos que han madurado por afinidad. Un anticuerpo se une selectiva o específicamente a un biomarcador de un trastorno gastrointestinal si el anticuerpo se une preferentemente a un antígeno expresado por una célula y tiene menos del 25%, o menos del 10%, o menos del 1% o menos del 0,1% de reactividad cruzada con un polipéptido expresado por una célula dentro del tejido gastrointestinal o células derivadas de otro tejido que migran de un tejido al tejido gastrointestinal. Normalmente, el anticuerpo tendrá una afinidad de unión (valor de la constante de disociación (Kd)), para el antígeno o epítopo de no más de 10-6 M, o 10-7M, o menos de aproximadamente 10-8 M, o 10-9 M, o 10-10 M o 10-11 M o 10-12 M. La afinidad de unión se puede evaluar utilizando cualquier método conocido por los expertos en la técnica, como la resonancia de plasmón de superficie, ensayos de inmunoafinidad o ELISA.
Como se usa en el presente documento, el término "biomarcador" significa cualquier analito, metabolito, ácido nucleico, secuencia de aminoácidos o fragmentos de los mismos, poliproteína, complejo proteico, molécula o compuesto químico que se produce, metaboliza, cataboliza, secreta, fagocita o expresa por una célula o tejido y que proporciona una medida útil de la presencia, ausencia o cantidad de un cierto tipo de célula o característica descriptiva indicativa, característica o sugerente de un diagnóstico de una enfermedad o trastorno particular.
Como se usa en el presente documento, la expresión "biomarcador epitelial" significa cualquier marcador del subconjunto de células epiteliales, p. ej. células glandulares normales o epiteliales de superficie, células glandulares metaplásicas o epiteliales de superficie, células glandulares displásicas o epiteliales de superficie, células cancerosas de origen epitelial o marcadores de la función de las células epiteliales, p. ej. proliferación, control del ciclo celular, gen supresor de tumores, oncogén, adhesión, migración, metabolismo de ácidos grasos, apoptosis, inflamación.
Como se usa en el presente documento, la expresión "biomarcador estromal" significa cualquier marcador del tipo de células estromales, p. ej. células endoteliales, fibroblastos o función de las células estromales, p. ej. angiogénesis, remodelación tisular.
Como se usa en el presente documento, la expresión "biomarcador inmune" significa cualquier marcador de un subconjunto de células inmunes, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, células supresoras, células T reguladoras, células dendríticas, macrófagos, granulocitos o función de células inmunitarias, p. ej. citoquinas, quimiocinas, activación, contacto célula-célula, proliferación, inflamación.
Como se usa en el presente documento, la expresión "biomarcador de ácido nucleico" significa cualquier locus específico de un gen o secuencia de ADN medida con sondas específicas de locus, p. ej. 9p21, 8q24.12-13, 17q11.2-q12. También incluye centrómeros medidos con sondas de enumeración de centrómeros, p. ej. los cromosomas 8, 9, 17. También incluye todo lo que se une al ácido nucleico y puede ayudar en la visualización del núcleo (por ejemplo, Hoechst, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)).
Como se usa en este documento, la expresión "marcador morfométrico" significa cualquier medida de estructuras, formas, partes, tamaños y texturas de células y tejidos. Los ejemplos de marcadores morfométricos incluyen el área nuclear, diámetro equivalente nuclear, solidez nuclear, excentricidad nuclear, relación entre glándula y estroma, relación entre área nuclear y área citoplásmica, tamaño nuclear glandular, tamaño nuclear glandular y gradiente de intensidad y textura nuclear. La expresión "diámetro equivalente nuclear" significa un escalar que especifica el diámetro de un círculo con la misma área que la región nuclear y se puede calcular como V(4*Área/pi). Es una estimación del diámetro de los núcleos, que son objetos no circulares con forma irregular. La expresión "solidez nuclear" significa un escalar que especifica la proporción de los píxeles en el casco convexo que también se encuentran en la región nuclear. Es igual a la proporción de área nuclear: área convexa de los núcleos basada en el marcaje fluorescente de los núcleos. La expresión "excentricidad nuclear" es un escalar que especifica la excentricidad de la elipse nuclear que tiene los mismos segundos momentos que la región nuclear. La excentricidad es la relación de la distancia entre los focos de la elipse y la longitud de su eje mayor. El valor está entre 0 y 1. La expresión "textura nuclear" es la disposición espacial de píxeles marcados con fluorescencia en el área del núcleo. Como se usa en el presente documento, la expresión "biomarcador de células madre" significa cualquier marcador para distinguir las células madre de las células no madre o el marcador de la función de las células madre.
En algunas realizaciones, la enfermedad es un trastorno gastrointestinal. En algunas realizaciones, el biomarcador se elige a partir de una o más de las moléculas identificadas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, los biomarcadores pueden ser la medida de los niveles de expresión del receptor, la activación del factor de transcripción; ubicación o cantidad o actividad de una proteína, polinucleótido, orgánulo y similares; el estado de fosforilación de una proteína, etc. En una realización, un biomarcador es un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, incluidos micro ARN, ARNsn, ARNm, ARNr, etc.), un receptor, un antígeno de membrana celular, un antígeno intracelular y un antígeno extracelular, una molécula de señalización, una proteína y similares, sin limitación, lípidos, lipoproteínas, proteínas, citoquinas, quimiocinas, factores de crecimiento, péptidos, ácidos nucleicos, genes y oligonucleótidos, junto con sus complejos relacionados, metabolitos, mutaciones, variantes, polimorfismos, modificaciones, fragmentos, subunidades, productos de degradación, elementos y otros analitos o medidas derivadas de la muestra. Un biomarcador también puede incluir una proteína o proteínas mutadas, un ácido nucleico mutado o ácidos nucleicos mutados, variaciones en el número de copias y/o variantes de transcripción, en circunstancias en las que tales mutaciones, variaciones en el número de copias y/o variantes de transcripción son útiles para generar un modelo predictivo, o son útiles en modelos predictivos desarrollados utilizando marcadores relacionados (por ejemplo, versiones no mutadas de las proteínas o ácidos nucleicos, transcripciones alternativas, etc.).
El término "biomaterial" o "biomateriales" significa cualquier proteína, tejido, molécula, componente de la matriz extracelular, bioestructura, membrana, compartimento subcelular o cualquier combinación de los anteriores que se derive de una célula y/o esté posicionada espacialmente fuera de la célula en una muestra celular.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "un perfil de expresión del biomarcador" significa una recopilación de datos recopilados por un usuario relacionados con la cantidad, intensidad, presencia, ausencia o distribución espacial de un biomarcador o conjunto de biomarcadores asignados a una célula o biomaterial o compartimento subcelular, cada uno dentro de una muestra celular.
Como se usa en el presente documento, la expresión "muestra celular" significa una composición que comprende una célula aislada o una pluralidad de células. En algunas realizaciones, la muestra celular comprende una célula individual. En algunas realizaciones, la muestra celular es una composición que comprende una pluralidad de células. En algunas realizaciones, la muestra celular es una muestra de tejido tomada a partir de un sujeto que padece un trastorno gastrointestinal. En una realización, la muestra celular es una muestra de tejido. En algunas realizaciones, la muestra celular comprende una pluralidad de células del tracto gastrointestinal. En algunas realizaciones, la muestra celular es una pluralidad de células esofágicas. En algunas realizaciones, la muestra celular está recién obtenida, se fija con formalina, también con alcohol y/o se incrusta en parafina. En algunas realizaciones, la muestra celular es una biopsia aislada de un sujeto que ha sido diagnosticado o se sospecha o se identifica que tiene uno o más trastornos gastrointestinales. En una realización, la muestra de la célula es una biopsia aislada de un sujeto que ha sido diagnosticado, o bien se sospecha o se ha identificado, que padece esófago de Barrett. En otra realización, la muestra celular comprende un tejido de un raspado, biopsia por punción o resección quirúrgica de un sujeto. En una realización de la invención, la una o más muestras de tejido se aíslan a partir de uno o más animales. Por ejemplo, en una realización, el animal o animales son uno o más seres humanos. En una realización particular, una o más muestras de células se aíslan de un paciente humano en uno o más puntos de tiempo, de manera que al menos una muestra de tejido se aísla de cada punto de tiempo del mismo paciente. En algunas realizaciones, una muestra celular puede incluir una sola célula o múltiples células o fragmentos de células o una porción de líquido corporal, tomada de un sujeto, por medio de venopunción, excreción, eyaculación, masaje, biopsia, aspirado con aguja, muestra de lavado, raspado, incisión quirúrgica, o intervención u otros medios conocidos en la técnica. En otra realización, la invención incluye obtener una muestra celular asociada con un sujeto, donde la muestra incluye uno o más biomarcadores. La muestra puede ser obtenida por el sujeto o por un agente tercero como, por ejemplo, un profesional médico. Entre los ejemplos de profesionales médicos se incluyen médicos, técnicos de emergencias médicas, enfermeras, socorristas, psicólogos, personal médico, enfermeras especializadas, cirujanos, dentistas y cualquier otro profesional médico corriente que sea reconocido como experto en la técnica. Una muestra puede incluir células de sangre periférica, leucocitos aislados o ARN extraído de células de sangre periférica o leucocitos aislados. La muestra se puede obtener de cualquier líquido corporal, por ejemplo, líquido amniótico, humor acuoso, bilis, linfa, leche materna, líquido intersticial, sangre, plasma sanguíneo, cerumen (cera del oído), líquido de Cowper (líquido pre-eyaculatorio), quilo, quimo, eyaculación femenina, menstruación, moco, saliva, orina, vómito, lágrimas, lubricación vaginal, sudor, suero, semen, sebo, pus, líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido intracelular y humor vítreo. En un ejemplo, la muestra se obtiene mediante una extracción de sangre, donde el profesional médico extrae sangre de un sujeto, como por ejemplo una jeringa. El fluido corporal puede luego analizarse para determinar el valor de una o más características descriptivas utilizando la función de interpretación o los métodos descritos en este documento. El valor de la una o más características descriptivas puede ser evaluado por la misma parte que realizó el método utilizando los métodos de la invención o que envió a un tercer agente para su evaluación utilizando los métodos de la invención. En una realización de la invención, el método comprende obtener o aislar al menos dos muestras de células de uno o más sujetos. En una realización de la invención, el método comprende obtener o aislar al menos tres muestras celulares de uno o más sujetos. En una realización de la invención, el método comprende obtener o aislar al menos cuatro muestras celulares de uno o más sujetos. Se puede usar cualquier muestra de tejido adecuada en los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, el tejido puede ser epitelio, músculo, tejido orgánico, tejido nervioso, tejido tumoral y sus combinaciones. En una realización, la muestra celular no se deriva de sangre, sueros o células sanguíneas. En una realización, la muestra celular no se deriva de hepatocitos, células del páncreas, vesícula biliar, vejiga, piel, corazón, pulmones, riñones, bazo, médula ósea, tejido adiposo, sistema nervioso, sistema circulatorio o sistema linfático. Las muestras de tejido se pueden obtener por cualquier medio estándar (por ejemplo, biopsia, punción del núcleo, disección y similares, como apreciará cualquier persona experta en la técnica). En algunas realizaciones, al menos una muestra celular se marca con una tinción histológica para producir una muestra celular teñida histológicamente. Como se usa en la invención descrita en el presente documento, las tinciones histológicas pueden ser cualquier tinción estándar como se aprecia en la técnica, incluyendo, entre otras, azul alciano, fucsina, hematoxilina y eosina (H&E), tricrómico de Masson, toluidina azul, tinción de Wright/Giemsa, y sus combinaciones. En alguna realización, como apreciarán los expertos en la técnica, las tinciones histológicas tradicionales no son fluorescentes. Al menos, otra sección está marcada con un panel de reactivos marcados con fluorescencia para producir una sección marcada con fluorescencia. Como se usa en la invención descrita en el presente documento, el panel de reactivos marcados con fluorescencia comprende una serie de reactivos, tales como anticuerpos marcados con fluorescencia, péptidos marcados con fluorescencia, polipéptidos marcados con fluorescencia, aptámeros marcados con fluorescencia, oligonucleótidos marcados con fluorescencia (por ejemplo, sondas de ácidos nucleicos, ADN, ARN, ADNc, PNA y similares), químicos marcados con fluorescencia y químicos fluorescentes (por ejemplo, Hoechst 33342, yoduro de propidio, Drag-5, rojo del Nilo, faloidina marcada con fluorescencia, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)) y sus combinaciones.
La "biología de los sistemas celulares" se define como la interacción de las redes celulares y moleculares de células normales, tumorales, inmunes, estromales y madre en tejidos y fluidos corporales que dan lugar a una función normal y enfermedad. Las células en los tejidos, como sistemas complejos, exhiben propiedades que no se anticipan por un análisis de sus componentes individuales y que son conocidas como propiedades emergentes que requieren el análisis de muchos factores para caracterizar los estados celulares y moleculares. En algunas realizaciones, se requiere la correlación entre las mediciones en células individuales para identificar e interpretar las respuestas celulares al tratamiento con medicamentos. Se puede utilizar un perfil biológico de sistemas celulares para capturar o compilar un conjunto de datos epidemiológicos sobre un paciente o población de sujetos. En algunas realizaciones, la población objeto es una población de pacientes con un riesgo elevado de desarrollar esófago de Barrett, padecer esófago de Barrett o haber sido diagnosticado con esófago de Barrett. Todos los kits y métodos de la presente invención también se pueden usar para compilar datos a partir de los datos epidemiológicos de un paciente o población de sujetos. Todos los kits y métodos de la presente invención también pueden usarse para adquirir y rastrear la progresión de una enfermedad o trastorno particular de un sujeto. En algunas realizaciones, la población objeto es una población de pacientes con un riesgo elevado de desarrollar esófago de Barrett, padecer esófago de Barrett o haber sido diagnosticado con esófago de Barrett. En algunas realizaciones, los niveles de expresión particulares de los biomarcadores se rastrean y las historias de los pacientes se compilan para caracterizar mejor la enfermedad del paciente que cae en una subclase particular del esófago de Barrett.
El "factor clínico" se define como una medida de una condición de un sujeto, por ejemplo, la actividad o la gravedad de la enfermedad. El "factor clínico" abarca todos los biomarcadores del estado de salud de un sujeto, incluidos los marcadores que no son muestras, y/u otras características de un sujeto, como, por ejemplo, la edad y el género, y la historia clínica relacionada con otras dolencias, trastornos, enfermedades, o el riesgo asociado con el desarrollo de tal dolencia, trastorno o enfermedad. Un factor clínico puede ser una puntuación, un valor o un conjunto de valores que se pueden obtener de la evaluación de una muestra celular (o una pluralidad de muestras) de un sujeto o un sujeto bajo una condición determinada. Un factor clínico también puede predecirse mediante biomarcadores y/u otros parámetros, como los sustitutos de la expresión génica.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "clasificar el esófago de Barrett" significa asignar una subcategoría de diagnóstico o puntuación de riesgo a un sujeto. Las subcategorías de diagnóstico incluyen:
Esófago de Barrett, sin displasia
Esófago de Barrett, atipia reactiva
Esófago de Barrett, indefinido para la displasia
Esófago de Barrett, displasia de bajo grado
Esófago de Barrett, displasia de alto grado
Adenocarcinoma esofágico
Como se usa en el presente documento, el término "control" significa tejido esofágico sano, tejido de esófago de Barrett sin displasia, tejido de esófago de Barrett de un sujeto que no progresó a displasia de grado bajo o alto, o carcinoma de esófago.
Tal como se usa en el presente documento, el término "conversión" significa someter una o más características descriptivas a una función de interpretación o algoritmo para un modelo predictivo de enfermedad. En algunas realizaciones, la enfermedad es el esófago de Barrett o una subclase del esófago de Barrett. En algunas realizaciones, la función de interpretación también puede producirse mediante una pluralidad de modelos predictivos. En una de las posibles realizaciones, el modelo predictivo incluiría un modelo de regresión y un clasificador o puntaje bayesiano. En una realización, una función de interpretación comprende uno o más términos asociados con uno o más biomarcadores o conjuntos de biomarcadores. En una realización, una función de interpretación comprende uno o más términos asociados con la presencia o ausencia o distribución espacial de los tipos de células específicos descritos en este documento. En una realización, una función de interpretación comprende uno o más términos asociados con la presencia, ausencia, cantidad, intensidad o distribución espacial de las características morfológicas de una célula en una muestra celular. En una realización, una función de interpretación comprende uno o más términos asociados con la presencia, ausencia, cantidad, intensidad o distribución espacial de características descriptivas de una célula en una muestra celular.
Como se usa en este documento, "que transmute dichos datos de imágenes digitales en una señal de imágenes digitales" significa el procedimiento de un procesador de datos que recibe datos de imágenes digitales y convierte el código digital de dichos datos de imágenes digitales en un código compatible con el software utilizado para crear una imagen de una muestra celular visible para un usuario.
