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JP2002541458A - 細胞ベースのスクリーニングのための小型化細胞アレイ製法および装置 - Google Patents

細胞ベースのスクリーニングのための小型化細胞アレイ製法および装置

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JP2002541458A
JP2002541458A JP2000609795A JP2000609795A JP2002541458A JP 2002541458 A JP2002541458 A JP 2002541458A JP 2000609795 A JP2000609795 A JP 2000609795A JP 2000609795 A JP2000609795 A JP 2000609795A JP 2002541458 A JP2002541458 A JP 2002541458A
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JP
Japan
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cell
substrate
cells
array
well
Prior art date
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Application number
JP2000609795A
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English (en)
Inventor
ラヴィ カプール、
テリー アダムス、
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cellomics Inc
Original Assignee
Cellomics Inc
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Filing date
Publication date
Application filed by Cellomics Inc filed Critical Cellomics Inc
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Abstract

(57)【要約】 本発明は選択的細胞パターニングのための基材の新規な製法、および基材それ自体を記載し、ここに、製法は基材の表面の反応性ヒドロキシル基をヒドロキシル−反応性二官能性分子と接触させて単層を形成させ、ステンシルを用いて、細胞培養基材上の制御された位置に細胞反発性または細胞接着性部位を沈積させる。また、組織特異的および器官−特異的細胞基材を作成するために幹細胞を選択的に分化させることを含む製法ならびに細胞基材それ自体も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、細胞ベースの高スループットおよび生物学的高含有量スクリーニン
グのための方法および装置に関する。
【０００２】 （背景技術） 本出願は、１９９９年４月１日に出願された米国仮特許出願第６０／１２７，
３３９および１９９９年６月７日に出願された第６０／１３８，１１９号への優
先権を請求し、１９９７年５月２９日に出願された米国特許出願第０８／８６５
，３４１号の一部継続出願である、１９９９年９月２２日に出願された米国特許
出願第０９／４０１，２１２の一部継続出願であり、１９９９年１２月２１日に
出願された米国特許出願第０９／４６８，６７３と関連する。
【０００３】 候補化合物を創製するための薬物発見およびコンビナトリアル・ケミストリー
の拡大する競争において、動物およびヒトに対するその生理学的インパクトのた
めに、高スループットスクリーニングを介して、非常に多数の物質を迅速にスク
リーニングできるのは非常に有用であろう。動物に対する「部分的に資格のある
」薬物候補の効果をテストする前に、薬物はまず生きた細胞でその生物学的活性
および潜在的毒性につきスクリーニングし得る。薬物候補に対する生物学的応答
がこれらの細胞スクリーニングの結果から予測し得る。
【０００４】 伝統的には、「リード化合物」は、時間を消費し、かつコストがかかる広範な
動物実験に迅速に移されてきた。さらに、動物における広範な薬物テストは分化
的により許容されなくなってきた。動物実験に先立っての生きた細胞でのそれら
の相互作用にしたがって薬物候補をスクリーニングするのは、動物試験に行く前
にいくつかの薬物候補を除去することによって引き続いての薬物スクリーニング
プロセスで必要な動物の数を減少させることができる。しかしながら、現行方法
を用いる薬物−細胞相互作用の操作および分析は、所与の時間で分析できる少数
の細胞および化合物、化合物送達に要する面倒な方法、および非常に大きな容量
のテストに必要な化合物のため、高スループットおよび高生物学的含有量スクリ
ーニング双方を可能としない。
【０００５】 核酸およびポリペプチドの高スループットスクリーニングはＤＮＡチップ技術
を用いて達成されてきた。典型的なＤＮＡ分析方法においては、１０ないし１４
塩基対のＤＮＡ配列が、小さなガラスプレート上に数が数万までの規定された位
置（またはスポット）に付着される（ここに引用して一体化される米国特許第５
，５５６，７５２号）。これは所与のガラスプレート上にＤＮＡのスポットのア
レイを作る。アレイにおけるスポットの位置は、ＤＮＡの各スポットに対して後
の参照用のアドレスを備える。ＤＮＡ配列が、蛍光分子で標識された相補的ＤＮ
Ａ配列とハイブリダイズされる。アレイ上の各アドレスからのシグナルは、ハイ
ブリダイズする核酸配列に付着した蛍光分子が光の存在下で蛍光を発すると検出
される。これらの装置は、薬物発見の努力およびヒトゲノム配列決定プロジェク
トでＤＮＡ配列の高スループットスクリーニングを備えるのに使用されてきた。
同様に、種々のアミノ酸長さの蛋白質配列がガラスプレート上のアレイとして区
別されるスポットに付着されてきた（引用して一体化させる米国特許第５，１４
３，８５４号）。
【０００６】 ガラスプレートに結合した核酸またはアミノ酸いずれかのアレイによって提供
された情報はそれらの基礎となる「言語」にしたがって制限される。例えば、Ｄ
ＮＡ配列は４つの核酸のみの言語を有し、蛋白質は約２０アミノ酸の言語を有す
る。対照的に、生物学的成分の複雑な組織化を含む生きた細胞は、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、細胞表面蛋白質、分子内蛋白質等のような種々の物質との潜在的相互作用の
同程度の大きさを持つ膨大な「言語」を有する。薬物作用についての典型的な標
的は体細胞であり、細胞内のものであるので、細胞それ自体は、感受性検出試薬
と組み合わせた場合に薬物発見における極端に有用なスクリーニングツールを提
供する。このように、高スループット、高含有量スクリーニング装置を有して、
細胞および細胞下レベルの高含有量空間的情報ならびに生理学的、生化学的およ
び分子活性の変化についての時間的情報を提供するのは最も有用であろう。
【０００７】 細胞のミクロアレイ 他の適用のための通常の基板上で単一細胞タイプのミクロアレイを作成するた
めの種々の方法が提案されてきた。かかる方法の１つの実施例は、光化学レジス
ト−フォトリソグラフィであり（ムルクシッヒ（Mrksich）およびホワイトサイ
ズ（Whitesides）,アン.レブ.バイオフィズ.バイオモル.ストラクト.(Ann.Rev.B
iophys.Biomol.Struct.)25:55-78,1996）、ここに、ガラスプレートが均一にフ
ォトレジストでコートされ、フォトマスクがフォトレジスト上に置かれて所望の
「アレイ」またはパターンを規定する。光への露出に際して、マスク解除された
領域におけるフォトレジストが取り出される。フォトリソグラフィにより規定さ
れた全表面は、露出されたガラスおよびフォトレジストで被覆された領域双方と
結合するオルガノシランのような疎水性物質で均一にコートされる。そして、ガ
ラスプレートを末端親水性基またはアミノ基のような化学的に反応性の基を有す
るオルガノシランで洗浄する。親水性オルガノシランは露出したガラスに結合し
、得られたガラスプレートは疎水性表面を横切って（元のフォトレジストの領域
に位置する）親水性または容器スポットのアレイを有する。親水性基のスポット
のアレイは、ニューロン起源のものを含めたある種の細胞の非特異的かつ非共有
の結合のための基板を提供する。
【０００８】 特異的であるが非共有結合的相互作用に基づいた別の方法において、スタンピ
ングを用いて、蛋白質吸着性アルカンチオールでコートされた金表面を生じさせ
る（米国特許第５，７７６，７４８号；シングビ（Singhvi）ら,サイエンス（Sc
ience） 264:696-698,1994）。次いで、裸の金表面を、蛋白質吸着に抵抗するポ
リエチレングリコール−末端アルカンチオールでコートする。ラミニン（細胞内
マトリクス中に見出される細胞−結合蛋白質）に対する全表面の露出の後、生き
た肝細胞はラミニンがコートされた島に均一に結合し、その上で増殖する（シン
グビ（Singhvi）ら，1994）。強力であるが非共有結合の金属キレート化を含む
技巧が、特異的蛋白質のパターンで金表面をコートするのに使用されてきた（シ
ガル（Sigal）ら，アナル.ケム（Anal.Chem.）68:490-497,1996）。この場合、
金表面はニトロ酢酸で末端化されたアルカンチオールでパターン化される。金の
裸の領域はトリ（エチレングリコール）でコートされて蛋白質吸着を減じる。Ｎ
ｉ２＋を添加した後、５つのヒスチジン標識蛋白質の特異的吸着が動的に安定で
あることが判明した。
【０００９】 パターン化基板上の反応可能な部位に蛋白質のような特異的分子を化学的に架
橋することによってより特異的な単一細胞タイプ結合を達成することができる（
アプリン（Aplin）およびフュグヘス（Hughes）,アナリスト.バイオケム（Analy
t.Biochem.）113:144-148,1981）。基板パターン化の別の技巧は、所望により、
反応可能なスポットのアレイを生じさせる。ガラスプレートを、ガラスに化学収
着してガラスをコートするオルガノシランで洗浄する。オルガノシランコーティ
ングは、アレイのパターンを規定する光学マスクを介して深紫外光によって照射
される。照射はＳｉ−Ｃ結合を切断して、反応性Ｓｉラジカルを形成させる。水
との反応はＳｉラジカルが極性シラノール基を形成するようにする。極性シラノ
ール基はアレイ上にスポットを構成し、さらに、ここに引用して一体化させる米
国特許第５，３２４，５９１号に開示されているように、修飾されて他の反応性
分子をスポットにカップリングさせる。例えば、遊離アミノ基のような生物学的
官能基を含有するシランはシラノール基と反応できる。遊離アミノ基を、蛋白質
、核酸、炭水化物および脂質のような生体分子のための共有結合の部位として用
いることができる。細胞の表面と相互作用するこど知られているレクチンの、反
応性アミノ基を介するガラス基板への非パターン化共有結合が示されている（ア
プリン（Aplin）およびフュグヘス（Hughes）,1981）。支持体上での単一細胞タ
イプのミクロアレイを形成するための光学方法はより少ない工程を要し、フォト
レジスト方法よりも速いが（すなわち、２工程のみ）、高価な光源からの高強度
紫外線の使用を要する。
【００１０】 これらの方法の全てにおいて、結果は単一細胞タイプのミクロアレイとなる。
なぜなら、生化学的に特異的な分子は微細パターン化化学アレイに均一に結合す
るからである。フォトレジスト方法において、細胞は接着によって遊離アミノ基
のスポット、および／または、順にセルに結合するスポットに付着する特異的な
分子のアレイに結合する。細胞は、同様にしてアレイの全てのスポットに結合す
る。光学方法において、細胞は遊離アミノ基のスポットのアレイに結合する。遊
離アミノ基のスポットの間にほとんどまたは全く差異はない。再度、細胞は同様
にして全てのスポットに接着し、このように、これらの細胞につき単一タイプの
細胞の相互作用のみ実験できる。なぜならば、アレイ上の各スポットは実質的に
相互に同一だからである。そのような細胞アレイは、単一試料における特別の種
々の細胞または特別の種々の細胞相互作用を研究するためのツールとしてその利
用性に柔軟性がない。このように、同時に分析できる細胞タイプおよび特異的細
胞相互作用の数を増加させるための、共通の基板上の多数の細胞タイプのアレイ
、ならびに細胞の高スループットおよび高生物学的含有量スクリーニングを備え
るための、共通の基板上の多数の細胞タイプのこれらのマイクロアレイを生産す
る方法に対する要望が存在する。
【００１１】 細胞生物学の光学的読み取り 数千もの化合物について高スループットスクリーニングを行うことは、多くの
化合物およびアッセイ化合物試薬の並行した取り扱いおよび処理を要する。標準
的な高スループットスクリーニングは、９６または３８４ウェルを持つ標準的な
マイクロプレート中のウェルのアレイに負荷された、いくつかのインジケータ化
合物と共に化合物および生物学的試薬の均一な混合物を使用する（カール（Kahl
）ら，ジェ.バイオモル.エスシーアール（J.Biomol.Scr.）2:33-40,1997）。各
ウェルから測定されたシグナル（蛍光発光、光学密度、または放射能のいずれか
）は、ウェル中の全ての物質からのシグナルを積分し、ウェルにおける全ての分
子の総じての集団平均を与える。このタイプのアッセイは共通して均一アッセイ
と言う。
【００１２】 米国特許第５，５８１，４８７号は９６ウェルプレートの全領域を像形成する
ためのＣＣＤディテクタ（電荷結合光検出器）を用いるイメージングプレートリ
ーダーを記載する。該像を分析して均一アッセイにつきウェルあたりの全蛍光を
計算する。
【００１３】 ショエダー（Schoeder）およびニーグル（Neagle）は、細胞単層を像形成した
場合に標準的な９６ウェルプレート中のウェルの底部のほぼ２００ミクロン内で
蛍光を選択的に励起してバックグラウンドを減少させるための低角度レーザー走
査照射およびマスクを記載する（ジェ.バイオモル.エスシーアール（J.Biomol.S
cr.）1:75-80,1996）。このシステムはＣＣＤカメラを用いて、プレート底部の
全領域を像形成する。このシステムはウェルの底部の細胞単層に由来するシグナ
ルを測定するが、測定されたシグナルはウェルの領域にわたって平均され、した
がって、依然として均一測定とみなされる。なぜなら、それは細胞の集団の平均
応答だからである。該像を分析して、細胞ベースの均一アッセイにつきウェルあ
たりの全蛍光を計算する。
【００１４】 プロフィット（Proffitt）ら（サイトメトリ（Cytometry）24:204-213,1996）
は、そのままで相対的細胞数を定量するためのシステムを有する半自動蛍光デジ
タルイメージングを記載し、ここに、細胞はフルオレセインジアセテート（ＦＤ
Ａ）で予備処理されている。システムは種々の組織培養プレート、特に９６−ウ
ェルマイクロプレートを利用する。システムは電動ステージ、ビデオカメラ、イ
メージ増倍管、およびＰＣ−ビィジョンデジタイザを持つマイクロコンピュータ
を備えた落射蛍光倒立型顕微鏡よりなる。ターボ・パスカル（Turbo Pascal）ソ
フトウェアはステージを制御し、プレートを走査し、ウェルあたり多数の像を取
る。ソフトウェアはウェルあたりの全蛍光を計算し、日常キャリブレーションを
備え、種々の組織培養プレート形式を配置する。デジタル像の閾値設定および生
きた細胞によってのみ摂取された場合に蛍光を発する試薬の使用を用いて、過剰
の蛍光試薬を除去することなくバックグラウンド蛍光を低下させる。
【００１５】 顕微鏡で蛍光細胞を像形成し、これらの細胞において起こる空間的分布および
時間的変化についての正確な情報を抽出するために種々の方法が開発されてきた
。最近の論文は多くのこれらの方法およびそれらの適用を記載する（テイラー（
Taylor）ら,アン.サイエンティスト（Am.Scientist）80:322-335,1992）。これ
らの方法は、細胞における蛍光レポータ分子の分布、量および生化学的環境の高
い空間的および時間的分解能での少数の検体の調製のために設計され最適化され
てきた。
【００１６】 色素および蛍光試薬での細胞の処理、細胞のイメージング、および修飾された
緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のような蛍光レポータ分子を生じさせるための細胞の
作成は有用な方法である（ワング（Wang）ら，イン メソッズ イン セル バ
イオロジー（In Methods in Cell Biology），ニューヨーク州，アラン Ｒ.リス
(Alan R.Liss),29:1-12,1989）。クラゲ（Aequorea victoria）の緑色蛍光蛋白
質（ＧＦＰ）は３９５ｎｍの励起最大、５１０ｎｍの発光最大を有し、外因因子
を要しない。遺伝子発現および蛋白質の位置決定の研究のためのＧＦＰの使用は
チャルフィー（Chalfie）ら，サイエンス（Science） 263:802-805,1994に議論
されている。野生型ＧＦＰのいくつかの特性がモリス（Morise）ら（バイオケミ
ストリー（Biochemistry） 13:2656-2662,1974）およびワード（Ward）ら（フォ
トケム.フォトバイオル（Photochem.Photobiol）.31:611-615,1980）に開示され
ている。リズロ（Rizzulo）ら（ネイチャー（Nature） 358:325-327,1992）によ
る論文は細胞中の細胞下小器官を可視化するためのツールとしての野生型ＧＦＰ
の使用を議論している。ケーター（Kaether）およびゲルデ（Gerdes）（FEBSレ
ターズ（FEBS Letters）369:267-271,1995）は、野生型ＧＦＰを用いる分泌経路
に沿っての蛋白質輸送の可視化を報告している。植物細胞におけるＧＦＰの発現
はフー（Hu）およびチェン（Cheng）（FEBSレターズ（FEBS Letters）369:331-3
34,1995）に議論され、他方、ショウジョウバエ胚におけるＧＦＰ発現はデービ
ス（Davis）ら（デブ. バイオロジー（Dev.Biology）170:767-729,1995）によっ
て記載されている。ここに引用して一体化させる米国特許第５，４９１，０８４
号は、注目する別の蛋白質に融合したレポータ分子としての細胞中のクラゲ（Ae
quorea victoria）からのＧＦＰの発現を開示している。ＧＦＰの突然変異体が
調製され、これはいくつかの生物学的系で使用されている（ハセルホフ（Hassel
hoff）ら，プロク.ナショナル.アカド.サイ.（Proc.Natl.Acad.Sci.）94:2122-2
127,1997;ブレジュク（Brejc）ら,プロク. ナショナル. アカド. サイ.（Proc.N
atl.Acad.Sci.）94:2306-2311,1997;チェング（Cheng）ら，ネーチャー バイオ
テク（Nature Biotech）,14:606-609,1996;ヘイム（Heim）およびツーエン（Tsi
en）,カル.バイオル.(Curr.Biol.)6:178-192,1996;エーリグ（Ehrig）ら，FEBS
レターズ（FEBS Letters）367:163-166,1995）。
【００１７】 セロミクス（株）（Cellomics,Inc.）によって開発されたアレイスキャン（AR
RAYSCANTM）システム（ここに引用して共にその全体を一体化させる、米国特許
第５，９８９，８３５号および１９９８年２月２７日に出願された米国特許出願
第０９／０３１，２７１号）は、特異的生物学的活性につき非常に多数の化合物
をスクリーニングする目的で、細胞中の蛍光標識レポータ分子の分布、環境、ま
たは活性を測定するための光学系である。アレイスキャンシステムは位置アレイ
に蛍光レポータ分子を含有する細胞を備え、各位置において多数の細胞を走査し
、光学情報をデジタルデータに変換し、デジタルデータを利用して細胞中の蛍光
標識レポータ分子の分布、環境または活性を測定することを含む。アレイスキャ
ンシステムはデータを処理し、表示し、そして保存し、このように、高含有量細
胞ベースのスクリーニングを提供することによって薬物発見を増加させるための
装置およびコンピュータ化された方法、ならびに大きなマイクロプレート形式で
の、組み合わされた高スループットおよび高含有量細胞ベーススクリーニングを
含む。
【００１８】 ミクロ流体 細胞基板に付着された細胞のアレイへの溶液の効果的な送達はミクロ流体シス
テムによって促進される。インク送達のための小さな液体試料の正確な取り扱い
（米国特許第５，２３３，３６９号；米国特許第５，４８６，８５５号；米国特
許第５，５０２，４６７号）、生体試料吸引（米国特許第４，９８２，７３９号
）、試薬の保存および送達（米国特許第５，０３１，７９７号）、および臨床診
断および化学合成のための分配されたマイクロ電子および流体装置アレイ（米国
特許第５，５８５，０６９号）のための方法および装置が記載されている。加え
て、表面に沿っての小さな液体試料を検出するのに使用できる固体基板中でのマ
イクロチャンネルの形成のための方法および装置が記載されている（米国特許第
５，５７１，４１０号；米国特許第５，５００，０７１号；米国特許第４，３４
４，８１６号）。
【００１９】 特に、生きた細胞イメージングのための積分高スループットおよび高含有量細
胞ベーススクリーニングの目的では、最適ミクロ流体装置は最も近い可能なウェ
ル間隔（すなわち、最高の可能なウェル密度）を可能とする流体構築体を含むで
あろう。ここに、流体構築体は細胞アレイ基板と一体化されて、細胞への有効な
流体送達を可能とし、ウェル中へのおよびウェルからのピペッティング流体に対
する必要性を除去する。そのような最適ミクロ流体装置は、ミリメートル下のウ
ェル内部距離にての細胞アレイで有利であろう。なぜなら、もし不可能でないの
であれば、そのような高度な空間的分解能および精度をもって流体をピペッティ
ングするのは実用的だからである。さらに、かかる一体化された装置は、細胞を
像形成するために流体構築体から細胞基板を除去する必要性なしに細胞ベースの
スクリーニングで直接使用し得る。
【００２０】 細胞ベースのスクリーニングのための最適ミクロ流体装置は、さらに、細胞の
環境制御を可能とする閉じたチャンバーを含み、好ましくは、基板上の細胞の生
理学に影響し得る電子力学的力に細胞を直接露出しないであろう。例えば、電子
流体力学ポンピングは極性溶媒では効率が低い（マーク マドウ（Marc Madou）
,ファンダメンタルズ オブ ミクロファブリケーション CRCプレス ボカ ラー
トン（Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, Boca Raton）,1997,４
３３頁）。電子−浸透圧は、典型的には、蛋白質のような荷電成分のある程度の
電気泳動分離が伴う。
【００２１】 米国特許第５，６０３，３５１号（「該３５１特許」）は、２つのチォンネル
付きの上方レベルおよび反応ウェル付きの底部レベルよりなるマルチレベルデザ
インを使用するミクロ流体装置を記載する。しかしながら、この装置は細胞ベー
スのスクリーニングで使用されるために設計されたのではない。「３５１特許」
は、細胞を含有する基板または細胞係合部位を開示しない。開示されたミクロ流
体ネットワークは、ウェル上で培養される生きた細胞が系列形式で２以上の異な
る流体で露出されるようにする最適細胞スクリーニングミクロ流体システムとは
反対に、２以上の試薬が反応ウェル中で組み合わされることを可能とするように
設計されている。「３５１」特許は、５０ウェル／インチ２の最適ウェル密度で
基板にエッチングされたウェルを持つ装置を開示する。さらに、基板はインキュ
ベーションおよび／または分析のために流体アレイから脱着されなければならな
い。最後に、「３５１」特許は、細胞培養で使用される水性媒体では効率が低い
ウェルのマトリクス内での電気的に制御された電子流体力学値のシステムを開示
し、また、細胞のアレイにおいてウェル間で近い間隔の程度を限定することがで
きる。
【００２２】 米国特許第５，６５５，５６０号は、テフロン（登録商標）バルブによって直 交点で垂直に結合されたマイクロチャンネルの直交アレイを取り込む複数インプ ットおよび複数アウトプットを備えた流体分布システムを含む目詰まり無しのバ ルビングシステムを開示する。しかしながら、この特許は、細胞アレイを含有す る基板を開示しないし、基板と組み合わされた一体化流体装置を開示せず、また 細胞ベースのスクリーニングに最適であるウェル密度も開示しない。
【００２３】 米国特許第５，９００，１３０号（該「１３０」特許）は、相互結合された毛
細管構造での流体移動の活性で電気的な制御を記載する。この特許は、細胞結合
部位によって占めることができる細胞基板の面積を最大化する流体構築体を教示
しない。また、この特許は細胞アレイを含有する基板を開示せず、また基板と組
み合わされた一体化流体装置も開示しない。さらに、その特許は電場の装置への
適用による流体の流動の制御を教示するに過ぎない。
【００２４】 米国特許第５，９１０，２８７号は、８６４を超えるウェルを持つプレートに
限定された、細胞を含めた生物学的および生化学的試料の蛍光測定のためのマル
チウェルプラスチックプレートを記載する。この特許は細胞アレイ基板と一体化
された流体構築物を備えたミクロ流体装置を記載しない。また、その特許は基板
上の細胞の環境制御を可能とする閉じたチャンバーを開示しない。
【００２５】 このように、これらの先行ミクロ流体装置のいずれも、流体構築体が細胞アレ
イ基板と一体化されて細胞への効果的な流体送達を可能とし、ウェル中へのおよ
びウェルからのピペッティングの必要性を除去する、最も近い可能なウェル間隔
（すなわち、最高の可能なウェル密度）を可能とする流体構築物を提供しない。
さらに、ウェルのアレイを含む先行ミクロ流体装置は、細胞培養のために水性培
地にて使用すれば効率がより低いであろう、かつウェル密度を制限するウェルの
マトリクス内で電気的に制御された電子流体力学値を用いる。
【００２６】 セルアレイ、光学的細胞生理学の読み取り、およびミクロ流体技術における前
記進歩は、改良された高スループットおよび高含有量細胞ベーススクリーニング
に適用することができる支持技術を提供するものの、さらに、そのようなスクリ
ーニングに必要な時間の量を減少させる一体化装置および方法、さらに、高スル
ープットおよび高含有量細胞ベーススクリーニングを行う能力および相互に柔軟
かつ迅速にスイッチングする能力を改良する装置および方法に対する当該分野で
の要望が依然として存在する。特に、ウェル密度を最大化し、それにより、一度
に像形成することができるウェルの数を増加させ、このように、像の適切な分解
能を維持しつつスクリーニングのスループットを多いに増大させる装置および方
法が非常に有利であろう。
【００２７】 薬物発見産業は、すでに９６−および３８４−ウェルのマイクロプレートを使
用し、それは１５３６−ウェルプレートの使用に向けて変遷している。しかしな
がら、先行技術を用いるウェル密度のさらなる増加は、非常に小さな直径のウェ
ル中へのおよびそれから外への液体のピペッティングの大きな混乱性のためあり
そうにない。
【００２８】 （発明の開示） 本発明は、細胞ベースのスクリーニングを行うのに必要な時間の量を低下させ
、高スループットおよび高含有量細胞ベーススクリーニングを行う能力および相
互に柔軟かつ迅速にスイッチングする能力を特異的に組み合わせる装置および方
法に対する当該分野における要望を満足する。本発明は、依然として像において
適切な画素分解能を得つつ、一度に像形成できるウェルの数を最大化させるため
の装置および方法を提供する。この結果は、ウェル密度を最大化する流体構築物
の使用を介して達成された。本発明は、このように、流体交換、および個々の細
胞の空間的に分解された特徴をより迅速に検出するように接近した間隔であるウ
ェルを内部に供給した閉じた流体容量を備えた小型化マイクロプレートシステム
を提供する。
【００２９】 １つの形態において、本発明は、複数の細胞結合位置を含有する表面を有する
基板、複数の細胞結合位置に試薬を送達するための流体送達系、ここに、流体送
