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ES2732191T3 - Diacuerpos covalentes y usos de los mismos - Google Patents

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ES2732191T3
ES2732191T3 ES09837939T ES09837939T ES2732191T3 ES 2732191 T3 ES2732191 T3 ES 2732191T3 ES 09837939 T ES09837939 T ES 09837939T ES 09837939 T ES09837939 T ES 09837939T ES 2732191 T3 ES2732191 T3 ES 2732191T3
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ES
Spain
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seq
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English (en)
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Leslie S Johnson
Ling Huang
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Macrogenics Inc
Original Assignee
Macrogenics Inc
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Abstract

Una molécula de diacuerpo que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, estando las cadenas polipeptídicas unidas covalentemente entre sí, en donde: I. la primera cadena de polipéptido comprende: (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un epítopo (1), (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un epítopo (2) y (iii) un tercer dominio que comprende: (1) un dominio Fc; o (2) un dominio bisagra; o (3) una región constante de cadena ligera (CL); estando el primer dominio y el segundo dominio unidos covalentemente, de tal forma que el primer dominio y el segundo dominio no se asocian entre sí para formar un sitio de unión a epítopo (1) o un sitio de unión a epítopo (2); II. la segunda cadena polipeptídica comprende: (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2) específica para el epítopo (2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) específica para el epítopo (1) y (iii) un sexto dominio que comprende: (1) un dominio Fc, donde el tercer dominio comprende un dominio Fc; o (2) una porción peptídica que comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), donde el tercer dominio comprende un dominio Fc o un dominio bisagra; o (3) una región constante 1 (CH1) de cadena pesada, una región bisagra, una región constante 2 (CH2) de cadena pesada y una región constante 3 (CH3) de cadena pesada, donde el tercer dominio comprende una región constante de cadena ligera (CL); estando el cuarto dominio y el quinto dominio unidos covalentemente, de tal forma que el cuarto dominio y el quinto dominio no se asocian entre sí para formar un sitio de unión a epítopo (1) o un sitio de unión a epítopo (2); en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian entre sí para formar un sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al epítopo (1); en donde el segundo dominio y el cuarto dominio se asocian entre sí para formar un sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al epítopo (2); y en donde: (1) los dominios segundo y tercero; y/o (2) los dominios quinto y sexto; están unidos entre sí mediante un enlazador polipeptídico intermedio que consiste en una secuencia que se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:278, 280, 281, 283, 284, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 293, 295 y 297.

Description

DESCRIPCIÓN
Diacuerpos oovalentes y usos de Ios mismos
1. Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a moléculas de diacuerpo, también conocidas como "reactivos de redireccionamiento de afinidad dual" ("DART"). Las moléculas de diacuerpo de la divulgación comprenden al menos dos cadenas polipeptídicas que se asocian para formar al menos dos sitios de unión a epítopo, que pueden reconocer epítopos iguales o diferentes. Adicionalmente, los epítopos pueden ser de las mismas moléculas o de moléculas diferentes o estar ubicados en las mismas células o en células diferentes. Las cadenas polipeptídicas individuales de la molécula de diacuerpo pueden estar unidas de manera covalente mediante enlaces covalentes no peptídicos, tales como, pero sin limitación, enlaces disulfuro de restos de cisteína ubicados dentro de cada cadena polipeptídica. En realizaciones particulares, las moléculas de diacuerpo de la presente divulgación comprenden además una región Fc, que permite la modificación por ingeniería de la funcionalidad de tipo anticuerpo en la molécula.
2. Antecedentes de la invención
El diseño de los diacuerpos covalentes se basa en la construcción de Fv monocatenario (scFv) (Holliger et al. (1993) "Diabodies": Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). En una IgG intacta no modificada, los dominios VL y VH se ubican en diferentes cadenas polipeptídicas, es decir, la cadena ligera y la cadena pesada, respectivamente. La interacción de una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo y, en particular, la interacción de los dominios VL y VH forma uno de los sitios de unión a epítopo del anticuerpo. Por el contrario, la construcción de scFv comprende un dominio VL y VH de un anticuerpo contenido en una sola cadena polipeptídica, en donde los dominios están separados por un enlazador flexible de suficiente longitud para permitir el autoensamblaje de los dos dominios produciendo un sitio de unión a epítopo funcional. Cuando el autoensamblaje es imposible debido a un enlazador de insuficiente longitud (menor de aproximadamente 12 restos de aminoácido), dos de las construcciones scFv interactúan entre sí formando una molécula bivalente, asociándose la región VL de una cadena con la región VH de la otra (revisado en Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies", Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). Además, la adición de un resto de cisteína al extremo C-terminal de la construcción ha demostrado permitir la unión por enlaces disulfuro de las cadenas polipeptídicas, estabilizando el dímero resultante sin interferir con las características de unión de la molécula bivalente (véase, por ejemplo, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27). Además, en los casos donde se seleccionan dominios VL y VH con diferente especificidad, puede construirse no solo una molécula bivalente, sino también biespecífica.
Los diacuerpos bivalentes tienen una gran variedad de aplicaciones que incluyen la terapia y el inmunodiagnóstico. La bivalencia permite tener gran flexibilidad en el diseño y la modificación por ingeniería del diacuerpo en diversas aplicaciones, proporcionando mejor avidez hacia los antígenos multiméricos, la reticulación de diferentes antígenos y la dirección dirigida a tipos específicos de células basándose en la presencia de ambos antígenos diana. Debido a su mayor valencia, las bajas constantes de disociación y el rápido aclaramiento de la circulación (para diacuerpos de pequeño tamaño, en o por debajo de ~50 kDa), las moléculas de diacuerpo conocidas en la técnica también han demostrado un uso particular en el campo de la obtención de imágenes de tumores (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris", Protein Eng.
10:1221). Es de importancia particular la reticulación de diferentes células, por ejemplo, la reticulación de linfocitos T citotóxicos con células tumorales (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells", Nature 314:628-631 y Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody", Protein Eng. 9:299-305). Los dominios de unión a epítopo de diacuerpos también pueden dirigirse a un determinante de superficie de cualquier célula efectora inmunitaria, tal como CD3, CD16, CD32 o CD64, que se expresan en linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK) u otras células mononucleares. En múltiples estudios, se observó que un diacuerpo de unión a determinantes de células efectoras, por ejemplo, Receptores Fcy (FcyR), también activa a la célula efectora (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins", Cáncer Res. 59:2909-2916). Normalmente, la activación de células efectoras se desencadena por la unión de un anticuerpo unido al antígeno a una célula efectora a través de la interacción de Fc y FcyR; por lo tanto, en este sentido, las moléculas de diacuerpo de la divulgación pueden exhibir una funcionalidad similar a Ig independientemente de si comprenden un dominio Fc (por ejemplo, como se ensayó en cualquier ensayo de función efectora conocido en la técnica o ejemplificado en el presente documento (por ejemplo, ensayo de ADCC)). Mediante la reticulación de células tumorales y efectoras, el diacuerpo no solo lleva la célula efectora a la proximidad de las células tumorales, sino que también conduce a la destrucción efectiva del tumor (véase, por ejemplo,, Cao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).
2.1 r e c e p to r e s de c é lu la s e fe c to r a s y su s p a p eles en el s is te m a in m u n ita r io
En la función Inmunltarla tradicional, la Interacción de Ios complejos antlouerpo-antfgeno con células del sistema Inmunitario da lugar a una amplia selección de respuestas, que varían de las funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, la desgranulación de mastocitos y la fagocitosis ante señales inmunomoduladoras, tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y la secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fc de los anticuerpos o complejos inmunitarios a receptores de superficie de células especializadas en células hematopoyéticas. La diversidad de las respuestas celulares desencadenadas por los anticuerpos y los complejos inmunitarios se debe a la heterogeneidad estructural de los receptores de Fc. Los receptores de Fc comparten dominios de unión al antígeno estructuralmente relacionados que supuestamente median en la señalización intracelular.
Los receptores de Fcy, miembros de la superfamilia de proteínas de los genes de inmunoglobulina, son glucoproteínas de superficie que pueden unirse a la parte Fcy de las moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos mediante un dominio de reconocimiento en la cadena alfa del receptor de Fcy. Los receptores de Fcy se definen por su especificidad hacia los subtipos de inmunoglobulina. Los receptores de Fcy para la IgG se conocen como FcyR, para la IgE, como FcsR, y para la IgA, como FcaR. Diferentes células auxiliares portan receptores de Fcy para anticuerpos de diferente isotipo, y el isotipo del anticuerpo determina qué células auxiliares participarán en una determinada respuesta (revisado por Ravetch J.V. et al. (1991) "Fc Receptors," Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. et al. (2001) "Stimulatory And Inhibitory Signals Originating From The Macrophage Fcgamma Receptors," Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. et al. (2002), "ITAMs Versus ITIMs: Striking A Balance During Cell Regulation", The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-1681; Ravetch J.V. et al. (2000) "Immune Inhibitory Receptors," Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. et al., (2001) "IgG Fc Receptors", Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. (1994) "Fc Receptors: Rubor Redux", Cell, 78(4): 553-60). Los diferentes receptores de Fcy, las células que los expresan y su especificidad por el isotipo se resumen en la tabla 1 (adaptada de Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4.a ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, Nueva York).
Receptores de Foy
Cada miembro de esta familia es una glucoproteína integral de la membrana, que posee dominios extracelulares relacionados con un conjunto de tipo C2 de dominios relacionados con inmunoglobulinas, un solo dominio transmembrana y un dominio intracitoplasmático de longitud variable. Existen tres FcyR conocidos, denominados FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRiII (CD16). Los tres receptores están codificados por distintos genes; sin embargo, la extensa homología entre los tres miembros de la familia sugiere que surgieron de un progenitor común, quizás mediante duplicación génica.
FcyRII(CD32)
Las proteínas FcyRII son glucoproteínas integrales de la membrana de 40 kDa que solo se unen a la IgG complejada debido a una baja afinidad hacia la Ig monomérica (106 M-1). Este receptor es el receptor FcyR que se expresa más ampliamente, presente en todas las células hematopoyéticas, incluyendo monocitos, macrófagos, linfocitos B, linfocitos NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. FcyRII solo tiene dos regiones de tipo inmunoglobulina en su cadena de unión a inmunoglobulina y, por tanto, tiene una afinidad mucho menor hacia IgG que hacia FcyRI. Existen tres genes de FcyRII humanos (FcyRII-A, FcyRII-B, FcyRII-C), uniéndose todos ellos a IgG en agregados o complejos inmunitarios.
Distintas diferencias dentro de los dominios citoplasmáticos de FcyRII-A y FcyRII-B crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas ante la ligadura del receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular que conduce a la activación celular tal como puede ser la fagocitosis y el estallido respiratorio, mientras que la isoforma B inicia señales inhibidoras, por ejemplo, Inhibiendo la activación de los linfocitos B.
FcyRIII (CD16)
Debido a la heterogeneidad de esta clase, el tamaño de FcyRIII varía entre 40 y 80 kDa en el ratón y en el ser humano. Dos genes humanos codifican dos transcripciones, FcyRIIIA, una glucoproteína integral de la membrana y FcyRIIIB, una versión unida a glucosilfosfatidil-inositol (GPI). Un gen murino codifica un FcyRIII homólogo a FcyRIIIA humano que engloba la membrana. El FcyRIII comparte características estructurales con cada uno de los dos FcyR. Al igual que FcyRII, FcyRIII se une a IgG con baja afinidad y contiene los dos dominios de tipo Ig extracelulares correspondientes. FcyRIIIA se expresa en macrófagos, mastocitos y es el único FcyR en linfocitos NK. En la actualidad, se sabe que FcyRIIIB unido a GPI solo se expresa en neutrófilos humanos.
Señalización a través de FcyR
Las señales de activación e inhibición son transducidas a través de Ios FcyR tras la ligadura. Estas funciones diametralmente opuestas se deben a las diferencias estructurales entre las diferentes isoformas de los receptores. Dos dominios distintos dentro de los dominios de señalización citoplasmáticos del receptor denominados motivos de activación basados en tirosina de inmunoreceptores (ITAM) o motivos de inhibición basados en tirosina de inmunoreceptores (ITIM) son los responsables de las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplasmáticas en estas estructuras dicta el resultado de las respuestas celulares mediadas por FcyR. Los complejos FcyR Que contienen ITAM incluyen FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, mientras que los complejos que contienen ITIM solo incluyen FcyRIIB.
Los neutrófilos humanos expresan el gen de FcyRIIA. El agrupamiento de FcyRIIA a través de complejos inmunitarios o reticulación de anticuerpos específicos sirve para agregar los ITAM junto con las cinasas asociadas a receptores que facilitan la fosforilación de ITAM. La fosforilación de los ITAM sirve como sitio de acoplamiento para Syk cinasa, cuya activación da como resultado la activación de sustratos aguas abajo (por ejemplo, PI3K). La activación celular conduce a la liberación de mediadores proinflamatorios.
El gen de FcyRIIB se expresa en los linfocitos B; su dominio extracelular es un 96 % idéntico a FcyRIIA y se une a los complejos de IgG de manera casi idéntica. La presencia de un ITIM en el dominio citoplasmático de FcyRIIB define esta subclase inhibidora de FcyR. Recientemente, se estableció la base molecular de esta inhibición. Cuando se liga junto con un FcyR activador, el ITIM de FcyRIIB se fosforila y atrae el dominio SH2 de la inositol polifosfato 5’-fosfatasa (SHIP), que hidroliza los mensajeros del fosfoinositol liberados como consecuencia de la activación de tirosina cinasa mediada por FcyR que contiene ITAM, impidiendo, por consiguiente, el flujo de entrada de Ca++ intracelular. De este modo, la reticulación de FcyRIIB atenúa la respuesta activadora a la ligadura de FcyR e inhibe la respuesta celular. De este modo, se suprimen la activación de linfocitos B, la proliferación de linfocitos B y la secreción de anticuerpos.
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El documento US 2007/004909 se refiere a moléculas de diacuerpo y a sus usos en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos, incluyendo trastornos inmunológicos y cánceres, en donde las moléculas de diacuerpo incluyen al menos dos cadenas polipeptídicas que se asocian para formar al menos dos sitios de unión a epítopo.
3. Sumario de la invención
La presente invención se refiere a una molécula de diacuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 del presente documento. Su uso puede ser en el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos, incluyendo el cáncer, trastornos autoinmunitarios, trastornos alérgicos y enfermedades infecciosas ocasionadas por bacterias, hongos o virus. Preferentemente, el diacuerpo de la presente divulgación puede unirse a dos epítopos diferentes en dos células diferentes, en donde el primer epítopo se expresa en un tipo de célula diferente a la del segundo epítopo, de modo que el diacuerpo puede unir las dos células entre sí.
En ciertos aspectos de la molécula de diacuerpo, el primer epítopo, el segundo epítopo y cuando proceda, el tercer y cuarto epítopo pueden ser iguales. En otros aspectos, el primer epítopo, el segundo epítopo y cuando proceda, el tercer y cuarto epítopo pueden ser diferentes entre sí. En ciertos aspectos de la molécula de diacuerpo que comprenden un tercer dominio de unión a epítopo, el primer epítopo y el tercer epítopo pueden ser iguales. En ciertos aspectos de la molécula de diacuerpo que comprenden un cuarto dominio de unión a epítopo, el primer y cuarto epítopo pueden ser iguales. En ciertos aspectos de la molécula de diacuerpo que comprenden un tercer dominio de unión a epítopo, el segundo epítopo y el tercer epítopo pueden ser iguales. En ciertos aspectos de la molécula de diacuerpo que comprenden un cuarto dominio de unión a epítopo, el segundo y cuarto epítopo pueden ser iguales. En aspectos preferidos de la molécula de diacuerpo, el primer epítopo y el segundo epítopo son diferentes. En otros aspectos más de la molécula de diacuerpo que comprenden un tercer dominio de unión al epítopo y un cuarto dominio de unión a epítopo, el tercer y cuarto epítopo pueden ser diferentes. Se ha de entender que cualquier combinación de los anteriores está comprendida en la presente divulgación.
En aspectos particulares de la molécula de diacuerpo, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo pueden derivarse de la misma inmunoglobulina. En otro aspecto, el segundo dominio y el cuarto dominio del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo pueden derivarse de la misma inmunoglobulina. En otro aspecto más, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o de la molécula del diacuerpo pueden derivarse de una inmunoglobulina diferente. En otro aspecto más, el segundo dominio y el cuarto dominio del diacuerpo o de la molécula del diacuerpo pueden derivarse de una inmunoglobulina diferente. Se ha de entender que cualquier combinación de los anteriores está comprendida en la presente divulgación.
En ciertos aspectos de la molécula de diacuerpo, la unión covalente entre la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo o de molécula de diacuerpo puede ser a través de un enlace disulfuro entre al menos un resto de cisteína de la primera cadena polipeptídica y al menos un resto de cisteína de la segunda cadena polipeptídica. Los restos de cisteína en la primera o segunda cadenas polipeptídicas que son responsables de los enlaces disulfuro pueden encontrarse en cualquier parte de la cadena polipeptídica, así como dentro de los dominios primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto. En una realización específica, el resto de cisteína de la primera cadena polipeptídica se encuentra en el primer dominio y el resto de cisteína de la segunda cadena polipeptídica se encuentra en el quinto dominio. Los dominios primero, segundo, cuarto y quinto corresponden a las regiones variables responsables de la unión. En las realizaciones preferidas, los restos de cisteína responsables de los enlaces disulfuro entre la primera y segunda cadena polipeptídica se ubican dentro de los dominios tercero y sexto, respectivamente. En un aspecto particular de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23) que puede estar codificada por la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17). En otro aspecto de dicha realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23) que puede estar codificada por la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17). En otro aspecto más de dicha realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77), derivada del dominio bisagra de una IgG humana y que puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 78). En otro aspecto de dicha realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77), derivada del dominio bisagra de una IgG humana y que puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 78). En determinados aspectos de dicha realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77). En otros aspectos de la dicha realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77). En otros aspectos más de la dicha realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende un dominio bisagra. En otros aspectos de la dicha realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende el dominio bisagra. En otros aspectos más de la dicha realización, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídiea comprende Ios 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el sexto dominio de la primera cadena polipeptídiea comprende un dominio Fe o una parte del mismo. En otros aspectos más de dicha realización, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica comprende un dominio Fc o una parte del mismo.
En otras realizaciones, los restos de cisteína de la primera o segunda cadena polipeptídica que son responsables de los enlaces disulfuro pueden estar ubicados fuera del primer, segundo o tercer dominios de la primera cadena polipeptídica y fuera del cuarto, quinto y sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica. En particular, el resto de cisteína de la primera cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al primer dominio o puede ser C-terminal respecto al primer dominio. El resto de cisteína de la primera cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al segundo dominio o puede ser C-terminal respecto al segundo dominio. El resto de cisteína de la primera cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al tercer dominio o puede ser C-terminal respecto al tercer dominio. Además, el resto de cisteína de la segunda cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al cuarto dominio o puede ser C-terminal respecto al cuarto dominio. El resto de cisteína de la segunda cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al quinto dominio o puede ser C-terminal respecto al quinto dominio. Por consiguiente, el resto de cisteína de la segunda cadena polipeptídica puede ser C-terminal respecto al sexto dominio o puede ser N-terminal respecto al sexto dominio. En un aspecto particular, el enlace disulfuro puede estar entre al menos dos restos de cisteína de la primera cadena polipeptídica y al menos dos restos de cisteína de la segunda cadena polipeptídica. En un aspecto particular, en donde el tercer dominio y el sexto dominio no comprenden un dominio Fc, o una parte del mismo, el resto de cisteína puede estar en el extremo C-terminal de la primera cadena polipeptídica y en el extremo C-terminal de la segunda cadena polipeptídica. Se ha de entender que cualquier combinación de los anteriores está comprendida en la presente divulgación.
En realizaciones específicas de la molécula de diacuerpo descritas anteriormente, el diacuerpo covalente de la divulgación engloba dímeros de moléculas de diacuerpo, en donde cada molécula de diacuerpo comprende una primera y una segunda cadenas polipeptídicas. En ciertos aspectos de dicha realización, las moléculas de diacuerpo pueden estar unidas de manera covalente para formar el dímero, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico. En aspectos preferidos de dicha realización, la unión covalente es un enlace disulfuro entre al menos un resto de cisteína de la primera cadena polipeptídica de cada una de las moléculas de diacuerpo del dímero. En aspectos aún más preferidos de esta molécula de diacuerpo, la unión covalente es un enlace disulfuro entre al menos un resto de cisteína de la primera cadena polipeptídica de cada una de las moléculas de diacuerpo que forman el dímero, en donde dicho al menos un resto de cisteína está ubicado en el tercer dominio de cada primera cadena polipeptídica.
En ciertos aspectos de la molécula de diacuerpo, el primer dominio de la primera cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al segundo dominio o puede ser C-terminal respecto al segundo dominio. El primer dominio de la primera cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al tercer dominio o puede ser C-terminal respecto al tercer dominio. El segundo dominio de la primera cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al primer dominio o puede ser C-terminal respecto al primer dominio. Además, el segundo dominio de la primera cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al tercer dominio o puede ser C-terminal respecto al tercer dominio. Por consiguiente, el tercer dominio de la primera cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al primer dominio o puede ser C-terminal respecto al primer dominio. El tercer dominio de la primera cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al segundo dominio o puede ser C-terminal respecto al segundo dominio. Con respecto a la segunda cadena polipeptídica, el cuarto dominio puede ser N-terminal respecto al quinto dominio o puede ser C-terminal respecto al quinto dominio. El cuarto dominio puede ser N-terminal respecto al sexto dominio o puede ser C-terminal respecto al sexto dominio. El quinto dominio de la segunda cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al cuarto dominio o puede ser C-terminal respecto al cuarto dominio. El quinto dominio de la segunda cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al sexto dominio o puede ser C-terminal respecto al sexto dominio. Por consiguiente, el sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al cuarto dominio o puede ser C-terminal respecto al cuarto dominio. El sexto dominio de la segunda cadena polipeptídica puede ser N-terminal respecto al quinto dominio o puede ser C-terminal respecto al quinto dominio. Se ha de entender que cualquier combinación de los anteriores está comprendida en la presente divulgación.
En determinadas realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio pueden ubicarse en C-terminal respecto al tercer dominio en la primera cadena polipeptídica; o el primer dominio y el segundo dominio pueden ubicarse en N-terminal respecto al tercer dominio en la primera cadena polipeptídica. Con respecto a la segunda cadena polipeptídica, el cuarto dominio y el quinto dominio pueden ubicarse en C-terminal respecto al sexto dominio o el cuarto dominio y el quinto dominio pueden ubicarse en N-terminal respecto al sexto dominio. En determinados aspectos de dicha realización, la presente divulgación se refiere a un diacuerpo biespecífico covalente, siendo dicho diacuerpo un dímero de moléculas de diacuerpo, comprendiendo cada molécula de diacuerpo una primera y una segunda cadena polipeptídica, cuya primera cadena polipeptídica comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítopo, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítopo y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fc o una porción del mismo, cuyos primeros y segundos dominios están ligados oovalentemente de manera que Ios dominios primero y segundo no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo y en donde el tercer dominio está ubicado en N-terminal respecto tanto al primer dominio como al segundo dominio; y cuya segunda cadena polipeptídica comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) y (iii) un sexto dominio que comprende al menos un resto de cisteína, cuyos dominios cuarto y quinto están unidos covalentemente, de tal forma que los dominios cuarto y quinto no se asocian para formar un sitio de unión a epítopo; y en donde la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica de cada molécula de diacuerpo están unidas covalentemente, con la condición de que la unión covalente no sea un enlace peptídico; en donde el primer dominio y el quinto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1)(VH1) que se une al primer epítopo; en donde el segundo dominio y el cuarto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2)(VH2) que se une al segundo epítopo.
Como se ha analizado anteriormente, los dominios de las cadenas polipeptídicas individuales están unidos de manera covalente. En aspectos específicos, el enlace covalente entre el primer y segundo dominio, el primer y tercer dominio, el segundo y tercer dominio, el cuarto y quinto dominio, el cuarto y sexto dominio y/o el quinto y sexto dominio puede ser un enlace peptídico. En particular, el primer y segundo dominio y el cuarto y quinto dominio pueden estar separados por el tercer dominio y el sexto dominio, respectivamente o por restos de aminoácidos adicionales, siempre que el primer y segundo y el cuarto y quinto dominio no se asocien para formar un sitio de unión. El número de restos de aminoácido puede ser 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 restos de aminoácido. En un aspecto preferido, el número de restos de aminoácido entre los dominios es de 8.
En ciertos aspectos de la molécula de diacuerpo, los dominios de la primera y la segunda cadena polipeptídica que comprenden un dominio Fc, es decir, opcionalmente, el tercer y sexto dominio, respectivamente, pueden comprender además un dominio bisagra de modo que el dominio comprenda una región bisagra-Fc. En realizaciones alternativas, la primera cadena polipeptídica o la segunda cadena polipeptídica pueden comprender un dominio bisagra sin comprender también un dominio Fc. Las cadenas pesadas, cadenas ligeras, regiones bisagra, dominios Fc y/o dominios bisagra-Fc para su uso en la molécula de diacuerpo pueden obtenerse de cualquier tipo de inmunoglobulina, incluyendo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En un aspecto preferido, el tipo de inmunoglobulina es IgG o cualquier subtipo de la misma, es decir, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otros aspectos, la inmunoglobulina de la que se obtienen las cadenas ligeras y pesadas está humanizada o quimerizada.
Además, el primer epítopo y el segundo epítopo son diferentes y, cuando sea aplicable, el tercer epítopo y el cuarto epítopo, al que se une el diacuerpo o la molécula de diacuerpo pueden ser diferentes epítopos del mismo antígeno o pueden ser diferentes epítopos de antígenos diferentes. Los antígenos pueden ser cualquier molécula contra la que se pueda generar un anticuerpo. Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de superficie celular, marcadores autoinmunes, proteínas víricas, fármacos, etc. En aspectos particulares, al menos un sitio de unión a epítopo del diacuerpo es específico para un antígeno en una determinada célula, tal como un linfocito B, un linfocito T, una célula fagocítica, un linfocito citolítico natural (NK) o una célula dendrítica.
En ciertos aspectos de la presente realización, al menos un sitio de unión a epítopo del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo es específico para un receptor de Fc, pudiendo ser dicho receptor de Fc un receptor de Fc activador o un receptor de Fc inhibidor. En aspectos particulares, el receptor de Fc es un receptor de Fcy y el receptor de Fcy es un receptor FcyRI, FcyRII o FcyRIII. En aspectos más preferidos, el receptor FcyRIII es un receptor FcyRIIIA (CD16A) o el receptor FcyRIIIB (CD16B), y, más preferentemente, el receptor FcyRIII es el receptor FcyRIIIA (CD16A). En otro aspecto preferido, el receptor FcyRII es el receptor FcyRIIA (CD32A) o el receptor FcyRIIB (CD32B) y más preferentemente, el receptor FcyRIIB (CD32B). En un aspecto particularmente preferido, un sitio de unión del diacuerpo es específico para CD32B y el otro sitio de unión es específico para CD16A. En una realización específica de la molécula de diacuerpo, al menos un sitio de unión a epítopo del diacuerpo o de la molécula de diacuerpo es específico para un receptor de Fc activador y al menos otro sitio es específico para un receptor de Fc inhibidor. En ciertos aspectos de dicha realización, el receptor de Fc activador es CD32A y el receptor de Fc inhibidor es CD32B. En otros aspectos de dicha realización, el receptor de Fc activador es BCR y el receptor de Fc inhibidor es CD32B. En otros aspectos más de dicha realización, el receptor de Fc activador es IgERI y el receptor de Fc inhibidor es CD32B.
En los casos donde un sitio de unión a epítopo es específico para CD16A, los dominios VL y VH pueden ser iguales o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo 3G8 murino, cuya secuencia ha sido clonada y se expone en el presente documento. En otros casos donde un sitio de unión a epítopo es específico para CD32A, los dominios VL y VH pueden ser iguales o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo IV.3 de ratón. En otros casos más donde un sitio de unión a epítopo es específico para CD32B, los dominios VL y VH pueden ser iguales o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo 2B6 murino, cuya secuencia ha sido clonada y se expone en el presente documento. Se ha de entender que cualquiera de los dominios VL o VH de los anticuerpos 3G8, 2B6 e IV.3 puede usarse en cualquier combinación. La presente divulgación también se refiere a un diacuerpo o a una molécula de diacuerpo biespecífico, en donde el primer epítopo es específico para CD32B y el segundo epítopo es específico para c D16A.
En otros aspectos, un sitio de unión a epítopo puede ser específico para un antfgeno patógeno. Como se usa en el presente documento, un antígeno patogénico es un antígeno implicado en una enfermedad patógena específica, incluyendo el cáncer, infección y enfermedad autoinmunitaria. Por lo tanto, el antígeno patógeno puede ser un antígeno tumoral, un antígeno bacteriano, un antígeno vírico o un antígeno autoinmunitario. Los antígenos patógenos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, lipopolisacárido, antígenos víricos seleccionados de grupo que consiste en antígenos víricos de virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus sincitial respiratorio, virus del Nilo Occidental (por ejemplo, los antígenos E16 y/o E53) y virus de hepatitis, ácidos nucleicos (ADN y ARN) y colágeno. Preferentemente, el antígeno patógeno es un antígeno neutralizante. En un aspecto preferido, cuando un sitio de unión a epítopo es específico para CD16A o CD32A, el otro sitio de unión a epítopo es específico para un antígeno patógeno, excluyendo los antígenos autoinmunitarios. En otro aspecto preferido más, cuando un sitio de unión a epítopo es específico para CD32B, el otro sitio de unión a epítopo es específico para cualquier antígeno patógeno. En realizaciones específicas, la molécula de diacuerpo de la divulgación se une a dos antígenos diferentes en la misma célula, por ejemplo, un sitio de unión a antígeno es específico para un receptor de Fc activador, mientras que el otro es específico para un receptor de Fc inhibidor. En otras realizaciones, la molécula de diacuerpo se une a dos epítopos neutralizantes víricos diferentes, por ejemplo, pero sin limitación, E16 y E53 del virus del Nilo Occidental.
Los diacuerpos de la divulgación se pueden usar para tratar una variedad de enfermedades y trastornos. Se describe un método para tratar una enfermedad o trastorno que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de una molécula de diacuerpo o diacuerpo covalente de la divulgación en la que al menos un sitio de unión es específico para un antígeno patógeno, tal como un antígeno expresado en la superficie de una célula cancerosa o en la superficie de una bacteria o de un virión y al menos otro sitio de unión es específico para un receptor de Fc, por ejemplo, CD16A.
También se describe un método para tratar una enfermedad o trastorno que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un diacuerpo o una molécula de diacuerpo de la divulgación, en el que al menos un sitio de unión es específico para CD32B y al menos otro sitio de unión es específico para CD16A.
También se describe un método para inducir tolerancia inmune a un antígeno patógeno que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un diacuerpo covalente o una molécula de diacuerpo covalente de la divulgación, en el que al menos un sitio de unión es específico para CD32B y al menos otro sitio de unión es específico para dicho antígeno patógeno. En aspectos de dicha realización, el antígeno patógeno puede ser un alérgeno u otra molécula hacia la que se desee tolerancia inmunitaria, tal como una proteína expresada en tejido trasplantado.
También se describe un método para la detoxificación que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de una molécula de diacuerpo o diacuerpo covalente de la divulgación, en el que al menos un sitio de unión es específico para un marcador de superficie celular y al menos otro sitio de unión es específico para una toxina. El diacuerpo de la divulgación administrado puede ser uno donde un sitio de unión es específico para un marcador de la superficie celular, tal como un Fc y el otro sitio de unión es específico para una toxina bacteriana o para un fármaco. El marcador de la superficie celular puede no encontrarse en glóbulos rojos.
3.1 Definiciones
A menos que se definan de otra manera, todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología científicos que se usan en el presente documento pretenden tener los significados comúnmente comprendidos por los expertos en la materia a la que pertenece la presente divulgación. En algunos casos, los términos con significados comúnmente comprendidos se definen en el presente documento con fines de claridad y/o para tener una referencia inmediata, y la inclusión de dichas definiciones en el presente documento no se ha de considerar necesariamente como representativa de una diferencia sustancial frente a lo que se comprende en la técnica. La práctica de la presente divulgación empleará, salvo que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos e inmunología, que están dentro de las habilidades en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, tales como, Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1999, incluyendo los suplementos hasta 2001); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, incluyendo los suplementos hasta 2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición (Sambrook y Russel, 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert y N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow y Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; y Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2000).
Como se usa en el presente documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos policlonales, anticuerpos camelizados, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), fragmentos Fv biespecíficos unidos por enlaces disulfuro (sdFv), intracuerpos y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-ld y anti-antild para los anticuerpos de la divulgación y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e lgY), clase (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
Como se usa en el presente documento, la expresión "se une de manera inmunoespecífica", "reconoce de manera inmunoespecífica", "se une de manera específica", "reconoce específicamente" y las expresiones análogas se refieren a moléculas que se unen específicamente a un antígeno (por ejemplo, epítopo o complejo inmunitario) y no se une específicamente a otra molécula. Una molécula que se une específicamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad según se determina mediante, por ejemplo, inmunoensayos, BIAcore u otros ensayos conocidos en la técnica. Preferentemente, las moléculas que se unen específicamente a un antígeno no tienen reacción cruzada con otras proteínas. Las moléculas que se unen específicamente a un antígeno pueden identificarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Como se usa en el presente documento, "complejo inmunitario" se refiere a una estructura que se forma cuando al menos una molécula diana y al menos un polipéptido que contiene la región Fcy heterólogo se une a otro formando un complejo de mayor peso molecular. Los ejemplos de complejos inmunitarios son complejos de antígenoanticuerpo que pueden o bien ser solubles o encontrarse en partículas (por ejemplo, un complejo antígeno/anticuerpo sobre una superficie celular).
Como se usa en el presente documento, las expresiones "cadena pesada", "cadena ligera", "región variable", "región marco conservada", "dominio constante" y similares, tienen su significado común en la técnica inmunológica, y se refieren a los dominios de las inmunoglobulinas naturales y a los dominios correspondientes de las proteínas de unión sintéticas (por ejemplo, recombinantes) (por ejemplo, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos, etc.). La unidad estructural básica de las inmunoglobulinas naturales (por ejemplo, IgG) es un tetrámero que tiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, normalmente expresadas como una glucoproteína de aproximadamente 150.000 Da. La parte amino-terminal ("N") de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La parte carboxi-terminal ("C") de cada cadena define una región constante, teniendo las cadenas ligeras un solo dominio constante y teniendo normalmente las cadenas pesadas tres dominios constantes y una región bisagra. Por lo tanto, la estructura de las cadenas ligeras de una molécula de IgG es n-Vl-Cl-c y la estructura de las cadenas pesadas de IgG es n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (donde H es la región bisagra). Las regiones variables de una molécula de IgG constan de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que contienen los restos que están en contacto con el antígeno y segmentos que no son CDR, a los que se conoce como segmentos marco, que, en general, mantienen la estructura y determinan el posicionamiento de los bucles de CDR (aunque ciertos restos marco también pueden estar en contacto con el antígeno). Por lo tanto, los dominios Vl y Vh tienen la estructura n-FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4-c.
Cuando se hace referencia a las proteínas o anticuerpos de unión (como se definen ampliamente en el presente documento), la asignación de los aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991). Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras maduras de las inmunoglobulinas se designan por la posición de un aminoácido en la cadena. Kabat describió numerosas secuencias de aminoácidos para los anticuerpos, identificó una secuencia consenso de aminoácidos para cada subgrupo y asignó un número de restos a cada aminoácido. El esquema de numeración de Kabat puede extenderse a los anticuerpos no incluidos en su compendio alineando el anticuerpo en cuestión con una de las secuencias consenso en Kabat haciendo referencia a aminoácidos conservados. Este método para asignar números de restos se ha vuelto una norma en el campo e identifica fácilmente los aminoácidos en posiciones equivalentes de diferentes anticuerpos, Incluyendo las variantes quiméricas o humanizadas. Por ejemplo, un aminoácido que está en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo murino.
Como se usa en el presente documento, la expresión "cadena pesada" se usa para definir la cadena pesada de un anticuerpo IgG. En una IgG intacta nativa, la cadena pesada comprende los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3. A lo largo de la presente memoria descriptiva, la numeración de los restos en una cadena pesada de IgG es la del índice de EU tal como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991). El "índice de EU como en Kabat" se refiere a la numeración del anticuerpo EU de lgG1 humano. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos que contienen los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 humana se muestran en las FIG. 1A y 1B, como se describe más adelante. Las FIG. 1A y 1B también exponen secuencias de aminoácidos de los dominios bisagra, CH2 y CH3 de las cadenas pesadas de IgG2, IgG3 y IgG4. Las secuencias de aminoácidos de los isotipos IgG2, IgG3 e IgG4 se alinean con la secuencia de IgG1 colocando el primer y último resto de cisteína de las respectivas regiones bisagra, lo que forma los enlaces S-S entre las cadenas pesadas, en las mismas posiciones. Para la reglón bisagra de lgG2 e lgG3, no todos Ios restos están numerados mediante el índice de EU.
La "región bisagra" o "dominio bisagra", en general, se define como el tramo desde Glu216 hasta Pro230 de la IgG 1 humana. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de la región bisagra de la IgG1 humana se presenta en la FIG.
1A (los restos de aminoácido de la FIG. 1A están numerados de acuerdo con el sistema de Kabat). Las regiones bisagra de los otros isotipos de IgG se pueden alinear con la secuencia de IgG1 colocando el primer y último resto de cisteína que forman los enlaces S-S entre cadenas pesadas en las mismas posiciones como se muestra en la FIG. 1A.
Como se usa en el presente documento, la expresión "región Fc", "dominio Fc" o expresiones análogas se usan para definir una región C-terminal de una cadena pesada de IgG. En la FIG. 1B se muestra un ejemplo de la secuencia de aminoácidos que contiene la IgG1 humana. Aunque los límites pueden variar ligeramente, según la numeración de acuerdo con el sistema de Kabat, el dominio Fc se extiende desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 447 (los restos de aminoácido de la FIG. 1B están numerados de acuerdo con el sistema de Kabat). La FIG. 1B también proporciona ejemplos de las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc de los isotipos de IgG IgG2, IgG3 e IgG4.
La región Fc de una IgG comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3. El dominio CH2 de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende desde los aminoácidos 231 hasta el aminoácido 341 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (FIG. 1B). El dominio CH3 de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende desde los aminoácidos 342 hasta 447 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (FIG. 1B). El dominio CH2 de una región Fc de IgG humana (al que también se le conoce como dominio "Cy2") tiene la exclusividad de que no se aparea estrechamente con otro dominio. En cambio, dos cadenas de hidratos de carbono ramificadas unidas a N se interponen entre los dos dominios CH2 de una IgG natural, intacta.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "proteína de unión al FcyR", "anticuerpo contra FcyR" y "anticuerpo anti-FcyR", se usan de manera indistinta y se refieren a una variedad de proteínas de tipo inmunoglobulina o derivadas de inmunoglobulina. Las "proteínas de unión a FcyR" se unen a FcyR a través de una interacción con los dominios Vl y/o Vh (a diferencia de la unión mediada por Fcy). Los ejemplos de proteínas de unión a FcyR incluyen anticuerpos completamente humanos, policlonales, quiméricos y humanizados (por ejemplo, que comprenden 2 cadenas pesadas y 2 ligeras), fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos Fab, Fab’, F(ab')2 y Fv), anticuerpos bifuncionales o multifuncionales (véase, por ejemplo, Lanzavecchia et al. (1987) "The Use Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes", Eur. J. Immunol. 17:105-111), anticuerpos monocatenarios (véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins", Science 242:423-26), proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión de presentación en fagos), "minicuerpos" (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.25.837.821) y otras proteínas de unión a antígeno que comprenden un dominio Vl y/o Vh o fragmento del mismo. En un aspecto, la proteína de unión a FcyRIIIA es un "anticuerpo tetramérico" es decir, que, en general, tiene la estructura de una IgG natural y que comprende dominios variables y constantes, es decir, dos cadenas ligeras que comprenden un dominio Vl y un dominio constante de cadena ligera y dos cadenas pesadas que comprenden un dominio Vh y dominios bisagra y constante de cadena pesada.
Como se usa en el presente documento, la expresión "antagonistas de FcyR" y las expresiones análogas se refieren a sustancias proteicas y no proteicas, incluyendo las moléculas pequeñas que antagonizan en al menos una actividad biológica de un FcyR, por ejemplo, bloquean la señalización. Por ejemplo, las moléculas de la divulgación bloquean la señalización bloqueando la unión de las IgG a un FcyR.
Como se usa en el presente documento, el término "derivado", en el contexto de los polipéptidos o de las proteínas, se refiere a un polipéptido o a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido modificada mediante la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos. eliminaciones o adiciones. El término "derivado" como se usa en el presente documento también se refiere a un polipéptido o a una proteína que se ha modificado, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido o a la proteína. Por ejemplo, pero sin limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un antígeno u otra proteína celular, etc. Un polipéptido o una proteína derivada puede producirse mediante modificaciones químicas usando las técnicas conocidas por los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un derivado de polipéptido o de proteína presenta una función similar o idéntica a la del polipéptido o la proteína del que se derivó.
Como se usa en el presente documento, el término "derivado" en el contexto de un derivado no proteico se refiere a una segunda molécula orgánica o inorgánica que se forma basándose en la estructura de una primera molécula orgánica o inorgánica. Un derivado de una molécula orgánica incluye, pero sin limitación, una molécula modificada, por ejemplo, mediante la adición o eliminación de un grupo hidroxilo, metilo, etilo, carboxilo o amina. Una molécula orgánica también puede esterificarse, alquilarse y/o fosforilarse.
Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de dlacuerpo" se refiere a un complejo de dos o más cadenas polipeptídicas o proteínas, que comprenden cada una al menos un dominio VL y un dominio VH o fragmento de los mismos, en donde ambos dominios están comprendidos dentro de una sola cadena polipeptídica. En ciertas realizaciones, "molécula de diacuerpo" incluye moléculas que comprenden un dominio Fc o un dominio bisagra-Fc. Dichas cadenas polipeptídicas del complejo pueden ser iguales o diferentes, es decir, la molécula de diacuerpo puede ser un homomultímero o un heteromultímero. En aspectos específicos, la expresión "molécula de diacuerpo" incluye dímeros o tetrámeros o dichas cadenas polipeptídicas que contienen tanto un dominio VL y VH. Las cadenas polipeptídicas individuales que comprenden las proteínas multiméricas pueden estar unidas de manera covalente a al menos otro péptido del multímero por enlaces disulfuro entre las cadenas.