Tal como se usa en el presente documento, las "características descriptivas" se definen como valores asociados con mediciones de datos, una serie de mediciones de datos, observaciones o una serie de observaciones sobre una muestra celular, típicamente evidenciadas por la presencia, ausencia, cantidad, localización o proximidad espacial a otras características descriptivas o biomarcadores relativos al espacio dentro de una muestra celular. Los ejemplos de características descriptivas incluyen valores calculados a través de una función de interpretación de las imágenes, medidas o cuantificadas mediante técnicas de microscopía estándar o conocidas, pero no se limitan a valores asociados con la presencia, ausencia, localización o distribución espacial de uno o más biomarcadores. Los ejemplos de características descriptivas incluyen valores calculados a través de una función de interpretación de imágenes, medidas o cuantificadas mediante técnicas de microscopía estándar o conocidas, pero no se limitan a valores asociados con la presencia, ausencia, localización o distribución espacial de uno o más biomarcadores elegidos de: modificaciones postraduccionales de proteínas tales como la fosforilación, la escisión proteolítica, la metilación, la miristoilación y la unión de carbohidratos; translocaciones de iones, metabolitos y macromoléculas entre compartimientos dentro o entre las células; cambios en la estructura y actividad de los orgánulos; y alteraciones en los niveles de expresión de macromoléculas tales como ARN codificantes y no codificantes y proteínas. En algunas realizaciones, las características descriptivas comprenden valores asociados con una combinación de más de una de las siguientes características morfológicas de una célula o muestra celular elegidas entre: la presencia de células caliciformes; la presencia de anomalías citológicas y estructurales; la presencia de estratificación celular; la presencia de epitelio multicapa; la maduración del epitelio superficial; el grado de brotación, irregularidad, ramificación y atrofia en las criptas; la proporción de criptas de bajo grado a criptas de alto grado; la presencia de separación y duplicación de la muscularis mucosaeis; la presencia, el número y el tamaño de los vasos sanguíneos de la pared delgada, los vasos linfáticos y las fibras nerviosas; la frecuencia de las mitosis; la presencia de mitosis atípicas; el tamaño y la cromicidad de los núcleos; la presencia de estratificación nuclear; la presencia de pleomorfismo; el núcleo: cociente del volumen de citoplasma; la presencia del cambio filiforme; la presencia de la unión escamocolumnar (línea Z) y su ubicación en relación con la unión gastroesofágica; la presencia del esófago de Barrett de segmento ultra corto; la diferenciación intestinal en células epiteliales columnares no-tumorales; la presencia de células epiteliales emparentadas, apiñadas, hipercromáticas y empobrecidas en mucina; el grado de pérdida de la polaridad celular; la penetración de las células a través de la muscularis mucosaeis original; la infiltración de células displásicas más allá de la membrana basal en la lámina propia. En algunas realizaciones, la característica descriptiva puede representar un valor numérico estimado por un operador de los aparatos o composiciones descritos en el presente documento utilizando métodos de cuantificación de tales biomarcadores como se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la característica descriptiva comprende un valor o valores asociados con la presencia, ausencia, proximidad, localización en relación con uno o más biomarcadores, o cantidad de uno o más de los siguientes tipos de células: células epiteliales, células epiteliales multicapa, células endoteliales, linfocitos mononucleares periféricos, células T, células B, células asesinas naturales, eosinófilos, mastocitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, fibroblastos, células caliciformes, células displásicas y células epiteliales cilíndricas no cubiláceas. En algunas realizaciones, la característica descriptiva comprende un valor relacionado con la presencia, ausencia, localización o proximidad relativa a otras características descriptivas o biomarcadores, o la cantidad de uno o más de los siguientes biomarcadores dentro o fuera de una célula: p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, tromboespondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína de activación de fibroblastos alfa, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, uroquinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa. La detección de un biomarcador en una o más secciones es una lectura de una o más características descriptivas de un perfil de biología de sistemas celulares. En algunas realizaciones, una "característica descriptiva" se refiere a una característica y/o un valor que se relaciona con una medición o serie de mediciones relacionadas con un biomarcador particular (que puede indicar la ubicación, función, distribución espacial, presencia o ausencia del biomarcador realizada dentro de una muestra celular). Las funciones biológicas incluyen, entre otras: modificaciones postraduccionales de proteínas, como la fosforilación, la escisión proteolítica, la metilación, la miristoilación y la unión de carbohidratos; translocaciones de iones, metabolitos y macromoléculas entre compartimientos dentro o entre las células; cambios en la estructura y actividad de los orgánulos; y alteraciones en los niveles de expresión de macromoléculas tales como ARN y proteínas codificantes y no codificantes, morfología, estado de diferenciación y similares. Un solo biomarcador puede proporcionar una lectura de más de una característica. Por ejemplo, el tinte Hoechst detecta el ADN, que es un ejemplo de un biomarcador. Se pueden identificar varias características mediante el colorante Hoechst en la muestra celular, como el tamaño del núcleo, la etapa del ciclo celular, la cantidad de núcleos, la presencia de núcleos apoptóticos, etc.
Como se usa en este documento, la expresión "derivado de" en el contexto de la relación entre una célula o secuencia de aminoácidos y un biomarcador relacionado o una secuencia de aminoácidos relacionada describe un biomarcador o una secuencia de aminoácidos relacionada que puede ser homóloga o estructuralmente similar a la estructura química relacionada o secuencia de aminoácidos relacionada.
Tal como se usa en este documento, la expresión "direccionable digitalmente" significa una imagen que el usuario puede ver, manipular o acceder mediante software.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "trastorno gastrointestinal" se refieren a cualquier enfermedad o anomalía relacionada con el canal alimentario que incluye, entre otras, una o más de las siguientes afecciones: dolor abdominal, enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE), estreñimiento, diarrea, diverticulosis, hemorragia gastrointestinal, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de colon, esófago de Barrett, enfermedad del colon irritable, colitis infecciosa, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, colitis isquémica, colitis por radiación, síndrome del intestino irritable, perforación aguda, íleo, apendicitis, abcesos intra-abdominales, obstrucción intestinal, gastritis, gastritis atrófica metaplásica autoinmune, úlceras en el estómago, enfermedad de úlcera péptica, dispepsia, tumores del estroma gastrointestinal, tumores del intestino delgado, síndrome de levator, enfermedad pilonidal, proctits, fístulas, fisuras, incontinencia.
Las expresiones "expresión génica altamente correlacionada" o "expresión marcadora altamente correlacionada" se refieren a valores de expresión de biomarcadores que tienen un grado suficiente de correlación para permitir su uso intercambiable en un modelo predictivo de esófago de Barrett. Por ejemplo, si el gen "x", que tiene un valor de expresión X, se usa para construir un modelo predictivo, el gen "y" altamente correlacionado que tiene un valor de expresión Y puede ser sustituido en el modelo predictivo de manera directa y evidente para los expertos en la técnica y el beneficio de la presente descripción. Suponiendo una relación aproximadamente lineal entre los valores de expresión de los genes "x" e "y", de modo que Y = a bX, entonces X puede sustituirse en el modelo predictivo con (Y - a)/b. Para las correlaciones no lineales, se pueden usar transformaciones matemáticas similares que convierten efectivamente el valor de expresión del gen "y" en el valor de expresión correspondiente para el gen "x". Las expresiones "marcador altamente correlacionado" o "marcador sustituto altamente correlacionado" se refieren a marcadores que pueden ser sustituidos y/o agregados a un modelo predictivo basado, por ejemplo, en los criterios anteriores. Un marcador altamente correlacionado se puede usar al menos de dos maneras: (1) mediante la sustitución del/de los biomarcador(es) altamente correlacionado(s) por el/los biomarcador(es) original(es) y la generación de un nuevo modelo para predecir el riesgo de esófago de Barrett; o (2) mediante la sustitución del/de los biomarcador(es) altamente correlacionado(s) por el/los biomarcador(es) original(es) en el modelo existente para predecir la propensión de un sujeto a desarrollarse, desarrollar un riesgo o un diagnóstico o un esófago de Barrett o una subclase del esófago de Barrett.
Tal como se usa en el presente documento, el término "instrucciones" se refiere a los materiales y métodos para teñir portaobjetos de tejido con las sondas, obtener imágenes de las sondas en los portaobjetos de tejido, analizar las imágenes para extraer los datos del biomarcador y/o procesar los datos en forma de una puntuación.
Tal como se usa en el presente documento, el término "ubicación" se refiere a un compartimento subcelular o compartimiento de tejido. Los compartimentos subcelulares incluyen el núcleo, el citoplasma, la membrana plasmática y la membrana nuclear. Los compartimentos de tejido incluyen el epitelio de la superficie, las glándulas, el estroma y el tumor.
Como se usa en el presente documento, el término "sonda" se refiere a cualquier molécula que se une o intercala a un biomarcador, ya sea covalentemente o no covalentemente. En algunas realizaciones, las sondas incluyen conjuntos de sondas que incluyen una o más sondas que se unen a un único biomarcador. La expresión "conjunto de sondas" es intercambiable algunas veces por un panel de dos o más sondas que permiten la detección de uno o más biomarcadores. En algunas realizaciones, la sonda o las sondas están marcadas con fluorescencia. En algunas realizaciones, cada sonda marcada con fluorescencia es específica para al menos un biomarcador. En una realización de la invención, el panel de sondas marcadas con fluorescencia detecta al menos aproximadamente dos biomarcadores diferentes. En una realización de la invención, el panel de sondas marcadas con fluorescencia detecta al menos aproximadamente tres biomarcadores diferentes. En una realización de la invención, el panel de sondas marcadas con fluorescencia detecta al menos aproximadamente cuatro biomarcadores diferentes. En una realización de la invención, el panel de sondas marcadas con fluorescencia detecta al menos aproximadamente cinco biomarcadores diferentes. En otra realización de la invención, el panel de sondas marcadas con fluorescencia detecta al menos aproximadamente de aproximadamente cuatro a aproximadamente seis, a aproximadamente diez, a aproximadamente doce biomarcadores diferentes o más. En otra realización de la invención, el panel de sondas marcadas con fluorescencia detecta al menos aproximadamente tres biomarcadores diferentes. En una realización adicional, cada sonda marcada con fluorescencia tiene diferentes propiedades fluorescentes, que son suficientes para distinguir las diferentes sondas marcadas con fluorescencia en el panel.
Como se usa en el presente documento, el término "relación" significa la relación de la cantidad de un biomarcador frente a la cantidad de un biomarcador diferente en el mismo o diferente compartimento subcelular o compartimento de tejido. También puede significar la relación de la cantidad de un biomarcador en un compartimento subcelular frente a la cantidad del mismo biomarcador en otro compartimento subcelular dentro de la misma célula. También puede significar la relación de la cantidad de un biomarcador en un compartimiento de tejido frente a la cantidad del mismo biomarcador en otro compartimiento de tejido dentro de la misma biopsia.
Como se usa en este documento, la expresión "riesgo de progresión" significa la probabilidad de progresar a una displasia de bajo grado, displasia de alto grado o adenocarcinoma de esófago.
El término "puntuación" se refiere a un valor único que se puede usar como componente en un modelo predictivo para el diagnóstico, pronóstico o plan de tratamiento clínico para un sujeto, en el que el valor único se calcula combinando los valores de las características descriptivas a través de una función de interpretación o algoritmo. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto tiene, está en riesgo de desarrollar o se le ha diagnosticado un trastorno gastrointestinal. En otra realización, se sospecha que el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar un esófago de Barrett o una subclase del esófago de Barrett. Las puntuaciones de riesgo son puntuaciones entre 1 y 100, 1 indicando el riesgo más bajo de progresión y 100 indicando el riesgo más alto de progresión. Las clases de riesgo son bajas, intermedias y altas.
La expresión "subclase del esófago de Barrett" se refiere a cualquier presentación del esófago de Barrett clasificada como que tiene una combinación común de una o más características descriptivas. En algunas realizaciones, una subclase de esófago de Barrett se refiere a una de las siguientes condiciones: esófago de Barrett, sin displasia, sin progresión en 5 años; esófago de Barrett, sin displasia, progresión a displasia de grado bajo/alto en 5 años; esófago de Barrett, indefinido para displasia, sin progresión en 5 años; esófago de Barrett, indefinido para displasia, progresión a displasia de grado bajo/alto o adenocarcinoma en 5 años; esófago de Barrett, atipia reactiva; esófago de Barrett, displasia de bajo grado, sin progresión en 5 años; esófago de Barrett, displasia de bajo grado, progresión a displasia de alto grado o adenocarcinoma en 5 años; esófago de Barrett, displasia de alto grado; adenocarcinoma esofágico que surge en una historia de esófago de Barrett.
En algunas realizaciones, una subclase de esófago de Barrett se refiere a una de las siguientes afecciones: displasia de bajo grado, displasia de alto grado, atipia reactiva o esófago de Barrett indeterminado. En algunas realizaciones de la invención, las composiciones y sistemas descritos en el presente documento están diseñados para estratificar grupos de pacientes con mayor precisión y diagnosticar las diferentes subclases de esófago de Barrett con mayor precisión.
La expresión "escáner óptico" se usa a lo largo de la memoria descriptiva para describir cualquier dispositivo o serie de dispositivos que genere datos de imagen a partir de una muestra celular o un conjunto de muestras celulares. En algunas realizaciones, el escáner óptico se usa para describir cualquier dispositivo o serie de dispositivos que genere datos de imágenes digitales a partir de una muestra celular o un conjunto de muestras celulares. En algunas realizaciones, el escáner óptico puede ser un microscopio conectado a un dispositivo óptico que genera datos de imágenes digitales, que, cuando se envían a aparatos de formación de imágenes, como una impresora láser, un lector de códigos de barras, un microscopio láser de barrido confocal o una pantalla de imágenes (monitor), puede producir una imagen visible para un usuario.
El término "sujeto" se usa a lo largo de la memoria descriptiva para describir un animal del cual se toma una muestra celular. En alguna realización, el animal es un ser humano. Para el diagnóstico de aquellas afecciones que son específicas para un sujeto específico, como un ser humano, el término "paciente" se puede usar indistintamente. En algunos casos, en la descripción de la presente invención, el término "paciente" se referirá a pacientes humanos que padecen una enfermedad o trastorno particular. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un humano sospechoso de tener o estar identificado como en riesgo de desarrollar un trastorno gastrointestinal. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano sospechoso de tener o estar identificado como en riesgo de desarrollar esófago de Barrett. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un mamífero que funciona como una fuente de la muestra celular aislada. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un animal no humano a partir del cual se aísla o se proporciona una muestra celular. El término "mamífero" abarca tanto a humanos como a no humanos e incluye, entre otros, a humanos, primates no humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos y porcinos.
Los términos "tratar" y "que trata" significan aliviar los síntomas, eliminar la causa de manera temporal o permanente, o prevenir o retardar la aparición de los síntomas. El término "tratamiento" incluye el alivio, la eliminación de la causa (temporal o permanente) o la prevención de los síntomas y trastornos asociados con cualquier afección. El tratamiento puede ser un tratamiento previo así como un tratamiento al inicio de los síntomas. Se describe en este documento un método para producir un perfil de biología de sistemas celulares de una o más muestras de células. Como se usa en este documento, la "biología de sistemas celulares" (también denominada biología celular de sistemas) es la investigación de las redes integradas e interactivas de genes, proteínas y metabolitos que son responsables de las funciones celulares normales y anormales. En algunas realizaciones, un perfil de biología de sistemas celulares se refiere a una caracterización sistémica de células en el contexto de una arquitectura de muestra celular de manera que las células tengan características particulares que dependen de las relaciones de diferentes células dentro de una muestra celular y el estado biológico o médico del tejido cuando se aísla de un sujeto. Son las interacciones, las relaciones y la orientación espacial de los biomarcadores o biomateriales derivados de una célula o células de una muestra celular lo que da lugar a las características descriptivas que se utilizan para construir un perfil. Las interrelaciones dentro de un perfil de biología de sistemas celulares se definen o calculan, por ejemplo, ya sea aritméticamente (por ejemplo, relaciones, sumas o diferencias entre características descriptivas) o estadísticamente (por ejemplo, métodos de agrupamiento jerárquico o análisis de componentes principales de combinaciones de valores descriptivos). En una realización particular, el perfil de biología de sistemas celulares define las interrelaciones entre una combinación de al menos aproximadamente dos características descriptivas recogidas de una célula o células dentro de una muestra celular. En una realización particular, un perfil de biología de sistemas celulares define las interrelaciones entre una combinación de al menos aproximadamente tres características descriptivas recogidas de una célula o células dentro de una muestra celular. En una realización particular, un perfil de biología de sistemas celulares define las interrelaciones entre una combinación de al menos aproximadamente cuatro características descriptivas recogidas de una célula o células dentro de una muestra celular. En una realización particular, el perfil de biología de sistemas celulares define las interrelaciones entre una combinación de al menos aproximadamente cinco características descriptivas recopiladas de una célula o células dentro de una muestra celular. En otra realización, el perfil de biología de sistemas celulares es la combinación de al menos aproximadamente seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más características descriptivas o valores asignados a las características descriptivas.
La presencia, ausencia, localización o distribución espacial, la proximidad a otros biomarcadores, o la cantidad de uno o más biomarcadores de la invención se pueden indicar como un valor. Un valor puede ser uno o más valores numéricos resultantes de la evaluación de una muestra celular bajo una condición. Los valores se pueden obtener, por ejemplo, mediante la obtención experimental de mediciones de una muestra celular mediante el uso de uno de los sistemas o composiciones descritos en el presente documento. Los valores se pueden obtener, por ejemplo, obteniendo experimentalmente datos de imágenes digitales de una muestra celular utilizando uno de los sistemas o composiciones descritos en este documento. Los valores se pueden obtener, por ejemplo, mediante la obtención experimental de mediciones de una muestra celular mediante la realización de uno de los métodos descritos en este documento. Alternativamente, cualquier experto en la técnica puede obtener datos de imágenes digitales de un proveedor de servicios tal como un laboratorio, o de una base de datos o un servidor en el que los datos de imágenes digitales se han almacenado, por ejemplo, en una memoria de almacenamiento.
Componentes del sistema
Se describe en este documento un sistema que comprende: una muestra celular; una pluralidad de sondas y/o tinciones; uno o más escáneres ópticos; uno o más procesadores de datos; una o más unidades de almacenamiento de datos; uno o más monitores; en el que el uno o más escáneres ópticos, el uno o más procesadores de datos, el uno o más monitores y la una o más unidades de almacenamiento de datos están en comunicación digital entre sí por un medio que transmite datos digitales. En algunas realizaciones, el sistema comprende una muestra celular aislada de un sujeto con un trastorno gastrointestinal. En algunas realizaciones, el sistema comprende una muestra celular aislada de un sujeto con esófago de Barrett o una subclase de esófago de Barrett. En algunas realizaciones, la muestra celular se aísla de un sujeto que se sospecha que tiene, está en riesgo de desarrollar o se le diagnostica un trastorno gastrointestinal. En algunas realizaciones, la muestra celular se aísla de un sujeto que se sospecha que tiene, está en riesgo de desarrollar, o se le diagnostica un esófago de Barrett o una subclase de esófago de Barrett.
En el presente documento también se describe un sistema para predecir el esófago de Barrett en un sujeto, incluyendo el sistema: una unidad de almacenamiento de datos o memoria para almacenar una o más características descriptivas asociadas con una muestra celular obtenida del sujeto, en donde las características descriptivas incluyen expresiones cuantitativas o datos de distribución espacial para al menos un conjunto de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los conjuntos de biomarcadores en el término 1, el término 2 y el término 3; donde los términos 1 a 3 incluyen cualquier combinación de uno o más biomarcadores p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, urocinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa.
En el presente documento también se describe un sistema para predecir el esófago de Barrett en un sujeto, incluyendo el sistema: una unidad de almacenamiento de datos o memoria para almacenar una o más características descriptivas asociadas con una muestra celular obtenida del sujeto, en donde las características descriptivas incluyen expresiones cuantitativas o datos de distribución espacial para al menos un conjunto de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los conjuntos de biomarcadores en el término 1, el término 2, el término 3 y el término 4; en donde los términos 1 a 4 incluyen cualquier combinación de uno o más biomarcadores p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, urocinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y uno o más procesadores de datos están acoplados operativamente a la unidad de almacenamiento de datos, unidades o memoria para determinar una puntuación con una función de interpretación en la que la puntuación predice el riesgo de desarrollar o ser diagnosticado con el esófago de Barrett en el sujeto; y en donde al menos uno de los términos se relaciona con la distribución espacial de uno o más biomarcadores. En algunas realizaciones, el uno o más procesadores de datos se operan de forma remota a través de una red. En algunas realizaciones, el uno o más procesadores de datos se operan de forma remota a través de una red digital.