達系は基板と接合するマルチレベルチャンバーを含み、ここに、マルチレベルチ
ャンバーはミクロ流体インプットチャンネルおよびアウトプットチャンネルの直
交したアレイおよび該ミクロ流体インプットチャンネルおよびアウトプットチャ
ンネルと流体結合した複数の流体位置を含み、および複数のウェル、ここに、個
々のウェルは１つの細胞結合位置および１つの流体位置の接合によって規定され
たスペースを含み、ここに、ウェルは１ｃｍ２あたり少なくとも約２０ウェルの
密度で存在することを含むことを特徴とする細胞スクリーニング用のカセットを
提供する。
【００３０】 別の形態において、 ａ．複数の細胞結合位置を含有する表面を有する基板、 ｂ．試薬を複数の細胞結合位置に送達するための流体送達系、ここに、流体送
達系は基板と接合するマルチレベルチャンバーを含み、マルチレベルチャンバー
は、 i．ミクロ流体インプットチャンネルおよびアウトプットチャンネルの直交
アレイ、ここに、各ウェルは１以上のインプットチャンネルおよび１以上のアウ
トプットチャンネルと流体結合し、 ii．ミクロ流体インプットチャンネルおよびアウトプットチャンネルと流体
結合した複数の流体位置、 iii．ミクロ流体インプットチャンネルと流体結合した１以上のインプット
マニホールド、 iv．ミクロ流体アウトプットチャンネルと流体結合した１以上のアウトプッ
トマニホールド、 v．１以上のインプットマニホールドと流体結合した少なくとも１つの源容
器、 vi．１以上のアウトプットマニホールドと流体結合した少なくとも１つの廃
棄容器を含み、 ｃ．複数のウェル、ここに、個々のウェルは１つの細胞結合位置および１つの
流体位置の接合によって規定されたスペース を含むことを特徴とする細胞スクリーニング用のカセットを提供する。
【００３１】 好ましい実施形態において、前記カセットの双方は、さらに、ミクロ流体装置
内の流体流動を制御するためのポンプ、基板の温度コントローラおよび／または
酸素および二酸化炭素の分圧を調節するためのコントローラを含む。
【００３２】 別の形態において、本発明は、カセットにおける拡散制御のための改良された
方法を提供し、ここに、改良はカセットのミクロ流体チャンネル内に位置するバ
ルブに対して受動的な復元力を一定に適用することを含む。
【００３３】 なお、さらなる形態において、本発明は、 ａ）複数の細胞を含有する位置アレイを備え、 ｂ）光学系を備えて位置アレイの像を取得し、 ｃ）位置アレイのサブアレイを系列的に像形成し、 ｄ）サブアレイの各々からデータを並行して取得する を特徴とする細胞スクリーニングのための方法を提供する。
【００３４】 好ましい実施形態において、位置アレイは前記で開示したもののようなカセッ
トとして提供される。
【００３５】 さらなる態様において、本発明は、選択的細胞パターニング用の基材の製法
、および基材自体を提供し、ここに、その方法は基材の表面の反応性ヒドロキシ
ル基をヒドロキシル−反応性二官能性分子と接触させて単層を形成し、ステンシ
ルを用いて細胞反発性または細胞接着性部位を基材に沈積させることを含む。好
ましい実施形態において、ヒドロキシル−反応性二官能性分子はアミノシランで
あって、細胞反発性部位はトレシル−活性化ポリエチレングリコールを含む。
【００３６】 とりわけ他の使用の中で、本発明の装置および方法は高含有量および／または
高スループット細胞ベーススクリーニングで理想的である。また、本発明の装置
は手づかみの診断装置のための細胞支持体システムとして理想的に適する（すな
わち、小型化されたイメージング細胞ベースアッセイシステム）。本発明の装置
のより小さな形式およびシールされた封じ込めは厳格なポータブルシステムでの
その使用を可能とする。より高い密度のプレートの使用から大きな経済的利点が
ある。さらに、高密度プレートを用いた場合にサブアレイのより速いイメージン
グにおいて経済的利点があり、この利点はもし隣接ウェル間の距離が最小化され
なければ十分実現できない。本発明はこれらの利点の双方を提供する。
【００３７】 本明細書中で引用した全ての特許、特許出願および文献はここに引用してその
全体に組み込まれる。
【００３８】 本明細書中で用いられるように、用語「ウェル」はチャンバーの１つの流体位
置を基板上の１つの細胞結合位置と接合させることによって作成された容量スペ
ースと定義される。容量スペースは流体位置に対応するチャンバー上の凹所によ
って、細胞結合位置に対応する基板上の凹所によって、チャンバーおよび基板を
分離するスペーサ支持体（ここに、チャンバーの基板中の凹所について要件はな
い）、これらのいずれかの組合わせ、または流体位置および細胞結合位置の間に
容量スペースを生じさせるためのいずれかの他の方法によって生じさせることが
できる。
【００３９】 本明細書中で用いられるように、用語「細胞結合位置」とは、細胞に結合する
ことができる複数の細胞結合部位を含む基板上の区別される位置を言う。基板を
誘導体化して細胞結合部位を生じさせることができるか、あるいは細胞結合部位
は基板上に天然に存在し得る。個々の細胞結合位置内の複数の細胞結合部位は単
一細胞タイプのみに結合できるか、あるいは１を超える細胞タイプに結合するこ
とができる。同一基板上の異なる細胞結合位置は、結合できる細胞のタイプが同
一または異なっていてもよい。
【００４０】 本明細書中で用いられる用語「流体位置」とは、細胞結合位置への流体の送達
および／または位置からの除去の部位であるチャンバー上の区別される位置を言
う。流体位置はエッチングされたドメイン、一段高い容器、またはいずれかの他
のタイプの凹所のような凹所を含むことができる。別法として、流体位置はイン
プットおよび／またはアウトプットチャンネルの末端、またはインプットおよび
／またはアウトプットチャンネルと流体結合した通路の末端のように平坦であり
得る。
【００４１】 本明細書中で用いられるように、用語「カセット」とは、基板およびチャンバ
ーの組合わせを意味する。組合わせはいずれかのモジュールとすることができ（
１を超えるピース)、再使用可能なチャンバーおよび使い捨て基板を備え、また
はモジュールではなく（単一ピース）いずれかの潜在的ウェル内漏洩を制限する
。
【００４２】 本明細書中で用いるように、用語「オンボード」はカセットと一体化している
ことを意味する。
【００４３】 本明細書中で用いるように、用語「一体化された流体」とは、ミクロ流体装置
が細胞結合のための基板表面およびチャンバーを共に含むことを意味する。
【００４４】 本明細書中で用いるように、用語「チャンバー」は、ミクロ流体チャンネルお
よび流体位置を含む流体送達系を意味し、これは特殊化された基板カバーとして
働く。
【００４５】 本明細書中で用いるように、用語「スイッチ可能なポンプ」とは、限定される
ものではないが、シリンジポンプ、バルブ付きの圧力制御容器、または有害な電
場効果が細胞によって経験されないように、ウェルのアレイのマトリクスに関し
て（電気的遮蔽の所望の使用で）外部で使用される導電学ポンプを含めたポンプ
を言う。
【００４６】 本明細書中で用いるように、用語「サブアレイ」とは、典型的には、ＣＣＤ（
電荷結合デバイス検出器）のような、イメージングディテクタアレイの形状に対
応するフォーマットの、ウェルの全アレイ中のウェルのいずれかの隣接サブセク
ションを意味する。
【００４７】 本明細書中で用いるように、用語「細胞アレイのマトリクス」とは、カセット
のアレイにおけるウェルの全組のまわりに嵌合するであろう仮想的平行四面体に
よって規定されたスペースを意味する。 本明細書中で用いるように、用語「アッセイ成分」とは、限定されるものでは
ないが、試薬、細胞、テスト化合物、培地、抗体、蛍光およびレポータを含めた
細胞スクリーニングアッセイに添加されるであろういずれの成分も言う。
【００４８】 本明細書中で用いるように、用語「蛍光」とは、限定されるものではないが、
冷光、発光および化学発光を含めたいずれかのタイプの発光をも含む。
【００４９】 １つの形態において、本発明は、共通基板上の複数の細胞タイプのマイクロア
レイを作成する方法を教示する。本明細書中で定義されるように、複数の細胞タ
イプのマイクロアレイとは、支持体表面上の均一な単一のコーティングに分布せ
ず、むしろ基板上の各「細胞結合位置」または細胞結合位置の群がその細胞結合
選択性において極めて希であり得るように不均一形式である基板上の細胞のアレ
イを言う。
【００５０】 複数の細胞タイプのミクロアレイを作成する方法は、（細胞結合位置の化学修
飾されたアレイとも本明細書中で言う）微細パターン化アレイを調製し、アレイ
を不均一に化学修飾し、次いで、細胞を不均一化学アレイに結合させることを含
む。
【００５１】 好ましい実施形態において、微細パターン化アレイは、それを横切って親水性
スポットまたは「細胞結合位置」８が規則的な間隔で分散された疎水性表面を生
じるように処理された基板４を含む（図１Ａ−１Ｂ）。基板は通常の光学顕微鏡
カバーグラスのように、ガラス、プラスチックまたはシリコンウェーハであり得
るが、基板を提供するいずれの他の適当な材料から作成することもできる。先に
記載したように、用語「細胞結合位置」を用いて基板上の特異的スポットを記載
し、いずれの特定の深さも要しない。基板４の表面は好ましくは約２ｃｍ×３ｃ
ｍであるが、より大きくまたはより小さくすることもできる。好ましい実施形態
において、微細パターン化アレイの細胞結合位置８は、限定されるものではない
が、細胞に非特異的に結合できるか、あるいは細胞に特異的に結合する分子に結
合するようにさらに化学修飾することができるアミノヒドロキシル基、スルフヒ
ドリル基またはカルボキシル基のような反応可能な官能基を含有する。
【００５２】 化学修飾された細胞結合位置は、基板上の細胞結合位置の特異的化学的修飾に
よって生成される。細胞結合位置は、細胞結合位置において異なるタイプの細胞
の付着および増殖を可能とする、あるいは単一の細胞タイプのみの付着を可能と
できる種々の異なる細胞結合分子を含むことができる。基板上の細胞結合位置を
囲う疎水性ドメインは細胞の付着および増殖を支持しない。
【００５３】 １つの実施形態において、複数の細胞タイプのマイクロ−アレイは、化学吸着
を介してアミノ基のような反応可能な官能基を有する物質の層でガラスをコーテ
ィングすることによって作成される。好ましい実施形態において、３−アミノプ
ロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）またはＮ−（２−アミノエチル−３−ア
ミノプロピル）トリメトキシシラン（ＥＤＡ）のようなアミノシアンを用いるが
、他の反応可能な物質を用いることもできる。この最初の工程に続き、反応可能
な官能基の存在のため、コートされたガラスウェーハの全表面は親水性である。
【００５４】 第２に、微細パターン化反応を行い、光切断可能または化学的に除去可能なア
ミノ保護基を有する物質を含有する液滴が、アミノシランをコートしたガラスウ
ェーハ上の区別される位置の微細パターンに入れられる。１つの実施形態におい
て、パターンは矩形または四角形アレイを含むが、（限定されるものではないが
、三角形または丸のような）いずれかの適当な区別されるパターンを用いること
もできる。１つの実施形態において、液滴は１ナノリットル（ｎｌ）ないし１０
００ｎｌの容量の範囲である。好ましい実施形態において、液滴は容量が２５０
−５００ｎｌの範囲である。適当な光化学的に除去できるアミノ保護物質は、限
定されるものではないが、４−ブロモメチル−３−ニトロベンゼン、１−（４，
５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）−エチル（ＤＭＮＰＥ）およびブチルオ
キシカルボニルを含む。１つの実施形態において、パターン化反応は１マイクロ
モラー（μＭ）および１０００μＭの間の試薬濃度を用い、気温ないし３７℃の
範囲の温度にて１ないし１００分間行われる。好ましい実施形態において、反応
は５００μＭの試薬濃度を用いて３７℃で６０分間行われる。
【００５５】 液滴は通常のインクジェット技術を介してアミノシランがコートされたガラス
ウェーハ上に置くことができる（米国特許第５，２３３，３６９号；米国特許第
５，４８６，８５５号）。別法として、１ｎｌおよび１０００ｎｌの間の流体を
移動できるペーパー付きのロッドと本明細書中で定義されるピンのアレイをアミ
ノ保護物質の浴に浸漬させて、それらの端部に保護物質の液滴を生じさせる。ピ
ンをガラスウェーハと接触させてそれに液滴を移動させる。別の実施形態におい
て、アミノ保護物質を含有する（共に引用して一体化させる）米国特許第５，５
６７，２９４号および第５，５２７，６７３号に記載されたガラスまたはプラス
チックで作成された毛細管のアレイをガラスウェーハと接触させて液滴を表面に
移動させる。このように、疎水性表面に保護されたアミノ基を含有するスポット
または細胞結合位置アレイでガラスウェーハを微細パターン化させる（図２Ａ−
Ｂ）。
【００５６】 第３に、未保護アミノ基と反応性である疎水性物質をガラスウェーハ上に洗浄
する。疎水性物質は脂肪酸またはヨウ化アルキル、またはいずれかの他の適当な
構造であり得る。ガラスのそのような誘導体化のためのある種の条件はプライム
（Prime）およびホワイトサイズ（Whitesides）,サイエンス（Science） 252:11
64-1167,1991,ロペツ（Lopez）ら、ジャーナル オブ ザ アメリカン ケミカ
ル ソサイアティ（Journal of the American Chemical Society）115:5877-587
8,1993,およびムルクシッヒ（Mrksich）およびホワイトサイズ（Whitesides）,
アン. レブ. バイオモル. ストラクト.(Ann.Rev.Biomol.Struct.)25:55-78,1996
に見出すことができる。脂肪酸またはヨウ化アルキルは未保護アミノ基と反応し
、それに対して共有結合し、アミノ基は今や脂肪酸またはヨウ化アルキル基のた
め疎水性である。細胞結合位置９の得られた修飾アレイは、疎水性バックグラウ
ンド上に保護アミノ基を含有する細胞結合位置アレイ８を備えたガラスウェーハ
４を含む（図２Ｃ）。
【００５７】 第４に、細胞結合位置の不均一アレイは、前記した方法にしたがって生成させ
た微細パターン化アレイ中のアミノ基を均一に脱保護することによって生成され
る。１つの実施形態において、化学的特異性は、細胞結合位置に特異的分子を化
学的に架橋させることによって付加することができる。細胞結合位置における遊
離アミノ基と反応し特異的分子に架橋するであろうエチレングリコールビス（ス
クシンイミジルスクシネート）のような多数のよく知られたホモ−またはヘテロ
−二官能性架橋剤がある。遊離アミノ基を他の生体分子と架橋させるための試薬
および条件は、以下の文献、グラバレク（Grabarek）およびゲルゲリー（Gergel
y）、アナリスト.バイオケム（Analyt.Biochem）185:131-135,1990:マッケンジー
（McKenzie）ら，ジェ.プロト.ケム.（J.Prot.Chem.）7:581-592,1988;ブリンク
リー（Brinkley）,バイオコンジュゲート ケム.（Bioconjugate Chem.）3:12-1
3;1992,フリッチュ（Fritsch）ら,バイオコンジュゲート ケム.（Bioconjugate
Chem.）7:180-186,1996;およびアプリン（Aplin）およびヒューズ（Hughes）,1
981によって例示されているように当該分野においてよく知られている。
【００５８】 好ましい実施形態において、細胞結合位置の不均一アレイはコンビナトリアル
形式で生成される。得られた細胞結合位置は不均一である（すなわち、各細胞結
合位置または細胞結合位置の群はその細胞結合選択性において極めて希であり得
る）。用語コンビナトリアルとは、細胞結合位置が可変的に処理されることを意
味する。
【００５９】 １つの実施形態において、工程３の細胞結合位置の修飾されたアレイの保護ア
ミノ基を脱保護し、次いで、化学的架橋剤と共に特異的分子を所望のパターンに
沈積させる。特異的架橋剤はアミノ基に結合することができ、さらに、細胞結合
基を保有できる。この工程において、細胞結合基のタイプは１つの細胞結合位置
から別の位置にかけて、あるいは細胞結合位置の１つの群から別の群にかけて変
化させてアレイ中に不均一なデザインを生じさせることができる。
【００６０】 別の実施形態において、工程３の化学修飾された細胞結合位置のアミノ基は不
均一に脱保護される。光活性化の架橋剤を脱保護されたアミノ基と反応させる。
所望のパターンの光学マスクを細胞結合位置の表面におき、露出された細胞結合
位置を光源で照射する。光を受け取る細胞結合位置の位置および数は光学マスク
の微細パターンによって制御される。適当な光活性化の架橋剤はアリールニトレ
ン、フッ素化アリールアジ化合物、ベンゾフェノンおよびジアゾピルベートを含
む。光学マスキングおよび架橋についての試薬および条件はプライム（Prime）
およびホワイトサイズ（Whitesides）,1991;サイビ（Sighvi）ら，1994,シーガ
ル（Sigal）ら，1996およびムルクシッヒ（Mrksich）およびホワイトサイズ（Wh
itesides），１９９６で議論されている。光活性化の架橋剤は、それが細胞結合
位置のアミノ基に化学的に結合し、光に露出された場合に抗体のような細胞結合
分子に共有結合する点で二官能性である。光活性化された架橋のための試薬およ
び条件はテブニン（Thevenin）ら，ユーロ.ジェ.バイオケム.（Eur.J.Biochem.
）206:471-477、1992およびゴールドマヒェア（Goldmacher）ら，バイオコンジュ
ゲート ケム.(Bioconjugate Chem.)3:104-107,1992に議論されている。
【００６１】 光活性化の架橋剤を用いる場合、ガラスプレートを細胞結合分子で満たして細
胞結合位置に結合させる。１つの実施形態において、表面抗原反応性抗体、細胞
外マトリクス蛋白質（例えば、フィブロネクチンまたはコラーゲン）または荷電
ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｌ−アルギニン）のような細
胞結合分子を約０．１ないし約１ｍＭの範囲の濃度で用いる。細胞結合分子が細
胞結合位置を覆っている間に、ガラスプレートを、ガラスプレートの物質の臨界
角度未満の角度にてガラスプレートの下面から照射し、その結果、光の全反射が
もたらされる。（全反射蛍光顕微鏡の議論については、トンプソン（Thompson）
ら，１９９３参照）。１つの実施形態において、照射は３００ナノメートル（ｎ
ｍ）ないし１０００ｎｍの間の波長の光で気温および３７℃の間にて０．１ない
し１０秒間行う。好ましい実施形態において、照射は約３００および４００ｎｍ
の間の波長の光を用いて気温にて１秒間行う。光学架橋は光活性化架橋を短い距
離に限定して細胞結合位置上の溶液に入れ、これはベイリー（Bailey）ら，ネイ
チャー（Nature） 366:44-48,1993;ファーカス（Farkas）ら、アン.レビュ.フィ
ジオル.(Ann.Rev.Physiol.)55:785-817,1993;テイラー（Taylor）ら、ソク.オプ
ト.インストラ.エング.(Soc.Opt.Instr.Eng.)2678:15-27,1996;トンプソン（Tho
mpson）ら．,イン メーソンW.T.(in Mason,W.T.)編，「生物的活動ノためのフ
ルオレッセント及びルミネセントプローブ（Fluorescent and Luminescent Prob
es for Biological Activity）」サンディエゴ：アカデミック プレス（Academ
ic Press）４０５−４１９頁，１９９３に記載されている。
【００６２】 光活性化の架橋剤は、架橋剤が照射された細胞結合位置においてのみ、抗体お
よびマトリクス蛋白質のような細胞結合分子と結合する。例えば、細胞結合位置
アレイの単一行を照射して、架橋剤に結合した細胞結合分子との細胞結合位置の
単一行を生じさせることができる。いずれの未結合細胞結合分子も除去するため
のアレイの洗浄に続き、第２の行を照射しつつ、かつ所望により他の行をマスク
しつつ、ガラスウェーハを第２の細胞結合分子で引き続いて満たすことによって
、細胞結合位置の第２の行を第２の細胞結合分子に結合させることができる。未
結合細胞結合分子はアレイをＰＢＳまたはいずれかの他の適当な緩衝液で洗浄す
ることによって除去される。このようにして、細胞結合位置または細胞結合位置
の群の複数の位置を、特定の細胞結合分子の存在下で順次にマスクすることによ
って順次に照射することができる。別法として、ピンポイント露出および光学マ
スキングを用いるものによって各細胞結合位置を照射することができる。このよ
うにして、異なる細胞結合分子をアレイの行または個々の細胞結合位置に結合さ
せ、いずれかの所望のパターンの細胞結合位置に結合した細胞の不均一なアレイ
を生じさせる。
【００６３】 細胞結合位置の化学修飾されたアレイを生じさせるためのさらなる実施形態に
おいて、化学修飾されたアレイをまず生成させ、ここに、細胞結合位置のアミノ
基は光切断可能な保護基で均一に保護される。行、列および／または個々の細胞
結合位置は順次に光脱保護されて、種々のパターンの光学マスクを用いることに
よって遊離アミノ基を露出させ、脱保護されるべき細胞結合位置を除きカバーす
る。露出された細胞結合位置（すなわち、マスクによってカバーされていない位
置を照射し、その結果、保護基が除去される。脱保護されたアミノ基に化学的に
結合し、細胞結合位置を活性化させる二官能性架橋剤でアレイを満たす。アミノ
基の光脱保護のための条件はパドワ（Padwa）,A.（編）「オーガニック フォト
ケミストリ（Organic Photochemistry）」，ニューヨーク州 9:225-323、1987、
テン（Ten）ら,マクロモル.ケム.(Makromol.Chem.)190:69-82,1989,ピラ（Pilla
i）,シンセシス（Synthesis）1980:1-26,1980,セルフ（Self）とトンプソン（Th
ompson）,ネーチャー メデシン（Nature Medicine）2:817-820,1996、およびセ
ンター（Senter）ら，フォトケミク.フォトバイオル.(Photochem.Photobiol.)42
:231-237,1985に議論されている。次に、細胞結合分子を修飾された化学アレイ
上に満たし、そこでそれらは架橋剤の他の半分と反応する。次いで、アレイを洗
浄していずれの未結合の二官能性架橋剤および細胞結合分子も除去する。別の細
胞結合位置または細胞結合位置の組は別の光学マスクを用いて脱保護することが
でき、そして、アレイを二官能性架橋剤、続いて脱保護アミノ基のこの第２の細
胞結合位置または細胞結合位置の組に結合する区別される細胞結合分子の第２の
処理で満たすことができる。アレイを洗浄して二官能性架橋剤および細胞結合分
子の第２の処理を除去する。このように、光脱保護、特異的分子の化学的架橋お
よび種々のマスク下での洗浄の反復された系列によって細胞結合分子の不均一ア
レイを生成させることができる。別法として、１つの工程で細胞結合分子と共に
架橋剤を脱保護された細胞結合位置に送達することができる。付着した細胞結合
分子の濃度勾配は、光学マスクを用いて露出された脱保護アミノ基の数を制御す
ることによって、あるいは光活性化の架橋剤のための照射の量を制御することに
よって作り出すことができる。
【００６４】 細胞結合位置の化学修飾されたアレイを用いて、細胞結合位置上に細胞の不均
一アレイを生じさせる。１つの実施形態において、疑われる細胞をアレイ上に導
入することによって、修飾された化学的アレイに細胞を「撒き」、細胞結合位置
への細胞の結合を可能とし、次いで、ウェーハをすすいで未結合および弱く結合
した細胞を除去する。細胞を細胞結合位置においてのみ結合させる。なぜならば
、細胞結合位置の位置の各々を囲う疎水性環境と組み合わせて、細胞結合位置に
おける特異的化学的環境は、細胞結合位置のみに対する細胞の選択的結合を可能
とするからである。さらに、細胞結合位置の特異的細胞結合分子での修飾は、特
異的細胞結合位置への細胞の選択結合を可能とし、細胞結合位置での細胞の不均
一アレイを生じさせる。加えて、細胞結合位置に特異的に結合する細胞表面分子
は天然に存在するか、あるいは、細胞が修飾された細胞結合位置と相互作用し、
それに特異的に結合するように、細胞膜貫通分子に融合されている「細胞結合位
置−特異的」分子によって遺伝子工学により作成することができる。異なる細胞
認識分子での細胞結合位置アレイの創製は、１つの細胞結合位置、細胞結合位置
の群、または全アレイが細胞の混合された集団からの細胞を特異的に「認識し」
、それを増殖させ、スクリーニングするのを可能とする。
【００６５】 １つの実施形態において、１リットルあたり約１０３ないし約１０７細胞の範
囲の濃度で培地に懸濁された細胞を、気温ないし３７℃範囲の温度にて１ないし
１２０分間細胞結合位置と接触させてインキュベートする。次いで、未結合細胞
を、培地または高密度溶液を用いて細胞結合位置からすすぎ去って、未結合細胞
を結合細胞からリフトさせる（チャンナバジャラ（Channavajjala）ら，J.Cell
Sci.110:249-256.1997）。好ましい実施形態において、１ｍｌあたり約１０５な
いし約１０６細胞の範囲の濃度で培地に懸濁させた細胞を、約１０分間ないし約
２時間の範囲の時間、３７℃において細胞結合位置と接触させてインキュベート
する。
【００６６】 細胞結合位置に付着した細胞の密度は、細胞懸濁液における細胞密度、化学修
飾された細胞結合位置への細胞結合を可能とする時間および／または細胞結合位
置における細胞結合分子の密度によって制御される。細胞付着手法の１つの実施
形態において、１ｍｌあたり１０３ないし１０７細胞を１分および１２０分の間
、気温と３７℃の間でインキュベートし、細胞結合位置は細胞結合分子１ｃｍ２ あたり０．１と１００ナノモルの間を含有する。好ましい実施形態において、１
ｍｌあたり１０５および１０６細胞を約３７℃で１０分間ないし２時間インキュ
ベートし、細胞結合位置は細胞結合分子１ｃｍ２あたり約１０ないし１００ナノ
モルを含有する。
【００６７】 １つの実施形態において、細胞は、ベル（Bell）ら，ジェ.ヒストケム.チトケ
ム(J.Histochem.Cytochem) 35:1375-1380,1987;プート（Poot）ら，ジェ.ヒスト
ケム.チトケム(J.Histochem.Cytochem)44:1363-1372,1996;ジョンソン（Johnson
）,ジェ.エレクト.ミクロス.テク.(J.Elect.Micros.Tech.)2:129-138,1985によ
って記載されているように細胞結合位置に化学的に結合させ、そして、抗体、核
酸ハイブリダイゼーションプローブまたは他のリガンドのような蛍光標識分子で
の後の時間におけるスクリーニングで使用される。
【００６８】 別の実施形態において、細胞は細胞の化学的もしくは分子的特性の蛍光インジ
ケータで修飾し、細胞結合位置の不均一な化学修飾されたアレイ上に撒き、次い
で、生きた状態で分析することができる。そのようなインジケータの実施例は、
ギウイラノ（Giuilano）ら，アン.レブ.バイオフィズ.バイオモル.ストラクト.(
Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.)24:405-434,1995;ハルーツニアン（Harootuni
an）ら，モル.バイオル.セル（Mol.Biol.Cell） 4:993-1002,1993;ポスト（Post
）ら,モル.バイオル.セル（Mol.Biol.Cell）6:1755-1768,1995;ゴナザルツ（Gon
azalez）およびチーン（Tsien）,バイオフィズ.ジェ（Biophys.J.）69:1272-128
0,1995;スワミナザン（Swaminathan）ら，バイオフィズ.ジェ（Biophys.J.）72:
1900-1907,1997およびチャルフィー（Chalfie）ら，サイエンス（Science） 263
:802-805,1994に提供される。インジケータは、限定されるものではないが、そ
れらが記載された条件下で発現されるように（チャルフィー（Chalfie）ら，199
4）、（ハウグランド（Haugland）、蛍光プローブおよび探索化学物質のハンド
ブック、第６版、モレキュラー プローブズ インク.（Molecular Probes,Inc.