Como se usa en el presente documento, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan de manera indistinta para referirse a un estado en un sujeto. En particular, la expresión "enfermedad autoinmunitaria" se usa indistintamente con la expresión "trastorno autoinmunitario" para referirse a una afección en un sujeto caracterizada por lesión celular, tisular y/u orgánica provocada por una reacción inmunológica del sujeto contra sus propias células, tejidos y/u órganos. La expresión "enfermedad inflamatoria" se usa indistintamente con la expresión "trastorno inflamatorio" para referirse a una afección en un sujeto, caracterizado por inflamación, preferentemente inflamación crónica. Los trastornos autoinmunitarios pueden estar asociados o no con la inflamación. Además, la inflamación puede estar provocada o no por un trastorno autoinmunitario. Por lo tanto, algunos trastornos pueden caracterizarse tanto como trastornos autoinmunitarios como inflamatorios.
"Cadenas polipeptídicas idénticas", como se usa en el presente documento, también se refiere a cadenas polipeptídicas que tengan una secuencia de aminoácidos casi idéntica, por ejemplo, incluyendo las cadenas que tienen una o más diferencias de aminoácidos, preferentemente sustituciones conservativas de aminoácidos, de modo que la actividad de las dos cadenas polipeptídicas no sea significativamente diferente.
Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a una neoplasia o a un tumor resultante del crecimiento no controlado, anómalo, de las células. Como se usa en el presente documento, el cáncer incluye explícitamente leucemias y linfomas. En algunas realizaciones, cáncer se refiere a un tumor benigno, que ha permanecido localizado. En otras realizaciones, el cáncer se refiere a un tumor maligno, que ha invadido y destruido estructuras corporales adyacentes y se dispersa a sitios distantes. En algunas realizaciones, el cáncer se asocia con un antígeno específico de cáncer.
Como se usa en el presente documento, la expresión "agente inmunomodulador" y variaciones de la misma se refieren a un agente que modula el sistema inmunitario de un hospedador. En determinadas realizaciones, un agente inmunomodulador es un agente inmunosupresor. En determinadas realizaciones diferentes, un agente inmunomodulador es un agente inmunoestimulador. Los agentes inmunomoduladores incluyen, pero sin limitación, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas, agentes miméticos y moléculas orgánicas.
Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" se refiere a un fragmento de un polipéptido o de una proteína o una molécula no proteica que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferentemente en un mamífero y lo más preferentemente, en un ser humano. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es un fragmento de un polipéptido o de una proteína que genera una respuesta de anticuerpos en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es un fragmento de un polipéptido o de una proteína al que se une de manera inmunoespecífica un anticuerpo, como se determina mediante cualquier método bien conocido por un experto en la materia, por ejemplo, mediante inmunoensayos. No es necesario que los epítopos antigénicos sean inmunogénicos.
Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 restos de aminoácidos contiguos, al menos 10 restos de aminoácidos contiguos, al menos 15 restos de aminoácidos contiguos, al menos 20 restos de aminoácidos contiguos, al menos 25 restos de aminoácidos contiguos, al menos 40 restos de aminoácidos contiguos, al menos 50 restos de aminoácidos contiguos, al menos 60 restos de aminoácidos contiguos, al menos 70 restos de aminoácidos contiguos, al menos 80 restos de aminoácidos contiguos, al menos 90 restos de aminoácidos contiguos, al menos 100 restos de aminoácidos contiguos, al menos 125 restos de aminoácidos contiguos, al menos 150 restos de aminoácidos contiguos, al menos 175 restos de aminoácidos contiguos, al menos 200 restos de aminoácidos contiguos o al menos 250 restos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido. En una realización específica, un fragmento de un polipéptido conserva al menos una función del polipéptido.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "ácidos nucleicos" y "secuencias de nucleótidos" incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), combinaciones de moléculas de ADN y ARN o moléculas híbridas de ADN/ARN y análogos de moléculas de ADN o ARN. Dichos análogos pueden generarse usando, por ejemplo, análogos de nucleótidos, que incluyen, pero sin limitación, inosina o bases tritiladas. Dichos análogos también pueden comprender moléculas de ADN o ARN que comprenden estructuras principales modificadas que les otorgan atributos beneficiosos para las moléculas, tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasas o una capacidad aumentada para atravesar membranas celulares. Los ácidos nucleicos o las secuencias de nucleótidos pueden ser monocatenarios, bicatenarios, pueden contener partes monocatenarias y bicatenarias y pueden contener partes tricatenarias, pero es, preferentemente, ADN bicatenario.
Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a aquella cantidad del agente terapéutico suficiente para tratar o controlar un trastorno o una enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede referirse a la cantidad de agente terapéutico suficiente para retardar o reducir al mínimo el inicio de la enfermedad, por ejemplo, retardar o reducir al mínimo la propagación del cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz también puede referirse a la cantidad de agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o control de una enfermedad. Además, una cantidad terapéuticamente eficaz con respecto a un agente terapéutico de la divulgación significa la cantidad de agente terapéutico solo, o combinado con otros tratamientos, que proporciona un beneficio terapéutico para el tratamiento o control de una enfermedad.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "agente profiláctico" y "agentes profilácticos" se refieren a cualquier agente que se pueda usar para la prevención de un trastorno, o la prevención de la recurrencia o propagación de un trastorno. Una cantidad profilácticamente eficaz puede referirse a la cantidad de agente profiláctico suficiente para impedir la recurrencia o la propagación de una enfermedad hiperproliferativa, en particular, cáncer o la presencia de dicha enfermedad en un paciente, incluyendo, pero sin limitación, aquellos que están predispuestos a la enfermedad hiperproliferativa, por ejemplo, aquellos que están genéticamente predispuestos al cáncer o previamente expuestos a agentes cancerígenos. Una cantidad profilácticamente eficaz también puede referirse a la cantidad del agente profiláctico que proporcione un beneficio profiláctico para la prevención de una enfermedad. Además, una cantidad profilácticamente eficaz con respecto a un agente profiláctico de la divulgación significa aquella cantidad de agente profiláctico solo, o en combinación con otros agentes, que proporciona un beneficio profiláctico para la prevención de la enfermedad.
Como se usa en el presente documento, los términos "prevenir" y "prevención" se refieren a la prevención de la recurrencia o del inicio de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto como resultado de la administración de un agente profiláctico o terapéutico.
Como se usa en el presente documento, la expresión "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso de la expresión "en combinación" no limita el orden en el que se administran los agentes profilácticos y/o terapéuticos a un sujeto con un trastorno. Un primer agente profiláctico o terapéutico puede administrarse antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), de manera concomitante con, o después de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto con un trastorno.
"Función efectora" como se usa en el presente documento significa un evento bioquímico debido a la interacción de una región Fc de anticuerpo con un receptor de Fc o un antígeno. Las funciones efectoras incluyen, pero sin limitación, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Las funciones efectoras incluyen aquellas que tienen lugar tras la unión de un antígeno y aquellas que tienen lugar independientes de la unión al antígeno.
"Célula efectora", como se usa en el presente documento, significa una célula del sistema inmunitario que expresa uno o más receptores de Fc y media en una o más funciones efectoras. Las células efectoras incluyen, pero sin limitación, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, linfocitos B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, linfocitos citolíticos naturales (NK) y pueden ser de cualquier organismo incluyendo, pero sin limitación, seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "se une específicamente a un complejo inmunitario" y las expresiones análogas se refieren a moléculas que se unen específicamente a un complejo inmunitario y no se unen específicamente a otra molécula. Una molécula que se une específicamente a un complejo inmunitario puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad según lo determinado mediante, por ejemplo, inmunoensayos, BIAcore u otros ensayos conocidos en la técnica. Preferentemente, las moléculas que se unen específicamente a un complejo inmunitario no tienen reacción cruzada con otras proteínas. Las moléculas que se unen específicamente a un complejo inmunitario pueden identificarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Una "proteína de fusión estable", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína de fusión que experimenta un nivel de degradación mínimo a no detectable durante la producción y/o almacenamiento, evaluado usando ensayos bioquímicos y funcionales comunes conocidos por los expertos en la materia, y puede almacenarse durante un período de tiempo prolongado sin pérdida de la actividad biológica, por ejemplo, la unión a FcyR.
4. Breve descripción de los dibujos
FIGS. 1 A-B s e c u e n c ia de a m in o á c id o s de las r e g io n e s CH1, b is a g r a y Fc de IgG h u m a n a La figura 1 proporciona las secuencias de aminoácidos de Ios dominios bisagra (A) y Fc (B) de IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. (Dominio bisagra de IgG1 (SEQ ID NO: 1); dominio bisagra de IgG2 (SeQ ID NO: 2); dominio bisagra de IgG3 (SEQ ID NO: 3); dominio bisagra de IgG4 (SeQ ID NO: 4); dominio Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 5); dominio Fc de IgG2 (SEQ ID NO: 6); dominio Fc de IgG3 (SeQ ID NO: 7); dominio Fc de IgG 1 (SeQ ID NO: 8)). Los restos de aminoácidos que se muestran en las FIG. 1A y 1B se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat EU. Las secuencias isotipo se alinean con la secuencia de IgG1 colocando el primer y último resto de cisteína de las respectivas regiones bisagra, lo que forma los enlaces S-S entre las cadenas pesadas, en las mismas posiciones. Para la Figura 1B, los restos del dominio CH2 están indicados por , mientras que los restos del dominio CH3 están indicados por ~.
FIG. 2 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS DE DIACUERPOS BIFUNCIONALES COVALENTES
Los polipéptidos de un diacuerpo bifuncional covalente consisten en un dominio VL de anticuerpo y un dominio VH de anticuerpo separados por un enlazador peptídico corto. El enlazador de 8 restos de aminoácido evita el autoensamblaje de una sola cadena polipeptídica en construcciones scFv, y, en cambio, las interacciones entre los dominios VL y VH de diferentes cadenas polipeptídicas predominantes. Se crearon 4 construcciones (cada construcción se describe desde el extremo amino-terminal ("n"), lado izquierdo de la construcción, hasta el extremo carboxi-terminal ("c"), lado derecho de la figura): construcción (1) (SEQ ID NO: 9) compuesta de, n-el dominio VL Hu2B6 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia C-terminal (LGGC)- c; construcción (2) (SEQ ID NO: 11) que se compone de n-el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia C-terminal (LGGC)-c; construcción (3) (SEQ ID NO: 12) que se compone de n-el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia C-terminal (LGGC)-c; construcción (4) (SEQ ID NO: 13) que se compone de n-el dominio VL Hu2B6 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia C-terminal (LGGC)-c.
FIG. 3 ANÁLISIS DE SDS-PAGE DE LOS DIACUERPOS PURIFICADOS POR AFINIDAD
Se sometieron diacuerpos purificados por afinidad a análisis de SDS-PAGE en condiciones reductoras (carriles 1-3) o no reductoras (carriles 4-6). Se indican los pesos moleculares aproximados del patrón (entre los carriles 3 y 4). Carriles 1 y 4, c Md h3G8; Carriles 2 y 5, CMD h2B6; y Carriles 3 y 6, CBD h2B6-h3G8.
FIG. 4 A-B ANÁLISIS DE SEC DE DIACUERPOS PURIFICADOS POR AFINIDAD
Se sometieron diacuerpos purificados por afinidad a análisis de SEC. (A) Perfil de elución de patrones conocidos: IgG de longitud completa (~150 kDa), fragmento Fab de IgG (~50 kDa) y scFv (~30 kDa); (B) Perfil de elución de CMD h2b6, CMD h3G8 y CBD h2B6-h3G8.
FIG. 5 UNIÓN de CBD h2B6-h3G8 A LAS PROTEÍNAS sCD32B Y sCD16A
Se ensayó la unión del CBD h2B6-h3G8 a las proteínas sCD32B y sCD16A en un análisis de ELISA de tipo sándwich. Se usó sCD32B como proteína diana. La sonda secundaria fue sCD16A conjugado con HRP. CMD h3G8, que se une CD16A, se usó como control.
FIG. 6 A-C ANÁLISIS DE BIACORE DE LA UNIÓN DE DIACUERPO A sCD16A, sCD32B Y sCD32B
La unión de CBD h2B6-h3G8, CMD h2B6 y CMD h3G8 a sCD16A, sCD32B y sCD32A (control negativo) se ensayó mediante análisis de SPR. También se ensayó como control scFv h3G8. (A) Unión a sCD16; (B) unión a sCD32B y (C) unión a sCD32A. Los diacuerpos se inyectaron a una concentración de 100 nM y el fragmento scFv a una concentración de 200 mM, sobre las superficies receptoras a un caudal de 50 ml/min durante 60 s. FIG. 7 A-C ANÁLISIS DE BIACORE DE LA UNIÓN DE DIACUERPO A sCD16A y sCD32B
La unión de CBD h2B6-h3G8, CMD h2B6 y CMD h3G8 a sCD16A y sCD32B se ensayó mediante análisis de SPR. El fragmento scFv h3G8 también se ensayó como control. (A) Unión de CMD h3G8 a sCD16A; (B) unión de CBD h2B6-h3G8 a sCD16A; (C) unión de scFv h3G8 a sCD16A; (D) unión de CMD h2B6 a sCD32B; y (E) unión de CBD h2B6-h3G8 a sCD32B. Los diacuerpos se inyectaron a concentraciones de 6,25-200 nM sobre superficies receptoras a un caudal de 70 ml/min durante 180 s.
FIG. 8 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA INTERACCIÓN DE LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS QUE CONTIENEN LOS DOMINIOS VL Y VH PARA FORMAR UNA MOLÉCULA DE DIACUERPO BIESPECÍFICA COVALENTE NH2 y COOH representan los grupos amino-terminal y carboxi-terminal, respectivamente, de cada cadena polipeptídica. S representa el resto de cisteína C-terminal en cada cadena polipeptídica. VL y VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas y discontinuas son para distinguir entre las dos cadenas polipeptídicas y, en particular, representan las partes enlazadoras de dichas cadenas. Fv h2B6 y Fv h3G8 indican un sitio de unión a epítopo específico para CD32B y CD16, respectivamente.
FIG. 9 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LAS CADENAS POLIPEPTÍDICAS QUE CONTIENEN DOMINIOS Fc DE LOS DIACUERPOS BIESPECÍFICOS COVALENTES
Representación de las construcciones polipeptídicas de las moléculas de diacuerpo de la divulgación (cada construcción se describe desde el extremo amino-terminal ("n"), lado izquierdo de la construcción, hasta el extremo carboxi-terminal ("c"), lado derecho de la figura). Construcción (5) (SEQ ID NO: 14) compuesta de, ndominio VL Hu2B6 - un primer enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - un segundo enlazador (LGGC)- y un dominio Fc C-terminal de IgG1 humana-c; construcción (6) (SEQ ID NO: 15) que se compone de n-el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y el segundo enlazador (LGGC)- y un dominio Fc C-terminal de lgG1 humana-c; construcción (7) (SEQ ID NO: 16) que se compone de n-el dominio VL Hu2B6 - un primer enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) -el dominio Vh de Hu3G8 - y una secuencia C-terminal (LGGCFNRGEC) (s Eq ID NO: 17)-c; construcción (8) (SEQ ID NO: 18) que se compone de n-el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y un segundo enlazador (LGGC)- y un dominio bisagra/Fc C-terminal de IgG 1 humana (con sustitución de aminoácido A215V)-c.
FIG. 10 UNIÓN DE MOLÉCULAS DE DIACUERPO QUE COMPRENDEN DOMINIOS Fc A sCD32B Y sCD16A Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc a sCD32B y sCD16A en un ensayo ELISA de tipo sándwich. Los diacuerpos ensayados se produjeron mediante 3 sistemas de expresión recombinante: cotransfección de pMGX669 y pMGX674, que expresan las construcciones 1 y 6, respectivamente; cotransfección de pMGX667 y pMGX676, que expresan las construcciones 2 y 5, respectivamente; y cotransfección de pMGX674 y pMGX676, que expresan las construcciones 5 y 6, respectivamente. Se usó la proteína sCD32B como proteína diana. La sonda secundaria fue sCD16A conjugado a HRP.
FIG. 11 r e p r e s e n ta c ió n e s q u e m á tic a DE LA INTERACCIÓN DE las dos c a d e n a s p o lip e p t Ídicas q u e c o m p r e n d e n c a d a u n a UN DOMINIO Fc par a fo r m a r un d ia c u e r p o b iv a le n t e , c o v a le n te
NH2 y COOH representan los grupos amino-terminal y carboxi-terminal, respectivamente, de cada cadena polipeptídica. S representa el al menos un enlace disulfuro entre un resto de cisteína de la segunda secuencia enlazadora de cada cadena polipeptídica. VL y VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas y discontinuas son para distinguir entre las dos cadenas polipeptídicas y, en particular, representan las primeras partes enlazadoras de dichas cadenas. CH2 y CH3 representan los dominios constantes CH2 y CH3 de un dominio Fc. Fv h2B6 y Fv h3G8 indican un sitio de unión a epítopo específico para CD32B y CD16, respectivamente.
FIG. 12 UNIÓN DE MOLÉCULAS DE DIACUERPO QUE COMPRENDEN DOMINIOS BISAGRA/Fc A sCD32B Y sCD16A
Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc a sCD32B y sCD16A en un ensayo ELISA de tipo sándwich. Los diacuerpos ensayados se produjeron mediante 4 sistemas de expresión recombinante: cotransfección de pMGX669 pMGX674, que expresan las construcciones 1 y 6, respectivamente; cotransfección de pMGX669 pMGX678, que expresan las construcciones 2 y 8, respectivamente; cotransfección de pMGX677 pMGX674, que expresan las construcciones 7 y 6, respectivamente; y cotransfección de pMGX677 pMGX678, que expresan las construcciones 7 y 8, respectivamente. Se usó la proteína sCD32B como proteína diana. La sonda secundaria fue sCD16A conjugado a HRP.
FIG. 13 r e p r e s e n ta c ió n e s q u e m á tic a DE la in te r a c c ió n de las c a d e n a s p o lip e p t íd ic a s par a fo r m ar un a m o lé c u la de d ia c u e r p o te t r a m é r ic a
NH2 y COOH representan los grupos amino-terminal y carboxi-terminal, respectivamente, de cada cadena polipeptídica. S representa el al menos un enlace disulfuro entre un resto de cisteína en la segunda secuencia enlazadora de la cadena polipeptídica, ‘más pesada’, que porta el dominio Fc y un resto de cisteína en la secuencia C-terminal de la cadena de polipéptido "más ligera" que no porta el dominio Fc. VL y VH indican el dominio ligero variable y el dominio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas y discontinuas son para distinguir entre cadenas polipeptídicas y, en particular, representan las primeras partes enlazadoras de las cadenas más pesadas o el enlazador de dichas cadenas más ligeras. CH2 y CH3 representan los dominios constantes CH2 y CH3 de un dominio Fc. Fv h2B6 y Fv h3G8 indican un sitio de unión a epítopo específico para CD32B y CD16, respectivamente.
FIG. 14 r e p r e s e n ta c ió n e s q u e m á tic a de las c a d e n a s p o l ip e p t íd ic a s QUE CONTIENEN DOMINIOS Fc QUE FORMAN DIACUERPOS BIESPECÍFICOS COVALENTES
Representación de construcciones polipeptídicos que forman las moléculas de diacuerpo de la divulgación (cada construcción se describe desde el extremo amino-terminal ("n"), lado izquierdo de la construcción, hasta el extremo carboxi-terminal ("c"), lado derecho de la figura). Construcción (9) (SEQ ID NO: 19) compuesta den-un dominio bisagra/Fc de la IgG 1 humana - el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ iD NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10))- y una secuencia LGGC C-terminal-c; construcción (10) (SEQ ID NO: 20) compuesto de n-un dominio Fc de la IgG1 humana - el dominio VL Hu3G8 -enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10))- y una secuencia LGGC C-terminal-c; construcción (11) (SEQ ID NO: 21) compuesto de n-el dominio VL Hu2b6 (G105C) - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID nO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y un dominio bisagra/Fc C-terminal de IgG1 humana con sustitución de aminoácido A215V; construcción (12) (SEQ ID NO: 22) compuesto de n-el dominio VL Hu3G8 - enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2b6 (G44c ) - y una secuencia FNRGEC C-terminal (SeQ ID NO: 23)-c.
f ig . 15 a -b a n á lis is de s d s -pag e y de t r a n s f e r e n c ia w e s t e r n de la a f in id a d DE d ia c u e r p o s t e t r a m é r ic o s
Los diacuerpos producidos mediante sistemas de expresión recombinante cotransfectados con vectores que expresan las construcciones 10 y 1, las construcciones 9 y 1, y las construcciones 11 y 12 se sometieron a análisis de SDS-PAGE en condiciones no reductoras (A) y análisis de transferencia Western usando H+L anti-IgG 1 humana de cabra como sonda (B). Las proteínas del gel SDS-PAGE se visualizaron con tinción con Simply Blue Safestain (Invitrogen). En ambos paneles A y B, las moléculas de diacuerpo que comprenden las construcciones 10 y 1, las construcciones 9 y 1, y las construcciones 11 y 12A están en las carriles 1, 2 y 3, respectivamente,
f ig . 16 unió n de m o lé c u la s de d ia c u e r p o q u e c o m p r e n d e n d o m in io s fc y en lac es d is u lfu r o en tr e c a d e n a s m o d if ic a d o s por in g e n ie r ía A sCD32B y sCD16A
Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc y enlaces disulfuro modificados por ingeniería entre las cadenas polipeptídicas ‘más ligera’ y ‘más pesada’ a sCD32B y sCD16A en un análisis de ELISA de tipo sándwich, Los diacuerpos ensayados se produjeron mediante 3 sistemas de expresión recombinante: que expresan las construcciones 1 y 10, que expresan las construcciones 1 y 9, y que expresan las construcciones 11 y 12, respectivamente. Se usó la proteína sCD32B como proteína diana, La sonda secundaria fue sCD16A conjugado a HRP. Se usó como control la unión de h3G8.
f ig . 17 r e p r e s e n ta c ió n e s q u e m á tic a del p r e c u r s o r de p o lip r o t e Ína de la m o lé c u la de d ia c u e r p o y r e p r e s e n ta c ió n e s q u e m á tic a de las c a d e n a s p o l ip e p t íd ic a s q u e c o n tie n e n lo s d o m in io s de c a d e n a lig e r a la m b d a y/o b is a g r a
Representación de las construcciones polipeptídicas que comprenden las moléculas de diacuerpo de la divulgación (cada construcción se describe desde el extremo amino-terminal ("n"), lado izquierdo de la construcción, hasta el extremo carboxi-terminal ("c"), lado derecho de la figura), Construcción (13) (SEQ ID NO: 95) compuesta de, n-dominio VL 3G8 - un primer enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de 2.4G2VH - un segundo enlazador (LGGC)-sitio de reconocimiento de furina (RAKR (SEQ ID NO: 93))-dominio VL de 2,4G2-un tercer enlazador (GGGSGGG (SEQ ID NO: 10)-dominio VH de 3g 8- y un dominio LGGC C-terminal; (la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO: 95 se proporciona en SEQ ID NO: 96), Construcción (14) (SEQ ID NO: 97) compuesta de, n-dominio VL 3G8 - un primer enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de 2.4G2VH - un segundo enlazador (LGGC)-sitio de reconocimiento de furina (RAKR (s Eq ID NO: 93))-FMD (proteasa C3 del virus de la fiebre aftosa) dominio VL de 2,4G2-un tercer enlazador (GGGSGGG (s Eq ID NO: 10)-dominio VH de 3G8- y un dominio LGGC C-terminal; (la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO: 97 se proporciona en SEQ ID NO: 98), Construcción (15) (SEQ ID NO: 99) compuesta de, n-dominio VL Hu2B6 - un enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu3G8-y un dominio FNRGEC C-terminal (SEQ ID NO: 23); (la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO: 99 se proporciona en SEQ ID NO: 100), Construcción (16) (SEQ ID NO: 101) compuesta de, n- dominio VL Hu3G8 -un enlazador (GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10)) - el dominio VH de Hu2B6- y un dominio VEPKSC C-terminal (SEQ ID NO: 77); (la secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO: 101 se proporciona en SEQ ID NO: 102),
f ig . 18 unió n de las m o lé c u la s de d ia c u e r p o d e r iv a d a s de u n a m o lé c u la p r e c u r s o r a de POLIPROTEÍNA A m CD32B Y sCD16A
Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo derivadas de la molécula precursora de poliproteína, construcción 13 (SEQ ID NO: 95) a CD32B murino (mCD32B) y CD16A soluble (sCD16A) en un análisis de ELISA de tipo sándwich. Se usó mCD32B como proteína diana, La sonda secundaria fue sCD16A conjugada a biotina,
f ig . 19 unió n de m o lé c u la s de d ia c u e r p o q u e c o m p r e n d e n d o m in io s de c a d e n a la m b d a y/o BISAGRA A sCD32B Y sCD16A
Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios derivados del extremo C-terminal de cadena ligera lambda humana y/o el dominio bisagra de la IgG a sCD32B y sCD16A, y se comparó con el diacuerpo que comprende las construcciones 1 y 2 (FIG, 5) en un análisis de ELISA de tipo sándwich. Los diacuerpos ensayados se produjeron mediante el sistema de expresión recombinante que expresaba las construcciones 15 y 16 (SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 101, respectivamente). Se usó sCd32B como proteína diana, La sonda secundaria fue sCD16A conjugado a HRP, Las barras con cuadros pequeños representan la combinación de las construcciones 15/16, mientras que las barras con cuadros grandes representan la combinación de las construcciones 1/2.
FIG, 20 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE DART 2B6/4420 UNIDO A CD32B UBICADO EN LA s u p e r fic ie de u n a c é lu la y u n a m o lé c u la c o n ju g a d a a f lu o r e s c e Ína
El diagrama muestra la flexibilidad del brazo anti-fluoresceína "adaptador universal" de DART, así como la posibilidad de sustituir el brazo 2B6 con otras especificidades. Las regiones V se muestran como cuadros, Los enlazadores GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) se muestran como líneas, el enlace disulfuro se muestra conectando las dos cadenas, Los constituyentes de una cadena se muestran en azul, mientras que el otro es de color rosa, N, extremo amino-terminal; C, extremo carboxi-terminal; FL, fluoresceína, VL, región variable de cadena ligera; VH, región variable de cadena pesada,
FIG, 21 (PANELES A Y B) EL DART 2B6/4420 SE UNE ESPECÍFICAMENTE A MOLÉCULAS CONJUGADAS A FLUORESCEÍNA Y PUEDE UNIRSE SIMULTÁNEAMENTE A CD32B.
(A) Se unieron 2B6/4420 o 2B6/3G8 a placas para ELISA recubiertas con proteína FITC-S, La unión y función del brazo 2B6 se detectaron mediante la unión de CD32B soluble, seguido de un anticuerpo específico para CD32B y un anticuerpo de detección secundario conjugado a HRP, (B) 2B6/4420 o 2B6/3G8 se unieron a placas para ELISA recubiertas con HulgG o FITC-HulgG (conjugadas a fluoresceína). Se detectó la unión mediante la unión con un suero policlonal específico para Fv 2B6 seguido de un anticuerpo secundario conjugado a HRP, FIG, 22 (PANELES A Y B) ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS B PURIFICADOS USANDO ANTICUERPOS ANTI-CD79B HUMANOS,
Se activaron linfocitos B purificados usando concentraciones crecientes de los anticuerpos anti-CD79b humano conjugados a FITC, CB3.1-FITC (A) o CB3.2-FITC (B) y 50 gg/ml del fragmento F(ab’)2 de Fc de IgG GAM específico (eje x). Se activaron linfocitos B en presencia de PBS (barras blancas) o 5 pg/ml de aFITCaCD32BDART (barras negras) o aCD16aCD32BDART (barras grises). Se realizaron las reacciones por triplicado y se calcularon las desviaciones típicas.
FIG. 23 (PANELES A Y B) ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS B PURIFICADOS
Se activaron linfocitos B purificados derivados de un segundo donante sano como se describe en la FIG. 22, Panel B. El índice de proliferación se midió en las células activadas en presencia del anticuerpo anti-CD79b conjugado a FITC, CB3.2-FITC (A) y se comparó con el índice de proliferación de células activadas en presencia del anticuerpo CB3.2 no marcado (B). FIG. 24 (Paneles superior e inferior) AGOTAMIENTO DE LINFOCITOS B MURINOS IN VIVO EN RATONES TRANSGÉNICOS HCD16A/B USANDO MGD261 Se inyectaron a ratones C57B1/6 mCD32-/-hCD16 A+, C57B1/6 mCD32-/- hCD32B+ y ratones C57B1/6 mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ de la colonia de reproducción MacroGenics por vía IV en los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17 MGD261 (10, 3, 1 o 0,3 mg/kg), o un anticuerpo irrelevante (hE16 10 mg/kg). Se recogió la sangre en los días -19 (antes de la extracción de sangre), 4, 11, 18, 25 y 32 para el análisis de FACS. Tres veces a la semana se registró el estado de salud y la actividad de los animales. Panel superior: h2B6-3G8 y mAb WNV; Panel inferior: ratones h2B6-3G8, -hCD16A o -hCD32B y ratones mAb WNV -hCD16A o - hCD32B.
FIG. 25 AGOTAMIENTO DE LINFOCITOS B MURINOS IN VIVO EN RATONES TRANSGÉNICOS HCD16A/B USANDO DB 2.4G2-3G8 Se inyectaron a ratones C57B1/6 mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+, mCD16-/-hCD16B+ y mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+ de la colonia de reproducción MacroGenics por vía IP en los días 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 y 18 el DB 2.4G2-3G8 (75 ug/ratón) o PBS. Se recogió la sangre en los días -10 (antes de la extracción de sangre), 4, 11 y 18 para el análisis de FACS. Tres veces a la semana se registró el estado de salud y la actividad de los animales.
FIG. 26 DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTI-TUMORAL DE MGD261 USANDO UN MODELO INTRAVENOSO (IV) DE LA LÍNEA DE CÉLULAS TUMORALES HUMANAS RAJI.
Se inyectó a ratones C57B1/6 mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/- de doce-veinte semanas de edad de la colonia de reproducción MacroGenics por vía IV en el día 05x106 células Raji. En los días 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 y 30 los ratones también fueron tratados por vía intraperitoneal (IP) con 250, 25 o 2,5 pg de MGD261 o con PBS (control negativo). Después se observó a los ratones a diario y se documentó el peso corporal dos veces a la semana. Los ratones que desarrollaron parálisis de las patas posteriores fueron sacrificados.
FIG. 27 EXPRESIÓN DE DART EN HOSPEDADOR NO MAMÍFERO
Se transformaron células BL21DE3 (Novagen) con el plásmido pET25b(+) T7-lac+ 3G8/3G8 y se usó una colonia resistente a la ampicilina para sembrar un caldo de cultivo. Cuando el cultivo alcanzó las 0,5 unidades de DO600, se añadió IPTG 0,5 mM para inducir la expresión. El cultivo se desarrolló a 30 °C durante 2 horas y se recogió medio libre de células.
FIG. 28 ELISA DE DART
Se realizaron ELISA de unión a DART h3G8-h3G8 usando placas Maxisorp de 96 pocilios. Tras la reacción, se lavó la placa con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 pl/pocillo del sustrato TMB. Tras 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo con 40 pl/pocillo de H2SO4 al 1 %. Se leyó la DO450 nm usando un lector de placas de 96 pocilios y el software SOFTmax. Se representó gráficamente la lectura usando el software GraphPadPrism 3.03.
FIG. 29 MUERTE DE LINFOCITOS B HUMANOS INDUCIDA POR DART
Se incubaron células PBMC humanas durante la noche con las moléculas indicadas. Se ensayó la apoptosis mediante análisis de FACS como el porcentaje de la población PI+anexina-V+ de linfocitos B (linfocitos CD20+) en la población total no regulada por FSC/SSC.
FIG. 30 CONSTRUCCIONES DE DART 8B5-CB3.1
Se produjeron múltiples construcciones de DART 8B5-CB3.1 para ilustrar la presente divulgación. Las construcciones 5 y 6, o 6 y 7, u 8 y 9, o 9 y 10, los plásmidos de expresión codificados se cotransfectaron en células HEK-293 para expresar el DART 8B5-CB3.1 con o sin marcador anti-flag usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El medio condicionado se recogió cada tres días tres veces. El medio condicionado se purificó luego usando la columna por afinidad de CD32B.
FIG. 31 ELISA DE DART 8B5-CB3.1
Se realizaron ELISA de competencia de DART 8B5-CB3.1/ch8B5 usando placas Maxisorp de 96 pocilios. Tras la reacción, se lavó la placa con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 pl/pocillo del sustrato TMB. Tras 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo con 40 pl/pocillo de H2SO4 al 1 %. Se leyó la DO450 nm usando un lector de placas de 96 pocilios y el software SOFTmax. Se representó gráficamente la lectura usando el software GraphPadPrism 3.03.
FIG. 32 DEMOSTRACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA ESTRUCTURA DE DART TETRAVALENTE
Se ilustra la estructura general de una especie de DART producida mediante el ensamblaje de cuatro cadenas polipeptídicas. Los cuatro dominios de unión al antígeno del DART de tipo Ig se muestran como elipses rayadas y de color gris oscuro.
FIG. 33 DART TETRAVALENTE DE TIPO Ig
Se proporciona un esquema de los sitios de unión a epítopo de un DART tetravalente de tipo Ig.
FIG. 34 ELISA DE UNIÓN DE mCD32-hCD16A
Se proporcionan los resultados de ELISA que demuestran que las especies de DART tetravalentes de tipo Ig del Ejemplo 6.10 se unen a antígeno con mayor afinidad que el anticuerpo de control (mAb ch-mCD32) u otras especies de DART.
FIG. 35 DEMOSTRACIÓN ESQUEMÁTICA DE LAS MOLÉCULAS DE DART de tipo Ig
Se proporciona un esquema de las moléculas de DART de tipo lg. La especificidad se indica mediante regiones sombreadas, con un patrón o de color blanco, las regiones constantes se indican en negro y los enlaces disulfuro se indican mediante líneas negras punteadas. Los extremos N-terminales de todas las cadenas de proteína están orientados hacia la parte superior de la figura, mientras que los extremos C-terminales de todas las cadenas de proteína están orientados hacia la parte inferior de la figura. Las ilustraciones A-E son biespecíficas y las ilustraciones F-J son triespecíficas. Las ilustraciones A y E son tetravalentes. Las ilustraciones B, C, F, l y J son hexavalentes. Las ilustraciones D, G y H son octavalentes. Para ver los detalles de las descripciones de cada uno de los dominios, véanse las Figuras 1,2, 9, 14 y 17, y el apartado 3.1.
FIG. 36 CAPACIDAD DE UNIÓN DEL DIACUERPO BlESPECIFICÜ HU2B64.5-HU3G85.1
La figura 36 muestra la capacidad del diacuerpo biespecífico Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 (cuadrados) para unirse a CD32b y CD16a en relación con los diacuerpos Hu2B64.5 o Hu3G85.1 (triángulos).
FIG. 37 ESQUEMA DE LOS DERIVADOS DE DART DE BUCLE E Y BUCLE K
La figura 37 ilustra la conformación general de los derivados DART del bucle E y el bucle K.
FIG. 38 DISPOSICIÓN DE HÉLICE DE LOS SEPARADORES PREFERIDOS DE BUCLE E Y BUCLE K La figura 38 muestra la disposición helicoidal de la secuencia preferida de "bucle E" (EVAALEK)4 (SEQ ID NO: 299) y secuencia preferida de "bucle K" (KVAALKE) 4 (SEQ ID NO: 300).
FIG. 39 DERIVADOS DE DART QUE CONTIENEN Fc DE BUCLE E Y BUCLE K
La figura 39 ilustra las diferentes especies de derivados de DART que contienen Fc de bucle E y bucle K que se pueden formar a través del intercambio de cadenas.
FIG. 40 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS DE DERIVADOS DE BUCLE E Y/O BUCLE K Y DERIVADOS QUE CONTIENEN Fc DE BUCLE E Y/O BUCLE K DE LOS DART h2B6YAhCB3
La figura 40 muestra los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaños en derivados de bucle E y/o bucle K y derivados de E y/o bucle K que contienen Fc de los DART h2B6YAhCB3. Se analizaron cuatro especies de dichas moléculas; todas tenían un bucle E y un bucle K: EK (sin región Fc), 2,1 mg; EFc/K (Fc ligado a bucle E), 2,7 mg; E/KFc (Fc ligado a bucle K), 1,8 mg; EFc/KFc (Fc ligado al bucle K y el bucle E del mismo DART), 2,0 mg
FIG. 41 ESTRUCTURA DE MOLECULAS DE DÍMERO PRODUCIDAS
La figura 41 muestra la posible estructura de la molécula dimérica producida identificada en el cromatograma de exclusión por tamaño de la figura 40.
FIG. 42 ANÁLISIS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE SDS-POLIACRILAMIDA DE LOS DERIVADOS DE BUCLE E Y/O BUCLE K Y LOS DERIVADOS DE BUCLE E Y/O BUCLE K QUE CONTIENEN Fc DE LOS DART h2B6YAhCB3 La figura 42 muestra los resultados de un análisis por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de las fracciones obtenidas mediante cromatografía de exclusión por tamaños (figura 40) de los derivados de bucle E y/o bucle K y los derivados de bucle E y/o bucle K que contienen Fc de los DART h2B6YAhCB3. Carriles flanqueantes: controles de marcadores moleculares; Carril 1: EK (sin región Fc); Carril 2: EFc/K, fracción agregada; Carril 3: EFc/K, fracción de monómero; Carril 4: E/KFc, fracción agregada; Carril 5: E/KFc, fracción de monómero; Carril 6: EFc/KFc, fracción agregada; Carril 7: EFc/KFc, fracción de dímero; Carril 8: EFc/KFc, fracción de monómero.
FIG. 43 ANÁLISIS DE ELISA DE UNIÓN BISPECÍFICA
La figura 43 muestra el resultado de un ELISA de unión biespecífica que compara los derivados DART h2B6YAhCB3 de bucle E/bucle K que contienen Fc (EFc/K o E/KFc), DART h2B6YAhCB3, de control y un derivado de DART h2B6YAhCB3 EFc/KFc.
FIG. 44 CAPACIDAD DE LOS DERIVADOS DE BUCLE E Y/O BUCLE K Y DE LOS DERIVADOS DE BUCLE E Y/O BUCLE K QUE CONTIENEN Fc DE LOS DART h2B6YAhCB3 PARA INHIBIR LA PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS T
La figura 44 muestra la capacidad de los derivados de bucle E y/o bucle K y de los derivados de bucle E y/o bucle K que contienen Fc de los DART h2B6YAhCB3 para inhibir la proliferación de linfocitos T.
FIG. 45 ABD-DART hCD16-hCD32B
La figura 45 muestra un esquema de una molécula de anticuerpo recombinante, ABD-DART hCD16-hCD32B compuesta del dominio ABD3 de la proteína G estreptocócica fusionado a un DART biespecífico recombinante que es inmunorreactivo con los antígenos hCD16 y hCD32B.
FIG. 46A/46B AFINIDAD DE UNIÓN DE ABD-DART hCD16-hCD32B USANDO ELISA ESPECÍFICO DUAL Las placas de ELISA se recubrieron con antígeno CD16 (figura 46A) o seroalbúmina humana (figura 46B) a una concentración de 2 pg/ml. Se unieron concentraciones variables de ABD-DART hCD16-hCD32B (■) y control de DART hCD16-hCD32B (O) que comenzaban con 2 pg/ml. Se añadió antígeno sCD32B biotinilado a la placa seguido de estreptavidina conjugada con HRP para la detección.
FIG. 47 CITOTOXICIDAD MEDIADA POR PBMC DE PROTEÍNAS DART
Citotoxicidad mediada por PBMC de proteínas DART. Se llevaron a cabo ensayos de ADCC usando líneas de linfocitos B humanos, Daudi como células diana incubadas con PBMC como células efectoras. Los ensayos individuales se efectuaron por triplicado a una relación de efector a diana de 20:1 y una titulación de anticuerpos: DART hCD16A-hCD32B (•) y ABD DART hCD16A-hCD32B (■). La citotoxicidad mediada por células se midió mediante un ensayo de liberación de LDH. La curva inferior a 10° es ABD DART hCD16A-hCD32B (■).
FIG. 48 PROPIEDADES FARMACOCINÉTICAS MEJORADAS DE ABD DART hCD16-hCD32B EN RATONES C57B1/6
Se inyectó a ratones (n=3) una sola inyección intravenosa de (A) ABD DART hCD16-hCD32B (•) y (B) DART hCD16-hCD32B (A) a 5 mg/kg. Se recogió suero de ratón en diversos puntos de tiempo y se cuantificaron las concentraciones de proteínas en suero mediante ELISA. Los cálculos farmacocinétioos se realizaron utilizando WinNonlin Professional 5.1.
FIG. 49A-E ACTIVIDAD DE DART HER2 x TCRb EN UN PANEL DE LÍNEAS CELULARES CON BAJA EXPRESIÓN DE HER2
Las moléculas de DART que tienen dominios de unión al receptor de linfocitos T y Her2 (TCR) se probaron para determinar su capacidad para mediar la citotoxicidad en múltiples líneas celulares de cáncer de colon y cáncer de vejiga que se habían caracterizado previamente por presentar bajos niveles de expresión de HER2 (y por lo tanto son refractarias al tratamiento con el anticuerpo anti-Her2/neu, Herceptin®. Las líneas celulares de cáncer de mama analizadas son ZR75-1 (HER22+) (FIG. 49A), MCF-7 (HER21+) (FIG. 49B) y MDA-MB468 (HER2-ve) (FIG. 49C). Las líneas celulares no de cáncer de mama analizadas son HT-29 (línea celular de cáncer de colon) (FIG. 49D) y SW780 (línea celular de cáncer de vejiga) (FIG. 49E).
5. Descripción de las realizaciones preferidas
Cada cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo contiene un dominio Vl y un dominio Vh, que se unen de manera covalente de modo que se impide el autoensamblaje de los dominios. La interacción de dos de las cadenas polipeptídicas producirá dos apareamientos Vl-Vh, formando dos sitios de unión a epítopo, es decir, una molécula bivalente. Ni el dominio VH ni el VL están restringidos a una posición dentro de la cadena polipeptídica, es decir, restringidos al extremo amino (N)-terminal o al extremo carboxi (C)-terminal, ni los dominios están restringidos a sus posiciones relativas entre sí, es decir, el dominio Vl puede ser N-terminal respecto del dominio Vh y viceversa. La única restricción es que haya una cadena polipeptídica complementaria disponible para formar el diacuerpo funcional. Cuando los dominios VL y VH se derivan del mismo anticuerpo, las dos cadenas polipeptídicas complementarias pueden ser idénticas. Por ejemplo, cuando los dominios de unión se derivan de un anticuerpo específico para el epítopo A (es decir, el dominio de unión se forma a partir de una interacción VLa-VHa), cada polipéptido comprenderá un VHa y un VLa. La homodimerización de dos cadenas polipeptídicas de anticuerpo producirá la formación de dos sitios de unión VLa-VHa, dando lugar a un anticuerpo monoespecífico bivalente. Cuando los dominios VL y VH se derivan de anticuerpos específicos para diferentes antígenos, la formación de un diacuerpo biespecífico funcional requiere la interacción de dos cadenas polipeptídicas diferentes, es decir, la formación de un heterodímero. Por ejemplo, para un diacuerpo biespecífico, una cadena polipeptídica comprenderá un dominio VLa y un VLb; la homodimerización de dicha cadena dará lugar a la formación de dos sitios de unión VLa-VHb, bien de no unión o de unión impredecible. Por el contrario, cuando dos cadenas polipeptídicas diferentes tienen libertad para interaccionar, por ejemplo, en un sistema de expresión recombinante, comprendiendo una un VLA y un VHb y comprendiendo la otra un VLB y un VHA, se formaran dos sitios de unión distintos: VLA-VHA y VLb-VHb. Para todos los pares de cadenas polipeptídicas de diacuerpos, la posibilidad de desalineamiento o la ausencia de unión de las dos cadenas es una posibilidad, es decir, la interacción de los dominios VL-VL o VH-VH; sin embargo, la purificación de los diacuerpos funcionales se controla fácilmente basándose en la inmunoespecificidad del sitio de unión adecuadamente dimerizado usando cualquier método basado en la afinidad conocido en la técnica o ilustrado en el presente documento, por ejemplo, cromatografía de afinidad.