En el presente documento también se describe un sistema para predecir el esófago de Barrett en un sujeto, incluyendo el sistema: una unidad de almacenamiento de datos o memoria para almacenar una o más características descriptivas asociadas con una muestra celular obtenida del sujeto, en donde las características descriptivas incluyen expresiones cuantitativas o datos de distribución espacial para al menos un conjunto de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los conjuntos de biomarcadores en el término 1, el término 2 y el término 3; en el que el término 1 incluye Ki-67, el término 2 incluye beta-catenina y el término 3 incluye la presencia de núcleos teñidos con tinción de Hoescht, y en el que los términos 1, 2 y 3 incluyen opcionalmente uno o más de los siguientes biomarcadores: alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, Cd45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleuquina-6, urocinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasLy HIF-1 alfa. En algunas realizaciones, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede contener una característica descriptiva identificada a través del reconocimiento por ordenador de la presencia, ausencia, cantidad, intensidad o distribución espacial de los componentes morfológicos de la célula. En algunas realizaciones, los términos de los conjuntos de biomarcadores se pueden agregar para calcular la puntuación.
En el presente documento también se describe un sistema para predecir el esófago de Barrett en un sujeto, incluyendo el sistema: una unidad de almacenamiento de datos o memoria para almacenar una o más características descriptivas asociadas con una muestra celular obtenida del sujeto, en donde las características descriptivas incluyen expresiones cuantitativas o datos de distribución espacial para al menos un conjunto de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los conjuntos de biomarcadores en el término 1, el término 2, el término 3 y el término 4; en donde los términos 1 a 4 incluyen cualquier combinación de uno o más biomarcadores p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, urocinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y uno o más procesadores de datos están acoplados operativamente a la unidad de almacenamiento de datos, unidades o memoria para determinar una puntuación con una función de interpretación en la que la puntuación predice un riesgo de desarrollar o ser diagnosticado con esófago de Barrett en el sujeto; y en donde al menos uno de los términos se relaciona con la distribución espacial de uno o más biomarcadores.
En el presente documento también se describe un sistema para predecir el esófago de Barrett en un sujeto, incluyendo el sistema: una unidad de almacenamiento de datos o memoria para almacenar una o más características descriptivas asociadas con una muestra celular obtenida del sujeto, en donde las características descriptivas incluyen la expresión cuantitativa o datos de distribución espacial para al menos un conjunto de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los conjuntos de marcadores en el término 1, término 2, término 3, término 4 y término 5; en el que los términos 1 a 5 incluyen cualquier combinación de uno o más biomarcadores p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, urocinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y un procesador de datos acoplado comunicativamente a la unidad de almacenamiento de datos, unidades o memoria para determinar una puntuación con una función de interpretación en la que la puntuación es predictiva del esófago de Barrett en el sujeto; y en donde al menos uno de los términos se relaciona con la distribución espacial de uno o más biomarcadores.
En el presente documento también se describe un sistema para predecir el esófago de Barrett en un sujeto, incluyendo el sistema: una unidad de almacenamiento de datos o memoria para almacenar una o más características descriptivas asociadas con una muestra celular obtenida del sujeto, en donde las características descriptivas incluyen la expresión cuantitativa o datos de distribución espaciales para al menos uno de los conjuntos de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los conjuntos de marcadores en el término 1, término 2, término 3, término 4, término 5 y término 6; en donde los términos 1 a 6 incluyen cualquier combinación de uno o más biomarcadores p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, urocinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y un procesador de datos acoplado comunicativamente a la unidad de almacenamiento de datos, unidades o memoria para determinar una puntuación con una función de interpretación en la que la puntuación es predictiva del esófago de Barrett en el sujeto; y en donde al menos uno de los términos se relaciona con la distribución espacial de uno o más biomarcadores.
En el presente documento también se describe un sistema para predecir el esófago de Barrett en un sujeto, incluyendo el sistema: una unidad de almacenamiento de datos o memoria para almacenar una o más características descriptivas asociadas con una muestra celular obtenida del sujeto, en donde las características descriptivas incluyen la expresión cuantitativa o datos de distribución espacial para al menos uno de los conjuntos de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los conjuntos de marcadores en el término 1, término 2, término 3, término 4, término 5, término 6 y término 7; en donde los términos 1 a 7 incluyen cualquier combinación de uno o más biomarcadores p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, urocinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y un procesador de datos acoplado comunicativamente a la unidad de almacenamiento de datos, unidades o memoria para determinar una puntuación con una función de interpretación en la que la puntuación es predictiva del esófago de Barrett en el sujeto; y en donde al menos uno de los términos se relaciona con la distribución espacial de uno o más biomarcadores.
En el presente documento también se describe un sistema para predecir el esófago de Barrett en un sujeto, incluyendo el sistema: una unidad de almacenamiento de datos, unidades o memoria para almacenar una o más características descriptivas asociadas con una muestra celular obtenida del sujeto, en donde las características descriptivas incluyen datos de expresión cuantitativa para al menos uno de los conjuntos de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los conjuntos de marcadores en el término 1, término 2, término 3, término 4, opcionalmente el término 5, opcionalmente el término 6 y opcionalmente el término 7; en donde los términos 1 a 7 incluyen cualquier combinación de uno o más biomarcadores p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, urocinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y un procesador de datos acoplado comunicativamente a la unidad de almacenamiento de datos, unidades o memoria para determinar una puntuación con una función de interpretación en la que la puntuación predice el esófago de Barrett en el sujeto.
En el presente documento también se describe un medio de almacenamiento legible por ordenador que almacena un código de programa ejecutable por ordenador, incluyendo el código del programa: un código de programa para almacenar un conjunto de datos de características descriptivas asociadas con una muestra celular obtenida del sujeto, en donde el primer conjunto de datos incluye datos de expresión cuantitativos para al menos un conjunto de marcadores seleccionado del grupo que consiste en los conjuntos de marcadores en el término 1, término 2, término 3, opcionalmente el término 4, opcionalmente el término 5, opcionalmente el término 6 y opcionalmente el término 7; en donde los términos 1 a 7 incluyen cualquier combinación de uno o más biomarcadores p16, p53, Ki-67, betacatenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, urocinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y un código de programa para determinar una puntuación con una función de interpretación en la que la puntuación predice el esófago de Barrett en el sujeto.
También se describe en este documento un software en un medio electrónico o sistema que comprende dicho software utilizado para correlacionar los grupos de biomarcadores, las características morfológicas y de los datos clínicos en índices útiles para distinguir uno o más tipos de células particulares de una mezcla de tipos de células en una muestra celular automáticamente.
También se describe en este documento un software en un medio electrónico o sistema que comprende dicho software utilizado para correlacionar los grupos de biomarcadores, características morfológicas y de datos clínicos en índices útiles para predecir la capacidad de respuesta de un paciente a una terapia particular.
También se describe en este documento un software en un medio electrónico o sistema que comprende dicho software usado para correlacionar los grupos de biomarcadores, características morfológicas y de datos clínicos en índices útiles para predecir uno o más programas de tratamiento clínico para un paciente automáticamente.
También se describe en este documento un software en un medio electrónico o sistema que comprende dicho software utilizado para correlacionar los grupos de biomarcadores, características morfológicas y de datos clínicos en índices útiles para predecir el riesgo de desarrollar una o más enfermedades o afecciones automáticamente. Generación y análisis de datos de imágenes digitales
La cantidad de uno o más biomarcadores de la invención se puede indicar como un valor. Un valor puede ser uno o más valores numéricos resultantes de la evaluación de una muestra bajo una condición. Los valores se pueden obtener, por ejemplo, mediante la obtención experimental de mediciones de una muestra celular mediante la realización de un ensayo en un laboratorio o, alternativamente, mediante la obtención de un conjunto de datos de un proveedor de servicios como un laboratorio, o de una base de datos o un servidor en el que el conjunto de datos se ha almacenado, por ejemplo, en una memoria de almacenamiento. En una realización, la muestra celular es obtenida o proporcionada por un sujeto. En algunas realizaciones, los métodos o composiciones que comprenden la muestra celular o el conjunto de muestras de células comprenden la identificación del sujeto que tiene el trastorno gastrointestinal. En algunas realizaciones, los métodos para generar o analizar la muestra celular o el conjunto de muestras de células comprenden la identificación del sujeto que tiene un riesgo mayor de desarrollar un trastorno gastrointestinal. En algunas realizaciones, los métodos para generar o analizar la muestra celular o el conjunto de muestras de células comprenden la identificación del sujeto que tiene un menor riesgo de desarrollar un trastorno gastrointestinal en comparación con la población general. En algunas realizaciones, los métodos para generar o analizar la muestra celular o el conjunto de muestras de células comprenden la identificación del sujeto como que no tiene el trastorno gastrointestinal. En algunas realizaciones, los métodos para generar o analizar la muestra celular o el conjunto de muestras de células comprenden la identificación del sujeto que tiene un esófago de Barrett. Una vez identificadas, las muestras de células se proporcionan para realizar un análisis de la célula o la pluralidad de células, un biomaterial o biomateriales dentro de la muestra celular. En una realización, una muestra celular o un conjunto de datos de características descriptivas derivadas de la muestra celular se analizan mediante uno o más procesadores de datos que, individual o colectivamente: (i) analizan los datos de imagen digital para identificar, medir o cuantificar una o más características descriptivas de la pluralidad de sondas y/o manchas; y (ii) convierten las una o más características descriptivas en una puntuación, en donde (ii) comprende opcionalmente la integración de datos almacenados sobre un sujeto o grupo de sujetos para convertir una o más características descriptivas en una puntuación. Se describe en este documento un sistema que comprende: (a) una muestra celular; (b) una pluralidad de sondas y/o tinciones que se unen a biomarcadores de la muestra celular; y (c) conjuntos de datos asociados con características descriptivas de uno o más procesadores de datos que, individual o colectivamente: (i) analizan los datos de la imagen digital para identificar, medir o cuantificar una o más características descriptivas de la pluralidad de sondas y/o manchas ; y (ii) convierten las una o más características descriptivas en una puntuación, en donde (ii) comprende opcionalmente la integración de datos almacenados sobre un sujeto o grupo de sujetos para convertir una o más características descriptivas en una puntuación.
Las características descriptivas del tejido se determinan mediante microscopía en una muestra celular o un conjunto de muestras de células en paralelo o en secuencia. En algunas realizaciones, las características descriptivas se pueden visualizar y cuantificar mediante microscopía de campo claro o microscopía fluorescente o un dispositivo que realice microscopía de campo claro y fluorescente mediante el uso de uno o más filtros de longitud de onda. En algunas realizaciones, el microscopio está en comunicación operativa con uno o más procesadores de datos.
Se describe en este documento un sistema o aparato que comprende uno o más procesadores de datos, cada uno en comunicación operativa con al menos un escáner óptico, que: (a) recibe datos de imagen digital; y (b) puede opcionalmente transmutar dichos datos de imagen digital en una señal de imagen digital, que puede crear una imagen digital de la muestra celular; y (c) analiza los datos de la imagen digital para identificar, medir o cuantificar una o más características descriptivas de una pluralidad de sondas y/o tinciones que se unen a biomarcadores de la muestra celular. En algunas realizaciones, el sistema o aparato comprende opcionalmente una o más unidades de almacenamiento de datos, cada una en comunicación operativa con al menos un procesador. El análisis de los datos de la imagen digital se realiza mediante uno o más procesadores de datos que crean conjuntos de datos asociados con la presencia, ausencia, cantidad o distribución espacial de dos o más biomarcadores.
En una realización, una característica descriptiva puede incluir un factor clínico o una pluralidad de factores clínicos. En una realización, se puede incluir un factor clínico dentro de un conjunto de datos. Un conjunto de datos puede incluir uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más, catorce o más, quince o más, dieciséis o más, diecisiete o más, dieciocho o más, diecinueve o más, veinte o más, veintiuno o más, veintidós o más, veintitrés o más, veinticuatro o más, veinticinco o más, veintiséis o más, veintisiete o más, veintiocho o más, veintinueve o más, o treinta o más factor o factores clínicos superpuestos o distintos. Un factor clínico puede ser, por ejemplo, la condición de un sujeto en presencia de una enfermedad o en ausencia de una enfermedad. Alternativamente, o además, un factor clínico puede ser el estado de salud de un sujeto. Alternativamente, o además, un factor clínico puede ser la edad, el sexo, el tipo de dolor torácico, el recuento de neutrófilos, el origen étnico, la duración de la enfermedad, la presión arterial diastólica, la presión arterial sistólica, un parámetro de historia familiar, un parámetro de historia clínica, un parámetro de síntoma médico, altura, peso, índice de masa corporal, frecuencia cardíaca en reposo y condición de fumador/no fumador. Los factores clínicos pueden incluir si el sujeto tiene dolor de pecho estable, si el sujeto ha sido diagnosticado con una hernia hiatial, si el sujeto tiene ERGE, si el sujeto tiene gastritis, si el sujeto ha sido diagnosticado previamente con esófago de Barrett, si el sujeto ha tenido un procedimiento gastrointestinal, ya sea que el sujeto tenga diabetes, si el sujeto tiene una afección inflamatoria, si el sujeto tiene una enfermedad infecciosa, si el sujeto está tomando un esteroide, si el sujeto está tomando un agente inmunosupresor o si el sujeto está tomando un agente quimioterapéutico.
El conjunto de datos compilado se convierte en una puntuación o puntuaciones, que luego se pueden usar para correlacionar las características descriptivas de la muestra celular en un perfil biológico o un resultado predictivo para el sujeto.
Resultados biológicos
Biomarcadores y características descriptivas
La cantidad de uno o más biomarcadores usados en el método de la invención se puede indicar como una característica descriptiva, proporcionada en términos de un valor. La cantidad es la cantidad de cualquier biomarcador específico en un compartimiento celular o de tejido. La intensidad de la señal para cada biomarcador en las imágenes de tejidos es directamente proporcional a la cantidad del biomarcador. Un valor puede ser uno o más valores numéricos resultantes del análisis de una muestra celular bajo una condición. Los valores se pueden obtener, por ejemplo, obteniendo una imagen de una muestra celular.
En una realización, la cantidad de uno o más marcadores puede ser uno o más valores numéricos asociados con los niveles de expresión de: p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína de activación de fibroblastos alfa, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleucina-6, uroquinasa activadora del plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; resultante de la evaluación de una muestra celular en una condición. Esta nomenclatura se utiliza para referirse a genes humanos de acuerdo con las directrices proporcionadas por el Comité de Nomenclatura Genética (HGNC) de la Organización del Genoma Humano (HUGO). Puede encontrarse más información sobre cada gen humano, como el número o números de entrada y nombres, ingresando el nombre del gen en la página de búsqueda en el sitio web genenames.org de HGNC Search. Por ejemplo, al ingresar el término "CD45" en el campo de búsqueda simple del sitio web de HGNC el 14 de febrero de 2011 aparece el nombre del gen aprobado de PTPRC (proteína tirosina fosfatasa, receptor tipo C, la entrada de secuencia de ID de Y00062 y NM_002838 y los símbolos anteriores de CD45.
En el presente documento también se describe un método implementado por ordenador para calificar una muestra celular o una pluralidad de muestras de células obtenidas de un sujeto, que incluye: obtener un primer conjunto de datos asociado con la primera muestra, en el que el primer conjunto de datos incluye datos de expresión cuantitativos para al menos dos marcadores seleccionados del grupo que consiste en p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleuquina-6, uroquinasa del activador de plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y determinar, mediante un procesador de ordenador, un primer puntaje del primer conjunto de datos que utiliza una función de interpretación, en donde el primer puntaje es predictivo del esófago de Barrett en el sujeto o clase de sujetos.
En una realización, el valor asociado de un biomarcador puede incluirse en los datos de imágenes digitales asociados con una muestra obtenida de un sujeto. Un conjunto de datos puede incluir el valor de expresión del marcador o la cantidad de dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más, catorce o más, quince o más, dieciséis o más, diecisiete o más, dieciocho o más, diecinueve o más, veinte o más, veintiuno o más, veintidós o más, veintitrés o más, veinticuatro o más, veinticinco o más, veintiséis o más, veintisiete o más, veintiocho o más, veintinueve o más, o treinta o más marcadores. Por ejemplo, un conjunto de datos puede incluir valores correspondientes a la presencia, ausencia, cantidad, ubicación o relación espacial entre: 9p21, 8q24.12-13, 17q11.2-q12 o centrómeros. En una realización, uno o más marcadores pueden dividirse en términos. Los términos pueden incluir un marcador, pero generalmente incluyen tres o más marcadores. Los términos pueden incluirse en datos de imagen digital asociados con una muestra celular obtenida o aislada de un sujeto. El conjunto de datos puede incluir uno o más términos, dos o más términos, tres o más términos, cuatro o más términos, cinco o más términos, seis o más términos, siete o más términos, ocho o más términos, nueve o más términos, o diez o más términos. En una realización, el término puede incluir uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más, catorce o más, quince o más, dieciséis o más, diecisiete o más, dieciocho o más, diecinueve o más, veinte o más, veintiuno o más, veintidós o más, veintitrés o más, veinticuatro o más, veinticinco o más, veintiséis o más, veintisiete o más, veintiocho o más, veintinueve o más, o treinta o más marcadores. En una realización, los marcadores se dividen en términos distintos: término 1, término 2, término 3, término 4, término 5, término 6 y término 7. En otra realización, ciertos términos corresponden a ciertos biomarcadores. Uno de varios entornos de análisis de imágenes se puede usar para extraer biomarcadores y características descriptivas de imágenes digitales como se describe en Mulrane, L., Rexhepaj, E., Penney, S., Callanan, J.J., Gallagher, W.M. (2008) Automated image analysis in histopathology: a valuable tool in medical diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics, 8, 707-725.
En algunas realizaciones, el sistema o aparato comprende una pluralidad de sondas y/o manchas que se unen a uno o más de los biomarcadores en la Tabla 1. Todas las combinaciones de los biomarcadores en la Tabla 1 están contempladas por la invención.
Tabla 1. Tabla de biomarcadores TissueCipher (Normal = tejido esofágico normal sin metaplasia de Barrett). Los biomarcadores se clasifican de acuerdo con sus funciones principales.