）,ユージン（Eugene）,1996にレビューされている）細胞膜を横切る拡散、細胞
膜の機械的乱れ（マクニール（McNeil）ら，ジェ. セル バイオロジー（J. Cel
l Biology）98:1556-1564,1984;クラーク（Clarke）およびマクニール（McNeil
）,ジェ.セル サイエンス（J.Cell Science）102:533-541,1992;クラーク（Cla
rke）ら，バイオテクニックス（BioTechniques）17:1118-1125,1994）、または
遺伝子工学のようないずれか１つのまたは種々の物理的方法の組合わせによって
アレイ上に接種される前または後に細胞に導入することができる。好ましい実施
形態において、細胞は蛍光レポータ遺伝子を含有するが、化学発光蛋白質をコー
ドするものを含めた他のタイプのレポータ遺伝子も適当である。生きた細胞の生
きた研究はその細胞周期の間の蛍光によって報告されているように、あるいは薬
物または他の反応性物質と接触させた場合に細胞の生理学的状態の分析を可能と
する。
【００６９】 本発明の別の形態において、細胞結合位置の不均一細胞アレイが提供され、こ
こに、細胞は、基板上の細胞結合位置の化学修飾されたアレイに結合されている
。細胞結合位置の基礎となる不均一な化学的修飾アレイは異なる特異性の種々の
細胞結合部位を提供するゆえに細胞アレイは不均一である。いずれの細胞タイプ
も整列させることができるが、その細胞タイプに特異的に結合することができる
分子は細胞結合位置の化学修飾されたアレイに存在するものとする。細胞結合位
置の不均一細胞アレイについての好ましい細胞タイプはリンパ球、癌細胞、ニュ
ーロン、菌類、細菌および他の原核生物および真核生物を含む。例えば、図３Ａ
は、表面パターン化基板上で増殖し、２つの蛍光プローブ（アクチンを染色する
ためのローダミンおよび核を染色するためのヘキスト（Hoechst））で標識され
た繊維芽細胞を含有する細胞結合位置にある不均一細胞アレイを示し、他方、図
３Ｂは、２つの蛍光プローブで標識され、異なる倍率で可視化されたスポットパ
ターンの繊維芽細胞増殖（Ｌ９２９および３Ｔ３細胞）を含有する細胞結合位置
にある不均一細胞アレイを示す。
【００７０】 細胞結合位置にある不均一細胞アレイで用いることができる細胞結合分子の実
施例は、限定されるものではないが、抗体、レクチンおよび細胞外マトリクス蛋
白質を含む。別法として、特異的細胞表面マーカを発現する遺伝子工学作成細胞
は修飾された細胞結合位置に選択的に直接結合させることができる。細胞結合位
置にある不均一細胞アレイは固定細胞または生きた細胞いずれかを含み得る。好
ましい実施形態において細胞結合位置にある不均一細胞アレイは、限定されるも
のではないが、細胞の化学的または分子的特性の蛍光インジケータで「標識され
た」細胞のような生きた細胞を含む。
【００７１】 本発明の別の形態において、細胞結合位置にある不均一細胞アレイを調製し、
ここに、細胞は少なくとも１つの蛍光レポータ分子を含有し、細胞結合位置にあ
る不均一細胞アレイを流体送達系に接触させて細胞への試薬送達を可能とさせ低
倍率で全不均一細胞アレイの蛍光像を取得することによって高スループットをス
クリーニングを行って、全ての細胞結合位置から一度に蛍光シグナルを検出し、
応答を呈するものを同定することを特徴とする細胞を分析する方法が提供される
。これに続いて、異なる生理学的およびスペクトル特性を持つ蛍光試薬の組を用
いて応答する細胞結合位置内で高含有量検出を行い、選択された細胞結合位置を
走査して細胞中の蛍光レポータ分子からの蛍光シグナルを取得し、蛍光シグナル
をデジタルデータに変換し、デジタルデータを利用して細胞内の蛍光レポータ分
子の分布、環境または活性を測定する。
【００７２】 細胞結合位置にある不均一細胞アレイの好ましい実施形態は前記で開示される
。流体送達系の好ましい実施形態において、チャンバーは不均一細胞アレイを含
有する基板と接合する。チャンバーは、好ましくは、ガラス、プラスチックまた
はシリコンから作成されるが、チャンバーを提供できるいずれの他の材料も適当
である。図４に示されたチャンバー１２の１つの実施形態は、基板４上の細胞結
合位置８にマッチするエッチングされたドメイン１３のアレイを有する。加えて
、インプットチャンネル１４がエッチングされて流体をエッチングされたドメイ
ン１３に供給する。エッチングされたドメイン１３から過剰の流体を除去するた
めの一連の「アウトプット」チャンネル１６もまた細胞結合位置に結合させるこ
とができる。チャンバー１２および基板１０はいっしょになってカセット１８を
構成する。この実施形態はエッチングされたドメインを利用するが、流体位置１
に形成された凹所１３のいずれの他のタイプをこの実施形態で利用することもで
きる。別法として、流体位置は平坦であってよく、細胞結合位置８は流体位置１
にマッチする凹所を含むことができる。もう１つの別法において、細胞結合部位
８および流体位置１は共に平坦であって、ウェルに対する容量スペースは基板４
およびチャンバー１２の間でのスペーサ支持体２０の使用によって作られる。
【００７３】 このように、チャンバー１２は、細胞結合位置位置１０に整列された細胞への
流体の送達のために使用される。流体は、限定されるものではないが、細胞の表
面発現部位と結合する、あるいは細胞によって摂取された特定の薬物、蛋白質、
リガンドまたは他の物質の溶液を含む。細胞結合位置１０に整列された細胞と相
互作用する流体は薬物をカプセル化するリポソームを含むこともできる。１つの
実施形態において、そのようなリポソームが光発色性の材料から形成され、これ
は光反応性合成ポリマーのような、光への露出に際して薬物を放出する（ウィル
なー（Willner）およびルビン（Rubin）,ケム.イント.(Chem.Int.)編、エングル
（Engl.）35:367-385,1996にレビューされている）。薬物は全てのチャンバー１
４中のリポソームから同時に放出でき、あるいは個々のチャンネルまたはチャン
ネルの別の行を照射して薬物を順次に放出させることもできる。そのような薬物
の制御された放出を遺伝子実験および生きた細胞実験で用いることができる。流
体送達の制御は、毛細管作用分野でよく知られたミクロ−バルブおよびミクロ−
ポンプの組合わせによって達成することができる（ここに引用にて一体化される
米国特許第５，５６７，２９４号；米国特許第５，５２７，６７３号；米国特許
第５，５８５，０６９号）。
【００７４】 図５に示されたチャンバー１２の別の実施形態は、細胞結合部位がチャンバー
１２のエッチングされたドメイン１３に浸漬されるように、基板４上の細胞結合
位置８よりも直径がわずかに大きなチャンバーのエッチングされたドメイン１３
にマッチングするインプットチャンネル１４のアレイを有する。スペーサ支持体
２０は、接触の側面に沿って、チャンバー１２および細胞結合位置１０に整列さ
れた細胞の間に置かれる。基板４およびチャンバー１２は、チャンバーの隆起し
た領域にあるエラストマまたは他の粘着性コーティングを用いて一緒にシールす
ることができる。チャンバー１２の各エッチングされたドメイン１３は、細胞結
合位置１０に整列された細胞の増殖および／または健康を支持する培地を個々に
または均一に満たすことができる。さらなる実施形態において（図６）、同一溶
液と共に細胞結合位置１０に整列された全ての細胞を処理するために、チャンバ
ーはインプットチャンネルを含有しない。
【００７５】 薬物または他の物質の送達は、以下のように、チャンバーの種々の修飾の使用
によって達成される。アレイの細胞との相互作用につきテストされるべき薬物の
溶液は９６ウェルマイクロタイタープレートからミクロ−毛細管２４のアレイに
負荷することができる（図７）。ミクロ−毛細管２４のアレイはチャンバー１２
のインプットチャンネル１４に１：１で対応し、溶液がミクロ−毛細管２４から
チャンバー１４に流動し、またはポンプ送液されるようにする。カセット１８は
、細胞結合位置８が流体で満たされたエッチングされたドメイン１３に沈むよう
に倒立される（図７Ｂ）。一旦流体および細胞の間で相互作用が起きれば、細胞
結合位置１０に整列された細胞から発せられたシグナルは直接測定することがで
きるか、あるいは別法として、基板４を後処理、固定および標識のためにチャン
バーから離してリフトすることができる。細胞のアレイの設置および除去はロボ
ットおよび／または水力学を介して達成することができる（シュローダー（Schr
oeder）およびニーグル（Neagle）,1996）。
【００７６】 図７に示されたチャンバー１２の１つの実施形態において、チャンネルおよび
マッチングするエッチングされた１３をチャンバーに化学的にエッチングする（
プライム（Prime）およびホワイトサイズ（Whitesides）,1991;ロペツ（Lopez）
ら，1993;ムルクシッヒ（Mrksich）およびホワイトサイズ（Whitesides）,1996
）。エッチングされたドメイン１３は細胞結合位置８よりも直径が大きい。これ
はチャンバー１２が基板４に接触シールされて、細胞のためのスペースおよび流
体の小さな容量を残すことを可能とする。インプットチャンネル１４はチャンバ
ー１２のエッチングされたドメイン１３の各行にエッチングされる。各インプッ
トチャンネル１４はチャンバー１２の２つの対向するエッジから伸び、各エッジ
で開く。単一の行のエッチングされたドメイン１３は、溶液を含有するミクロ−
毛細管２０をチャンバー１２のエッジと接触させることによってインプットチャ
ンネル１４と流体連絡する。結合されたインプットチャンネル１４の各行は同時
にまたは順次に満たすことができる。バルブおよびポンプまたは毛細管作用によ
るインプットチャンネル１４の充填の間に、チャンバー１２のチャンネルの各々
は満たされ、薬物は通過して、インプットチャンネル１４によって結合されたエ
ッチングされたドメイン１３の行にある各エッチングされたドメイン１３を満た
す。
【００７７】 チャンバー１２のさらなる実施形態において、図８ｂに示されるように、一段
と高い容器２８およびインプットチャンネル１４をチャンバー１２の表面に置く
ことができる。好ましい実施形態において、一段と高い容器２８およびインプッ
トチャンネル１４はポリテトラフルオロエチレンまたはエラストマ材料から作成
することができるが、それらは商品名ＳＹＬＧＡＲＤ １８４ＴＭ下でダウコー
ニング（Dow Corning）によって製造されたポリ（ジメチルシロキサン）のよう
な、基板４への付着を可能とするいずれの他の粘着性材料から作成することもで
きる。効果はエッチングされたチャンネルを有するチャンバーと同一であり、チ
ャンネルおよびその使用は同様である。
【００７８】 図８Ａに示されたチャンバーの別の実施形態において、第１のチャンネル３０
はチャンバー１２の１つのエッジから第１のエッチングされたドメイン１３また
は一段と高い容器２８およびチャンネルまで延びる。第２のチャンネル３２は対
向エッジから第１のエッチングされたドメインに隣接する第２のエッチングされ
たドメインまで延びる。第１の３０および第２の３２のチャンネルは相互に流体
連絡していないが、インプットチャンネル１４または一段と高い容器２８の同一
行にある。
【００７９】 図９および図１０に示された別の実施形態において、チャンバー１２は各エッ
チングされたドメイン１３または一段と高い容器２８からチャンバーのエッジに
延びるインプットチャンネル１４を有することができる。チャンネル１４はチャ
ンバー１２の１つのエッジ（図９）、または双方のエッジ（図１０）に全て由来
することができる。また、インプットチャンネル１４はエッチングされたドメイ
ン１３の両側に分けて、インプットチャンネル１４によって占められるスペース
を最小化することもできる。別々の流体チャンネルは、一度に一行または一度に
１つの凹所が薬物で充填される動的実験の性能を可能とする。
【００８０】 図１１に描かれたさらなる実施形態において、各エッチングされたドメインは
、チャンネル１４の端部およびエッチングされたドメイン１３の間にプラグ３６
を有する対応するインプットチャンネル１４と流体連絡し、これは所望の時間ま
で注入された溶液がエッチングされたドメイン１３に流入することを妨げる。溶
液はあとの時点での使用のためインプットチャンネル１４に予め負荷することが
できる。同様に、プラグ３６はインプットチャンネル１４と流体連絡した連結さ
れエッチングドメイン１３の組における末端エッチングドメイン１３の間に配す
ることができる。プラグ３６の放出に際して、物質は、インプットチャンネル１
４と流体連絡するすべてのエッチングされたドメインを通って流動しそれを充填
する。
【００８１】 １つの実施形態において、プラグ３６は、照射に際して親水性となり、薬物と
共に凹所へと通過する光切断可能の架橋剤で架橋されている、限定されるもので
はないが、蛋白質、炭水化物または脂質のような疎水性ポリマーから形成される
。別法として、プラグ３６は、照射された場合に分解し、溶液に沿ってエッチン
グドメイン１３へと通過する光切断可能の架橋剤で架橋されている蛋白質、炭水
化物または脂質のような架橋されたポリマーから形成することができる。
【００８２】 基板４およびチャンバー１２を含むカセット１８は蛍光リーダー装備に挿入さ
れる。蛍光リーダー装備は、カセットを取り扱い、環境を制御し、溶液のウェル
への送達を制御し、細胞のアレイから（一度に１ウェルまたは同時に全アレイ）
発せられた蛍光を分析する光学−機械的装置である。好ましい実施形態において
（図１２）、蛍光リーダー装備４４は、カセットを操作するためのリーダーおよ
びマイクロロボットとしての蛍光顕微鏡を用いる一体化された回路監視ステーシ
ョンを含む。本発明のリーダーはディテクタで蛍光検体を像形成するように切形
されたいずれの光学系を含むことができる。保存区画４８は、カセット１８を保
持し、それからそれらはコンピュータ５６によって制御されるロボットアーム５
０によって検索される。ロボットアーム５０はカセット１８を蛍光リーダー装備
４４に挿入する。カセット１８は、当該カセットを第２の保存区画５４に入れる
別のロボットアーム５２によって蛍光リーダー装備４４から取り出される。
【００８３】 蛍光リーダー装備４４は、一体化された回路「チップ」を欠陥につき「スクリ
ーニングする」ように使用される光学ベースの一体化回路監視ステーションの修
飾として設計された光学的−機械的装置である。環境制御、マイクロロボットお
よび光学リーダーを取り込むシステムはカールツァイス（Carl Zeiss）[Jena,Gm
bH]のような会社によって生産されている。ロボット取り扱い、流体送達、およ
び速くて正確な走査を容易にすることに加え、２つの読み取りモード、高含有量
および高スループットが支持される。高含有量読み出しはアレイスキャンリーダ
ーによって行われるものと実質的に同様である（米国特許第５，９８９，８３５
号）。高含有量モードにおいて、複数の細胞タイプのミクロ−アレイ上の各位置
は十分な数の視野を記録する５−４０Ｘ以上の倍率で像形成されて測定の所望の
統計学的分解能を達成する。
【００８４】 高スループットモードにおいて、蛍光リーダー装備４４は０．２×ないし１．
０×倍率のかなり低い倍率で複数の細胞タイプのミクロ−アレイを像形成し、低
下した分解能を提供するが、基板上の全ての細胞結合位置が単一像で記録される
ことを可能とする。１つの実施形態において、０．５×倍率で像形成された複数
の細胞タイプの２０ｍｍ×３０ｍｍミクロ−アレイは１０μｍ画素の１０００×
１５００アレイを満足し、細胞内蛍光分布を規定するには不十分であるが、単一
ウェルにおいて平均応答を記録するには、およびウェル中の特定の細胞サブタイ
プの数をカウントするには十分な２０μｍ／画素の分解能を生じる。典型的な取
り込み回数は秒のオーダーであるので、自動ローディングおよび取り扱いとカッ
プリングさせた読み出し技術の高スループットモードは１分間あたり数百の化合
物のスクリーニングを可能とする。
【００８５】 図１３に示された１つの実施形態において、蛍光リーダー装備は、コンピュー
タ−制御されたｘ，ｙ，ｚ−ステージ６４、低倍率対物レンズ７０（例えば、０
．５×）および１以上の高倍率対物レンズ７２を保持するコンピュータ−制御さ
れた回転対物レンズ台６８、励起フィルタホイール７６を備えた白色光源ランプ
７４、発光フィルタ８０を備えた二色フィルタシステム７８、およびディテクタ
８２（例えば、冷却された電荷−結合装置）を含む直立または倒立蛍光顕微鏡４
４である光学的−機械的デザインを含む。高スループットモードでは、低倍率対
物レンズ７０が所定の位置に移動され、全細胞アレイの１以上の蛍光像が記録さ
れる。いくらかの選択された蛍光応答を呈したウェルを同定し、さらに、高含有
量スクリーニングを介して分析され、ここに、米国特許第５，９８９，８３５号
に記載されているように、対物レンズ台６８が回転されて高倍率対物レンズ７２
を選択し、ｘ，ｙ，ｚ−ステージ６４が細胞および細胞下高含有量スクリーニン
グ双方に付き「選択された」ウェルを中心になるように調整される。
【００８６】 別の実施形態において、蛍光リーダー装備４４は共焦点または標準照射モード
いずれかにて走査されたレーザービームを利用することができる。カールツァイ
ス（Carl Zeiss）（ジェナ（Jena）,GmbH,ドイツ）によって製造され、またはデ
ン（Denk）ら（サイエンス（Science）248:73,1990）に議論されている複数のレ
ーザーラインまたは別々のレーザーダイオードの群に基づく。
【００８７】 高スループットスクリーニングモードの別の実施形態は、細胞の不均一微細パ
ターン化アレイにあるウェルのサブセットを走査する蛍光エクサイターおよび蛍
光発光ディテクタのアレイ（１×８、１×１２等）よりなる低分解能システムの
使用を含む。好ましい実施形態において、このシステムは束となった光学繊維よ
りなるが、蛍光励起光を指令し、同一ウェルからの蛍光発光を収集するいずれの
システムも十分であろう。このシステムでの複数の細胞タイプの全ミクロ−アレ
イの走査は、各ウェルから、細胞およびそれがつけられた溶液双方からの全蛍光
を生じる。この実施形態は、無細胞システムからの蛍光シグナルの収集を可能と
する（いわゆる「均一」アッセイ）。
【００８８】 図１４Ａは、まず高スループット検出を用いて全アレイ「Ａ」からの応答を測
定する蛍光リーダー装備を用いて高スループットおよび高含有量モード双方にお
いて複数の細胞タイプのミクロ−アレイを分析するためのフローチャートの形態
での方法を示す。（図１４Ｂ）。予め設定された閾値を超えて応答するいずれの
ウェルも、ヒットと考えられ、そのウェル中の細胞を高含有量スクリーニングを
介して測定する。（図１４Ｃ）。高含有量モード（「Ｂ」）は高スループットモ
ード（「Ａ」）の間に測定された同一細胞パラメータを測定しても測定しなくて
も良い。
【００８９】 本発明の別の実施形態において、細胞スクリーニングシステムが開示され、こ
こに、用語「スクリーニングシステム」は蛍光リーダー装備、複数の細胞タイプ
（ここに、細胞は少なくとも１つの蛍光レポータ分子を含有する）のミクロ−ア
レイおよび細胞の不均一微細パターン化アレイと会合させたチャンバーを含む蛍
光リーダー装備に挿入することができるカセット、蛍光リーダー装備からのデー
タを受け取るためのデジタルディテクタ、およびデジタルディテクタからのデジ
タルデータを取得し処理するためのコンピュータ手段の統合を含む。
【００９０】 蛍光リーダー装備、および複数の細胞タイプのミクロ−アレイおよびチャンバ
ーを含むカセットの好ましい実施形態は前記で開示した。デジタルディテクタの
好ましい実施形態は米国特許第５，９８９，８３５号に開示されており、蛍光リ
ーダー装備からの蛍光データを取得し、それをデジタルデータに変換する高分解
能デジタルカメラを含む。好ましい実施形態において、コンピュータ手段は、米
国特許第５，９８９，８３５号に記載されているように、デジタルシグナルをデ
ジタルディテクタからコンピュータに輸送するデジタルケーブル、アッセイ結果
の使用者対話および表示のためのディスプレイ、アッセイ結果を処理するための
手段、およびデータ保存および検索のためのデジタル記憶媒体を含む。
【００９１】 好ましい実施形態において、本発明の細胞スクリーニングシステムは前記で開
示されたエレメンチの好ましい実施形態の統合を含む（図１５）。複数の細胞タ
イプ１０のアレイは基板４上の化学修飾された細胞結合位置８に結合した細胞を
含む。チャンバー１２は、基板４上の細胞１０への化合物の添加のためのミクロ
流体送達系として働き、２つの組合わせはカセット１８を含む。カセット１８は
蛍光リーダー装備４４に入れられる。前記し、出典明示してその全部を本明細書
の一部とみなす米国特許第５，９８９，８３５号に記載されているようにデジタ
ルデータが処理される。米国特許第５，９８９，８３５号に記載されているよう
に、データはコンピュータスクリーン８６に表示することができ、バイオインフ
ォマティクスデータベースの一部を形成する。このデータベース９０は本発明の
方法により得られたデータの保存および検索を可能とし、また、細胞での従前の
実験に関連するデータの取得および保存を可能とする。コンピュータディスプレ
イスクリーンの実施例は図１６に示される。
【００９２】 実施例１ 特異的リンパ系細胞の付着のための複数の細胞タイプのミクロ−ア
レイへの抗体のカップリング １．用いた細胞系はその表面にＩｇＭを発現しないマウスＢ細胞リンパ腫系（
Ａ２０）であった。複数の細胞タイプのミクロ−アレイは、２０％硫酸に一晩浸
漬され、過剰の蒸留水中で２−３回洗浄し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム中で洗浄
し、ブロットして乾燥されることによる誘導体化のために調製した。複数の細胞
タイプのミクロ−アレイは直ちに使用するかまたは清浄なガラスビーカーに入れ
、将来の使用のためにパラフィンで被覆した。
【００９３】 ２．複数の細胞タイプのミクロ−アレイを６０ｍｍペトリ皿に入れ、３−アミ
ノプロピルトリメトキシシランを複数の細胞タイプのミクロ−アレイ上に重層し
て、エッジ上で実行することなく完全な被覆を保証した（細胞の２２×２２ｍｍ
不均一微細パターン化アレイにつきほぼ０．２ｍｌ、および細胞の２２×４０ｍ
ｍ不均一微細パターン化アレイについてのほぼ０．５ｍｌ）。室温での４分後、
複数の細胞タイプのミクロ−アレイを脱イオン水中で洗浄し、過剰の水をブロッ
ティングによって除去した。
【００９４】 ３．複数の細胞タイプのミクロ−アレイを清浄な６０ｍｍペトリ皿に入れ、室
温で３０分間、グルタルアルデヒド（ＰＢＳ中２．５％、２．５ｍｌ）と共にイ
ンキュベートし、続いて、３回ＰＢＳ洗浄した。過剰のＰＢＳをブロッティング
によって除去した。
【００９５】 ４．複数の細胞タイプのミクロ−アレイ中の細胞核をブロッキング工程の間、
蛍光ヘキスト色素によって除去した。Ｃ−ＤＭＥＭ中の適当な数のリンパ系細胞
（後記参照）を１５ｍｌの円錐チューブに移し、ヘキスト色素を１０μｇ／ｍｌ
の最終濃度まで添加した。細胞を５％ＣＯ２中で３７℃で１０−２０分間インキ
ュベートし、次いで、室温で１０００×ｇにて７分間ペレット化した。未結合ヘ
キスト色素を含有する上清を除去し、新鮮な培地（Ｃ−ＤＭＥＭ）を添加して以
下のように細胞を懸濁させた：細胞の２２×２２ｍｍ不均一微細パターン化アレ
イあたり０．２ｍｌ中のほぼ１．２５−１．５×１０５細胞、および細胞の２２
×４０ｍｍ不均一微細パターン化アレイのための０．７５ｍｌ中のほぼ２．５×
１０５細胞。
【００９６】 ５．複数の細胞タイプのミクロ−アレイをＰＢＳ中で軽く洗浄し、皿の側面に
触れることなく清浄な乾燥した６０ｍｍペトリ皿に移した。細胞を、前記した密
度で複数の細胞タイプのミクロ−アレイの頂部に注意深くヒペットで置いた。皿
を５％ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、未結合細胞を反
復されたＰＢＳ洗浄によって除去した。
【００９７】 ６．抗体溶液（ヤギ抗−マウスＩｇＭまたはヤギ抗−マウス全血清）をパラフ
ィルム上にスポットした（細胞の２２×２２ｍｍ不均一微細パターン化アレイに
つき５０μｌ、細胞の２２×４０ｍｍ不均一微細パターン化アレイにつき１００
μｌ）。気泡を捕獲することなく複数の細胞タイプの処理されたミクロ−アレイ
の全表面を抗血清が覆うように、複数の細胞タイプのミクロ−アレイをスポット
上に逆転させた。複数の細胞タイプのミクロ−アレイを室温にて１時間、抗体溶
液と共にインキュベートした。
【００９８】 ７．複数の細胞タイプのミクロ−アレイを注意深くパラフィルムからシフトさ
せ、清浄な６０ｍｍペトリ皿に入れ、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、未反応部
位を室温にて１時間、２．５ｍｌの１０％血清（ＤＭＥＭまたはハンクスの平衡
塩溶液中の子ウシまたは胎児ウシ血清）の添加によってブロックした。
【００９９】 ８．両細胞系は抗−マウス全血清に結合するはずであり、Ｘ１６のみが抗−マ
ウスＩｇＭに結合するはずである。特異的リンパ系細胞株の化学修飾された表面
への結合は図１７に示される。表面ＩｇＭ分子を欠くが、ＩｇＧ分子を提示する
マウスリンパ系Ａ２０細胞系は、ヤギ抗−マウスＩｇＭで修飾された表面（図１
７Ｂ）または未被覆スライド（図１７Ａ）よりも全ヤギ抗−マウス血清で修飾さ
れた表面（図１７Ｃ）にかなり強く結合した。
【０１００】 実施例２ 高含有量および高スループットスクリーニング 脂肪細胞および筋細胞のような細胞へのグルコース摂取のインスリン−依存性
刺激は、細胞内区画から原形質膜へのＧＬＵＴ４グルコース輸送の転移の結果と
なる細胞質プロセスの複雑なオーケストレーションを必要とする。直接的シグナ
ル変換事象および転移プロセスに必要な細胞骨格再組織化のような間接的プロセ
スを含めた、多数の分子事象が受容体へのインスリン結合によってトリガーされ
る。アクチン−細胞骨格は細胞質組織化で重要な役割を果たすので、この生きた
ゲルを調節する細胞内シグナリングイオンおよび分子もまたＧＬＵＴ４転移の中
間体と考えることができる。
【０１０１】 インスリン凝症のための２レベルスクリーニングは以下のように考えられる。
青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）と共にＧＬＵＴ４の安定なキメラを運ぶ細胞を複数の
細胞タイプアレイのミクロ−アレイ上に配置し、そして、Ｆｌｕｏ３のアセトキ
シメチルエステル形態、カルシウムインジケータ（緑色蛍光）を負荷した。次い
で、位置アレイをミクロ流体送達系を用いて化合物のアレイで処理し、複数の細
胞タイプの全ミクロ−アレイのＦｌｕｏ−３像の短い配列を、カルシウム応答を
呈するウェルにつき分析した。次いで、応答を誘導した化合物を含有するウェル
を、時間および空間的に検出された青色蛍光を用いて原形質膜へのＧＬＵＴ４転
移の証拠として細胞間ベースで分析する（すなわち、高含有量ベース）。
【０１０２】 図１８は、高スループットモード（図１８Ａ）および高含有量モード（図１８
Ｂ）にての複数の細胞タイプの全ミクロ−アレイの系列的像を示す。図１９は、
高含有量モードからの細胞データを示す。
【０１０３】 改良されたカセットおよび増強されたウェル密度 別の形態において、本発明は、依然として像中に適切な画素分解能を得つつ、
細胞平板培養面積およびサブ−アレイで像形成できるウェルの数を最大化するた
めの装置および方法を提供する。この結果は、ウェル間の距離および面積を最大
化し、このように、ウェル密度を最大化する流体構築物の使用を介して達成され
た。
【０１０４】 本形態の１つの実施形態において、表面を有する基板、ここに、表面は複数の
細胞結合位置を含有し；複数の細胞結合位置へ試薬を送達するための流体送達系
、ここに、流体送達系は基板に接合するマルチレベルのチャンバーを含み、ここ
に、マルチレベルチャンバーは、 i．ミクロ流体インプットチャンネルおよびアウトプットチャンネルの直交
アレイ、ここに、各ウェルは１以上のインプットチャンネルおよび１以上のアウ
トプットチャンネルと流体結合し、 ii．ミクロ流体インプットチャンネルおよびアウトプットチャンネルと流体
結合した複数の流体位置、 iii．ミクロ流体インプットチャンネルと流体結合した１以上のインプット
マニホールド、 iv．ミクロ流体アウトプットチャンネルと流体結合した１以上のアウトプッ
トマニホールド、 v．１以上のインプットマニホールドと流体結合した少なくとも１つの源容
器、 vi．１以上のアウトプットマニホールドと流体結合した少なくとも１つの廃
棄容器を含み、 複数のウェル、ここに、個々のウェルは１つの細胞結合位置および１つの流体
位置の接合によって規定されたスペース を含むことを特徴とする細胞スクリーニング用のカセットが提供される。
【０１０５】 好ましい実施形態において、カセットは、さらに、ミクロ流体装置内にて流体
流動を制御するためのポンプ；装置内の酸素および二酸化炭素分圧を調節するた
めの基板温度コントローラおよび／またはコントローラを含む。
【０１０６】 本発明の基板は、細胞が選択的に細胞増殖基板に接着し、サイズがミリメータ
下ないし数ミリメータである、「細胞結合位置」と言う、小さな領域内に含有さ
れるように、化学修飾される。基板上の細胞結合位置およびチャンバー上の流体
位置の組合わせは「ウェル」と言うスペースを規定する。基板は圧倒的に平坦で
あり、細胞結合位置は、２つの部分が組み立てられる場合に、かく形成されたウ
ェルの領域にいくらかの深さがあるように、基板カバー上に流体位置凹所とマッ
チすることができる。逆に、基板カバー流体位置は平坦であってもよく、基板は
、２つの部分が組み立てられる場合にかく形成されたウェルの領域にいくらかの
深さがあるように、細胞結合位置に凹所を含有することができる。流体およびテ
スト化合物は、基板と組み合わされてカセットを形成するチャンバーを介してウ
ェルに供給される。好ましい実施形態において、チャンバーは基板カバーとして
作用し、装置のミクロ流体チャンネルと流体結合した流体位置を含有し、ここに
、流体位置は、各ウェルの容量がチャンバーにエッチングされるように、基板上