En otras realizaciones, una o más de las cadenas polipeptídicas del diacuerpo comprende un dominio Fc. Los dominios Fc de las cadenas polipeptídicas de las moléculas de diacuerpo preferentemente se dimerizan, dando lugar a la formación de una molécula de diacuerpo que presenta propiedades de tipo inmunoglobulina, por ejemplo, interacciones Fc-FcyR. Los diacuerpos que comprenden Fc pueden ser dímeros, por ejemplo, compuestos por dos cadenas polipeptídicas, que comprenden cada una un dominio VH, un dominio VL y un dominio Fc. La dimerización de dichas cadenas polipeptídicas da lugar a un diacuerpo bivalente que comprende un dominio Fc, aunque con una estructura distinta de la del anticuerpo bivalente no modificado (FIG. 11). Dichas moléculas de diacuerpo presentarán fenotipos modificados con respecto a la inmunoglobulina de tipo silvestre, por ejemplo, semivida en suero modificada, propiedades de unión modificadas, etc. En otras realizaciones, las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fc pueden ser tetrámeros. Dichos tetrámeros comprenden dos cadenas polipeptídicas ‘más pesadas’, es decir, una cadena polipeptídica que comprende un dominio VL, un dominio VH y un dominio Fc, y dos cadenas polipeptídicas ‘más ligeras’, es decir, cadena polipeptídica que comprende un dominio VL y un dominio VH. Las cadenas más ligeras y más pesadas interactúan para formar un monómero, y dichos monómeros interaccionan a través de sus dominios Fc no apareados para formar una molécula de tipo Ig. Dicho diacuerpo de tipo Ig es tetravalente y puede ser monoespecífico, biespecífico o tetraespecífico.
Los al menos dos sitios de unión de la molécula de diacuerpo pueden reconocer los mismos epítopos o diferentes. Epítopos diferentes pueden ser del mismo antígeno o epítopos de diferentes antígenos. En una realización, los epítopos son de diferentes células. En otra realización, los epítopos son antígenos de superficie celular de la misma célula o del mismo virus. Los sitios de unión a los epítopos pueden reconocer cualquier antígeno frente al que se pueda generar un anticuerpo. Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de superficie celular, marcadores autoinmunes, proteínas víricas, fármacos, etc. En aspectos particulares, al menos un sitio de unión a epítopo del diacuerpo es específico para un antígeno en una determinada célula, tal como un linfocito B o un linfocito T, una célula fagocítica, un linfocito citolítico natural (NK) o una célula dendrítica.
Cada dominio de la cadena polipeptídica del diacuerpo, es decir, el dominio VL, VH y FC puede estar separado por un enlazador peptídico. El enlazador peptídico puede tener 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos. En ciertas realizaciones, la secuencia enlazadora de aminoácidos es GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) codificada por la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 74).
En determinadas realizaciones, cada cadena polipeptfdica de la molécula de diacuerpo se modifica por ingeniería para que comprenda al menos un resto de cisteína que interaccione con un homólogo en al menos un resto de cisteína de una segunda cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo para formar un enlace disulfuro entre cadenas. Dichos enlaces disulfuro entre cadenas servirán para estabilizar la molécula de diacuerpo, mejorando la expresión y recuperación de los sistemas recombinantes, dando lugar a una formulación estable y sistemática, así como a la mejora de la estabilidad del producto aislado y/o purificado in vivo. Dicho al menos un resto de cisteína puede introducirse como un solo aminoácido o como parte de una secuencia de aminoácidos mayor, por ejemplo, dominio bisagra, en cualquier parte de la cadena polipeptídica. En una realización específica, dicho al menos un resto de cisteína se modifica por ingeniería para que se encuentre en el extremo C-terminal de la cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, dicho al menos un resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de la secuencia de aminoácidos LGGC. En una realización específica, el extremo C-terminal de la cadena polipeptídica que comprende la molécula de diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos LGGC. En otra realización, dicho al menos un resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio bisagra, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 4. En una realización específica, el extremo C-terminal de una cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos de un dominio bisagra de IgG, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1. En otra realización, el extremo C-terminal de una cadena polipeptídica de una molécula de diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77), que puede codificarse por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 78). En otras realizaciones, dicho al menos un resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (SEQ ID NO: 17), que puede codificarse por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 76). En una realización específica, el extremo C-terminal de una cadena polipeptídica que comprende el diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (SEQ ID NO: 17), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 76). En otras realizaciones más, dicho al menos un resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), que puede codificarse por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 75). En una realización específica, el extremo C-terminal de una cadena polipeptídica que comprende el diacuerpo de la divulgación comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), que puede codificarse por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 75).
En determinadas realizaciones, la molécula de diacuerpo comprende al menos dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos LGGC y están unidas de manera covalente por un enlace disulfuro entre los restos de cisteína de dichas secuencias LGGC. En otra realización específica, la molécula de diacuerpo comprende al menos dos cadenas polipeptídicas, una de las cuales comprende la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23), mientras que la otra comprende un dominio bisagra (que contiene al menos un resto de cisteína), en donde dichas al menos dos cadenas polipeptídicas están unidas de manera covalente por un enlace disulfuro entre el resto de cisteína de FNRGEC (SEQ ID NO: 23) y un resto de cisteína en el dominio bisagra. En aspectos particulares, el resto de cisteína responsable del enlace disulfuro ubicado en el dominio bisagra es Cys-128 (según la numeración de acuerdo con el sistema Kabat EU; ubicado en el dominio bisagra de una cadena pesada de IgG intacta no modificada) y el resto de cisteína complementario en la SEQ ID NO: 23 es Cys-214 (según la numeración de acuerdo con el sistema Kabat EU, ubicado en el extremo C-terminal de una cadena ligera de IgG intacta, no modificada) (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains", J. Biol. Chem. 280:14402-14412). En otras realizaciones más, el al menos un resto de cisteína se modifica por ingeniería para que se encuentre en el extremo N-terminal de la cadena de aminoácidos. En otras realizaciones más, el al menos un resto de cisteína se modifica por ingeniería para que se encuentre en la parte enlazadora de la cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo. En otras realizaciones, el dominio VH o VL se modifica por ingeniería para que comprenda al menos una modificación de aminoácidos respecto al dominio VH o VL precursor, de modo que la modificación de aminoácidos comprenda una sustitución de un aminoácido precursor por cisteína.
La divulgación abarca moléculas de diacuerpo que comprenden un dominio Fc. El dominio Fc o parte del mismo puede derivarse de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina incluyendo, pero sin limitación, IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En las realizaciones preferidas, el dominio Fc (o parte del mismo) se deriva de IgG. En realizaciones específicas, el isotipo de IgG es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o un alotipo de los mismos. En una realización, la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc, dominio Fc que comprende un dominio CH2 y un dominio CH3 seleccionados de manera independiente a partir de cualquier isotipo de inmunoglobulina (es decir, un dominio Fc que comprende el dominio CH2 derivado de IgG y el dominio CH3 derivado de IgE, o el dominio CH2 derivado de IgG1 y el dominio CH3 derivado de IgG2, etc.). Dicho dominio Fc se puede diseñar en una cadena polipeptídica que comprende la molécula de diacuerpo de la divulgación en cualquier posición con respecto a otros dominios o porciones de dicha cadena polipeptídica (por ejemplo, el dominio Fc puede ser c-terminal para los dominios VL y VH del polipéptido de la cadena; puede ser N-terminal para los dominios VL y VH; o puede ser N-terminal para un dominio y c-terminal para otro (es decir, entre dos dominios de la cadena polipeptídica)).
La presente divulgación también engloba moléculas que comprenden un dominio bisagra. El dominio bisagra puede derivarse de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina, incluyendo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En las realizaciones preferidas, el dominio bisagra se deriva de IgG, en el que el ¡sotipo de IgG es igG1, lgG2, lgG3 o lgG4, o un alotipo de los mismos. Dicho dominio bisagra puede modificarse por ingeniería para dar una cadena polipeptídica que comprenda la molécula de diacuerpo junto con un dominio Fc de modo que la molécula de diacuerpo comprenda un dominio bisagra-Fc. En determinadas realizaciones, el dominio bisagra y Fc se seleccionan independientemente de cualquier isotipo de inmunoglobulina conocido en la técnica o ilustrado en el presente documento. En otras realizaciones, el dominio bisagra y Fc están separados por al menos otro dominio de la cadena polipeptídica, por ejemplo, el dominio VL. El dominio bisagra, u opcionalmente, el dominio bisagra-Fc, pueden modificarse por ingeniería para dar un polipéptido de la divulgación en cualquier posición respecto a otros dominios o partes de la cadena polipeptídica. En determinadas realizaciones, una cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo comprende un dominio bisagra, encontrándose dicho dominio bisagra en el extremo C-terminal de la cadena polipeptídica, en donde dicha cadena polipeptídica no comprende un dominio Fc. En otras realizaciones más, una cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo comprende un dominio bisagra-Fc, encontrándose dicho dominio bisagra-Fc en el extremo C-terminal de la cadena polipeptídica. En otras realizaciones, una cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo comprende un dominio bisagra-Fc, encontrándose dicho dominio bisagra-Fc en el extremo N-terminal de la cadena polipeptídica.
Como se ha analizado anteriormente, la divulgación engloba multímeros de las cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada una de sus cadenas polipeptídicas un dominio VH y VL. En determinados aspectos, las cadenas polipeptídicas de los multímeros contienen además un dominio Fc. La dimerización de los dominios Fc conducen a la formación de una molécula de diacuerpo que presenta funcionalidad de tipo inmunoglobulina, es decir, función mediada por Fc (por ejemplo, la interacción Fc-FcyR, unión del complemento, etc.). En determinadas realizaciones, los dominios VL y VH que comprenden cada cadena polipeptídica tienen la misma especificidad, y la molécula de diacuerpo es bivalente y monoespecífica. En otras realizaciones, los dominios VL y VH que comprenden cada cadena polipeptídica tienen diferente especificidad y el diacuerpo es bivalente y biespecífico.
En otras realizaciones más, las moléculas de diacuerpo de la divulgación engloban tetrámeros de las cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada una de sus cadenas polipeptídicas un dominio VH y VL. En determinadas realizaciones, dos cadenas polipeptídicas del tetrámero comprenden además un dominio Fc. Por tanto, el tetrámero está se compone de dos cadenas polipeptídicas ‘más pesadas’, que comprenden cada una un dominio VL, un dominio VH y un dominio Fc, y dos cadenas polipeptídicas ‘más ligeras’, que comprenden un dominio VL y VH. La interacción de una cadena más pesada y una más ligera para dar un monómero bivalente acoplado con la dimerización de dichos monómeros a través de los dominios Fc de las cadenas más pesadas dará lugar a la formación de una molécula de tipo inmunoglobulina tetravalente (ilustrada en el Ejemplo 6.2 y el Ejemplo 6.3). En ciertos aspectos, los monómeros son los mismos y la molécula de diacuerpo tetravalente es monoespecífica o biespecífica. En otros aspectos, los monómeros son diferentes y la molécula tetravalente es biespecífica o tetraespecífica.
La formación de una molécula de diacuerpo tetraespecífica como se ha descrito anteriormente requiere la interacción de cuatro cadenas polipeptídicas diferentes. Es difícil lograr dichas interacciones de manera eficaz en un solo sistema de producción recombinante celular, debido a las múltiples variantes de los posibles apareamientos erróneos de las cadenas. Una solución para aumentar la probabilidad de apareamientos erróneos es modificar por ingeniería mutaciones de tipo "botón en ojal" en los pares de cadenas polipeptídicas deseadas. Dichas mutaciones favorecen la heterodimerización frente a la homodimerización. Por ejemplo, con respecto a las interacciones Fc-Fc, una sustitución de aminoácido (preferentemente una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma un "botón", por ejemplo, triptófano) se puede introducir en el dominio CH2 o CH3, de manera que la interferencia estérica evitará la interacción con un dominio mutado similar y obligará al dominio mutado a emparejarse con un dominio en el que se haya diseñado una mutación complementaria o acomodativa, es decir, el ‘ojal’ (por ejemplo, una sustitución con glicina). Dichas series de mutaciones pueden modificarse por ingeniería en cualquier par de polipéptidos que comprenda la molécula de diacuerpo, y además, modificarse en cualquier parte de las cadenas polipeptídicas de dicho par. Los métodos de modificación por ingeniería de proteínas para favorecer la heterodimerización frente a la homodimerización son bien conocidos en la técnica, en particular, con respecto a la modificación por ingeniería de moléculas de tipo inmunoglobulina, y están englobados en el presente documento (véase, por ejemplo, Ridgway et al. (1996) "Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization", Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library", J. Mol. Biol. 270: 26-35 y Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101).
También se describen moléculas de diacuerpo que comprenden la variante de Fc o dominios variantes de bisagra-Fc (o parte de los mismos), comprendiendo dicho dominio Fc variante al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustitución, inserción, eliminación) con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre o dominio bisagra-Fc comparable (o parte de los mismos). Las moléculas que comprenden dominios Fc variantes o dominios bisagra-Fc (o parte de los mismos) (por ejemplo, anticuerpos) normalmente tienen fenotipos alterados con respecto a moléculas que comprenden dominios Fc de tipo silvestre o dominios bisagra-Fc o porciones de los mismos. El fenotipo variante se puede expresar como semivida en suero modificada, estabilidad modificada, susceptibilidad modificada a enzimas celulares o función efectora modificada según lo determinado en un ensayo dependiente de linfocitos NK o dependiente de macrófagos. Las variantes del dominio Fc identificadas como modificadoras de la función efectora se desvelan en la solicitud internacional W004/063351, las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514, y las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos n,2 US2006-0134709 A1, presentada el 10 de noviembre de 2005 y US2006-0177439 A1, presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitudes concurrentes de los inventores,
Los diacuerpos biespecíficos de la divulgación pueden unirse al mismo tiempo a dos epítopos distintos e independientes. En ciertas realizaciones, los epítopos son del mismo antígeno, En otras realizaciones, los epítopos son de antígenos diferentes. En las realizaciones preferidas, al menos un sitio de unión a epítopo es específico para un determinante expresado en una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, CD3, CD16, CD32, CD64, etc.) que se expresan en linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK) u otras células mononucleares. En una realización, la molécula de diacuerpo se une al determinante de células efectoras y también activa dicha célula efectora. En este sentido, las moléculas de diacuerpo de la divulgación pueden exhibir una funcionalidad similar a lg independientemente de si comprenden además un dominio Fc (por ejemplo, como se ensaya en cualquier ensayo de función efectora conocido en la técnica o ejemplificado en el presente documento (por ejemplo, ensayo de ADCC). En ciertas realizaciones, el diacuerpo biespecífico de la divulgación se une tanto a un antígeno del cáncer en una célula tumoral como a un determinante de células efectoras mientras activa dicha célula. En realizaciones alternativas, el diacuerpo biespecífico o la molécula de diacuerpo de la divulgación pueden inhibir la activación de una diana, por ejemplo, célula efectora, uniéndose simultáneamente y de este modo ligando, un receptor activador e inhibidor en la misma célula (por ejemplo, se une tanto a CD32A como a CD32B, tanto a BCR como a CD32B o tanto a IgERI como a CD32B) como se ha descrito anteriormente (véase, el apartado de Antecedentes). En otro aspecto de dicha realización, el diacuerpo biespecífico puede presentar propiedades antivíricas uniendo simultáneamente dos epítopos neutralizantes en un virus (por ejemplo, epítopos de VRS; epítopos de WNV tales como E16 y E53).
En determinadas realizaciones, las moléculas de diacuerpo biespecíficas de la divulgación ofrecen oportunidades únicas para dirigirse a tipos de células específicas. Por ejemplo, el diacuerpo o la molécula de diacuerpo biespecíficos puede modificarse por ingeniería para comprender una combinación de sitios de unión al epítopo que reconozcan una serie de antígenos únicos frente a un tipo de célula o tejido diana. Adicionalmente, cuando cualquiera o ambos antígenos individuales esté/n normalmente separados en otros tipos de tejido y/o célula, es posible usar dominios de unión de baja afinidad con el fin de construir el diacuerpo o la molécula de diacuerpo. Dichos dominios de unión de baja afinidad serán incapaces de unirse al epítopo o antígeno con suficiente avidez con fines terapéuticos. Sin embargo, cuando están presentes epítopos o antígenos en una sola célula o tejido diana, la avidez del diacuerpo o la molécula de diacuerpo hacia la célula o el tejido, con respecto a la célula o al tejido que expresa solo uno de los antígenos, aumentará de modo que la célula o el tejido pueda seleccionarse como diana de manera eficaz mediante la molécula de diacuerpo. Dicha molécula biespecífica puede presentar una mejor unión a uno o ambos de sus antígenos diana en células que expresen dichos antígenos con respecto a un diacuerpo monoespecífico o un anticuerpo con una especificidad solo hacia uno de los antígenos.
Preferentemente, las propiedades de unión de los diacuerpos de la divulgación se caracterizan mediante ensayos funcionales in vitro para determinar la actividad de unión y/o una o más funciones de células efectoras del mediador FcyR (mediadas a través de interacciones Fc-FcyR o mediante la unión inmunoespecífica de una molécula de diacuerpo a un FcyR) (véanse los apartados 5.4.2 y 5.4.3). Las afinidades y las propiedades de unión de las moléculas, por ejemplo, diacuerpos, de la divulgación hacia un FcyR se pueden determinar usando ensayos in vitro (ensayos bioquímicos o inmunológicos) conocidos en la técnica para determinar interacciones entre dominio de unión-antígeno o Fc-FcyR, es decir, la unión específica de un antígeno a un dominio de unión o la unión específica de una región Fc a un FcyR, respectivamente, incluyendo, pero sin limitación, ensayo de ELISA, ensayo de resonancia de plasmón superficial, ensayo de inmunoprecipitación (véase el apartado 5.4.2). En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la divulgación tienen propiedades de unión similares en modelos in vivo (tales como los descritos y desvelados en el presente documento) como aquellos ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye moléculas de la divulgación que no presenten el fenotipo deseado en los ensayos in vitro, pero que presenten el fenotipo deseado in vivo.
En algunas realizaciones, las moléculas de la divulgación se modifican por ingeniería para que comprendan un patrón de glicosilación modificado o una glicoforma modificada con respecto a la parte comparable de la molécula molde. Las glicoformas modificadas por ingeniería pueden ser útiles para diversos fines, incluyendo, pero sin limitación, mejorar la función efectora. Las glicoformas modificadas por ingeniería se pueden generar mediante cualquier método conocido por un experto en la materia, por ejemplo, usando cepas modificadas por ingeniería o de expresión variable, mediante la expresión conjunta con una o más enzimas, por ejemplo, DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT111), mediante la expresión de un diacuerpo de la divulgación en diversos organismos o estirpes celulares de diversos organismos, o modificando el/los hidrato/s de carbono después de que el diacuerpo haya sido expresado y purificado. Los métodos para generar glicoformas modificadas por ingeniería son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, las descritas en Umana et al. (1999) "Engineered Glycoforms 0f An Antineuroblastoma IgG1 With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity", Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII", Bioteohnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, (2002) "Laok Of Fucose On Human igG1 N-Linked Oligosaccharide improves Binding To Human Fogamma Rili And Antibody-Dependent Cellular Toxicity", J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al, (2003) "The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human lgG1 Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity", J Biol Chem 278:3466-3473), documentos US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCTWO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc, Princeton, NJ); tecnología de ingeniería de glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza, Véase, por ejemplo, los documentos WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al, (2004) "Fucose Depletion From Human lgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between lgG1 And FcGammaRlllA", JMB, 336: 1239-49,
La divulgación engloba además la incorporación de aminoácidos no naturales para generar los diacuerpos de la divulgación, Dichos métodos son conocidos por los expertos en la materia, tales como los que usan la maquinaria biosintética natural para permitir la incorporación de aminoácidos no naturales a proteínas, véase, por ejemplo, Wang et al, (2002) "Expanding The Genetic Code", Chem, Comm, 1: 1-11; Wang et al, (2001) "Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli", Science, 292: 498-500; van Hest et al, (2001) "Protein-Based Materials", Toward A New Level Of Structural Control", Chem, Comm, 19: 1897-1904, Las estrategias alternativas se centran en las enzimas responsables de la biosíntesis de aminoacil-ARNt, véase, por ejemplo, Tang et al, (2001) "Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine in An Engineered Bacteria1Host", J, Am, Chem, Soc, 123(44): 11089-11090; Kiick et al, (2001) "Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues in Escherichia coli", FEBS Lett, 502(1-2):25-30,
En algunas realizaciones, la divulgación engloba métodos para modificar un dominio VL, VH o Fc de una molécula de la divulgación mediante la adición o eliminación de un sitio de glicosilación, Los métodos para modificar el hidrato de carbono de proteínas son bien conocidos en la técnica y están englobados dentro de la divulgación, véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos n,26,218,149; documento EP 0359 096 B1; publicación de los Estados Unidos n,2 US 2002/0028486; documento WO 03/035835; publicación de los Estados Unidos n,22003/0115614; Patente de los Estados Unidos n,26,218,149; Patente de los Estados Unidos n,26,472,511,
Las moléculas de diacuerpo de la presente divulgación pueden construirse para que comprendan un dominio que es un ligando de unión para el receptor del grupo de eliminador natural 2D (NKG2D), Dichos ligandos de unión y particularmente aquellos que no se expresan en células normales, incluye la molécula de histocompatibilidad 60 (H60), el producto del gen-1 inducible temprano del ácido retinoico (RAE-1) y el transcrito 1 (MULT1) similar a la proteína de unión a UL16 murino (Raulet D,H, (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And its Ligands," Nature Rev, immunol, 3:781-790; Coudert, J,D, et al, (2005) "Altered NKG2D Function in NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells", Blood 106:1711-1717), Los ligandos adicionales reactivos con NKG2D humano incluyen las moléculas MICA y MiCB relacionadas con la cadena de clase i del MHC (Diefenbach, A, et al, (1999) "Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune in," Curr, Biol, 9(22):R851-R8533; Bauer, S, et al, (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-lnducible MICA", Science 285(5428):727-729; Stephens, H,A, (2001) "MICA and MiCB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved?", Trends immunol, 22:378-385,
La secuencia de MICA es la SEQ ID NO: 311:
MGLGPVFLLL AGIFPFAPPG AAAEPHSLRY NLIVLSWDGS VQSGFLIEVH
LDGQPFLRCD RQKCRAKPQG QWAEDVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL
AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE 1HEDNSTRSS QHFYYDGELF LSQNLETKEW
TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGVV
LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT
QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH S1HPVPSGKV
LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FV IIIFY V RC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD
QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA
La secuencia de MICB es la SEQ ID NO: 312:
PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE
DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED
SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTNFWKEDAM
KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVNVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRNIT
LTWRQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTCYMEH
SGNHGTHPVP SGKALVLQSQ RTDFPYVSAA M P C F V IIIIL CVPCCKKKTS
AAEGP
Los anticuerpos que se unen específicamente al receptor de linfocitos T incluyen el anticuerpo anti-TCR BMA 031 (Kurrle, R. et al. (1989) "BMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application", Transplant Proc.
21(1 Pt 1 ):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) "Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex," Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human a/p T Cell", J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human a/p T Cell Receptor", J. Immunol. 147(12):4366-4373). Los anticuerpos que se unen específicamente al receptor NKG2D incluyen Ky K-2.0 (Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity", J. Mol. Biol. 384:1143-1156; y el documento PCT/US09/54911).
Mediante el uso de dicho diacuerpo, la célula diana se redirige para que sea una célula que puede unirse a células que presentan el receptor (NKG2D). El receptor NKG2D se expresa en todos los linfocitos citolíticos naturales humanos (y de otros mamíferos)(Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA", Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing", Immunity 17(1):19-29) así como en todos los linfocitos T Cd8+ (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8ap T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells", Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing", Immunity 17(1 ):19-29).
Como alternativa, las moléculas de diacuerpo de la presente divulgación pueden construirse para que comprendan un dominio que es un ligando de unión para el receptor de linfocitos T ("TCR"). El TCR se expresa de forma nativa por los linfocitos T CD4+ o CD8+ y permite que dichas células reconozcan los péptidos antigénicos que están unidos y presentados por las proteínas de MHC de clase I o clase II de las células presentadoras de antígeno. El reconocimiento de un complejo de pMHC (péptido-MHC) por un TCR inicia la propagación de una respuesta inmunitaria celular que da lugar a la producción de citocinas y a la lisis de la célula presentadora de antígenos (véase, por ejemplo, Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes," Biochem. J. 415(Pt 2): 183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy", Cytometry A.
73(11 ):1093-1 ü99; Beier, K.C. et al. (2007) "Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation", Eur. Respir. J.
29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes", Am. J. Ther. 12(6):534-550).
Mediante la construcción de dichas moléculas de diacuerpo para que comprendan adicionalmente un dominio de unión a epítopo capaz de unirse a, por ejemplo, un receptor presente en la superficie de una célula diana, dichas moléculas de diacuerpo serán moléculas DART y, por lo tanto, serán capaces de unirse a las células diana y de este modo harán que las células diana muestren el ligando de unión para el receptor 2D del grupo de eliminador natural (NKG2D) o para el TCR (el que esté presente en el diacuerpo unido a la célula diana (véase, por ejemplo, Germain, C. et al. (2008) "Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein", Prot. Engineer. Design Selection 21(11):665-672).
Dichos diacuerpos pueden usarse para redireccionar cualquier célula diana deseada a una célula que sea un objetivo de la lisis celular mediada por células NK o la citotoxicidad mediada por linfocitos T. En una realización, el dominio de unión a epítopo del diacuerpo capaz de unirse a un receptor presente en la superficie de una célula diana es un epítopo que se une a un antígeno asociado a tumor para redirigir dichas células cancerosas a sustratos para la lisis celular mediada por células NK o citotoxicidad mediada por linfocitos T. De particular interés es un antígeno asociado a un tumor que es un antígeno del cáncer de mama, un antígeno del cáncer de ovario, un antígeno del cáncer de próstata, un antígeno de cáncer de cuello de útero, un antígeno de carcinoma pancreático, un antígeno de cáncer de pulmón, un antígeno de cáncer de vejiga, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer testicular, un antígeno del cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una neoplasia maligna de linfocitos B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con el linfoma no Hodgkin o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.
Los antígenos asociados a tumores adecuados para dicho uso incluyen A33 (un antfgeno de carcinoma colorreotal; Almqvist, Y. 2006, Nucí Med Biol. Nov;33(8):991-998); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cáncer Res. 66(1):6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); beta-catenina(Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); Ca 125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cáncer 15 Supl 3:274-81); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol.
33(2):167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther.
40(4):139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91 (9):1234-40); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11 (1):31 -7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91 (9):1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA (antígeno carcinoembrionario; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fértil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CTLA4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13); EGF-R (receptor de factor de crecimiento epidérmico; Adenis, A. et al.
2003 Bull Cáncer. 90 n.2 de espec.: S228-32); Erb (ErbB1; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21 (57):8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al.
2006 Int J Cáncer. 118(1): 123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cáncer Immunol Immunother.
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2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301 -11); Ps Ma (Ragupathi, G. 2005 Cáncer Treat Res. 123:157-80); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1 (5):881-91); receptor de TNF (receptor de TNF-a, receptor de TNF-p; o receptor de TNF-y; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets.
1 (4):327-64); o receptor de VEGF (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11 (9):992-8).
Los antígenos adicionales asociados a tumores para dicho uso (y las publicaciones que describen anticuerpos específicamente reactivos para dichos antígenos) incluyen ADAM-9 (Publicación de Patente de los Estados Unidos n.2 2006/0172350; Publicación PCT n.2 WO 06/084075); ALCAM (Publicación PCT n.2 WO 03/093443); carboxipeptidasa M (Publicación de Patente de los Estados Unidos n.2 2006/0166291); CD46 (Patente de los Estados Unidos n.2 7.148.038; Publicación PCT n.2 WO 03/032814); Citoqueratina 8 (Publicación PCT n.2 WO 03/024191); Receptores de efrina (y, en particular, EphA2 (Patente de los Estados Unidos n.27.569.672; Publicación PCT n.2 WO 06/084226); Integrina alfa-V-beta-6 (Publicación PCT n.2 WO 03/087340); JAM-3 (Publicación PCT n.2 WO 06/084078); KID3 (Publicación PCT n.2 WO 05/028498); KID31 (Publicación PCT n.2 WO 06/076584); LUCA-2 (Publicación de Patente de los Estados Unidos n.22006/0172349; Publicación PCT n.2 WO 06/083852); Oncostatina M (receptor beta de oncostatina) (Patente de los Estados Unidos n.27.572.896; Publicación PCT n.2 w O 06/084092); PiPa (Patente de los Estados Unidos n.27.405.061; Publicación PCT n.2 WO 04/043239); RAAG10 (Patente de los Estados Unidos n.27.527.969; Publicación PCT n.2 WO 04/001381); ROR1 (Patente de los Estados Unidos n.2 5.843.749); TES7 (Publicación PCT n.2 WO 08/066691); y el receptor de transferrina (Patente de los Estados Unidos n.27.572.895; Publicación PCT n.2 WO 05/121179).
También son de interés los antígenos específicos de agentes infecciosos particulares, por ejemplo, agentes víricos que incluyen, pero sin limitación, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), gripe, virus del papiloma humano (VPH), pie y boca (coxsackievirus), el virus de la rabia, virus del herpes simple (VHS) y los agentes causantes de la gastroenteritis, incluidos los rotavirus, adenovirus, calicivirus, astrovirus y virus de Norwalk; agentes bacterianos incluyendo, pero sin limitación, E. coli, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Hemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis y Streptococcus pneumoniae, agentes fúngicos y parásitos, tales como Giardi.
Como alternativa, dicho epítopo puede unirse a un receptor Fc (por ejemplo, FcyRI o FcyRIl), para, por ejemplo, redirigir las células leucémicas monocíticas agudas a sustratos para la lisis celular mediada por células NK.
5.1 DOMINIOS DE UNIÓN A DIACUERPOS
Los diacuerpos de la presente divulgación comprenden dominios de unión al antígeno generalmente derivados de inmunoglobulinas o anticuerpos. Los anticuerpos de los que se derivan los dominios de unión usados en los métodos pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos (por ejemplo, ser humano, primate no humano, murino, burro, ovejas, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo). Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Como se usa en el presente documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, e incluyen anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o bibliotecas de secuencias codificantes de inmunoglobulinas humanas, sintéticas o de ratones que expresen anticuerpos de genes humanos.
La divulgación contempla el uso de cualquiera de los anticuerpos conocidos en la técnica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, enfermedad autoinmunitaria, enfermedades inflamatorias o enfermedades infecciosas como fuente de dominios de unión para los diacuerpos de la divulgación. Los ejemplos no limitantes de los anticuerpos del cáncer conocidos se proporcionan en el apartado 5.7.1, así como otros anticuerpos específicos para los antígenos diana enumerados y anticuerpos contra los antígenos del cáncer enumerados en el apartado 5.6.1; los ejemplos no limitantes de los anticuerpos conocidos para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune y enfermedad inflamatoria se proporcionan en el apartado 5.7.2., así como anticuerpos contra antígenos diana enumerados y anticuerpos contra los antígenos enumerados en el apartado 5.6.2; en otras realizaciones, es posible usar anticuerpos contra epítopos asociados con enfermedades infecciosas como se enumera en el apartado 5.6.3. En determinadas realizaciones, los anticuerpos comprenden una región Fc variante que comprende una o más modificaciones de aminoácidos, que se han identificado con una función efectora conferida y/o afinidad potenciada por el FcyRIIB y una afinidad disminuida por FcyRIIIA con respecto a una molécula comparable que comprende una región Fc de tipo silvestre. Un ejemplo no limitante de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios junto con las moléculas de la divulgación se presenta en la Tabla 9, y un ejemplo no limitante de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de trastornos autoinmunitarios se presenta en la tabla 10.
Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de los anticuerpos en seres humanos y los ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar diacuerpos con dominios variables procedentes de anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados. Los dominios variables de anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de presentación en fagos anteriormente descritos usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véanse también las Patentes de los Estados Unidos n.24.444.887 y 4.716.111; las publicaciones internacionales n.2 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91 /10741.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo, una variante o un fragmento del mismo, que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región marco conservada que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana o una CDR que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado puede comprender esencialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los que todas o esencialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o esencialmente todas las regiones marco conservadas son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana.
Las regiones marco conservadas y las CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder exactamente a las secuencias precursoras, por ejemplo, la CDR donante o la región marco conservada consenso pueden mutagenizarse mediante la sustitución, inserción o eliminación de al menos un resto para que la CDR o resto marco de ese sitio no corresponda a la secuencia consenso o al anticuerpo donante. Dichas mutaciones, sin embargo, preferentemente no son extensas. Normalmente, al menos el 75 % de los restos de los anticuerpos humanizados corresponderán con los de la región marco conservada (FR) precursora y las secuencias CDR, más frecuentemente el 90 %, y lo más preferentemente más del 95 %. Los anticuerpos humanizados pueden ser producidos usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, el injerto de CDR (patente europea n.2 EP 239400; la publicación internacional n.2 WO 91/09967; y las Patentes de los Estados Unidos n.2 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), sustitución en superficie o acondicionamiento de la superficie (patentes europeas n.2 EP 592.106 y EP 519.596; Padlan (1991) "A Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties", Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) "Human-Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific Binding Activity By Preserving Non-CDR Complementarity-Modulating Residues", Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska et al. (1994) "Humanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable Domain Resurfacing", Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973), redistribución de cadenas (patente de los Estados Unidos n.25.565.332), y técnicas desveladas en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.26.407.213, 5.766.886, 5.585.089, la publicación internacional n.2 WO 9317105, Tan et al. (2002) "Superhumanized' Antibodies: Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining Region Grafting With Human Germline Sequences: Application To An Anti-CD28", J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al. (2000) "Design And Synthesis Of Germline-Based Hemi-Humanized Single-Chain Fv Against The CD18 Surface Antigen", Protein Eng. 13:353-60, Morea et al. (2000) "Antibody Modeling: Implications For Engineering And Design", Methods 20:267-79, Baca et al. (1997) "Antibody Humanization Using Monovalent Phage Display", J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska et al. (1996) "A Comparison Of Two Murine Monoclonal Antibodies Humanized By CDR-Grafting And Variable Domain Resurfacing", Protein Eng. 9:895-904, Couto et al. (1995) "Designing Human Consensus Antibodies With Minimal Positional Templates", Cáncer Res. 55 (23 Sup):5973s-5977s, Couto et al. (1995) "Anti-BA46 Monoclonal Antibody Mc3: Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In Vitro Characterization", Cáncer Res. 55:1717-22, Sandhu (1994) "A Rapid Procedure For The Humanization Of Monoclonal Antibodies", Gene 150:409-10, Pedersen et al. (1994) "Comparison Of Surface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin Fv Domains. Implication For Humanization Of Murine Antibodies", J. MoI. BíoI. 235:959-973, Jones et al, (1986) "Replaeing The Complementarity-Determining Regions ln A Human Antibody With Those From A Mouse", Nature 321:522-525, Rieehmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy", Nature 332:323-327 y Presta (1992) "Antibody Engineering", Curr. Op. Bioteeh. 3(4):394-398. A menudo, los restos mareo de las regiones mareo conservadas serán sustituidos por el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para modificar, preferentemente, mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de la región mareo conservada se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la modelización de las interacciones de los restos de CDR y de la región marco conservada para identificar los restos marco importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar los restos marco poco habituales en posiciones específicas. (Véanse, por ejemplo, Queen et al., Patente de los Estados Unidos n.25.585.089; Publicaciones de los Estados Unidos n.22004/0049014 y 2003/0229208; Patentes de los Estados Unidos n.2 6.350.861; 6.180.370; 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101 y Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy", Nature 332:323-327.).
En una realización más preferida, el dominio de unión humanizado se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo murino donante. Los expertos en la materia apreciarán que la divulgación engloba el injerto de CDR de los anticuerpos en general. Por lo tanto, los anticuerpos donantes y aceptores pueden derivarse de animales de la misma especie e incluso de la misma clase o subclase de anticuerpo. Más habitualmente, sin embargo, los anticuerpos donantes y aceptores se derivan de animales de diferente especie. Por lo general, el anticuerpo donante es un anticuerpo no humano, tal como puede ser un mAb de roedor, y el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano.
En algunas realizaciones, al menos una CDR del anticuerpo donante se injerta en el anticuerpo humano. En otras realizaciones, al menos dos y, preferentemente, las tres CDR de cada una de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera se injertan en el anticuerpo humano. Las CDR pueden comprender las CDR de Kabat, las CDR de bucles estructurales o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la divulgación engloba un anticuerpo contra FcyRIIB humanizado que comprende al menos una cadena pesada a la que se injerta la CDR y al menos una cadena ligera a la que se injerta la CDR.
Los diacuerpos usados en los métodos incluyen derivados que son modificados, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al diacuerpo. Por ejemplo, pero sin limitación, los derivados de diacuerpos incluyen diacuerpos que han sido modificados, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no convencionales.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes del anticuerpo se derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina tal como pueden ser anticuerpos que tengan una región variable derivada de un anticuerpo no humano y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison (1985) "Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies", Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) "Chimeric Antibodies," BioTechniques 4:214-221; Gillies et al. (1989) "High-Level Expression Of Chimeric Antibodies Using Adapted cDNA Variable Region Cassettes", J. Immunol. Methods 125:191-202; y las Patentes de los Estados Unidos n.26.311.415, 5.807.715, 4.816.567 y 4.816.397.
A menudo, los restos marco de las regiones marco conservadas serán sustituidos por el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para modificar, preferentemente, mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de la región marco conservada se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la modelización de las interacciones de los restos de CDR y de la región marco conservada para identificar los restos marco importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar los restos marco poco habituales en posiciones específicas. (Véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.2 5.585.089; y Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy", Nature 332:323-327).
Los anticuerpos monoclonales a partir de los que pueden prepararse los dominios de unión de los diacuerpos de la divulgación usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando técnicas de hibridoma que incluyen aquellas conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling, et al., en: "Monoclonal Antibodies and T-Cel1Hybridomas", págs. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridoma. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no al método mediante el que se produce.
Los métodos para producir y examinar anticuerpos específicos usando la tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En un ejemplo no limitante, es posible inmunizar ratones con un antígeno de interés o una célula que exprese dicho antígeno. Una vez que se detecta una respuesta Inmunltarla, por ejemplo, Ios anticuerpos específicos para el antígeno se detectan en el suero del ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. A continuación, se fusionan los esplenocitos mediante técnicas bien conocidas a cualquiera de las células de mieloma apropiadas. Se seleccionan y se clonan los hibridomas por dilución limitante. Los clones de hibridomas se someten luego a ensayo mediante métodos conocidos en la técnica para determinar células que secreten anticuerpos capaces de unirse al antígeno. El fluido de ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse inoculando ratones por vía intraperitoneal con clones de hibridoma positivos. Los antígenos de interés incluyen, pero sin limitación, antígenos asociados con los cánceres proporcionados en el apartado 5.8.1, antígenos asociados con las enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias proporcionadas en el apartado 5.8.2, antígenos asociados con las enfermedades infecciosas proporcionadas en el apartado 5.8.3, y las toxinas proporcionadas en el apartado 5.8.4.
También es posible generar anticuerpos usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, los dominios funcionales del anticuerpo son presentados en la superficie de las partículas de fago que portan las secuencias de polinucleótidos que las codifican. En una realización particular, dicho fago puede usarse para presentar dominios de unión al antígeno, tal como el fragmento Fab y Fv o Fv estabilizado con enlaces disulfuro, expresados a partir de un repertorio o biblioteca combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). El fago que expresa un dominio de unión al antígeno que se une al antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con un antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o perla. El fago usado en estos métodos normalmente son fagos filamentosos, incluyendo fd y M13. Los dominios de unión al antígeno son expresados como proteína fusionada de forma recombinante a la proteína del gen III o gen VIII del fago. Los ejemplos de los métodos de presentación en fagos que se pueden usar para preparar inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas, de la presente divulgación incluyen los desvelados en Brinkmann et al. (1995) "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments", J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al. (1995) "Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins", J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) "Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments", Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al. (1997) "An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries", Gene, 187:9-18; Burton et al. (1994) "Human Antibodies From Combinatorial Libraries", Advances in Immunology, 57:191-280; Publicaciones PCT Wo 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de los Estados Unidos n.2 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
La tecnología de presentación en fagos puede usarse para aumentar la afinidad de un anticuerpo por su antígeno. Esta técnica sería útil para obtener anticuerpos de alta afinidad. La tecnología, conocida como maduración por afinidad, emplea la mutagénesis o el paseo por las CDR y la reselección usando el antígeno relacionado para identificar los anticuerpos que se unen con mayor afinidad al antígeno en comparación con el anticuerpo inicial o parental (véase, por ejemplo, Glaser et al. (1992) "Dissection Of The Combining Site In A Humanized Anti-Tac Antibody", J. Immunology 149:2607-2614). La mutagenización de codones completos en lugar de nucleótidos simples produce un repertorio semialeatorizado de mutaciones de aminoácidos. Es posible construir bibliotecas que consisten en una combinación de clones variantes, cada uno de los cuales difiere en modificaciones de un solo aminoácido en una sola CDR y que contienen variantes que representan cada posible sustitución de aminoácidos para cada resto CDR. Los mutantes con mayor afinidad de unión por el antígeno pueden explorarse poniendo en contacto los mutantes inmovilizados con antígeno marcado. Se puede usar cualquier método de rastreo conocido en la técnica para identificar anticuerpos mutantes con mayor avidez por el antígeno (por ejemplo, ELISA) (véase Wu et al. (1998) "Stepwise In vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized mAb", Proc Natl. Acad Sci.USA 95:6037-6042; Yelton et al. (1995) "Affinity Maturation Of The Br96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis", J. Immunology 155:1994-2004). También es posible el paseo por las CDR que asigna al azar la cadena ligera (véase Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site", J. Mol. Bio. 263:551-567).
La presente divulgación también engloba el uso de dominios de unión que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de unión que se describen en el presente documento o que se conocen en la técnica con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos) en las regiones marco conservadas o CDR. Preferentemente, las mutaciones de estos dominios de unión mantienen o mejoran la avidez y/o afinidad de los dominios de unión por FcyRIIB al que se unen de manera inmunoespecífica. Se pueden usar técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia (por ejemplo, inmunoensayos) para determinar la afinidad de un anticuerpo por un determinado antígeno.