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Análisis de datos de imágenes digitales
Se describen en este documento equipos de escaneo óptico, equipos de visualización de imágenes digitales u otros tipos de escáneres que generan datos de imágenes digitales respecto a la presencia, ausencia, ubicación, cantidad y/o intensidad de al menos una sonda o mancha que se une a un biomarcador de la muestra celular; y uno o más procesadores de datos que, individual o colectivamente: (i) reciben los datos de la imagen digital desde el escáner óptico y, opcionalmente, transmutan dichos datos de imagen digital en una señal de imagen digital; y (ii) analizan los datos de la imagen digital para identificar, medir o cuantificar una o más características descriptivas de al menos una sonda y/o mancha. En algunas realizaciones, el procesador de datos comprende un equipo de escaneo óptico y un equipo de visualización de imágenes digitales que genera datos de imágenes digitales respecto a la presencia, ausencia, ubicación, cantidad y/o intensidad de al menos una sonda o mancha que se une a un biomarcador de la muestra celular; y uno o más procesadores de datos que, individual o colectivamente: (i) reciben los datos de la imagen digital desde el escáner óptico y, opcionalmente, transmutan dichos datos de imágenes digitales en una señal de imagen digital; y (ii) analizan los datos de la imagen digital para identificar, medir o cuantificar una o más características descriptivas de la pluralidad de sondas y/o manchas. En otra realización, la invención se refiere a un dispositivo único que comprende un equipo de imágenes digitales, como un escáner óptico y un procesador de datos que colectivamente: (a) generan datos de imágenes digitales respecto a la presencia, ausencia, ubicación, cantidad y/o intensidad de al menos una sonda o mancha que se une a un biomarcador de la muestra celular; (b) reciben los datos de la imagen digital del escáner óptico y, opcionalmente, transmutan dichos datos de imagen digital en una señal de imagen digital que se proyecta en un monitor para que un operador lo vea; y (c) analizan los datos de la imagen digital para identificar, medir o cuantificar una o más características descriptivas de la pluralidad de sondas y/o manchas.
En algunas realizaciones, el análisis de los datos de la imagen digital se realiza mediante algoritmos desarrollados por dispositivos que realizan algoritmos conocidos y, opcionalmente, crean una imagen mediante exploración progresiva, exploración de líneas, transferencia de área o exploración de matriz óptica. En algunas realizaciones, el análisis de los datos de las imágenes digitales se realiza mediante uno de los muchos dispositivos disponibles comercialmente en la técnica, tales como: Scan Scope Systems (Aperio Technologies Inc.), Aphelion (ADCIS), Aureon Pathomatrix o Aureon DiscoveryPath (Aureon Laboratories), la estación de trabajo BLISS (Bacus Laboratories), TMAx (Beecher Instruments), GenoMx VISION (Biogenex), PATHIAM o TissueAnalytics System (BioImagene, Inc.), Sistema automatizado de imágenes celulares III (Dako), CELLENGER (Definiens), AQUA (HistoRx) , Disinct-1 o Discovery TMA (Molecular Devices, Corp), VisioMorph (Visopharm), HistoQuant (3DHistech), algoritmos diseñados por SlidePath.
En algunas realizaciones, el análisis de una imagen digital puede realizarse por uno cualquiera de los métodos descritos en las patentes de EE.UU. N° 7.893.988, Patente de EE.UU. N° 7.860.292, Patente de EE.UU. N° 7.844.125, Patente de EE.UU. No. 7.826.649, Patente de EE.UU. No. 7.787.674, Patente de EE.UU. No. 7.738.688, Patente de EE.UU. No. 7.689.024, Patente de EE.UU. No. 7.668.362, Patente de EE.UU. No. 7.646.495, Patente de EE.UU. No. 7.602.524, Patente de EE.UU. No. 7.518.652, Patente de EE.UU. No. 7.502.519, Patente de EE.UU. N° 7.463.761, Patente de EE.UU. N° 7.457.446, Patente de EE.UU. No. 7.428.324, Patente de EE.UU. No. 7.257.268, Patente de EE.UU. N° 7.116.440, Patente de EE.UU. N° 7.035.478.
En algunas realizaciones, el análisis de una imagen digital se puede realizar por cualquiera de los métodos descritos en la publicación de patente de EE.UU. N° 2008/0154145 A1, solicitud de patente de EE.UU. N° 2009/0310424 A1, solicitud de patente de EE.UU. N° 2009/0135380 A1.
En algunas realizaciones, el análisis de los datos de la imagen digital se realiza midiendo los patrones presentes en los valores de píxeles de las imágenes digitales utilizando una estructura de red implementada por ordenador. La estructura de la red incluye una jerarquía de procesos, una red de clase y una red de datos. La red de datos representa información asociada con cada ubicación de píxeles en forma de capas de imagen, capas temáticas y redes de objetos. El sistema de análisis realiza tanto el procesamiento orientado a píxeles como el procesamiento orientado a objetos utilizando esa combinación de representaciones de datos que produce el resultado más rápido. El procesamiento orientado a píxeles y orientado a objetos se combina para que se utilicen menos cálculos y menos memoria para analizar una imagen digital adquirida. La red de datos incluye capas de imágenes de valores de píxeles asociados con ubicaciones de píxeles que están vinculadas a objetos de redes de objetos. Cada red de objetos tiene varias capas de objetos (también llamados "niveles" de objetos). Los objetos de la red de datos se clasifican en clases de la red de clases. La red de datos también incluye capas temáticas. Las capas temáticas se utilizan en combinación con las capas de imagen y las redes de objetos para analizar imágenes digitales. Existe una relación de uno a uno entre la ubicación de un píxel y la clase temática de una capa temática. Por ejemplo, en una aplicación, las operaciones se realizan en los valores de píxeles asociados con un objeto, dependiendo de la clase temática vinculada a cada ubicación de píxeles que está vinculada al objeto. Sin embargo, el sistema de análisis también puede analizar imágenes digitales sin utilizar capas temáticas.
En un modo de memoria descriptiva y antes de que se adquieran los valores de píxeles, el usuario del sistema de análisis especifica la red de clases y la jerarquía de procesos. Las clases de la red de clases describen categorías de objetos que el usuario espera encontrar en la imagen digital. El usuario también especifica clases temáticas que describen categorías de valores de píxeles. La jerarquía de procesos describe cómo se analizará la imagen digital para encontrar un objeto determinado. La jerarquía de procesos define los pasos del proceso realizados en los valores y objetos de píxeles. En el modo de memoria descriptiva, el usuario también especifica tipos de enlaces para conectar pasos de proceso, clases y objetos de la red de datos entre sí. Un enlace entre dos nodos describe la relación entre los dos nodos.
En un modo de ejecución, el sistema de análisis realiza los pasos del proceso en los valores de píxeles adquiridos. Al realizar los pasos del proceso, las ubicaciones de píxeles asociadas con valores de píxeles particulares se vinculan a los objetos, y los objetos se clasifican como pertenecientes a clases específicas de la red de clases. Las ubicaciones de píxeles asociadas con valores de píxeles particulares también se clasifican como pertenecientes a una de las clases temáticas. El sistema de análisis vincula los pasos del proceso, las clases y los objetos entre sí de una manera que permite al sistema de análisis detectar un objeto determinado definido por una clase. Por ejemplo, el sistema de análisis puede reconocer dónde se produce un patrón predefinido en la imagen digital.
El análisis de imágenes orientado a objetos puede reconocer mejor los patrones en imágenes digitales complejas que el procesamiento estadístico puramente orientado a píxeles. Sin embargo, el procesamiento orientado a objetos es computacionalmente más intensivo y, por lo tanto, más lento que el procesamiento estadístico puro. El reconocimiento de patrones más preciso del análisis de imágenes orientado a objetos se puede conservar, al mismo tiempo que se reduce la cantidad de cálculos requeridos, combinando el procesamiento orientado a objetos y orientado a píxeles. Por ejemplo, un objeto en una imagen digital puede analizarse realizando un procesamiento estadístico solo en valores de píxeles asociados con ubicaciones de píxeles que están vinculadas a objetos específicos de una red de objetos. En el paso uno, el usuario del sistema de análisis especifica la red de clase definiendo la probabilidad de que los objetos de la red de datos pertenezcan a cada clase particular de red de clase. El usuario del sistema de análisis es, por ejemplo, un médico investigador que está aplicando su conocimiento experto para entrenar el sistema de análisis en el modo de memoria descriptiva. En el paso dos, el usuario especifica la jerarquía de procesos. El usuario especifica no solo los pasos del proceso individual, sino también el orden en que los pasos del proceso deben ejecutarse en el modo de ejecución. En el paso tres, el usuario especifica un filtro y el usuario especifica los parámetros del filtro. Un ejemplo de un parámetro de filtro es el tamaño del objeto a filtrar. El tamaño se puede definir como la longitud del borde del objeto o el diámetro del objeto, medido en unidades de píxeles. En el paso cuatro, el sistema de análisis adquiere los valores de píxeles de la primera capa de imagen. En el paso cinco, el sistema de análisis se ejecuta en el modo de ejecución y genera una red de datos mediante la vinculación selectiva de las ubicaciones de píxeles a los objetos de acuerdo con la red de clase y la jerarquía de procesos. Cada objeto se genera al vincular las ubicaciones de los píxeles de los objetos asociadas con los valores de los píxeles que tienen características similares. En el paso seis, se genera una nueva capa de imagen realizando un procesamiento orientado a píxeles solo en aquellos valores de píxeles de la primera capa de imágenes cuyas ubicaciones de píxeles están vinculadas a objetos específicos de la primera red de objetos. De esta manera, se reducen los cálculos necesarios para analizar los patrones de destino en la imagen digital y se aumenta la velocidad a la que se reconocen y miden los patrones.
El análisis morfológico del tejido se puede realizar visualizando el tejido o utilizando un algoritmo para medir la expresión del biomarcador y otras mediciones del análisis anterior a la morfología del tejido considerando la importancia de tales mediciones con respecto a su distribución espacial. Por ejemplo, en una realización, se proporciona una muestra celular de un sujeto sano o un sujeto que se ha identificado como que no tiene o tiene un bajo riesgo de desarrollar el esófago de Barrett. Se proporciona otra muestra celular de un sujeto que se sospecha que tiene esófago de Barrett o está identificado como que tiene esófago de Barrett. En una realización, cualquiera de los métodos proporcionados en este documento comprende proporcionar una muestra celular tomada de un sujeto identificado que tiene esófago de Barrett. Los aspectos morfológicos de las dos muestras de células se comparan para evaluar la frecuencia relativa de los biomarcadores. En algunas realizaciones, se comparan al menos uno o más de los siguientes aspectos morfológicos de las muestras de células: la presencia de células caliciformes; la presencia de anomalías citológicas y arquitectónicas; la presencia de estratificación celular; la presencia de epitelio multicapa; la maduración del epitelio superficial; el grado de brotación, irregularidad, ramificación y atrofia en las criptas; la proporción de criptas de bajo grado frente a las criptas de alto grado; la presencia de separación y duplicación de la muscularis mucosae; la presencia, el número y el tamaño de vasos sanguíneos de pared delgada, vasos linfáticos y fibras nerviosas; la frecuencia de las mitosis; la presencia de mitosis atípicas; el tamaño y la cromicidad de los núcleos; la presencia de estratificación nuclear; la presencia de pleomorfismo; el cociente de volumen entre núcleo y citoplasma; la presencia de cambios filiformes; la presencia de la unión escamocolumnar (línea Z) y su ubicación en relación con la unión gastroesofágica; la presencia del esófago de Barrett de segmento ultra corto; la diferenciación intestinal en células epiteliales columnares no-tumorales; la presencia de células epiteliales emparentadas, apiñadas, hipercromáticas y empobrecidas en mucina; el grado de pérdida de la polaridad celular; la penetración de las células a través de la muscularis mucosae original; la infiltración de células displásicas más allá de la membrana basal en la lámina propia. En algunas realizaciones, se comparan las relaciones espaciales entre ciertos aspectos morfológicos. Por ejemplo, una muestra celular tomada de un sujeto sano o un sujeto identificado como que no tiene esófago de Barrett puede tener una diferenciación intestinal muy limitada o completamente ausente en células epiteliales columnares no tumorales. Por el contrario, una muestra celular de un sujeto que se sospecha que tiene o se ha identificado que tiene esófago de Barrett tendrá un grado moderado o alto de diferenciación intestinal en células epiteliales columnares no tumorales en posiciones agrupadas espacialmente entre puntos en el tejido en comparación con la muestra celular del sujeto sano o del sujeto identificado como que no tiene esófago de Barrett.
En algunas realizaciones, las puntuaciones se determinarán en función de la presencia, ausencia, cantidad relativa o distribución espacial de una de las siguientes características morfológicas en la muestra celular proporcionada en comparación con una muestra celular de un sujeto que se ha identificado como con un mayor riesgo de desarrollar esófago de Barrett u otro trastorno gastrointestinal. En algunas realizaciones, las puntuaciones se determinarán en función de la presencia, ausencia o distribución espacial, o la cantidad relativa de una de las siguientes características morfológicas en comparación con una muestra celular tomada de un sujeto que ha sido identificado con esófago de Barrett u otro trastorno gastrointestinal: la presencia de células caliciformes; la presencia de anomalías citológicas y arquitectónicas; la presencia de estratificación celular; la presencia de epitelio multicapa; la maduración del epitelio superficial; el grado de brotación, irregularidad, ramificación y atrofia en las criptas; la proporción de criptas de bajo grado respecto a criptas de alto grado; la presencia de separación y duplicación de la muscularis mucosae; la presencia, el número y el tamaño de vasos sanguíneos de pared delgada, vasos linfáticos y fibras nerviosas; la frecuencia de las mitosis; la presencia de mitosis atípicas; el tamaño y la cromicidad de los núcleos; la presencia de estratificación nuclear; la presencia de pleomorfismo; el cociente entre el volumen del núcleo y del citoplasma; la presencia de cambios filiformes; la presencia de la unión escamocolumnar (línea Z) y su ubicación en relación con la unión gastroesofágica; la presencia del esófago de Barrett de segmento ultra corto; la diferenciación intestinal en células epiteliales columnares no-tumorales; la presencia de células epiteliales emparentadas, apiñadas, hipercromáticas y empobrecidas en mucina; el grado de pérdida de la polaridad celular; la penetración de las células a través de la muscularis mucosae original; la infiltración de células displásicas más allá de la membrana basal en la lámina propia.
Conversión de datos en puntuaciones
El operador del sistema, dispositivos, aparatos y composiciones descritos en este documento se utilizan para identificar una o más puntuaciones que puedan correlacionarse con los datos clínicos de un sujeto para predecir un resultado clínico, un tratamiento clínico, una respuesta a un tratamiento en particular, o un diagnóstico de una subclase de una enfermedad. En algunas realizaciones, el sujeto o conjunto de sujetos se diagnostica con una subclase particular del esófago de Barrett. Después de medir los patrones, se asigna una puntuación o puntajes a la intensidad o cantidad de los patrones identificados, según las características descriptivas que se identifiquen en una o más muestras de células proporcionadas. En algunas realizaciones, se revisa la distribución espacial de los biomarcadores y su relación con las muestras de células tomadas del sujeto o del sujeto identificado como que no tienen esófago de Barrett u otro trastorno gastrointestinal para determinar una puntuación. Luego se usa un algoritmo para compilar cada puntaje o conjunto de puntajes para cada muestra celular y generar la probabilidad de que una muestra celular tomada de un sujeto que haya sido identificado con un trastorno gastrointestinal pueda tener una subclase particular de esófago de Barrett. En algunas realizaciones, el método puede comprender predecir si un sujeto identificado como que tiene esófago de Barrett pueda tener esófago de Barrett, sin displasia, sin progresión en 5 años; esófago de Barrett, sin displasia, progresión de displasia de grado bajo/alto en 5 años; esófago de Barrett, indefinido para displasia, sin progresión en 5 años; esófago de Barrett, indefinido para displasia, progresión de displasia de grado bajo/alto o adenocarcinoma en 5 años; esófago de Barrett, atipia reactiva; esófago de Barrett, displasia de bajo grado, sin progresión en 5 años; esófago de Barrett, displasia de bajo grado, progresión a displasia de alto grado o adenocarcinoma en 5 años; esófago de Barrett, displasia de alto grado; o adenocarcinoma esofágico que surge con antecedentes de haber padecido esófago de Barrett.
En una realización, la función utilizada para correlacionar una puntuación con un diagnóstico particular de un trastorno gastrointestinal se basa en un modelo predictivo. En una realización, el modelo predictivo se selecciona del grupo que consiste en un modelo de mínimos cuadrados parciales, un modelo de regresión logística, un modelo de regresión lineal, un modelo de análisis discriminante lineal, un modelo de regresión de cresta y un modelo de partición recursiva basada en árbol. En una realización, el rendimiento del modelo predictivo se caracteriza por un área bajo la curva (AUC) que varía de 0,68 a 0,70. En una realización, el rendimiento del modelo predictivo se caracteriza por un AUC que varía de 0,70 a 0,79. En una realización, el rendimiento del modelo predictivo se caracteriza por un AUC que varía de 0,80 a 0,89. En una realización, el rendimiento del modelo predictivo se caracteriza por un AUC que varía de 0,90 a 0,99.
Un ejemplo de una fórmula para un clasificador de 4 características es:
P progresión = 1/e z
z = pü + x 1p1 + X2p2 + X3p3 + X4p4
donde:
P progresión = probabilidad de progresión a displasia de bajo grado, displasia de alto grado o adenocarcinoma esofágico
x = una característica
xi = 0,99 cuantil de una intensidad media celular de p53
x2 = 0,99 cuantil de una intensidad media celular de HIF1 alfa
x3 = 0,05 cuantil de una intensidad media celular de HIF1 alfa de beta-catenina
x4 = 0,5 cuantil de una relación entre la membrana plasmática y el núcleo de COX-2
p = coeficiente de regresión para cada característica de biomarcador obtenida a través del ajuste de un modelo lineal generalizado utilizando una función de enlace logit
Métodos
Se describe en este documento el uso del sistema, dispositivos, aparatos, kits y composiciones para realizar una o más etapas de todos los métodos descritos en el presente documento.