の細胞結合位置にマッチする凹所を含む。
【０１０７】 基板の表面にて、細胞結合位置の間およびその周りにあるシーリング領域があ
り、流体位置の間およびその周りにあるチャンバーの底部面には対応するシーリ
ング領域がある。基板およびチャンバーが接合されると、両成分のシーリング領
域が会合してシールを形成し、これは、それにより形成されたウェルの間のシー
リング領域を横切った流体の流れを妨げる。両成分のこれらのシーリング領域は
物理的におよび／または化学修飾してシーリングを増強することができる。第１
の実施例において、オクタデシルトリクロロシランの疎水性シランコーティング
をシーリング領域にコートする。第２の実施例において、ダイマックス社（Dyma
x Corporation）から入手できるようなＵＳＰクラスＩＶ−対応である光硬化性
接着剤およびシアノアクリレートは、セラミックス、ガラス、プラスチック、ま
たは金属から作成された生化学装置での使用が可能である。第３の実施例におい
て、アレイのウェルにマッチする精度のカットアウトを持つ生体適合性テープ材
料がエイヴリー・デニソン・スペシャルティー・テープ・ディビジョン（Avery
Dennision Specialty Tape Division）から入手できる。同様に、接着剤をこれ
らのシーリング領域に正確に適用するための、タイコ社（Tyco Corporation）か
ら入手できるような、生物医学アクリル接着剤がテープから表面に移すことがで
きる。第４の実施例において、マスターボンド（株）（Master Bond,Inc.）から
入手できるような、光硬化性シリコーンエラストマを、基板のシーリング領域お
よびチャンバーの間の結合およびシーリングで使用することができる。
【０１０８】 本発明のミクロ流体カセットは、限定されるものではないが、 １）（細胞結合位置の組の同時イメージング（すなわち、「サブアレイ」）に
基づく；図２０参照）細胞の統計学的−関連組のより速いイメージング、 ２）プレートあたりのより多いウェルおよびプレートあたりに占められるより
閣内物理的スペース（すなわち、より高いウェル密度）、 ３）価値あるテスト化合物のより効果的な使用、および ４）全ウェルが像形成されないマイクロプレートと比較した細胞のより効果的
な使用； を含めた、高含有量スクリーニングシステムで使用された先行技術細胞アレイミ
クロ流体装置よりも優れた利点を有する。
【０１０９】 前記で議論したように、各ウェルについての先行ミクロウェルプレート流体交
換は、ウェルに挿入され、各々、流体をウェルにまたはウェルから噴射または吸
引するピペットによって達成できるのみである。先行ミクロウェルプレートにお
ける自動流体取扱いは、手法において各流体移動工程のために各ウェルにピペッ
トを挿入するロボットピペッターを用いることによって達成される。このピペッ
トは、典型的には、注目するミクロウェルプレートと交換される流体の源または
目的地のための別のマイクロプレートウェルにまたはそれに移動されることが要
求される。
【０１１０】 一体化された流体工学は、ミリメートル下ウェル内部距離を持つアレイで有利
である。なぜならば、不可能でなければ、空間的分解能および精度の許容される
程度で流体をピペッティングするのは実用的でないからである。許容できるレベ
ルの精度は、測定誤差が２％を超えるべきではないことを要求する。このように
、９６ウェルプレートのウェルにおける１００マイクロリットル（μｌ）容量で
は、２μｌの測定誤差が要求されるであろう。１００ナノリットル（ｎｌ）容量
では、２ｎｌ測定誤差が要求されるであろう。このレベルの精度は、組成物のス
ペクトルおよび粘度を横切った先行自動ピペッターで信頼性よく利用できない。
【０１１１】 ウェル間距離の最小化は、ウェルのサブアレイの速い平行読み取りを可能とす
る。もし一体化流体工学が余りにもバルキーである（すなわち、ウェルの密な間
隔を可能しない）ならば、かかる速い平行読み取り能力は喪失される。本発明の
好ましい実施形態において、直交チャンネル構築物が利用され、より少ないチャ
ンネル、バルブ、およびポンプを可能とし、それにより、さらに、本発明のカセ
ット上のチャンネルによって取られたスペースを減少させる。最も好ましい実施
形態において、チャンネルはウェルのそれの上方のレベルに置かれ、最も近い可
能なウェル間間隔設置を可能とする。さらなる好ましい実施形態において、ドレ
ーン「ポンプ」としての多孔性媒体の使用は、システムのより単純なデザインお
よび製造を可能とする。本発明によると、チャンネルは、規定された本明細書に
おける流体構築物を可能とするいずれかのサイズとし得る。好ましい実施形態に
おいて、それらは四角形断面チャンネルについての幅、または丸断面チャンネル
についての直径が約０．０２５ｍｍないし約０．５ｍｍの間のサイズの範囲であ
る。
【０１１２】 本発明のミクロ流体カセットの流体構築物は、（限定されるものではないが、
ポンプ、マニホールド、制御された圧力容器、および／またはバルブ）が細胞ア
レイのマトリクスの外部に位置するのを可能とする。図４０は、全てのポンプお
よびバルブがカセットに内蔵されているように見える、本発明のポンピングおよ
びバルビングスキームの１つの実施形態を示す。種々の図面（および当業者に明
白であろうもの）に示されたポンピングおよびバルビングスキームの全ての変形
は、ウェルのマトリクスの外部の内蔵活性装置にて、外蔵活性装置にて、または
いくつかは内蔵装置でいくつかは外蔵装置にて、このようにして実行される。結
果として、制御エレメントはカセット内部（内蔵）またはカセットの外部（外蔵
）であり得る。いずれの場合にも、チャンネルおよびウェルの近い間隔設定を制
限し得るウェルのアレイのマトリクス内に活性成分はない。このカセットは生き
た細胞の培養および分析に特に設計されたので、流体構築物およびそのサブ成分
および機能的部分の全ては支持体に適合し、生きた細胞の培養を可能とする。生
きた細胞培養で設計されたサブ−成分および機能的部分の特定の形態は後に確認
される。
【０１１３】 好ましい実施形態において、本発明のカセットは、いずれのウェルが流動によ
ってアドレスされるかを制御もする圧力−駆動流動を提供するための外蔵ポンプ
を含む。この設計特徴は、多くの先行技術方法とは異なり、ポンピング方法が、
水性で、極性であって、蛋白質および塩を含有する細胞培地で使用された場合に
効果的ではないのではなく、または有害でないことを保証する。例えば、電子流
体力学ポンピングは極性溶媒で効果的ではない（マーク・マドー（Marc Madou）
,ファンダメンタルズ オブ ミクロファブリケーション, CRC プレス,ボッカ
ラトン（Fundamntals of Microfabrication,CRC Press,Boca raton）,1997，４
３３頁）。電気浸透圧には、典型的には、蛋白質のような荷電培地成分のある程
度の電気泳動分離が伴う。また、電気浸透圧は、典型的には、装置中で生きた細
胞の生理学に影響し得る１００Ｖ／ｃｍないし１０００Ｖ／ｃｍの範囲内の電場
強さの使用を要する。本発明の流体制御システムは、生物学的流体を用いる場合
、電気的に誘導される方法の不利を蒙らない。
【０１１４】 別の実施形態において、ポンプは内蔵であって、電気−駆動流動を利用し得る
が、電場はウェルのアレイのマトリクスに制限され、細胞が存在するウェルのい
ずれかを横切って電場勾配は適用されない。この実施形態は図４１に示され、こ
こに、２つの電極を用いて、異なる内蔵源容器（７３０）に対応する流体チャン
ネルのセグメントに沿って電場ポテンシャル差を適用する。その電極対を持つ各
チャンネルセグメントは動電学ポンプ（７４０）を形成する。これらの源容器（
７３０）はカスケード表面における充填ポート（７００）を介して培地および／
または化合物を供給することができる。容器およびポンプの間のバルブ（７２０
）は、対応する動電学ポンプがオフである場合は常に閉じられて、対応する動電
学ポンプがオンである場合は常に開いて、逆圧を維持し、各々、空気および流体
の取り込みを可能とする。電極１（７６０）に適用された電圧の制御を用いて、
対応するチャンネルセグメント中の流体の動電学的流動を誘導する。（ウェルの
マトリクスに最も近い）電極２（７８０）は、ウェルのマトリクスにおけるよう
に、接地ポテンシャルに維持されて、細胞に近くで発生するポテンシャル差およ
び／または電場は最小であるかまたは全くない。なぜならば、電場は細胞生理学
に影響することが知られているからである。別法として、動電学的ポンプはアレ
イから下流に位置させて、負圧ポンプとして働かせることができる。この実施形
態において、もしあれば、ポンピング作用によ培地の電気泳動は、それが既に細
胞によって使用され、廃棄容器に向かっている途中である後に培地に影響するに
過ぎないであろう。
【０１１５】 全ての実施形態において、流体の流動を制御するためのウェルのマトリクスの
外部にある内蔵または外蔵ポンプの使用は、ウェルのマトリクス内での能動バル
ブの必要性を除去し、このように、ウェルの近い間隔設定を妨げるであろうマト
リクス内のスペースを割り当てる問題を排除する。
【０１１６】 圧力制御による流体経路の制御は、水性、極性であり、蛋白質および塩を含有
する細胞培地と適合し、効果的である種々の拡散手段の任意の使用を可能とする
。また、これらの手段は装置上で最小のスペースを必要とし、ウェルの閉じた空
間を妨げない。
【０１１７】 米国特許第５，６０３，３５１号は直交チャンネルを含むが、チャンネルネッ
トワークが、反応ウェルにおいて２以上の試薬が合わさせるのを可能とするよう
に規定されず、むしろ試薬が系列的にウェルに供給されるようにする。本発明の
カセットの目的は、２以上の異なる流体を相互に露出するのではなく、系列的に
ウェル底部で培養された生きた細胞を２以上の異なる流体に露出することである
。
【０１１８】 本発明のカセットの流体チャンネルは源容器から各ウェルへの、および各ウェ
ルから２以上の廃棄容器への流体および化合物の輸送を提供する。各ウェルには
、別のインプットおよびアウトプットチャンネルを設けることができ（図２１）
、ｎ×ｎアレイ（０４０）につき２ｎ２チャンネル（１００、１２０）を生じる
。ｍの流体または蒸気混合物のｎ×ｎアレイへの流動を制御するには、ｍ＋ｎ２ のバルブまたはポンプが必要である（図２２）。しかしながら、大きなアレイで
は、このタイプの構築物についてのチャンネル、ポンプおよびバルブの数は実用
的ではなくなる。可変またはスイッチ可能圧力を有するポンプ（例えば、シリン
ジポンプ）はバルブ付きの加圧容器と機能的に同等である。したがって、ポンプ
、容器およびバルブの以下の議論においては、これらの構成要素は本発明の精神
を変更することなく置換できることが理解されるべきである。
【０１１９】 直交−チャンネルマルチレベル構築物 インプット（１００）およびアウトプット（１２０）チャンネルの直交非交差
アレイからなり、複数レベルを利用するカセットの構築物の好ましい実施形態が
開示される。このクラスの構築物内の特別の実施形態は図２３−２６および図３
３および３４に与えられる。
【０１２０】 この場合の構築物は、各ウェルにつき別々のインプットおよびアウトプットチ
ャンネルを持つ構築物のクラスと比較して、ウェルあたりにより少ない独立した
チャンネルしか要しないので、これらの直交−チャンネル構築物は、チャンネル
についての経路を収容するためのウェルの間で要する横方向スペース（１４０）
を最小化する。
【０１２１】 直交−チャンネルマルチレベル構築物はｎ２のウェルにアドレスするのに２ｎ
チャンネルを要するに過ぎない。好ましい実施形態において、行および列チャン
ネルそれ自体はそれらが交差しないように２つの区別される層中に形成される。
行チャンネルは列チャンネルの上方にあり、またはその逆である。これらの２つ
の層はウェル層の同一面にあるか（図２３および２４）、あるいはウェル層上方
の面中にある（図２５−２６および３３−３４）。他の実施形態において、２を
超える面を持つ構造が考えられる。
【０１２２】 最も好ましい実施形態において、最小ウェル間距離（１４０）が、各ウェルを
分離するある壁の厚みに対する光学的および物理学的要件によってのみ拘束され
るように、チャンネルはウェルの面の上方に置かれる。チャンネルをウェル上方
のレベルに置く利点は以下の実施例によって示される。０．４ｍｍ×０．４ｍｍ
であるウェルは、ウェル間の０．１ｍｍ壁に対する許容性をもって０．５ｍｍピ
ッチグリッド上に置くことができ、１０×１０ウェルアレイにつき５ｍｍ×５ｍ
ｍ領域を生じる。０．２ｍｍ幅の行および列チャンネルは、チャンネル間の十分
な距離を持つ装置の上方レベルにおいて容易に形成することができる。対照的に
、もし０．１ｍｍ壁を持つ０．２ｍｍチャンネルがウェルの面内で要し（および
行および列チャンネル層がウェルの面内で２つの別々の面に形成される）ならば
、ウェルピッチは０．８ｍｍまで増加する。これは１０×１０ウェルアレイにつ
き８ｍｍ×８ｍｍ領域を生じる。この実施例において、ウェル間のチャンネルの
変位は２．６のファクターだけアレイに要する面積を増加させる。各ウェルにつ
き別のインプットおよびアウトプットチャンネルを持つ異なる構築物では、ウェ
ル間で要する追加の空間はかなり大きい。
【０１２３】 ウェルのレベルの上方またはレベル内のチャンネルでは、水平（１６０）また
は垂直（１８０）結合チャンネルまたは通路が、各ウェル（ｊ，ｋ）からその対
応する行チャンネルｊおよび列チャンネルｋへ形成される。ガラス、半導体、ま
たはプラスチック材料からのかかる構造の製造は当該分野で良く知られている。
１つのそのような方法において、多工程層間プロセスを用い、二酸化ケイ素（Ｓ
ｉＯ２）を窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）層内にリソグラフィーにより形成する（タ
ーナー（Ｔurner）およびクレーグヘッド（Craighead）,プロク. SPIE(Proc.SPI
E) 3528:114-117(1998)）。構造の湿潤エッチング液への露出はＳｉＯ２を除去
して、エッチングされていないＳｉ３Ｎ４内にチャンネルネットワークを生じる
。
【０１２４】 直交−チャンネル構築物におけ流動の制御 行（Ａ、Ｂ、Ｃ等）および列（１、２、３等）の直交アレイにおいて、流体の
ウェル（ｊ，ｋ）へのおよびウェルからの流動は、例えば、正圧が行ｊに適用さ
れて、アウトプットチャンネルｋのバルブが開かれた場合（ここに、ｊおよびｋ
は、例えば、各々、行Ｄおよび列７を言う）に生じる。全行ｊの全てのウェルへ
の流動は、例えば、正圧が行ｊに適用されて、全てのアウトプットチャンネルの
バルブ（１、２、３等）が開かれた場合に生じる。同様の手法は列の全てのウェ
ルへの流動を生じるであろう。
【０１２５】 ここに議論される圧力は、現実には、雰囲気の常圧、さもなければ「ゲージ」
圧として知られているものに対する圧力差である。このように、正圧のバルブは
、それによって適用された圧力が常圧よりも大きい量であり；不圧のバルブは、
それによって適用された圧力が常圧未満である量である。これらの圧力は、各々
、正および負のゲージ圧といわれる。
【０１２６】 本明細書中で用いられる用語流体経路は、行ｊおよびｍ等および列ｋおよびｎ
等の流動制御装置を可能とすることによって流体の流動に付されたウェルの特定
の組｛（ｊ，ｋ），（ｊ，ｎ），（ｍ，ｋ），（ｍ，ｎ）…等｝を示す。２つの
行および２つの列の流動制御装置を可能とすると、４つのウェルを通っての流体
経路を生じることに注意されたし。これは、単一ウェルが関与する４つの経路よ
りもむしろ４つのウェルが関与する単一の流体経路とここでは定義される。
【０１２７】 能動バルブまたはポンプの数の減少 能動的に制御された流体制御装置（ポンプまたはバルブ付きの加圧容器）の種
々の組合わせを用いて、所望のウェル（０１０）または流体経路を通っての流動
を生じさせる。例えば、ｍの化合物は、ｍの正圧源容器またはポンプ（２００）
、バルブレスマニホールド（２４０）および気圧のバルブフリー廃棄容器（３０
０）を用いることによって単一ウェルに多重化することができる（図２７）。こ
のバルブレスマニホールド（２４０）はバルブ付きマニホールド［例えば、図２
８の（２６０）］によって置き換えて、ｍの源の間の流体の拡散を良好に制御す
ることができる。別法として、常圧のｍの源容器（２２０）に連結されたｍのバ
ルブ（２６０）付きの不圧廃棄容器またはポンプ（３２０）を用いることによっ
て同一の機能を達成することができる（図２８）。常圧の源容器の使用は、源容
器を通ってのガスの便宜なバルビングを可能として、培地中の溶解したＣＯ２と
Ｏ２の所望のレベルを確立し維持する。
【０１２８】 別の実施形態において、多孔性媒体を充填した廃棄容器は毛細管作用ポンプ（
３４０）として働き、不圧を提供する（図２８）。濡れの熱力学は、固体−液体
−気体の接触線によって境界が形成された液体−気体界面を横切って圧力を生じ
させる。毛細管作用のこの圧力を用いて、液体の列を、いずれかのマイクロチャ
ンネル経路から高表面積多孔性媒体へ吸い上げることができる。一連のそのよう
な不圧容器は、流動の制御のために多重化バルブ付きマニホールドを介してアレ
イに連結することができるか、あるいは単一の容器を、同時に全てのウェルのア
ウトプットチャンネルに密接にカップリングさせることができる。限定されるも
のではないが、シリガゲル技術、ゼオライトのような多孔性セラミック材料、親
水性（合成または天然）繊維のパッド、およびアルギネート、ポリ（ビニル）ア
ルコールゲル、アガロース、糖ポリアクリレートゲルおよびポリアクリルアミド
ゲルのような部分的に水和されたまたは凍結乾燥されたヒドロゲルを含めた多数
の多孔性媒体が当該分野で知られている。好ましい実施形態において、多孔性媒
体はシリガゲル技術に基づく。薄膜または濾過シートを用いて、マイクロチャン
ネルアレイから多孔性媒体を区切ることができる。この方法は、多孔性媒体の内
部領域が流体によって濡れるまでポンピング用の圧力を提供することができる。
多孔性媒体の適当な選択およびこの方法の設計によって、適切に大量の液体をポ
ンプ送液して、本発明のアレイシステムでの選択された測定を行うことができる
。
【０１２９】 別の実施形態において、図２７に示されたｍの正圧源容器またはポンプ（２０
０）のアレイを、ｌ×ｎインプット（４００）およびｎ×ｌアウトプット（４１
０）バルブマニホールドによってウェルのｎ×ｎ直交チャンネル（０４０）に多
重化される（図２９）。各ウェルについての別々のインプットおよびアウトプッ
トチャンネルを持つ構築物については、ｍ＋ｎ２のバルブまたはポンプがこの状
況で必要なことを明記されたし。再度、バルブレスマニホールド（２４０）をバ
ルブ付きマニホールド［例えば、図２８の（２６０）］で置き換えて、ｍの源間
の流体の拡散を良好に制御することができる。ウェル（ｊ，Ｋ）を通っての流動
はインプットバルブｊおよびアウトプットバルブｋが開いた場合に行われる。別
法として、ｌ×ｎインプット（４００）およびｎ×ｌアウトプットバルブ（４１
０）マニホールドによって図２８におけるように気圧のｍの容器（２２０）およ
び不圧廃棄容器（３２０または３４０いずれか）でもって同一機能を達成するこ
とができる（図３０）。
【０１３０】 洗浄チャンネル 好ましい実施形態において、ウェル｛（ｊ，ｋ）｝または列チャンネル｛ｋ｝
を通って進むことなく与えられた行ｊから廃棄容器に液体または気体のセグメン
トが通過するのを可能とする追加の列チャンネルｋ＊または列チャンネル｛ｋ＊ ｝の組によってｎ×ｎマイクロウェルアレイが増加される。これらの追加の列チ
ャンネル｛ｋ＊｝は洗浄チャンネル（１３０）といわれる。なぜなら、それらは
ウェルを通っての流動の必要なしに行チャンネルの洗浄を可能とするからである
。
【０１３１】 一般に、洗浄チャンネルｋ＊（１３０）は列チャンネルｋ（０１６）に対して
隣接してかつ平行に位置させることができるが、それらが直交する地点で行チャ
ンネルｊ（０１４）に通路を介して連結させることができる［対応するウェル（
ｊ，ｋ）に直接連結することができない］。１つの実施形態において、各列チャ
ンネルｋは関連する平行洗浄チャンネルｋ＊を有する（図３３および３４）。他
の実施形態において、行チャンネル｛ｊ｝の全組のための洗浄を提供するただ１
つの洗浄チャンネルがあり、あるいは列チャンネル｛ｋ｝のアレイ内に存在する
洗浄チャンネル｛ｋ＊｝のいずれかの組合わせがある。ただ１つの洗浄チャンネ
ルがある場合、それをアレイの最後の列チャンネルに隣接させて位置させるのが
好ましいであろう（ここにｋ＝ｎ）。
【０１３２】 図３５は、ウェル（ｊ，ｋ）を通っての流体流動の場合の、行ｊから洗浄チャ
ンネルｋ＊（ここに、ｋ＊は列チャンネルｋに直ぐに隣接する）への液体または
気体のセグメントをすすぐための方法の実施例を示す。この手法および構築物は
、この流体セグメントが、行チャンネルｊに沿って下流にあるウェル｛（ｊ，ｋ
＋１），（ｊ，ｋ＋２）等｝にわたって通過することなく廃棄容器に向けられる
のを可能とする。これは、与えられた化合物が１つのウェル（ｊ，ｋ）から他の
下流ウェル｛（ｊ，ｋ＋１），（ｊ，ｋ＋２）等｝への拡散を制限するのに望ま
しい（ここに、当該化合物は要求されないであろう）。加えて、後記するように
、気体セグメントをマイクロチャンネルミクロアレイに導入することによって拡
散を制御することができる。
【０１３３】 図３２は正圧源容器を使用する図２９のポンピングおよびバルビングスキーム
がいかにしてｎの行チャンネルおよび２ｎの列チャンネルの直交アレイ（ｎの通
常列チャンネル＋ｎの洗浄列チャンネル）で働くように拡大できるかを示す。こ
れは２ｎ×ｌアウトプットバルブマニホールド（４２０）を要する。一般に、付
加された各追加の洗浄チャンネルｋ＊については、１つの追加のバルブが、列チ
ャンネルに結合したバルブマニホールドに付加される。同様に、不圧廃棄容器を
使用する図３０の配列は洗浄チャンネル（１３０）を一体化させるアレイで働く
ように拡大することができる。
【０１３４】 デュアル−ポンプド設計 流体経路×｛（ｊ，ｋ），（ｊ，ｎ），（ｍ，ｋ），（ｍ，ｎ）…等｝を通っ
ての、より一般的にはいずれかの長さのチューブを通っての流動は、経路または
チューブの長さに沿って存在する連続的圧力勾配によって引き起こされる。流体
経路のインプットおよびアウトプットに適用された圧力によるこの圧力勾配の制
御は、経路の壁を横切っての流動の漏れがないことを必要とする。また、漏れは
薬物スクリーニング用のウェルに対する化合物の適当な付与量を危うくする。経
路の壁のシーリングは適用されるであろうゲージ圧に適したものでなければなら
ない。１分あたり大雑把に数ミリメートルの流動速度、数センチメートル以下の
経路長さ、および１００ｍｍ×１００ｍｍのオーダーのチャンネル断面では、ハ
ーゲンポアゼイ則は、必要な端部間圧力差ΔＰは１気圧（１気圧〜平方インチあ
たり１４ポンド）未満であることを予測する。それにもかかわらず、当該分野で
知られている種々の材料および構造が本発明の装置で実行できることを考慮する
と、隣接するウェル間の漏れ、システムの壁を横切って働くゲージ圧を低下させ
ることによって最小化される。この目的に向けて、本発明の装置は不圧廃棄容器
とともに正圧源容器（すなわち、「二重ポンプド」システム）を用いて、与えら
れた全端部間圧力差を達成するために適用しなければならない最大ゲージ圧を実
質的半分カットすることができる。
【０１３５】 「単一−ポンプドシステム、すなわち、一端で気圧に開かれ、他端で（正また
は負のゲージ圧力±ΔＰいずれかへ）ポンプ送液されるシステムでは、システム
の壁を横切って作用する圧力差はポンプド容器の位置、すなわち、図２７および
２９の（２００）または；図２８および３０の（３２０、３４０）」。漏れは最
大ゲージ圧のこれらの地点で最も起こるらしく、正圧は経路から外へ流体を除去
する傾向にあり、不圧は隣接ウェルまたはチャンネルから経路に流体を吸い込む
傾向にある（これは、隣接チャンネルおよびウェルが流動に付されない場合にゼ
ロのゲージ圧に保持されることを仮定する。システムの壁を横切っての圧力差を
制御する別の方法はそれらが流動下にない場合に隣接経路へマッチする圧力を適
用することである）。流動経路に沿っての中間点において、システムの壁を横切
っての圧力差は、各々、±ΔＰおよび正および負にポンプ送液されたシステムで
のゼロの間の値を有する。
【０１３６】 各々、インプットおよびアウトプット容器において圧力±ΔＰ／２を確立する
ことによって、同一の端部間圧力差ΔＰが経路を横切って働く。この場合、シス
テムの壁を横切って働く最小ゲージ圧は±ΔＰ／２であって、システムの対応す
る終点で起こる。さらに、もしウェルが経路の長さに沿ってインプットおよびア
ウトプット容器の間の中央点にほぼあれば、適応された装置内のゲージ圧はゼロ
に近い。経路の終点において、最大圧力差±ΔＰ／２はプラスチックチューブま
たはシリカの毛細管内の漏れなしに、より容易に保持される。システムの終点で
のみ起こるようであるので、漏れの検出は促進される。
【０１３７】 １つの実施形態において、デュアルポンピングシステムの２つのシリンジは同
一の直径および容量であり、それらは押す−引く配置において同一アクチュエー
タに連結しているので、各シリンジは同一直線距離を動き、移動の各増分につき
同一容量が交換される。いずれの特定の源化合物もアレイに押して入れられ、等
容量の廃棄流体が引き出される。このように、ｍの源シリンジのアレイはｍの不
圧廃棄容器のアレイを含有する。不圧廃棄容器のこのアレイは、ちょうど、源容
器のアレイが行列に対して多重化されるので、ｌ×ｍバルブレスマニホールドに
よって列チャンネルに多重化される。
【０１３８】 別の実施形態において、源および廃棄シリンジは異なる直径であり、異なる直
線速度で各シリンジを駆動する２つの別々のドライバーによってシリンジは制御
されなければならないが、各シリンジにおいて同一の容量変化を生ずる。例えば
、より小さな直径のシリンジを化合物につき使用でき、他方、より大きな直径の
シリンジを廃棄容器として使用し得る。もし直径の比率が２のファクターであれ
ば、小さなシリンジのドライバーが１つの直線ユニットを移動させて流体を除去
するにつれて、大きなシリンジのドライバーは直線ユニットの１／４のみを移動
させて流体を回収するが、交換された容量は同一である。図３１は「デュアル−
ポンプド」システムのこの実施形態の１つの特定の場合を示し、ここに、いずれ
かの特定の源シリンジポンプの作動にて、（例えば、コンピュータ制御によって
）協調して作動されなければならない１つの廃棄シリンジポンプのみがある。別
法として、不圧ポンプは図３１にも示される毛細管作用ポンプであり得る。毛細
管作用ポンプでは、ポンプの「作動」はバルブによって達成される。
【０１３９】 要約すると、デュアル−ポンプドシステムは以下の利点、 １）最大適用ゲージ圧力の低下、 ２）適用ゲージ圧力は経路の中央点近くで小さい、および ３）漏れは容易に検出され、システムの終点において最も起こるようである；
を有する。
【０１４０】 より高いレベルの多重化 ポンプ容器および直交チャンネルアレイの間のマルチ−ポート流動マニホール
ドの使用は、ｍの異なる流体または気体混合物にて、これらの種々の実施形態に
おけるｍの異なるポンプ（２００）または容器（２２０）が、ｎ×ｎウェルアレ
イ（００２）の各ウェル（ｊ，ｋ）において選択的かつ順次に流動を生じること
を可能とする。より一般的には、単一の流体経路｛（ｊ，ｋ），（ｊ，ｎ），（
ｍ，ｋ），（ｍ，ｎ）…等｝を規定するウェルの組はこのシステムによって規定
できる。ただ１つの液体または気体混合物の流動がある時点でただ１つの流体経
路を通じて起こり得る。異なる経路を通っての異なる液体または気体の混合物の
同時流動を可能とするより高いレベルの多重化が、流動マニホールドのより複雑
なシステムで可能である。そのようなシステムは本発明の設計の一般化として容
易に構築される。
【０１４１】 拡散の制御 この実施形態の原理は、バルブエレメント（５２０）および弁座（５４０）が
、一方向の流動を可能とし、流動が停止された場合に拡散を抑制することを可能
とするような形状とされることである。
【０１４２】 さらに、全てのバルブに対する復元力が「受動的に」かつ一定に適用される。
チェックバルブについての詳細な制御システムは必要でない。なぜならば、流体
圧力勾配の制御はそれによって個々のバルブが開かれる手段だからである。
【０１４３】 例えば、２ｎのマイクロチャンネルおよびｎ２ウェルの間の多数の開かれた経
路を持つ直交マイクロチャンネルの使用は、本発明のいくつかの実施形態におい
ては、ウェルおよびマイクロチャンネルの間での化合物の拡散を制御するための
さらなる方法によって増加させることができる。先行技術のシステムとは異なり
、本発明のミクロ流体システムは、ウェル間拡散の制御のために装置内に詳細な
制御システムを必要としない。内蔵バルブの能動的制御を要しないウェル間拡散
を制御する２つの例示的手段が開示される。これらの方法の双方は、ウェルのア
レイに対して外部にあって、このように、本発明の総じての設計の原理に適合す
るバルブ、ポンプおよびマニホールドからの流体流動制御によってウェル間拡散
をブロックする；より少ないチャンネルしか必要とせず、より小さなウェル間間
隔設定を可能とする流体構築物のクラスにおけるウェルのサブ−アレイの最適イ
メージング。
【０１４４】 第１の方法は異なる流体セグメントの間の空気のセグメントの挿入を使用する
。前記実施形態で与えられた正圧および／または負圧方法を使用して、これらの
空気セグメントを挿入する。一般に、特定の行｛ｊ｝および列｛ｋ｝または｛ｋ ＊ ｝を横切っての適当な配列での異なる圧力の適用は、インプットチャンネル｛
ｊ｝中の多数の別々の空気セグメントを多数の異なる流体の間に置くことができ
る。特に、また、行ｊ中の空気セグメントをこれらの２つのウェルの間に挿入し
維持しつつ、適当な配列決定は１つの流体セグメントを１つのウェル（ｊ，ｋ）
に向け、かつ直接的別の流体セグメントを別のウェル（ｊ，ｋ−１）に向けるこ
とができる。引き続いて、使用されていないウェルを通じ、または洗浄チャンネ