Las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia pueden usarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, o fragmento del mismo, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR, que producen sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, los derivados incluyen sustituciones de menos de 15 aminoácidos, sustituciones de menos de 10 aminoácidos, sustituciones de menos de 5 aminoácidos, sustituciones de menos de 4 aminoácidos, sustituciones de menos de 3 aminoácidos o sustituciones de menos de 2 aminoácidos con respecto al anticuerpo original o fragmento del mismo. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones conservativas de aminoácidos realizadas en uno o más de los restos de aminoácidos no esenciales previstos.
5.1.1 d ia c u e r p o s q u e c o m p r e n d e n s it io s de unió n al e p Ít o p o q u e se unen de m a n e r a INMUNOESPECÍFICA a FcyRIIB
En una realización particular, al menos uno de los dominios de unión de los diacuerpos de la divulgación es agonista hacia al menos una actividad de FcyRIIB. En una realización de la divulgación, dicha actividad es la inhibición de la señalización mediada por el receptor de linfocitos B. En otra realización, el dominio de unión inhibe la activación de linfocitos B, la proliferación de linfocitos B, la producción de anticuerpos, el flujo de entrada de calcio intracelular de linfocitos B, la progresión del ciclo celular o la actividad de una o más moléculas de la señalización aguas abajo en la vía de transducción de señales de FcyRIIB. En otra realización más, el dominio de unión potencia la fosforilación de FcyRIIB o el reclutamiento de SHIP. En una realización adicional de la divulgación, el dominio de unión inhibe la actividad de MAP cinasa o el reclutamiento de Akt en la vía de señalización mediada por el receptor de linfocitos B. En otra realización, el dominio de unión es agonista de la inhibición de la señalización de FcsRI mediada por FcyRIIB. En una realización particular, dicho dominio de unión inhibe la activación de mastocitos inducida por FcsRI, la movilización del calcio, la desgranulación, la producción de citocinas o la liberación de serotonina. En otra realización, los dominios de unión de molécula de diacuerpo estimulan la fosforilación de FcyRIIB, estimulan el reclutamiento de SHIP, estimulan la fosforilación de SHIP y su asociación con Shc, o inhiben la activación de los miembros de la familia de las MAP cinasas (por ejemplo, Erk1, Erk2, JNK, p38, etc.). En otra realización más, los dominios de unión de la molécula de diacuerpo potencian la fosforilación de tirosinas de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra realización, los dominios de unión de la molécula de diacuerpo inhiben la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos o macrófagos.
En otra realización, los dominios de unión antagonizan al menos una actividad de FcyRIIB. En una realización, dicha actividad es la activación de la señalización mediada por el receptor de linfocitos B. En una realización particular, los dominios de unión potencian la actividad de los linfocitos B, la proliferación de linfocitos B, la producción de anticuerpos, el flujo de entrada de calcio intracelular o la actividad de una o más moléculas de señalización aguas abajo en la vía de transducción de señales de FcyRIIB. En otra realización particular más, los dominios de unión disminuyen la fosforilación de FcyRIIB o el reclutamiento de SHIP. En una realización adicional de la molécula de diacuerpo, los dominios de unión potencian la actividad de MAP cinasa o el reclutamiento de Akt en la vía de señalización mediada por el receptor de linfocitos B. En otra realización, los dominios de unión son antagonistas de la inhibición de la señalización de FcsRI mediada por FcyRIIB. En una realización particular, los dominios de unión potencian la activación de mastocitos inducida por FcsRI, la movilización del calcio, la desgranulación, la producción de citocinas o la liberación de serotonina. En otra realización, los dominios de unión inhiben la fosforilación de FcyRIIB, inhiben el reclutamiento de SHIP, inhiben la fosforilación de SHIP y su asociación con Shc, potencian la activación de los miembros de la familia de las MAP cinasas (por ejemplo, Erk1, Erk2, JNK, p38, etc.). En otra realización más, los dominios de unión inhiben la fosforilación de tirosinas de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra realización, los dominios de unión potencian la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos o macrófagos. En otra realización, los dominios de unión impiden la fagocitosis, el aclaramiento de partículas opsonizadas por macrófagos esplénicos.
En otras realizaciones, al menos uno de los dominios de unión puede usarse para dirigir los diacuerpos de la divulgación a células que expresen FcyRIIB.
En una realización particular, uno de los dominios de unión se deriva de un anticuerpo monoclonal murino producido por el clon 2B6 o 3H7, que tiene números de registro ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente. Los hibridomas productores de anticuerpos 2B6 y 3H7 se han depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 13 de agosto de 2002 en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con fines de los procedimientos en materia de patentes, y los números de registro asignados PTA-4591 (para el hibridoma productor de 2B6) y PTA-4592 (para el hibridoma productor de 3H7), respectivamente. En una realización preferida, los dominios de unión son humanos o han sido humanizados, preferentemente se derivan de una versión humanizada del anticuerpo producido por el clon 3H7 o 2B6.
La divulgación también engloba diacuerpos con dominios de unión de otros anticuerpos, que se unen específicamente a FcyRIIB, preferentemente FcyRIIB humano, más preferentemente FcyRIIB humano, nativo, que se derivan de clones que incluyen, pero sin limitación, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 y 1F2 que tienen los números de registro ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, pTa -5960 y PTA-5959, respectivamente. Los hibridomas productores de los clones anteriormente identificados fueron depositados en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 7 de mayo de 2004. En las realizaciones preferidas, los dominios de unión de los anticuerpos anteriormente descritos están humanizados.
En una realización específica, Ios dominios de unión utilizados en Ios diacuerpos de la presente divulgación son de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR), preferentemente, las 6 CDR) del anticuerpo producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. En otra realización, el dominio de unión se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal murino producido a partir del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2, respectivamente y/o compite con el anticuerpo monoclonal murino producido a partir del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2, tal como se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA u otro inmunoensayo competitivo apropiado, y también se une a FcyRIIB con una afinidad superior a la del dominio de unión a FcyRIIA.
La presente invención también engloba diacuerpos con dominios de unión que comprenden una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable que es al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable y/o cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. La presente divulgación engloba además diacuerpos con dominios de unión que se unen específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad de lo que se une el anticuerpo o fragmento del mismo a FcyRIIA, y que comprende una secuencia de aminoácidos de una o más de las CDR que es al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. La determinación del porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos puede realizarse mediante cualquier método conocido por los expertos en la materia, incluyendo las búsquedas de proteínas BLAST.
La presente divulgación también engloba el uso de diacuerpos que contienen dominios de unión que se unen específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad de lo que el dominio de unión se une a FcyRIIA, que son codificados por una secuencia de nucleótidos que se hibrida a la secuencia de nucleótidos del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 en condiciones rigurosas. En una realización preferida, el dominio de unión se une específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad que FcyRIIA, y comprende una cadena ligera variable y/o cadena pesada variable codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de cadena ligera variable y/o cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 en condiciones rigurosas. En otra realización preferida, los dominios de unión se unen específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad que FcyRIIA, y comprenden una o más CDR codificadas por una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. Las condiciones de hibridación rigurosas incluyen, pero sin limitación, hibridación a ADN unido al filtro en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X/SDS al 0,1 % a aproximadamente 50-65 °C, condiciones altamente rigurosas tales como la hibridación a ADN unido al filtro en SSC 6X a aproximadamente 45 °C seguido de uno o más lavados en SSC 0,1X/SDS al 0,2 % a aproximadamente 602C o cualquier otra condición rigurosa de hibridación conocida por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY, en las páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3).
La presente divulgación también engloba el uso de dominios de unión que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de unión que se describen anteriormente con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos) en las regiones marco conservadas o CDR. Preferentemente, las mutaciones de estos dominios de unión mantienen o mejoran la avidez y/o afinidad de los dominios de unión por FcyRIIB al que se unen de manera inmunoespecífica. Se pueden usar técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia (por ejemplo, inmunoensayos) para determinar la afinidad de un anticuerpo por un determinado antígeno.
Las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia pueden usarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, o fragmento del mismo, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR, que producen sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, los derivados incluyen sustituciones de menos de 15 aminoácidos, sustituciones de menos de 10 aminoácidos, sustituciones de menos de 5 aminoácidos, sustituciones de menos de 4 aminoácidos, sustituciones de menos de 3 aminoácidos o sustituciones de menos de 2 aminoácidos con respecto al anticuerpo original o fragmento del mismo. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones conservativas de aminoácidos realizadas en uno o más de los restos de aminoácidos no esenciales previstos.
En las realizaciones preferidas, los dominios de unión se derivan de anticuerpos humanizados. Un anticuerpo específico FcyRIIB humanizado puede comprender esencialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los que todas o esencialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o esencialmente todas las regiones marco conservadas son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana.
Los diacuerpos de la presente divulgación comprenden dominios variables humanizados específicos para FcyRIIB en los que una o más regiones de una o más CDR de las regiones variables de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano (el anticuerpo receptor) han sido sustituidas por partes análogas de una o más CDR de un anticuerpo monoclonal donante que se une específicamente a FcyRIIB, con una afinidad mayor que FcyRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. En otras realizaciones, los anticuerpos humanizados se unen al mismo epítopo que 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2, respectivamente.
En una realización preferida, las regiones CDR del dominio de unión a FcyRIIB humanizado se derivan de un anticuerpo murino específico de FcyRIIB. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento comprenden alteraciones, incluyendo, pero sin limitación, eliminaciones, inserciones o modificaciones de aminoácidos, del anticuerpo aceptor, es decir, regiones marco conservadas de dominio variable de cadena pesada y/o ligera, humanas, que son necesarias para conservar la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal donante. En algunas realizaciones, las regiones marco conservadas de los anticuerpos humanizados que se describen en el presente documento no consisten necesariamente en la secuencia de aminoácidos exacta de la región marco conservada de una región variable del anticuerpo humano natural, sino que contiene diversas modificaciones, incluyendo, pero sin limitación, eliminaciones, inserciones o modificaciones de aminoácidos que alteran las propiedades del anticuerpo humanizado, por ejemplo, que mejoran las propiedades de unión de una región del anticuerpo humanizado que es específica de la misma diana que el anticuerpo específico de FcyRIIB murino. En las realizaciones más preferidas, se realiza una cantidad mínima de modificaciones en la región marco conservada con el fin de evitar introducciones a gran escala de restos marco no humanos y para garantizar una inmunogenicidad mínima del anticuerpo humanizado en los seres humanos. El anticuerpo monoclonal donante preferentemente es un anticuerpo monoclonal producido por los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2.
En una realización específica, el dominio de unión engloba los dominios variables de un anticuerpo con injerto de CDR que se une específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad de la que se une el anticuerpo a FcyRIIA, en la que el anticuerpo con injerto de CDR comprende un dominio de región variable de cadena pesada que comprende restos marco del anticuerpo receptor y restos del anticuerpo monoclonal donante, que se unen específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad de la que el anticuerpo se une a FcyRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido por los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2. En otra realización específica, los diacuerpos de la divulgación comprenden dominios variables de un anticuerpo con injerto de CDR que se une específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad de la que el anticuerpo se une a FcyRIIA, en donde el anticuerpo con injerto de CDR comprende un dominio de región variable de cadena ligera que comprende restos marco del anticuerpo receptor y restos del anticuerpo monoclonal donante, que se unen específicamente a FcyRIIB con mayor afinidad de la que el anticuerpo se une a FcyRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido por los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1 F2.
Los dominios variables anti-FcYRIIB humanizados usados en la molécula de diacuerpo pueden tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:25) y/o CDR2 (SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:27) y/o CDR3 (SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29) y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEQ ID NO:30 o SEQ ID NO:31) y/o una CDR2 (SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:34 o SEQ ID NO:35) y/o CDR3 (SEQ ID NO:36 o SEQ ID NO:37).
En una realización específica, el diacuerpo comprende los dominios variables de un anticuerpo 2B6 humanizado, en donde la región VH consiste en los segmentos FR del segmento VH de la línea germinal humana VH1-18 (Matsuda et al. (1998) "The Complete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin Heavy Chain Variable Región Locus", J. Exp. Med. 188:2151-2162) y JH6 (Ravetch et al. (1981) "Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus: Characterization Of Embryonic And Rearranged J And D Genes", Cell 27(3 Pt. 2): 583-91), y una o más regiones CDR de la VH de 2B6, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, la SEQ lD NO: 26 o la SEQ ID NO: 28. En una realización, la VH de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. En otra realización, el dominio de VH de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de Hu2B6VH, SEQ ID NO: 85 y puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 86. En otra realización específica, el diacuerpo comprende además una región VL, que consiste en los segmentos FR del segmentó VL de la línea germinal humana VK-A26 (Lautner-Rieske et al. (1992) "The Human Immunoglobulin Kappa Locus. Characterization Of The Duplicated A Regions", Eur. J. Immunol. 22: 1023-1029) y JK4 (Hieter et al. (1982) "Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Región Genes", J. Biol. Chem. 257: 1516-22), y una o más regiones CDR de VL de 2B6, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 36. En una realización, la VL de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; la s Eq ID NO: 40 o la SEQ ID NO: 41. En una realización específica, la VL de 2B6 tiene la secuencia de aminoácidos de Hu2B6VL, SEQ ID NO: 87 y puede codificarse por la secuencia de nucleótidos proporcionada en la SEQ ID NO: 88.
En otra realización específica, el diacuerpo tiene los dominios variables de un anticuerpo 3H7 humanizado, en dónde la región VH consiste en los segmentos FR de un segmentó VH de la línea germinal humana y las regiones CDR de la VH de 3H7, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 35. En otra realización específica, el anticuerpo 3H7 humanizado comprende además las regiones VL, que consisten en los segmentos FR de un segmento VL de la línea germinal humana y las reglones CDR de VL de 3H7, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
En particular, los dominios de unión se unen de manera inmunoespecífica a los dominios extracelulares de la proteína FcyRIIB humana nativa y comprenden (o, como alternativa, consisten en) las secuencias de CDR de 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2, en cualquiera de las siguientes combinaciones: una CDR1 de VH y una CDR1 de VL; una CDR1 de VH y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH y una CDR3 de VL; una CDR2 de VH y una CDR1 de VL; una CDR2 de VH y una CDR2 de VL; una CDR2 de VH y una CDR3 de VL; una CDR3 de VH y una CDR1 de VH; una CDR3 de VH y una CDR2 de VL; una CDR3 de VH y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH1, una CDR2 de VH y una CDR1 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VL; una CDR2 de VH, una CDR3 de VH y una CDR1 de VL, una CDR2 de VH, una CDR3 de VH y una CDR2 de VL; una CDR2 de VH, una CDR2 de VH y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH, una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR2 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR2 de VH, una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR3 de VH y una CDR1 de v L; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR3 de VH y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR3 de VH y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR2 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR2 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR2 de VH, una CDR3 de VH, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR2 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR2 de VH, una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL; una CDR1 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL; una CDR2 de VH, una CDR3 de VH, una CDR1 de VL, una CDR2 de VL y una CDR3 de VL; o cualquier combinación de las CDR de VH y CDR de VL desveladas en el presente documento.
Los anticuerpos para derivar dominios de unión que se han de incluir en los diacuerpos de la divulgación además pueden caracterizarse mediante cartografía de epítopos, de modo que sea posible seleccionar anticuerpos que tengan la mayor especificidad por FcyRIIB en comparación con FcyRIIA. Los métodos de cartografía de epítopos de los anticuerpos son bien conocidos en la técnica y están englobados dentro de los métodos de la divulgación. En ciertas realizaciones, las proteínas de fusión que comprenden una o más regiones de FcyRIIB pueden usarse para cartografiar el epítopo de un anticuerpo de la divulgación. En una realización específica, la proteína de fusión contiene la secuencia de aminoácidos de una región de un FcyRIIB fusionada a la parte Fc de una IgG2 humana.
Cada proteína de fusión además puede comprender sustituciones y/o reemplazos de aminoácidos de ciertas regiones del receptor por la región correspondiente de un receptor homólogo, por ejemplo, FcyRIIA, como se muestra en la siguiente Tabla 2. pMGX125 y pMGX132 contienen el sitio de unión a IgG del receptor FcyRIIB, el primero con el extremo C-terminal de FcyRIIB y el último con el extremo C-terminal de FcyRIIA y pueden usarse para diferenciar la unión C-terminal. El resto tienen sustituciones de FcyRIIA en el sitio de unión a IgG y bien el extremo N-terminal de FcyIIA o FcyIIB. Estas moléculas pueden ayudar a determinar parte de la molécula receptora en la que se unen los anticuerpos.
Tabla 2. Lista de proteínas de fusión que se pueden usar para investigar el epítopo de los anticuerpos anti-FcYRIIB monoclonales. Los restos 172 a 180 pertenecen al sitio de unión a IgG de FcyRIIA y B. Los aminoácidos específicos de la secuencia de Fc RIIA están en ne rita.
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continuación
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Las proteínas de fusión pueden usarse en cualquier ensayo bioquímico para determinar la unión de un anticuerpo anti-FcYRIIB de la divulgación, por ejemplo, un ensayo ELISA. En otras realizaciones, es posible realizar una confirmación adicional de la especificidad por el epítopo usando péptidos con restos específicos reemplazados por los de la secuencia de FcyRIIA.
Los anticuerpos se pueden caracterizar mediante ensayos para identificar la función de los anticuerpos de la divulgación, en particular, la actividad para modular la señalización de FcyRIIB. Por ejemplo, los ensayos de caracterización pueden medir la fosforilación de los restos de tirosina del motivo ITIM de FcyRIIB, o medir la inhibición de la movilización de calcio generada por el receptor de linfocitos B. Los ensayos de caracterización pueden ser ensayos a base de células o libres de células.
Se ha establecido bien en la técnica que, en los mastocitos, la agregación conjunta de FcyRIIB con el receptor de IgE de alta afinidad, FcsRI, da lugar a la inhibición de la desgranulación inducida por antígeno, la movilización de calcio y la producción de citocinas (Metcalfe DD et al. (1997) "Mast Cells", Physiol. Rev. 77:1033-1079; Long E. O. (1999) "Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors", Annu. Rev. Immunol. 17: 875-904). Los detalles moleculares de esta vía de señalización se han dilucidado recientemente (Ott V. L. (2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition OfFc Epsilon RI Signaling", J. Immunol. 162(9):4430-4439). Una vez agregado junto con FcsRI, FcyRIIB se fosforila rápidamente en tirosina en su motivo ITIM, y luego recluta inositol-5-fosfatasa que contiene la homología de Src-2 (SHIP), una inositol polifosfato 5-fosfatasa que contiene el dominio SH2, que, a su vez, se fosforila y se asocia con Shc y p62dok (p62dok es el prototipo de una familia de moléculas adaptadoras, que incluye dominios de señalización, tales como un dominio de homología de pleckstrina amino-terminal (dominio PH), un dominio PTB, y una región carboxi-terminal que contiene motivos PXXP y numerosos sitios de fosforilación (Carpino et al. (1997) "p62(dok): A Constitutively Tyrosine-Phosphorylated, GAP-Associated Protein In Chronic Myelogenous Leukemia Progenitor Cells", Cell, 88: 197-204; Yamanshi et al. (1997) "Identification Of The Abl-And rasGAP-Associated 62 kDa Protein As A Docking Protein, Dok", Cell, 88:205-211).
Los anticuerpos anti-FcYRIIB que se usan en la divulgación del mismo modo se pueden caracterizar por su capacidad para modular una o más respuestas mediadas por IgE. Preferentemente, se usarán las estirpes celulares que coexpresan el receptor de alta afinidad por IgE y el receptor de baja afinidad por FcyRIIB con el fin de caracterizar los anticuerpos anti-FcYRIIB para modular las respuestas mediadas por IgE. En una realización específica, se usarán células de una estirpe celular de leucemia basófila de rata (RBL-H23; et al. (1981) "IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones", Eur. J. Immunol. 11: 317-323) transfectadas con FcyRIIB humano de longitud completa. RBL-2H3 es una estirpe celular de rata bien caracterizada que se ha usado ampliamente para estudiar los mecanismos de señalización tras la activación celular mediada por IgE. Cuando se expresa en células RBL-2H3 y se coagrega con FcsRI, FcyRIIB inhibe la movilización del calcio, la desgranulación y la producción de citocinas inducidas por FcsRI (Malbec et al. (1998) "Fc Epsilon Receptor I-Associated Lyn-Dependent Phosphorylation Of Fc Gamma Receptor IIB During Negative Regulation Of Mast Cell Activation", J. Immunol 160:1647-1658; Daeron et al. (1995) "Regulation Of High-Affinity IgE Receptor-Mediated Mast Cell Activation By Murine Low-Affinity IgG Receptors", J. Clin. Invest.
95:577; Ott V. L. (2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling", J. Immunol. 162(9):4430-4439).
Los anticuerpos que se usan en la divulgación también pueden caracterizarse por su inhibición de la activación de los mastocitos inducida por FcsRI. Por ejemplo, es posible usar células de una estirpe celular de leucemia basófila de rata (RBL-H23; et al. (1981) "IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones", Eur. J. Immunol. 11:317-323) que se ha transfectado con FcyRIIB son sensibilizadas con IgE y estimuladas con fragmentos F(ab’)2 de anticuerpos de conejo anti-IgG de ratón, para agregar solo FcsRI, o con anticuerpos de conejo anti-IgG de ratón, completos para coagregar FcyRIIB y FcsRI. En este sistema, la modulación indirecta de las moléculas de señalización aguas abajo puede ensayarse tras la adición de anticuerpos de la divulgación a las células sensibilizadas y estimuladas. Por ejemplo, pueden ensayarse la fosforilación de tirosina de FcyRIIB y el reclutamiento y fosforilación de SHIP, la activación de miembros de la familia MAP cinasa, incluyendo, pero sin limitación, Erk1, Erk2, JNK o p38; y la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y RasGAP.
Un ensayo ilustrativo para determinar la inhibición de la activación de Ios mastooitos inducida por FcsRI mediante Ios anticuerpos de la divulgación puede comprender lo siguiente; transfección de células RBL-H23 con FcyRIIB humano; sensibilización de las células RBL-H23 con IgE; la estimulación de células RBL-H23 con el fragmento F(ab’)2 del anticuerpo de conejo anti-lgG de ratón (para agregar solo FcsRI y generar la señalización mediada por FcsRI, como control) o la estimulación de células RBL-H23 con anticuerpo de conejo anti-lgG de ratón, completo (para agregar FcyRIIB y FcsRI, dando lugar a la inhibición de la señalización mediada por FcsRI). Las células que hayan sido estimuladas con anticuerpos de conejo anti-lgG de ratón completos además pueden incubarse previamente con los anticuerpos de la divulgación. La medición de la actividad dependiente de FcsRI de células que se han incubado previamente con los anticuerpos de la divulgación y las células que no se han incubado previamente con los anticuerpos de la divulgación y la comparación de los niveles de actividad dependiente de FcsRI en estas células, indicarían una modulación de la actividad dependiente de FcsRI por los anticuerpos de la divulgación.
El ensayo ilustrativo anteriormente descrito puede, por ejemplo, usarse para identificar anticuerpos que bloqueen la unión del ligando (IgG) al receptor FcyRIIB y antagonice la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcsRI impidiendo la coagregación de FcyRIIB y FcsRI. Asimismo, este ensayo identifica a los anticuerpos que potencian la coagregación de FcyRIIB y FcsRI, y son agonistas de la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcsRI, potenciando la coagregación de FcyRIIB y FcsRI.
En algunas realizaciones, los diacuerpos anti-FcYRllB, que comprenden los dominios de unión al epítopo de los anticuerpos anti-FcYRllB identificados, descritos en el presente documento o conocidos en la técnica, de la divulgación se caracterizan por su capacidad para modular una respuesta mediada por IgE controlando y/o midiendo la desgranulación de los mastocitos o basófilos, preferentemente, en un ensayo a base de células. Preferentemente, los mastocitos o basófilos que se usan en dichos ensayos se han modificado por ingeniería para que contengan FcyRIIB humano usando métodos recombinantes convencionales conocidos por un experto en la materia. En una realización específica, los anticuerpos anti-FcYRllB de la divulgación se caracterizan por su capacidad para modular una respuesta mediada por IgE en un ensayo de liberación de p-hexosaminidasa (enzima contenida en los gránulos) a base de células. La liberación de p-hexosaminidasa a partir de los mastocitos y basófilos es un hecho principal en un estado alérgico e inflamatorio (Aketani et al. (2001) "Correlation Between Cytosolic Calcium Concentration And Degranulation In RBL-2H3 Cells In The Presence Of Various Concentrations Of Antigen- Specific lgEs", Immunol. Lett. 75; 185-189; Aketani et al. (2000) "A Screening Method For Antigen-Specific IgE Using Mast Cells Based On Intracellular Calcium Signaling", Anal. Chem. 72; 2653-2658). Se puede ensayar liberación de otros mediadores inflamatorios, incluyendo, pero sin limitación, la serotonina y la histamina para medir una respuesta mediada por IgE de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. Aunque no se pretende quedar limitado a ningún mecanismo de acción en particular, la liberación de los gránulos, tales como aquellos que contienen phexosaminidasa a partir de los mastocitos y basófilos es un proceso que depende de la concentración de calcio intracelular, que se inicia mediante la reticulación de los FcyRI con antígenos multivalentes.
La capacidad de estudiar los mastocitos humanos se ha visto limitada por la ausencia de cultivos de mastocitos humanos apropiados a largo plazo. Recientemente, dos nuevas estirpes celulares de mastocitos humanos dependientes del factor de células madre, denominadas LAD1 y LAD2, fueron establecidas a partir de aspirados de médula ósea de un paciente con leucemia/sarcoma de mastocitos (Kirshenbaum et al. (2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation OfFcRl o FcyRI", Leukemia research, 27:677-82). Se ha descrito que ambas estirpes celulares expresan FcsRI y varios marcadores de mastocitos humanos. Las células LAD 1 y 2 pueden usarse para evaluar el efecto de los anticuerpos de la divulgación sobre las respuestas mediadas por IgE. En una realización específica, los ensayos de liberación de p-hexosaminidasa basados en células, tales como los descritos anteriormente, se pueden usar en células LAD para determinar alguna modulación de la respuesta mediadas por IgE usando los anticuerpos anti-FcYRllB de la divulgación. En un ensayo ilustrativo, se ceban mastocitos humanos, por ejemplo, LAD 1, con IgE humana quimérica anti-nitrofenol (NP) y se les expone a BSA-NP, el antígeno polivalente y se controla la desgranulación celular midiendo la p-hexosaminidasa liberada en el sobrenadante (Kirshenbaum et al. (2003) "Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation OfFcRl o FcyRI", Leukemia research, 27:677-82).
En algunas realizaciones, si los mastocitos humanos tienen una baja expresión de FcyRIIB endógeno, determinada usando los métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, la tinción para FACS, puede ser difícil controlar y/o detectar las diferencias en la activación de la vía inhibidora mediada por los diacuerpos anti-FcYRllB de la divulgación. Se puede regular positivamente la expresión de FcyRIIB usando citocinas y condiciones de crecimiento particulares. Se ha descrito que es posible regular positivamente a un alto nivel FcyRIIB en estirpes celulares de monocitos humanos, por ejemplo, THP1 y U937, (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RllB In Human Monocytic Cells", J. Biol. Chem., 277(7); 5082-5089) y en monocitos humanos primarios (Pricop et al. (2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines", J. of Immunol., 166; 531-537) mediante IL4. Se ha descrito que la diferenciación de células U937 con dibutiril AMP cíclico aumenta la expresión de FcyRII (Cameron et al. (2002) "Differentiation Of The Human Monocyte Cell Line, U937, With Dibutyryl CyclicAMP Induces The Expression Of The Inhibitory Fc Receptor, FcgammaRllB", Immunology Letters 83, 171-179). De este modo, la expresión endógena de FcyRIIB en mastocitos humanos para usarlos en Ios métodos puede regularse positivamente usando citocinas, por ejemplo, IL-4, IL-13, para potenciar la sensibilidad de detección.
Los diacuerpos anti-FcYRIIB también pueden ensayarse para determinar la inhibición de la señalización mediada por el receptor de linfocitos B (BCR). La señalización mediada por BCR puede incluir al menos una o más respuestas biológicas aguas abajo, tales como la activación y proliferación de los linfocitos B, la producción de anticuerpos, etc. La coagregación de FcyRIIB y BCR produce la inhibición de la progresión del ciclo celular y la supervivencia celular. Además, la coagregación de FcyRIIB y BCR conduce a la inhibición de la señalización mediada por BCR.
Específicamente, la señalización mediada por BCR comprende al menos uno o más de lo siguientes: modulación de las moléculas de señalización aguas abajo (por ejemplo, el estado de fosforilación de FcyRIIB, el reclutamiento de SHIP, la localización de Btk y/o PLCy, la actividad MAP cinasa, el reclutamiento de Akt (señal anti-apoptótica), la movilización del calcio, la progresión del ciclo celular y la proliferación celular.
Aunque numerosas funciones efectoras de la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR están mediadas a través de SHIP, recientemente, se ha demostrado que los linfocitos B activados con lipopolisacárido (LPS) derivados de ratones deficientes en SHIP muestran una inhibición significativa de la movilización del calcio mediada por FcyRIIB, producción de lns(1,4,5)P3 y fosforilación de Erk y Akt (Brauweiler et al. (2001) "Partially Distinct Molecular Mechanisms Mediate Inhibitory FcgammaRllB Signaling In Resting And Activated B Cells", Journal of Immunology, 167(1): 204-211). Por consiguiente, para caracterizar los anticuerpos de la divulgación, es posible usar linfocitos B ex vivo procedentes de ratones deficientes en SHIP. Un ensayo ilustrativo para determinar la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR por los anticuerpos de la divulgación puede comprender lo siguiente: el aislamiento de linfocitos B esplénicos de ratones deficientes en SHIP, la activación de dichos linfocitos con lipopolisacárido y la estimulación de dichos linfocitos con F(ab’)2 anti-lgM para agregar BCR o con anticuerpo anti-lgM para coagregar BCR con FcyRIIB. Los linfocitos que se hayan estimulado con anticuerpo antilgM intacto para coagregar BCR con FcyRIIB se pueden incubar previamente además con los anticuerpos de la divulgación. La actividad de células dependiente de FcyRIIB puede medirse mediante técnicas convencionales conocidas. La comparación del nivel de la actividad dependiente de FcyRIIB en células que han sido previamente incubadas con los anticuerpos, y células que no han sido previamente incubadas, y la comparación de los niveles indicaría una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIB por los anticuerpos.
La medición de la actividad dependiente de FcyRIIB puede incluir, por ejemplo, la medición de la movilización del calcio intracelular por citometría de flujo, la medición de la fosforilación de Akt y/o Erk, la medición de la acumulación de Pl(3,4,5)P3 mediada por BCR o la medición de la proliferación de linfocitos B mediada por FcyRIIB.
Es posible usar ensayos, por ejemplo, para identificar diacuerpos o anticuerpos anti-FcYRIIB para usarlos en la divulgación que modulen la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR bloqueando el sitio de unión al ligando (lgG) frente al receptor de FcyRIIB y antagonizando la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR impidiendo la coagregación de FcyRIIB y BCR. También se pueden usar los ensayos para identificar anticuerpos que potencien la coagregación de FcyRIIB y BCR y agonicen la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de BCR.
Los anticuerpos anti-FcYRIIB también se pueden ensayar para determinar la señalización mediada por FcyRII en monocitos/macrófagos humanos. La coagregación de FcyRIIB con un receptor portador del motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) actúa para regular a la baja la fagocitosis mediada por FcyR usando SHIP como su efector (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RllB In Human Monocytic Cells", J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089). La coagregación de FcyRIIA con FcyRIIB produce la rápida fosforilación del resto de tirosina en el motivo ITIM de FcyRIIB, dando lugar a una potenciación de la fosforilación de SHIP, la asociación de SHIP con Shc, y la fosforilación de proteínas que tienen un peso molecular de 120 y 60-65 kDa. Además, la coagregación de FcyRIIA con FcyRIIB produce la regulación por disminución de la fosforilación de Akt, que es una serina-treonina cinasa implicada en la regulación celular y sirve para suprimir la apoptosis.
Los diacuerpos anti-FcYRIIB también pueden ensayarse para determinar la inhibición de la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos/macrófagos humanos. Por ejemplo, las células de una estirpe celular monocítica humana, THP-1 puede estimularse con fragmentos Fab del anticuerpo monoclonal de ratón IV. 3 contra FcyRII y anticuerpo de cabra anti-ratón (para agregar FcyRI lA solo) o con anticuerpo monoclonal lV.3 de ratón completo y anticuerpo de cabra anti-ratón (para coagregar FcyRIIA y FcyRIIB). En este sistema, la modulación de las moléculas de señalización aguas abajo, tal como la fosforilación de tirosinas de FcyRIIB, la fosforilación de SHIP, la asociación de SHIP con Shc, la fosforilación de Akt y la fosforilación de proteínas que tienen un peso molecular de 120 y 60-65 kDa se puede ensayar tras la adición de moléculas de la invención a las células estimuladas. Además, la eficiencia fagocítica dependiente de FcyRIIB de la estirpe celular monocítica se puede medir directamente en presencia y ausencia de los anticuerpos de la divulgación.
Otro ensayo ilustrativo para determinar la inhibición de la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos/macrófagos humanos por los anticuerpos de la divulgación puede comprender lo siguiente: estimular las células THP-1 con el Fab del anticuerpo anti-FoYRii de ratón IV.3 y el anticuerpo de cabra anti-ratón (para agregar solo FcyRIIA y generar la señalización mediada por FcyRIIA); o con el anticuerpo anti-FcYRII de ratón y el anticuerpo de cabra anti-ratón (para coagregar FcyRIIA y FcyRIIB e inhibir la señalización mediada por FcyRIIA. Las células que se han estimulado con el anticuerpo anti-FcYRII de ratón y el anticuerpo de cabra anti-ratón además se pueden incubar previamente con las moléculas de la divulgación. La medición de la actividad dependiente de FcyRIIA de células estimuladas que se han incubado previamente con moléculas de la divulgación y células que no se hayan incubado previamente con anticuerpos de la divulgación y la comparación de los niveles de actividad dependiente de FcyRIIA en estas células indicaría una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIA por los anticuerpos de la divulgación.
El ensayo ilustrativo que se describe se puede usar, por ejemplo, para identificar dominios de unión que bloqueen la unión al ligando del receptor FcyRIIB y antagonicen la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA impidiendo la coagregación de FcyRIIB y FcyRIIA. Asimismo, este ensayo identifica los dominios de unión que potencian la coagregación de FcyRIIB y FcyRIIA y sean agonistas de la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA.
Los dominios de unión a FcyRIIB de interés se pueden ensayar al tiempo que comprenden los anticuerpos midiendo la capacidad de las células THP-1 para fagocitar glóbulos rojos de oveja (SRBC) opsonizados con IgG marcada con fluoresceína mediante los métodos anteriormente descritos (Tridandapani et al. (2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells", J. Biol. Chem. 275: 20480-7). Por ejemplo, un ensayo ilustrativo para medir la fagocitosis comprende: tratar las células THP-1 con los anticuerpos de la divulgación o con un anticuerpo de control que no se una a FcyRII, comparar los niveles de actividad de dichas células, en donde la diferencia en las actividades de las células (por ejemplo, la actividad de formación de rosetas (el número de células THP-1 que se unen a SRBC recubierto con IgG), actividad de adherencia (el número total de SRBC unido a células THP-1) y la tasa fagocítica) indicarían una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIA por los anticuerpos de la divulgación. Este ensayo se puede usar para identificar, por ejemplo, anticuerpos que bloqueen la unión al ligando del receptor FcyRIIB y antagonicen la inhibición mediada por FcyRIIB de la fagocitosis. Este ensayo también puede identificar anticuerpos que potencian la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA.
En una realización preferida, los dominios de unión modulan la actividad dependiente de FcyRIIB en monocitos/macrófagos humanos de al menos una o más de las siguientes formas: modulación de moléculas de señalización aguas abajo (por ejemplo, la modulación del estado de fosforilación de FcyRIIB, modulación de la fosforilación de SHIP, modulación de la asociación de SHIP y Shc, modulación de la fosforilación de Akt, modulación de la fosforilación de proteínas adicionales de aproximadamente 120 y 60-65 kDa) y modulación de la fagocitosis.
5.1.2 DOMINIOS DE UNIÓN A CD16A
El siguiente apartado analiza las proteínas de unión a CD16A que pueden usarse como fuentes para las regiones variables de cadena ligera y pesada para la producción de diacuerpos covalentes. En la presente divulgación, las proteínas de unión a CD16A incluyen moléculas que contienen los dominios VL y VH de los anticuerpos anti-CD16A, cuyos dominios VH y VL se usan para la producción de los diacuerpos de la presente divulgación.
Se pueden usar diversas proteínas de unión a CD16A en relación con la presente divulgación. Las proteínas de unión a CD16A adecuadas incluyen anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, así como fragmentos de anticuerpos de unión a CD16A (por ejemplo, scFv o anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, minicuerpos) y otras proteínas de tipo anticuerpo que se unen a CD16A mediante una interacción con un dominio de región variable de cadena ligera, un dominio de región variable de cadena pesada, o ambos.
En algunas realizaciones, la unión a CD16A comprende un dominio VL y/o VH que tiene una o más CDR con secuencias procedentes de un anticuerpo anti-CD16A no humano, tal como un anticuerpo anti-CD16A de ratón, o una o más regiones marco conservadas derivadas de secuencias marco conservadas de una o más inmunoglobulinas humanas. Se conoce una serie de anticuerpos anti-CD16A no humanos de los que pueden obtenerse las CDR y otras secuencias (véase, por ejemplo, Tamm et al. (1996) "The Binding Epitopes Of Human CD16 (Fc gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding", J. Imm. 157:1576-81; Fleit et al. (1989) pág.159; “LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS”, Reinherz et al., eds. Nueva York: Springer-Verlag; (1986); LEUCOCYTE TYPING III: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, McMichael A J, ed., Oxford: Oxford University Press, 1986); “LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS”, Kapp et al, eds. Oxford Univ. Press, Oxford; “LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS”, Schlossman et al, eds. Oxford Univ. Press, Oxford; “LEUKOCYTE TYPING VI: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS”, Kishimoto, ed. Taylor & Francis. Además, como se muestra en los ejemplos, se pueden obtener nuevas proteínas de unión a CD16A que reconozcan CD16A humana expresada en células usando métodos bien conocidos para la producción y selección de anticuerpos monoclonales o proteínas de unión relacionadas (por ejemplo, tecnología de hibridoma, presentación en fagos y similares). Véase, por ejemplo, O'Connell et al. (2002) "Phage Versus Phagemid Libraries For Generation Of Human Monoclonal Antibodies", J. Mol. Biol. 321:49-56; Hoogenboom et al. (2000) "Natural And Designer Binding Sites Made By Phage Display Technology", Imm. Today 21:371078; Krebs et al. (2001) "High-Throughput Generation And Engineering Of Reeombinant Human Antibodies", J. Imm, Methods 254:67-84; y otras referencias citadas en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales de una especie no humana pueden ser quimerizados o humanizados usando técnicas de humanización de anticuerpos conocidas en la técnica.
Como alternativa, es posible producir anticuerpos completamente humanos contra CD16A usando animales transgénicos que tengan elementos de un sistema inmunitario humano (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.25.569.825 y 5.545.806), usando células de sangre periférica humana (Casali et al. (1986) "Human Monoclonals From Antigen-Specific Selection Of B Lymphocytes And Transformation By EBV", Science 234:476-479), mediante el rastreo de una biblioteca de ADN a partir de linfocitos B humanos de acuerdo con el protocolo general que se indica en Huse et al. (1989) "Generation Of A Large Combinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda", Science 246:1275-1281 y mediante otros métodos.
En una realización preferida, el donante de unión es del anticuerpo 3G8 o una versión humanizada del mismo, por ejemplo, tales como aquellos desvelados en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.2 2004/0010124. Se contempla que, para determinados fines, puede ser ventajoso usar proteínas de unión a CD16A que se unan al receptor de CD16A en el mismo epítopo al que se une 3G8, o al menos suficientemente cerca de este epítopo para bloquear la unión por 3G8. Los métodos para lal cartografía de epítopos y los experimentos de unión competitiva para identificar proteínas de unión con las propiedades de unión deseadas son bien conocidos por los expertos en la materia de la inmunología experimental. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, citado anteriormente; Stahli et al. (1983) "Distinction Of Epitopes By Monoclonal Antibodies", Methods in Enzymology 92:242-253; Kirkland et al. (1986) "Analysis Of The Fine Specificity And Cross-Reactivity Of Monoclonal Anti-Lipid A Antibodies", J. Immunol. 137:3614-3619; Morel et al. (1988) "Monoclonal Antibodies To Bovine Serum Albumin: Affinity And Specificity Determinations", Molec. Immunol. 25:7-15; Cheung et al. (1990) "Epitope-Specific Antibody Response To The Surface Antigen Of Duck Hepatitis B Virus In Infected Ducks", Virology 176:546-552; y Moldenhauer et al. (1990) "Identity Of HML-1 Antigen On Intestinal Intraepithelial T Cells And Of B-ly7 Antigen On Hairy Cell Leukaemia", Scand. J. Immunol. 32:77-82. Por ejemplo, se puede determinar si dos anticuerpos se unen al mismo sitio usando uno de los anticuerpos para capturar el antígeno en una placa para ELISA, y luego midiendo la capacidad del segundo anticuerpo para unirse al antígeno capturado. También se puede obtener una comparación de epítopos marcando un primer anticuerpo, directa o indirectamente, con una enzima, radionúclido o fluoróforo, y midiendo la capacidad de un segundo anticuerpo no marcado para inhibir la unión del primer anticuerpo al antígeno en las células, en solución o en una fase sólida.
También es posible medir la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión del receptor de CD16A a complejos inmunitarios formados en placas para ELISA. Dichos complejos inmunitarios se forman primero recubriendo la placa con un antígeno tal como fluoresceína, luego aplicando a la placa un anticuerpo antifluoresceína específico. Este complejo inmunitario sirve luego como ligando para los receptores de Fc solubles, tales como sFcRIIIa. Como alternativa, es posible formar y marcar un complejo inmunitario soluble, directa o indirectamente, con una enzima, radionúclido o fluoróforo. Posteriormente, puede medirse la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión de estos complejos inmunitarios marcados a receptores de Fc, en solución o en una fase sólida.
Las proteínas de unión a CD16A pueden contener o no una región Fc de inmunoglobulina humana. Las regiones Fc no están presentes, por ejemplo, en las proteínas de unión a scFv. Las regiones Fc están presentes, por ejemplo, en anticuerpos IgG monoclonales tetraméricos humanos o humanizados. Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones de la presente divulgación, la proteína de unión a CD16A incluye una región Fc que tiene una función efectora modificada, por ejemplo, afinidad reducida por un ligando efector tal como un receptor de Fc o componente C1 del complemento en comparación con la región Fc no modificada (por ejemplo, el fragmento Fc de las proteínas IgG 1 naturales). En una realización, la región Fc no está glicosilada en el aminoácido de la región Fc correspondiente a la posición 297. Dichos anticuerpos carecen de la función efectora de Fc.