Se describe en este documento un método para determinar el riesgo de progresión del esófago de Barrett en un sujeto, que comprende: a) detectar un subconjunto de biomarcadores en una muestra del sujeto, en el que dos o más biomarcadores en dicho subconjunto se seleccionan del grupo que consiste en p53, HIF-1 alfa, beta-catenina y COX-2; y b) determinar al menos una o más características descriptivas enumeradas en la Tabla 4 o 5 asociadas con dichos biomarcadores, en donde la presencia, ausencia, ubicación, proporción o cantidad de las características descriptivas determina una puntuación, relativa a un control, en donde la puntuación se correlaciona con el riesgo de progresión de un esófago de Barrett en el sujeto. En otra realización, al menos uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en p16, Ki-67, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína de activación de fibroblastos alfa, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleuquina-6, uroquinasa activadora de plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas y FasL. En otra realización, al menos uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en AMACR, CD1a, CD45RO, CD68, CK-20, Ki-67, NF-kB y p16. En otra realización, el sujeto tiene un riesgo mayor de una progresión a displasia de bajo grado, displasia de alto grado o cáncer de esófago. En otra realización, al sujeto no se le diagnostica displasia, atipia reactiva, indefinida para la displasia, displasia de bajo grado o displasia de alto grado. En otra realización, el método comprende además detectar el subconjunto de biomarcadores utilizando sondas que se unen específicamente a cada uno de dichos biomarcadores. En otra realización, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o 60 características descriptivas se determinan a partir de la Tabla 4. En otra realización, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, o 89 características descriptivas se determinan a partir de la Tabla 5.
También se describe en este documento un método para clasificar el esófago de Barrett en un sujeto, que comprende: a) detectar un subconjunto de biomarcadores en una muestra del sujeto, en el que dos o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en HIF-1 alfa, p53, CD45RO, p16, AMACR, CK-20, CDX-2, HER2/neu, CD1a, COX-2, NF-kB, y un biomarcador de ácido nucleico; y b) determinar al menos una o más características descriptivas enumeradas en la Tabla 6 asociadas con dichos biomarcadores, en donde la presencia, ausencia, ubicación, proporción o cantidad de las características descriptivas determina una puntuación, relativa a un control, en donde la puntuación se correlaciona con la clasificación del esófago de Barrett. En otra realización, al menos uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en Ki-67, beta-catenina, metaloproteinasa de matriz 1, CD68, CD4, horquilla P3, trombospondina-1, C-myc, proteína de activación de fibroblastos alfa, ciclina D1, EGFR, interleuquina-6, uroquinasa activadora de plasminógeno PLAU (uPA), Fas y FasL. En otra realización, la clasificación del esófago de Barrett no comprende displasia, atipia reactiva, displasia de bajo grado ni displasia de alto grado. En otra realización, el método comprende además detectar el subconjunto de biomarcadores utilizando sondas que se unen específicamente a cada uno de dichos biomarcadores. En otra realización, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70 o 71 características descriptivas se determinan a partir de la Tabla 6.
En otra realización, los métodos comprenden además la muestra que comprende un raspado, biopsia o resección quirúrgica de células y/o tejidos del sujeto. En otra realización, los métodos comprenden además características descriptivas que se identifican en compartimientos subcelulares y/o de tejido. En otra realización, los métodos comprenden además características descriptivas que comprenden además uno o más marcadores morfométricos seleccionados del grupo que consiste en área nuclear, diámetro equivalente nuclear, solidez nuclear, excentricidad nuclear, relación de glándula a estroma, relación de área nuclear a área citoplásmica, tamaño glandular nuclear, tamaño glandular nuclear y gradiente de intensidad, y textura nuclear. En otra realización, los métodos comprenden además la muestra que está a temperatura ambiente o congelada. En otra realización, los métodos comprenden además la muestra recién obtenida, fijada con formalina, fijada con alcohol o incrustada en parafina. En otra realización, los métodos comprenden además sondas que son fluorescentes y/o comprenden un marcador fluorescente, preferiblemente en la que cada sonda está marcada con un fluoróforo diferente. En otra realización, los métodos comprenden además el subconjunto de biomarcadores que comprenden al menos 3 biomarcadores y en el que los 3 biomarcadores son un biomarcador epitelial, un biomarcador inmune y/o un biomarcador estromal. En otra realización, los métodos detectan además un biomarcador de células madre. En otra realización, los métodos comprenden además la detección de 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 8 o más, o 12 o más biomarcadores simultáneamente. En otra realización, los métodos comprenden además que el sujeto sea un ser humano.
También se describe en este documento un método para cuantificar uno o más biomarcadores en una muestra celular que comprende: proporcionar una muestra celular, poner en contacto una pluralidad de sondas y/o tinciones con muestras de células ya sea en serie o simultáneamente, y determinar la cantidad relativa de sondas unidas a una pluralidad de biomarcadores que utilizan el sistema que comprende: (a) una muestra celular; (b) una pluralidad de sondas y/o tinciones que se unen a biomarcadores de la muestra celular; (c) uno o más escáneres ópticos que generan datos de imágenes digitales sobre la presencia, ausencia, ubicación, cantidad y/o intensidad de al menos una sonda o mancha que se une a un biomarcador de la muestra celular; (d) uno o más procesadores de datos, cada uno en comunicación operativa con al menos un escáner óptico, que, individual o colectivamente:
(i) recibe los datos de la imagen digital del escáner óptico y, opcionalmente, transmuta dichos datos de imagen digital en una señal de imagen digital; y (ii) analiza los datos de la imagen digital para identificar, medir o cuantificar una o más características descriptivas a partir de la pluralidad de sondas y/o manchas; y (iii) convierte las una o más características descriptivas en una puntuación, en donde (iii) comprende opcionalmente la integración de datos almacenados sobre un sujeto o grupo de sujetos para convertir una o más características descriptivas en una puntuación; (e) uno o más monitores, cada uno en comunicación operable con al menos un procesador de datos, que comprende una pantalla y que recibe un componente de las imágenes digitales u, opcionalmente, recibe la señal de imagen digital del procesador de datos y proyecta una señal digital en imagen direccionable en su pantalla; y (f) una o más unidades de almacenamiento de datos, cada una en comunicación operativa con al menos un procesador.
También se describe en este documento un método para diagnosticar el esófago de Barrett que comprende: (a) proporcionar una muestra celular de tejido; (b) poner en contacto una pluralidad de sondas con una muestra celular; (c) identificar una o más características descriptivas; (d) determinar una o más puntuaciones según la presencia, ausencia o cantidad de características descriptivas; y (e) correlacionar la puntuación con una subclase de esófago de Barrett. En algunas realizaciones, una o más etapas del método se realizan usando una o más de las composiciones, aparatos, dispositivos, kits o sistemas descritos en el presente documento.
Las muestras de células se obtienen de una biopsia (como una biopsia por punción), se cortan y se fijan en un portaobjeto o varios portaobjetos, y luego se cada portaobjeto o portaobjetos se toma una imagen digital y se analiza digitalmente por uno o más de los métodos descritos en este documento para identificar la presencia, ausencia, cantidad relativa y/o distribución espacial de biomarcadores en la muestra celular.
También se describe en este documento un método para determinar la respuesta del paciente a una terapia para trastornos del tracto gastrointestinal que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de muestras de células; (b) poner en contacto una pluralidad de sondas con cada muestra celular; (c) identificar una o más características descriptivas de cada muestra celular; (d) determinar una o más puntuaciones de cada muestra celular según la presencia, ausencia o cantidad de características descriptivas; y (e) predecir la respuesta del paciente respecto a una terapia para tratar o prevenir un trastorno gastrointestinal basado en la puntuación.
También se describe en este documento un método para compilar un perfil biológico de sistemas celulares de un sujeto o conjunto de sujetos que comprende: (a) proporcionar una o más muestras de células de un conjunto de sujetos; (b) poner en contacto una pluralidad de sondas con una o más muestras de células; (c) identificar una o más características descriptivas para cada muestra celular; (d) determinar una o más puntuaciones para cada muestra celular según la presencia, ausencia o cantidad de características descriptivas; y (e) compilar las puntuaciones para cada sujeto.
Un método para clasificar los tejidos del tracto gastrointestinal, que comprende: determinar, analizar, calcular o evaluar un perfil de expresión de biomarcadores de cada muestra celular; y clasificar las células en grupos determinados por la similitud del perfil de expresión de los biomarcadores. En algunas realizaciones, el método de clasificación de los tejidos del tracto gastrointestinal comprende determinar un perfil de expresión de biomarcadores usando un kit descrito en el presente documento.
Un método para determinar, probar, calcular o evaluar la capacidad de respuesta del paciente frente a una terapia para trastornos del tracto gastrointestinal que comprende:
(a) proporcionar una pluralidad de una muestra celular;
(b) poner en contacto una pluralidad de sondas con la muestra celular;
(c) identificar una o más características descriptivas;
(d) determinar una o más puntuaciones según la presencia, ausencia o cantidad de características descriptivas; y (e) predecir la capacidad de respuesta del paciente frente a una terapia para tratar o prevenir un trastorno gastrointestinal basado en la puntuación.
También se describe en este documento un método para controlar la diferenciación, morfología o progresión tumoral del sujeto que comprende: proporcionar dos o más muestras de células de dicho sujeto; determinar un perfil de expresión de cada una de las muestras de células; clasificar las muestras de células en agrupaciones determinadas por la similitud del perfil de expresión de los biomarcador; ordenar los grupos por similitud del perfil de expresión de los biomarcador; y determinar un curso temporal de los niveles de expresión del biomarcador para cada uno de la pluralidad de biomarcadores en diferentes etapas de diferenciación, morfología o progresión tumoral en las muestras de células. En algunas realizaciones, el método comprende determinar un perfil de expresión usando un kit descrito en el presente documento.
También se describe en este documento un método para identificar biomarcadores expresados diferencialmente, que comprende: determinar un perfil de expresión de biomarcadores de cada uno de un conjunto de muestras celulares en diferentes etapas de diferenciación, morfología o tumoral; clasificar las células en grupos determinados por la similitud del perfil de expresión del biomarcador; ordenar los grupos por la similitud del perfil de expresión del biomarcador; y determinar un curso temporal de niveles del biomarcador para cada uno de la pluralidad de biomarcadores en diferentes etapas de diferenciación, morfología o etapas tumorales en las muestras de células; e identificar biomarcadores expresados diferencialmente. En algunas realizaciones, el método para identificar biomarcadores expresados diferencialmente comprende usar un kit descrito en el presente documento.
También se describe en este documento un método para identificar un tipo de célula específico dentro de una muestra celular que contiene una pluralidad de células que comprende: determinar un perfil de expresión del biomarcador de una pluralidad de células; clasificar la pluralidad de células en agrupaciones determinadas por la similitud del perfil de expresión del biomarcador; y determinar la naturaleza y función de la pluralidad de células. En algunas realizaciones, el método para identificar un tipo de célula específico dentro de una muestra celular que contiene una pluralidad de células comprende usar el kit descrito en el presente documento.
También se describe en este documento un método para predecir el esófago de Barrett en un sujeto, que incluye: obtener una muestra celular del sujeto, en donde la muestra incluye una pluralidad de analitos; poner en contacto la muestra celular con una sonda y/o tinte o un conjunto de sondas; generar una pluralidad de complejos entre la sonda y/o el conjunto de sondas y la pluralidad de analitos; detectar la presencia, ausencia, cantidad o distribución espacial de la pluralidad de complejos para obtener un conjunto de datos de características descriptivas asociadas con la muestra celular, en donde el primer conjunto de datos incluye datos de expresión cuantitativos para al menos un conjunto de biomarcadores seleccionado del grupo que consiste en el marcador que se establece en el término 1, el término 2, el término 3 y, opcionalmente, el término 4 y, opcionalmente, el término 5 y, opcionalmente, el término 6 y, opcionalmente, el término 7; en donde de los términos 1 a los términos 7 cualquier combinación de uno o más biomarcadores seleccionados de los siguientes: p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína de activación de fibroblastos alfa, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleuquina-6 , uroquinasa activadora de plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y determinar una puntuación a partir del conjunto de datos utilizando una función de interpretación, en la que la puntuación predice el esófago de Barrett en el sujeto.
Kits
También se describe en este documento un kit que comprende (a) un conjunto de sondas que incluye una o una pluralidad de sondas para determinar un conjunto de datos asociado con una característica o características descriptivas para al menos un biomarcador de una muestra celular obtenida del sujeto; y (b) instrucciones para usar la sonda o la pluralidad de sondas para determinar una o más características descriptivas de la muestra celular; y, opcionalmente, (c) pasar el software almacenado a un formato legible por ordenador (tal como un disco duro, unidad flash, CD, DVD, disco, disquete, etc.) para convertir una o más características descriptivas en una puntuación. También se describe en este documento un kit que comprende (a) un conjunto de sondas que incluye una o una pluralidad de sondas para determinar un conjunto de datos asociado con una característica o características descriptivas para al menos un biomarcador de una muestra celular obtenida del sujeto; y (b) pasar el software almacenado en un formato legible por ordenador para convertir una o más características descriptivas en una puntuación.
También se describe en este documento un kit para el pronóstico de un resultado clínico particular del esófago de Barrett que comprende: (a) un conjunto de sondas que incluye una o una pluralidad de sondas para determinar un conjunto de datos asociado con una característica o características descriptivas para al menos un biomarcador de una muestra celular obtenida del sujeto; y (b) instrucciones para usar la sonda o la pluralidad de sondas para determinar una o más características descriptivas de la muestra celular, en donde las instrucciones incluyen instrucciones para determinar una puntuación del conjunto de datos donde la puntuación es predictiva de un resultado clínico particular de esófago de Barrett en el sujeto. También se describe en este documento un kit para el pronóstico de un resultado clínico particular del esófago de Barrett que comprende: (a) un conjunto de sondas que incluye una o una pluralidad de sondas para determinar un conjunto de datos asociado con una característica o características descriptivas para al menos un biomarcador de una muestra celular obtenida del sujeto y elegido de entre los siguientes: p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (a Ma c R, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína de activación de fibroblastos alfa, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleuquina-6, uroquinasa activadora de plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL, HIF-1 alfa; células epiteliales, células epiteliales multicapa, células endoteliales, linfocitos mononucleares periféricos, células T, células B, células asesinas naturales, eosinófilos, células madre, mastocitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, fibroblastos, células calciformes, células displásicas, células epiteliales columnares no tumorales, 9p21, 8q24.12-13, o centrómeros; y (b) instrucciones para usar la sonda o la pluralidad de sondas para determinar una o más características descriptivas de la muestra celular, en donde las instrucciones incluyen instrucciones para determinar una puntuación del conjunto de datos donde la puntuación es predictiva de un resultado clínico particular de esófago de Barrett en el sujeto.
También se describe en este documento un kit para el pronóstico de un resultado clínico particular del esófago de Barrett que comprende: (a) un conjunto de sondas que incluye una o una pluralidad de sondas para determinar un conjunto de datos asociado con una característica o características descriptivas para al menos un biomarcador de una muestra celular obtenida del sujeto y elegido de entre los siguientes: p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfametilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína de activación de fibroblastos alfa, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleuquina-6, uroquinasa activadora de plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL, HIF-1 alfa; células epiteliales, células epiteliales multicapa, células endoteliales, linfocitos mononucleares periféricos, células T, células B, células asesinas naturales, eosinófilos, células madre, mastocitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, fibroblastos, células tumorales, células displásicas, células epiteliales columnares no tumorales, 9p21, 8q24.12-13, 17q11.2-q12, o centrómeros; y (b) instrucciones para usar la sonda o la pluralidad de sondas para determinar una o más características descriptivas de la muestra celular, en donde las instrucciones incluyen instrucciones para determinar una puntuación del conjunto de datos donde la puntuación es predictiva de un resultado clínico particular de esófago de Barrett en el sujeto.
También se describe en este documento un kit para determinar el riesgo de progresión del esófago de Barrett en un sujeto que comprende: a) una o más sondas que pueden detectar al menos dos o más biomarcadores del grupo que consiste en p53, HIF-1 alfa, beta-catenina y COX-2; y b) instrucciones para usar las sondas para determinar una o más características descriptivas para generar una puntuación a partir de una muestra de células y/o tejido de un sujeto. En otra realización, el kit comprende además sondas que son capaces de detectar al menos uno o más biomarcadores detectados que se seleccionan del grupo que consiste en p16, Ki-67, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B, Cd68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína de activación de fibroblastos alfa, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleuquina-6, uroquinasa activadora de plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas y FasL. En otra realización, el kit comprende además sondas que son capaces de detectar al menos uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en AMACR, CD1a, CD45RO, CD68, CK-20, Ki-67, NF-kB y p16. En otra realización, el puntaje es predictivo del resultado clínico del esófago de Barrett en el sujeto y/o diagnóstico de la subclase del esófago de Barrett en el sujeto. En otra realización, las sondas comprenden sondas de anticuerpos que se unen específicamente a dichos biomarcadores. En otra realización, las sondas son fluorescentes y/o comprenden un marcador fluorescente. En otra realización, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o 60 características descriptivas se determinan a partir de la Tabla 4. En otra realización, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, o 89 características descriptivas se determinan a partir de la Tabla 5. En otra realización, el puntaje es predictivo del resultado clínico del esófago de Barrett en el sujeto y/o diagnóstico de la subclase del esófago de Barrett en el sujeto. En otra realización, las sondas comprenden sondas de anticuerpos que se unen específicamente a dichos biomarcadores. En otra realización, las sondas son fluorescentes y/o comprenden un marcador fluorescente.
También se describe en este documento un kit para el diagnóstico de una subclase particular de esófago de Barrett que comprende: (a) un conjunto de sondas que incluye una o una pluralidad de sondas para determinar un conjunto de datos asociado con una característica descriptiva o características para al menos un biomarcador de un muestra celular obtenida del sujeto; y (b) instrucciones para usar la sonda o la pluralidad de sondas para determinar una o más características descriptivas de la muestra celular, en donde las instrucciones incluyen instrucciones para determinar una puntuación del conjunto de datos donde la puntuación predice un diagnóstico del sujeto para una subclase del esófago de Barrett.
También se describe en este documento un kit para el diagnóstico de una subclase particular del esófago de Barrett que comprende: (a) un conjunto de sondas que incluyen una o una pluralidad de sondas para determinar un conjunto de datos asociado con una característica o características descriptivas para al menos un biomarcador de una muestra celular obtenida del sujeto y elegida de entre las siguientes: p16, p53, Ki-67, beta-catenina, alfametilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína de activación de fibroblastos alfa, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleuquina-6, urocinasa activadora de plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL, HIF-1 alfa; células epiteliales, células epiteliales multicapa, células endoteliales, linfocitos mononucleares periféricos, células T, células B, células asesinas naturales, eosinófilos, células madre, mastocitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, fibroblastos, células tumorales, células displásicas, células epiteliales columnares no tumorales, 9p21, 8q24.12-13, 17q11.2-q12, o centrómeros; y (b) instrucciones para usar la sonda o la pluralidad de sondas para determinar una o más características descriptivas de la muestra celular, en donde las instrucciones incluyen instrucciones para determinar una puntuación del conjunto de datos donde la puntuación predice un diagnóstico del sujeto para una subclase del esófago de Barrett. También se describen en este documento kits para el diagnóstico de un resultado clínico particular. En otra realización, el puntaje es predictivo del resultado clínico del esófago de Barrett en el sujeto y/o diagnóstico de la subclase del esófago de Barrett en el sujeto. En otra realización, las sondas comprenden sondas de anticuerpos que se unen específicamente a dichos biomarcadores. En otra realización, las sondas son fluorescentes y/o comprenden un marcador fluorescente.