ルｋ＊（１３０）を介して空気セグメントをシステムから外に通過させることが
できる（図３５）。
【０１４５】 拡散制御の第２の方法は、チャンネルｊをウェル（ｊ，ｋ）および（ｊ，ｋ＋
１）に結合する各対の隣接通路（通路ｋおよび通路ｋ＋１）（１８０）の間の「
正常に閉じられた」チェックバルブ（５００）を用いる。同様に、チェックバル
ブは、洗浄列チャンネル｛ｋ＊｝を取り込む構築物で使用することができる。他
の実施形態において、ウェルをマイクロチャンネルに、または行チャンネルを洗
浄列チャンネルに結合する通路（１６０、１８０）内にチェックバルブを置くこ
とができる。これらのバルブは、圧力勾配がアレイの流体経路を横切って適用さ
れなければ閉じられる。次いで、選択された流体経路に沿って分布したバルブの
みが押されて開く。流動が停止されて、バルブが閉じた位置に復帰すると、バル
ブはウェルおよびマイクロチャンネル間の、または行チャンネルおよび洗浄チャ
ンネルの間の化合物の拡散を抑制する。その対応する弁座（５４０）中のバルブ
エレメント（５２０）を閉じる復元力は当該分野で知られているいずれかの数の
方法によって提供することができる。復元力の強さは、適当な流動速度（典型的
には、１ｃｍ／分未満）を生じる圧力勾配の適用に際してバルブを開かすことが
可能でなければならない。復元力の適用のための方法は、金属、半導体または有
機材料の変形；空気圧；静電力、磁気力、および重力による機械的力を含む。
【０１４６】 別の実施形態において、外部から適用された磁場勾配（６２０）は、磁性材料
を取り込むバルブエレメント（５２０）に対して復元力を誘導する。これは、限
定されるものではないが、図３７に示された常磁性ビーズ（６００）の使用（例
えば、ダイナル社（Dynal Corp.）によって供給）を含む。これらの常磁性ビー
ズ（６００）は、各行および列チャンネル内でかつそれに沿って製造されたミク
ロボールバルブ中のボールとして働く。米国特許第５，６４３，７３８号および
第５，６８１，４８４号は磁気により作動されたミクロボールチェックバルブを
記載する。しかしながら、これらの特許は、「求めに応じて」ボールバルブの閉
鎖を可能とし、いくつかの外部圧力によって課された流動を停止させるその目的
として有する能動的に制御されたバルブを特に記載する。本発明の場合には、ミ
クロ流動構築物システムに対する特別の利点は、温和な復元力が、アレイ全体に
わたってボールバルブの大きなアンサンブルに同時に適用され、能動的制御は要
しないことである。流体経路に沿っての選択されたボールの運動（バルブを開く
ことが望まれた場合には常に）は、流体それ自体を流動させる手段によって達成
される。ボールバルブは流体の流動によって制御され、流体の流動がボールバル
ブによって制御されるのではない。さらに、この実施形態においては、拡散を停
止するのに十分な温和なシールが得られる場合、他の方向とは異なり、シールが
１つの方向で得られないように、弁座は特に設計される。
【０１４７】 １つの実施形態において１つのミクロボールバルブは、チャンネルｊをウェル
（ｊ，ｋ）および（ｊ，ｋ＋１）に結合する各対の隣接通路（通路ｋおよび通路
ｋ＋１）の間に位置する。そのバルブを含む経路を横切って圧力勾配が適用され
る場合のみ、各ミクロボールバルブが開く。流体圧力が流動の方向にボールを移
動させる場合にその流動が停止されないように、一方側の弁座（５４０）の設計
は（例えば、溝にて）形状付与される。特定のボールバルブの部位において圧力
勾配が適用されない（および流体は流動されない）場合、磁気復元力はその常磁
性ボールを弁座（５４０）の他方側に対して逆に押し付けて（ここに、弁座はボ
ールに嵌合するような形状である）、マイクロチャンネルのその部分を横切って
の化合物の拡散を抑制する。全てのバルブが正常に閉じられるように、全アレイ
に適用された磁場勾配によってこの復元力が誘導される。
【０１４８】 別の実施形態において、外部から適用された磁場勾配（６２０）は、強磁性材
料を取り込むバルブエレメント（５２０）に対する復元力を誘導する。例えば、
精度のあるクロムスチールボールはｍｍ下ないし数ｍｍの直径の範囲にてグレン
・ミルズ社（Glenn Mills Inc.）,クリフント NJ（Clifton,NJ）から入手可能で
ある。
【０１４９】 図３８は、この設計原理を例示する形状の弁座の実施形態を示す。特に、外部
から適用された復元力がボールを左側に押し付けて弁座中の丸い開口に入れる場
合、ボールを通過した拡散は停止される。外部から適用された圧力によって流動
が作動された場合、ボールは右側に押されるが、ボールは流動を提示しない。な
ぜならば弁座の右側は卵形の形状であって、一方側に沿って溝−様変形を含み、
流体用の経路を形成してバルブのこの開いた位置にボールを回避するからである
。
【０１５０】 図３９は、本発明の全カセットに適用された単一の磁場勾配が、インプットチ
ャンネルのボールバルブの組およびアウトプットチャンネルのボールバルブの組
双方に対して力を誘導することができる実施形態を示す。
【０１５１】 １つの実施形態において、磁場勾配の方向はアレイの面に対して平行であるが
、行および列チャンネル双方に対して４５度の向きである。このように、各ボー
ルはその対応する弁座（５４０）の「閉じた」側の方向に力の成分を受ける。他
の実施形態において、磁場勾配がアレイの面に対して垂直に適用され、ボールバ
ルブは水平マイクロチャンネル内または垂直通路内で垂直向きに作動する。後者
の場合において（垂直通路内の垂直に作動されたボールバルブ）、通路構築物は
、再度、各ボールが、その対応する弁座（５４０）の「閉じた」側の方向の磁力
成分に付されるのを可能としなければならない。
【０１５２】 球状形状の強磁性または常磁性バルブエレメント（５２０）の実施例が与えら
れたが、同様に機能する他の形状および他の復元力を一般的に用いることができ
る。
【０１５３】 ウェルの寸法および特徴 別の形態において、本発明は、表面、ここに表面は複数の細胞結合位置を含有
し；試薬を複数の細胞結合位置に送達するための流体送達系、ここに、流体送達
系は基板と接合するマルチレベルチャンバーを含み、ここに、マルチレベルチャ
ンバーはミクロ流体インプットチャンネルおよびアウトプットチャンネルならび
にミクロ流体インプットチャンネルおよびアウトプットチャンネルと流体結合し
た複数の流体位置の直交アレイを含み、複数のウェル、ここに、個々のウェルは
１つの細胞結合位置および１つの流体位置の接合によって規定されたスペースを
含み、ここに、ウェルは１ｃｍ２あたり少なくとも約２０のウェルの密度で存在
することを有する基板を含むことを特徴とする細胞スクリーニングのためのカセ
ットを提供する。好ましい実施形態において、ウェル密度は１ｃｍ２あたり約２
０ウェルおよび１ｃｍ２あたり約６４００ウェルの間である。
【０１５４】 好ましい実施形態において、本発明のこの形態のカセットは、さらに、ミクロ
流体インプットチャンネルと流体結合した１以上のインプットマニホールドなら
びにミクロ流体アウトプットチャンネルと流体結合した１以上のアウトプットマ
ニホールドを含む。別の好ましい実施形態において、本発明のこの形態のカセッ
トは、さらに、１以上のインプットマニホールドと流体結合した少なくとも１つ
の源容器および１以上のアウトプットマニホールドと流体結合した少なくとも１
つの廃棄容器を含む。これらの実施形態における種々の制御装置は前記した通り
である。
【０１５５】 ウェルの形状は本発明の異なる実施形態において異なり得るので、本発明にお
けるウェルの形状の幾何学に制限は課されない。矩形ウェル形状はアレイ中のウ
ェルの間の最小距離および面積を可能とするが、この形状は、ウェルのコーナー
領域において細胞培養または流体特性の潜在的差の不利を有する。したがって、
円状である、丸いコーナーを持つ矩形状であるウェル形状が本発明の好ましい実
施形態で使用される。
【０１５６】 本発明のアレイシステムは、薬物スクリーニングアッセイシステムにおける細
胞の視野内での個々の細胞のイメージングのために設計される。細胞の視野内で
の各個々の細胞の並行した測定を含むイメージングアッセイでのスクリーニング
は高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）と言われる。なぜならば、細胞内プロセス
についての詳細な情報が単一細胞の像内に含有されるからである。より低い分解
能のイメージングまたは細胞の集団にわたってシグナルを積分するよりディテク
タでのスクリーニングを、それがより速いゆえに高スループットスクリーニング
（ＨＴＳ）と言う。ＨＣＳにおいて、細胞は、典型的には、５μｍないし１５μ
ｍの範囲にある長軸の長さで形状が球形または楕円体である細胞の核を像形成す
ることによって同定される。本発明で使用される細胞アレイは、通常の９６−ウ
ェルプレートと比較してより高い密度のマルチウェルフォーマットを用いること
によってＨＣＳの速度を最適化する。
【０１５７】 ＨＣＳでは、統計学的に関連する試料を提供する細胞の数ならびに単位表面積
あたりに要求される細胞の数は、アッセイのタイプおよび培養されるべき細胞の
タイプに応じて変化する。このように、各アッセイについての統計学的基準によ
って要求されるウェルの最小サイズは異なる。それにもかかわらず、最小または
最適ウェルサイズがいかなるものであっても、ウェルが適切な像分解能で読むこ
とができて個々の細胞核を解像することができる速度は本発明の装置によって最
適化され、これはいくつかのウェルが一度に並行して像形成されるのを可能とす
る。もしウェル間に最小の余分なスペースしかなく、全像内の細胞平板培養面積
がしたがって最大化されればこれは最も効率的になされる。
【０１５８】 さらに、本発明のアレイシステムは、同一の光学イメージング細胞ベーススク
リーニングシステムに対してＨＴＳおよびＨＣＳ双方の柔軟性のある実行を最適
化する。必要な画素密度（１ミクロンあたりの画素）はＨＴＳではより低く（例
えば、１ミクロンあたり０．００１ないし０．１画素）、ＨＣＳではより高い（
例えば、１ミクロンあたり０．１ないし４．０またはそれ以上の画素）。本発明
のシステムはＨＴＳおよびＨＣＳのシームレス組合わせ使用を提供し、ＨＴＳで
同定された「ヒット」もまたより詳細な分析のためにＨＣＳモードで読まれる。
事実、同一プラットフォームでのおよび同一試料でのＨＣＳの利用可能性は、Ｈ
ＴＳモードで同定された「ヒット」に関連する情報を大いに増加させる。それに
もかかわらず、ＨＣＳの最も速い可能な速度は、ＨＣＳが使用される場合常に最
大全スクリーニングスループットを可能とするのに有利である。アレイの最大ウ
ェル密度と組合わせてＨＣＳで要求される最小画素密度は、ウェルがＨＣＳモー
ドで読むことができる最大速度を規定する２つの非常に重要なパラメータである
。本発明は、本発明のアレイシステムの設計がいかにしてこのＨＣＳ速度ならび
にＨＴＳ速度を最大化できるかを記載する。
【０１５９】 ９６−ウェルのマイクロプレートでの使用では、通常の顕微鏡イメージングシ
ステムは各７ｍｍ直径のウェルの中心にある０．１ｍｍないし１０ｍｍの幅であ
る四角形の視野を像形成できる。ウェルは系列的に像形成されるか「読まれる」
。ステージの各位置において、典型的には、ウェルのただ１つの領域が読まれる
。（ＨＴＳまたはＨＣＳモードいずれかで）全アレイを読むためには、試料ステ
ージはマイクロプレートを少なくとも９６回移動させなければならない。
【０１６０】 本発明において、本発明者らは多くのウェルが一度に読まれる新規な細胞スク
リーニング方法を規定する。本発明のアレイは、９６−ウェルのマイクロプレー
トにおけるよりも大雑把に１０倍小さなウェル幅およびウェル間距離を有するの
で（幅がミリメートル下であり、全プレート寸法が数センチメートル幅よりもむ
しろ数ミリメートルであるウェル）、本発明で開示されるもののような細胞スク
リーニングシステムは同時に多くのウェルを像形成できる。このように、試料ス
テージはプレートあたりより少ない回数しか移動されず、いくつかのウェルは並
行して読まれる（図３９）。
【０１６１】 これは、各サブアレイの全てのウェルからのデータを並行して取得しつつ、全
ミクロウェルアレイ（０４０）の「サブアレイ」（０２０）の系列的像形成を実
質的に含む。例えば、３×３ウェルサブアレイの像形成は試料ステージの９倍少
ない移動を必要としデータ取得の大雑把に９倍速い速度を可能とする。
【０１６２】 与えられたＣＣＤディテクタアレイ（０８０）では、光学系（０６０）の倍率
は、ディテクタ上に投影されたサブアレイ（０２０）の面積を決定する。例えば
、１ミクロンあたり１画素の像画素密度は、１０×光学倍率および１０μｍ×１
０μｍエレメントの１０００×１０００画素ＣＣＤアレイを用いることによって
ウェルの１０００μｍ×１０００μｍサブアレイにつき達成される。第２の実施
例において、ウェルの２０００μｍ×２０００μｍサブアレイを同一倍率で２０
００×２０００画素ＣＣＤアレイに像形成させて同一の像画素密度を得ることが
できる。第３の実施例において、１．０×光学倍率および１０μｍ×１０μｍエ
レメントの１０００×１０００画素ＣＣＤアレイを用いることによって、１ミク
ロンあたり０．１画素の像画素密度がウェルの１０ｍｍ×１０ｍｍサブアレイに
つき達成される。第４の実施例において、アレイの１０ｍｍ×１０ｍｍサブアレ
イを２．０×倍率において２０００×２０００画素ＣＣＤアレイに像形成させて
同一像画素密度を得ることができる。
【０１６３】 以下に、本発明者らは、サブアレイの像形成を最適化する本発明にしたがって
ウェルサイズおよび間隔設定の特別の実施形態の実施例を与える。これらのウェ
ルサイズは、アレイの各位置内の所望の数の細胞結合部位に結合した所望の数の
細胞を含有するのに十分に大きくなければならない。細胞結合部位で培養すべき
所望の細胞密度の考えられる範囲（すなわち、非常に広い間隔を設けた細胞の、
または密集単層の培養が望ましいであろう）のため、所望のウェルサイズは、直
径が約１０μｍの非常に小さな細胞結合位置にただ１つの細胞を含有するもの（
すなわち、２０ないし５０ミクロンのウェルサイズ）から、１つの大きな細胞結
合部位またはアレイの単一位置を含む多くの細胞結合部位のアレイを含有するも
の（すなわち、１ないし２ｍｍのウェルサイズ）までの範囲であり得る。前者の
場合はより高いウェル密度に導き、後者はより低いウェル密度に導くことができ
る。
【０１６４】 高いおよび低い両ウェル密度では、および１または多くの細胞結合部位を含有
するウェルでは、本発明によるミクロ流体構築物のクラスは、ウェルの最適間隔
設定、ウェル間の最小の余分なスペース、およびサブアレイにおいて同時に像形
成でき、かつ依然として像中に適切な画素分解能を得ることができるウェルの最
大数を可能とする。
【０１６５】 本発明者らは、今回、サブアレイサイズ、光学倍率、および画素分解能の好ま
しい範囲では、かつ本明細書中に記載するミクロ流体構築物の利点に基づき、い
かにして本発明の装置が、ウェルを像形成しまたは読み取ることができるスピー
ドの大きな増加を可能とするウェルサイズおよび間隔設定を支持するかを説明す
るために前記に掲げた光学分解能の４つの実施例を用いる。さらなるサブアレイ
サイズ、光学倍率、および画素分解能は本発明の方法および装置によって支持さ
れる。本発明の範囲は利用可能な画素の数において当該分野の現在の状態によっ
て制限されず、またエレクトロニックイメージングシステムにおける画素サイズ
においても限定されない １．前記した第１の実施例では、ウェルの１０００μｍ×１０００μｍサブア
レイが（１ミクロンあたり１画素の像分解能にて）１０００×１０００画素ＣＣ
Ｄカメラに像形成される。本発明者らは、今回、本発明によって支持されるウェ
ルサイズおよび密度の４つの実施例を与える。（ａ）第１に、２００μｍ−厚み
の壁および１ｃｍ２あたり４００ウェルのウェル密度を持つ３００μｍ×３００
μｍウェルの２×２サブアレイ。４の群におけるこれらのウェルを像形成して、
プレートを一度に１ウェルで読み取るのに比較して４倍のスピードの増加を生じ
る。（ｂ）第２に、１００μｍ壁を持つ２００μｍ×２００μｍのウェルの３×
３サブアレイはスピードおよび１ｃｍ２あたりで１１１１ウェルのウェル密度の
９倍増加を生じる。単位面積あたりのウェルの数は、現在の最高密度の商業的マ
イクロプレート（１５３６ウェルプレート）によって提供されるものの８０倍大
きいファクターである。（ｃ）第３に、１００μｍ×１００μｍウェルおよび１
００μｍ壁の５×５サブアレイは、２５倍のスピードの増加および１ｃｍ２あた
り２５００ウェルの密度を生じる。（ｄ）第４に、なおさらに高いウェルの密度
およびより大きなスピードの利点では、ウェルは１００μｍ壁を持つ２５μｍ×
２５μｍとすることができ、８×８サブアレイ、６４倍のスピード増加、および
１ｃｍ２あたり６４００細胞のウェル密度を生じる。
【０１６６】 ２．（１ミクロンあたり１画素の像分解能での）２０００×２０００画素ＣＣ
Ｄカメラに像形成されたウェルの２０００μｍ×２０００μｍサブアレイでは、
ウェル密度の１つの追加の実施例が、前記で考えられた４つの実施例以外に考え
られる。（ａ）まず、２００μｍ−厚みの壁を持つ８００μｍ×８００μｍウェ
ルの２×２サブアレイは４倍のスピード増加および１ｃｍ２あたり１０００ウェ
ルのウェル密度を生じる。単位面積あたりのウェルの数は、現行の最大密度の商
業的マイクロプレート（１５３６ウェルプレート）によって提供されるものより
も５倍大きい因子である。（ｂ）第２に、２００μｍ−厚みを持つ３００μｍ×
３００μｍウェルの４×４サブアレイは、１６倍のスピード増加および１ｃｍ２ あたり４００ウェルのウェル密度を生じる。（ｃ）第３に、１００μｍ壁を持つ
２００μｍ×２００μｍウェルの６×６サブアレイは、３６倍のスピード増加お
よび１ｃｍ２あたり９００ウェルのウェル密度を生じる。（ｄ）第４に、１００
μｍ壁を持つ１００μｍ×１００μｍウェルの１０×１０サブアレイは、１００
倍のスピード増加および１ｃｍ２あたり２５００ウェルのウェル密度を生じる。
（ｅ）第５に、１００μｍ壁を持つ２５μｍ×２５μｍの１６×１６サブアレイ
は、２５６倍のスピード増加および１ｃｍ２あたり６４００ウェルのウェル密度
を生じる。
【０１６７】 ３．（１ミクロンあたり０．１画素の像分解能での）１０００×１０００画素
ＣＣＤカメラに像形成されたウェルの１０ｍｍ×１０ｍｍサブアレイでは、本発
明者らは、再度、前記実施例１に記載されたウェルサイズおよび密度の４つの場
合を記載する。（ａ）まず、２００μｍ−厚みの壁を持つ３００μｍ×３００μ
ｍウェルの２０×２０サブアレイは、４００倍のスピード増加および１ｃｍ２あ
たり４００ウェルの密度を生じる。（ｂ）第２に、１００μｍ壁を持つ２００μ
ｍ×２００μｍウェルの３０×３０サブアレイは、９００倍のスピード増加およ
び１ｃｍ２あたり１１１１ウェルのウェル密度を生じる。前記したように、この
場合は、現行の最大密度の商業的マイクロプレートによって提供されるものより
も８０倍大きいウェル密度を支持する。（ｃ）第３に、１００μｍ壁を持つ１０
０μｍ×１００μｍウェルの５０×５０ウェルサブアレイは２５００倍のスピー
ド増加および１ｃｍ２あたり２５００ウェルのウェル密度を生じる。（ｄ）第４
に、１００μｍの壁を持つ２５μｍ×２５μｍウェルの８０×８０サブアレイは
、６４００倍のスピード増加および１ｃｍ２あたり６４００ウェルの密度を生じ
る。なお高いウェルの密度およびより大きい（２５００倍）スピードの利点のた
めには、ウェルは、１００μｍ幅であるウェルを分離する壁を持つ１００μｍ×
１００μｍとすることができ、サブアレイあたり２５００ウェル、および１ｃｍ ２ あたり２５００ウェルを生じる。
【０１６８】 ４．（１ミクロンあたり０．１画素の像分解能での（２０００×２０００画素
ＣＣＤカメラに像形成されたウェルの１０ｍｍ×１０ｍｍサブアレイでは、１０
０、４００、１１１１、２５００および６４００ウェルｃｍ２の前記実施例２か
らの場合が再度適用されるが、サブアレイは各側で１０倍広いので１００倍大き
いスピードの増加を生じる。このように、１００、４００、１１１１、２５００
および６４００ウェル／ｃｍ２のウェル密度についてのスピード増加は、１０ｍ
ｍ×１０ｍｍアレイにおいて、各々、４００×、１６００×、３６００×、１０
０００×および２５６００×である。
【０１６９】 以下の表は種々の他の装置についてのウェルピッチを比較する。
【０１７０】
【表１】 ＊見積もったスピード増加は、各ウェルを別々に像形成することによる像形成と
比較したサブアレイによって全アレイが像形成できるスピードの比較である。
【０１７１】 本発明のミクロ流体装置のこれらの特定の形態の全て−直交チャンネル、マル
チレベル構築物、高ウェル密度、これらの構築物への流体流動制御、ウェルの空
間的に最適化されたサブアレイへのウェルの配置、および化合物のウェル間拡散
の制御の任意の手段は、細胞培養培地（生物学的マクロ分子および塩を含有する
極性水性溶液）の使用と、培地中での溶解された酸素および二酸化炭素ガスの生
理学的レベルの維持と、および所望の生物学的温度（典型的には３７℃であるが
、１５℃ないし４０℃のほぼ範囲の他の温度は特定の細胞タイプで望ましいであ
ろう）の維持と適合する統合システムを形成するように特異的に選択され、設計
される。
【０１７２】 特に、細胞培養培地は所望のレベルの温度および溶解した二酸化炭素および酸
素に対して外蔵容器中で平衡化することができる。このように、外蔵容器および
バルブを用い、培地をマイクロチャンネルを通ってウェルへと移動される。雰囲
気からのこれらのマイクロチャンネルおよびウェルのシーリングは、ガスの分圧
が、外部容器の平衡化によって制御されるのを可能とする。好ましい実施形態に
おいて、ウェル内の培地中の二酸化炭素のレベルは、装置へのその流動に先立っ
て培地を平衡化させることによって、および／または二酸化炭素および酸素の混
合物をそれがウェル内に入るにつれて培地と交換することによって確立し、維持
することができる。生きた細胞培養のための異なる環境的に制御された多数のチ
ャンバーが存在する（米国特許第５，５５２，３２１号および第４，９７４，９
５２号；ペイン（Payne）ら，ジェ.ミクロスコピー（J.Microscopy） 147:329-3
35(1987);ボルツ（Boltz）ら，チトメトリー（Cytometry）17:128-134(1994);モ
ーリス（Moores）ら，プロック. ナショナル. アカド. サイ.(Proc.Natl.Acad.S
ci.)93:443-446(1996)；ネーチャー バイオテック.（Nature Biotech.）14:362
1-362(1996)）。
【０１７３】 さらなる好ましい実施形態において、全基板の温度は、ヒータと接触させるか
またはヒータを一体化させて構成し、温度センサと接触させることによって制御
される。エレクトロニック温度制御システムは、ヒータを調節して選択された温
度設定点を達成する。このように、本発明で記載されたミクロ流体アレイシステ
ムの設計は、外部インキュベータシステムなしに生きた細胞培養を支持する方法
で容易に用いられる。図１２はいかにして本発明がカセットの自動読み取りを提
供するかを示す。カセットは、蛍光リーダー装備４４における読み取りの前およ
び後に２つの保存区画（４８および５４）内で制御された環境条件下に保たれる
。蛍光リーダー装備によって読まれつつ、システムはカセットのウェル内の細胞
培養培地中の溶解されたガスの適当な温度および組成を維持する。ウェル内の温
度制御は、蛍光リーダー装備のカセット内で装置および温度センサを加熱するこ
とによって供される。ウェル内の溶解ガス組成の制御は、カセットのウェルへの
培地の流動に先立って、（商業的に入手可能な）予め混合された空気および二酸
化炭素の源での培地の平衡化によって供される。ガス分圧を調節するためのいず
れのタイプのコントローラも本発明で用いることができる。好ましい実施形態に
おいて、システムは、細胞培養培地および／またはテスト化合物を含有する容器
または複数容器に結合された予め混合されたガス源を含むガスコントローラを含
む。ガス圧力レギュレーターおよび流動制御バルブは、このガス混合物の流動の
速度および連結された流体容器中のその圧力を制御する。ガス混合物の流体での
この平衡化はカセットに内蔵されたまたは外蔵された容器中で行うことができる
が、いずれの場合においてもウェルのマトリクスの外部で行うことができる。
【０１７４】 本発明は、高スループットおよび／または高含有量細胞ベーススクリーニング
を行うのに必要な時間の量を減少させる装置および方法についての分野における
要求を満足する。また、本発明の装置は手づかみの臨床装置のための細胞支持体
システムとして理想的に適合する（すなわち、小型化された像形成細胞ベースア
ッセイシステム）。薬物発見産業はすでに９６−ウェルのマイクロプレートを用
いており、３８４−ウェルプレートの使用に向けて移り変わるところである。１
５３６ウェルまでを備えたプレートが考えられる。このように、本発明の物のよ
うな、より高い密度のプレートの使用からスループットおよび経済性双方におい
て大きな利点がある。
【０１７５】 本発明の細胞アレイにおける細胞の密封された封じ込めは、ポータブルであっ
ていずれの向きでも使用できる厳しいシステムを提供する。軍事的および民間の
トキシンテストでは、本発明の装置は２つの主要な利点を提供するであろう。ま
ず、細胞機能に基づくトキシンテストは分子構造に基づくトキシンテスト（例え
ば、質量分析または光学的分光学と比較して有利である。なぜならば、それは、
その毒性に対するリンクが知られていないかまたは他の条件に依存し得る化合物
の関連特性よりもむしろ組織に対する化合物の最終的な効果をテストするからで
ある。第２に、細胞機能ベースのセンサについての自動化され、小型化され、頑
丈でポータブルなフォーマットは、大きなロボットピペッティングシステムによ
って充填され大きな顕微鏡リーダーによって読まれた大きなマイクロプレートを
含む現在の技術水準と比較して有利であろう。
【０１７６】 加えて、単純なプラスチックマイクロプレートのような先行技術装置では可能
でなかった本発明の装置に他のアッセイ能力を取り込むことができる。例えば、
質量分析または毛細管電気泳動分析装置、またはＤＮＡおよび／または蛋白質分
析についてのシステムを本発明の装置に取り込んでテスト化合物の化学的および
構造的パラメータを測定することができる。そのような取り込みは、ＨＣＳまた
はＨＴＳシステムによって測定された細胞ベースの機能的パラメータを補う情報
を提供するであろう。慣用的マイクロプレートでは、そのような追加のアッセイ
機能はプレートの外部にあり、したがって、マイクロプレートからの試料の移動
および分析器具それ自体のための広範な追加の器具を必要とする。本発明の統合
された流体工学を備えた小型化フォーマットにおいて、試料は、チップ上または
一体的に結合された第２のチップ上のミクロ分析システムに一体的にポンプ送液
される。そのようなミクロ分析チップはコストを低下させ、細胞ベースの分析の
スピードを劇的に増大させるであろう。この意味において、ミクロスケールの生
きた細胞分析システムとミクロスケールの化学的分析システムとの統合は、現存
の方法および装置よりも優れた大きな改良を提供すると予測される。
【０１７７】 実施例４ 細胞パターニング その天然構造におけるポリマーおよびガラス表面は、数十年の間、細胞増殖基
材として用いられてきた。異なる技術を利用して、それらの材料の表面化学を調
整して、それらを、細胞接着分子の吸着；材料のスルホン化（欧州特許出願５７
６１８４）；ＲＧＤのごとき細胞外マトリックス蛋白質断片のコポリマーブレン
ド（米国特許第５，７３３，５３８号）；およびシラン（米国特許第５，０７７
，０８５号）またはチオール（米国特許第５，７７６，７４８号）のごとき（溶
液化学を用いる）さらなる化学的修飾のための表面の（溶液化学を用いる）化学
的酸化を含めて、細胞接着に魅力あるものとされてきた。
【０１７８】 これらの基材の表面を調整して、それらを細胞接着に魅力あるものとすること
に加えて、細胞接着のために表面を反発性とする技術が開発されてきた。細胞反
発表面は、数日間細胞反発を示す、極端に疎水性の表面（接触角＞９０゜）を利
用することによって達成されてきた（デユルシー（Dulcey）ら., サイエンス（S
cience）252：551(1991)）。より広く利用される製法は、共通の連結化学を介し
て糖および酸素−豊富部位を表面に固定化することによって、極端に親水性の表
面（接触角ほぼ０゜）を使用する。これらの表面は、分解および細胞接着を行う
前に、細胞反発のより長い期間を示す。細胞反発で最も利用される分子は酸素が
豊富なポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、基材を化学的
に活性化させてポリ（エチレンイミド）−ＰＥＧ分子と反応させ（ブリンク（Br
ink）, コロイズ アンド サーフェーシズ（Colloids and Surfaces）, 1992.
66:p.149-156）、活性化された表面をアミノ化し、それをＰＥＧ−エポキシドの
ごとき二官能性親電子分子と反応させ（バーグストローム（Bergstrom, K.）,
ジャーナル オブ バイオメディカル マテリアルズ リサーチ（Journal of B
iomedical Materials Research）, 1992.26：p.779-790；ＷＯ ９８／３２４６
６ ＥＰ０５７６１８４，ニルソン（Nilsson, D.）, イン メソッズ イン
エンザイモロジー（in Methods in Enzymology）, 1984.104：p.56-69； ソフ
ィア（Sofia, S.）, マクロモレキュールズ（Macromolecules）, 1998.31:p.505
9-5070）、ＰＥＧ−ベンゾフェノンおよびＰＥＧ−スチレンコポリマーブレンド
のごとき光不安定ＰＥＧ−コンジュゲートを介して光化学的に（ベッカー（Beck
er）,マクロモレキュラー ケミストリー（Makromolecular Chemistry）, 1982.