Por lo tanto, la proteína de unión a CD16A puede no presentar unión mediada por Fc a un ligando efector, tal como un receptor de Fc o el componente C1 del complemento debido a la ausencia del dominio Fc en la proteína de unión mientras, en otros casos, la falta de unión o la función efectora se debe a una alteración de la región constante del anticuerpo.
5.1.2.1 Proteínas de unión a CD16A que comprenden secuencias CDR similares a las secuencias CDR de un mAb 3G8.
Las proteínas de unión a CD16A que pueden usarse en la práctica de la divulgación incluyen proteínas que comprenden una secuencia CDR derivada de (es decir, que tiene una secuencia igual o similar a) las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8. Los ADNc complementarios que codifican las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo monoclonal 3G8 de ratón, incluyendo las secuencias que codifican CDR, se clonaron y secuenciaron como se describe. Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de 3G8 se proporcionan más adelante. Usando la región variable y las secuencias CDR de ratón, se produjo y analizó las propiedades de un gran número de anticuerpos monoclonales humanizados, que comprenden regiones determinantes de la complementariedad derivadas de las CDR de 3G8. Para identificar los anticuerpos humanizados que se unen a CD16A con alta afinidad y que tienen otras propiedades deseables, se produjeron cadenas pesadas del anticuerpo que comprendía una región VH con las CDR derivadas de 3G8 y se combinaron (por coexpresión) con las cadenas ligeras del anticuerpo que comprendían una región VL con las CDR derivadas de 3G8 para producir un anticuerpo tetramérico para el análisis. Las propiedades de los anticuerpos tetraméricos resultantes se determinaron como se describe más adelante. Como se describe a continuación, las proteínas de unión a CD16A que comprenden CDR de 3G8, tales como las proteínas de anticuerpos humanizados que se describen en el presente documento, pueden usarse de acuerdo con la divulgación.
5.1.2.1.1 Región VH
La proteína de unión a CD16A puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que al menos una CDR (y normalmente tres CDR) tienen la secuencia de una CDR (y más comúnmente las tres CDR) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 y para el que las partes restantes de la proteína de unión sean esencialmente humanas (derivadas de y esencialmente similares a la región variable de cadena pesada de un anticuerpo o anticuerpos humanos).
También se describe un anticuerpo 3G8 humanizado o un fragmento de anticuerpo que contiene CDR derivadas del anticuerpo 3G8 en un armazón sustancialmente humano, pero en el que al menos una de las CDR del dominio variable de cadena pesada difiere en la secuencia con respecto a la CDR de cadena pesada del anticuerpo de ratón 3G8 correspondiente. Por ejemplo, en una realización, la/s CDR difiere/n de la secuencia de las CDR de 3G8 al menos en que tienen una o más sustituciones de CDR que en la técnica se ha demostrado que afectan a la unión de 3G8 a CD16A, como se conoce en la técnica o como se describe en las Tablas 3 y 4A-H. Las proteínas de unión a CD16 adecuadas pueden comprender 0, 1, 2, 3 o 4, o más de estas sustituciones (y con frecuencia tienen de 1 a 4 de estas sustituciones) y opcionalmente también pueden tener sustituciones adicionales.
T l . i i n l mini VH
Figure imgf000037_0002
h h *
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continuación
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continuación
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TABLA 4B:FR1
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continuación
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continuación
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TABLA 4E: CDR2
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continuación
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TABLA 4F: FR3
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continuación
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continuación
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TABLA 4G:CDR3
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t a b l a 4H:FR4
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En una realización, la proteína de unión a CD16A puede contener una secuencia del dominio variable de cadena pesada que es igual que el, o similar al, dominio VH de la construcción Hu3G8VH-1, cuya secuencia se proporciona en la SEQ ID NO: 68. Por ejemplo, la descripción proporciona una proteína de unión a CD16A que comprende un dominio VH con una secuencia que (1) difiere del dominio de VH de Hu3G8VH-1 (SEQ ID NO: 68) en cero, una o más de una de las sustituciones de CDR establecidas en la tabla 1; (2) difiere del dominio VH de la construcción Hu3G8VH-1 en cero, una o más de una de las sustituciones de región marco conservada como se establece en la tabla 1; y (3) es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, a menudo idéntica en al menos aproximadamente el 90 %, y a veces idéntica en al menos aproximadamente el 95 %, o incluso idéntica en al menos aproximadamente el 98 % a la secuencia VH de Hu3G8VH-1 en las posiciones restantes.
Los dominios VH ilustrativos de las proteínas de unión a CD16 tienen la secuencia de 3G8VH, Hu3G8VH-5 y Hu3G8VH-22 (SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, respectivamente). Las secuencias de nucleótidos ilustrativas que codifican las secuencias de 3G8VH y Hu3G8v H-5 (SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 69, respectivamente) se proporcionan mediante la SEQ ID NO: 80 y la SEQ ID NO: 81, respectivamente.
El dominio VH puede tener una secuencia que difiere de la de la construcción Hu3G8VH-1 (SEQ ID NO: 68) en al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro 4, al menos cinco o al menos seis de las sustituciones que se muestran en la tabla 3. Se cree que estas sustituciones dan lugar a una mayor afinidad por CD16A y/o reducen la inmunogenicidad de una proteína de unión a CD16A cuando se administra a seres humanos. En determinadas realizaciones, el grado de identidad de secuencia con el dominio VH de Hu3G8VH-1 en el resto de las posiciones es de al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 98 %.
A modo ilustrativo y no limitante, en la tabla 4 se muestran las secuencias de una serie de dominios VH de proteína de unión a CD16A. Las cadenas pesadas que comprenden estas secuencias fusionadas a una región constante de Cy1 humana se coexpresaron con la cadena ligera de la construcción hu3G8VL-1 (descrita más adelante) para formar los anticuerpos tetraméricos, y la unión de los anticuerpos a CD16A se midió para evaluar el efecto de las sustituciones de aminoácidos en comparación con el dominio VH de hu3G8VH-1. Las construcciones en las que el dominio VH tiene una secuencia de hu3G8VH-1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 42, 43, 44 y 45 mostraron una alta afinidad de unión, mostrando unión intermedia los dominios VH de hu3G8VH-6 y -40. Se considera que tienen propiedades de unión particularmente favorables las proteínas de unión a CD16A que comprenden los dominios VH de las construcciones hu3G8VH-5 y hu3G8VH-22 (SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, respectivamente).
5.1.2.2 Región VL
Se realizaron estudios similares para identificar las secuencias del dominio variable de cadena ligera con propiedades de unión favorables. También se describe una proteína de unión a CD16A que contiene un dominio variable de cadena ligera en el que al menos una CDR (y, normalmente, las tres CDR) tienen la secuencia de una CDR (y más comúnmente las tres CDR) de cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 y para el que las partes restantes de la proteína de unión son esencialmente humanas (derivadas de y esencialmente similares a, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo o anticuerpos humanos).
También se describe un fragmento de un anticuerpo 3G8 humanizado que contiene las CDR derivadas del anticuerpo 3G8 en una región marco conservada esencialmente humana, pero en el que al menos una de las CDR del dominio variable de cadena ligera difiere en secuencia con respecto a la CDR de cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8. En una realización, la/s CDR difiere/n de la secuencia de 3G8 teniendo al menos una o más sustituciones de aminoácidos en una CDR, tales como, una o más sustituciones mostradas en la tabla 2 (por ejemplo, arginina en la posición 24 de la CDR1; serina en la posición 25 de la CDR1; tirosina en la posición 32 de la CDR1; leucina en la posición 33 de la CDR1; ácido aspártico, triptófano o serina en la posición 50 de la CDR2; serina en la posición 53 de la CDR2; alanina o glutamina en la posición 55 de la CDR2; treonina en la posición 56 de la CDR2; serina en la posición 93 de la CDR3; y/o treonina en la posición 94 de la CDR3). En diversas realizaciones, el dominio variable puede tener 0, 1, 2, 3, 4, 5 o más de estas sustituciones (y a menudo tienen de 1 a 4 de estas sustituciones) y, opcionalmente, pueden tener también otras sustituciones.
En una realización, la proteína de unión a CD16A adecuada puede contener una secuencia del dominio variable de cadena ligera que es igual que o similar al, la construcción del dominio VL de Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71), cuya secuencia se proporciona en la tabla 6. Por ejemplo, la invención proporciona una proteína de unión a CD16A que comprende un dominio VL con una secuencia que (1) difiere del dominio VL de la construcción Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71) en cero, una o más de las sustituciones de CDR que se exponen en la tabla 5; (2) difiere del dominio VL de la construcción Hu3G8VL-1 en cero, una o más de las sustituciones de región marco conservada que se exponen en la tabla 5; y (3) es al menos aproximadamente un 80 % idéntica, frecuentemente al menos aproximadamente un 90 % y en ocasiones hasta aproximadamente un 95 % idéntica o incluso hasta al menos aproximadamente un 98 % idéntica a la secuencia VH de Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71) en el resto de las posiciones.
l
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Tabla 6. Secuencias de Vl derivadas de Vl de 3G8*
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continuación
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continuación
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TABLA 6B:FR1
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t a b la 6C: CDR1
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continuación
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continuación
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TABLA 6E: CDR2
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t a b la 6F: FR3
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continuación
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TABLA6G:CDR3
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TABLA6H:FR4
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continuación
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Los dominios VL ilustrativos de las proteínas de unión a CD16 tienen la secuencia de 3G8VL, Hu3G8VL-1 o Hu3G8VL-43, (SEQ ID NO: 82, SEQ lD NO: 71 y SEQ ID NO: 72, respectivamente) como se muestra en las tablas 5 y 6. Las secuencias de nucleótidos ejemplares que codifican 3G8VL (SEQ ID NO: 82) y Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71) se proporcionan en la SEQ ID NO: 83 y la SEQ ID NO: 84, respectivamente.
El dominio VL puede tener una secuencia que difiere de la construcción Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71) en cero, uno, al menos dos, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 o al menos 9 de las sustituciones que se muestran en la Tabla 2. Se cree que estas sustituciones dan lugar a una mayor afinidad por CD16A y/o reducen la inmunogenicidad de una proteína de unión a CD16A cuando se administra a seres humanos. En determinadas realizaciones, el grado de identidad de las secuencias en las posiciones restantes es de al menos aproximadamente el 80 %, de al menos aproximadamente el 90 %, de al menos aproximadamente el 95 % o de al menos aproximadamente el 98 %.
A modo ilustrativo y no limitante, las secuencias de varios dominios VL de las proteínas de unión a CD16A se muestran en la tabla 6. Las cadenas ligeras que comprenden estas secuencias fusionadas a un dominio constante Ck humano se coexpresaron con una cadena pesada de Hu3G8VH (anteriormente descrita) para formar anticuerpos tetraméricos, y la unión de los anticuerpos a CD16A se midió para evaluar el efecto de las sustituciones de aminoácidos en comparación con el dominio VL de la construcción Hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71). Las construcciones en las que el dominio VL tiene una secuencia de hu3G8VL-1,2, 3, 4, 5, 10, 16, 18, 19, 21,22, 24, 27, 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37 y 42 mostraron una alta afinidad de unión y hu3G8VL-15, 17, 20, 23, 25, 26, 29, 30, 31,38, 39, 40 y 41 mostraron una unión intermedia. Las proteínas de unión a CD16A que comprenden los dominios VL de las construcciones hu3G8VL-1, hu3G8VL-22 y hu3G8VL-43 se considera que tienen propiedades de unión particularmente favorables (SEQ ID NO:71, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 72, respectivamente).
5.1.2.2.1 Combinaciones de los dominios VL y/o VH
Como se sabe en la técnica y se describe en otra parte del presente documento, las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina pueden expresarse mediante métodos recombinantes en condiciones en las que estas se asocian para producir un diacuerpo, o también pueden combinarse in vitro. De este modo, se apreciará que se puede combinar un dominio VL derivado de 3G8 descrito en el presente documento con un dominio VH derivado de 3G8 descrito en el presente documento para producir un diacuerpo de unión a CD16A, y se contemplan todas estas combinaciones.
A modo ilustrativo, y no como limitación, los ejemplos de los diacuerpos de CD16A útiles son aquellos que comprenden al menos un dominio VH y al menos un dominio VL, en los que el dominio VH es de hu3G8VH-1, hu3G8VH-22 o hu3G8VH-5 (SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 69, respectivamente) y el dominio VL es de hu3G8VL-1, hu3G8VL-22 o hu3G8VL-43 (SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 41, respectivamente). En particular, los anticuerpos humanizados que comprenden hu3G8VH-22 (SEQ ID NO: 22) y, hu3G8VL-1, hu3G8VL-22 o hu3G8VL-43 (SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 72, respectivamente) o hu3G8VH-5 (SEQ ID NO: 69) y hu3G8VL-1 (SEQ ID NO: 71) tienen propiedades favorables.
Los expertos en la materia apreciarán que las secuencias de los dominios VL y VH descritos en el presente documento además pueden modificarse usando los métodos conocidos en la técnica, tales como maduración por afinidad (Véase Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site", J. Mol. Biol.
263:551-567; Daugherty et al. (1998) "Antibody Affinity Maturation Using Bacterial Surface Display", Protein Eng.
11:825-832; Boder et al. (1997) "Yeast Surface Display For Screening Combinatorial Polypeptide Libraries", Nat. Biotechnol. 15:553-557; Boder et al. (2000) "Directed Evolution Of Antibody Fragments With Monovalent Femtomolar Antigen-Binding Affinity", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701-10705; Hudson et al. (2003) "Engineered Antibodies", Nature Medicine 9:129-39). Por ejemplo, las proteínas de unión a CD16A pueden modificarse usando técnicas de maduración por afinidad con el fin de identificar proteínas con mayor afinidad por CD16A y/o menor afinidad por CD16B.
Una proteína de unión a CD16 ilustrativa es el anticuerpo 3G8 de ratón. La secuencia de aminoácidos que comprende los dominios VH y VL del anticuerpo 3G8 humanizado se describe en las FIG. 2, 9, 14 y se expone en las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72.
5.2 d ia c u e r p o s q u e c o m p r e n d e n r e g io n e s Fc o par tes de las m ism as
Se describen moléculas de dlacuerpo que comprenden dominios Fc o porciones de Ios mismos (por ejemplo, un dominio CH2 o CH3). En determinadas realizaciones, el dominio Fc, o la/s parte/s de los mismos, comprenden uno o más dominios constantes de la región Fc de lgG2, lgG3 o lgG4 (por ejemplo, CH2 o CH3). También se describen moléculas que comprenden un dominio Fc o una porción del mismo, en donde el dominio Fc o parte del mismo comprende al menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, sustitución) con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre equivalente o parte del mismo. Los dominios Fc variantes son bien conocidos en la técnica y se usan principalmente para modificar el fenotipo del anticuerpo que comprende dicho dominio Fc variante evaluado mediante ensayos de la actividad de unión o la función efectora bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA, análisis SPR o ADCC. Dichos dominios Fc variantes o partes de los mismos, pueden conferir o modificar la función efectora mostrada por una molécula de diacuerpo descrita en el presente documento que comprende un dominio Fc (o una porción del mismo) como se evalúa funcionalmente, por ejemplo, en un ensayo dependiente de los linfocitos NK o dependiente de macrófagos. Las variantes del dominio Fc identificadas como modificadoras de la función efectora se desvelan en la solicitud internacional W004/063351, las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514 y las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.22006-0134709 A1, presentada el 10 de noviembre de 2005 y 2006-0177439 A1, presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitudes concurrentes de los inventores.
También se describe el uso de cualquier variante de Fc conocida en la técnica, tales como las desveladas en Duncan et al. (1988) "Localization 0f The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor 0n IgG", Nature 332:563-564; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma Rl And Fc Gamma Rll Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG", J. Immunol. 147:2657-2662; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma Rll", Mol. Immunol. 29:53-59; Alegre et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo", Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H", Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92:11980-11984; Jefferis et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation", Immunol. Lett. 44:111-117; Lund et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors", FASEB J. 9:115-119; Jefferis et al. (1996) "Modulation Of Fc (Gamma) R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions", Immunol. Lett. 54:101-104; Lund et al. (1996) "Multiple Interactions Of Igg With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains", J. Immunol. 157:4963-4969; Armour et al. (1999) "Recombinant Human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities", Eur. J. Immunol.
29:2613-2624; Idusogie et al. (2000) "Mapping Of The C1Q Binding Site On Rituxan", A Chimeric Antibody With A Human IgG1 Fc", J. Immunol. 164:4178-4184; Reddy et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4", J. Immunol. 164:1925-1933; Xu et al. (2000) "In Vitro Characterization Of Five Humanized 0KT3 Effector Function Variant Antibodies", Cell. Immunol. 200:16-26; Idusogie et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement", J. Immunol.
166:2571-2575; Shields et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc gamma Rl", Fc gamma Rll, Fc gamma Rlll, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R", J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Jefferis et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models", Immunol. Lett. 82:57-65; Presta et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function", Biochem. Soc. Trans. 30:487-490); documentos US 5.624.821; US 5.885.573; US 6.194.551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572.
En determinadas realizaciones, dichas una o más modificaciones a los aminoácidos de la región Fc disminuyen la afinidad y la avidez de la región Fc y, por lo tanto, la molécula de diacuerpo descrita, por uno o más receptores FcyR. También se describen diacuerpos que comprenden una variante de la región Fc o parte de la misma, en donde dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácidos con respecto a una región Fc de tipo silvestre, uniéndose dicha región Fc variante solo a un FcyR, en donde dicho FcyR es FcyRIIIA. Como alternativa, los diacuerpos pueden comprender una región Fc variante o una parte de la misma, en donde dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácidos con respecto a una región Fc de tipo silvestre, uniéndose dicha región Fc variante solo a un FcyR, en la que dicho FcyR es FcyRIIA. Como alternativa, los diacuerpos pueden comprender una región Fc variante o una porción de la misma, en donde dicha región Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácidos con respecto a una región Fc de tipo silvestre, uniéndose dicha región Fc variante solo a un FcyR, en donde dicho FcyR es FcyRIIB. También se describen moléculas que comprenden un dominio Fc variante, en donde la variante confiere o media en la actividad aumentada de ADCC y/o una unión aumentada a FcyRIIA (CD32A), con respecto a una molécula que no comprende dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre, medido usando los métodos conocidos por los expertos en la materia y descritos en el presente documento. Como alternativa, las moléculas pueden comprender un dominio Fc variante, en donde la variante confiere o media en la actividad disminuida de ADCC (u otra función efectora) y/o unión aumentada a FcyRIIB (CD32B), con respecto a una molécula que no comprende dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre, medido usando los métodos conocidos por los expertos en la materia y descritos en el presente documento.
La invención también engloba el uso de un dominio Fc que comprende dominios o regiones de dos o más ¡sotipos de IgG, Como se conoce en la técnica, la modificación de aminoácidos de la región Fc puede afectar profundamente a la función efectora y/o a la actividad de unión mediada por el fragmento Fc. Sin embargo, estas modificaciones en las características funcionales además pueden perfeccionarse y/o manipularse por ingeniería cuando se ponen en práctica en el contexto de los ¡sotipos IgG seleccionados. De forma análoga, las características naturales del segmento Fc del ¡sotipo pueden manipularse mediante una o más modificaciones de aminoácidos. Los múltiples ¡sotipos de IgG (es decir, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) presentan diferentes propiedades físicas y funcionales incluyendo la semivida en suero, la fijación del complemento, afinidades de unión a FcyR y actividades de función efectora (por ejemplo, ADCC, CDC) debido a las diferencias en las secuencias de aminoácidos de sus dominios bisagra y/o Fc. En determinadas realizaciones, la modificación de aminoácidos y la región Fc de IgG se seleccionan independientemente en función de sus respectivas actividades de función de enlace efectora por separado para diseñar un diacuerpo con las características deseadas. En la mayoría de las realizaciones, dichas modificaciones de aminoácidos y las regiones bisagra/Fc de IgG se ensayado por separado para determinar su actividad de unión y/o función efectora como se describe en el presente documento o como se sabe en la técnica en el contexto de una IgG1. En determinadas realizaciones, dicha modificación de aminoácidos y región bisagra/Fc de la IgG presentan funcionalidad similares, por ejemplo, mayor afinidad por FcyRIIA, cuando se ensayan por separado para determinar la unión a FcyR o la función efectora en el contexto de la molécula de diacuerpo u otra molécula que contenga Fc (por ejemplo, una inmunoglobulina). La combinación de dicha modificación de aminoácidos y la región Fc de la IgG seleccionada actúan entonces de manera aditiva o, más preferentemente, de manera sinérgica para modificar dicha funcionalidad de la molécula de diacuerpo de la divulgación, con respecto a una molécula de diacuerpo de la divulgación que comprende una región Fc de tipo silvestre. En otras realizaciones, dicha modificación de aminoácidos y la región Fc de la IgG presentan funcionalidades opuestas, por ejemplo, mayor o menor, respectivamente, afinidad por FcyRIIA, cuando se ensayan por separado para determinar la actividad de unión a FcyR y/o la función efectora en el contexto de la molécula de diacuerpo u otra molécula que contenga Fc (por ejemplo, una inmunoglobulina) que comprende una región Fc de tipo silvestre como se describe en el presente documento o como se conoce en la técnica; la combinación de dicha modificación de aminoácidos y región de la IgG seleccionadas "opuestas" actúan entonces para atemperar o reducir selectivamente una funcionalidad específica en el diacuerpo de la divulgación con respecto a un diacuerpo de la divulgación que no comprende una región Fc o que comprende una región Fc de tipo silvestre del mismo ¡sotipo. Como alternativa, se describen regiones Fc variantes que comprenden combinaciones de modificaciones de aminoácidos conocidas en la técnica y regiones de IgG seleccionadas que muestran propiedades novedosas, en donde dichas propiedades no fueron detectables cuando dichas modificaciones y/o regiones se ensayaron de manera independiente como se describe en el presente documento.
Las características funcionales de los múltiples ¡sotipos de IgG y los dominios de los mismos, son bien conocidas en la técnica. Las secuencias de aminoácidos de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 se presentan en las FIG. 1A-1B. La selección y/o combinaciones de dos o más dominios de ¡sotipos de IgG específicos para su uso en los métodos pueden basarse en cualquier parámetro conocido de los ¡sotipos precursores, incluyendo la afinidad por FcyR (tabla 7; Flesch et al. (2000) "Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G", J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) "Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody", J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) "Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036-9040). Por ejemplo, el uso de regiones o dominios derivados de los ¡sotipos de IgG que presentan unión limitada o no se unen a FcyRIIB, por ejemplo, IgG2 o IgG4, pueden encontrar un uso particular cuando se desea modificar por ingeniería un diacuerpo para aumentar al máximo la unión a un receptor activador y reducir al mínimo la unión a un receptor inhibidor. De forma análoga, el uso de regiones o dominios Fc de ¡sotipos de IgG conocidos por unirse preferentemente a C1q o FcyRIIIA, por ejemplo, IgG3 (Brüggemann et al. (1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies", J. Exp. Med. 166:1351-1361), pueden combinarse con las modificaciones de aminoácidos de Fc conocidas en la técnica para mejorar la ADCC, para diseñar una molécula de diacuerpo tal que la actividad de función efectora, por ejemplo, activación del complemento o ADCC, se maximiza.
Tabla 7. Características generales de la unión de IgG a FcyR, adaptadas de Flesch y Neppert, 1999, J. Clin. Lab.
Anal. 14:141-156
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5.3 c o n ju g a d o s m o le c u la r e s
Las moléculas de dlacuerpo descritas en el presente documento pueden fusionarse de manera reoomblnante o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a polipéptidos heterólogos (es decir, un polipéptido no relacionado o una porción del mismo, preferentemente, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos del polipéptido para generar proteínas de fusión. La fusión no es necesariamente directa, sino que puede producirse a través de secuencias enlazadoras.
Además, las moléculas de diacuerpo de la divulgación (es decir, polipéptidos) pueden conjugarse a un agente terapéutico o a un resto de fármaco que modifica una respuesta biológica dada. Como alternativa a la conjugación directa, debido a los múltiples sitios de unión en las moléculas de diacuerpo multivalentes, por ejemplo, tetravalentes, de la divulgación, al menos una región de unión del diacuerpo puede diseñarse para que se una al agente terapéutico o al resto de fármaco deseado sin afectar a la unión del diacuerpo.
Los agentes terapéuticos o restos de fármacos no se consideran limitados a los agentes terapéuticos químicos convencionales. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas (es decir, PE-40) o toxina diftérica, ricina, gelonina y proteína antivírica de la hierba carmín, una proteína, tal como el factor de necrosis tumoral, interferones, incluyendo, pero sin limitación, interferón a (IFN-a), interferón p (IFN-p), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), activador de plasminógeno tisular (TPA), un agente apoptótico (por ejemplo, TNF-a, TNF-p, AIM I como se divulga en la Publicación PCT n.2 WO 97/33899), AIM II (véase la Publicación PCT n.2 WO 97/34911), ligando de Fas y VEGI (Publicación PCT n.2 WO 99/23105), un agente trombogénico o un agente antiangiogénico (por ejemplo, angiostatina o endostatina) o un modificador de la respuesta biológica, tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor de estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos ("GM-CSF") y factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF"), factor estimulante de colonias de macrófagos ("M-CSF") o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona del crecimiento ("GH"); proteasas o ribonucleasas.
Las moléculas de diacuerpo de la divulgación (es decir,, polipéptidos) se pueden fusionar con secuencias marcadoras, como un péptido para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos del marcador es un péptido de hexa-histidina, tal como el marcador proporcionado en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales se encuentran disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al. (1989) "Bioassay For Trans-Activation Using Purified Human Immunodeficiency Virus TAT-Encoded Protein: Trans-Activation Requires mRNA Synthesis", Proc. Natl Acad Sci. USA, 86: 821-824, por ejemplo, la hexa-histidina posibilita una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, pero sin limitación, el marcador "HA" de hemaglutinina, que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al. (1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein", Cell, 37: 767-778) y el marcador "flag" (Knappik et al. (1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments", Biotechniques, 17 (4):754-761).
Otras proteínas de fusión adicionales se pueden generar mediante las técnicas de intercambio de genes, reordenamiento de motivos, reordenamiento de exones y/o reordenamiento de codones (citadas colectivamente como "reordenamiento de ADN"). El intercambio de ADN puede emplearse para modificar las actividades de las moléculas de la divulgación (por ejemplo, los sitios de unión a epítopo con mayores afinidades y menores constantes de disociación). Véase, en general, las Patentes de los Estados Unidos n.2 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; y 5.837.458 y Patten et al. (1997) "Applications Of DNA Shuffling To Pharmaceuticals And Vaccines", Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-733; Harayama (1998) "Artificial Evolution By DNA Shuffling", Trends Biotechnol.
16:76-82; Hansson et al. (1999) "Evolution Of Differential Substrate Specificities In Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling", J. Mol. Biol. 287:265-276; y Lorenzo et al. (1998) "PCR-Based Method For The Introduction Of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus", BioTechniques 24:308-313. Las moléculas de diacuerpo de la divulgación o los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la divulgación, además se pueden modificar para someterse a una mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción de nucleótidos aleatorios u otros métodos previos a la recombinación. Una o más partes de un polinucleótido que codifique una molécula de la divulgación, pueden ser recombinadas con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
La presente divulgación también engloba moléculas de diacuerpo de la divulgación conjugadas a o que reconocen de manera inmunoespecífica un agente de diagnóstico o terapéutico o cualquier otra molécula para la que se desea una semivida en suero mayor/menor y/o dirigida a un determinado subconjunto de células. Las moléculas de la divulgación pueden usarse a efectos diagnósticos para, por ejemplo, controlar el desarrollo o la progresión de una enfermedad, un trastorno o una infección como parte de un procedimiento de ensayo clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento concreto. La detección se puede facilitar acoplando las moléculas de la divulgación a una sustancia detectable o mediante las moléculas que reconocen de manera inmunoespecífica la sustancia deteetable. Los ejemplos de sustancias detectables Incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse directamente a las moléculas de la divulgación o indirectamente a través de un producto intermedio (tal como, por ejemplo, un enlazador conocido en la técnica) usando técnicas conocidas, o la molécula puede reconocer de manera inmunoespecífica la sustancia detectable: la unión inmunoespecífica a dicha sustancia. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.24.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso como agente de diagnóstico. Dichos diagnóstico y detección pueden realizarse diseñando las moléculas para que reconozcan de manera inmunoespecífica la sustancia detectable o mediante el acoplamiento de las moléculas de la divulgación a sustancias detectables incluyendo, pero sin limitación, diversas enzimas, enzimas que incluyen, pero sin limitación, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o acetilcolinesterasa; complejos de grupos prostéticos tales como, pero sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, pero sin limitación, umbelliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; material luminiscente tal como, pero sin limitación, luminol; materiales bioluminiscentes tales como, pero sin limitación, luciferasa, luciferina y aecuorina; material radiactivo tal como, pero sin limitación, bismuto ( 13Bi), carbono (14C), cromo (51Cr), cobalto (57Co), flúor (18F), gadolinio (153Gd, 159Gd), galio (68Ga, 67Ga), aermanio (68Ge), holmio (166Ho), indio (115ln, 113ln, 112ln, 111ln), yodo (131l, 125l, 123l, 121l), lantano (140La), lutecio (177Lu), manganeso (54Mn), molibdeno (99Mo), paladio (103Pd), fósforo (32P), praseodimio (142Pr), prometio (149Pm), renio (186Re, 188Re), rodio (105Rh), rutenio (97Ru), samario (153Sm), escandio (47SC), selenio (75Se), estroncio (85Sr) azufre (35S), tecnecio (99Tc), talio ( 01Tl), estaño (113Sn, 117Sn), tritio (3H), xenón (133Xe), iterbio (169Yb, 175Yb), itrio (90Y), cinc (65Zn); metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
Las moléculas de diacuerpo de la divulgación pueden reconocer de manera inmunoespecífica o conjugarse a un resto terapéutico tal como una citotoxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida), un agente terapéutico o un elemento radiactivo (por ejemplo, emisores alfa, emisores gamma, etc.). Los agentes citotóxicos o citotoxinas incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y c/'s-diclorodiamina-platino (ll) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Además, una molécula de diacuerpo de la divulgación puede conjugarse o puede diseñarse para reconocer de manera inmunoespecífica restos terapéuticos tales como materiales radiactivos o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (véase lo anterior para los ejemplos de los materiales radiactivos). En determinadas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N’,N",N"‘-tetraacético (DOTA) que puede unirse al polipéptido mediante una molécula enlazadora. Dichas moléculas enlazadoras se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al. (1998) "Comparison Of 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-N,N',N",N'"-Tetraacetic Acid (DOTA)-Peptide-ChL6, A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker, To 2-lminothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-DOTA-ChL6 ln Breast Cáncer Xenografts", Clin. Cáncer Res. 4:2483-2490; Peterson et al. (1999) "Enzymatic Cleavage Of Peptide-Linked Radiolabels From lmmunoconjugates, Bioconjug. Chem. 10:553-; y Zimmerman et al, (1999) "A Triglycine Linker lmproves Tumor Uptake And Biodistributions Of 67-Cu-Labeled Anti-Neuroblastoma mAb chCE7 F(ab)2 Fragments", Nucl. Med. Biol.
26:943-950.
Las técnicas para conjugar dichos restos terapéuticos a los polipéptidos, incluyendo, por ejemplo, dominios Fc, son bien conocidas; véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For lmmunotargeting Of Drugs ln Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pág. 243-56, Alan R. Liss, lnc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2.a Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pág. 623-53, Marcel Dekker, lnc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents ln Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, págs. 475­ 506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody ln Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pág. 303-16, Academic Press; y Thorpe et al. (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", lmmunol. Rev., 62:119-158.
Las moléculas de diacuerpo de la divulgación pueden administrarse con o sin un resto terapéutico conjugado a las mismas, pueden administrarse solas o combinadas con factor/es citotóxico/s y/o citocina/s para su uso como tratamiento terapéutico. Cuando se administran solas, puede diseñarse al menos un epítopo de una molécula de diacuerpo multivalente, por ejemplo, tetravalente, para que reconozca inmunoespecíficamente a una diana terapéutica, por ejemplo, factor/es citotóxico/s y/o citocina/s, que puede administrarse de manera concurrente o posterior a la molécula de la divulgación. De esta manera, la molécula de diacuerpo puede escoger específicamente el agente terapéutico de manera similar a la conjugación directa. Como alternativa, una molécula de la divulgación puede conjugarse a un anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpos según lo descrito por Segal en la patente de los Estados Unidos n.24.676.980. Las moléculas de diacuerpo de la divulgación también pueden unirse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o la purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, pero sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.
5.4 CARACTERIZACIÓN DE LA UNIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE DIACUERPO
Las moléculas de diacuerpo de la presente divulgación pueden caracterizarse de una variedad de formas. En particular, las moléculas de la divulgación pueden ensayarse para determinar la capacidad para unirse de manera inmunoespecífica a un antígeno, por ejemplo, FcRIIIA o FcRIIB, o, cuando la molécula comprende un dominio Fc (o una parte del mismo) para determinar la capacidad para presentar interacciones Fc-FcyR, es decir, la unión específica de un dominio Fc (o parte del mismo) a un FcyR. Dicho ensayo se puede realizar en solución (por ejemplo, Houghten (1992) "The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of Bioactive Peptides", BioTechniques, 13:412-421), sobre perlas (Lam (1991) "A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity", Nature, 354:82-84, sobre microplacas (Fodor (1993) "Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips", Nature, 364:555-556), sobre bacterias (patente de los Estados Unidos n.25.223.409), sobre esporas (patentes de los Estados Unidos n.25.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), sobre plásmidos (Culi et al. (1992) "Screening For Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869) o sobre un fago (Scott et al. (1990) "Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library", Science, 249:386-390; Devlin (1990) "Random Peptide Libraries: A Source Of Specific Protein Binding Molecules", Science, 249:404-406; Cwirla et al. (1990) "Peptides On Phage: A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382; y Felici (1991) "Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector", J. Mol. Biol., 222:301-310). Las moléculas que se hayan identificado para unirse de manera inmunoespecífica a un antígeno, por ejemplo, FcyRIIIA, se pueden ensayar luego para determinar su especificidad y afinidad por el antígeno.
Las moléculas de la divulgación que se han modificado para que comprendan múltiples dominios de unión a epítopo pueden ensayarse respecto de su unión inmunoespecífica a uno o más antígenos (por ejemplo, antígenos de cáncer y reactividad cruzada con otros antígenos (por ejemplo, FcyR)) o, cuando las moléculas comprenden un dominio Fc (o una parte del mismo), para interacciones Fc-FcyR mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que pueden usarse para analizar la unión inmunoespecífica, reactividad cruzada e interacciones Fc-FcyR incluyen, pero sin limitación, pero sin limitación, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos usando técnicas tales como el análisis de transferencia Western, ensayos radioinmunológicos, ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a una enzima), inmunoensayos en "sándwich", ensayos de precipitación inmunológica, reacciones de precipitación, reacciones de precipitación de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos de radiometría inmunológica, ensayos inmunológicos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A, por nombrar solo algunos. Dichos ensayos son habituales y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", Vol.
1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).
La afinidad de unión y la constante de desactivación de la interacción del dominio de unión al antígeno o la interacción Fc-FcyR pueden determinarse con ensayos de unión competitivos. Un ejemplo de un ensayo de unión competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del antígeno marcado, tales como FcyR tetramérico (por ejemplo, 3H o 125I, véase el apartado 5.4.1) con una molécula de interés (por ejemplo, las moléculas de la presente divulgación que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo en presencia de cantidades crecientes del epítopo no marcado, tal como FcyR tetramérico (véase el apartado 5.4.1), y la detección de la molécula unida al antígeno marcado. La afinidad de la molécula de la presente divulgación para un antígeno y las constantes de desactivación de la unión pueden determinarse a partir de los datos de saturación mediante el análisis de Scatchard.
Las afinidades y propiedades de unión de las moléculas de la divulgación para un antígeno o FcyR pueden determinarse inicialmente usando ensayos in vitro (ensayos bioquímicos o inmunológicos) conocidos en la técnica para interacciones antígeno-dominio de unión o Fc-FcyR, interacciones, incluyendo, pero sin limitación, ensayo de ELISA, ensayo de resonancia de plasmón superficial, ensayos de inmunoprecipitación. Preferentemente, las propiedades de unión de las moléculas de la divulgación también se caracterizan mediante ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de células efectoras mediadoras de FcyR, como se describe en el apartado 5.4.2. En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la divulgación tienen propiedades de unión similares en modelos in vivo (tales como los descritos y desvelados en el presente documento) como aquellos ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye moléculas de la divulgación que no presenten el fenotipo deseado en los ensayos in vitro, pero que presenten el fenotipo deseado in vivo.
En algunas realizaciones, el rastreo y la Identificación de moléculas que comprenden múltiples dominios de unión al epftopo y, opcionalmente, dominios Fc (o partes de los mismos) se realizan ensayos de base funcional, preferentemente de alto rendimiento. Los ensayos de base funcional pueden ser cualquier ensayo conocido en la técnica para caracterizar una o más funciones de células efectoras mediada por FcyR, tales como aquellas que se describen en el presente documento en los apartados 5.4.2 y 5.4.3. Los ejemplos no limitantes de las funciones de células efectoras que pueden usarse de acuerdo con los métodos descritos, incluyen, pero sin limitación, citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo (ADCC), fagocitosis dependiente de anticuerpos, fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, unión a células, formación de rosetas, unión a C1q y citotoxicidad mediada por células dependientes del complemento.
En una realización preferida, se usa el análisis cinético BIAcore para determinar las constantes de activación o desactivación de la unión de las moléculas de la presente divulgación a un antígeno y/o a FcyR. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y disociación de un antígeno o FcyR de microplacas con moléculas inmovilizadas (por ejemplo, moléculas que comprenden dominios de unión a epítopo o dominios Fc (o partes de los mismos), respectivamente) en su superficie. El análisis BIAcore se describe en el apartado 5.4.3.
Preferentemente, el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS), usando cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la materia, se usa para el ensayo inmunológico o funcional para caracterizar moléculas de la divulgación. Los citómetros de flujo son capaces de examinar rápidamente una gran cantidad de células individuales que se hayan unido, por ejemplo, opsonizadas, por moléculas de la divulgación (por ejemplo, 10­ 100 millones de células por hora) (Shapiro et al. (1995) Practical Flow Cytometry). Adicionalmente, los parámetros específicos que se usan para optimizar el comportamiento del diacuerpo incluyen, pero sin limitación, la concentración de antígeno (es decir, el complejo tetramérico FcyR, véase el apartado 5.4.1), el tiempo de la competencia cinética o condiciones rigurosas de FACS, pudiendo variarse todas ellas para seleccionar las moléculas de diacuerpo que comprendan las moléculas de la divulgación que presenten las propiedades de unión específicas, por ejemplo, unión concurrente a múltiples epítopos. Los citómetros de flujo para clasificar y examinar células biológicas son bien conocidos en la técnica. Los citómetros de flujo conocidos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.ÜÜ. números 4.347.935; 5.464.581; 5.483.469; 5.602.039; 5.643.796; y 6.211.477. Otros citómetros de flujo conocidos son el sistema FACS Vantage™ fabricado por Becton Dickinson and Company, y el sistema COPAS™ fabricado por Union Biometrica.
La caracterización de la afinidad de unión al antígeno diana o la afinidad de unión a Fc-FcyR, y la valoración del antígeno diana o la densidad del FcyR en la superficie celular se pueden realizar mediante métodos bien conocidos en la técnica, tales como el análisis de Scatchard o mediante el uso de kits siguiendo las instrucciones del fabricante, tal como Quantum™ Simply Cellular ® (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). El uno o más ensayos funcionales pueden ser cualquier ensayo conocido en la técnica para caracterizar una o más funciones de las células efectoras mediadas por FcyR como es conocido por un experto en la materia o descrito en el presente documento. Las moléculas descritas en el presente documento comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo) se ensaya en un análisis de ELISA para determinar la unión a uno o más antígenos diana o uno o más FcyR, por ejemplo, FcyRIIIA, FcyRIIA, FcyRIIA; seguido por uno o más ensayos de ADCC. En algunas realizaciones, las moléculas de la divulgación se ensayan además usando un ensayo basado en la resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIAcore. Los ensayos basados en la resonancia de plasmón superficial son bien conocidos en la técnica y además se describen en el apartado 5.4.3, y se ilustran en el presente documento, por ejemplo, en el Ejemplo 6.1.
En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la invención comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo) se caracterizan además en un modelo animal para determinar la interacción con un antígeno diana (por ejemplo, un FcyR) o la interacción Fc-FcyR. Cuando se van a valorar interacciones de Fc-FcyR, los modelos animales preferidos para su uso en los métodos son, por ejemplo, ratones transgénicos que expresan FcyR humanos, por ejemplo, cualquier modelo de ratón descrito en las Patentes de los Estados Unidos n.25.877.397 y 6.676.927. Otros ratones transgénicos para su uso en dichos métodos incluyen, pero sin limitación, ratones FcyRIIIA nuligénicos atímicos portadores de FcyRIIIA humano; ratones atímicos nuligénicos para FcyRIIIA portadores de FcyRIIA humano; ratones atímicos nuligénicos para FcyRIIIA portadores de FcyRIIB humano y FcyRIIIA humano; ratones atímicos nuligénicos para FcyRIIIA portadores de FcyRIIB humano y FcyRIIA humano; ratones atímicos nuligénicos para FcyRIIIA y FcyRIIA portadores de FcyRIIIA y FcyRIIA humano y atímicos nuligénicos para FcyRIIIA, FcyRIIA y FcyRIIB portadores de FcyRIIIA, FcyRIIA y FcyRIIB humano.
5.4.1 ENSAYOS DE UNIÓN QUE COMPRENDEN FcyR
La caracterización de la unión al FcyR con moléculas que comprenden un dominio Fc (o porción del mismo) y/o que comprenden el dominio de unión al epítopo específico para un FcyR se puede realizar usando cualquier FcyR, incluyendo, pero sin limitación, variantes polimórficas de FcyR. En algunas realizaciones, se usa una variante polimórfica de FcyRIIIA, que contiene una fenilalanina en la posición 158. En otras realizaciones, la caracterización se realiza usando una variante polimórfica de FcyRIIIA que contenga una valina en la posición 158. La variante polimórfica 158V de FcyRIIIA presenta mayor afinidad por IgG1 que la variante 158F y una actividad ADCC aumentada (véase, por ejemplo, Koene et al. (1997) "Fc gammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By Natural Killer Cell Fc gammaRiiia, independently Of The Fc gammaR!iia-48L/R/H Phenotype", Blood, 90:1109-14; Wu et al. (1997) "A Novel Polymorphism Of FcgammaRiiia (CD16) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease", J. Clin. invest. 100: 1059-70; este resto, de hecho, interactúa directamente con la región bisagra inferior de igG1 como se ha demostrado recientemente en estudios de cocristalización de igG1 -FcyRIIIA, véase, por ejemplo, Sondermann et al. (2000) "The 3.2-A Crystal Structure Of The Human igG1 Fc Fragment-Fc gammaRIII complex", Nature, 406(6793):267-273. Los estudios han demostrado que en algunos casos, los anticuerpos terapéuticos tienen eficacia mejorada en pacientes homocigotos para FcyRIIIA-158V. Por ejemplo, el anticuerpo monoclinal anti-CD20 Rituximab fue terapéuticamente más eficaz en pacientes homocigotos para FcyRIIIA158V en comparación con pacientes heterocigotos para FcyRIIIA 158F (véase, por ejemplo, Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA Gene", Blood, 99(3): 754-758). En otras realizaciones, las moléculas terapéuticas que comprenden esta región también pueden ser más eficaces en pacientes heterocigotos para FcyRIIIA-158V y FcyRIIIA-158F y en pacientes con FcyRIIA-131H. Aunque no se pretende quedar limitado a ningún mecanismo de acción en particular, la selección de moléculas de la divulgación con alotipos alternativos puede posibilitar variantes que una vez modificadas en diacuerpos terapéuticos, serán clínicamente más eficaces para pacientes homocigotos para dicho alotipo.