También se describe en este documento un kit para clasificar el esófago de Barrett en un sujeto, que comprende: a) una o más sondas que pueden detectar al menos dos o más biomarcadores del grupo que consiste en HIF-1 alfa, p53, CD45RO, p16, AMACR, CK-20, CDX-2, HER2, CD1a, COX-2, NF-kB, Ki-67, CD-68, beta-catenina y ácido nucleico; y b) instrucciones para usar las sondas para determinar una o más características descriptivas para generar una puntuación a partir de una muestra de células y/o tejido de un sujeto.
En otra realización, el kit comprende además sondas que son capaces de detectar al menos uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en Ki-67, beta-catenina, metaloproteinasa de matriz 1, CD68, CD4, forkhead box P3, trombospondina-1, C-myc, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, EGFR, interleuquina-6, uroquinasa activadora de plasminógeno PLAU (uPA), Fas y FasL. En otra realización, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70 o 71 características descriptivas se determinan a partir de la Tabla 6. En otra realización, el puntaje es predictivo del resultado clínico del esófago de Barrett en el sujeto y/o diagnóstico de la subclase del esófago de Barrett en el sujeto. En otra realización, las sondas comprenden sondas de anticuerpos que se unen específicamente a dichos biomarcadores. En otra realización, las sondas son fluorescentes y/o comprenden un marcador fluorescente.
También se describe en este documento un kit para predecir la capacidad de respuesta frente a una terapia para tratar o prevenir el esófago de Barrett o un trastorno gastrointestinal en un sujeto, que comprende: (a) un conjunto de sondas que incluye una pluralidad de sondas para determinar un conjunto de datos de una muestra celular obtenida del sujeto para al menos dos biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en p16, p53, Ki-67, betacatenina, alfa-metilacil-CoA racemasa (AMACR, P504S), metaloproteinasa de matriz 1, CD1a, NF-kappa-B p65, ciclooxigenasa-2, CD68, CD4, forkhead box P3, CD45, trombospondina-1, C-myc, citoqueratina-20, proteína alfa de activación de fibroblastos, ciclina D1, HER2/neu, EGFR, interleuquina-6, uroquinasa activadora de plasminógeno PLAU (uPA), CDX2, Fas, FasL y HIF-1 alfa; y (b) instrucciones para usar la pluralidad de sondas para determinar el conjunto de datos de la muestra, en donde las instrucciones incluyen instrucciones para determinar un puntaje del conjunto de datos, en donde el puntaje es predictivo de la capacidad de respuesta de un sujeto a una terapia.
Todos los kits mencionados anteriormente pueden comprender opcionalmente cualquier sonda, tinte o conjunto de sondas y/o tintes específicos para un analito que corresponda a la presencia, ausencia, cantidad o distribución espacial de uno o más de los siguientes tipos de células: células epiteliales, células epiteliales multicapa, células endoteliales, linfocitos mononucleares periféricos, células T, células B, células asesinas naturales, eosinófilos, células madre, mastocitos, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, fibroblastos, células tumorales, células displásicas y células epiteliales columnares no tumorales. Los biomarcadores o analitos asociados a cada tipo de célula son conocidos en toda la técnica.
Todos los kits mencionados anteriormente pueden comprender opcionalmente cualquier sonda, tinte o conjunto de sondas y/o tintes específicos para una característica cromosómica que corresponde a la presencia, ausencia, cantidad o distribución espacial de una o más de las siguientes características cromosómicas: 9p21, 8q24.12-13, 17q11.2-q12, o centrómeros.
Todos los kits mencionados anteriormente pueden incluir un software almacenado en un formato legible por ordenador (como un disco duro, unidad flash, CD, DVD, disco, disquete, etc.) para convertir una o más características descriptivas en una puntuación.
Aunque la presente invención se ha descrito en relación con ciertas realizaciones específicas con fines de instrucción, la presente invención no está limitada a las mismas. Por ejemplo, aunque las realizaciones del sistema de análisis y la estructura de la red implementada por ordenador que se han descrito anteriormente en relación con la detección asistida por ordenador de ciertos biomarcadores u orgánulos subcelulares, el sistema de análisis y la estructura de red pueden aplicarse igualmente para detectar y analizar ciertos patrones determinados en imágenes digitales de otros objetos posicionados espacialmente en una imagen digital. Por ejemplo, el sistema de análisis se puede usar para detectar y analizar regiones anatómicas de compartimentos subcelulares, así como la frecuencia de diferentes regiones de una imagen posicionadas espacialmente. Al analizar muestras celulares representadas en imágenes digitales capturadas de microscopios fotográficos, las clases temáticas pueden asignarse a ubicaciones de píxeles que representan estructuras celulares o biomateriales probados o no probados. Por consiguiente, pueden ponerse en práctica diversas modificaciones, adaptaciones y combinaciones de las diversas características de las realizaciones descritas sin apartarse del alcance de la invención como se expone en las reivindicaciones.
Ejemplo 1
Desarrollo de pruebas para predecir el riesgo de adenocarcinoma esofágico en pacientes con esófago de Barrett Objetivo del proyecto: Desarrollar una prueba o varias pruebas de diagnóstico y pronóstico para el esófago de Barrett para predecir el riesgo de desarrollar un cáncer de esófago.
Necesidad clínica de la prueba: Anualmente se realizan más de 339.000 biopsias de GI superior en los EE. UU. y la estratificación del riesgo es difícil para los médicos. Aproximadamente el 50% de los pacientes diagnosticados por primera vez con cáncer de esófago (13.000 nuevos casos por año en los EE. UU.) dan negativo en displasia en la endoscopia previa, lo que significa que la vigilancia endoscópica actual no detecta a muchos pacientes en riesgo de cáncer. Además, muchos resultados de la biopsia para un diagnóstico de Barrett se reportan como indefinidos, lo que lleva a una incertidumbre en el riesgo de desarrollar cáncer.
Uso indicado para la prueba: Pacientes sometidos a endoscopia con sospecha de tener esófago de Barrett y para los cuales se dispondrá de material de biopsia para su análisis. Resultados procesables: el clasificador identificará a los pacientes con riesgo bajo, alto o intermedio de padecer cáncer esofágico. El médico responsable de la atención puede determinar si se debe aplicar un procedimiento como la ablación por radiofrecuencia (RFA), la resección endoscópica de la mucosa (EMR) u otro método de tratamiento.
Optimización de ensayos y formación de cohorte de pacientes de análisis
Se determinaron las condiciones de tinción de fluorescencia multiplexadas que producían una óptima señal:ruido y se corrigió el patrón de tinción para 14 biomarcadores de proteínas (Tabla 2). Se desarrollaron algoritmos de análisis de imágenes para i) identificar secciones de biopsia individuales en portas que contenían múltiples biopsias, ii) eliminar la autofluorescencia de las imágenes digitales de secciones de tejido esofágico, iii) segmentar núcleos individuales, citoplasmas y membranas plasmáticas en imágenes digitales de secciones de tejido esofágico, iv) segmentar el epitelio de superficie y glándulas del estroma en imágenes digitales de cortes de tejido esofágico y v) extraer características biomarcadoras cuantitativas de compartimentos subcelulares (núcleos, citoplasma, membrana plasmática) y compartimientos de tejidos (epitelio, glándulas, estroma). En la Fase 2, a continuación, se muestran ejemplos de imágenes de biomarcadores en tejidos esofágicos y miméticos de análisis de imágenes.
Tabla 2. Panel de biomarcadores diagnósticos-pronósticos
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Cohorte de análisis
La cohorte de análisis analizada hasta ahora se describe en la Tabla 3. La cohorte de análisis se está ampliando para incluir casos a partir de aproximadamente 200 casos.
Tabla 3. Sumario de la cohorte de análisis
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Sin progresión: pacientes que no progresaron sin displasia, atipia reactiva o indefinida para la displasia a displasia de bajo grado (LGD), displasia de alto grado (HGD) o adenocarcinoma esofágico (EAC)
Progresión a LGD: pacientes que progresaron de ausencia de displasia, atipia reactiva o indefinida para la displasia a displasia de bajo grado y pacientes que tenían diagnósticos múltiples de displasia de bajo grado
Progresión a HGD/CAE: pacientes que presentaron displasia de alto grado y pacientes que progresaron de ausencia de displasia, atipia reactiva, indefinido para displasia o displasia de bajo grado a displasia de alto grado o adenocarcinoma esofágico
Estudio de capacitación para evaluar la importancia diagnóstica y pronóstica de la prueba y para desarrollar clasificadores diagnósticos y pronósticos
Los 14 biomarcadores de proteínas y la morfología descritas en la Tabla 2 se evaluaron en la cohorte de análisis inicial de 78 pacientes en la Tabla 3.
Métodos: Marcado con biomarcador de fluorescencia multiplexado e imagenología en tejidos esofágicos
Se prepararon portaobjetos de vidrio con secciones de 5 micrómetros de espesor de biopsias esofágicas fijadas con formalina y embebidas en parafina. Los portaobjetos se cocieron a 60°C durante 30 minutos para fundir la parafina y se sumergieron en Aqua DePar (Biocare Medical) durante 10 minutos a 75°C para eliminar la parafina de las secciones de tejido. Luego se sumergieron los portaobjetos en tampón de recuperación de antígeno (EDTA 1 mM, Tris 10 mM al 0,05% de Tween 20, pH 9) a 99°C durante 20 minutos, seguido de temperatura ambiente durante 20 minutos. Los portaobjetos se lavaron dos veces durante 5 minutos cada lavado en solución salina de Tween 20 tamponada con Tris al 0,025% a temperatura ambiente y luego se aplicó el potenciador de señal Image-iT FX (Invitrogen) durante 30 minutos a temperatura ambiente. El potenciador de señal se reemplazó con tampón de bloqueo y los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente.
El tampón de bloqueo se reemplazó luego con un cóctel de 3 cócteles de anticuerpos primarios de la siguiente manera para cada subpanel:
Subpanel 1: IgG de conejo anti-Ki-67, IgG2a de ratón anti-citoqueratina-20, IgG1 de ratón anti-beta-catenina;
Subpanel 2: IgG de conejo anti-AMACR, IgG2a de ratón anti-p16, IgG2b p53 de ratón;
Subpanel 3: IgG de conejo anti-COX2, IgG3 de ratón anti-CD68, IgG1 de ratón anti-NFkB p65;
Subpanel 4: IgG de conejo anti-HIF-1 alfa, IgG2a de ratón anti-CD45RO, IgG1 de ratón anti-CD1a;
Subpanel 5: IgG de conejo anti-HER2, IgG2a de ratón anti-citoqueratina-20, IgG1 de ratón anti-CDX-2.
Los portaobjetos se incubaron con los cócteles de anticuerpos primarios durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavaron los portaobjetos tres veces durante 4 minutos cada lavado en solución salina tamponada con tris al 0,025% de Tween 20 y se volvió a aplicar el tampón de bloqueo. El tampón de bloqueo se reemplazó con un cóctel de anticuerpos secundarios específicos para cada isotipo conjugado con fluoróforos para cada subpanel de la siguiente manera: Subpanel 1: IgG anti-conejo de Alexa Fluor 488 de cabra, IgG2a anti-ratón de Alexa Fluor 555 de cabra, IgG1 anti-ratón de Alexa Fluor 647 de cabra; Subpanel 2: IgG2a anti-ratón de Alexa Fluor 488 de cabra, IgG anti-conejo de Alexa Fluor 555 de cabra, IgG2b anti-ratón de Alexa Fluor 647 de cabra; Subpanel 3: IgG3 anti-ratón de Alexa Fluor 488 de cabra, IgG1 anti-ratón de Alexa Fluor 555 de cabra, IgG anti-conejo de Alexa Fluor 647 de cabra; Subpanel 4: IgG anti-conejo de Alexa Fluor 488 de cabra, IgG2a anti-ratón de Alexa Fluor 555 de cabra, IgG1 anti-ratón de Alexa Fluor 647 de cabra; Subpanel 5: IgG anti-conejo de Alexa Fluor 488 cabra, IgG2a anti-ratón de Alexa Fluor 555 de cabra, IgG1 anti-ratón de Alexa Fluor 647 de cabra. Los portaobjetos se incubaron con los cócteles de anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente.
Los portaobjetos se lavaron tres veces durante 4 minutos cada lavado en solución salina tamponada con Tris y luego se aplicaron 10 mg/ml de Hoechst 33342 (diluido en agua desionizada) a los portaobjetos durante 3 minutos, seguido de un lavado en agua desionizada durante 3 minutos. Luego, los portaobjetos se secaron al aire y se montaron con cubreobjetos usando medio Antifade Gold Prolong (Invitrogen). Secciones en serie adicionales también se tiñeron con hematoxilina y eosina utilizando métodos estándar de histología.
Los portaobjetos teñidos con fluorescencia se escanearon con 20 aumentos en un ScanScope FL con un filtro cuatribanda DAPI/FITC/TRITC/Cy5 (Aperio Technologies, Vista, California). Se determinaron los tiempos de exposición óptimos para cada panel de biomarcadores y se aplicaron los mismos ajustes de exposición para cada panel de biomarcadores a todas las exploraciones de portaobjetos. Ejemplo de imágenes digitales de cada canal fluorescente para los subpaneles del biomarcador 1-5 se muestran en las Figs. 4-8. Se escanearon portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina a 20 veces en el escáner de portaobjetos NanoZoomer Digital Pathology (Hamamatsu Corporation, K.K., Japón).
Análisis de imágenes para extraer datos cuantitativos de biomarcadores
El análisis de imágenes se realizó en portaobjetos completos de imágenes digitales de las biopsias del esófago de Barrett utilizando el software Matlab para desarrollar algoritmos de análisis de imágenes específicas. Estos algoritmos fueron desarrollados por Cernostics. El flujo de trabajo del procesamiento de imágenes de Cernostics consta de los siguientes componentes: detección de imágenes, validación de imágenes, segmentación de objetos de imágenes de orden bajo, medición de características y segmentación de objetos de imágenes de orden superior. Una captura de pantalla del tablero de instrumentos de Cernostics para el procesamiento de imágenes, la segmentación y la extracción de datos se muestra en la figura 9. La detección de imágenes consiste en un algoritmo para la detección automática de secciones de tejido en toda la imagen de la diapositiva. Cada sección de tejido tiene auto-fluorescencia de eritrocitos eliminados por un algoritmo de detección automatizado. Cada sección de tejido se envía luego a un algoritmo de detección de núcleos, que, a su vez, se utiliza para estimar el citoplasma celular. Se calcula un mimético de membrana plasmática para los marcadores que se sabe que se expresan en la membrana plasmática. Las miméticos de imagen de células, núcleos y membranas plasmáticas se utilizan para calcular las características de los objetos de imagen que consisten en mediciones de formas morfológicas, expresiones de marcadores en los diferentes compartimentos celulares y relaciones de expresiones de marcadores en los diferentes compartimentos celulares. Las coordenadas x-y de cada entidad de objeto de imagen se registran para permitir los análisis espaciales de expresión de los biomarcadores. Para cada sección de tejido, se calculan miméticos de orden superior para identificar glándulas, epitelio, estroma e inflamación. Los patrones de expresión de marcadores se localizan entonces en estos objetos de imagen de orden superior. El análisis de la imagen calcula la intensidad media de cada biomarcador en cada célula o compartimento celular. La distribución de células individuales se resume para cada caso de paciente en los percentiles indicados. La comparación de los cuantiles entre las clases de diagnóstico y las clases de riesgo es más sensible que la comparación de medias en la detección de muestras con sobreexpresión o pérdida de expresión de biomarcadores en pequeñas cantidades de células. Ejemplo de miméticos de análisis de imágenes se muestran en la figura 10.
En la figura 10, se escaneó un portaobjetos de biopsia esofágica teñido para el Subpanel 1 (Hoechst, Ki-67-Alexa Fluor 488, CK-20-Alexa Fluor 555, Beta-catenina-Alexa Fluor 647) con 20 aumentos (A). Se aplicó un análisis de imagen para identificar y segmentar las biopsias individuales en la diapositiva (B). Se muestran imágenes de biopsia completa de la biopsia superior derecha en los cuatro canales de fluorescencia C: Hoechst, D: Ki-67, E: CK-20, F: Beta-catenina. El análisis de imágenes se utilizó para identificar y eliminar la autofluorescencia (G), aplicar un mimético de borde nuclear (H), mimético de área nuclear (I), mimético de célula (J), mimético de membrana plasmática (K) y miméticos de glándula y estroma (L).
Análisis estadísticos: significación pronóstica-estratificación de los casos según el riesgo de progresar a LGD, HGD o EAC
Se seleccionaron 276 características (intensidad media en células o compartimentos celulares, relaciones de una intensidad de biomarcador entre dos compartimentos celulares, relaciones de dos biomarcadores entre uno o dos compartimentos celulares, tamaño nuclear, forma e intensidad) una cada vez mediante regresión logística para producir una clasificación univariada de características que son significativamente diferentes entre los no progresores y los progresores. En la Tabla 4 se resumen 60 características con un valor de p < 0,05 en la comparación de casos Sin Progresión frente a Progresión a casos de HGD/EAC. Las características estadísticamente significativas en la Tabla 4 se derivan de los siguientes biomarcadores: AMACR, Beta-catenina, CD1a, CD45RO, CD68, COX2, HIF1alfa, Ki-67, NF-kB, p16, p53. En la Tabla 5 se resumen 89 características con un valor de p de < 0,05 en comparación de casos Sin Progresión frente a Progresión a LGD y Progresión a HGD/EAC. Las características estadísticamente significativas en la Tabla 5 se derivan de los siguientes biomarcadores: AMACR, Beta-catenina, CD1a, CD45RO, CD68, CK-20, COX2, HIF1alfa, Ki-67, NF-kB, p16, p53.
Las 50 funciones principales fueron seleccionadas e ingresadas en un procedimiento de regresión logística paso a pasos. El mejor modelo fue elegido usando el criterio de información de Akaike. El predictor lineal resultante utiliza las siguientes características:
Percentil 99 de la intensidad media celular p53
Percentil 99 de la intensidad media celular HIF-1
Percentil 5 de la intensidad media de células de beta-catenina
Percentil 50 de la relación membrana plasmática:núcleo COX2
Las características representan procesos tumorales/epiteliales, inflamación y angiogénesis en el sistema de tejido del esófago de Barrett.