3:p.217-223；米国特許第５，５０２，１０７号）行うことを含めた製法によっ
て、ポリマーおよびガラス基材に付着させることができる。
【０１７９】 これまでに述べた技術は、細胞の引力または細胞の反発部位の１つを含有する
ホモ−単層に導くであろう。前記技術の組合せはある種のヘテロ−単層に至るこ
とができる。もしこれらの細胞接着および細胞反発合図の位置決定が高度に制御
できるならば、細胞は選択された基材上にパターン化することができる。細胞パ
ターニングはシラン（米国特許第５，０７７，０８５号）、チオール（米国特許
第５，７７６，７４８号）およびアジド（米国特許第５，５９３，８１４号）を
利用してガラスおよび金属化ガラス基材上で達成されてきた。これらの製法は、
多工程の装備の集中的なプロセスを用いる細胞の選択的位置決定、および／また
は分子の深紫外線アブレーションのごとき再現性のない技術、および／または機
械的スタンピングによる印刷を提供し、および／または基材の光学的性質を変化
させる厚みが１０ナノメーター（ｎｍ）のポリマー層を要する。
【０１８０】 かくして、基材の光学的性質を低下させないガラスおよびプラスチックのごと
き耐久性基材上での細胞パターニングのための、ならびに細胞パターニング基材
それ自体のための提供可能な、容易で、装備無反応で、再現性のある製法に対す
る要望が当該分野にある。ガラスおよびシリコンウエハのためのほとんどの表面
修飾プロセスは、用いられる厳しい溶媒の性質のためプラスチックに使用できな
い。チオールはプラスチックへのコーティングには適しない。というのは、基材
とで配位結合を形成するために新造金属を必要とするからである。プラスチック
へのコーティングに適用できるが、シランは、基材とで共有結合を形成するため
に、ガラスおよびシリコンによって呈されるごとく、ヒドロキシル化表面を必要
とする。
【０１８１】 かくして、１つの態様において、本発明は選択的細胞パターニングのための基
材を製造する新規な製法を提供する。１つの実施形態において、製法は、 ａ）表面を持つ基材を供し、ここに、表面は反応性ヒドロキシル基を含有し； ｂ）基材の表面のヒドロキシル基を、ヒドロキシ反応性部位および求核部位を
含む二官能性分子と接触させて、単層を形成させ； ｃ）ステンシルを基材に適用し； ｄ）親電子細胞反発部位を単層の露出領域に適用して、細胞反発部位および工
程ｂで沈積させた二官能性求核体の間に共有結合を形成させ、細胞反発位置を形
成させ； ｅ）ステンシルを除去し；次いで、 ｆ）細胞接着分子を基材に適用して、細胞結合位置を生成させ、ここに、細胞
接着分子はステンシルが接触した位置においてのみ基材と結合する； ことを含む。
【０１８２】 もう１つの実施形態において、製法は、 ａ）表面を持つ基材を供し、ここに、表面は基材の表面の反応性ヒドロキシル
基を含み； ｂ）基材の表面のヒドロキシル基を、ヒドロキシル−反応性部位および求核部
位を含む二官能性分子と接触させて、単層を形成させ ｃ）ステンシルを基材に適用し； ｄ）細胞接着性分子を単層の露出領域に適用して、細胞結合位置を生じさせ； ｅ）ステンシルを除去し；次いで、 ｆ）親電子細胞反発部位を基材に適用して、細胞反発位置を生じさせ、ここに
、細胞反発部位は、ステンシルが接触した位置においてのみ、工程ｂで沈積した
二官能性求核体とで共有結合を形成する； ことを含む。
【０１８３】 表面反応性ヒドロキシル基は天然に存在することができるか、あるいは当該分
野で知られたいずれかの技術を介して導入することができる。例えば、ポリマー
またはガラスは、それらが、オルガノシランと反応して共有結合Ｓｉ−Ｏ−基材
（シロキサン）結合を生じる表面ヒドロキシル基を表すように酸化することがで
きる（米国特許第５，０７７，０８５号）。
【０１８４】 好ましい実施形態において、酸化は、酸素をドープしたラジオ周波数グロー放
電を用いて達成することができる酸素プラズマ処理により達成される。この放電
は、バックグラウンドガス（酸素）と反応して、ラジオ周波数における時間−変
化電場下でフリーラジカルを生じる荷電粒子（電子および陽イオン）を生成する
ことができる装置で達成される。試料は円筒形リアクターに入れられ、最小量の
酸素ガスが導入され、荷電粒子は平行な板の電極の間を回転し、その結果、Ｏ2
結合が切断する。この切断の後、高エネルギーフリーラジカルは自己をポリマー
骨格に挿入することができ、その結果ヒドロキシル基の中での種々の酸素部位が
形成される（米国特許第５，３５７，００５号；米国特許第５，１３２，１０８
号） 本明細書中で用いるごとく二官能性分子は、 （ａ）限定されるものではないが、シラン、カルボキシメチル基、スクシンイ
ミド、スクシンイミジルスクシネート、ベンゾトリアゾールカルボネート、グリ
シジルエーテル（またはエポキシド）、オキシカルボニルイミダゾール、ｐ−ニ
トロフェニルカルボネート、アルデヒド、イソシアネートおよびトレシレートを
含めたヒドロキシル−反応性親電子体；ならびに （ｂ）限定されるものではないが、スルフヒドリル基、アミン基、ヒドロキシ
ル基または蛋白質もしくはその断片、ペプチド、および細胞表面受容体のための
合成リガンドを含めた求核体、ここに求核体は他の分子および／または細胞に結
合することができるもの を含む。
【０１８５】 １つの実施形態において、二官能性分子はオルガノシランを含む。ここに、シ
ランは親電子体であり、求核体は、限定されるものではないが、スルフヒドリル
基、アミン基、ヒドロキシル基、または蛋白質、ペプチド、および細胞表面受容
体のための合成リガンドを含み、ここに親電子体は他の分子および／または細胞
に結合することができる。本明細書中で用いるごとく、オルガノシランはより大
きなクラスの分子に該当し、これは自己−組み立て（ＳＡ）フイルムを形成する
能力を有する。この分子の一般式はＲnＳｉＸ4-nを含み、ここに、ｎ＝１、２ま
たは３；Ｘ＝Ｃｌ、ＯＣＨ3またはＯＣ2Ｈ5、およびＲは前記した求核体である
。
【０１８６】 好ましい実施形態において、二官能性分子はアミノシランを含み、ここに、シ
ランは表面ヒドロキシル基に付着する親電子体であり、アミン基は他の分子およ
び／または細胞に結合することができる求核体である。
【０１８７】 より好ましい実施形態において、アミノシランは、限定されるものではないが
、トリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン、トリメトキシシリルエチ
レンジアミン、アミノプロピルトリエトキシシラン、トリメトキシアミノプロピ
ルシラン、またはトリクロロシリルエチレンジアミン、アミノプロピルトリクロ
ロシランのごときクロロシランを含むメトキシまたはエトキシシランよりなる群
から選択される。最も好ましい実施形態にておいて、アミノシランはトリメトキ
シシリルプロピルジエチレントリアミンである。
【０１８８】 本明細書中で用いるごとく、細胞接着分子は、（１）電荷を導入し；および／
または（２）極性であり；および／または（３）硫黄および／またはアミンを含
有し；および／または（４）細胞、または蛋白質、ペプチドおよび細胞表面受容
体のための合成リガンドのごとき他の細胞結合部位を連結し、それにより、細胞
結合位置を表示させることができる化合物を含む。
【０１８９】 本明細書中で用いるごとく、用語「細胞反発性部位」は、細胞結合を直接阻害
することができるか、あるいはその位置への細胞結合を阻害する他の部位に結合
する化合物を含み、これはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および他の酸素−
豊富化合物糖ヒドロゲル、極端に親水性の表面、または極端に疎水性の表面を含
む。
【０１９０】 これらの実施形態の全てにおいて、細胞接着性分子および／または細胞反発性
部位は、液相または気相沈積を介して基材に適応することができる。好ましい実
施形態において、細胞接着性分子および／または細胞反発部位の蒸気沈積が利用
される。例えば、種々のシランのアポール（apor）相沈積が示されてきた（トリ
ップ（Tripp）ら., ラングムイア（Langmuir）8:1120-1126(1992)；モーゼス（M
oses）ら., アナリティカル ケミストリー（Analytical Chemistry）20:4(1978
)）。ほとんどの場合、シランの溶液に試料を添加するよりはむしろ、（伝統的
な真空技術によって達成できる）気化したシランの存在下にヒドロキシル化表面
が置かれる。反応はその表面で起こり、その結果、シラン溶液沈積のそれと同様
な自己−組み立て単層が得られる。
【０１９１】 溶媒は必要ないので、広い範囲の細胞接着性分子および細胞反発性部位が気相
沈積で用いることができる。例えば多くのシラン溶媒はポリマー基材を溶解させ
、その光学性質を破壊する。この実施形態において、製法は溶媒の使用を全く回
避する。
【０１９２】 もう１つの好ましい実施形態において、細胞反発性部位は、限定されるもので
はないが、塩化２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル（塩化トレシル）−
活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニル
アルコール、または糖（マンニトール）またはＰＥＧのごときいずれかの他のア
ミン反応性の極端に親水性の化合物を含めたアミン−反応性部位（ここに、アミ
ン−反応性部分は、限定されるものではないが、カルボシキメチル基、スクシン
イミド、スクシンイミジルスクシネート、ベンゾトリアゾールカルボネート、グ
リシジルエーテル（またはエポキシド）、オキシカルボニルイミダゾール、ｐ−
ニトロフェニルカルボネート、アルデヒド、イソシアネートおよびトレシレート
を含むことができる）；またはトリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒド
ロオクチル基（１３ｆ）のごときいずれかのアミン−反応性の極端に疎水性の化
合物（ここに、アミン−反応性部分は、限定されるものではないが、カルボキシ
メチル基、スクシンイミド、スクシンイミジルスクシネート、ベンゾトリアゾー
ルカルボネート、グリシジルエーテル（またはエポキシド）、オキシカルボニル
イミダゾール、ｐ−ニトロフェニルカルボネート、アルデヒド、イソシアネート
およびトレシレートを含むことができる）を含む。最も好ましい実施形態におい
て、アミン−反応性細胞反発性部位は塩化トレシル−活性化ポリエチレングリコ
ール（「塩化トレシル活性化−ＰＥＧ」）を含む。
【０１９３】 トレシル−活性化ＰＥＧの化学を用いて、表面ヒドロキシル、アミンまたはス
ルフヒドリル基を調節することができる。塩化トレシルは求核体および最初のヒ
ドロキシルアミン、またはスルフヒドリル基担持炭素の間に安定な結合を形成さ
せるであろう。好ましい実施形態において、表面アミノシラン基との反応のため
に、ＰＥＧをトレシル基に付着させる。
【０１９４】 これらの好ましい実施形態において、サイズの拘束を有しないステンシルの使
用によって、細胞接着合図が規定できる。また、ステンシルによって規定できる
細胞反発合図はアミノシラン単層に連結される。細胞結合位置は、所望により、
細胞接着蛋白質、蛋白質断片またはペプチドでコートすることができ、細胞でシ
ードすることができ、その結果、細胞のパターン化アレイが得られる。
【０１９５】 このヒドロキシル化基材は、親電子体および求核体を含む二官能性分子と接触
させる。この修飾された基材は、ゴム、ポリウレタンおよびポリ（ジメチル）シ
ロキサン（「ＰＤＭＳ」）のごときテキスチャード弾性基材（ここに、「ステン
シル」という）と接触させて、ステンシルの規定された領域および修飾された基
材の間にハーメチックシールを形成する。好ましい実施形態においてステンシル
はＰＤＭＳを含む。これらの物質は、かなり入手可能であり、価格が高い高エネ
ルギーレーザー装置を使用する伝統的なＵＶフォトリソグラフィー方法よりも優
れた利点を提供する（米国特許第５，０７７，０８５号）。
【０１９６】 ステンシルは、細胞反発性または細胞接着性部位の引き続いての液相または気
相沈積から基礎となる基材の規定された領域を物理的に保護するのを可能とする
物理的マスクを含む。「物理的マスク」を用いるこの開示された製法はそれ自体
を、「光学マスク」（デユルシー（Dulcey）ら., サイエンス（Science）252:5
51(1991)と米国特許第５，９６５，３０５号および第５，３９１，４６３号）ま
たは「接触捺印」（米国特許第５，５１２，１３１号および第５，７７６，７４
８号）の使用に頼る現行技術から区別する。基材の規定された領域を保護または
脱保護するための光学マスクの使用は、光活性化可能化学および／または光不安
定分子の使用に限定される。表面の規定された領域の［保護」または「脱保護」
を可能とはせず、「接触捺印」の使用は物質の表面への液相移動に制限される。
さらに、接触捺印は、制御された量の材料の表面への再現性のある移動を可能と
しない。本発明で開示された「ステンシル」の使用は、基材の領域の保護を可能
として、光反応性／光不安定分子に制限されない液相または気相化学での未保護
領域の修飾を可能とする。
【０１９７】 本発明は１つの特別の種類の基材に制限されない。一次単層またはオルガノシ
ランの連結化学は、それが表面ヒドロキシル基と反応するものである。これらの
ヒドロキシル基は、低温プラズマ処理によって、実質的にいずれのプラスチック
およびガラスの表面にも導入することができる。二次連結化学、トレシル化学は
表面アミン、ヒドロキシルおよびスルフヒドリルと反応でき、広いアレイの表面
化学に付着するのを可能とする。また、所望の効果は（いずれのシラン処理も排
除することができる）高密度表面ヒドロキシル基で達成することができる（ダス
ト（Dust）, マクロモレキュールズ（Macromolecules）, 1990.23:3742-3746；
米国特許第５，３３０，９１１号）。これらの利点の全ては、ガラスおよびプラ
スチック上へのパターニングの開示された製法を利用でき、容易かつ精度のある
ものとする。
【０１９８】 使用される化学の良性性質は、生物学適用でそれを魅力的なものとし、ガラス
、および限定されるものではないが、ポリ（スチレン）、ポリ（オレフィン）、
ポリ（ジメチル）シロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（カルボネート）、ポリ（ビニ
ル）クロライド、ポリ（エチレン）、ポリ（エチレン）トリフタレート、テフロ
ン、およびフッ素化エチレンコ−ポリ（プロピレン）（ＦＥＰ）を含めた選択さ
れたいずれかの熱可塑性プラスチックおよび熱硬化性プラスチック上でアレイが
調製できるようにする。また、本発明の製法は、その製法を用いて容易性および
柔軟性がポリマーおよびガラス基材に適用できるようにする。ポリ（スチレン）
、アクリルおよびポリ（オレフィン）のごときプラスチックは、その入手可能性
形状およびサイズの柔軟性、作成の容易性、耐久性、低コストおよびその光学性
質に対する制御のためガラス、セラミックスおよび金属よりも優れた利点を有す
る。プラスチックは最小コストで容易に得られ、ほとんどのいずれの考えられる
形状にも成形することができ、耐久性がある。
【０１９９】 選択的細胞パターニングのための基材を調製する本発明の製法は、接触印刷を
使用する製法より再現性がある。何故ならば、オペレーター誤差の機会がより少
ないからである。基材にスタンプを適用する従属性（スタンプが押し下げられる
力、スタンプに対する溶液の量）により接触印刷時、結果が変化するオペレータ
ー依存性がある（米国特許第５，７７６，７４８号）。細胞接着性分子および／
または細胞反発性部位の液相または気相沈積を行いつつマスクするためにステン
シルを用いる本発明の製法はオペレーターとは独立しており、かくして、秤るこ
とができおよび製造可能なプロセスを提供する。
【０２００】 細胞パターニングの本開示製法は、従来のチオール化よりも顕著な利点を有す
る。チオールとの接触印刷の従来の技術はオペレーター誤差を導入するのみなら
ず、組織培養基材の表面に蒸発した金の薄い層を必要とする。金蒸発に関与する
高温のため、ほとんどのプラスチックは用いることができない。光学的品質は制
限され、金の付加された層のため蛍光が吸収され、これは、細胞−ベースのスク
リーニングを行う場合に集められる情報の品質を低下させる。より低い光学的品
質に加えて、金コーティングに関連した高いコストがある。さらに、シランの結
合は共有結合であり、不純物およびチオール結合が配位結合であって、共有結合
ではないという事実のため経時的に分解する金上のチオールのように分解に付さ
れない。本発明の製法は、光学的に透明な基材上の細胞パターニングを可能とし
、基材に対する制御の付加されたオプションを与え、従って、光学的品質のため
に最も優れた入手可能なプラスチックまたはガラスを選択する自由がある。
【０２０１】 本製法の特別の実施形態において、ポリ（スチレン）およびポリ（オレフィン
）の場合、酸素プラズマを用いて、表面を活性化させ、ガラスの場合には酸洗浄
を用いて、表面を活性化させる。両方の表面は、さらに、連結された分子の終止
端部の第一級アミンを特徴とするアミノシランの弱い酸性アルコール溶液と共に
インキュベートすることができる。シラン処理に続き、ステンシルを基材に適用
する。塩化トレシル−活性化ＰＥＧの水溶液はステンシルの周りの基材に適用さ
れ、その結果、露出されたアミンの領域、および相互に注意深く制御された隣接
するＰＥＧの領域が得られる。表面の修飾の後、表面を細胞接着蛋白質、蛋白質
断片またはペプチドでプライマー処理して、細胞接着プロセスを速める（米国特
許第５，８７４，２１９号）。
【０２０２】 もう１つの態様において、本発明は細胞培養のための新規なパターン化基材を
提供する。１つの態様において、本発明は １．複数の細胞接着性分子がカップリングされた反応性表面を有する少なくと
も第１の部分： ２．複数の細胞反発性部位がカップリングされた露出表面を有する少なくとも
第２の部分を含み、ここに、細胞接着分子はシラン類よりなる群から選択され、
ここに、細胞反発性部位は塩化トレシル−活性化ポリ（エチレン）グリコールを
含むことを特徴とする細胞パターニング基材を提供する。
【０２０３】 好ましい実施形態において、シランは、ＲｎＳｉＸ4-nを含み、ここに、ｎ＝
１、２または３；Ｘ＝Ｃｌ、ＯＣＨ3またはＯＣ2Ｈ5；Ｒ＝スルフヒドリル基、
アミン基、ヒドロキシル基、荷電基、極性基、または蛋白質、蛋白質断片、ペプ
チド、および細胞表面受容体のための合成リガンドを含めた、それに制限するも
のではない求核体（ここに、求核体は他の分子および／または細胞に結合するこ
とができる）である。好ましい実施形態において、シランはアミノシランである
。より好ましい実施形態においてアミノシランは限定されるものではないが、ト
リメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン、トリメトキシリルエチレンジ
アミン、アミノプロピルトリエトキシシラン、トリメトキシアミノプロピルシラ
ンまたはトリクロロシリルエチレンジアミン、アミノプロピルトリクロロシラン
のごときクロロシランを含めたメトキシまたはエトキシシラン類よりなる群から
選択される。最も好ましい実施形態において、トリメトキシシリルプロピルジエ
チレントリアミンが用いられる。
【０２０４】 もう１つの実施形態において、基材は、さらに、細胞接着性蛋白質、蛋白質断
片、またはフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ビトロネクチン、オステ
オポンチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤＳペプチド、ＹＩＧＳＲペプチドを含めた
ペプチドを含む。細胞接着促進剤に対する細胞接着の強度は、細胞接着蛋白質、
蛋白質断片またはペプチドの組成を変化させることによって修飾することができ
る。さらなる実施形態において、基材は、さらに、細胞接着性蛋白質、蛋白質断
片またはペプチドを介して直接的または間接的に細胞結合位置に結合した細胞を
含む。原核生物、真核生物および古細菌細胞を含めたいずれの細胞型を用いるこ
ともできる。
【０２０５】 本発明の種々の製法および基材による細胞結合位置は単一の細胞の直径ほど小
さくでき、数百の細胞の直径ほど大きくすることができる。細胞結合位置（すな
わち、細胞反発性位置）の間の距離は細胞のサイズに依存するが、特定の適用が
異なる細胞結合位置における細胞の相互作用を要求するのでなければ、細胞が細
胞結合位置の間のギャップ（すなわち、１細胞直径）を架橋できないように十分
に大きい。
【０２０６】 さらなる実施形態において、種々の細胞パターニング基材を流体送達系と接合
させて、細胞結合位置への流体および／または試薬の流れを供する。好ましい実
施形態において、流体送達系はここに記載したものである。
【０２０７】 もう１つの実施形態において、細胞パターニング基材は、前記で開示した本発
明の製法によって作成された細胞パターニング基材を含む。
【０２０８】 本発明のこの態様は、説明のみの目的を意図し、添付の請求の範囲によって定
義される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない付随する好まし
い実施形態を参照してよく理解することができる。
【０２０９】 材料および製法 本発明を実施するのに利用することができる試薬および装備は、限定されるも
のではないが、６０および３５ｍｍのペトリ皿、マイクロプレート、熱可塑性プ
ラスチック、ポリ（オレフィン）、プラズマクリーナー／滅菌器、デジタル対流
ゲージ、トリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン、および２，２，２
−トリフルオロエタンスルホニル−ポリ（エチレン）5000グリコールを含む。
【０２１０】 ポリ（スチレン）、ポリ（オレフィン）、またはポリ（エステル）およびポリ
（エーテル）のごとき他の熱可塑性プラスチック基材は、以下の製法を用い、プ
ラズマクリーナー内部で酸素プラズマ処理される。基材はガラス管かチャンバー
内に置かれ、チャンバーをデジタル対流ゲージによって示して〜２００ミリトー
ルの圧力まで真空に引く。酸素を調節バルブを通じてパルスし、チャンバーを再
度〜２００ミリトールの圧力まで真空に引く。前記酸素パルスをさらに２回反復
する。最後の酸素パルスの後、ガスをチャンバーへ一定に漏らし、（酸素漏れバ
ルブおよび活性化された真空ポンプで）最終平衡圧力は〜３００ミリトールであ
るべきである。適当な圧力に達した後、電圧スイッチを入れてＨＩ（１００Ｗ）
とし、基材を２５分間処理する。
【０２１１】 ガラスの表面は以下の方法を用いて活性化する。１Ｍ ＫＯＨ溶液は二重蒸留
／脱イオン（ＤＩ）水中で調製する。ガラス表面は１Ｍ ＫＯＨ溶液中で１０分
間インキュベートする。１０分の後、基材は二重ＤＩ水中で３回すすぐ。カバー
グラスはＨＣｌ：ＭｅＯＨ（１：１）中に３０分間浸漬する。インキュベーショ
ンの後、カバーグラスを二重ＤＩ水中ですすぎ、硫酸の濃縮浴に３０分間移し、
続いて、二重ＤＩ水で３回すすぐ。次いで、カバーグラスを蒸留水中で１５分間
沸騰させ、基材を窒素ガンによって吹き付ける。
【０２１２】 アミノシラン処理はガラス、ポリ（スチレン）およびポリ（オレフィン）につ
いて同一である。トリメトキシシリルプロピルジエチレンジアミンの１％溶液は
温和に酸性化されたメタノール（９４％メタノール、５％水、および０．００４
％氷酢酸）中で調製し、基材と共に１５分間インキュベートする。シラン処理の
後、基材はメタノールですすぎ、８０℃オーブン中で３０分間焼く。
【０２１３】 ＰＤＭＳステンシルをアミノ化したガラスまたはポリ（スチレン）に適用する
（この実施形態は、限定されるものではないが、５０、１００、２００および５
００ミクロンスポットを含む）。圧力は、ステンシルが密なシールを作成するま
で適用する。
【０２１４】 トレシル−ＰＥＧ処理はガラスおよびポリ（スチレン）につき同一である。ス
テンシル適用の後、０．１２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液は水中で調製する。トレ
シル−ＰＥＧの２５％溶液（重量）は炭酸水素塩中で調製する。溶液はステンシ
ルの周りに適用し、ＰＤＭＳの周りにプールし、その結果、露出されたアミノ化
表面領域のみが液体に接触する。基材は４時間インキュベートする。
【０２１５】 ＰＥＧ処理に続き、表面を０．１２Ｍ炭酸水素ナトリウムですすぐ。基材を２
時間インキュベートし、ＰＢＳの気流下ですすぐ。基材（「部分的に活性」）は
３０日間を超えて乾燥ボックス中に貯蔵し、しかる後、蛋白質をコーティングし
、細胞をインキュベートする。
【０２１６】 本明細書で用いるごとく、用語「部分的に活性な」基材は、疎細胞ドメインに
よって分離された蛋白質結合位置のパターン化アレイを得るために、化学的およ
び／またはテキスチャー的に修飾されたガラスまたプラスチック基材である。
【０２１７】 蛋白質コーティング １．部分的に活性な基材は、１μｇ／ｍｌないし２５μｇ／ｍｌの範囲の濃度
において、限定されものではないが、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン
、ビトロネクチン、オステオポンチン、またはその断片、ならびにＲＧＤペプチ
ド、ＲＧＤＳペプチド、ＹＩＧＳＲペプチドを含めた、蛋白質、蛋白質断片、ま
たはペプチド溶液中で１ないし２時間インキュベートする。
【０２１８】 ２．インキュベーションの後、基材をＰＢＳの気流中ですすぐ。
【０２１９】 ３．蛋白質／ペプチドをコートした基材は凍結乾燥して、蛋白質／ペプチド構
造を維持する。これらの「準活性な」基材は、乾燥ボックス中で＞３０日間貯蔵
する。シラン結合は共有結合であって、不純物およびチオール結合が配位結合で
あって、共有結合ではないという事実のため、経時的に分解する金上のチオール
がそうであるようには、分解には付されない。本明細書で用いる用語「準活性な
」基材は、疎細胞ドメインによって分離された蛋白質またはペプチド−豊富ドメ
インのパターン化アレイを生じさせるために化学的および／またはテキスチャー
的に修飾されたガラスまたはプラスチック基材である。
【０２２０】 細胞シーディング １．細胞は標準的な技術によってシーディングのために調製される。
【０２２１】 ２．部分的に活性なまたは準活性な基材は細胞培地中で５分間再水和させる。
【０２２２】 ３．細胞は完全な細胞培地中で３７℃および５％ＣＯ2にて（細胞タイプに応
じて）３０分間ないし２時間部分的にまたは準活性な基材と共に所望のシーディ
ング密度でインキュベートする。
【０２２３】 ４．次いで、細胞と整列させた「十分に活性な」基材は細胞スクリーニングア
ッセイで用いることができる。低温保存または室温乾燥の後、十分に活性な基材
は長期保存することができる。本明細書で用いるごとく、用語「十分に活性な」
基材は、疎細胞性ドメインによって分離された細胞のパターン化アレイを生じさ
せるために、化学的におよび／またはテキスチャー的に修飾されたガラスまたは
プラスチック基材である。それらは、部分的にまたは準活性な基材から誘導する
ことができるが、準活性な基材の使用が好ましい。
【０２２４】 実施例５ パターン化幹細胞および分化細胞の基材 幹細胞は（１）自己更新を受けるか、あるいは（２）分化した子孫を生じる固
有の能力を保有する。外因性因子（培養基、成長因子、周囲の細胞媒体からの物
理的−化学的合図）は、幹細胞の発生運命を媒介する。測定された幹細胞とも呼
ばれる組織特異的幹細胞は多能性を呈するが、全能性は呈しない。測定された幹
細胞は、生物におけるその前駆体細胞から遺伝子タイプ的にかつ表現型的に遠く
隔たった不滅化細胞とは対照的に、培養中の自己−複製に駆動することができる
か、遺伝子タイプ的にかつ表現型的に全生物にイン・ビトロで近い多くの組織特
異的子孫に選択的に分化することができる初代の部分的に始動された細胞にアク
セスする能力を提供する。
【０２２５】 不滅化細胞に対する幹細胞由来組織−特異的子孫を用いる薬理学的関連性は、
前者によってもたらされる遺伝子型および表現型マッチに由来する。新しい化学
化合物は初代薬物スクリーニングにおいて「活性」と同定されることから来るの
で、それは、その薬理学的プロフィールにアクセスするようにデザインされた多
数のテストをパスしなければならない。細胞毒性、生物学的利用性および特異性
のごとき生物−関連性の指標は、このプロフィールを生じる能力と共に評価され
、生物に遺伝子型的におよび表現型的にマッチした細胞の使用を要する。これは
、動物テスト段階を超えて臨床に移された場合に当該化合物が治療的に関連する
であろう確率を増大させる。初代細胞（肝細胞、ニューロン、軟骨細胞、筋細胞
、脂肪細胞）の使用は二次および三次テストでよく記載されている。しかしなが
ら、適切な細胞を得るにおける困難性（アクセスまたは量）、およびアッセイ容
量をカバーする十分な量でのその培養は依然として主な問題である。幹細胞由来
初代細胞の使用は、初代細胞のより高い関連性および源双方に対する解決を提供
することができる。
【０２２６】 他の研究は、基材上にパターン化された細胞接着促進剤に結合した内皮細胞か
らの空間的に配向した新生毛細血管の生産に焦点を当ててきた（ルドルフ（Rudo
lph)ら，米国特許第５，７２１，１３１号）。しかしながら、得られた基材は単
一タイプの分化細胞のみを含有する。何故ならば、その製法は、分化試薬で細胞
結合位置を個々にアドレスすることを可能としなかったからである。
【０２２７】 本発明は、幹細胞の順序だったアレイからの多数の最終的に分化した細胞、な
らびに基材それ自体を含むパターン化細胞基材を調製する製法を提供する。薬物
発見のためのこれらのパターン化細胞基材の使用は、イン・ビボ設定への外挿の
ためのイン・ビトロ薬理学的スクリーニングデータの信頼レベルおよび関連性を
増加させる。
【０２２８】 本発明の製法および基材は、発生生物学における事象：（限定されるものでは
ないが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）誘導体化基材、オートクリン／パラクリ
ン／内分泌因子等を含めた）分化因子の制御された送達を用いる幹細胞からの始
動した成熟または最終的分化細胞の形成を模倣する。以前の技術は、溶液からの
１以上の不滅化された遺伝子型的におよび表現型的に区別される細胞型の選択的
接着を可能とする多数の細胞接着ドメインで細胞基材表面を「修飾する（pepper
ing）」ことによる細胞不均一性の導入を教示する。限定された数の「細胞−特
異的細胞接着部位」は、単一基材上で達成できる区別される細胞型の数を制限す
る。以前の技術は、多数の分化子孫に分化する幹細胞の固有の能力を利用しない
。
【０２２９】 対照的に、本発明は、幹細胞の集団の多数の分化細胞への制御された分化によ
って、選択されたいずれかの基材（セラミックス、金属、ポリマー、コンポジッ
ト等）上での細胞不均一性の誘導を教示する。制御された分化は、いずれかの数
の変形および幾何学において「混合された細胞型のパターン」の創製を可能とす
る。また、本発明は、選択された生物に対して遺伝子型および表現型関連性が近
い器官特異的および組織特異的細胞基材、ならびに組織特異的および／または器
官特異的細胞の間のイン・ビボ相互作用をモデルとする基材の創製を可能とする
。これは、生物または全身レベルへのより大きな関連性を持つ情報を提供するこ
とができる細胞ベースのスクリーニングプラットフォームの創製を可能とする。
【０２３０】 本発明の細胞基材の調製は、 （ａ）基材表面； （ｂ）表面の複数の細胞結合位置、ここに、細胞結合位置は、 （１）１以上の細胞接着分子；および （２）細胞接着分子に結合した複数の幹細胞；および （ｃ）表面の複数の細胞反発位置を含み、ここに、細胞反発性位置は細胞反発
性部位を含み、ここに、個々の細胞結合位置は細胞反発性位置によって分離され
るパターン化幹細胞基材の提供を必要とする。
【０２３１】 単一タイプまたは複数タイプの幹細胞はパターン化アレイ中の細胞結合位置に
結合している。本明細書で用いるごとく、用語「パターン化幹細胞基材」は、幹
細胞が制御されたパターンにて基材上に配列されることを意味する。幹細胞は単
一クラスの幹細胞を含むことができるか、あるいは複数の幹細胞タイプを含むこ
とができ、この場合、異なる幹細胞タイプの位置決定も制御される。
【０２３２】 本明細書中で用いるごとく、用語「幹細胞」とは、少なくとも１つのタイプの
分化した子孫を生じる能力を保有するいずれの細胞型をいう。それ自体、幹細胞
は、限定されるものではないが、いずれかの細胞型への分化および自己−更新が
できる細胞（多能性細胞）；いずれかの細胞型への分化ができるが、自己−更新
できない細胞（全能性細胞）；自己−更新および多くの細胞型への分化が可能な
細胞（広い能力；多能性幹細胞）、限定された自己−更新および限定されたタイ
プの細胞への分化が可能な細胞（先祖細胞）；特異的細胞型への分化を遂げたが
、未だ完全には分化していない細胞（始動先祖細胞）を含む（例えば、ゲージ（
Gage）ら，サイエンス（Science）287:1433-1438(2000)）。種々の実施形態にお
いて、幹細胞は神経幹細胞、神経先祖細胞、神経膠先祖細胞、間葉幹細胞、造血
幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、胚幹細胞、またはその組合せよりなる群から選
択される。特異的クラスの幹細胞への言及を以下に行う： 肝幹細胞はトージェイルソン（Thorgeirsson），FASEB J. 10:1249(1996)にレ
ビューされている。肝細胞の例は、限定されるものではないが、ＳＥＣ細胞、卵
形細胞、ならびに培養されたＷＢ−Ｆ３４４細胞、Ｌ２０３９細胞、およびＲＬ
Ｅφ１３細胞を含む（コールマン（Coleman）ら.，アン.ジェ.パソル.（Am. J.