Se desarrolló un ensayo de unión a FcyR para determinar la unión de las moléculas de la divulgación a FcyR, y, en particular, para determinar la unión de los dominios Fc a FcyR. Los ensayos permitieron realizar la detección y cuantificación de las interacciones Fc-FcyR, a pesar de la débil afinidad inherente del receptor por su ligando, por ejemplo, en el intervalo micromolar por FcyRIIB y FcyRIIIA. El método se describe con detalle en la solicitud internacional WO04/063351 y en las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos n.22005/0037000 y 2005/0064514. Resumiendo, el método implica la formación de un complejo de FcyR que se puede preparar en cualquier inmunoensayo convencional conocido en la técnica, por ejemplo, FACS, ELISA, resonancia del plasmón superficial, etc. Además, el complejo de FcyR tiene una mayor avidez por una región Fc, en comparación con un FcyR no complejado. De acuerdo con la divulgación, el complejo molecular preferido es un complejo tetramérico inmunitario, que comprende: (a) la región soluble de FcyR (por ejemplo, la región soluble de FcyRIIIA, FcyRIIA o FcyRIIB); (b) una secuencia AVITAG de 15 aminoácidos biotinilada (AVITAG) unida operativamente al extremo carboxi-terminal de la región soluble de FcyR (por ejemplo, la región soluble de FcyRIIIA, FcyRIIA o FcyRIIB); y (c) estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE); en una proporción molar para formar un complejo de FcyR tetramérico (preferentemente en una proporción molar de 5:1). La proteína de fusión se biotinila enzimáticamente, usando, por ejemplo, la enzima Bir A de E. coli, una biotina ligasa que biotinila específicamente un resto de lisina en la secuencia AVITAG de 15 aminoácidos. Las proteínas FcyR solubles biotiniladas se mezclan luego con SA-PE en una proporción molar de 1X SA-PE:5X FcyR soluble biotinilado para formar un complejo tetramérico de FcyR.
Los polipéptidos que comprenden las regiones Fc han demostrado unirse a los complejos tetraméricos de FcyR con al menos una afinidad 8 veces superior a la de FcyR monomérico no complejado. La unión de los polipéptidos que comprenden las regiones Fc a los complejos tetraméricos FcyR se puede determinar usando las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS), ensayos radioinmunológicos, ensayos ELISA, etc.
También se describe el uso de los complejos inmunes que comprenden moléculas de la divulgación y se forman de acuerdo con los métodos descritos anteriormente, para determinar la funcionalidad de las moléculas que comprenden una región Fc en ensayos a base de células o libres de células.
Por cuestiones de conveniencia, los reactivos se pueden proporcionar en un kit para ensayo, es decir, una combinación envasada de reactivos para el ensayo de la capacidad de las moléculas que comprenden regiones Fc para unirse a los complejos tetraméricos de FcyR. Otras formas de complejos moleculares para su uso para determinar las interacciones de Fc-FcyR también se consideran útiles en los métodos, por ejemplo, proteínas de fusión.
5.4.2 ENSAYOS FUNCIONALES DE MOLÉCULAS CON CADENAS PESADAS VARIANTES
También se describe la caracterización de las moléculas descritas en el presente documento, que incluyen varios dominios de unión a epítopos y, opcionalmente, dominios Fc (o partes de los mismos) usando ensayos conocidos por los expertos en la materia para identificar la función de células efectoras de las moléculas. También se describe la caracterización de las moléculas de la divulgación respecto de la función de las células efectoras mediada por FcyR. Adicionalmente, cuando al menos uno de los antígenos diana de la molécula de diacuerpo de la divulgación es un FcyR, la unión del FcyR por la molécula de diacuerpo puede servir para activar las vías mediada por FcyR similares a las activadas por la unión de FcyR-Fc. Por lo tanto, cuando al menos un dominio de unión al epítopo de la molécula de diacuerpo reconoce un FcyR, la molécula de diacuerpo puede generar la función de célula efectora mediada por FcyR sin contener un dominio Fc (o parte del mismo), o sin la unión concomitante de Fc-FcyR. Los ejemplos de funciones de las células efectoras que pueden analizarse incluyen, pero sin limitación, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, unión a C1q y citotoxicidad mediada por células dependientes del complemento. Se puede usar cualquier ensayo a base de células o libre de células conocido por los expertos en la materia para determinar la actividad de la función de células efectoras (para ver Ios ensayos de células efectoras, véase Perussla et al, (2000) "Assays For Antlbody-Dependent Cell-Medlated Cytotoxlclty (AdCC) And Reverse ADCC (Redlrected Cytotoxlclty) ln Human Natural Klller Cells", Methods Mol. BIoI. 121: 179-92; Bagglollnl et al, (1988) "Cellular Models For The Detectlon And Evaluatlon Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Actlvlty", Experlentla, 44(10): 841-848; Lehmann et al. (2000) "Phagocytosls: Measurement By FIow Cytometry", J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown (1994) "ln Vltro Assays Of Phagocytlc Functlon Of Human Perlpheral Blood Leukocytes: Receptor Modulatlon And Slgnal Transductlon", Methods Cell BIoI., 45: 147-64; Munn et al. (1990) "Phagocytosls Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured ln Recomblnant Macrophage Colony-Stlmulatlng Factor", J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majld et al. (2002) "Fc Receptors Are Crltlcal For Autolmmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System ln Experimental Autolmmune Encephalomyelltls", Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Dlng et al. (1998) "Two Human T Cell Receptors Bind ln A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptlde Complex Uslng Dlfferent TCR Amino Acids", Immunlty 8:403-411).
En una realización, las moléculas de la divulgación pueden ensayarse para determinar la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos humanos. Como alternativa, la fagocitosis mediada por FcyR de las moléculas de la divulgación puede ensayarse en otros fagocitos, por ejemplo, neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares; PMN); monocitos de sangre periférica humana, macrófagos derivados de monocitos, que puede obtenerse utilizando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, véase Brown (1994) "In Vitro Assays Of Phagocytlc Functlon Of Human Perlpheral Blood Leukocytes: Receptor Modulatlon And Slgnal Transductlon", Methods Cell BIoI., 45: 147-164). En una realización, la función de las moléculas de la divulgación se caracteriza midiendo la capacidad de las células THP-1 para fagocitar glóbulos rojos de oveja (SRBC) opsonizados con IgG fluoresceinada mediante los métodos descritos previamente (Trldandapanl et al. (2000) "The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Slgnal Transductlon In Myeloid Cells", J. BIoI. Chem. 275: 20480-20487).
Otro ensayo ilustrativo para determinar la fagocitosis de las moléculas de la divulgación es un ensayo de opsonofagocitosis dependiente de anticuerpos (ADCP) que puede comprender lo siguiente: recubrir una biopartícula diana, tal como Escherichia coli marcadas con FITC (Molecular Probes) o Staphylococcus aureus marcadas con FITC con (i) anticuerpo 4-4-20 de tipo silvestre, un anticuerpo anti-fluoresceína (véase Bedzyk et al. (1989) "Comparison Of Variable Reglón Prlmary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family", J. BIoI. Chem, 264(3): 1565-1569), como el anticuerpo de control para el ensayó ADCP dependiente de FcyR; o (ii) el anticuerpo 4­ 4-20 que alberga la mutación D265A que anula la unión a FcyRIII, como control de fondo para el ensayó ADCP dependiente de FcyR (iii) un diacuerpo que comprende el dominio de unión al epítopo del anticuerpo 4-4-20 y un dominio Fc y/o un dominio de unión al epítopo específico para FcyRIII; y la formación de la partícula opsonizada; la adición de cualquiera de las partículas opsonizadas descritas (i-iii) a las células efectoras THP-1 (una estirpe celular monocítica disponible de ATCC) en una proporción de 1:1, 10:1, 30:1, 60:1, 75:1 o 100:1 para permitir que se produzca la fagocitosis mediada por FcyR; preferentemente incubando las células y E. co/i-FITC/anticuerpo a 37 °C durante 1,5 horas; la adición de azul de tripano tras la incubación (preferentemente a temperatura ambiente durante 2-3 mln) a las células para inactivar la fluorescencia de las bacterias que se adhieren al exterior de la superficie celular sin ser internalizadas; la transferencia de células a un tampón para FACS (por ejemplo, 0,1 %, BSA en PBS, azlda de sodio al 0,1%), analizando la fluorescencia de linfocitos THP1 usando FACS (por ejemplo, BD FACS Calibur). Preferentemente, las células THP-1 que se usan en el ensayó se analizan por FACS para determinar la expresión de FcyR en la superficie celular. Las células THP-1 expresan CD32A y CD64. CD64 es un FcyR de alta afinidad que se bloquea para realizar el ensayó ADCP de acuerdó con los métodos de la invención. Las células THP-1 preferentemente se bloquean con lgG1 soluble a 100 pg/ml o suero humanó al 10 %. Para analizar la magnitud de la ADCP, se establece preferentemente la ventana de análisis en las células THP-1 y se mide la mediana de la intensidad de la fluorescencia. La actividad ADCP para mutantes individuales se calcula y se presenta como el valor normalizado para el chMab 4-4-20 de tipo silvestre obtenido. Las partículas opsonizadas se añaden a células THP-1 de manera que la proporción de las partículas opsonizadas con respecto a las células THP-1 es de 30:1 o 60:1. En las realizaciones más preferidas, el ensayó ADCP se realiza con controles, tales como E. coli-FITC en medió, E. coli-FITC y células THP-1 (para que sirvan como actividad ADCP independiente de FcyR), E. coli-FITC, células THP-1 y anticuerpo 4-4-20 de tipo silvestre (para que sirva como actividad ADCP dependiente de FcyR), E coli-FITC, células THP-1, D265A de 4-4-20 (para que sirva como control de fondo para la actividad ADCP dependiente de FcyR).
En otra realización, las moléculas de la divulgación pueden ensayarse para determinar la actividad ADCC mediada por FcyR en células efectoras, por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales, usando cualquiera de los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Perussla et al. (2000) "Assays For Antlbody-Dependent Cell-Medlated Cytotoxlclty (ADCC) And Reverse AdCc (Redlrected Cytotoxlclty) In Human Natural Klller Cells", Methods Mol. BIoI. 121: 179-92; Weng et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predlct Response To Rituximab In Patlents Wlth Follicular Lymphoma", J. Clin. Oncol. 21:3940-3947; Dlng et al. (1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptlde Complex Uslng Dlfferent TCR Amino Acids", Immunlty 8:403-411). Un ensayó ilustrativo para determinar la actividad ADCC de las moléculas de la divulgación se basa en un ensayó de liberación de 51Cr que comprende: marcar células diana con [51Cr]Na2CrO4 (esta molécula permeable en la membrana celular se usa comúnmente para marcaje puesto que se une a las proteínas citoplasmáticas y, aunque es liberada espontáneamente de células con cinética lenta, se libera masivamente después de la necrosis de células diana); opsonización de células diana con las moléculas de la divulgación que comprenden cadenas pesadas variantes; la combinación de células diana radiomarcadas, opsonizadas con células efectoras en una placa de microtitulación en una proporción apropiada de células diana con respecto a células efectoras; la incubación de la mezcla de células durante 16-18 horas a 37 sC; la recogida de los sobrenadantes; y el análisis de la radiactividad. La citotoxicidad de las moléculas de la divulgación entonces se puede determinar, por ejemplo, usando la siguiente fórmula: % de lisis = (cpm experimental - cpm de fuga diana)/(cpm de lisis con detergente - cpm de fuga diana) x 100 %. Como alternativa, el % de lisis = (ADCC-AICC)/(liberación máxima - liberación espontánea). La lisis específica se puede calcular usando la fórmula: lisis específica = % de lisis con las moléculas de la divulgación - % de lisis en ausencia de las moléculas de la divulgación. Puede generarse una gráfica variando la relación de diana:células efectoras o la concentración de anticuerpo.
Preferentemente, las células efectoras que se usan en los ensayos ADCC son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que preferentemente se purifican de sangre humana normal, usando los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, usando centrifugación en gradiente de densidad Ficoll Paque. Las células efectoras preferidas para su uso en los métodos de la invención expresan diferentes receptores activadores de FcyR. También se describen células efectoras, THP-1, que expresan FcyRI, FcyRIIA y FcyRIIB, y macrófagos primarios derivados de monocitos derivados de sangre humana completa que expresan FcyRIIIA y FcyRIIB, para determinar si los mutantes de cadena pesada de los anticuerpos muestran actividad ADCC aumentada y fagocitosis respecto a los anticuerpos IgG1 de tipo silvestre.
La estirpe celular de monocitos humanos, THP-1, activa la fagocitosis mediante la expresión del receptor de alta afinidad FcyRI y el receptor de baja afinidad FcyRIIA usando un método conocido por los expertos en la materia (Fleit et al. (1991) "The Human Monocyte-Like Cell Line THP-1 Expresses Fc Gamma RI And Fc Gamma RII", J. Leuk. Biol. 49: 556-565). Las células THP-1 no expresan de manera constitutiva FcyRIIA o FcyRIIB. La estimulación de estas células con citocinas afecta al patrón de expresión de FcR (Pricop et al. (2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines", J. of Immunol., 166: 531-537). El crecimiento de células THP-1 en presencia de citocina IL4 induce la expresión de FcyRIIB y ocasiona una disminución en la expresión de FcyRIIA y FcyRI. La expresión de FcyRIIB también puede potenciarse aumentando la densidad celular (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells", J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089). Por el contrario, Por el contrario, se ha notificado que IFNy puede conducir a la expresión de FcyRIIIA (Pearse et al. (1993) "Interferon Gamma-Induced Transcription Of The High-Affinity Fc Receptor For IgG Requires Assembly Of A Complex That Includes The 91-kDa Subunit Of Transcription Factor ISGF3", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 4314-4318). La presencia o ausencia de receptores en la superficie celular se puede determinar usando FACS con los métodos comunes conocidos por los expertos en la materia. La expresión de FcyR inducida por citocinas en la superficie celular proporciona un sistema para ensayar la activación e inhibición en presencia de FcyRIIB. Si las células THP-1 no pueden expresar el FcyRIIB otra línea celular de monocitos humanos, U937, se pueden usar. Se ha demostrado que estas células se diferencian de manera terminal en macrófagos en presencia de IFNy y TNF (Koren et al. (1979) "In Vitro Activation Of A Human Macrophage-Like Cell Line", Nature 279: 328-331).
La destrucción de células tumorales dependiente de FcyR está mediada por linfocitos NK y macrófagos en modelos tumorales en ratones (Clynes et al. (1998) "Fc Receptors Are Required In Passive And Active Immunity To Melanoma", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 652-656). También se describe el uso de monocitos elutriados de donantes como células efectoras para analizar la eficacia de los mutantes de Fc para generar la citotoxicidad celular de células diana en ensayos de fagocitosis y ADCC. Los patrones de expresión de FcyRI, FcyRIIIA y FcyRIIB se ven afectados por diferentes condiciones de crecimiento. La expresión de FcyR de monocitos elutriados congelados, monocitos elutriados frescos, monocitos mantenidos en FBS al 10 %, y monocitos cultivados en FBS GM-CSF y/o en suero humano se pueden determinar usando los métodos comunes para los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden teñir las células con anticuerpos específicos de FcyR y analizarlas por FACS para determinar los perfiles de FcR. Las condiciones que mejor imitan la expresión de FcyR in vivo de los macrófagos se usan después para los métodos del presente documento.
También se describe el uso de células de ratón, especialmente cuando las células humanas con los perfiles FcyR correctos no pueden obtenerse. También se describe la estirpe de células de macrófagos de ratón RAW264.7(ATCC) que puede transfectarse con FcyRIIIA humano y los transfectantes estables se aíslan usando los métodos conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Ralph et al. (1977) "Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets By Macrophage-Related Cell Lines: Enhancement By PPD And LPS", J. Immunol. 119: 950-4). Los transfectantes pueden cuantificarse para determinar la expresión de FcyRIIIA mediante análisis de FACS usando la experimentación rutinaria, y los de alta expresión pueden usarse en ensayos ADCC. También se describe el aislamiento de macrófagos peritoneales del bazo que expresan FcyR humano de ratones transgénicos nuligénicos tales como los descritos en el presente documento.
Pueden recogerse linfocitos de sangre periférica de donantes (PBM) usando un gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia). Dentro de la población de células mononucleares aisladas, la mayor parte de la actividad ADCC se encuentra a través de los linfocitos citolíticos naturales (NK) que contengan FcyRIIIA, pero no FcyRIIB en su superficie. Los resultados con estas células indican la eficacia de Ios mutantes en la activación de ADCC de Ios linfocitos NK y establecen los reactivos para realizar ensayos con monocitos elutriados.
Las células diana utilizadas en los ensayos ADCC incluyen, pero sin limitación, estirpes celulares de cáncer de mama, por ejemplo, SK-BR-3 con número de registro ATCC HTB-30 (véase, por ejemplo, Tremp et al. (1976) "Human Breast Cáncer ln Culture", Recent Results Cáncer Res. 33-41); Linfocitos B; células derivadas de linfoma de Burkitt, por ejemplo, células Raji con número de registro ATCC CCL-86 (véase, por ejemplo, Epstein et al. (1965) "Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain (EB1) Of Human Lymphoblasts From Burkitt’s Lymphoma", J. Natl. Cáncer Inst. 34: 231-240), y células Daudi con el número de Registro de la ATCC CCL-213 (véase, por ejemplo, Klein et al. (1968) "Surface IgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And ln Derived Culture Lines", Cáncer Res. 28: 1300-1310). Las células diana pueden ser reconocidas por el sitio de unión al antígeno de la molécula de diacuerpo que se va a ensayar.
El ensayo ADCC se basa en la capacidad de los linfocitos NK para mediar en la muerte celular a través de una vía apoptótica. Los linfocitos NK median en la muerte celular en parte por el reconocimiento de FcyRIIIA de un dominio Fc de IgG unido a un antígeno en una superficie celular. Los ensayos ADCC que se usan de acuerdo con los métodos del presente documento pueden ser ensayos basados en la radiactividad o ensayos basados en la fluorescencia. El ensayo de ADCC usado para caracterizar las moléculas descritas en el presente documento que comprenden regiones Fc variantes comprende marcar las células diana, por ejemplo, SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji, Daudi, la opsonización de células diana con un anticuerpo que reconozca un receptor de superficie celular en la célula diana a través de su sitio de unión al antígeno; la combinación de células diana opsonizadas, marcadas y las células efectoras en una proporción apropiada, que puede determinarse mediante experimentación rutinaria; cosechar las células; detectar el marcador en el sobrenadante de células diana lisadas, usando un esquema de detección apropiado basado en el marcador usado. Las células diana se pueden marcar con un marcador radiactivo o un marcador fluorescente, usando los métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, los marcadores incluyen, pero sin limitación, [51Cr]Na2CrO4; y el éster acetoximetílico del ligando de potenciación de la fluorescencia, 2,2’:6’,2"-terpiridin-6-6"-dicarboxilato (TDA).
En una realización específica preferida, se usa un ensayo fluorimétrico con resolución temporal para medir la actividad ADCC contra células diana que se han marcado con el éster acetoximetílico del ligando de potenciación de la fluorescencia, 2,2’:6’,2"-terpiridin-6-6"-dicarboxilato (TDA). Dichos ensayos fluorimétricos son conocidos en la técnica, por ejemplo, véase, Blomberg et al. (1996) "Time-Resolved Fluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled With A Fluorescence Enhancing Ligand", Journal of Immunological Methods, 193: 199­ 206. Resumiendo, se marcan las células diana con el diéster acetoximetílico de TDA (2,2’:6’2"-terpiridin-6-6"-dicarboxilato de bis(acetoximetilo)), (BATDA), que rápidamente se difunde a través de la membrana celular de células viables. Las esterasas intracelulares escinden los grupos éster, y la molécula TDA impermeable en la membrana regenerada se queda atrapada dentro de la célula. Tras la incubación de células efectoras y diana, por ejemplo, durante al menos dos horas hasta 3,5 horas, a 37 °C, bajo CO2 al 5 %, la molécula de TDA liberada de células diana lisadas se quela con Eu3+ y se cuantifica la fluorescencia de los quelatos de europio-TDA formados en un fluorómetro de resolución temporal (por ejemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallace).
En otra realización específica, el ensayo de ADCC que se usa para caracterizar las moléculas descritas en el presente documento que comprenden múltiples sitios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo) comprende las siguientes etapas: preferentemente 4-5x106 células diana (por ejemplo, células SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji) se marcan con bis(acetoximetil)2,2,:6',2"-terpiridin-t-6"-dicarboxilato (reactivo DELFIA BATDA, Perkin Elmer/Wallac). Para una eficacia óptima del marcaje, el número de células diana que se usa en el ensayo ADCC preferentemente no debe ser superior a 5x106. Se añade el reactivo BATDA a las células y la mezcla se incuba a 37 °C, preferentemente con el CO2 al 5 %, durante al menos 30 minutos. Después, se lavan las células con un tampón fisiológico, por ejemplo, PBS con sulfinpirazol 0,125 mM, y medios que contienen sulfinpirazol 0,125 mM. Las células diana marcadas luego se opsonizan (se recubren) con una molécula descrita en el presente documento que contenga un dominio de unión al epítopo específico para FcyRIIA y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo). En las realizaciones preferidas, la molécula usada en el ensayo ADCC también es específica de un receptor de superficie celular, un antígeno tumoral o un antígeno del cáncer. La molécula de diacuerpo de la invención puede unirse específicamente a cualquier antígeno del cáncer o tumoral, tal como los que se enumeran en el apartado 5.6.1. Las células diana del ensayo ADCC se seleccionan de acuerdo con los sitios de unión a epítopo modificados por ingeniería en el diacuerpo de la divulgación, de modo que el diacuerpo se una específicamente a un receptor de superficie celular de la célula diana.
Las células diana se añaden a las células efectoras, por ejemplo, PBMC, para obtener proporciones de células efectoras: células diana de aproximadamente 1:1, 10:1, 30:1, 50:1, 75:1 o 100:1. Las células efectoras y diana se incuban durante al menos dos horas, hasta 3,5 horas, a 37 °C, bajo CO2 al 5 %. Se recogen los sobrenadantes celulares y se añaden a una solución ácida de europio (por ejemplo, solución DELFIA Europium, Perkin Elmer/Wallac). La fluorescencia de los quelatos de europio-TDA formados se cuantifica en un fluorómetro de resolución temporal (por ejemplo, Victor 1420, Perkin Elmer/Wallac). La liberación máxima (LM) y la liberación espontánea (LE) se determinan mediante la incubación de células diana con TX-100 al 1 % y medio solo, respectivamente. La citotoxicidad celular independiente de los anticuerpos (AICC) se mide mediante la incubación de células diana y efectoras en ausencia de una molécula de ensayo, por ejemplo, dlacuerpo de la divulgación. Cada ensayo se realiza preferentemente por triplicado. La media del porcentaje de la lisis específica se calcula como: liberación experimental (ADCC) - AICC)/(LM-LE) x 100.
También se describen ensayos conocidos en la técnica, y se ejemplifican en el presente documento, para caracterizar la unión de C1q y la mediación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) por las moléculas descritas en el presente documento que comprenden los dominios Fc (o partes de los mismos). Para determinar la unión a C1q, puede realizarse un ensayo ELISA de unión a C1q. Un ensayo ilustrativo puede comprender lo siguiente: se pueden recubrir placas de ensayo durante la noche a 4 °C con polipéptido que comprenda una molécula de la divulgación o polipéptido de partida (control) en un tampón de recubrimiento. Después, las placas se lavan y se bloquean. Tras lavar, se puede añadir a cada pocilio una alícuota de C1q humano e incubarse durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras un lavado adicional, se pueden añadir a cada pocilio 100 ul de un anticuerpo de oveja anti-C1q de complemento conjugado a peroxidasa e incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se puede lavar otra vez con tampón de lavado y se pueden añadir a cada pocilio 100 gl de tampón de sustrato que contenga OPD (diclorhidrato de O-fenilendiamina (Sigma)). La reacción de oxidación, observada por la aparición de un color amarillo, puede dejarse actuar durante 30 minutos y detenerse mediante la adición de 100 ul de 4,5 NH2 SO4. Luego se lee la absorbancia a (492-405) nm.
Para evaluar la activación de complemento, se puede realizar un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, según lo descrito en Gazzano-Santoro et al. (1997) "A Non-Radioactive Complement-Dependent Cytotoxicity Assay For Anti-CD20 Monoclonal Antibody", J. Immunol. Methods 202:163-171. Resumiendo, se pueden diluir con tampón diversas concentraciones de la molécula que comprende un dominio Fc (variante) (o parte del mismo) y complemento humano. Las células que expresan el antígeno al que se une la molécula de diacuerpo pueden diluirse hasta una densidad de aproximadamente 1 x106 células/ml. Se pueden añadir mezclas de las moléculas de diacuerpo que comprenden un dominio Fc (variante) (o parte del mismo), complemento humano diluido y células que expresan el antígeno a una placa de 96 pocilios para cultivo tisular, de fondo plano y dejarse incubar durante 2 horas a 37 °C y CO2 al 5 % para facilitar la lisis celular mediada por el complemento. Se pueden añadir entonces 50 ul de azul de alamar (Accumed International) a cada pocilio e incubarse durante la noche a 37 °C. Se mide la absorbancia usando un fluorómetro de 96 pocilios con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados pueden expresarse en unidades de fluorescencia relativa (UFR). Las concentraciones de la muestra se pueden calcular a partir de una curva patrón y el porcentaje de actividad en comparación con la molécula no variante, es decir, una molécula que no comprende un dominio Fc o que comprende un dominio Fc no variante, se reporta para la variante de interés.
5.4.3 OTROS ENSAYOS
Las moléculas de la divulgación que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc se pueden ensayar usando cualquiera de los ensayos basados en la resonancia de plasmón superficial conocidos en la técnica para caracterizar los parámetros cinéticos de un dominio de unión al antígeno o unión Fc-FcyR. Cualquier instrumento de SPR disponible en el comercio incluyendo, pero sin limitación, los instrumentos BIAcore, disponibles de Biacore AB (Uppsala, Suecia); los instrumentos IAsys disponibles de Affinity Sensors (Franklin, mA.); el sistema IBIS disponible de Windsor Scientific Limited (Berks, RU), los sistemas SPR-CELLIA disponibles de Nippon Laser y Electronics Lab (Hokkaido, Japón), y SPR Detector Spreeta disponible de Texas Instruments (Dallas, TX) se pueden usar. Para más información sobre la tecnología basada en SPR, véase Mullet et al. (2000) "Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays", Methods 22: 77-91; Dong et al. (2002) "Some new aspects in biosensors", Reviews in Mol. Biotech. 82: 303-23; Fivash et al. (1998) "BIAcore For Macromolecular Interaction", Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al. (2000) "Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis", Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61. Adicionalmente, cualquiera de los instrumentos SPR y los métodos basados en SPR para medir las interacciones proteína-proteína descritos en las patentes de EE. Uu . números 6.373.577; 6.289.286; 5.322.798; 5.341.215; 6.268.125, se contemplan en los métodos del presente documento.
Resumiendo, los ensayos basados en SPR implican la inmovilización de un miembro de un par de unión en una superficie y el control de su interacción con el otro miembro del par de unión en solución y en tiempo real. El análisis de SPR se basa en la medición del cambio del índice de refracción del disolvente cerca de la superficie que sucede tras la formación o disociación del complejo. La superficie en la que ocurre la inmovilización es la microplaca de sensor, que está en el núcleo de la tecnología SPR; que consiste en una superficie de vidrio recubierta con una capa delgada de oro y que forma la base para una selección de superficies especializadas diseñadas para optimizar la unión de una molécula a la superficie. En el mercado, se dispone de una variedad de microplacas, en especial, de las empresas que se han enumerado anteriormente, todos los cuales se pueden usar en los métodos del presente documento. Los ejemplos de microplacas de sensor incluyen las disponibles en BIAcore AB, Inc., por ejemplo, microplaca de sensor CM5, SA, NTA y HPA. Se puede inmovilizar una molécula de la divulgación sobre la superficie de un microplaca de sensor usando cualquiera de los métodos y las químicas de inmovilización que se conocen en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, el acoplamiento covalente directo mediante grupos amina, el acoplamiento covalente directo mediante grupos sulfhidrilo, la unión de biotina a una superficie recubierta con avidina, el acoplamiento de aldehido a grupos hidrato de carbono y la unión mediante la marcador de histidina con microplacas de NTA.
En algunas realizaciones, los parámetros cinéticos de la unión de las moléculas de la divulgación que comprenden múltiples sitios de unión a epitopo y, opcionalmente, un dominio Fc, a un antigeno o un FcyR se pueden determinar usando un instrumento BIAcore (por ejemplo, instrumento BIAcore 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ). Como se ha tratado anteriormente, véase el apartado 5.4.1, se puede usar cualquier FcyR para evaluar la unión de las moléculas descritas en el presente documento cuando al menos un sitio de unión a epitopo de la molécula de diacuerpo reconoce de manera inmunoespecifica un FcyR, y/o cuando la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc (o parte del mismo). En una realización especifica, el FcyR es FcyRIIIA, preferentemente un FcyRNIA monomérico soluble. Por ejemplo, en una realización, el FcyRIIIA monomérico soluble es la región extracelular de FcyRIIIA unida a la secuencia enlazadora-AVITAG. En otra realización especifica, el FcyR es FcyRIIB, preferentemente, un FcyRIIB dimérico soluble.
En todos los ensayos inmunológicos, el reconocimiento/la unión de FcyR con una molécula descrita en el presente documento se puede efectuar mediante múltiples dominios: en determinados ejemplos, las moléculas descritas en el presente documento reconocen de manera inmunoespecifica un FcyR a través de uno de los múltiples dominios de unión a epitopo; en otros ejemplos más, cuando la molécula descrita en el presente documento contiene un dominio Fc (o parte del mismo), la molécula de diacuerpo puede reconocer de manera inmunoespecifica un FcyR por las interacciones de Fc-FcyR; en otros ejemplos más, cuando una molécula descrita en el presente documento comprende un dominio Fc (o parte del mismo) y un sitio de unión a epitopo que reconoce de manera inmunoespecifica un FcyR, la molécula de diacuerpo puede reconocer un FcyR a través de un dominio de unión al epitopo o el dominio Fc (o parte del mismo). Un ensayo ilustrativo para determinar los parámetros cinéticos de una molécula que comprende múltiples dominios de unión al epitopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo) a un antigeno y/o un FcyR usando un instrumento BIAcore, comprende lo siguiente: se inmoviliza un primer antigeno en una de las cuatro celdas de flujo de una superficie de microplaca de sensor, preferentemente mediante química de acoplamiento con amina de modo que aproximadamente 5.000 unidades de respuesta (UR) de dicho primer antigeno se inmovilicen en la superficie. Una vez que se prepara una superficie apropiada, las moléculas descritas en el presente documento que reconocen de manera inmunoespecifica el primer antigeno se pasan por la superficie, preferentemente, mediante inyecciones de un minuto de una solución 20 gg/ml a un caudal de 5 gl/ml. Los niveles de moléculas descritas en el presente documento unidas a la superficie en esta etapa normalmente varian entre 400 y 700 UR. A continuación, se inyectan series de diluciones de un segundo antigeno (por ejemplo, FcyR) o el receptor FcyR en el tampón HBS-P (HEPES 20 mM, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, pH 7,5) sobre la superficie a 100 gl/min. La regeneración de las moléculas entre diferentes diluciones del segundo antigeno o el receptor se lleva a cabo preferentemente mediante inyecciones individuales de 5 segundos de NaHCÜ3 100 mM, pH 9,4; NaCI 3 M. Cualquier técnica de regeneración conocida en la técnica se contempla en el método del presente documento.
Una vez que se recopila todo el conjunto de datos, las curvas de unión resultantes se ajustan de manera global usando algoritmos de cálculo suministrados por el fabricante del instrumento de SPR, por ejemplo, BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ). Estos algoritmos calculan las constantes Kon y Koff, a partir de las que se deduce la constante de unión en equilibrio aparente, Kd se deduce como el cociente de las dos constantes de velocidad (es decir, Koff/Kon). Se pueden encontrar tratamientos más detallados de cómo se derivan cada una de las constantes de velocidad en el manual del software BIAevaluation (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). El análisis de los datos derivados se puede realizar usando cualquier método conocido en la técnica. Para más información sobre diversos métodos de interpretación de los datos cinéticos generados, véase Myszka (1997) "Kinetic Analysis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors", Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7; Fisher et al. (1994) "Surface Plasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of Biomolecular Interactions", Current Opinion in Biotechnology 5: 389-95; O'Shannessy (1994) "Determination Of Kinetic Rate And Equilibrium Binding Constants For Macromolecular Interactions: A Critique Of The Surface Plasmon Resonance Literature", Current Opinion in Biotechnology, 5:65-71; Chaiken et al. (1992) "Analysis Of Macromolecular Interactions Using Immobilized Ligands", Analytical Biochemistry, 201: 197-210; Morton et al. (1995) "Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors: A Comparison Of Analysis By Linearization, The Integrated Rate Equation, And Numerical Integration", Analytical Biochemistry 227: 176-85; O’Shannessy et al., 1996, Analytical Biochemistry 236: 275-83.
En las realizaciones preferidas, los parámetros cinéticos determinados usando un análisis de SPR, por ejemplo, BIAcore, pueden usarse como una medida predictiva de cómo funcionará una molécula descrita en el presente documento en un ensayo funcional, por ejemplo, ADCC. Un método ilustrativo para predecir la eficacia de una molécula de la divulgación basándose en los parámetros cinéticos obtenidos de un análisis de SPR puede comprender lo siguiente: determinar los valores de Koff para la unión de una molécula descrita en el presente documento a FcyRIIIA y FcyRIIB (mediante un dominio de unión al epitopo y/o un dominio Fc (o parte del mismo)); representar gráficamente (1) Koff (de tipo siIvestre)/Koff (mutante) para FcyRIIIA; (2) Koff (mutante)/Koff (de tipo silvestre) para FcyRIIB frente a los datos de ADCC. Los números superiores a uno muestran una menor velocidad de disociación para FcyRIIIA y una mayor velocidad de disociación para FcyRIIB respecto al de tipo silvestre; y presenta una función ADCC mejorada.
5.5 m éto d o s par a pr o d u c ir m o lé c u la s de d ia c u e r p o de la in ven c ió n
Las moléculas de diacuerpo de la presente Invención pueden producirse usando diversos métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo la síntesis de proteína de novo y la expresión recombinante de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión. Las secuencia de ácidos nucleicos deseadas se pueden producir mediante métodos recombinantes (por ejemplo, mutagénesis por PCR de una variante previamente preparada del polinucleótido deseado) o mediante síntesis del ADN en fase sólida. Normalmente, se usan métodos de expresión recombinante. En un aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un VH y/o VL para CD16A de acuerdo con la reivindicación 1 del presente documento; en otro aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un VH y/o VL para CD32B de acuerdo con la reivindicación 1 del presente documento. A causa de la degeneración del código genético, una variedad de secuencias de ácido nucleico codifican cada secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina, y la presente descripción incluye todos los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión descritas en el presente documento.
5.5.1 POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN LAS MOLÉCULAS DE LA INVENCIÓN
También se describen polinucleótidos que codifican las moléculas de la divulgación, incluyendo los polipéptidos y anticuerpos. Se pueden obtener los polinucleótidos que codifican las moléculas de la divulgación, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos se puede determinar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Una vez determinada la secuencia de nucleótidos de las moléculas que son identificadas mediante los métodos del presente documento, la secuencia de nucleótidos se puede modificar por ingeniería usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; y Ausubel et al., eds., 1998, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY), generando, por ejemplo, Anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo, generando sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos.
En una realización, las bibliotecas humanas o cualquier otra biblioteca disponible en la técnica, pueden examinarse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, para clonar los ácidos nucleicos que codifiquen las moléculas de la divulgación.
5.5.2 EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE LAS MOLÉCULAS DE LA INVENCIÓN
Una vez que se ha obtenido una secuencia de ácido nucleico codifica moléculas de la divulgación (es decir,, anticuerpos), puede producirse el vector para la producción de las moléculas mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Pueden usarse métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen las secuencias codificantes para las moléculas de la divulgación y las señales de control de transcripción y traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. (Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubel et al. eds., 1998, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY).
Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de una molécula identificada mediante los métodos del presente documento se puede transferir a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposomal y precipitación con fosfato de calcio) y cultivarse después las células transfectadas mediante las técnicas convencionales para producir las moléculas de la divulgación. En realizaciones específicas, la expresión de las moléculas de la divulgación está regulada por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.
Las células hospedadoras que se usan para expresar las moléculas identificadas mediante los métodos del presente documento pueden ser células bacterianas tales como Escherichia coli o, preferentemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula de inmunoglobulina recombinante completa. En particular, células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como un elemento promotor mayor del gen temprano intermedio procedente del citomegalovirus humano son un sistema de expresión eficaz para las inmunoglobulinas (Foecking et al. (1986) "Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors", Gene 45:101-106; Cockett et al. (1990) "High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hámster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification", Biotechnology 8:662-667).
Se puede utilizar una variedad de sistemas vectoriales de expresión en el hospedador para expresar las moléculas identificadas mediante los métodos del presente documento. Dichos sistemas de expresión en el hospedador representan vehículos mediante los que se pueden producir las secuencias de codificación de las moléculas de la divulgación y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfeetan con las secuencias que codifican Ios nuoleófidos adecuados, expresan las moléculas de la divulgación in situ. Estos incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformado con ADN de bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN plásmido o ADN cósmido que contienen secuencias codificantes para las moléculas identificadas por los métodos del presente documento; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos del presente documento; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión recombinante de virus (por ejemplo, baculovirus) que contengan las secuencias codificantes de las moléculas identificadas mediante los métodos del presente documento; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco (TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos del presente documento; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 293T, células 3T3, células linfocíticas (véase el documento US 5.807.715), células Per C.6 (células retinianas humanas desarrolladas por Crucell) que albergan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus); el promotor 7.5K del virus vaccinia).
En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar de forma ventajosa una serie de vectores de expresión dependiendo del uso previsto de la molécula que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicha proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de un anticuerpo, se pueden desear vectores que dirijan la expresión de elevados niveles de productos de proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, aunque sin limitación, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Rüther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones", EMBO J. 2:1791 -1794), en el que la secuencia que codifica el anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en marco con la región que codifica lac Z de manera que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The Ipp Gene Of Escherichia Coli", Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli", J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Se pueden usar también vectores pGEX para expresar los polipéptido foráneos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a perlas de una matriz de glutatión-agarosa seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de la proteasa de la trombina o de la proteasa del factor Xa de tal manera que el producto del gen diana clonado puede liberarse del resto GST.
En un sistema de insecto, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica el anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).
En células hospedadoras de mamífero, se pueden utilizar numerosos sistemas de expresión basados en virus. En los casos donde se usa un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia que codifica el anticuerpo de interés se puede ligar a un complejo de control de la transcripción/traducción adenovírico, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. A continuación, se puede insertar este gen quimérico en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de inmunoglobulina en huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). Para la traducción eficaz de las secuencias codificantes de anticuerpos insertadas también pueden ser necesarias señales de inicio específicas. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de toda la inserción. Estas señales de control de la traducción exógenas y los codones de inicio pueden ser de una variedad de orígenes, naturales y sintéticos. La eficacia de expresión se puede mejorar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de la transcripción, etc. (Véase Bitter et al. (1987) "Expression And Secretion Vectors For Yeast", Methods in Enzymol. 153:516-544).
Además, se puede seleccionar una cepa de célula hospedadora que module o modifique la expresión de las secuencias insertadas y procese el producto génico en la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos de la proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los polipéptidos que comprenden una molécula de diacuerpo de la divulgación se pueden expresar como un solo producto génico (por ejemplo, como una sola cadena polipeptídica, es decir, como precursor de poliproteína), que requiere la escisión proteolítica mediante mecanismos celulares nativos o recombinantes para formar polipéptidos separados de las moléculas de diacuerpo de la divulgación. También se describe la modificación por ingeniería de una secuencia de ácido nucleico para codificar una molécula precursora de poliproteína que contenga los polipéptidos de la divulgación, que incluye secuencias codificantes capaces de dirigir la escisión posterior a la traducción del precursor de poliproteína. La escisión posterior a la traducción del precursor de poliproteína produce los polipéptidos de la divulgación. La escisión postraduccional de la molécula precursora que comprende Ios polipéptidos de la divulgación puede ocurrir in vivo (es decir, dentro de la célula hospedadora mediante sistemas/mecanismos de células nativas o recombinantes, por ejemplo, escisión de furina en un sitio apropiado) o puede ocurrir in vitro (por ejemplo, la incubación de dicha cadena polipeptídica en una composición que comprende proteasas o peptidasas de actividad conocida y/o en una composición que comprende condiciones o reactivos que se sabe que fomentan la acción proteolítica deseada). La purificación y modificación de las proteínas recombinantes es bien conocida en la técnica, de modo que el diseño del precursor de poliproteína podría incluir una serie de realizaciones fáciles de apreciar por el trabajador experto. Cualquiera de las proteasas o peptidasas conocidas en la técnica se puede usar para la modificación descrita de la molécula precursora, por ejemplo, trombina (que reconoce la secuencia de aminoácidos LVPRaGS (SEQ ID NO: 89)), o el factor Xa (que reconoce la secuencia de aminoácidos I(E/D)GRa (SEQ ID NO:90) (Nagai et al. (1985) "Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli", Proc. Nat. Acad. Sci.UsA 82:7252-7255, y revisado en Jenny et al. (2003) "A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa", Protein Expr. Purif. 31:1-11)), enterocinasa (que reconoce la secuencia de aminoácidos DDDDKa (SEQ ID NO: 91) (Collins-Racie et al. (1995) "Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA", Biotechnology 13:982-987)), furina (que reconoce la secuencia de aminoácidos RXXRa, con preferencia por RX(K/R)Ra (SEQ ID NO:92 y SeQ ID NO:93, respectivamente) (R adicional en la posición P6 parece potenciar la escisión)), y AcTEV (que reconoce la secuencia de aminoácidos ENLYFQaG (SEQ ID NO:94) (Parks et al. (1994) "Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase", Anal. Biochem. 216:413-417)) y la proteasa C3 del virus de la fiebre aftosa. Véanse, por ejemplo, apartado 6.4, anteriormente citado.
Diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación posterior a la traducción de las proteínas y productos génicos. Se pueden seleccionar estirpes de células adecuadas o sistemas hospedadores para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Con este fin, se pueden usar células hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, la glucosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero sin limitación, células CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.
Para producción a largo y con alto rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden modificar por ingeniería las estirpes celulares que expresan de manera estable un anticuerpo de la divulgación. En lugar de usar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotores, potenciadores, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN foráneo, pueden dejarse crecer las células modificadas mediante ingeniería durante 1-2 días en un medio enriquecido, y a continuación, cambiarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos que, a la vez, puedan clonarse y expandirse en estirpes de células. Este método se puede usar de forma ventajosa para modificar mediante ingeniería estirpes de células que expresen los anticuerpos de la divulgación. Dichas estirpes de células modificadas mediante ingeniería pueden ser particularmente útiles en la exploración y la evaluación de compuestos que interactúan directa o indirectamente con las moléculas de la divulgación.
Se puede usar una serie de sistemas de selección, incluyendo, pero sin limitación, los genes de timidina cinasa del virus de herpes simple (Wigler et al. (1977) "Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells", Cell 11: 223-232), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska et al. (1992) "Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells: First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy", Bioessays 14: 495-500) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al. (1980) "Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hámster aprt Gene", Cell 22: 817-823) genes que se pueden emplear en células tk-, hgprt o aprt, respectivamente. Asimismo, se puede usar la resistencia antimetabolitos como la base de selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al. (1980) "Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076); neo, confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions", Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy", Science 260:926-932; y Morgan et al. (1993) "Human Gene Therapy", Ann. Rev. Biochem. 62:191-217) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells", Gene 30:147-156). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et al. (eds.), 1993, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al, (1981) "A New Dominant Hybrid Seleetive Marker For Higher Eükaryotio Cells", J. Mol. Biol. 150:1-14.
Se pueden aumentar los niveles de expresión de una molécula de la divulgación mediante la amplificación del veotor (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, Nueva York, 1987). Cuando un marcador en el sistema de vectores que expresa un anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucleótidos de un polipéptido de la molécula de diacuerpo, también aumentará la producción del polipéptido (Crouse et al. (1983) "Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes", Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
La célula hospedadora puede transfectarse simultáneamente con dos vectores de expresión, codificando el primer vector el primer polipéptido de la molécula de diacuerpo, y codificando el segundo vector el segundo polipéptido de la molécula de diacuerpo. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permitan la expresión de ambos polipéptidos. Como alternativa, se puede usar un solo vector que codifique ambos polipéptidos. Las secuencias codificantes para los polipéptidos de las moléculas de la divulgación pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que una molécula de la divulgación (es decir,, diacuerpos) se ha expresado de forma recombinante, se puede purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de polipéptidos, poliproteínas o diacuerpos (por ejemplo, análogos a los esquemas de purificación de anticuerpos basados en la selectividad del antígeno), por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico (opcionalmente después de la selección de la Proteína A donde la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc (o parte del mismo)), y cromatografía en columna de separación por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de polipéptidos, poliproteínas o diacuerpos.
5.6 m é to d o s p r o filá c t ic o s y t e r a p é u t ic o s
Las moléculas de la divulgación son particularmente útiles para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, trastorno o infección donde se desea una función de las células efectoras (por ejemplo, ADCC) mediada por FcyR (por ejemplo, cáncer, enfermedad infecciosa). Como se ha tratado anteriormente, los diacuerpos de la invención pueden presentar funcionalidad de tipo anticuerpo para generar una función efectora, aunque la molécula de diacuerpo no comprenda un dominio Fc. Al comprender al menos un dominio de unión al epítopo que reconozca de manera inmunoespecífica un FcyR, la molécula de diacuerpo puede presentar unión a FcyR y actividad análogas a las interacciones de Fc-FcyR. Por ejemplo, las moléculas de la divulgación pueden unirse a un antígeno de superficie celular y un FcyR (por ejemplo, FcyRIIIA) en una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, linfocito NK), estimulando una función efectora (por ejemplo, ADCC, CDC, fagocitosis, opsonización, etc.) contra dicha célula.
También se describe que, la molécula de diacuerpo descrita en el presente documento comprende un dominio Fc (o parte del mismo). En dichas realizaciones, el dominio Fc puede comprender además al menos una modificación de aminoácido en relación con el dominio Fc de tipo silvestre (o parte del mismo) y/o puede contener dominios de uno o más isotipos de IgG (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4). Las moléculas de la invención que comprenden dominios Fc variantes pueden presentar fenotipos conferidos o modificados con respecto a las moléculas que comprenden el dominio Fc de tipo silvestre, tal como una actividad de función efectora modificada o conferida (por ejemplo, ensayada en un ensayo dependiente de linfocitos NK o dependiente de macrófagos). Además, las moléculas descritas en el presente documento con actividad de función efectora conferida o modificada son útiles para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, un trastorno o una infección cuando se desea una eficacia mejorada de la actividad de la función efectora. Como alternativa, las moléculas de diacuerpo descritas en el presente documento que comprenden un dominio Fc (o parte del mismo) median en la cascada dependiente del complemento. Las variantes del dominio Fc identificadas como modificadoras de la función efectora se desvelan en la solicitud internacional WO04/063351, las publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos 2005/0037000 y 2005/0064514 y las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.22006-0134709 A1, presentada el 10 de noviembre de 2005, y 2006-0177439 A1, presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitudes concurrentes de los inventores.
También se describen métodos y composiciones para el tratamiento, la prevención o el control de un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas que comprenden uno o más sitios de unión al epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo) diseñado como se describe en el presente documento, molécula que se una a un antígeno del cáncer. Las moléculas de la divulgación son particularmente útiles para la prevención, la inhibición, la reducción del crecimiento o la regresión de tumores primarios, metástasis de células cancerosas y enfermedades infecciosas. Aunque no se pretende quedar limitado a ningún mecanismo de acción en particular, las moléculas de la divulgación median en la función efectora produciendo el aclaramiento del tumor, la disminución del tumor o una combinación de los mismos. En realizaciones alternativas, los diacuerpos de la divulgación median en la actividad terapéutica mediante reticulación de antígenos y/o receptores de superficie celular y potencian la apoptosis o la señalización de Ios reguladores negativos del crecimiento.
Aunque no se pretende quedar limitado a ningún mecanismo de acción en particular, las moléculas de diacuerpo de la divulgación presentan una mejor eficacia terapéutica con respecto a los anticuerpos terapéuticos conocidos en la técnica, en parte, debido a la capacidad del diacuerpo de unirse de manera inmunoespecífica a una célula diana que exprese un antígeno específico (por ejemplo, FcyR) a niveles reducidos, por ejemplo, en virtud de la capacidad del diacuerpo de permanecer en la célula diana más tiempo debido a una mejor avidez de la interacción de diacuerpoepítopo.
Los diacuerpos de la divulgación con mejores afinidad y avidez por los antígenos (por ejemplo, FcyR) son particularmente útiles para el tratamiento, la prevención o el control de un cáncer, u otras enfermedades o trastornos, en un sujeto, en el que los FcyR se expresan a niveles bajos en las poblaciones de células diana. Como se usa en el presente documento, la expresión de FcyR en células se define en términos de la densidad de dichas moléculas por célula, medida usando los métodos comunes conocidos por los expertos en la materia. Las moléculas descritas en el presente documento que comprenden múltiples sitios de unión a epítopos y, opcionalmente, un FcyR (o parte del mismo) preferentemente también tienen una avidez y afinidad y/o función efectora conferida o potenciada en células que expresan un antígeno diana, por ejemplo, un antígeno del cáncer, a una densidad de 30.000 a 20.000 moléculas/célula, a una densidad de 20.000 a 10.000 moléculas/célula, a una densidad de 10.000 moléculas/célula o inferior, a una densidad de 5.000 moléculas/célula o inferior o a una densidad de 1.000 moléculas/célula o inferior. Las moléculas de la divulgación tienen utilidad particular para el tratamiento, la prevención o el control de una enfermedad o de un trastorno, tales como el cáncer, en una subpoblación, en las que el antígeno diana se expresa a niveles bajos en la población de células diana.
Las moléculas de la divulgación también se pueden utilizar ventajosamente en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos por el tratamiento o la prevención de enfermedades, tales como el cáncer, enfermedad autoinmunitaria, trastornos inflamatorios y enfermedades infecciosas. las moléculas de la divulgación pueden usarse en combinación con anticuerpos monoclonales o quiméricos, linfocinas o factores de crecimiento hematopoyético (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), que, por ejemplo, sirven para aumentar el número o la actividad de las células efectoras que interactúan con las moléculas y aumentar la respuesta inmune. Las moléculas de la divulgación también pueden utilizarse ventajosamente en combinación con uno o más fármacos utilizados para tratar una enfermedad, trastorno o infección tal como, por ejemplo, agentes anticancerosos, agentes antiinflamatorios o agentes antivirales, por ejemplo, como se detalla en el apartado 5.7.
5.6.1 CÁNCERES
También se describen métodos y composiciones para el tratamiento o la prevención del cáncer en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más moléculas que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo. También se describen métodos y composiciones para el tratamiento o la prevención del cáncer en un sujeto con polimorfismos de FcyR, como los homocigotos para los alelos FyKIIIA-158V o FcyKIIIA-158F. También se describe la ingeniería de al menos un dominio de unión a epítopo de la molécula de diacuerpo para unirse inmunoespecíficamente a FcyRIIIA (158F). También se describe la ingeniería de al menos un dominio de unión a epítopo de la molécula de diacuerpo para unirse inmunoespecíficamente a FcyRIIIA (158V).
La eficacia de la terapia convencional con anticuerpos monoclonales depende del polimorfismo del FcyR del sujeto (Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcRIIIa Gene", Blood 99: 754-758; Weng et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma", J Clin Oncol.
21(21):3940-3947). Estos receptores son expresados en la superficie de células efectoras y median en la ADCC. Los alelos de alta afinidad de los receptores activadores de baja afinidad, mejoran la capacidad de las células efectoras para intervenir en la ADCC. Al contrario que la dependencia de las interacciones de Fc-FcyR para efectuar la función efectora, los métodos del presente documento abarcan la ingeniería de moléculas para reconocer inmunoespecíficamente los receptores de activación de baja afinidad, permitiendo que las moléculas sean diseñadas para un polimorfismo específico. Como alternativa o además, la molécula descrita en el presente documento puede modificarse por ingeniería para que comprenda un dominio Fc variante que presente afinidad potenciada para FcyR (con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre) en las células efectoras. Las moléculas modificadas por ingeniería descritas en el presente documento proporcionan mejores reactivos para inmunoterapia para tratar a pacientes, independientemente de su polimorfismo de FcyR.
Las moléculas de diacuerpo modificadas por ingeniería de acuerdo con la divulgación se analizan mediante ADCC usando una estirpe celular cultivada o células PMBC derivadas del paciente para determinar la capacidad de las mutaciones Fc para potenciar la ADCC. La técnica ADCC convencional se realiza usando los métodos que se desvelan en el presente documento. Se recogen linfocitos de sangre periférica usando un gradiente Ficoll-Paque (Pharmacia). Células diana, es decir, las estirpes celulares cultivadas o células derivadas del paciente, se cargan con europio (PerkinElmer) y se incuban con los efectores durante 4 h a 372C. El europio liberado es detectado usando un lector de placas fluorescentes (Wallac). Los datos de ADCC resultantes indican la eficacia de las moléculas de la divulgación para generar la cltotoxlcldad mediada por Ios llnfocltos NK y establecer qué moléculas pueden ser anallzarse con las muestras del paclente y monocltos elutrlados. A contlnuaclón, se anallzan las moléculas de dlacuerpo que presenten el potenclal más alto para generar la actlvldad ADCC en un ensayo ADCC usando las PBMC de los paclentes. Como células efectoras, se usan células PBMC de donantes sanos.
Tamblén se descrlben métodos de prevenclón o tratamlento del cáncer caracterlzado por un antígeno del cáncer, modlflcando por lngenlería la molécula de dlacuerpo para que reconozca de manera lnmunoespecíflca el antígeno del cáncer, de modo que la molécula de dlacuerpo sea por sí mlsma cltotóxlca (por ejemplo, medlante los retlculaclón de los receptores de superflcle que conducen a la apoptosls o regulaclón negatlva aumentada de señales prollferatlvas) y/o comprende un domlnlo Fc, de acuerdo con la dlvulgaclón, y/o medla en una o más funclones efectoras (por ejemplo, ADCC, fagocltosls). Los dlacuerpos que han sldo dlseñados de acuerdo con la dlvulgaclón son útlles para la prevenclón o el tratamlento del cáncer, puesto que estos tlenen una actlvldad cltotóxlca (por ejemplo, mayor capacldad de destrucclón de las células tumorales y/o mejor, por ejemplo, actlvldad ADCC o CDC).
Los cánceres asoclados con un antígeno del cáncer pueden tratarse o prevenlrse medlante la admlnlstraclón de un dlacuerpo que se una a un antígeno del cáncer y sea cltotóxlco, y/o haya sldo modlflcado por lngenlería de acuerdo con los métodos del presente documento para presentar una funclón efectora. Por ejemplo, pero sln Ilmltaclón, los cánceres asoclados con los slgulentes antígenos del cáncer se pueden tratar o prevenlr con los métodos y composlclones descrltos: antígeno de pan-carclnoma KS 1/4 (Perez et al. (1989) "Isolatlon And Characterlzatlon Of A Cdna Encodlng The Ks1/4 Eplthellal Carclnoma Marker", J. Immunol. 142:3662-3667; Moller et al. (1991) "Blspeclflc-Monoclonal-Antlbody-Dlrected Lysls Of Ovarlan Carclnoma Cells By Actlvated Human T Lymphocytes", Cáncer Immunol. Immunother. 33(4):210-216), antígeno de carclnoma de ovarlo (CA125) (Yu et al. (1991) "Coexpresslon Of Dlfferent Antlgenlc Markers On Moletles That Bear CA 125 Determlnants", Cáncer Res. 51(2):468-475), fosfato ácldo prostátlco (Tallor et al. (1990) "Nucleotlde Sequence Of Human Prostatlc Acld Phosphatase Determlned From A Full-Length cDNA Clone", Nucl. Aclds Res. 18(16):4928), antígeno específlco de próstata (Henttu et al. (1989) "cDNA Codlng For The Entlre Human Prostate Speclflc Antlgen Shows Hlgh Homologles To The Human Tlssue Kalllkreln Genes", Blochem. Blophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israell et al. (1993) "Molecular Clonlng Of A Complementary DNA Encodlng A Prostate-Speclflc Membrane Antlgen", Cáncer Res. 53:227-230), antígeno p97 asoclado a melanoma (Estln et al. (1989) "Transfected Mouse Melanoma Llnes That Express Varlous Levels Of Human Melanoma-Assoclated Antlgen p97", J. Natl. Cáncer Inst. 81(6):445-454), antígeno gp75 de melanoma (Vljayasardahl et al. (1990) "The Melanoma Antlgen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product", J. Exp. Med. 171 (4):1375-1380), antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) (Natall et al. (1987) "Immunohlstochemlcal Detectlon Of Antlgen In Human Prlmary And Metastatlc Melanomas By The Monoclonal Antlbody 140.240 And Its Posslble Prognostlc Slgnlflcance", Cancer 59:55-63; Mlttelman et al. (1990) "Actlve Speclflc Immunotherapy In Patlents Wlth Melanoma. A Cllnlcal Trlal Wlth Mouse Antlldlotyplc Monoclonal Antlbodles Ellclted Wlth Syngenelc Antl-Hlgh-Molecular-Welght-Melanoma-Assoclated Antlgen Monoclonal Antlbodles", J. Clln. Invest. 86:2136-2144)), antígeno de membrana específlco de la próstata, antígeno carclnoembrlonarlo (CEA) (Foon et al. (1995) "Immune Response To The Carclnoembryonlc Antlgen In Patlents Treated Wlth An Antl-Idlotype Antlbody Vacclne", J. Clln. Invest. 96(1):334-42), antígeno de muclna epltellal pollmórflca, antígeno de glóbulos grasos de leche humana, antígenos asoclados con tumor colorrectal tales como: CEA, TAG-72 (Yokota et al. (1992) "Rapld Tumor Penetratlon Of A Slngle-Chaln Fv And Comparlson Wlth Other Immunoglobulln Forms", Cáncer Res. 52:3402-3408), CO17-1A (Ragnhammar et al. (1993) "Effect Of Monoclonal Antlbody 17-1A And GM-CSF In Patlents Wlth Advanced Colorectal Carclnoma - Long-Lastlng, Complete Remlsslons Can Be Induced", Int. J. Cáncer 53:751-758); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) "Monoclonal Antlbody Detectlon Of A Clrculatlng Tumor-Assoclated Antlgen. I. Presence Of Antlgen In Sera Of Patlents Wlth Colorectal, Gastrlc, And Pancreatlc Carclnoma", J. Clln. Immunol. 2:135-140), CTA-1 y LEA, antígeno de Ilnfoma de Burkltt-38.13, CD19 (Ghetle et al. (1994) "Antl-CD19 Inhlblts The Growth Of Human B-Cell Tumor Llnes In Vltro And Of Daudl Cells In SCID Mlce By Induclng Cell Cycle Arrest", Blood 83:1329-1336), antígeno de Ilnfoma B humano CD20 (Reff et al. (1994) "Depletlon Of B Cells In Vlvo By A Chlmerlc Mouse Human Monoclonal Antlbody To CD20", Blood 83:435-445), CD33 (Sgouros et al. (1993) "Modellng And Doslmetry Of Monoclonal Antlbody M195 (Antl-CD33) In Acute Myelogenous Leukemla", J. Nucl. Med. 34:422-430), antígenos específlcos de melanoma tales como gangllósldo GD2 (Saleh et al. (1993) "Generatlon Of A Human Antl-Idlotyplc Antlbody That Mlmlcs The GD2 Antlgen", J.Immunol., 151, 3390-3398), gangllósldo GD3 (Shltara et al. (1993) "A Mouse/Human Chlmerlc Antl-(Ganglloslde GD3) Antlbody Wlth Enhanced Antltumor Actlvltles", Cáncer Immunol. Immunother. 36:373-380), gangllósldo GM2 (Llvlngston et al. (1994) "Improved Survlval In Stage III Melanoma Patlents Wlth GM2 Antlbodles: A Randomlzed Trlal Of Adjuvant Vacclnatlon Wlth GM2 Ganglloslde", J. Clln. Oncol. 12:1036-1044), gangllósldo GM3 (Hoon et al. (1993) "Molecular Clonlng Of A Human Monoclonal Antlbody Reactlve To Ganglloslde GM3 Antlgen On Human Cancers", Cáncer Res. 53:5244-5250), antígeno superflclal celular de tlpo trasplante específlco de tumor (TSTA) tal como antígenos tumorales lnducldos vírlcamente lncluyendo vlrus de tumores de ADN de antígeno T y antígenos de envolturas de vlrus de tumores de ARN, alfa-fetoproteína de antígeno oncofetal tal como CEA de colon, antígeno oncofetal de tumor de vejlga (Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antlbodles To Cell Surface Antlgens Shared By Chemlcally Induced Mouse Bladder Carclnomas", Cáncer. Res. 45:2210-2188), antígeno de dlferenclaclón tal como antígeno L6 de carclnoma de pulmón humano, L20 (Hellstrom et al. (1986) "Monoclonal Mouse Antlbodles Ralsed Agalnst Human Lung Carclnoma", Cáncer Res. 46:3917-3923), antígenos de flbrosarcoma, antígenoGp37 de Ilnfoclto T de leucemlna humana (Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) "Idlotype Vacclnes Agalnst Human T Cell Leukemia, II. Generation And Charaeterization Of A Monoclonal idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3}", J. Immunol, 141:1398-1403}, neoglicoproteína, esfingolípidos, antígeno de cáncer de mama tal como EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico}, Antígeno HER2 (p185HE 2}, mucina epitelial polimórfica (PEM} (Hilkens et al. (1992} "Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property", Trends in Biochem. Sci. 17:359-363}, antígeno APO-1 de linfocito humano maligno (Trauth et al. (1989} "Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis", Science 245:301-304}, antígeno de diferenciación (Feizi (1985} "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens", Nature 314:53-57} tales como el antígeno I encontrado en eritrocitos fetales y endodermo primario, I(Ma} encontrado en adenocarcinomas gástricos, M18 y M39 encontrados en epitelio mamario, SSEA-1 encontrado en células mieloides, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5 y D.,56-22 encontrados en el cáncer colorrectal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), C14 encontrado en adenocarcinoma colónico, F3 encontrado en adenocarcinoma de pulmón, AH6 encontrado en cáncer gástrico, hapteno Y, Ley encontrado en células de carcinoma embrionario, TL5 (grupo sanguíneo A}, receptor de EGF encontrado en células A431, serie E.| (grupo sanguíneo B} encontrado en cáncer de páncreas, FC10.2 encontrado en células de carcinoma embriónico, adenocarcinoma gástrico, CO-514 (grupo sanguíneo Lea} encontrado en el adenocarcinoma, NS-10 encontrado en adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb}, G49, receptor del EGF, (grupo sanguíneo ALeb/Ley} encontrado en adenocarcinoma de colon, 19.9 encontrado en cáncer de colon, mucinas de cáncer gástrico, T5A7 encontrado en las células mieloides, R24 encontrado en melanoma, 4,2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2, M1:22:25:8 encontrado en células de carcinoma embrionario y SSEA-3, SSEA-4 encontrados en embriones en fase de 4-8 células. En otra realización, el antígeno es un péptido derivado del receptor de linfocitos T de un linfoma de linfocitos T cutáneos (véase, Edelson (1998} "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy", Cáncer J Sci Am. 4:62-71}.
Los cánceres y trastornos relacionados que pueden tratarse o prevenirse mediante los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, los siguientes: leucemias que incluyen, pero sin limitación, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas, tales como leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, eritoleucemia, leucemias y síndrome mielodisplásico, leucemias crónicas incluyendo, pero sin limitación, leucemia mielocítica crónica (granulocítica}, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas; policitemia vera; linfomas, incluyendo pero sin limitación, enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin; mielomas múltiples tales como, pero sin limitación, mieloma indolente, mieloma no secretor, mieloma osteosclerótico, leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma solitario y plasmocitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstrom; gammapatía monoclonal de significado indeterminado; gammapatía monoclonal benigna; enfermedad de la cadena pesada; sarcomas óseos y de tejido conjuntivo, tales como sarcoma óseo, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor maligno de células gigantes, fibrosarcoma óseo, cordoma, sarcoma del periostio, sarcomas de tejidos blandos, angiosarcoma (hemangiosarcoma}, fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, neurilemoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial; tumores cerebrales incluyendo, pero sin limitación, glioma, astrocitoma, glioma del tronco encefálico, ependimoma, oligodendroglioma, tumor no glial, neurinoma acústico, craneofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma de cerebro primario; cáncer de mama, incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma, carcinoma lobular (de células pequeñas}, carcinoma intraductal, cáncer de mama medular, cáncer de mama mucinoso, cáncer de mama tubular, cáncer de mama papilar, enfermedad de Paget y cáncer de mama inflamatorio; cáncer suprarrenal, incluyendo, pero sin limitación, feocromocitoma y carcinoma corticosuprarrenal; cánceres de tiroides tales como, pero sin limitación, cáncer de tiroides papilar o folicular, cáncer de tiroides medular y cáncer de tiroides anaplásico; cáncer de páncreas, incluyendo, pero sin limitación, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina y tumor de células de los islotes o carcinoide; cáncer hipofisario incluyendo, pero sin limitación, enfermedad de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia y diabetes insípida; cáncer de ojos incluyendo, pero sin limitación, melanoma ocular tal como melanoma del iris, melanoma coroideo y melanoma del cuerpo ciliar, y retinoblastoma; cánceres de vagina, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y melanoma; cáncer de vulva, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de células basales, sarcoma y enfermedad de Paget; cánceres cervicouterinos incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma; cánceres de útero, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma endometrial y sarcoma de útero; cánceres de ovario, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma epitelial de ovario, tumor limítrofe, tumor de células germinales y tumor estromal; cánceres esofágicos, incluyendo, pero sin limitación, cáncer escamoso, adenocarcinoma, carcinoma cítico adenoide, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmacitoma, carcinoma verrucoso y carcinoma de células de avena (células pequeñas}; cánceres de estómago incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma, hongo (polipoide}, ulceración, diseminación superficial, diseminación difusa, linfoma maligno, liposarcoma, fibrosarcoma y carcinosarcoma; cánceres de colon; cánceres rectales; cánceres hepáticos incluyendo, pero sin limitación, carcinoma hepatocelular y hepatoblastoma, cánceres de vesícula biliar incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma; colangiocarcinomas, incluyendo, pero sin limitación, de tipo papilar, nodular y difuso; cáncer de pulmón, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de pulmón no microcítico, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermoide}, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes y cáncer de pulmón microcítico; cánceres de testículo, incluyendo, pero sin limitación, tumor germinal, seminoma, anaplásico, clásico (típico}, espermatocítico, no seminoma, carcinoma embriónico, carcinoma teratómico, coriocarcinoma (tumor del saco vitelino}, cánceres de próstata incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma; cánceres del pene; cánceres bucales incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas; cánceres básales; cánceres de glándulas salivales Incluyendo, pero sin limitación, adenocarclnoma, carcinoma mucoepidermoide y carcinoma adenoidquístico; cánceres de faringe, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de células escamosas y verrugoso; cánceres de piel, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas y melanoma, melanoma de diseminación superficial, melanoma nodular, melanoma maligno lentigo, melanoma acral lentiginoso; cánceres renales, incluyendo, pero sin limitación, cáncer de células renales, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrosarcoma, cáncer de células transicionales (pelvis renal y/o uréter); tumor de Wilms; cánceres de vejiga, incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células transicionales, cáncer de células escamosas, adenocarcinoma, carcinosarcoma. Además, los cánceres incluyen mixosarcoma, sarcoma osteogénico, endoteliosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar y adenocarcinomas papilares (para más información sobre dichos trastornos, véase, Fishman et al. (1985) Medicine, 2.a Ed., J.B. Lippincott Co., Filadelfia; y Murphy et al. (1997) Informed Decisions: The Complete Book of Cáncer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books EE.ÜÜ., Inc., Estados Unidos de América).
Por consiguiente, Los métodos y composiciones descritos en el presente documento también son útiles en el tratamiento o prevención de una variedad de cánceres u otras enfermedades proliferativas anormales, incluyendo (pero sin limitación) los siguientes: carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, próstata, cuello del útero, tiroides y piel; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Burkett; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma. También se contempla que los cánceres ocasionados por aberraciones de la apoptosis también serían tratados mediante los métodos y las composiciones descritos en el presente documento. Dichos cánceres pueden incluir, pero sin limitación, linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones de p53, tumores de mama, próstata y ovario dependientes de hormonas y lesiones precancerosas, tales como poliposis adenomatosa familiar y síndromes mielodisplásicos. En realizaciones específicas, el tumor maligno o los cambios disproliferativos (tales como metaplasias y displasias) o trastornos hiperproliferativos, se tratan y previenen mediante los métodos y las composiciones descritos en el presente documento en el ovario, vejiga, mama, colon, pulmón, piel, páncreas o útero. En otras realizaciones específicas, sarcoma, el melanoma o la leucemia se trata o previene mediante los métodos y composiciones descritos en el presente documento.
En una realización específica, una molécula descrita en el presente documento (por ejemplo, un diacuerpo que contenga múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo)) inhibe o disminuye el crecimiento de células cancerosas en al menos el 99 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 45 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 35 %, al menos un 30 %, al menos un 25 %, al menos un 20 % o al menos un 10 % con respecto al crecimiento de células cancerosas en ausencia de dicha molécula descrita en el presente documento.
En una realización específica, una molécula descrita en el presente documento (por ejemplo, un diacuerpo que contenga múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo)) destruye las células, o inhibe o disminuye el crecimiento de células cancerosas en al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 100 % mejor que la molécula precursora.
5.6.2 ENFERMEDAD AÜTOINMÜNE Y ENFERMEDADES INFLAMATORIAS
En algunas realizaciones, las moléculas descritas en el presente documento comprenden un dominio de unión al epítopo específico para FcyRIIB y/o un dominio Fc variante (o parte del mismo), Modificado por ingeniería de acuerdo con los métodos del presente documento, presentando dicho dominio Fc mayor afinidad por FcyRIIB y menor afinidad por FcyRIIIA y/o FcyRIIA con respecto al a dominio Fc de tipo silvestre. Las moléculas descritas en el presente documento con dichas características de unión son útiles para regular la respuesta inmunitaria, por ejemplo, para inhibir la respuesta inmunitaria en relación con enfermedades autoinmunes o enfermedades inflamatorias. Aunque no se pretende restringirse a ningún mecanismo de acción, las moléculas de la divulgación con una afinidad por FcyRIIB y/o que comprenden un dominio Fc con una mayor afinidad por FcyRIIB y una menor afinidad por FcyRIIIA y/o FcyRIIA pueden conducir a atenuar la respuesta activadora frente a FcyR y a la inhibición de la capacidad de respuesta celular, y, por tanto, tienen eficacia terapéutica para tratar y/o prevenir un trastorno autoinmunitario.
También se describen métodos para prevenir, tratar o controlar uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio en un sujeto además comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antiinflamatorios. También se describen métodos para la prevención, el tratamiento o el control de uno o más síntomas asociados con una enfermedad autoinmune además comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes inmunomoduladores. El apartado 5.7 proporciona los ejemplos no limitantes de agentes antiinflamatorios y agentes inmunomoduladores.
Los ejemplos de las enfermedades autoinmunes que se pueden tratar administrando las moléculas de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad autoinmune de Addison, enfermedades autoinmunes de las glándulas suprarrenales, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmunes, trombocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, pénfigo ampolloso, cardiomiopatía, esprúe celiaco-dermatitis, síndrome de fatiga crónica y disfunción inmunitaria (CFIDS), Polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, Síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, Síndrome de CREST, enfermedad de las aglutininas frías, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis, Enfermedad de Graves, enfermedad de Guillain-Barre, Tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía de IgA, artritis juvenil, líquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Meniere, enfermedad del tejido conectivo mixto, esclerosis múltiple, diabetes mellitus de tipo 1 y mediada por el sistema inmunitario, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policrondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, Psoriasis, Artritis psoriásica, fenómeno de Raynauld, Síndrome de Reiter, Artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, Síndrome de Sjoegren, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de gigantocitos, colitis ulcerosa, uveítis, Vasculitis tal como vasculitis herpetiforme con dermatitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener. Los ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, pero sin limitación, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía indiferenciada, artropatía indiferenciada, artritis, osteólisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones víricas o bacterianas crónicas. Como se describe en el apartado 2.2.2., algunos trastornos autoinmunes se asocian con un estado inflamatorio. Por lo tanto, existe un solapamiento entre lo que se considera un trastorno autoinmune y un trastorno inflamatorio. Por tanto, algunos trastornos autoinmunes también pueden caracterizarse como trastornos inflamatorios. Los ejemplos de los trastornos inflamatorios que pueden prevenirse, tratarse o controlarse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), trastornos alérgicos, choque séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía indiferenciada, artropatía indiferenciada, artritis, osteólisis inflamatoria e inflamación crónica resultante de infecciones víricas o bacterianas crónicas.
Las moléculas descritas en el presente documento que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para FcyRIIB y/o un dominio Fc variante con una afinidad potenciada por FcyRIIB y una afinidad disminuida por FcyRIIIA también pueden usarse para disminuir la inflamación que experimentan los animales, particularmente mamíferos, con trastornos inflamatorios. En una realización específica, una molécula de la divulgación reduce la inflamación en un animal en al menos un 99 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 60 %, al menos un 50 %, al menos un 45 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 35 %, al menos un 30 %, al menos un 25 %, al menos un 20 % o al menos un 10 % con respecto a la inflamación en un animal, al que no se haya administrado dicha molécula.
Las moléculas descritas en el presente documento que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para FcyRIIB y/o un dominio Fc variante con afinidad potenciada por FcyRIIB y afinidad disminuida por FcyRIIIA también pueden usarse para prevenir el rechazo a trasplantes.
5.6.3 ENFERMEDADES INFECCIOSAS
También se describen métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más moléculas de la divulgación que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para un agente infeccioso asociado con dicha enfermedad infecciosa. En determinadas realizaciones, las moléculas de la divulgación son tóxicas para un agente infeccioso, potencian la respuesta inmunitaria contra dicho agente o potencian la función efectora contra dicho agente, en comparación con la respuesta inmunitaria en ausencia de dicha molécula. Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse con las moléculas de la divulgación son ocasionadas por agentes infecciosos incluyendo, pero sin limitación, virus, bacterias, hongos, protozoos y virus.
Las enfermedades víricas que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la divulgación en combinación con los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, las causadas por el virus de la hepatitis de tipo A, hepatitis de tipo B, hepatitis de tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simple de tipo I (VSH-I), herpes simple de tipo II (VSH-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma, papovavirus, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus coxsackie, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la polio, viruela, virus de Epstein Barr, virus de la ¡nmunodeficiencia humana de tipo I (VIH-I), virus de la ¡nmunodeficiencia humana de tipo II (VIH-II) y agentes de enfermedades víricas tales como meningitis vírica, encefalitis, dengue o viruela.
Las enfermedades bacterianas que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la divulgación en combinación con los métodos descritos en el presente documento, que son ocasionadas por bacterias incluyen, pero sin limitación, micobacterias rickettsia, micoplasma, Neisseria, S. pneumonía, Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme), Bacillus antracis (carbunco), tétanos, estreptococos, estafilococos, micobacterias, tétanos, Pertissus, cólera, peste, difteria, clamidia, S. aureus y legionela.
Las enfermedades protozoarias que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la divulgación en combinación con los métodos descritos en el presente documento, que son ocasionadas por protozoos incluyen, pero sin limitación, Leishmania, Kokzidioa, tripanosoma o malaria.
Las enfermedades parasitarias que pueden tratarse o prevenirse usando las moléculas de la divulgación en combinación con los métodos descritos en el presente documento, que son ocasionadas por parásitos incluyen, pero sin limitación, Chlamydia y Rickettsia.
De acuerdo con un aspecto de la divulgación, las moléculas de la divulgación que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para un agente infeccioso presentan una función efectora de anticuerpo hacia dicho agente, por ejemplo, una proteína patógena. Los ejemplos de agentes infecciosos incluyen, pero no se limitan a, bacterias (por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecials, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans, y Pseudomonas aeruginosa), un patógeno (por ejemplo, papovavirus B-linfotrópico (PVL); Bordatella pertussis; virus de la enfermedad de Borna (VEB); coronavirus bovino; virus de coriomeningitis; virus del Dengue; un virus, E. coli; ébola; ecovirus-1; ecovirus-11 (EV); endotoxina (LPS); bacteria entérica; virus huérfano entérico; enterovirus; virus de leucemia felina; virus de la fiebre aftosa; virus de leucemia del mono gibón (VLMG); bacterias gram-negativas; Helicobacter pylori; virus de la hepatitis B (VHB); virus del herpes simple; HIV-1; citomegalovirus humano; coronovirus humano; gripe A, B y C; legionela; Leishmania mexicana; Listeria monocytogenes; virus del sarampión; meningococos; morbilivirus; virus de la hepatitis de ratón; virus de la leucemia murina; gammaherpesvirus murino; retrovirus murino; coronavirus murino, virus de la hepatitis de ratón; Mycobacterium avium-M; Neisseria gonorrhoeae; virus de la enfermedad de Newcastle; Parvovirus B19; Plasmodium falciparum; virus de la viruela; Pseudomonas; Rotavirus; Samonella typhiurium; Shigella; estreptococos; virus linfotrópico de linfocitos T 1; virus vaccinia).
5.6.4 DETOXIFICACIÓN
El uso puede ser en métodos de detoxificación en un sujeto expuesto a una toxina (por ejemplo, una molécula farmacológica tóxica) que comprende administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más moléculas de la divulgación que comprenden al menos un dominio de unión al epítopo específico para la molécula farmacológica tóxica. En determinadas realizaciones, la unión de una molécula de la divulgación a la toxina reduce o elimina el efecto fisiológico adverso de dicha toxina. En otras realizaciones más, la unión de un diacuerpo de la divulgación a la toxina aumenta o potencia la eliminación, degradación o neutralización de la toxina con comparación con la eliminación, degradación o neutralización en ausencia de dicho diacuerpo. La inmunotoxicoterapia de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento puede usarse para tratar sobredosis o exposición a fármacos incluyendo, pero sin limitación, digoxina, PCP, cocaína, colchicina y antidepresivos tricíclicos.
5.7 TRATAMIENTO COMBINADO
También se describe la administración de las moléculas de la divulgación en combinación con otras terapias conocidas por los expertos en la técnica para el tratamiento o la prevención del cáncer. enfermedad autoinmunitaria, enfermedades infecciosas o intoxicación, incluyendo, pero sin limitación, quimioterapias experimentales y convencionales actuales, terapias hormonales, terapias biológicas, inmunoterapias, radioterapias o cirugía. En algunas realizaciones, las moléculas de la divulgación pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes, anticuerpos terapéuticos u otros agentes conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad infecciosa o intoxicación.
En determinadas realizaciones, una o más moléculas de la divulgación se administran a un mamífero, preferentemente, un ser humano, de manera concurrente con uno o más de otros agentes terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer. La expresión "de manera concurrente" no se limita a la administración de los agentes profilácticos o terapéuticos exactamente al mismo tiempo, sino más bien se entiende que una molécula de la divulgación y el otro agente se administran a un mamífero en un orden y dentro de un intervalo temporal de modo que la molécula de la divulgación pueda actuar junto con el otro agente para proporcionar un mayor beneficio en comparación si estos fueron administrados de otro modo. Por ejemplo, cada agente profiláctico o terapéutico (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal o terapia biológica) puede administrarse al mismo tiempo o de manera sucesiva en cualquier orden en diferentes puntos temporales; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, estos deben administrarse de manera suficientemente próxima en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada agente terapéutico puede administrarse por separado, en cualquier forma apropiada y por cualquier vía apropiada. En diversas realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran con menos de 1 hora de diferencia, aproximadamente 1 hora de diferencia, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas de diferencia, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, de aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, de aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, de aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, no más de 24 horas de diferencia o no más de 48 horas de diferencia. En las realizaciones preferidas, se administran dos o más componentes durante la misma visita del paciente.
En otras realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran con aproximadamente de 2 a 4 días de diferencia, con de aproximadamente 4 a 6 días de diferencia, con aproximadamente 1 semana de diferencia, con aproximadamente de 1 a 2 semanas de diferencia o más de 2 semanas de diferencia. En las realizaciones preferidas, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran en un marco temporal en el que ambos agentes todavía sean activos. Un experto en la materia podría determinar dicho marco temporal determinando la semivida de los agentes administrados.
En determinadas realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos descritos en el presente documento se administran cíclicamente a un sujeto. La terapia cíclica implica la administración de un primer agente durante un período de tiempo, seguido de la administración de un segundo agente y/o un tercer agente durante un período de tiempo y repitiendo esta administración secuencial. La terapia cíclica puede reducir la presentación de resistencia a una o más de las terapias, evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias y/o mejorar la eficacia del tratamiento.
En determinadas realizaciones, los agentes profilácticos o terapéuticos se administran en un ciclo de menos de aproximadamente 3 semanas, aproximadamente una vez cada dos semanas, aproximadamente una vez cada 10 días o aproximadamente una vez cada semana. Un ciclo puede comprender la administración de un agente terapéutico o profiláctico por infusión durante aproximadamente 90 minutos cada ciclo, aproximadamente 1 hora cada ciclo, aproximadamente 45 minutos cada ciclo. Cada ciclo puede comprender al menos 1 semana de descanso, al menos 2 semanas de descanso, al menos 3 semanas de descanso. El número de ciclos administrados será de aproximadamente 1 a aproximadamente 12 ciclos, más normalmente, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 ciclos y más normalmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 ciclos.
En otras realizaciones más, los agentes terapéuticos y profilácticos descritos en el presente documento se administran en regímenes de dosificación metronómica, por infusión continua o administración frecuente sin períodos de descanso prolongados. Dicha administración metronómica puede implicar la dosificación en intervalos constantes sin períodos de descanso. Por lo general, los agentes terapéuticos, en particular, los agentes citotócicos, se usan a menores dosis. Dichas pautas posológicas comprenden la administración diaria prolongada de dosis relativamente bajas durante períodos de tiempo largos. En las realizaciones preferidas, el uso de dosis menores puede reducir al mínimo los efectos secundarios tóxicos y eliminar los períodos de descanso. En determinadas realizaciones, los agentes terapéuticos y profilácticos se administran por infusión a dosis baja prolongada o continua que varía de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 2 días, a aproximadamente 1 semana, a aproximadamente 2 semanas, de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 1 mes y a aproximadamente 2 meses, a aproximadamente 3 meses, a aproximadamente 4 meses, a aproximadamente 5 meses, a aproximadamente 6 meses. El programa de dichas pautas posológicas puede ser optimizado por el oncólogo experto.
En otras realizaciones, los ciclos de tratamiento se administran de manera concurrente a un mamífero, es decir, se administran dosis individuales de los agentes terapéuticos por separado, pero en un intervalo temporal de modo que las moléculas de la divulgación puedan funcionar conjuntamente con el otro agente o agentes. Por ejemplo, un componente puede administrarse una vez a la semana en combinación con los demás componentes, que pueden administrarse una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. En otras palabras, las pautas posológicas para los agentes terapéuticos se llevan a cabo de manera concurrente, aunque los agentes terapéuticos no se administren al mismo tiempo ni durante la misma visita del paciente.
Cuando se usan en combinación con otros agentes profilácticos y/o terapéuticos, las moléculas de la divulgación y el agente profiláctico y/o terapéutico pueden actuar de manera aditiva o, más preferentemente, de manera sinérgica.
Puede administrarse una molécula de la divulgación de manera concurrente con uno o más agentes terapéuticos en la misma composición farmacéutica. Puede administrarse una molécula de la divulgación de manera concurrente con uno o más otros agentes terapéuticos en composiciones farmacéuticas diferentes. Puede administrarse una molécula de la divulgación antes de o después de la administración de otro agente profiláctico o terapéutico.