En la Figura 11 se muestran la curva de las Características operativas del receptor (ROC) para el predictor multivariado y los diagramas de caja con un ejemplo de corte que produce una especificidad del 90,9% y una sensibilidad del 88,2% en la estratificación del grupo sin progresión y progresión frente al grupo HGD/EAC. En la figura 11, las 50 principales características de una clasificación univariada de las características para discriminar los casos "sin progresión" de los de "progresión a HGD/EAC" se seleccionaron y se ingresaron en un procedimiento de regresión logística por pasos. El mejor modelo fue elegido usando el criterio de información de Akaike. La gráfica ROC (izquierda) muestra la sensibilidad y la especificidad en función del umbral de pronóstico. El círculo más grande y la línea de puntos y la inserción de la tabla muestran el resultado de un análisis de decisión ejemplar que optimiza la compensación entre falsos positivos y falsos negativos. La relación de costes es 1 y la proporción de probabilidades de prevalencia es 1. La gráfica de la derecha muestra diagramas de caja para el predictor lineal con la línea de puntos en un ejemplo de corte que produce una especificidad del 90,9% y una sensibilidad del 88,2%. El grupo sin progresión consiste en pacientes que no progresaron a ningún tipo de displasia o cáncer. El grupo de Progresión a HGD/EAC consiste en esófago de Barrett con displasia de bajo grado, sin displasia, atipia reactiva o indefinido para la displasia que progresó a displasia de alto grado o adenocarcinoma esofágico.
Las curvas ROC y los diagramas de caja para las dos características principales por clasificación univariada (p53 y HIF1-alfa: CD1a) se muestran en la figura 12. En la figura 12, los gráficos ROC muestran la sensibilidad y la especificidad para p53 (A) y la relación HIF1-alfa:CD1a (C) en función del umbral predictivo. El círculo más grande y la línea de puntos y la inserción de la tabla muestran el resultado de un análisis de decisión ejemplar que optimiza la compensación entre falsos positivos y falsos negativos. La relación de costes es 1 y la proporción de probabilidades de prevalencia es 1. Las gráficas B y D muestran gráficas de caja para los predictores lineales con la línea de puntos en un corte ejemplar que produce una especificidad de 93,9% y una sensibilidad de 58,8% para p53 y una especificidad de 85,3% y una sensibilidad de 82,4% para la relación HIF1-alfa:CD1a. El grupo sin progresión consiste en pacientes que no progresaron a ningún tipo de displasia o cáncer. El grupo de Progresión a HGD/EAC consiste en esófago de Barrett con displasia de bajo grado, sin displasia, atipia reactiva o indefinido para la displasia que progresó a displasia de alto grado o adenocarcinoma esofágico. Los valores de P después del ajuste de Bonferroni son 0,0128 para p53 y 0,0017 para HIF1alfa-CD1a.
Significación diagnóstica: estratificación de los casos según el diagnóstico o la clasificación del esófago de Barrett Se seleccionaron 205 características (intensidad media en células o compartimentos celulares, relaciones de una intensidad de biomarcador entre dos compartimentos celulares, relaciones de dos biomarcadores entre uno o dos compartimentos celulares, tamaño nuclear, forma e intensidad) una cada vez mediante regresión logística para producir una clasificación univariada de las características que son significativamente diferentes entre los casos de esófago de Barrett sin displasia o atipia reactiva frente a los casos de esófago de Barrett con displasia de bajo grado o displasia de alto grado. La Tabla 6 resume las 71 características que tuvieron un valor de p < 0,05 en este análisis. Las características estadísticamente significativas descritas en la Tabla 6 se derivan de los siguientes biomarcadores y morfometría: área de núcleos, diámetro equivalente de núcleos, solidez de núcleos, excentricidad de núcleos, intensidad de ADN (Hoechst), HIF1alfa, p53, CD45RO, p16, AMACR, CK-20, CDX-2, HER2, CD1a, COX-2, NF-kB.
La Tabla 7 enumera las características significativas de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico y las localizaciones subcelulares.
Tabla 4. Clasificación univariada de los valores de P de la regresión logística de casos sin progresión frente a progresión frente a los casos de HGD/EAC.
Figure imgf000033_0001
relación de membrana 0,650 0,218 2,976 0,003 1,915 1,248 2,938 0,0000042 HIF1 alfa: núcleo CD1a
0,99
Intensidad media de 0,014 0,005 2,859 0,004 1,014 1,004 1,024 0,0000305 los núcleos p530,99
Intensidad media del 0,014 0,005 2,478 0,013 1,014 1,003 1,025 0,0001976 citoplasma p530,99
Intensidad media de la 0,015 0,006 2,374 0,018 1,015 1,003 1,028 0,0003323 célula p530,99
Intensidad media de 0,020 0,007 2,661 0,008 1,020 1,005 1,035 0,0007769 los núcleos HIF1alfa
0,99
Intensidad media de 0,016 0,008 2,091 0,037 1,016 1,001 1,032 0,0009684 los núcleos p530,99
Intensidad media de la -0,289 0,102 -2,837 0,005 0,749 0,613 0,914 0,0011908 célula CD1a 0,95
Intensidad media del -0,233 0,081 -2,874 0,004 0,792 0,676 0,929 0,0012823 citoplasma 0,01
Intensidad media del -0,207 0,078 -2,661 0,008 0,137 0,697 0,969 0,0013442 citoplasma CD1a 0,01
relación de plasma 0,349 0,142 2,465 0,014 1,418 1,074 1,872 0,0015026 celular:Nuc AmACR
0,99
Intensidad media del -0,214 0,081 -2,647 0,008 0,808 0,689 0,915 0,0015588 citoplasma CD1a 0,99
relación de citoplasma 0,032 0,012 2,722 0,006 1,032 1,009 1,056 0,0018362 HIF1alfa:membrana
CD1a
relación de membrana 0,763 0,368 2,075 0,038 2,145 1,043 4,410 0,0020232 p53:núcleo AMACR
0,95
Intensidad media de -0,197 0,076 -2,597 0,009 0,821 0,708 0,953 0,0036836 los núcleos CD1a 0,01
Intensidad media de -0,147 0,058 -2,539 0,011 0,864 0,771 0,967 0,0039722 los núcleos CD1a 0,05
Intensidad media del 0,022 0,009 2,432 0,015 1,022 1,004 1,040 0,0040797 citoplasma HIF1alfa
0,99
Intensidad media del 0,015 0,009 1,614 0,107 1,015 0,997 1,033 0,0042746 citoplasma p530,99
Intensidad media de la 0,016 0,009 1,708 0,088 1,016 0,998 1,034 0,0044423 célula p530,95
relación de citoplasma 0,017 0,008 2,197 0,028 1,017 1,002 1,033 0,0048921 p53:membrana
AMACR 0,99
Intensidad media 0,021 0,008 2,455 0,014 1,021 1,004 1,038 0,0049838 celular HIFIalfa 0,99
Intensidad media de 0,021 0,010 2,167 0,030 1,021 1,002 1,041 0,0052668 los núcleos CD680,99
relación de citoplasma -1,032 0,451 -2,289 0,022 0,356 0,147 0,862 0,0063369 NFKB:membrana
CD680,01
relación de citoplasma -1,928 0,859 -2,244 0,025 0,146 0,027 0,783 0,0071582 CD1a:membrana
CD45RO 0,05
relación de membrana -68,69 93,221 -0,737 0,461 0,000 0,000 3,288E 0,0077902 AMACR:núcleo P16 5 49
0,5
relación de membrana -35,23 47,327 -0,744 0,457 0,000 0,000 9,645E 0,0082491 AMACR: núcleo 0,5 3 24
intensidad media -0,167 0,074 -2,265 0,023 0,846 0,732 0,978 0,0085289 núcleos beta-catenina
0,5
relación membrana 0,637 0,304 2,096 0,036 1,891 1,042 3,431 0,0091023 HIF1 alfa: núcleos
CD1a 0,95
Intensidad media -0,269 0,121 -2,221 0,026 0,765 0,603 0,969 0,0091937 celular beta-catenina
0,95
relación citoplasma -0,766 0,342 -2,241 0,025 0,465 0,308 0,908 0,0094542 CD45RO:membrana
HIF1 alfa 0,01
Intensidad media de la 0,01 -0,099 0,045 -2,210 0,027 0,830 0,989 0,0108643 célula P160,01 0,906
relación de citoplasma -3,866 1,844 -2,097 0,036 0,021 0,001 0,777 0,0114551 CD1a:membrana
CD45RO 0,01
Intensidad media -0,171 0,079 -2,155 0,031 0,843 0,722 0,985 0,0115135 celular beta-catenina
0,05
relación de citoplasma -0,393 0,199 -1,973 0,048 0,675 0,457 0,997 0,0123236 NFKB:membrana
CD680,05
relación de citoplasma 0,026 0,014 1,937 0,053 1,027 1,000 1,055 0,0154614 p53:membrana
AMACR 0,05
intensidad media del 0,019 0,009 2,100 0,036 1,019 1,001 1,037 0,0162049 citoplasma CD680,99
relación de citoplasma -1,159 0,559 -2,074 0,038 0,314 0,105 0,938 0,0163040 p53:membrana nuclear
0,01
relación de membrana 0,765 0,338 2,263 0,024 2,149 1,108 4,170 0,0179868 COX2:núcleos NFKB
0,95
intensidad media de 0,019 0,010 1,962 0,050 1,019 1,000 1,039 0,0185398 células CD680,99
relación membrana 0,265 0,144 1,842 0,065 1,304 0,983 1,729 0,0210546 COX2:núcleo 0,99
relación membrana 2,707 1,212 2,232 0,026 14,97 1,391 161,21 0,0216124 COX2:núcleo 0,5 7 4
intensidad media -0,140 0,071 -1,977 0,048 0,869 0,756 0,999 0,0217620 citoplasma betacatenina 0,05
relación citoplasma -1,467 0,815 -1,801 0,072 0,231 0,047 1,138 0,0233622 COX2:membrana 0,01
CD68 -0,645 0,340 -1,900 0,057 0,524 0,270 1,021 0,0244353 citoplasma:membrana
relación 0,05
relación membrana 0,299 0,184 1,622 0,105 1,348 0,940 1,935 0,0250856 CD45RO:núcleo
HIF1alfa 0,99
intensidad media -0,240 0,127 -1,887 0,059 0,787 0,613 1,009 0,0258754 celular AMACR 0,01
intensidad media -0,147 0,074 -1,980 0,048 0,863 0,747 0,999 0,0307526 núcleos beta-catenina
0,01
intensidad media 0,009 0,004 2,036 0,042 1,009 1,000 1,018 0,0321749 núcleos Ki670,99
relación citoplasma -1,353 0,711 -1,903 0,057 0,258 0,064 1,041 0,0325397 CD68:membrana 0,01
relación membrana 134419,9 -0,008 0,993 0,000 0,000 Inf 0,0333813 nuclear Ki67:núcleo 1106,1 88
beta-catenina 0,5 10
relación membrana 172094,0 -0,009 0,993 0,000 0,000 Inf 0,0333813 nuclear Ki67:núcleo 1609,2 78
total 0,5 07
relación citoplasma 0,026 0,013 2,003 0,045 1,027 1,001 1,054 0,0343305 HIF1alfa: membrana
CD1a 0,95
relación célula -0,596 0,368 -1,617 0,106 0,551 0,268 1,135 0,0351331 citoplasma COX20,05
intensidad media -0,132 0,070 -1,888 0,059 0,876 0,764 1,005 0,0410004 citoplasma betacatenina 0,01
p53 intensidad media -0,263 0,140 -1,879 0,060 0,769 0,584 1,011 0,0426466 celular 0,01
relación membrana 0,889 0,459 1,937 0,053 2,432 0,990 5,980 0,0430243 COX2:núcleo 0,95
relación membrana -0,834 0,461 -1,812 0,070 0,434 0,176 1,071 0,0459256 nuclear Ki67:núcleo
total 0,99
relación membrana 3,248 1,696 1,915 0,055 25,74 0,927 714,91 0,0505738 COX2:NFKB núcleo
0,5 6 5
relación citoplasma -0,054 0,029 -1,872 0,061 0,947 0,895 1,003 0,0510762 COX2:membrana 0,5
relación citoplasma 0,222 0,131 1,687 0,092 1,248 0,965 1,615 0,0510880 P16:membrana 0,05
intensidad media -0,159 0,091 -1,750 0,080 0,853 0,714 1,019 0,0526574 celular p530,05
Tabla 5. Clasificación univariada de los valores de P de la regresión logística de los casos sin progresión frente progresión a LGD y la progresión a casos de HGD/EAC.
Figure imgf000036_0001
relación citoplasma 1,264 0,432 2,925 0,003 3,538 1,517 8,252 0,0003597 p16:membrana
plasmática 0,01
relación citoplasma 0,371 0,143 2,591 0,010 1,449 1,094 1,917 0,0006047 p16:membrana
plasmática 0,05
relación citoplasma 0,726 0,278 2,609 0,009 2,066 1,198 3,565 0,0006340 AMACR: membrana
plasmática p160,05
relación citoplasma 2,183 0,779 2,802 0,005 8,869 1,927 40,826 0,0009991 AMACR: membrana
plasmática p160,01
intensidad media 0,010 0,004 2,402 0,016 1,010 1,002 1,018 0,0011155 núcleos p530,99
intensidad media -0,160 0,057 2,824 0,005 0,852 0,763 0,952 0,0011196 celular CD1a 0,05
intensidad media -0,129 0,045 -2,848 0,004 0,879 0,804 0,961 0,0015972 núcleos CD1a 0,05
relación membrana 0,798 0,279 2,863 0,004 2,222 1,286 3,837 0,0019325 plasmática
COX2:núcleo NFKB
0,95
intensidad media -0,212 0,076 -2,805 0,005 0,809 0,698 0,938 0,0019355 celular CD1a 0,01
relación membrana 0,310 0,130 2,384 0,017 1,364 1,057 1,760 0,0025299 plasmática p53:núcleo
AMACR 0,99
relación COX2 -1,515 0,634 -2,388 0,017 0,220 0,063 0,762 0,0026297 citoplasma:membrana
plasmática 0,01
intensidad media -0,148 0,056 -2,652 0,008 0,862 0,773 0,962 0,0027675 citoplasma CD1a 0,05
relación membrana 0,735 0,339 2,170 0,030 2,085 1,074 4,048 0,0029764 nuclear p53:núcleo
AMACR 0,95
intensidad media 0,009 0,004 2,135 0033 1,009 1,001 1,018 0,0030656 citoplasma p530,99
relación membrana -1,746 0,665 -2,627 0009 0,174 0,047 0,642 0,0032675 plasmática p16:núcleo
0,95 -intensidad media 0,011 0,005 2,149 0032 1,011 1,001 1,020 0,0036121 celular p530,99
intensidad media -0,052 0,020 -2,615 0 009 0,949 0,913 0,987 0,0038135 celular p160,05 -relación membrana 2,821 1,039 2,716 0 007 16,798 2,194 128,626 0,0038420 plasmática
COX2:núcleo 0,5
relación citoplasma -0,067 0,025 -2,690 0007 0,935 0,891 0,982 0,0046218 COX2:membrana
plasmática 0,5
relación membrana 1,000 0,379 2,637 0 008 2,718 1,293 5,714 0,0049389 plasmática
COX2:núcleo 0,95
intensidad media -0,088 0,035 -2,481 0 013 0,916 0,855 0,982 0,0053106 celular p160,01
relación citoplasma 0,016 0,007 2,255 0 024 1,016 1,002 1,031 0,0054591 p53:membrana
AMACR 0,99
intensidad media -0,040 0,016 -2,514 0 012 0,961 0,932 0,991 0,0058166 núcleos p160,05
relación citoplasma 0,006 0,002 2,575 0 010 1,006 1,001 1,010 0,0058939 CK20:membrana
nuclear Ki670,99
intensidad media -0,150 0,059 -2,565 0 010 0,861 0,767 0,965 0,0059660 citoplasma CD1a 0,01
intensidad media 0,009 0,004 2,492 0013 1,009 1,002 1,016 0,0068895 núcleos Ki670,99
relación citoplasma -0,568 0,273 -2,081 0037 0,567 0,332 0,968 0,0073582 COX2:membrana
plasmática 0,05
citoplasma -1,038 0,423 -2,456 0014 0,354 0,155 0,811 0,0079558 CK20:membrana
nuclear Ki670,01
intensidad media -0,135 0,054 -2,493 0 013 0,873 0,785 0,971 0,0080586 núcleos CD1a 0,01
relación citoplasma -0,911 0,453 -2,008 0045 0,402 0,165 0,979 0,0083563 CD68:membrana
plasmática COX20,01
relación membrana 0,089 0,037 2,419 0 016 1,093 1,017 1,174 0,0083992 plasmática CK20:
núcleo Ki670,99
relación membrana -0,929 0,385 -2,411 0016 0,395 0,185 0,840 0,0086131 nuclear Ki67:núcleo
0,99
membrana plasmática -0,361 0,157 -2,300 0 021 0,697 0,513 0,948 0,0088832 p16:núcleo p530,95
relación citoplasma -0,032 0,013 -2,457 0014 0,968 0,944 0,993 0,0092092 CD68:membrana
plasmática COX20,5
relación citoplasma -0,672 0,282 -2,381 0017 0,511 0,294 0,888 0,0094753 NFKB: membrana
plasmática CD680,01
membrana plasmática 3,402 1,440 2,363 0018 30,027 1,787 504,662 0,0097278 COX2: núcleo NFKB
0,5
intensidad media 0,011 0,006 1,720 0085 1,011 0,998 1,024 0,0107267 núcleos p530,95
intensidad media -0,046 0,021 -2,228 0 026 0,955 0,917 0,994 0,0109146 núcleos CD1a 0,5
relación citoplasma 0,181 0,085 2,125 0 034 1,199 1,014 1,417 0,0111103 HIF1alfa:membrana
plasmática 0,05
relación citoplasma 0,009 0,004 2,360 0 018 1,009 1,002 1,016 0,0112116 CK20:membrana
nuclear Ki670,95
relación membrana 0,170 0,075 2,263 0 024 1,185 1,023 1,373 0,0125502 plasmática CK20:
núcleo Ki670,95
relación membrana 0,209 0,098 2,133 0 033 1,232 1,017 1,492 0,0146451 plasmática
HIF1alfa:núcleo CD1a
0,99
intensidad media -0,017 0,008 -2,231 0 026 0,983 0,968 0,998 0,0147046 núcleos p160,5
intensidad media -0,047 0,022 -2,129 0 033 0,954 0,914 0,996 0,0147551 celular CD1a 0,5
intensidad media -0,019 0,009 -2,225 0 026 0,981 0,965 0,998 0,0148032 celular p160,5
relación membrana -8,796 4,671 -1,883 0060 0,000 0,000 1,432 0,0149746 AMACR:núcleo 0,5
relación citoplasma -0,131 0,095 -1,375 0169 0,877 0,727 1,057 0,0154471 NFKB: membrana
plasmática 0,5
relación citoplasma 0,026 0,013 1,986 0 047 1,026 1,000 1,052 0,0164280 p53:membrana
plasmática AMACR
0,95
relación membrana -16,069 8,741 -1,838 0066 0,000 0,000 2,896 0,0174328 AMACR: núcleo P16
0,5
relación citoplasma -0,286 0,157 -1,822 0068 0,752 0,553 1,022 0,0175976 CD68:membrana
plasmática COX20,05
intensidad media -0,023 0,012 -2,038 0 042 0,977 0,955 0,999 0,0181563 núcleos CD1a 0,95
intensidad media 0,012 0,008 1,597 0,110 1,012 0,997 1,028 0,0187632 celular p530,95
relación citoplasma 0,104 0,052 2,011 0,044 1,110 1,003 1,229 0,0223427 CD45RO: membrana
plasmática HIF1A0,05
intensidad media 0,011 0,007 1,437 0,151 1,011 0,996 1,025 0,0228740 citoplasma p530,95
intensidad media -0,017 0,008 -2,086 0,037 0,984 0,968 0,999 0,0231425 citoplasma P160,5
relación citoplasma -1,136 0,603 -1,885 0,059 0,321 0,099 1,046 0,0236419 NFKB: membrana 0,05
intensidad media -0,083 0,040 -2,061 0,039 0,921 0,851 0,996 0,0255629 núcleos AMACR 0,05