Pathol.）151:355(1997)； オオモリ（Omori）ら，ヘパトロジー（Hepatology
） 26:720(1997)； フィオリノ（Fiorino）ら，イン ビトロ セル デブ. バ
イオル. アニム.(In Vitro Cell Dev. Biol. Anim.) 34:247-258(1998)； アゲ
リ（Agelli）ら，ヒストケム. ジェ.（Histochem. J.） 29:205-217(1997)；
ブリル（Brill）ら，プロク. ソク. エクスプ. バイオル. メド.(Proc. Soc. Ex
p. Biol. Med.) 204:261-269(1993)）。 神経幹および先祖細胞：ニューロン幹および先祖細胞は、限定されるものでは
ないが、ＮＴ−２細胞（プレジャー（Pleasure）ら，ジェ. ニューロサイエンス
（J. Neuroscience）12:1802-1815(1992)）およびゲージ（Gage），サイエンス
（Science） 287:1433-1438(2000)； グリッティ（Gritti）ら, ジェ. ニュー
ロサイエンス（J. of Neuroscience）16:1091-1100(1996)； フレデリクセン(F
rederiksen)ら, ニューロン（Neuron）1:439(1988)； レイノルズ(Reynolds)と
ワイス（Weiss)，サイエンス（Science）255:1707(1992)； デービス（Davis）
と テンプル（Temple），ネーチャー（Nature）372:263(1994)； マッキー（Mc
Kay），サイエンス（Science）276:66-71(1997)； ビカリオ−アベジョン（Vic
ario-Abejon）ら，ニューロン（Neuron）15:105(1995)； ジョー（Johe）ら，
ジーンズ アンド ディベロプ.（Genes and Develop.） 10:3129-3142(1996)；
および米国特許第５，８２４，４８９号； 第６，００１，６５４号； 第６
，０３３，９０６号）に記載されたものを含む。
【０２３３】 神経膠先祖細胞：神経膠先祖細胞の例は、限定されるものではないが、ＳＮＢ
−１９細胞およびイン・ビトロで分化することができる稀突起神経膠細胞を含む
（ライブル（Raible）ら，ジェ.ニューロサイ. レス.(J. Neurosci. Res.) 34:2
87-294(1993)； （ウェルチ（Welch）ら，イン ビトロ セル デブ. バイオル
.-アニマル（In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal） 31:610-616(1995)）。
【０２３４】 間葉幹細胞は、骨、軟骨、腱、筋肉、骨髄、支質、脂肪および皮膚を含めた種
々の間葉細胞に分化する能力を保有する可能性先祖細胞である。そのような幹細
胞は、限定されるものでないが、Ｃ２Ｃ１２細胞（テボール（Teboul）ら，J. B
iol. Chem. 270:28183-28187(1995)； ニシムラ（Nishimura）ら，ジェ. バイ
オル.ケム.(J. Biol.Chem.) 273:1872-1879(1998)；および米国特許第５，４８
６，３５９号；第５，８２７，７４０号；第５，９４２，２２５号；第６，０２
２，５４０号に記載されたごとき細胞を含む。
【０２３５】 造血幹細胞は種々の分化した造血細胞型を生起できるいずれの造血多能性先祖
細胞もいう。この定義内にある細胞型は、限定されるものではないが、ＣＤ３４
+骨髄単核細胞（BMMC）（ベラルディ（Berardi）ら，ブラッド（Blood）86:2123
-2129,1995）、ＰＢＳＣ（フリッシュ（Fritsch）ら，ボーン マロー トラン
スプランテーション（Bone Marrow Transplantaion）17:169-178,1996）、丸石
領域形成細胞（CAFC）（レミュークス（Lemieux）ら, ブラッド（Blood）86:133
9-1347,1995）および５−ＦＵ ＢＭ細胞（アルコーン（Alcorn）とホリオーク
（Holyoake），ブラッド レビューズ（Blood Reviews） 10:167-176,1996）；
米国特許第５，８０７，７４４号）を含む。
【０２３６】 上皮幹細胞とは、長く生き、比較的未分化であり、細胞分裂に対して大きな能
力を有し、最終的に上皮のホメオスタシスを担う細胞をいう。このタイプの細胞
は、限定されるものではないが、米国特許第５，５５６，７８３号； 米国特許
第５，４２３，７７８号； ローチャット（Rochat）ら，セル（Cell） 76:1063
(1994)； ジョーンズ（Jones）ら，セル（Cell） 73:713(1993)； ジョーンズ（
Jones）ら，セル（Cell）80:83(1995)およびスラック（Slack），サイエンス（S
cience）287:1431-1433(2000)に記載されたものを含む。
【０２３７】 本発明のこの態様の細胞接着分子は、細胞接着分子、ＲＧＤ−含有ペプチドの
ごとき細胞外マトリックス蛋白質または蛋白質断片のコポリマーブレンド、シラ
ンまたはチオールを含めた、前記したもののごとき基材への幹細胞接着を支持で
きるいずれの化合物も含むことができる。１つの実施形態において、前記で開示
したメトキシまたはエトキシシランのごときアミノシランを用いる。
【０２３８】 細胞結合を直接的に阻害することができる部位、あるいは限定されるものでは
ないが、前記したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および他の酸素−豊富化合
物、糖、ヒドロゲル、極端に親水性の表面、または極端に疎水性の表面を含めた
細胞反発性位置への細胞結合を阻害する他の部位に結合する部位をいう。
【０２３９】 また、細胞結合位置は、未制御細胞幹分化を妨げるための当該分野で知られて
いるいずれかの化合物を含むことができる、幹細胞の未制御分化の阻害剤も含む
ことができる。そのような化合物は、限定されるものではないが、それらの未制
御分化を妨げつつ、細胞結合位置の創製を可能とするために利用される、細胞接
着リガンドにカップリングしたチオールまたはシランの自己−組み立て単層を含
む。もう１つの例は、軸索−含有ニューロン細胞への細胞の分化を阻害する、Ｎ
ｅｕｒｏ２Ａ神経芽細胞腫細胞系の培養へのプロテアーゼトロンビンの添加であ
る（グーウイッツ（Gurwitz）ら，プロク. ナショナル.アカド.サイ.(Proc. Nat
l. Acad. Sci.) 85:3440-3444(1988)）。かくして、細胞結合促進剤は未制御分
化の阻害剤として働くこともできる。別法として、細胞結合位置は細胞のフィー
ダー層で被覆して、未制御幹細胞の分化を阻害する。
【０２４０】 本発明のこの態様の基材は、限定されるものではないが、プラスチック、ガラ
ス、セラミックスおよび金属を含めた当該分野で知られたいずれの材料より作成
することもできる。好ましくは、そのようなパターン化基材はポリスチレン（ポ
リ（オレフィン）のごとき商業的に入手できるプラスチック基材上に作成される
。好ましい実施形態において、基材は２５μｍないし１２５μｍの範囲のエッジ
間間隔によって分離された１００μｍ−５００μｍ直径の円状細胞結合位置を保
有する。基材上の全フットプリント９６、３８４および１５３６ウェルマイクロ
プレートのフォーマットにマッチし、１５３６（３２列×４８段）、３８４（１
６列×２４段）、および９６ウェル（８列×１２段）マイクロプレートと比較し
てほぼ１５０倍小さな表面である。
【０２４１】 さらなる態様において、本発明は、 （ａ）基材表面； （ｂ）（i）１以上の細胞接着分子； （ii）第１の分化した細胞型 を含む表面の第１の複数の細胞結合位置； （ｃ）（i）１以上の細胞接着分子； （ii）第２の分化細胞型；ここに、第１および第２の分化した細胞型は
整理されたパターンにて基材上に整列され； を含む表面の第２の複数の細胞結合位置；および （ｄ）表面の複数の細胞反発性位置、ここに、細胞反発性位置は細胞反発性部
位を含み、ここに、個々の細胞結合位置は細胞反発性位置によって分離される；
を含むパターン化された分化細胞基材を提供する。
【０２４２】 本明細書中で用いるごとく、用語「パターン化分化細胞基材」とは、分化細胞
が制御された様式にて基材上に配列され、ここに、最終的分化がパターン化後に
達成されることを意味する。
【０２４３】 １つの実施形態において、分化した細胞は、基材上で選択的に分化した幹細胞
に由来する。この実施形態において、幹細胞型は神経幹細胞、神経先祖細胞、神
経膠先祖細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、胚幹細胞、ま
たはその組合せよりなる群から選択される。別法として、分化は基材上での（先
祖細胞を始動した）細胞を平板培養するに先立って開始することができる。当業
者であれば、限定されるものではないが、以下のものを含めて、この実施形態の
多くの置き換えを考えることができるであろう： １．単一基材上の所定の位置における２以上の分化細胞型への単一幹細胞型の
選択的分化。
【０２４４】 ２．２以上の分化した細胞型を生じる単一基材上に配列した２以上の幹細胞型
の選択的分化。
【０２４５】 ３．単一または複数の幹細胞型の順次の選択的分化、それにより、単一の分化
した細胞型がまず生産され、続いて、他の細胞結合位置において幹細胞型が選択
的に分化される。
【０２４６】 かくして、好ましい実施形態において、本発明の結果、所定の様式で配列され
た複数タイプの分化した細胞型を持つ基材が得られる。配列することができる異
なる細胞型の数は幹細胞の分化ポテンシャルによってのみ制限される。というの
は、限定されるものではないが、マイクロスポッター（Certesian Technologies TM , Hewlett PackardTM, Gentic MicrosystemsTM）を含めたデバイス、および限
定されるものではないが、米国特許第５，８５８，１８８号および第６，００７
，６９０号に開示されたもののごとき流体送達系を用い、種々の細胞結合位置を
分化剤で個々にアドレスすることができる。分化剤での幹細胞の選択的アドレシ
ングは、選択された子孫への制御された分化を可能とする。好ましい実施形態に
おいて、本発明の流体送達系をパターン化細胞基材と組み合わせてミクロ流体カ
セットが得られ、これはパターン化未分化幹細胞へ分化化合物を送達することが
できる。
【０２４７】 好ましい実施形態において、第１および第２の分化した細胞型は、限定される
ものではないが、脳、血管組織、皮膚、膵臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、腸および
胃を含めた単一組織で見い出される細胞型である。
【０２４８】 もう１つの好ましい実施形態において、第１および第２の分化した細胞型は、
限定されるものではないが、末梢神経−平滑筋および／または骨格筋；上皮組織
−平滑筋；血管内皮−平滑筋；神経膠細胞−毛細血管の内皮細胞；脂肪細胞−末
梢神経細胞の軸索および／またはシュワン細胞；および膵臓Ｂ細胞−膵臓Ａ細胞
を含めた、イン・ビボで相互作用する異なる組織で見い出される細胞型である。
【０２４９】 もう１つの好ましい実施形態において、第１および第２の分化した細胞型は神
経膠細胞、ニューロン、脂肪細胞、平滑筋細胞、骨格筋脂肪、骨芽細胞、軟骨細
胞、支質細胞および筋細胞よりなる群から選択される。
【０２５０】 種々の最も好ましい実施形態において、（ａ）誘導された第１の分化した細胞
型は神経膠細胞であって、第２の分化した細胞型はニューロン細胞であり、かく
して、脳のための細胞基材モデルを生じ；（ｂ）第１の分化した細胞型は脂肪細
胞であって、第２の分化した細胞型は筋肉細胞であり；（ｃ）第１の分化した細
胞型はニューロン細胞であって、第２の分化した細胞型は筋肉細胞である。
【０２５１】 さらなる好ましい実施形態において、パターン化幹細胞基材またはパターン化
細胞基材は流体送達系チャンバーと接合させて、カセットが形成され、ここに、
流体送達系は試薬を幹細胞または分化した細胞に送達し、 （i）基材の表面の細胞結合位置にマッチする複数のドメイン、および （ii）細胞結合位置に試薬を供給するミクロ流体チャンネルを含む。
【０２５２】 本明細書中で用いるごとく、「試薬」は、分化剤、ならびに細胞培養基および
細胞培養のための細胞培養のための補足物、および細胞に対する薬物化合物ライ
ブラリーおよびトキシンの効果をスクリーニングするためのテスト化合物を含む
。
【０２５３】 最も好ましい実施形態において、単一のミクロ流体チャネルは、流体を基材上
の単一細胞結合位置に供給して、各細胞結合位置への別々の流体の流れを供し、
それにより、幹細胞の選択的分化および／または選択されたテスト剤を含む１以
上の細胞結合位置における幹細胞または分化細胞の選択的処理を可能とする。
【０２５４】 もう１つの態様において、本発明は、パターン化幹細胞の選択的分化製法によ
って作成されたパターン化分化細胞基材を供し、ここに、製法は、 （ａ）（１）基材表面； （２）（i）１以上の細胞接着分子； （ii）第１の分化した細胞型； を含む表面の第１の複数の細胞結合位置； （３）（i）１以上の細胞接着分子； （ii）第２の分化した細胞型；ここに、第１および第２の分化し
た細胞型は制御されたパターンで基材上に整列される； を含む表面の第２の複数の細胞結合位置； （ｂ）細胞結合位置を分化剤と選択的に接触させて、選択された子孫への幹細
胞の制御された分化を供し、ここに、選択された接触はパターン化分化細胞基材
を生じる； を含む。
【０２５５】 好ましい実施形態において、パターン化細胞基材は前記した流体送達系と接合
させる。
【０２５６】 前記した態様のさらなる好ましい実施形態において、幹細胞および得られた分
化細胞は、選択されたテスト剤に応答して、細胞上または中、または細胞の細胞
下区画内または間のルミネセントレポーター分子の分布、環境、または活性を測
定する細胞スクリーニングアッセイで用いられる少なくとも１つのレポーター分
子を保有する。限定されるものではないが、ここに引用しその全体を一体化させ
る米国特許第５，９８９，８３５号；係属する米国特許出願第０９／０３１，２
７１号（１９９８年２月２７日出願）；第０９／３５２，１７１号（１９９９年
７月１２日出願）；第０９／２９３，２０９号（１９９９年４月１６日出願）；
第０９／２９３，２０９号（１９９９年４月１６日出願）；第０９／３９８，９
６５号（１９９９年９月１７日出願）；第０９／４３０，６５６号（１９９９年
１０月２９日出願）；第０９／５１３，７８３号（２０００年２月２４日出願）
；ギウリアーノ（Giuliano）ら，アン. レブ. バイオフィズ. バイオモル. スト
ラクト.(Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.) 24:405-434(1995)； およびギ
ウリアーノ（Giuliano）ら，トレンズ イン バイオテック.（Trends in Biote
ch.） 16:135-140(1998)に記載されたものを含めた種々のそのようなルミネセン
トレポーター分子を本発明のこの態様で用いることができる。
【０２５７】 ルミネセントプローブは小さな分子、標識されたマクロ分子、または限定され
るものではないが、緑色蛍光蛋白質キメラを含めた遺伝子工学作成蛋白質であり
得る。本明細書中で用いるごとく、「ルミネセント」プローブは蛍光、ルミネセ
ントおよびケミルミネセントプローブを含む。
【０２５８】 もう１つの実施形態において、ただ１つの分化した細胞型はルミネセント受容
体分子を保有し、第１および第２の分化した細胞型の間で相互作用が起こる場合
、ルミネセントレポーター分子を介して細胞型のただ１つが相互作用をレポート
する。
【０２５９】 ルミネセント標識レポーター分子は細胞をテスト化合物と接触させる前、それ
と共にまたはその後に細胞によって発現され得るか、または細胞に添加すること
ができる。例えば、レポーター分子はトランスフェクトされた幹細胞によってル
ミネセント標識蛋白質キメラとして発現させることができる。別法として、ルミ
ネセント標識レポーター分子は発現させ、単離させ、幹細胞にバルブ−負荷させ
ることができ、あるいはレポーター分子を単離後にルミネセント標識することが
できる。さらなる別法として、レポーター分子は、レポーター分子を検出する標
識抗体のごときルミネセント標識と引き続いて接触させる幹細胞によって発現さ
せることができる。
【０２６０】 好ましくは、第１の分化した細胞型におけるルミネセントレポーター分子は、
第２の分化した細胞型におけるルミネセントレポーター分子からスペクトル的に
区別することができる。
【０２６１】 また、本発明は、前記開示のパターン化幹細胞基材を供し、細胞結合位置を分
化剤と選択的に接触させて、幹細胞の選択された子孫への制御された分化を供す
ることを含み、ここに選択的接触がパターン化分化細胞基材を生じる選択的幹細
胞分化製法を提供する。幹細胞を分化した細胞に分化させるための当該分野で知
られたいずれの製法も用いることができる。種々の幹細胞を分化した子孫に分化
させるための条件を供する文献は、例えば、ここに引用してその全体を一体化さ
せる以下の文献中で見い出すことができる： 間葉幹細胞：米国特許第５，８２７，７４０号（脂質生成分化）；米国特許第
６，０２２，５４０号（骨形成分化）；米国特許第５，９４２，２２５号（骨形
成、軟骨形成、腱形成、骨髄支質細胞および筋形成分化）； クエンダ（Cuenda
）ら，ジェ. バイオル. ケム.（J. Biol. Chem.） 274:4341-4346(1999)（Ｃ２
Ｃ１２筋形成分化）； ニシムラ（Nishimura）ら，ジェ. バイオル. ケム.(J.
Biol. Chem.) 273:1872-1879(1998)（Ｃ２Ｃ１２骨芽細胞形成分化）； テボー
ル（Teboul）ら，ジェ. バイオル. ケム.(J. Biol. Chem.) 270:28183-28187(19
95)（Ｃ２Ｃ１２脂肪生成分化） 神経幹および先祖細胞：米国特許第５，８２４，４８９号（ニューロンおよび
神経膠細胞）；米国特許第６，００１，６５４号（ニューロンおよび平滑筋細胞
）；米国特許第６，０３３，９０６号（神経膠細胞）；プレジャー（Pleasure）
ら，ジェ. ニューロサイ.(J. Neurosci.) 12:1802-1815(1992)（ニューロンへの
ＮＴｅｒａ２分化）； 神経膠細胞および神経幹および先祖細胞；ウェルチ（Welch）ら，イン ビト
ロ セル デブ. バイオル.-アニマル（In Vitro Cell Dev. Biol.-Animal）31:
610-616(1995)（ＳＮＢ−１９神経膠分化）； 米国特許第５，８２４，４８９
号（ニューロンおよび神経膠細胞） 造血幹細胞：ローマン（Lawman）ら，ジェ. ヘマトザー.（J. Hematother.）
1:251-259(1992)； ハス（Huss），ステム セルズ（Stem Cells） 18:1-9(200
0)； ザング（Zhang）ら，ブラッド（Blood）95:138-146(2000)； ザング（Zh
ang）ら，ブラッド（Blood） 92:118-128(1998) 肝幹細胞：ブリル（Brill）ら，プロク. ソク. エクスプ. バイオル. メド.(P
roc. Soc. Exp. Biol. Med.) 204:261-269(1993)； ブリル（Brill）ら，ディ
グ. ディズ. サイ.（Dig. Dis. Sci.）, 44:364-371(1999)； フィオリーノ（F
iorino）ら，イン ビトロ セル デブ. バイオル.-アニム（In Vitro Cell De
v. Biol. Anim.）34:247-258(1998) 種々の好ましい実施形態において、基材を前記した開示の流体送達系と接合さ
せ、幹細胞は、選択された先祖の表現型を同定するように働く少なくとも１つの
ルミネセントレポーター分子を保有する。
【０２６２】 これらの実施形態において、幹細胞を分化剤と接触させて、（単一子孫のため
の）基材への均一に適用される、または特異的細胞結合位置に選択的に適用され
る（複数子孫）適当な分化剤を用い、分化した子孫へのトランスフェクトされた
パターン化細胞の分化を行う。異なる子孫への単一幹細胞型の、または異なる子
孫への異なる幹細胞への分化は、いずれかの所望の併置での異なる細胞型を担う
細胞結合位置での基材の形成を可能とする。このようにして、細胞分化の単純な
いし中程度に複雑なモデルを用いて、薬物発見およびライフサイエンスのための
細胞ベースの分析で用いる多細胞組織−特異的および器官−特異的細胞基材を調
製する。
【０２６３】 １つのモデル系において、ニューロンおよび神経膠細胞幹細胞を作成して、蛍
光蛋白質レポーターを発現させ、それらの細胞骨格蛋白質のダイナミックスを測
定する。細胞骨格は、いずれかの１つの時点における薬物発見パイプラインにお
ける多くのリード化合物があるようであるよく特徴付けられた有効な薬物発見標
的となった。幹細胞系の各々は、それらが、同一位置内に一緒にパターン化され
るように（共培養）、同様に細胞アレイ内の別々の位置にパターン化することが
できるように、スペクトル的に区別されるレポーター分子を発現する。別法とし
て、異なる幹細胞を別々の位置にパターン化することができ、ここに、その位置
は異なる位置における細胞間の相互作用を行うのに十分近接している。後者の２
つの態様は器官タイプ文脈で２つの細胞型の薬物応答の同時測定を可能とし、こ
こに、細胞が生きた動物の脳組織内にあるので相互作用するのが可能である。各
細胞型内に含まれたレポーター分子はスペクトル的に区別されるので、プラット
フォームは、共培養内の各細胞型に対する機能を検出し、それを帰属決定する。
【０２６４】 第２のモデル系において、多能性細胞系であるマウスＣ２Ｃ１２細胞は、ミク
ロアレイにパターン化されたルミネセントレポーター分子で作成され、２つの細
胞型、骨格筋筋細胞および脂肪細胞に分化される。この場合、幹細胞は、限定さ
れるものではないが、各細胞型内で時間および空間において測定される、ＰＦＫ
−１およびＰＦＫ−２のリン酸化状態のレポーター、細胞ＡＴＰレベルの測定（
エネルギー移動）、ＮＡＤ+/ＮＡＤＨのごとき酸化−還元共因子の比率、および
二次メッセンジャーｃＡＭＰの濃縮を含めた、炭水化物代謝フラックスのルミネ
セントレポーター分子を発現させるように作成される。筋肉および脂肪細胞では
、炭水化物代謝は各細胞型の生理学的機能；筋肉細胞の収縮および弛緩および脂
肪細胞における脂肪貯蔵および代謝を調製するのに重要な役割を演じる。従って
、このモデル系は、２つの組織型内での同一分子経路に対するリード化合物の効
果の測定を可能とする。さらに、この複数の組織型スクリーニングプラットフォ
ームはリード化合物の効率、特異性および毒性学の効果的なアドレシングを可能
とする。
【０２６５】 第３のより複雑なモデル系は、ニューロンおよび骨格筋幹細胞の共培養を含み
、両方の型はスペクトル的に区別されるルミネセントレポーター分子を発現する
ように作成される。細胞はパターン化され、基材上で分化される。ニューロンお
よび骨格筋細胞の複雑な相互作用に対するリード化合物の効果は、各細胞型に作
成されたルミネセントレポーター分子を用いて作成される。分化したニューロン
および骨格筋細胞の共培養は、励起−収縮カップリング事象の直接的測定および
これらの事象に対して有するリード化合物の効果を可能とする。
【０２６６】 これらのアプローチは、他の組織型の間の相互作用、および、限定されるもの
ではないが、末梢神経−平滑筋または平滑筋；上皮組織−平滑筋；血管内皮−平
滑筋；神経膠細胞−毛細血管の内皮細胞；脂肪細胞−末梢神経細胞およびシュワ
ン細胞の軸索；および膵臓Ｂ細胞−膵臓Ａ細胞を含めた器官内の複数細胞型間の
相互作用に一般化される。
【０２６７】 本発明は、さらに、細胞ベースのスクリーニングを提供し、ここに、幹細胞お
よび／または分化細胞は、選択されたテスト剤に応答して、細胞上または中、ま
たは細胞の区画内または間のルミネセントレポーター分子の分布、環境または活
性を保有する。限定されるものではないが、引用してその全部を一体化させる米
国特許第５，９８９，８３５号；係属する米国特許出願第０９／０３１，２７１
号（１９９８年２月２７日出願）；第０９／３５２，１７１号（１９９９年７月
１２日）；第０９／２９３，２０９号（１９９９年４月１６日出願）；第０９／
３９８，９６５号（１９９９年９月１７日出願）；０９／４３０，６５６号（１
９９９年１０月２９日出願）；第０９／５１３，７８３号（２０００年２月２４
日）；ギウリアーノ（Giuliano）ら，アン. レブ. バイオフィズ. バイオモル.