intensidad media -0,040 0,021 -1,969 0,049 0,960 0,923 1,000 0,0257324 citoplasma CD1a 0,5
relación citoplasma -0,027 0,013 -2,083 0,037 0,973 0,949 0,998 0,0270777 CD68:membrana
plasmática COX20,95
relación membrana 0,255 0,139 1,833 0,067 1,290 0,983 1,695 0,0282164 plasmática
COX2:núcleo 0,99
relación citoplasma -0,850 0,415 -2,047 0,041 0,427 0,189 0,965 0,0290736 Ki67:membrana
nuclear 0,01
relación citoplasma 0,502 0,262 1,921 0,055 1,653 0,990 2,760 0,0302793 AMACR: membrana
0,01
relación citoplasma -0,224 0,134 -1,676 0,094 0,799 0,615 1,039 0,0315419 p16:membrana nuclear
p530,01
intensidad media -0,015 0,008 -1,889 0,059 0,985 0,969 1,001 0,0320830 núcleos CD1a 0,99
intensidad media -0,020 0,011 -1,844 0,065 0,980 0,960 1,001 0,0366663 celular CD1a 0,95
relación membrana -5,337 3,154 -1,692 0,091 0,005 0,000 2,325 0,0370970 plasmática P16:núcleo
0,5
relación membrana -1,667 1,106 -1,508 0,132 0,189 0,022 1,649 0,0372701 plasmática P16: núcleo
p530,5
relación citoplasma 0,016 0,008 1,955 0,051 1,016 1,000 1,032 0,0389365 HIF1alfa: membrana
plasmática CD1a 0,99
intensidad media -0,013 0,007 -1,902 0,057 0,987 0,974 1,000 0,0397682 núcleos AMACR 0,99
intensidad media -0,024 0,013 -1,948 0,051 0,976 0,952 1,000 0,0407365 núcleos HIF1alfa 0,5
relación citoplasma -0,405 0,214 -1,891 0,059 0,667 0,438 1,015 0,0409237 CD68:membrana
plasmática 0,05
relación NFKB 0,690 0,354 1,950 0 051 1,994 0,997 3,989 0,0410493 membrana: núcleo
CD680,5
relación citoplasma 0,130 0,067 1,921 0 055 1,138 0,997 1,299 0,0427105 HIF1alfa: membrana
plasmática CD1a 0,01
intensidad media -0,033 0,018 -1,853 0 064 0,967 0,934 1,002 0,0439938 núcleos AMACR 0,5
relación citoplasma 0,237 0,126 1,891 0 059 1,268 0,991 1,622 0,0452599 CD1a:membrana
plasmática 0,01
relación citoplasma -0,189 0,103 -1,828 0067 0,828 0,676 1,014 0,0457721 NFKB:CD68
membrana plasmática
0,05
intensidad media -0,082 0,045 -1,842 0 065 0,921 0,844 1,005 0,0459226 celular AMACR 0,05
intensidad media -0,019 0,010 -1,769 0 077 0,982 0,962 1,002 0,0459685 citoplasma CD1a 0,95
relación citoplasma -0,921 0,491 -1 ,874 0061 0,398 0,152 1,043 0,0459773 CD68:membrana
plasmática 0,01
intensidad media 0,010 0,007 1,594 0111 1,010 0,998 1,024 0,0484793 núcleos CD680,99
relación plasma p16: -0,128 0,068 -1,872 0 061 0,880 0,770 1,006 0,0488473 núcleo p530,99
intensidad media -0,006 0,004 -1,818 0 069 0,994 0,987 1,001 0,0495530 núcleos P160,99
intensidad media -0,035 0,019 -1 ,803 0 071 0,966 0,930 1,003 0,0498546 celular AMACR 0,5
relación citoplasma -1,498 0,847 -1,767 0077 0,224 0,042 1,177 0,0505213 NFKB: membrana
plasmática 0,01
relación citoplasma -0,014 0,008 -1,800 0072 0,986 0,972 1,001 0,0535724 NFKB: membrana
plasmática 0,95
intensidad media -0,012 0,007 -1,720 0 085 0,988 0,975 1,002 0,0540265 celular CD1a 0,99
relación membrana -1,618 0,892 -1,814 0070 0,198 0,034 1,140 0,0543659 nuclear Ki67: núcleo
0,95
relación membrana 0,249 0,138 1,803 0071 1,283 0,979 1,681 0,0557799 plasmática betacatenina: núcleo CK20
0,95
intensidad media -0,024 0,013 -1,800 0 072 0,976 0,951 1,002 0,0587989 celular HIF1alfa 0,5
Tabla 6. Clasificación univariada de características por valores de P de regresión logística del esófago de Barrett sin displasia y casos atípicos reactivos de esófago de Barrett frente a bajo grado de displasia de esófago de Barret y casos de displasia de alto grado de esófago de Barrett.
Característica valor p Área de núcleos 0,000242 Área de núcleos 0,000261 Diámetro equivalente de núcleos 0,000302 Diámetro equivalente de núcleos 0,000353 Intensidad media de las células Hoechst 0,000436 Área del núcleo 0,000736 relación de citoplasma HIF1 alfa: membrana 0,001293 Intensidad media de las células Hoechst 0,001588 Intensidad de la cantidad de células Hoechst 0,001975 Intensidad media de los núcleos de Hoechst 0,002379 intensidad de citoplasma p53: membrana nuclear 0,002448 intensidad de citoplasma HIF1alfa: membrana plasmática CD45RO 0,002557 Intensidad media de las células Hoechst 0,002619 Diámetro equivalente de núcleos 0,002762 Área de núcleos 0,003403 Relación de citoplasma p16:membrana plasmática 0,003594 Intensidad del cuantil de células Hoechst 0,003991 Área de los núcleos 0,00409 Intensidad media de los núcleos de Hoechst 0,004273 relación de citoplasma AMACR: membrana nuclear p53 0,004531 diámetro equivalente de núcleo 0,004562 Intensidad cuantil de células Hoechst 0,005236 relación de citoplasma CD45RO: membrana plasmática 0,005248 relación de membrana plasmática CK-20: núcleos CDX-2 0,006393 relación de membrana nuclear de CDX-2: núcleos 0,006651 intensidad cuantil de núcleos de Hoechst 0,006928 intensidad cuantil de núcleos de Hoechst 0,008597 diámetro equivalente de núcleo 0,0092 Intensidad media de los núcleos de Hoechst 0,009652 Intensidad media del citoplasma AMACR 0,00988 relación de citoplasma CDX-2: membrana plasmática HER2 0,009952 Intensidad media de células AMACR 0,01121 Intensidad media de las células CDX-2 0,011466
Intensidad media nuclear de AMACR 0,013133 intensidad cuantil de núcleos de Hoechst 0,014573 intensidad media CDX-2 citoplasma 0,016699 relación membrana plasmática HER2: nuclear CK-20 0,017772 Solidez de núcleos 0,018268 Solidez de núcleos 0,018759 Relación de citoplasma: membrana plasmática CD1a 0,019828 relación citoplasma HER2: membrana plasmática CK-20 0,020837 relación de citoplasma HER2: membrana plasmática 0,021122 intensidad cuantil de células p53 0,023041 intensidad cuantil de núcleos p53 0,023621 intensidad media de núcleos HER2 0,024433 relación de citoplasma p16: membrana AMACR 0,024943 intensidad media celular p53 0,025204 intensidad media nuclear CDX-2 0,025682 Intensidad media del citoplasma HER2 0,025711 relación de citoplasma CD45RO: membrana plasmática CD1a 0,026059 relación de citoplasma CK-20: membrana plasmática 0,026579 relación de citoplasma: membrana plasmática COX-2 0,027833 intensidad cuantil de células CDX-2 0,028296 relación de citoplasma p53: membrana pl6 0,028584 intensidad cuantil de núcleos HER2 0,028831 intensidad media de núcleos p53 0,029849 Intensidad media de las células HER2 0,030829 Intensidad media del citoplasma p53 0,031419 intensidad cuantil de núcleos CDX-2 0,032277 intensidad cuantil de núcleos AMACR 0,034435 intensidad cuantil de células HER2 0,040346 relación de membrana nuclear p53: nuclear p16 0,042366 relación de membrana plasmática p16: intensidad núcleo 0,043742 relación de citoplasma NF-KB: membrana plasmática COX-2 0,044321 relación de citoplasma NF-KB: núcleo COX-2 0,045511 relación de citoplasma AMACR: membrana 0,046059 Intensidad media de células Hoechst 0,048906 Intensidad media de células HIF1 alfa 0,050217 intensidad media de citoplasma HIF1 alfa 0,051545 Intensidad media de las células CD45RO 0,05373 Excentricidad de los núcleos 0,058986 Tabla 7 Características significativas del biomarcador diagnósticas y pronósticas y localizaciones subcelulares
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar el riesgo de progresión del esófago de Barrett en un sujeto, que comprende:
a) detectar un subconjunto de biomarcadores en una muestra del sujeto, en donde dos o más biomarcadores en dicho subconjunto se seleccionan del grupo que consiste en p53, HIF-1alfa, beta-catenina y COX-2; y
b) determinar al menos una o más características descriptivas asociadas con cada uno de dichos dos o más biomarcadores, en donde las características descriptivas se seleccionan de:
percentil 1, 5, 95, 99 de la intensidad media de p53 en células; percentil 95, 99 de la intensidad media de p53 en ácidos nucleicos; percentil 95, 99 de la intensidad media del p53 en citoplasma; percentil 1 de la relación entre citoplasma:membrana nuclear de p53;
percentil 50, 99 de la intensidad media de HIF-1 alfa en ácidos nucleicos; percentil 99 de la intensidad media del HIF-1 alfa en citoplasma; percentil 50, 99 de la intensidad media de HIF-1 alfa en células; percentil 1 de la membrana de HIF-1 alfa; percentil 5 de la relación entre citoplasma:membrana plasmática de HIF-1 alfa;
percentil 1, 5 de la intensidad media de beta-catenina en células; percentil 1, 5 de la intensidad media de beta-catenina en ácidos nucleicos; percentil 1, 5 de la intensidad media de beta-catenina en citoplasma; percentil 5 de la relación entre célula:citoplasma de la beta-catenina;
percentil 50, 95, 99 de la relación membrana plasmática:núcleo de COX-2; percentil 50, 95, 99 de la relación membrana:núcleo de COX-2; percentil 1, 5, 50 de la relación citoplasma:membrana plasmática de COX-2; percentil 5 de la relación célula:citoplasma de COX-2;
y en donde la característica descriptiva y su presencia, ausencia, ubicación, relación o cantidad determina un valor numérico, en relación con un control, donde el valor numérico para cada característica descriptiva y su presencia, ausencia, ubicación, relación o cantidad se proporciona en la Tabla 4 o Tabla 5 como Efecto; combinando los valores numéricos determinados de cada uno de los dos o más biomarcadores seleccionados a través de una función de interpretación o algoritmo para determinar una puntuación de riesgo que se correlaciona con el riesgo de progresión del esófago de Barrett en el sujeto, en donde la puntuación de riesgo es una puntuación de 1-100, donde 1 indica el menor riesgo de progresión y 100 indica el mayor riesgo de progresión del esófago de Barrett en el sujeto.
2. El método de la reivindicación 1, que además detecta al menos uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en AMACR, CD1a, CD45RO, CD68, CK-20, Ki-67, NF-kB y p16, en donde las características descriptivas se seleccionan de:
percentil 99 de la proporción de células:núcleos plasmáticos de AMACR; percentil 50 de la relación membrana AMACR:P16 núcleo; percentil 50 de la relación membrana:núcleo AMACR; percentil 1,5, 50 de intensidad media de las células AMACR; percentil 1 y 5 de la relación de citoplasma AMACR:membrana plasmática p16; percentil 5, 50 y 99 de intensidad media de núcleos de AMACR; percentil 1 de la relación de citoplasma:membrana plasmática de AMACR;
percentil 1, 5, 50, 95, 99 de intensidad media celular CD1a; percentil 1, 5, 50, 95 de intensidad media citoplasmática CD1a; percentil 1, 5, 50, 95, 99 de intensidad media de los núcleos CD1a; percentil 1 y 5 de citoplasma CD1a:membrana CD45RO; percentil 1 de relación de citoplasma CD1a:membrana plasmática;
percentil 1 de relación citoplasma CD45RO: membrana Half1alfa; percentil 99 de relación de membrana CD45RO: núcleo HIF1alfa; percentil 5 de relación citoplasma CD45RO: membrana plasmática HIF1alfa;
percentil 99 de intensidad media en núcleos de CD68; 0,99 de intensidad media en citoplasma de CD68; percentil 99 de intensidad media celular de CD68; percentil 1 y 5 de relación de citoplasma CD68: membrana; percentil 50 y 5 de relación de citoplasma CD68: membrana plasmática COX2; percentil 1 y 5 de relación de citoplasma y membrana plasmática de CD68;
percentil 99 y 1 de relación de citoplasma CK20: membrana nuclear Ki67; percentil 99 y 95 de relación de membrana plasmática CK20: núcleo Ki67; percentil 95 de relación de citoplasma CK20: membrana nuclear Ki67; percentil 99 de intensidad media de Ki-67 en núcleos; percentil 50 de relación de membrana nuclear Ki-67: núcleos de beta-catenina; percentil 50 y 99 de relación de membrana nuclear Ki-67: núcleo total; percentil 1 de relación de citoplasma Ki-67: membrana nuclear; percentil 95 de relación de membrana nuclear Ki67: núcleo;
percentil 1 y 5 de relación de citoplasma NF-kB: membrana CD68; percentil 1 y 5 de relación de citoplasma NF-kB: membrana plasmática CD68; percentil 1, 50 y 95 de relación de citoplasma NF-kB: membrana plasmática; percentil 5 de relación de citoplasma NF-kB: membrana; percentil 50 de relación de membrana NF-kB: núcleo CD68; y percentil 1, 5 y 50 de intensidad media de p16 en células; percentil 5 de relación de citoplasma p16: membrana; percentil 1 y 5 de relación de citoplasma p16: membrana plasmática; percentil 95 de relación de membrana plasmática p16: núcleo; percentil 5, 50 y 99 de intensidad media de p16 en núcleos; percentil 95 de membrana plasmática p16: p53 en núcleo; percentil 50 de intensidad media de p16 en células; percentil 50 de intensidad media de p16 en citoplasma; percentil 1 de relación de p16 en citoplasma: p53 en membrana nuclear; percentil 50 de relación de p16 en membrana plasmática: núcleo; percentil 50 de relación de p16 en membrana plasmática: p53 en núcleo; percentil 99 de relación de p16 en plasma: p53 en núcleo.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el sujeto tiene un mayor riesgo de progresión a displasia de bajo grado, displasia de alto grado o cáncer de esófago.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el sujeto se diagnostica sin displasia, atipia reactiva, indefinida para la displasia, displasia de bajo grado o displasia de alto grado.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además detectar el subconjunto de biomarcadores utilizando sondas que se unen específicamente a cada uno de dichos biomarcadores.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende determinar al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o 60 características descriptivas de la tabla 4.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende determinar al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80 u 89 características descriptivas de la tabla 5.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra comprende un raspado, biopsia o resección quirúrgica de células y/o tejido del sujeto.
9. El método de la reivindicación 1, en donde (a) las características descriptivas se identifican en compartimentos subcelulares y/o de tejido; o (b) la muestra está a temperatura ambiente o congelada; opcionalmente, en donde la muestra se obtiene recientemente, se fija con formalina, se fija con alcohol o se incrusta en parafina.
10. El método de la reivindicación 5, en donde las sondas son fluorescentes y/o comprenden un marcador fluorescente, preferiblemente en donde cada sonda está marcada con un fluoróforo diferente.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el subconjunto de biomarcadores comprende al menos 3 biomarcadores y en donde los 3 biomarcadores son un biomarcador epitelial, un biomarcador inmune y/o un biomarcador estromal; opcionalmente detectando además un biomarcador de células madre.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde (a) la detección de 2 biomarcadores o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 8 o más, o 12 o más se determina simultáneamente.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el sujeto es un ser humano.
14. El uso de un kit en un método de la reivindicación 1 para determinar el riesgo de progresión del esófago de Barrett en un sujeto, comprendiendo el kit:
a) una o más sondas que sean capaces de detectar al menos dos o más biomarcadores del grupo que consiste en p53, HIF-1alfa, beta-catenina y COX-2; y
b) instrucciones para usar las sondas para determinar una o más características descriptivas para generar una puntuación de riesgo a partir de una muestra de células y/o tejido de un sujeto.
15. El uso del kit de la reivindicación 14, en donde el puntaje es predictivo del resultado clínico del esófago de Barrett en el sujeto y/o diagnóstico de la subclase del esófago de Barrett en el sujeto; y/o en el que las sondas comprenden sondas de anticuerpos que se unen específicamente a dichos biomarcadores; y/o en el que las sondas son fluorescentes y/o comprenden una marcador fluorescente; y/o en donde al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, o 89 características descriptivas son de la tabla 4 o la tabla 5.
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