ストラクト.（Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.) 24:405-434(1995)； お
よびギウリアーノ（Giuliano）ら，トレンズ イン バイオテック.（Trends in
Biotech.） 16:135-140(1998)に記載されたものを含めた、種々のそのようなル
ミネセントレポーター分子が本発明のこの態様で用いることができる。
【０２６８】 本実施形態のこの製法において、パターン化幹細胞アレイおよびパターン化分
化細胞アレイを用いて、テスト化合物に応答しての、細胞上または中、または細
胞の細胞下区画内または間のルミネセントレポーター分子の分布、環境または活
性の変化を分析する。細胞を含有する基材を保持するのに適したステージを備え
た光学系、デジタルイメージを作り出すことができる検出デバイス、細胞から放
出された蛍光またはルミネセンスを検出デバイスに向けるための手段、および検
出デバイスからのデータを受け取り処理するためのコンピューターを含む細胞ス
クリーニングシステムを用いて、細胞をイメージしおよび／または走査する。そ
のようなデバイスの好ましい実施形態は、ここに引用してその全部を一体化させ
る米国特許第５，９８９，８３５号；および係属する米国特許出願第０９／０３
１，２７１号（１９９８年２月２７日出願）に開示されている。細胞スクリーニ
ングシステムを利用し、レポーター分子からのルミネセントシグナルをデジタル
データに変換し；デジタルデータを用いて、テスト剤に応答しての、レポーター
分子の分布、環境または活性の変化を測定する。
【０２６９】 そのようなデジタルデータを用いて細胞質−核、細胞膜−細胞質、小胞体−ゴ
ルジ装置の間のレポーター分子の分布に対するテスト化合物の効果を報告し、な
らびにアポトーシス；受容体内部化；転写因子活性化；蛋白質キナーゼ活性化；
プロテアーゼ活性；オルガネラの構造、分布および機能；マクロ分子の分布；遺
伝子発現；微小管細胞骨格構造；アクチン細胞骨格構造；核の形状；核の面積；
核のサイズ；核の周囲；ミトコンドリアポテンシャル；細胞形状；細胞移動度；
細胞サイズ；および細胞周囲について報告することができる（例えば、米国特許
第５，９８９，８３５号；係属する米国特許出願第０９／０３１，２７１号（１
９９８年２月２７日出願）；第０９／３５２，１７１号（１９９９年７月１２日
出願）；第０９／２９３，２０９号（１９９９年４月１６日出願）；第０９／３
９８，９６５号（１９９９年９月１７日出願）；第０９／４３０，６５６号（１
９９９年１０月２９日出願）；および第０９／５１３，７８３号（２０００年２
月２４日出願）参照）。
【０２７０】 限定されるものではないが、前記した開示のものを含めた製法における流体送
達系の使用、またはマイクロスポッターのごとき自動精度装備（Cartesian Tech
nologiesTM, Hewlett PackardTM, Gentic MicrosystemsTM）の使用は、選択され
た分化剤での特異的細胞結合位置の送達を可能とする。
【０２７１】 実施例 オルガノタイプ分化モデルシステム 神経膠細胞分化：高度に攻撃的なヒト神経膠芽細胞腫から採取した細胞は、培
養中に無限に増殖し、分化剤の存在下で改編された形態学的および増殖特徴を呈
することが示されている、ＳＮＢ−１９と命名された（ウェルチ（Welch）ら，1
995）これらの細胞は、ルミネセントレポーター分子を発現するように作成され
（後記参照）、それ自体、またはニューロン幹細胞と組み合わせることによって
、細胞基材上にパターン化される。分化を誘導するためには、１ｍＭジブチリル
−ｃＡＭＰおよび１ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ホスホジエステラーゼ阻
害剤）の混合物を培養に添加し、細胞を１２ないし２４時間インキュベートする
。これらの剤は細胞を誘導して、同一培養中の他の神経膠細胞としばしば相互作
用する複数プロセスを精巧に作成し（ウェルチ（Welch）ら，1995）、ならびに
細胞が分裂するのを停止させる。
【０２７２】 神経膠幹細胞をトランスフェクトして、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）−神経膠フ
ィブリル酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）を発現させる。キメラ。ＧＦＡＰは中間フィラ
メント細胞骨格の成分であり、神経膠幹細胞および分化した神経膠細胞で見い出
される主要な細胞骨格蛋白質である。
【０２７３】 ニューロン分化：本発明で用いることができるいくつかのニューロン幹細胞系
が存在する。ヒトテラトカルシノーマ細胞系からのＮＴ２細胞（プレジャー（Pl
easure）ら，1992）、それらは誘導して安定な有糸分裂後ヒトニューロンに分化
させることができる点でユニークであり、それらは発散した遺伝子産物の発現の
ためのビヒクルであることが示されている（プレジャー（Pleasure）ら，1992）
。ＮＴ２細胞は青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）−β−チューブリンキメラを発現する
ように作成されている。β−チューブリンは細胞骨格の主要な成分である。次い
で、細胞を、それ自体、あるいは神経膠幹細胞と組み合わせることによって、細
胞基材上にパターン化する。分化を誘導するために、ＮＴ２細胞はまず分化のプ
ログラムに入り、これはレチノイン酸（１０-5Ｍ）、有糸分裂阻害剤および特殊
化された細胞外マトリックスの２週間の処理で開始される。部分的に分化した細
胞を基材に移し、そこでそれらは、軸索および樹状体を形成する精巧なプロセス
によって分化の最終段階を受ける。細胞は有糸分裂後となるが、ルミネセント蛋
白質レポーター分子のごとき機能的蛋白質を発現する能力を保持する。
【０２７４】 混合された神経膠−ニューロン分化：分化の最終段階にあるＮＴ２幹細胞をＳ
ＮＢ−１９細胞と共に同一基材に添加する。両方の細胞型を付着させた後、共培
養を１ ｍＭジブチリル−ｃＡＭＰおよび１ｍＭイソブチルメチルキサンチンで
処理する。２つの細胞型をそれらが分化するにつれて相互作用させる。ＮＴ２細
胞は分化を始動するので、ジブチリル−ｃＡＭＰはニューロン細胞分化に対して
ほとんどないし全く効果を有さず、それを増強さえできる。というのは、ｃＡＭ
Ｐはいくつかの細胞型の分化を誘導することが知られているからである。
【０２７５】 共通の幹細胞からの脂肪および骨格筋組織：マウスＣ２Ｃ１２細胞系は多能性
であり、骨格筋（クエンダ（Cuenda）およびコーエン（Cohen），1999）、脂肪
細胞（テボール（Teboul）ら，1995）および骨芽細胞（ニシムラ（Nishimura）
ら，1998）に分化することができるのが示されている。Ｃ２Ｃ１２細胞は、まず
、炭水化物代謝のルミネセントレポーター分子を発現するように作成される（後
記参照）。細胞を基材上にパターン化し、ここに、増殖培地は＜１％子ウシ血清
を含有する。血清濃度のこの大きな低下（もともと１０％）は２０ないし４８時
間にわたってＣ２Ｃ１２細胞を誘導して分裂を停止させ、細長い多核細胞に融合
し、収縮筋管を形成する。脂肪細胞分化を誘導するには、細胞を５μＭチアゾリ
ジンジオンおよび１００μＭ脂肪酸の混合物で処理する（テボール（Teboul）ら
, 1995）。分化は２４ないし４８時間後に起こり、細胞増殖の遅延化および細胞
による脂肪酸の摂取および脂質液滴へのその取り込みが伴う。
【０２７６】 Ｃ２Ｃ１２細胞は、細胞エネルギー利用および貯蔵をバランスさせるにおける
鍵となる役割を演じる６−ホスホロフルクト−２−キナーゼ／フルクトース−２
，６−ビスフォスフェターゼ（ＰＦＫ−２）を含むレポーター分子でトランスフ
ェクトする。この二官能性酵素の活性は炭水化物酸化（エネルギー生成）および
炭水化物合成（エネルギー要求）の間で細胞をスイッチするように作用すること
ができる。ＰＦＫ−２のリン酸化状態は、酵素が細胞炭水化物分解または合成を
刺激するか否かを指令する（クーランド（Kurland）およびピルキス（Pilkis）
，プロテイン サイエンス（Protein Science）4:1023-1037(1995)）。ＰＦＫ−
２リン酸化部位を含有するアミノ酸配列を、挿入を許容するＧＦＰについてのコ
ーディング配列内の特異的部位に挿入し（バイルド（Baird）ら，プロク. ナシ
ョナル. アカド. サイ.(Proc. Natl. Acad. Sci.), 96:11241-11246(1999)）、
他方、ＧＦＰの蛍光特性はＰＦＫ−２のリン酸化に際して変化する。
【０２７７】 神経および筋肉組織相互作用：他のモデル系からの細胞構成要素を組み合わせ
て、組織−組織相互作用をモデル化する。ニューロンＮＴ２細胞をＣ２Ｃ１２細
胞と組み合わせて、分化の間のその相互作用を可能とし、組織のような多くが正
常な発生の間に相互作用する。３つのシナリオをテストする。
【０２７８】 １．ＮＴ２およびＣ２Ｃ１２細胞を一緒に整列させ、一緒に分化させる。
【０２７９】 ２．ＮＴ２細胞を基材上で整列させ、分化させ、続いてＣ２Ｃ１２細胞を添加
し、分化させる； ３．Ｃ２Ｃ１２筋肉幹細胞を基材上に整列させ、分化させ、続いてニューロン
ＮＴ２幹を添加し、分化させる。
【０２８０】 他の実施例 米国特許第６，０３３，９０６号に開示されているごとく、ニューロン稜幹細
胞をポリ−Ｄ−リシンおよびフィブロネクチンで処理して、末梢ニューロンおよ
び神経膠細胞を生じさせることができる。フィブロネクチンで処理すると、同一
幹細胞は神経膠細胞のみを生じ、ニューロンは生じなかった。
【０２８１】 １００ｎＭデキサメタゾン＋１０ｍＭ β−グリセロホスフェートで処理した
間葉幹細胞を誘導して骨形成を受けさせる（米国特許第５，９４２，２２５号）
。５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰで処理した同一幹細胞を誘導して軟骨細胞形成を受けさ
せ；もし５−アザシチジンで処理すると、それらは誘導されて筋肉形成を受ける
。最後に１０ｕ／ｍｌ ＩＬ−１αで処理した同一幹細胞支質細胞に分化する。
【０２８２】 米国特許第５，８２７，７４０号は、グルココルチコイドおよびホスホジエス
テラーゼ阻害剤で間葉幹細胞を処理して脂肪形成を誘導することを教示する。
【０２８３】 本発明は前記特定の好ましい実施形態によって限定されない。本発明の概念を
逸脱することなく開示された好ましい実施形態に対して種々の修飾を行うことが
できるのは当業者に可能であろう。全てのそのような修飾は本発明の範囲内にあ
ることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、小さな基板微細パターン化の化学アレイの平面図である。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、大きな基板微細パターン化の化学アレイの平面図である。
【図２】 図２は、基板上の微細パターン化の化学アレイを生産する方法を示す図である
。
【図３Ａ】 図３Ａは、微細パターン化の化学アレイに付着され、２つの蛍光プローブで標
識された、表面パターン化チップ上での繊維芽細胞増殖を示す写真である。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、微細パターン化化学アレイに付着され、２つの蛍光プローブで標識
された、スポットパターンの繊維芽細胞増殖を示す写真である。
【図４】 図４は、複数の細胞タイプの頂部およびチャンバー底部のミクロアレイの組合
わせであるカセットの図である。
【図５】 図５は、細胞の不均一微細パターン化アレイにおいて「ウェル」にアドレスす
るためのナノ製造インプットチャンネルを有するチャンバーの図である。
【図６】 図６は、チャンネルを持たないチャンバーの図である。
【図７】 図７Ａは、基板上にエッチングされたミクロ流体チャンネルを持つチャンバー
の頭上図である。 図７Ｂは、基板上にエッチングされたミクロ流体チャンネルを持つチャンバー
の側面図である。
【図８】 図８Ａは、ミクロ流体チャンネルおよびウェルが流体送達チャンバー上に刻ま
れた材料の隆起したマトリクスから形成されたチャンバーの頭上図である。 図８Ｂは、ミクロ流体チャンネルおよびウェルが流体送達チャンバー上に刻ま
れた材料の隆起したマトリクスから形成されたチャンバーの側面図である。
【図９】 各ウェルが、チャンバーの１つの側面から由来するチャンネルによってアドレ
スされるチャンバーの図である。
【図１０】 図１０は、ウェルがチャンバーの２つの側面に由来するチャンネルによってア
ドレスされるチャンバーの図である。
【図１１】 図１１は、ミクロ流体スイッチが光、熱または他の機械的手段によって制御さ
れるチャンバーの図である。
【図１２】 図１２は、蛍光リーダー装備の図である。
【図１３】 図１３は、蛍光リーダー装備光学系の１つの実施形態の図である。
【図１４Ａ】 図１４Ａは、細胞スクリーニング方法の概観を備えるフローチャートである。
【図１４Ｂ】 図１４Ｂは、マクロ（高スループットモード）処理フローチャートである。
【図１４Ｃ】 図１４Ｃは、ミクロ（高含有量モード）処理フローチャートである。
【図１５】 図１５は、統合された細胞スクリーニングシステムの図である。
【図１６】 図１６は、蛍光リーダー装備のユーザインターフェイスの写真である。
【図１７】 図１７Ａは、未修飾基板に非特異的に付着されたリンパ系細胞を示す写真であ
る。 図１７Ｂは、ＩｇＭをコートした基板に非特異的に付着されたリンパ系細胞を
示す写真である。 図１７Ｃは、全抗血清セラムをコートした基板に特異的に結合したリンパ系細
胞を示す写真である。
【図１８】 図１８Ａは、「ヒット」を同定する蛍光リーダー装備の高スループットモード
からの写真像である。 図１８Ｂは、高含有量生物学的情報を同定する高含有量モードを示す一連の写
真像である。
【図１９】 図１９は、高含有量モードから集められた細胞データのディスプレイを示す写
真像である。
【図２０】 図２０は、全アレイの細胞結合位置のサブアレイの同時像形成による細胞像形
成の最適化を示す。基板上の細胞結合位置アレイ、チャンバー上の流体位置アレ
イ、および２つを接合することによって形成されたウェルのアレイの間には１：
１の依存性がある。
【図２１】 図２１は、各流体位置に別々のインプットおよびアウトプットチャンネルが設
けられ、ｎ×ｎアレイについての２ｎ２のチャンネルを生じるミクロ流体装置の
８×８アレイ（６４ウェル、１２８チャンネル）を例示する。
【図２２】 図２２は、ｍ＋ｎ２バルブまたはポンプを利用してｍの液体または気体混合物
の８×８アレイへの流動を制御する。
【図２３】 図２３は、流体送達系がインプットおよびアウトプットチャンネルの直交非交
差アレイ、および複数レベルを利用する水平結合チャンネルからなり、ここに、
２つの層はウェル層の同一面にあるミクロ流体装置の実施形態を示す。
【図２４】 図２４は図２３の実施形態の端面図および側面図を示す。
【図２５】 図２５は、流体送達系がインプットおよびアウトプットチャンネルの直交非交
差アレイ、および複数レベルを利用する垂直結合チャンネルからなり、ここに、
２つの層がウェル層のその上方の面にあるミクロ流体装置の実施形態を示す。
【図２６】 図２６は図２５の実施形態の端面図および側面図を示す。
【図２７】 図２７は、ｍの正圧源容器またはポンプ、バルブレスマニホールド、および気
圧のバルブフリー廃棄容器を用いることによって化合物が単一流体位置に多重化
されたミクロ流体装置の実施形態を示す。
【図２８】 図２８は、ｍの正圧源容器またはポンプ、バルブドマニホールド、または気圧
のｍ源容器に結合したｍのバルブを備えた負圧廃棄容器またはポンプまたは気圧
のバルブフリー廃棄容器を用いることによって、化合物を単一流体位置に多重化
させたミクロ流体装置の実施形態を示す。
【図２９】 図２９は、ｍの正圧源容器またはポンプのアレイが１×ｎインプットおよびｎ
×ｌアウトプットバルブマニホールドによって流体位置のｎ×ｎ直交チャンネル
アレイに多重化されたミクロ装置の実施形態を示す。
【図３０】 図３０は、気圧のｍの容器およびｌ×ｎインプットおよびｎ×ｌアウトプット
バルブマニホールドによる負圧廃棄容器を備えたミクロ流体装置の実施形態を示
し、ここに、負圧容器は機械的にまたは熱力学的にポンプ送液することができる
。
【図３１】 図３１は、いずれかの特定の正圧源容器の作動と協働して作動されなければな
らないただ１つの廃棄負圧容器があるデュアルポンプドシステムの実施形態を示
す。この負圧容器は機械的もしくは熱力学的（例えば、毛細管作用ポンプ）いず
れかの手段によって機能することができる。毛細管作用ポンプでは、ポンプの「
作動」はバルブによって達成される。
【図３２】 図３２は、正圧源容器を使用する図２９のポンピングおよびバルビングスキー
ムがいかにして、ｎ行チャンネルおよび２ｎ列チャンネルの直交アレイ（ｎの通
常列チャンネル＋ｎ洗浄列チャンネル）で働くように拡大することができること
を示す。これは２ｎ×ｌアウトプットバルブマニホールドを必要とする。同様に
、負圧廃棄容器を使用する図３０の配列は洗浄チャンネルを取り込むアレイで働
くように拡大することができる。
【図３３】 図３３は、各列チャンネルｋが会合する平行洗浄チャンネルｋ＊を有するミク
ロ流体装置の実施形態を示す。
【図３４】 図３４は、流体送達系が、複数レベルを利用する、垂直結合チャンネルを備え
たインプットおよびアウトプットチャンネルの直交非交差アレイからなり、ここ
に、２つの層はウェル層のその上方面にあって、各列チャンネルｋが会合した平
行洗浄チャンネルｋ＊を有するミクロ流体装置の実施形態を示す。
【図３５】 図３５は、ウェル（ｊ，ｋ）を通っての流体流動の場合において、行チャンネ
ルｊから洗浄チャンネルｋ＊（ここに、ｋ＊は列チャンネルｋにすぐに隣接する
）への液体または気体のセグメントをすすぐための方法の実施例を示す。
【図３６】 図３６は、チャンネルを流体位置に結合する隣接通路の各対の間の、バルブエ
レメントおよび弁座を含む、「正常に閉じられた」チェックバルブを用いる拡散
制御の方法を示す。
【図３７】 図３７は、外部から適用された磁場勾配が、磁性材料を取り込むバルブエレメ
ントおよび弁座に対する復元力を誘導する実施形態を示す。
【図３８】 図３８は、外部から適用された復元力がボールを左側に押して弁座中の丸い開
口に入れる場合のみボールを通過した拡散が停止される形状付与弁座の実施形態
を示す。
【図３９】 図３９は、全ミクロ流体装置に適用された単一磁場勾配が、インプットチャン
ネルのボールバルブの組およびアウトプットチャンネルのボールバルブの組双方
に対する力を誘導することを可能とする実施形態を示す。
【図４０】 図４０は、カセットに内蔵された全てのポンプおよびバルブがあるように本発
明のポンピングおよびバルビングスキームの１つの実施形態を示す。
【図４１】 図４１は、ポンプが埋蔵され、電気により駆動される流動を利用し、ここに、
電場がウェルのアレイのマトリクスに対して外部にある領域に限定され、生きた
細胞が存在するウェルのいずれかを横切って適用される電場勾配が最小または全
くない実施形態を示す。
【図４２】 図４２（ａ）はトレシル−ＰＥＧの標準的な構造を示し、ここに、「ｎ」はい
ずれかの数に等しい。（ｂ）はトリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミ
ンの構造を示す。
【図４３】 図４３（ａ）はアミン−ＰＥＧ表面産物の例を示す。（ｂ）は表面アミンの例
を示す。
【図４４】 図４４は細胞接着性分子および細胞反発性分子の選択的位置決定を達成するた
めの最も好ましい実施形態である。
【図４５】 図４５は、組織−特異的および器官−特異的細胞基材の双方を生じさせるため
の、基材上での幹細胞の選択的分化についての実験フローチャートである。 （符号の説明） ００１ 流体位置 ００２ 所望により凹所を持ってもよい流体位置アレイ ００３ サブアレイ ００４ 基板 ００８ 細胞結合位置 ００９ 細胞結合位置の化学的修飾 ０１０ 細胞結合位置上に整列させた細胞 ０１２ チャンバー ０１３ 流体位置に形成された凹所 ０１４ インプットチャンネル ０１６ アウトプットチャンネル ０１８ カセット ０２０ スペーサ支持体 ０２４ ミクロ毛細管チューブ ０２８ 一段と高い容器 ０３０ 第１のチャンネル ０３２ 第２のチャンネル ０３６ プラグ ０４０ 流体位置アレイ ０４４ 蛍光リーダー器具 ０４８ 第１の保存区画 ０５０ 第１のロボットアーム ０５２ 第２のロボットアーム ０５４ 第２の保存区画 ０５６ コンピュータ ０６０ オプティクス ０６４ コンピュータ制御ｘ−ｙ−ｚステージ ０６８ コンピュータ制御回転対物レンズ台 ０７０ 低倍率対物レンズ ０７２ 高倍率対物レンズ ０７４ 白色光の光源ランプ ０７６ 励起フィルタホイール ０７８ ２色フィルタシステム ０８０ 発光フィルタ ０８２ ディテクタ（例えば、冷却ＣＣＤ） ０８６ コンピュータスクリーン ０９０ データベース １４０ ウェル間の横方向 １６０ 水平結合チャンネル １８０ 垂直結合チャンネル ２００ スイッチ可能な正圧源容器またはポンプ ２２０ 常圧の源容器 ２４０ ｍ×ｌバルブレスマニホールド ３００ 廃棄容器 ３２０ スイッチ可能な負圧廃棄容器またはポンプ ３４０ 熱力学的にポンピングされた廃棄容器 ４００ ｌ×ｎバルブマニホールド ４１０ ｎ×ｌバルブマニホールド ４２０ ２ｎ×ｌバルブマニホールド ５００ チェックバルブ ５２０ バルブエレメント ５４０ 弁座 ５６０ 磁場（Ｂ）勾配 ５８０ 磁性ボウルチェックバルブに対する復元力 ６００ ビーズ ６２０ 磁場 ７００ ポートの充填 ７１０ チャンネル ７２０ バルブ ７３０ 容器 ７４０ 動電学ポンプ ７６０ 電極１ ７８０ 電極２
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 37/00 １０２ 37/00 １０２ １０３ １０３ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アダムス、 テリー アメリカ合衆国 15215 ペンシルベニア 州 ピッツバーグ イースターン アヴェ ニュー 100 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA36 FB03 FB07 FB12 HA14 4B029 AA07 AA08 AA21 BB11 CC02 CC08 FA15 GA03 4B063 QA01 QA05 QQ05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR77 QR84 QS31

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）反応性ヒドロキシル基を含有する表面を持つ基材を供し
    、； ｂ）前記基材の前記表面の前記ヒドロキシル基を、ヒドロキシ−反応性部位お
    よび求核部位を含む二官能性分子と接触させて単層を形成させ； ｃ）ステンシルを前記基材に適用し； ｄ）親電子細胞反発部位を前記単層の露出領域に適用して、工程ｂで沈積した
    前記細胞反発部位および前記二官能性求核体の間に共有結合を形成させ、細胞反
    発位置を生じさせ； ｅ）前記ステンシルを除去し；次いで、 ｆ）前記ステンシルに接触した位置のみにおいて前記基材に結合する細胞接着
    分子を前記基材に適用して細胞結合位置を生じさせる、； ことを特徴とする選択的細胞パターニング用の基材の製法。
  2. 【請求項２】 ａ）反応性ヒドロキシル基を含有する表面を持つ基材を供し
    、； ｂ）前記基材の前記表面の前記ヒドロキシル基を、ヒドロキシ−反応性部位お
    よび求核部位を含む二官能性分子と接触させて単層を形成させ； ｃ）ステンシルを前記基材に適用し； ｄ）前記単層上の露出領域に細胞接着性分子を適用して、細胞結合位置を生じ
    させ； ｅ）前記ステンシルを除去し；次いで、 ｆ）前記ステンシルに接触した位置のみにおいて工程ｂで沈積した前記二官能
    性求核体とで共通結合を形成する親電子細胞反発部位を前記基材に適用して細胞
    反発位置を生じさせる； ことを特徴とする選択的細胞パターニング用の基材の製法。
  3. 【請求項３】 前記基材の前記表面に前記反応性ヒドロキシル基を供するよ
    うに前記基材を処理することを特徴とする請求項１または２に記載の製法。
  4. 【請求項４】 前記基材を酸素プラズマ処理して、前記基材の前記表面に前
    記反応性ヒドロキシル基を供することを特徴とする請求項３に記載の製法。
  5. 【請求項５】 前記二官能性分子がオルガノシランを含むことを特徴とする
    請求項１または２に記載の製法。
  6. 【請求項６】 前記二官能性分子がアミノシランを含むことを特徴とする請
    求項１または２に記載の製法。
  7. 【請求項７】 前記反応性細胞反発部位が塩化トレシル活性化−ポリ（エチ
    レン）グリコール化合物を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の製法
    。
  8. 【請求項８】 前記基材の前記表面の前記ヒドロキシル基と前記二官能性分
    子との前記接触に気相析出を用いることを特徴とする請求項１または２に記載の
    製法。
  9. 【請求項９】 さらに、細胞−結合蛋白質またはペプチドの細胞結合位置へ
    の結合を可能とする条件下で、前記細胞結合位置を前記細胞−結合蛋白質または
    前記ペプチドと接触させることを含むことを特徴とする請求項１または２に記載
    の製法。
  10. 【請求項１０】 さらに、細胞の前記細胞結合位置への結合を可能とする条
    件下で、前記細胞結合位置を前記細胞と接触させることを含むことを特徴とする
    請求項１または２に記載の製法。
  11. 【請求項１１】 さらに、前記細胞の前記細胞−結合蛋白質または前記ペプ
    チドへの結合を可能とする条件下で、前記細胞結合位置の前記細胞−結合蛋白質
    または前記ペプチドを前記細胞と接触させることを含むことを特徴とする請求項
    ９に記載の製法。
  12. 【請求項１２】 さらに、前記基材を凍結乾燥することを特徴とする請求項
    ９に記載の製法。
  13. 【請求項１３】 さらに、前記基材を低温保存または乾燥することを特徴と
    する請求項１０に記載の製法。
  14. 【請求項１４】 さらに、前記基材を低温保存または乾燥することを特徴と
    する請求項１１に記載の製法。
  15. 【請求項１５】 第１の複数の細胞接着性分子がカップリングした反応性表
    面を有する少なくとも第１の部分、および第２の複数の細胞反発性部位がカップ
    リングした露出した表面を有する少なくとも第２の部分を含み、前記細胞接着性
    分子はシラン類よりなる群から選択され、前記細胞反発性部位は塩化トレシル−
    活性化（ポリエチレン）グリコールを含むことを特徴とする細胞パターニング基
    材。
  16. 【請求項１６】 前記シランがアミノシランを含むことを特徴とする請求項
    １５に記載の細胞パターニング基材。
  17. 【請求項１７】 前記アミノシランが、トリメトキシシリルプロピルジエチ
    レントリアミン、トリメトキシシリルエチレンジアミン、アミノプロピルトリエ
    トキシシラン、トリメトキシアミノプロピルシラン、またはトリクロロシリルエ
    チレンジアミン、アミノプロピルトリクロロシランのごときクロロシランを限定
    されるものではないが含む、メトキシまたはエトキシシランよりなる群から選択
    されることを特徴とする請求項１６に記載の細胞パターニング基材。
  18. 【請求項１８】 前記アミノシランが前記トリメトキシシリルプロピルジエ
    チレントリアミンであることを特徴とする請求項１６に記載の細胞パターニング
    基材。
  19. 【請求項１９】 さらに、複数の前記細胞接着性分子に結合した細胞−結合
    蛋白質またはペプチドを含むことを特徴とする請求項１５に記載の細胞パターニ
    ング基材。
  20. 【請求項２０】 前記基材が凍結乾燥されることを特徴とする請求項１９に
    記載の細胞パターンニング基材。
  21. 【請求項２１】 さらに、複数の前記細胞接着促進剤に結合した細胞を含む
    ことを特徴とする請求項１５に記載の細胞パターニング基材。
  22. 【請求項２２】 さらに、前記細胞−結合蛋白質または前記ペプチドに結合
    した細胞を含むことを特徴とする請求項１９に記載の細胞パターニング基材。
  23. 【請求項２３】 前記基材が低温保存されるか、または乾燥に付されること
    を特徴とする請求項２１に記載の細胞パターニング基材。
  24. 【請求項２４】 前記基材が低温保存されるか、または乾燥に付されること
    を特徴とする請求項２２に記載の細胞パターニング基材。
  25. 【請求項２５】 請求項１または２に記載の製法によって調製されることを
    特徴とする細胞パターニング基材。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004533605A (ja) * 2001-03-09 2004-11-04 バイオミクロ システムズ インコーポレイティッド アレイとのミクロ流体的インターフェース接続方法およびシステム
WO2005029074A1 (ja) * 2003-09-24 2005-03-31 Olympus Corporation 生体関連物質の反応装置
JP2005099004A (ja) * 2003-08-27 2005-04-14 Matsushita Electric Ind Co Ltd マイクロチップ並びにその製造方法及びそれを用いた検査方法
JP2005160441A (ja) * 2003-12-05 2005-06-23 Dainippon Printing Co Ltd パターニング用基板および細胞培養基板
JP2005257544A (ja) * 2004-03-12 2005-09-22 Gl Sciences Inc マイクロチップ
JP2007033090A (ja) * 2005-07-22 2007-02-08 Asahi Glass Co Ltd 光学検出用基板およびその製造方法
JP2008505630A (ja) * 2004-07-09 2008-02-28 サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク 新規のマイクロ流体システム及び細胞捕獲方法
JP2009513978A (ja) * 2005-10-26 2009-04-02 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 流体試料をセンサーアレイにデリバリーするための方法及びシステム
JP2014209853A (ja) * 2013-04-17 2014-11-13 大日本印刷株式会社 細胞培養用基材の製造方法
JP2015014507A (ja) * 2013-07-04 2015-01-22 株式会社ニコン 分注装置、バイオチップのスクリーニング装置、分注方法、及びバイオチップのスクリーニング方法
JP2020180794A (ja) * 2019-04-23 2020-11-05 住友ゴム工業株式会社 医療用検査装置及び細胞検査方法

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7282240B1 (en) 1998-04-21 2007-10-16 President And Fellows Of Harvard College Elastomeric mask and use in fabrication of devices
US6743576B1 (en) 1999-05-14 2004-06-01 Cytokinetics, Inc. Database system for predictive cellular bioinformatics
US6651008B1 (en) 1999-05-14 2003-11-18 Cytokinetics, Inc. Database system including computer code for predictive cellular bioinformatics
US7151847B2 (en) 2001-02-20 2006-12-19 Cytokinetics, Inc. Image analysis of the golgi complex
AU4365601A (en) 2000-03-17 2001-10-03 Harvard College Cell patterning technique
WO2002016903A2 (en) * 2000-08-23 2002-02-28 Imego Ab Microfluidic device and method with trapping of sample in carities having lids that can be opened or closed
US7998746B2 (en) 2000-08-24 2011-08-16 Robert Otillar Systems and methods for localizing and analyzing samples on a bio-sensor chip
US20020048821A1 (en) 2000-08-24 2002-04-25 David Storek Sample preparing arrangement and a method relating to such an arrangement
DE10041853C1 (de) * 2000-08-25 2002-02-28 Gmd Gmbh Konfigurierbares Mikroreaktornetzwerk
EP1181974A1 (en) * 2000-08-25 2002-02-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Configurable microreactor network
US6844184B2 (en) 2000-11-08 2005-01-18 Surface Logix, Inc. Device for arraying biomolecules and for monitoring cell motility in real-time
US6893851B2 (en) 2000-11-08 2005-05-17 Surface Logix, Inc. Method for arraying biomolecules and for monitoring cell motility in real-time
US7326563B2 (en) 2000-11-08 2008-02-05 Surface Logix, Inc. Device and method for monitoring leukocyte migration
US7374906B2 (en) 2000-11-08 2008-05-20 Surface Logix, Inc. Biological assays using gradients formed in microfluidic systems
US7033819B2 (en) 2000-11-08 2006-04-25 Surface Logix, Inc. System for monitoring cell motility in real-time
US7033821B2 (en) 2000-11-08 2006-04-25 Surface Logix, Inc. Device for monitoring cell motility in real-time
US6864065B2 (en) 2000-11-08 2005-03-08 Surface Logix, Inc. Assays for monitoring cell motility in real-time
AU2002230415A1 (en) 2000-11-17 2002-05-27 Universal Imaging Corporation Rapidly changing dichroic beamsplitter
US7218764B2 (en) 2000-12-04 2007-05-15 Cytokinetics, Inc. Ploidy classification method
US6599694B2 (en) 2000-12-18 2003-07-29 Cytokinetics, Inc. Method of characterizing potential therapeutics by determining cell-cell interactions
GB2389692B (en) 2001-02-20 2005-06-29 Cytokinetics Inc Method and apparatus for automated cellular bioinformatics
US6956961B2 (en) 2001-02-20 2005-10-18 Cytokinetics, Inc. Extracting shape information contained in cell images
US7016787B2 (en) 2001-02-20 2006-03-21 Cytokinetics, Inc. Characterizing biological stimuli by response curves
US7085765B2 (en) 2001-03-12 2006-08-01 Cellomics, Inc. Methods to increase the capacity of high content cell-based screening assays
WO2002088388A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Ruebben Albert A method and a device for quantification of mutation loads
US6977138B2 (en) 2001-07-24 2005-12-20 Massachusetts Institute Of Technology Reactive polymer coatings
US7169577B2 (en) 2001-07-27 2007-01-30 Surface Logix, Inc. Cell isolation and screening device and method of using same
US7285412B2 (en) 2001-07-27 2007-10-23 Surface Logix Inc. Device for magnetic immobilization of cells
US7169578B2 (en) 2001-07-27 2007-01-30 Surface Logix, Inc. Cell isolation and screening device and method of using same
US7666661B2 (en) 2001-08-27 2010-02-23 Platypus Technologies, Llc Substrates, devices, and methods for quantitative liquid crystal assays
JP2005506839A (ja) * 2001-10-02 2005-03-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 細胞外マトリックスおよび他の分子を使用する幹細胞の増殖および分化
TW200409668A (en) * 2002-05-28 2004-06-16 Jsr Corp Device for fluid processor and its fluid flow path setting device, fluid processor, and fluid processing method
JP2004081019A (ja) * 2002-08-23 2004-03-18 Jsr Corp 細胞反応検査用装置および細胞反応検査方法
CA2500283A1 (en) * 2002-09-25 2004-04-08 California Institute Of Technology Microfluidic large scale integration
GB2423988A (en) 2003-07-18 2006-09-13 Cytokinetics Inc Characterizing biological stimuli by response curves
US20050014217A1 (en) 2003-07-18 2005-01-20 Cytokinetics, Inc. Predicting hepatotoxicity using cell based assays
US7235353B2 (en) 2003-07-18 2007-06-26 Cytokinetics, Inc. Predicting hepatotoxicity using cell based assays
CN100514065C (zh) * 2003-08-27 2009-07-15 松下电器产业株式会社 微芯片及其制造方法以及使用微芯片的检查方法
US20050059140A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-17 Andrea Liebmann-Vinson Methods of surface modification to enhance cell adhesion
EP1759720A4 (en) 2004-06-01 2012-05-30 Dainippon Printing Co Ltd ARTIFICIAL BLOOD VESSEL AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME
US7323318B2 (en) 2004-07-15 2008-01-29 Cytokinetics, Inc. Assay for distinguishing live and dead cells
KR100740228B1 (ko) 2005-07-11 2007-07-16 연세대학교 산학협력단 세포고정용 생체물질을 패터닝하는 장치와 방법 및 이러한방법에 의하여 제조된 세포칩
US7909928B2 (en) 2006-03-24 2011-03-22 The Regents Of The University Of Michigan Reactive coatings for regioselective surface modification
WO2007136724A2 (en) 2006-05-17 2007-11-29 Cellumen, Inc. Method for automated tissue analysis
US7947148B2 (en) 2006-06-01 2011-05-24 The Regents Of The University Of Michigan Dry adhesion bonding
US8399047B2 (en) 2007-03-22 2013-03-19 The Regents Of The Univeristy Of Michigan Multifunctional CVD coatings
US9968935B2 (en) 2007-08-20 2018-05-15 Platypus Technologies, Llc Devices for cell assays
DE102008060991A1 (de) * 2008-12-08 2010-06-10 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Subtrate zur Selektion und spezifischen Beeinflussung der Funktion von Zellen
FR2941531B1 (fr) * 2009-01-26 2019-07-05 Phuong Lan TRAN Dispositif microfluidique, systeme et procede de mise en oeuvre
EP2686688B1 (en) 2011-03-17 2019-05-08 Cernostics, Inc. Systems and compositions for diagnosing barrett's esophagus and methods of using the same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776748A (en) * 1993-10-04 1998-07-07 President And Fellows Of Harvard College Method of formation of microstamped patterns on plates for adhesion of cells and other biological materials, devices and uses therefor
BE1008955A3 (fr) * 1994-11-14 1996-10-01 Univ Catholique Louvain Procede d'obtention de biomateriaux et produits obtenus.

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004533605A (ja) * 2001-03-09 2004-11-04 バイオミクロ システムズ インコーポレイティッド アレイとのミクロ流体的インターフェース接続方法およびシステム
JP2005099004A (ja) * 2003-08-27 2005-04-14 Matsushita Electric Ind Co Ltd マイクロチップ並びにその製造方法及びそれを用いた検査方法
WO2005029074A1 (ja) * 2003-09-24 2005-03-31 Olympus Corporation 生体関連物質の反応装置
JP2005098806A (ja) * 2003-09-24 2005-04-14 Olympus Corp 生体関連物質の反応装置
JP2005160441A (ja) * 2003-12-05 2005-06-23 Dainippon Printing Co Ltd パターニング用基板および細胞培養基板
JP2005257544A (ja) * 2004-03-12 2005-09-22 Gl Sciences Inc マイクロチップ
JP2008505630A (ja) * 2004-07-09 2008-02-28 サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク 新規のマイクロ流体システム及び細胞捕獲方法
JP2007033090A (ja) * 2005-07-22 2007-02-08 Asahi Glass Co Ltd 光学検出用基板およびその製造方法
JP2009513978A (ja) * 2005-10-26 2009-04-02 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 流体試料をセンサーアレイにデリバリーするための方法及びシステム
JP2014209853A (ja) * 2013-04-17 2014-11-13 大日本印刷株式会社 細胞培養用基材の製造方法
JP2015014507A (ja) * 2013-07-04 2015-01-22 株式会社ニコン 分注装置、バイオチップのスクリーニング装置、分注方法、及びバイオチップのスクリーニング方法
JP2020180794A (ja) * 2019-04-23 2020-11-05 住友ゴム工業株式会社 医療用検査装置及び細胞検査方法

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