También se describe la administración de una molécula de la divulgación en combinación con otros agentes profilácticos o terapéuticos por las mismas o diferentes vías de administración, por ejemplo, oral y parenteral. Cuando una molécula de la divulgación se administra de manera concurrente con otro agente profiláctico o terapéutico que pueda producir efectos secundarios adversos incluyendo, pero sin limitación, toxicidad, el agente profiláctico o terapéutico puede administrarse ventajosamente a una dosis que se encuentre por debajo del umbral que genera el efecto secundario adverso,
Las cantidades de dosificación y las frecuencias de la administración que se proporcionan en el presente documento están englobadas por las expresiones terapéuticamente eficaz y profilácticamente eficaz, Además, la dosificación y frecuencia normalmente variarán de acuerdo con factores específicos de cada paciente, dependiendo de los agentes terapéuticos o profilácticos específicos que se administren, la gravedad y el tipo de cáncer, la vía de administración, así como la edad, el peso corporal, la respuesta y el historial médico anterior del paciente, Los regímenes apropiados puede seleccionarlos un experto en la materia considerando dichos factores y siguiendo, por ejemplo, las dosis publicadas en la bibliografía y recomendadas en "Physician’s Desk Reference" (56a ed,, 2002),
5.7.i a g e n te s a n t in e o p lÁs ic o s
También se describe la administración de una o más moléculas de la divulgación con uno o más agentes terapéuticos utilizados para el tratamiento y/o prevención del cáncer, En una realización, pueden administrarse inhibidores de la angiogénesis combinados con las moléculas de la divulgación, Los inhibidores de la angiogénesis que se pueden usar en los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen, entre otros: angiostatina (fragmento de plasminógeno); antitrombina antiangiogénica III; Angiozima; ABT-627; Bay 12-9566; Benefin; Bevacizumab; BMS-275291; inhibidor derivado de cartílago (CDI); CAI; fragmento de complemento CD59; CEP-7055; Col 3; combretastatina A-4; Endostatina (fragmento de colágeno XVIII); fragmento de fibronectina; Grobeta; Halofuginona; heparinasas; fragmento hexasacárido de heparina; HMV833; gonadotropina coriónica humana (hCG); IM-862; interferón alfa/beta/gamma; proteína inducible por interferón (IP-10); interleucina-12; Kringle 5 (fragmento de plasminógeno); Marimastat; inhibidores de la metaloproteinasa (TIMP); 2-metoxiestradiol; MMI 270 (CGS 27023A); Anticuerpo monoclonal IMC-1C11; Neovastat; NM-3; Panzem; PI-88; inhibidor de la ribonucleasa placentaria; inhibidor activador del plasminógeno; factor de plaquetas-4 (PF4); Prinomastat; fragmento de 16 kDa de prolactina; proteína relacionada con la proliferina (PRP); PTK 787/ZK 222594; Retinoides; Solimastat; Escualamina; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; Tetrahidrocortisol-S; tetratiomolibdato; talidomida; Trombospondina-1 (TSP-1); TNP-470; factor de crecimiento transformante-beta (TGF-b); Vasculostatina; Vasostatina (fragmento de calreticulina); ZD6126; ZD 6474; inhibidores de la farnesil transferasa (FTI); y bisfosfonatos,
Los agentes antineoplásicos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la divulgación en las diversas realizaciones, Incluyendo composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas y kits, incluyen, pero sin limitación: acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfán; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diazicuona; docetaxel; doxorrubicina; clorhidrato de doxorrubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracil; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (incluyendo la interleucina II recombinante o rIL2), interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-nl; interferón alfa-n3; interferón beta-1a; interferón gamma-1b; iproplatino; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprólido; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromano; piposulfán; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalán sódico; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorrelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; clorhidrato de zorubicina, Otros fármacos antineoplásicos incluyen, pero sin limitación: 20-epi-1,25-dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografólido; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína morfogenética anti-dorsalizante 1; antiandrógeno; carcinoma de próstata; antiestrógeno; antineoplastón; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores de genes de la apoptosis; reguladores de la apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrón; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilestaurosporina; derivados de beta-lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidores de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; sulfoximina de butionina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; IL-2 de la viruela aviar; capecitabina; carboxamida-aminotriazol; carboximidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína cinasa (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; sulfonamida de cloroquinoxalina; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diazicuona; didemnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil-espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebseleno; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógeno; antagonistas de estrógeno; etanidazol; fosfato de etopósido; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorubicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texapirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutatión; hepsulfam; herregulina; hexametilen-bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina; agonistas del interferón; interferones; interleucinas; iobenguano; yododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; jasplakinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarina N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinano; leptolstatina; letrozol; factor inhibidor de la leucemia; interferón alfa leucocítico; leuprolida estrógeno progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido de disacárido lipófilo; compuestos de platino lipófilos; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecán; texafirina de lutecio; lisofilina; péptidos líticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN bicatenario defectuoso; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; mitotoxina de factor de crecimiento de fibroblastos-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal; gonadotrofina coriónica humana; monofosforil lípido A sk de pared celular de miobacteria; mopidamol; inhibidor del gen de resistencia a múltiples fármacos; terapia basada en el supresor 1 de tumores múltiples; agente anticanceroso de mostaza; micaperóxido B; extracto de la pared celular de micobacteria; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; O6-bencilguanina; octreotida; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetron; ondansetron; oracina; inductor de citocina oral; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato de pentosano sódico; pentostatina; pentrozol; perflubrón; perfosfamida; alcohol perilílico; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarrubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor activador del plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfímero sódico; porfiromicina; prednisona; propil-bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores del proteasoma; modulador inmunitario basado en la proteína A; inhibidor de la proteína cinasa C; inhibidores de la proteína cinasa C, microalgal; inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietileno-hemoglobina piridoxilada; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de farnesil proteína transferasa ras; inhibidores de ras; inhibidores de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rogletimida; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona B1; ruboxil; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de la senescencia; oligonucleótidos sentido; inhibidores de la transducción de señales; moduladores de la transducción de señales; proteína de unión al antígeno de cadena sencilla; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato sódico; fenilacetato sódico; solverol; proteína de unión a la somatomedina; sonermina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; inhibidor de células madre; inhibidores de la división de células madre; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista del péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramin; swainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; talimustina; metyoduro de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalán sódico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de la telomerasa; temoporfina; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinán; hormona estimulante tiroidea; etiopurpurina de etilo y de estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; factor de células madre pluripotenciales; inhibidores de la transducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetrón; turosterida; inhibidores de tirosina cinasa; tirfostinas; Inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor de crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de uroquinasa; vapreotida; variolina B; sistema de vector, terapia génica eritrocítica; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinixaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y estimalámero de zinostatina. Los fármacos antineoplásicos adicionales preferidos son 5-fluorouracilo y leucovorina.
Los ejemplos de los anticuerpos terapéuticos que se pueden usar en los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suiza) que es un inmunosupresor, anticuerpo monoclonal anti-CD25 humanizado para la prevención del rechazo de aloinjerto renal agudo; PANOREX™ que es un anticuerpo lgG2a de antígeno de superficie celular murino anti-17-IA (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2 que es un anticuerpo IgG murino anti-idiotipo (epítopo GD3) (ImClone System); IMC-C225 que es un anticuerpo IgG anti-EGFR quimérico (ImClone System); VITAXIN™ que es un anticuerpo de integrina anti-aVp3 humanizado (Applied Molecular Evolution/Medlmmune); Smart M195 que es un anticuerpo IgG anti-CD33 humanizado (Protein Design Lab/Kanebo); LYMPHOCIDE™ que es un anticuerpo IgG anti-CD22 humanizado (Immunomedics); ICM3 es un anticuerpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 es un anticuerpo anti-CD80 primatizado (IDEC Pharm/Mitsubishi); IDEC-131 es un anticuerpo humanizado anti-CD40L (IDEC/Eisai); IDEC-151 es un anticuerpo anti-CD4 primatizado (IDEC); IDEC-152 es un anticuerpo anti-CD23 primatizado (IDEC/Seikagaku); SMART anti-CD3 es una IgG anti-CD3 humanizada (Protein Design Lab); 5G1.1 es un anticuerpo anti-factor del complemento 5 (C5) humanizado (Alexion Pharm); D2E7 es un anticuerpo humanizado anti-TNF-a (CAT/BASF); CDP87o es un fragmento Fab anti-TNF-a humanizado (Celltech); IDEC-151 es un anticuerpo IgG1 anti-CD4 primatizado (IDEC Pharm/SmithKIine Beecham); MDX-CD4 es un anticuerpo IgG anti-CD4 humano (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 es un anticuerpo IgG4 anti-TNF-a humanizado (Celltech); LDP-02 es un anticuerpo humanizado anti-a4p7 (LeukoSite/Genentech); OrthoCIone OKT4A es un anticuerpo IgG anti-CD4 humanizado (Ortho Biotech); ANTo Va ™ es un anticuerpo IgG anti-CD40L humanizado (Biogen); ANTEGREN™ es un anticuerpo IgG anti-VLA-4 humanizado (Elan); y CAT-152 es un anticuerpo anti-TGF-p2 humano (Cambridge Ab Tech). Otros ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse se presentan en la tabla 8.
Tabla 8: Anticuerpos terapéuticos contra el cáncer
Empresa Producto Enfermedad Diana Abgenix ABX-EGF Cáncer receptor del EGF AltaRex OvaRex cáncer de ovario antígeno tumoral CA125 BravaRex cánceres metastásicos antígeno tumoral MUC1 Antisoma Theragyn (pemtumomab-itrio-90) cáncer de ovario antígeno PEM
Therex cáncer de mama antígeno PEM Boehringer Blvatuzumab cabeza y cuello CD44 Ingelheim cáncer
Centocor/J&J Panorex Cáncer colorrectal 17-1A ReoPro PTCA gp IIIb/IIIa ReoPro MI agudo gp IIIb/IIIa ReoPro apoplejía isquémica gp IIIb/IIIa Corixa Bexocar NHL CD20 CRC Anticuerpo monoclonal, 105AD7 vacuna contra el cáncer colorrectal gp72 Technology idiotípico
Crucell Anti-EpCAM cáncer Ep-CAM Cytoclonal Anticuerpo monoclonal, cáncer cáncer de pulmón no microcítico NA
de pulmón
Genentech Herceptin cáncer mama metastásico HER-2
Herceptin cáncer de mama en fase temprana HER-2 Rituxan NHL de grado bajo o folicular CD20
recidivante/resistente al tratamiento
Rituxan NHL de grado intermedio o alto CD20 Anticuerpo monoclonal-VEGF CPNMC, metastásico VEGF Anticuerpo monoclonal-VEGF cáncer colorrectal, metastásico VEGF (continuación)
Empresa Producto Enfermedad Diana Fab de AMD degeneración macular asociada a la edad CD18
E-26 (IgE de 2.a gen) Asma y rinitis alérgica IgE idec Zevalin (Rituxan itrio-90) NHL de linfocitos B positivos a CD20, CD20
recidivante o resistente de bajo grado o
folicular y NHL resistente a rituximab
ImClone Cetuximab innotecán refractario colorrectal receptor del EGF carcinoma
Cetuximab cisplatino y de cabeza y cuello recién diagnosticado o receptor del EGF recurrente
radiación cáncer
Cetuximab gemcitabina recién diagnosticado metastásico receptor del EGF pancreático
carcinoma
Cetuximab cisplatino 5FU o cáncer de cabeza y cuello recurrente o receptor del EGF Taxol metastásico
Cetuximab carboplatino carcinoma de pulmón no microcítico recién receptor del EGF paclitaxel diagnosticado
Cetuximab cisplatino cáncer de cabeza y cuello (enfermedad receptor del EGF local-regional incurable, extensa y
metástasis distante)
Cetuximab radiación carcinoma de cabeza y cuello local, receptor del EGF avanzado
BEC2 Bacillus Calmette carcinoma de pulmón microcítico mimético Guerin gangliósido GD3
BEC2 Bacillus Calmette melanoma mimético Guerin gangliósido GD3
IMC-1C11 cáncer colorrectal con metástasis en hígado receptor del v e g f ImmonoGen nuC242-DM1 Colorrectal cáncer gástrico y pancreático nuC242 ImmunoMedics LymphoCide linfoma no de Hodgkin CD22
LymphoCide Y-90 linfoma no de Hodgkin CD22 CEA-Cide tumores sólidos metastásicos CEA
CEA-Cide Y-90 tumores sólidos metastásicos CEA
CEA-Scan (arcitumomab cáncer colorrectal (radioimagen) CEA marcado con Tc-99m)
CEA-Scan (arcitumomab Cáncer de mama (radioimagen) CEA marcado con Tc-99m)
CEA-Scan (arcitumomab cáncer de pulmón (radioimagen) CEA marcado con Tc-99m)
CEA-Scan (arcitumomab tumores intraoperatorios (obtención de CEA marcado con Tc-99m) radioimágenes)
LeukoScan (sulesomab marcado Infección de tejidos blandos (radioimagen). CEA con Tc-99m)
LymphoScan (marcado con Tc- linfomas (radioimagen) CD22 99m)
AFP-Scan (marcado con Tc-99m) Cánceres de células gémicas del hígado 7 AFP (radioimagen)
Intracel HumaRAD-HN (+ itrio-90) cáncer de cabeza y cuello NA HumaSPECT obtención de imágenes colorrectales NA Medarex MDX-101 (CTLA-4) cáncer de próstata y otros cánceres CTLA-4 (continuación)
Empresa Producto Enfermedad Diana MDX-210 (sobreexpresión de Cáncer de próstata HER-2 her-2)
MDX-210/MAK Cáncer HER-2 MedImmune Vitaxin Cáncer avp3 Merck KGaA Anticuerpo monoclonal 425 Diversos cánceres receptor del EGF IS-IL-2 Diversos cánceres Ep-CAM Millennium Campath (alemtuzumab) leucemia linfocítica crónica CD52 NeoRx CD20-estreptavidina (+ biotinitio linfoma no de Hodgkin CD20
90)
Avidicina (albúmina NRLU13) cáncer metastásico NA Peregrine Oncolym (+ yodo-131) linfoma no de Hodgkin HLA-DR 10 beta Cotara (+ yodo-131) glioma maligno irresecable proteínas asociadas al ADN
Pharmacia C215 (+ enterotoxina cáncer de páncreas NA Corporation estafilocócica)
Anticuerpo monoclonal, Cáncer Cáncer de pulmón y riñón NA
de pulmón/riñón
nacolomab tafenatox (C242 cáncer de colon y de páncreas NA enterotoxina estafilocócica)
Protein Design Nuvion Tumores malignos de linfocitos T CD3
Labs SMART M195 LMA CD33
SMART1D10 NHL antígeno HLA-DR Titan CEAVac cáncer colorrectal, avanzado CEA TriGem melanoma metastásico y cáncer de pulmón GD2-microcítico gangliósido, TriAb cáncer mama metastásico MUC-1 Trilex CEAVac cáncer colorrectal, avanzado CEA TriGem melanoma metastásico y cáncer de pulmón GD2-microcítico
cáncer gangliósido, TriAb cáncer mama metastásico MUC-1 Viventia NovoMAb-G2 No Hodgkins NA Biotech radiomarcado linfoma
Monopharm C Carcinoma colorrectal y de páncreas antígeno SK-1 GlioMAb-H (+ toxina gelonina) glioma, melanoma y neuroblastoma NA
Xoma Rituxan NHL de grado bajo o folicular CD20
recidivante/resistente al tratamiento
Rituxan NHL de grado intermedio o alto CD20
ING-1 adenocarcinoma Ep-CAM
5.7.2 in m u n o m o d u la d o r e s y a g e n t e s a n t iin f la m a t o r io s
También se describen métodos de tratamiento para enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias que comprenden la administración de las moléculas de la divulgación en combinación con otros agentes de tratamiento. Los ejemplos de los agentes inmunomoduladores incluyen, pero sin limitación, metotrexato, ENBREL, REMICADE™, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A y antibióticos macrólidos (por ejemplo, FK506 (tacrolimus)), metilprednisolona (MP), corticoesteroides, esteroides, micofenolato de mofetilo, rapamicina (sirolimus), mizoribina, desoxiespergualina, brequinar, malononitriloamindas (por ejemplo, leflunamida), moduladores de los receptores de linfocitos T y moduladores de los receptores de citocinas.
Los agentes antiinflamatorios han presentado resultados satisfactorios en tratamientos de trastornos inflamatorios y autoinmunes y ahora son un tratamiento común y convencional de dichos trastornos. Cualquier agente antiinflamatorio bien conocido por un experto en la técnica puede usarse en los métodos descritos en el presente documento. Los ejemplos no limitantes de agentes antiinflamatorios incluyen agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE), fármacos antiinflamatorios esteroideos, beta-agonistas, agentes anticolinérgicos y xantinas metílicas. Los ejemplos de AINE incluyen, pero sin limitación, aspirina, ibuprofeno, celecoxib (CELEb REX™), diclofenac (VOLTAREN™), etodolac (LODiNe™), fenoprofeno (Na LFON™), indometacina (INDOCIN™), ketoralac (TORADOL™), oxaprozina (DAYp Ro ™), nabumentona (RELAFEN™), sulindac (CLINORIL™), tolmentina (TOLECTIN™), rofecoxib (VIOXX™), naproxeno (ALEVE™, NAPR0SYN™), ketoprofeno (ACTRON™) y nabumetona (RELAFEN™). Dichos AINE funcionan inhibiendo una enzima ciclooxigenasa (por ejemplo, COX-1 y/o COX-2). Los ejemplos de medicamentos antiinflamatorios esteroideos incluyen, pero sin limitación, glucocorticoides, dexametasona (DECADRON™), cortisona, hidrocortisona, prednisona (DELTASONE™), prednisolona, triamcinolona, azulfidina y eicosanoides tales como prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos.
Un ejemplo no limitante de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios junto con las moléculas de la divulgación se presenta en la tabla 9 y un ejemplo no limitante de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de trastornos autoinmunitarios se presenta en la tabla 10.
Figure imgf000083_0001
continuación
Figure imgf000084_0001
continuación
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continuación
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5.7.3 a g e n te s q u e se usan par a el t r a t a m ie n t o de e n fe r m e d a d e s in fe c c io s a s
Las moléculas de la divulgación se pueden administrar en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes terapéuticos adicionales conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad infecciosa. También se describe el uso de las moléculas de la divulgación en combinación con antibióticos conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad infecciosa. Los antibióticos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la divulgación incluyen, pero sin limitación, macrólido (por ejemplo, tobramicina (Tobi®)), una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina (Keflex®), cefradina (Velosef®), cefuroxima (Ceftin®), cefprozilo (Cefzil®), cefaclor (Ceclor®), cefixima (Suprax®) o cefadroxil (Duricef®)), una claritromicina (por ejemplo, claritromicina (Biaxin®)), una eritromicina (por ejemplo, eritromicina (EMycin®)), una penicilina (por ejemplo, penicilina V (V-Cillin K® o Pen Vee K®)) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacino (Floxin®), ciprofloxacino (Cipro®) o norfloxacino (Noroxin®)), antibióticos aminoglicósidos (por ejemplo, apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, dibekacina, neomicina, neomicina, undecilenato, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina y espectinomicina), antibióticos de anfenicol (por ejemplo, azidamfenicol, cloranfenicol, florfenicol y tiamfenicol), antibióticos de ansamicina (por ejemplo, rifamida y rifampina), carbacefems (por ejemplo, loracarbef), carbapenems (por ejemplo, biapenem e imipenem), cefalosporinas (por ejemplo, cefaclor, cefadroxilo, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefozoprano, cefpimizol, cefpiramida y cefpiroma), cefamicinas (por ejemplo, cefbuperazona, cefmetazol y cefminox), monobactamas (por ejemplo, aztreonam, carumonam y tigemonam), oxacefems (por ejemplo, flomoxef y moxalactama), penicilinas (por ejemplo, amdinocilina, amdinocilina pivoxilo, amoxicilina, bacampicilina, ácido bencilpenicilínico, bencilpenicilina sódica, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamcilina, yodhidrato de penetamato, penicilina o-benetamina, penicilina O, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina y fencihicilina potásica), lincosamidas (por ejemplo, clindamicina y lincomicina), anfomicina, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (por ejemplo, apiciclina, clortetraciclina, clomociclina y demeclociclina), 2,4-diaminopirimidinas (por ejemplo, brodimoprima), nitrofuranos (por ejemplo, furaltadona y cloruro de furazolio), quinolonas y análogos de estas (por ejemplo, cinoxacina, clinafloxacino, flumequina y grepagloxacina), sulfonamidas (por ejemplo, acetil-sulfametoxipirazina, bencilsulfamida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, sulfacrisoidina y sulfacitina), sulfonas (por ejemplo, diatimosulfona, glucosulfona sódica y solasulfona), cicloserina, mupirocina y tuberina.
Las moléculas de la divulgación pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antimicóticos. Los agentes antimicóticos que se pueden usar combinados con las moléculas de la divulgación incluyen, pero sin limitación anfotericina B, itraconazol, ketoconazol, fluconazol, intratecal, flucitosina, miconazol, butoconazol, clotrimazol, nistatina, terconazol, tioconazol, ciclopirox, econazol, haloprogrina, naftifina, terbinafina, undecilenato y griseofuldina.
Las moléculas de la divulgación pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes antivíricos. Los agentes antivíricos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la divulgación incluyen, pero sin limitación, inhibidores de proteasa, inhibidores nucleosídicos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleosídicos de transcriptasa inversa y análogos de nucleósido. Los ejemplos de los agentes antivíricos incluyen, pero sin limitación, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina y ribavirina, así como foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, ritonavir, los interferones alfa; adefovir, clevadina, entecavir, pleconaril.
5.8 TERAPIA CON VACUNA
También se describe el uso de una composición de la divulgación para inducir una respuesta inmunitaria contra un agente antigénico o inmunogénico, incluyendo, pero sin limitación, antígenos del cáncer y antígenos de enfermedades infecciosas (cuyos ejemplos se desvelan a continuación). Las composiciones de vacuna descritas en el presente documento pueden comprender uno o más agentes antigénicos o inmunogénicos frente a los que se desea una respuesta inmunitaria, en donde Ios uno o más agentes antigénioos o inmunogénicos están recubiertos con un anticuerpo variante descrito en el presente documento que tiene una afinidad potenciada hacia FcyRIIIA. Las composiciones de vacuna descritas en el presente documento son particularmente eficaces para generar una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta inmunitaria protectora frente al agente antigénico o inmunogénico.
En algunas realizaciones, el agente antigénico o inmunogénico en las composiciones de vacuna descritas en el presente documento comprende un virus contra el que se desea una respuesta inmunitaria. Los virus pueden ser recombinantes o quiméricos y preferentemente están atenuados. La producción de los virus recombinantes, quiméricos y atenuados puede realizarse usando los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. También se describe una vacuna viral recombinante viva o una vacuna viral recombinante inactivada para formularse como se describe en el presente documento. Se puede preferir la vacuna de virus vivo, porque la multiplicación en el hospedador conduce a un estímulo prolongado de clase y magnitud similares al que se produce en las infecciones naturales, y por tanto, confiere una considerable inmunidad de larga duración. La producción de dichas formulaciones de vacuna de virus recombinantes, vivos puede lograrse usando métodos convencionales que implican la propagación del virus en cultivo celular o en el alantoides del embrión de pollo seguido por purificación.
En una realización específica, el virus recombinante es no patógeno para el sujeto al que se le administra. En este sentido, el uso de virus modificados por ingeniería genética con fines vacunales puede requerir la presencia de características de atenuación en estas cepas. La introducción de mutaciones apropiadas (por ejemplo, eliminaciones) en los moldes usados para la transfección pueden proporcionar a los nuevos virus las características de atenuación. Por ejemplo, las mutaciones con cambio de sentido específicas que se asocian con sensibilidad a la temperatura o adaptación al frío pueden prepararse en mutaciones por eliminación. Estas mutaciones deben ser más estables que las mutaciones puntuales asociadas con mutantes sensibles al frío o a la temperatura y las frecuencias de inversión deben ser extremadamente bajas. Las tecnologías de ADN recombinante para ingeniería de virus recombinantes son conocidas en la técnica y pueden usarse. Por ejemplo, se conocen técnicas para modificar virus de ARN de hebra negativa, véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos n.25.166.057.
Como alternativa, se pueden construir virus quiméricos con características "suicidas" para usarlos en las formulaciones de vacuna intradérmicas descritas en el presente documento. Dichos virus solo pasarían por una o unas cuantas series de replicación dentro del hospedador. Si se usara como vacuna, el virus recombinante pasaría ciclo/s de replicación limitado/s e induciría un nivel de respuesta inmunitaria suficiente, pero no pasaría más en el hospedador humano ni provocaría una enfermedad. Como alternativa, puede formularse el virus inactivado (muerto). Las formulaciones de vacunas de virus inactivados se pueden preparar usando las técnicas convencionales para "destruir" los virus quiméricos. Las vacunas de virus inactivados están "muertas" en el sentido de que se ha destruido su infectividad. En el mejor de los casos, la infectividad del virus se destruye sin afectar a su inmunogenicidad. Con el fin de preparar vacunas inactivadas, el virus quimérico puede hacerse crecer en cultivo celular o en el alantoides de embriones de pollo, se puede purificar mediante ultracentrifugación zonal, se inactiva con formaldehído o p-propiolactona y se combina.
En determinadas realizaciones, epítopos completamente foráneos, incluyendo los antígenos derivados de otros patógenos víricos o no víricos se pueden modificar por ingeniería en el virus para su uso en las formulaciones de vacuna intradérmica descritas en el presente documento. Por ejemplo, antígenos de virus no relacionados, como el VIH (gp160, gp120, gp41) antígenos de parásitos (por ejemplo, malaria), antígenos bacterianos o micóticos o antígenos tumorales pueden modificarse por ingeniería, obteniéndose la cepa atenuada.
Se puede construir prácticamente cualquier secuencia génica heteróloga en los virus quiméricos descritos en el presente documento para su uso en las formulaciones de vacuna intradérmicas. Preferentemente, las secuencias génicas heterólogas son restos y péptidos que actúan como modificadores de la respuesta biológica. Preferentemente, los epítopos que inducen una respuesta inmunitaria protectora frente a cualquiera de una variedad de patógenos, o los antígenos que se unen a anticuerpos neutralizantes, pueden ser expresados por o como parte de los virus quiméricos. Por ejemplo, las secuencias génicas heterólogas que pueden construirse en virus quiméricos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, hemaglutinina neuraminidasa gripal y paragripal, y glicoproteínas de fusión tales como los genes de HN y F de PIV3 humano. En otra realización más, las secuencias génicas heterólogas que pueden modificarse por ingeniería en los virus quiméricos pueden ser aquellas que codifican proteínas con actividades inmunomoduladoras. Los ejemplos de las proteínas inmunomoduladoras incluyen, pero sin limitación, citocinas, interferón de tipo 1, interferón gamma, factores estimulantes de colonias, interleucina 1, -2, -4, -5, -6, -12, y antagonistas de estos agentes.
También se describen células patógenas o virus, preferentemente virus atenuados, que expresan el anticuerpo variante en su superficie.
Las composiciones de vacuna descritas en el presente documento pueden comprender un polipéptido de fusión en donde un agente antigénico o inmunogénico está unido operativamente a un anticuerpo variante descrito en el presente documento que tiene una afinidad mejorada por FcyRIIIA. La modificación por ingeniería de los polipéptidos de fusión para su uso en las composiciones de vacuna se realiza usando Ios métodos de tecnología de ADN recombinante habituales y están dentro del nivel de conocimientos habituales.
También se describen métodos para inducir tolerancia en un sujeto administrando una composición descrita en el presente documento, Preferentemente, una composición adecuada para inducir tolerancia en un sujeto comprende un agente antigénico o inmunogénico recubierto con un anticuerpo variante descrito en el presente documento, en donde el anticuerpo variante tiene una mayor afinidad por FcyRIIB, Aunque no se pretende quedar limitado a ningún mecanismo de acción en particular, dichas composiciones son eficaces para inducir tolerancia activando la vía inhibidora mediada por FcyRIIB,
5,9 c o m p o s ic io n e s y m é to d o s de a d m in is t r a c ió n
También se describen métodos y composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas descritas en el presente documento (es decir, diacuerpos) que comprenden múltiples dominios de unión a epítopo y, opcionalmente, un dominio Fc (o parte del mismo), También se describen métodos de tratamiento, profilaxis y mejoría de uno o más síntomas asociados a una enfermedad, trastorno o infección mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una proteína de fusión o una molécula conjugada de la divulgación, o una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión o una molécula conjugada de la divulgación, En un aspecto preferido, un anticuerpo, una proteína de fusión o una molécula conjugada, está esencialmente purificada (es decir, esencialmente libre de sustancias que limiten su efecto o produzcan efectos secundarios no deseados), En una realización específica, el sujeto es un animal, preferentemente, un mamífero tal como un animal no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas etc,) y un primate (por ejemplo, mono, tal como un macaco cangrejero y un ser humano), En una realización preferida, el sujeto es un ser humano, En otra realización preferida más, el anticuerpo de la divulgación es de la misma especie que el sujeto,
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar una composición que comprende las moléculas de la divulgación, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o la proteína de fusión, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al, (1987) "Receptor-Mediated ln Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System", J. BíoI. Chem. 262:4429-4432), la construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retrovírico u otro, etc, Los métodos para administrar una molécula de la divulgación incluyen, pero sin limitación, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosa (por ejemplo, las vías intranasal y oral). En una realización específica, las moléculas de la divulgación se administran por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea, Las composiciones pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, se puede emplear también la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de formación de aerosol. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.26.019.968; 5.985.320; 5.985.309; 5.934.272; 5.874.064; 5.855.913; 5.290.540; y 4.880.078; y las Publicaciones PCT n.2 WO 92/19244; documento WO 97/32572; documento WO 97/44013; documento WO 98/31346; y el documento WO 99/66903.
Las moléculas de la divulgación se pueden envasar en un envase cerrado herméticamente tal como una ampolla o un sobre que indique la cantidad del anticuerpo. Las moléculas de la divulgación se suministran en forma de polvo liofilizado esterilizado en seco o concentrado libre de agua en un envase cerrado herméticamente, y pueden reconstituirse, por ejemplo, con agua o solución salina a la concentración apropiada para la administración a un sujeto. Preferentemente, las moléculas de la divulgación se suministran en forma de un polvo liofilizado estéril, seco en un envase cerrado herméticamente a una dosis unitaria de al menos 5 mg, más preferentemente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg o al menos 75 mg. Las moléculas liofilizadas de la divulgación deben almacenarse a una temperatura entre 2 y 8 °C en su envase original, y las moléculas deben administrarse en el transcurso de 12 horas, preferentemente, en el transcurso de 6 horas, en el transcurso de 5 horas, en el transcurso de 3 horas o en el transcurso de 1 hora tras su reconstitución. En una realización alternativa, las moléculas de la divulgación se suministran en forma líquida en un envase cerrado herméticamente que indique la cantidad y concentración de la molécula, proteína de fusión o molécula conjugada. Preferentemente, la forma líquida de las moléculas de la divulgación se suministra en un envase cerrado herméticamente con al menos 1 mg/ml, más preferentemente, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 150 mg/ml, al menos 200 mg/ml de las moléculas.
La cantidad de la composición de la invención que será eficaz para el tratamiento, la prevención o la mejoría de uno o más síntomas asociados con un trastorno puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. La dosis exacta que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la afección, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente, Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo de modelos in vitro o animales,
Para Ios diacuerpos englobados por la divulgación, la dosis administrada a un paciente normalmente es de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente. Preferentemente, la dosis administrada a un paciente es de entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0,0001 y 2 mg/kg, 0,0001 y 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, de 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, de 0,0001 a 0,15 mg/kg, de 0,0001 a 0,10 mg/kg, de 0,001 a 0,5 mg/kg, de 0,01 a 0,25 mg/kg o de 0,01 a 0,10 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosis y frecuencia de administración de Ios diacuerpos de la divulgación se pueden disminuir o modificar potenciando la captación y penetración de Ios diacuerpos en el tejido mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.
En una realización, la dosis de las moléculas de la divulgación administradas a un paciente puede ser de 0,01 mg a 1.000 mg/día si se usa como terapia de un solo agente. En otra realización, las moléculas de la divulgación se usan combinadas con otras composiciones terapéuticas y las dosis administradas a un paciente son menores que cuando se usan dichas moléculas como terapia de un solo agente.
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas localmente en la zona que necesite tratamiento; esto se puede lograr mediante, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local, por inyección o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Preferentemente, cuando se administra una molécula de la divulgación, debe prestarse atención en usar materiales a Ios que no se absorba la molécula.
En otra realización, las composiciones pueden administrarse en una vesícula, en particular, un liposoma (Véase, Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery", Science 249:1527-1533); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), LIss, Nueva York, pág. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibíd., pág. 317-327; véase, en general, en el mismo lugar).
En otra realización más, las composiciones pueden administrarse en un sistema de liberación controlada o un sistema de liberación sostenida. Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan una o más moléculas de la divulgación. Véase, por ejemplo, Patente de Ios Estados Unidos n.24.526.938; publicación PCT WO 91/05548; publicación PCT Wo 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cáncer Xenograft Using A Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application", Pro, Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery", Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760. En una realización, se puede usar una bomba en un sistema de liberación controlada (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, (1987) "Implantable Pumps", CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusión Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis", Surgery 88:507-516; y Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery", N. Engl. J. Med. 321:574-579). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada de anticuerpos (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Dlphosphonate", Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Braln Implant: In Vivo Characterization", Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Déficits", J. Neurosurg. 7( 1): 105-112); Patente de Ios Estados Unidos n.2 5.679.377; Patente de Ios Estados Unidos n.25.916.597; Patente de Ios Estados Unidos n.25.912.015; Patente de Ios Estados Unidos n.25.989.463; Patente de Ios Estados Unidos n.25.128.326; publicación PCT n.2 WO 99/15154; y publicación PCT n.2 WO 99/20253). Los ejemplos de polímeros que se usan en las formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero sin limitación, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), metacrilato de poli(metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol de vinilo), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA) y pollortóésteres. En otra realización más, se puede colocar un sistema de liberación controlada próximo a la diana terapéutica (por ejemplo, Ios pulmones), requiriéndose, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pág. 115-138 (1984)). En otra realización, las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada se usan de acuerdó con Dunn et al. (véase el documento U.S. 5.945.155). Este método en concreto se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo a partir del sistema polimérico. La implantación puede producirse, en general, en cualquier parte del organismo del paciente que necesite el tratamiento terapéutico. En otra realización, se usa un sistema de administración sostenida no polimérico, con lo que, como sistema de administración del fármaco, se usa un implante no polimérico en el cuerpo del sujetó. Tras la implantación en el cuerpo, el disolvente orgánico del implante se disipará, dispersará o lixiviará de la composición hacia el fluido del tejido circundante y el material no polimérico coagulará o precipitará poco a poco, formando una matriz sólida, matriz microporosa (véase el documento US 5.888.533).
Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery", Science 249:1527-1533). Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la divulgación. Véase, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos n.24.526.938; publicaciones internacionales PCT n.2 WO 91/05548 y WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cáncer Xenograft Using A Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application", Pro, Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery", Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
Cuando la composición es un ácido nucleico que codifica un diacuerpo de la divulgación, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para potenciar la expresión de su diacuerpo codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retrovírico (véase la patente de los Estados Unidos n.24.980.286) o por inyección directa o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección o administrándolo en unión a un péptido de tipo homeocaja que se sabe que entra en el núcleo, por ejemplo, Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Como alternativa, se puede introducir un ácido nucleico intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedadora para su expresión por recombinación homóloga.
El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de moléculas de la divulgación puede incluir un solo tratamiento o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, se trata un sujeto con moléculas de la divulgación en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 30 mg/kg de peso corporal, una vez a la semana durante entre aproximadamente 1 y 10 semanas, preferentemente entre 2 y 8 semanas, más preferentemente entre aproximadamente 3 y 7 semanas, e incluso más preferentemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran una vez al día, dos veces o tres veces al día. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran una vez a la semana, dos veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, dos veces al año o una vez al año. También se apreciará que la dosis eficaz de las moléculas usadas para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el ciclo del tratamiento específico.
5.9.1 COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Las composiciones descritas en el presente documento incluyen composiciones de fármaco a granel útiles para la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que sean apropiadas para la administración a un sujeto o paciente) que puedan usarse en la preparación de formas farmacéuticas unitarias. Dichas composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un agente profiláctico y/o terapéutico desvelado en el presente documento o una combinación de estos agentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, las composiciones descritas en el presente documento comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de diacuerpo de la divulgación y un anticuerpo terapéutico (por ejemplo, anticuerpo monoclonal específico para tumor) que es específico para un antígeno de cáncer particular y un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que se ha aprobado por parte de un organismo de control del gobierno federal o estatal, o que está listada en la Farmacopea de Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida de forma general para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "transportador" se refiere a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.
En general, Ios Ingredientes de las composiciones descritas en el presente documento se suministran bien por separado o se mezclan conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de principio activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede distribuirse con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que Ios ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.
Estas composiciones descritas en el presente documento pueden formularse en sus formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, aquellas formadas con aniones tales como Ios derivados del ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como Ios derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
5.9.2 TERAPIA GÉNICA
Los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican moléculas de la divulgación pueden administrarse para tratar, prevenir o mejorar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, el trastorno o la infección, por medio de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o que puede expresarse. En esta realización, Ios ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado o proteína de fusión que media en un efecto terapéutico o profiláctico.
Se puede usar cualquiera de Ios métodos para terapia génica disponibles en la técnica. A continuación, se describen métodos ilustrativos.
Para realizar revisiones generales de Ios métodos para terapia génica, véase Goldspiel et al. (1993) "Human Gene Therapy", Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu et al. (1991) "Delivery Systems For Gene Therapy", Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) "Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions", Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy", Science 260:926-932; y Morgan et al. (1993) "Human Gene Therapy", Ann. Rev. Biochem 62:191 -217. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
Una composición descrita en el presente documento puede comprender ácidos nucleicos que codifican un diacuerpo de la divulgación, formando parte dichos ácidos nucleicos de un vector de expresión que expresa el anticuerpo en un hospedador apropiado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, preferentemente, promotores heterólogos, operativamente unidos a la región codificante del anticuerpo, siendo dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico del tejido. En otra realización particular, se usan moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias codificantes de anticuerpos y cualquier otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que fomentan la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de Ios ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (Koller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al. (1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells", Nature 342:435-438).
Una composición descrita en el presente documento puede comprender ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión, formando parte dichos ácidos nucleicos de un vector de expresión que expresa la proteína de fusión en un hospedador apropiado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, preferentemente, promotores heterólogos, operativamente unidos a la región codificante de una proteína de fusión, siendo dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico del tejido. En otra realización particular, se usan moléculas de ácido nucleico en las que la secuencia codificante de la proteína de fusión y cualquier otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que fomentan la recombinación homóloga en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de la proteína de fusión.
La administración de Ios ácidos nucleicos en el sujeto puede ser directa, en cuyo caso el sujeto es expuesto directamente al ácido nucleico o a vectores portadores del ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso, las células primero son transformadas con Ios ácidos nucleicos in vitro, después se trasplantan al sujeto. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.
En una realización específica, Las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, cuando estas se expresan para producir el producto codificado. Esto se puede realizar mediante cualquiera de Ios numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolos de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante infección, usando vectores retrovíricos defectuosos o atenuados u otros vectores víricos (véase la patente de Ios Estados Unidos n.2 4.980.286), o por inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de mioropartíoulas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o administrándolos en unión a un péptido conocido por entrar en el núcleo, administrándolo en unión a un antígeno sometido a endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated ln Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System", J. Biol. Chem 262:4429-4432) (que puede usarse para elegir tipos de células que expresen específicamente los receptores), etc. En otra realización, Pueden formarse complejos de ácido nucleico-antígeno en los que el antígeno comprenda un péptido vírico fusogénico para romper endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica. En otra realización más, el ácido nucleico puede ser la diana in vivo para la captación y expresión específica de células, seleccionando como diana un receptor específico (véanse, por ejemplo, publicaciones PCT WO 92/06180; documento WO 92/22635; documento W092/20316; documento W093/14188; documento WO 93/20221). Como alternativa, se puede introducir un ácido nucleico intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedadora para su expresión, mediante recombinación homóloga. (Koller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus ln Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al. (1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination ln Embryonic Stem Cells", Nature 342:435-438).
Pueden usarse vectores víricos que contengan secuencias de ácido nucleico que codifiquen una molécula de la divulgación (por ejemplo, un diacuerpo o una proteína de fusión). Por ejemplo, se puede usar un vector retrovírico (Véase Miller et al. (1993) "Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression", Meth. Enzymol. 217:581-599). Estos vectores retrovíricos contienen los componentes necesarios para el empaquetamiento correcto del genoma vírico y la integración en el ADN de la célula hospedadora. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo o una proteína de fusión que va a usarse en terapia génica se clonan en uno o más vectores, lo que facilita el suministro de la secuencia de nucleótidos a un sujeto. Se pueden encontrar más detalles acerca de los vectores retrovíricos en Boesen et al. (1993) "Circumvention Of Chemotherapy-lnduced Myelosuppression By Transfer Of The Mdr1 Gene", Biotherapy 6:291-302), que describen el uso de un vector retrovírico para suministrar el gen mdr 1 a células madre hematopoyéticas con el fin de hacer a las células madre más resistentes a quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovíricos en terapia génica son: Clowes et al. (1994) "Long-Term Biological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle Cells Expressing Retrovirally Introduced Human Genes", J. Clin. Invest. 93:644-651; Keim et al. (1994) "Retrovirus-Mediated Gene Transduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells", Blood 83:1467-1473; Salmons et al. (1993) "Targeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy", Human Gene Therapy 4:129-141; y Grossman et al. (1993) "Retroviruses: Delivery Vehicle To The Liver", Curr. Opin. Genetics and Devel. 3:110-114.
Los adenovirus son otros vectores víricos que pueden usarse en terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar genes a los epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan de manera natural los epitelios respiratorios en los que provocan una enfermedad leve. Otras dianas para los sistemas de suministro a base de adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no estén en división. Kozarsky et al. (1993, "Gene Therapy: Adenovirus Vectors", Current Opinión in Genetics and Development 3:499-503) presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al. (1994, "Lung Gene Therapy: In Vivo Adenovirus-Mediated Gene Transfer To Rhesus Monkey Airway Epithelium", Human Gene Therapy. 5:3-10) demostraron el usó de vectores adenovíricos para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos rhesus. Otros casos de usó de adenovirus en terapia génica se pueden encontrar en Rosenfeld et al. (1991) "Adenovirus-Mediated Transfer Of A Recombinant Alpha 1-Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium In Vivo", Science 252:431-434; Rosenfeld et al. (1992) "In Vivo Transfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium", Cell 68:143-155; Mastrangeli et al. (1993) "Diversity Of Airway Epithelial Cell Targets For In Vivo Recombinant Adenovirus-Mediated Gene Transfer", J. Clin. Invest. 91:225-234; Publicación PCT WO94/12649; y Wang et al. (1995) "A Packaging Cell Line For Propagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene-Región Deletions", Gene Therapy 2:775-783. En una realización preferida, se usan vectores adenovíricos.
También se han propuesto virus adenoasociados (AAV) para usarlos en terapia génica (véase, por ejemplo, Walsh et al. (1993) "Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies", Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 y la patente de EE.UU. n.25.436.146).
Otro enfoque para la terapia génica implica transferir un gen a las células de un cultivó tisular mediante métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección vírica. Normalmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células luego se siembran bajó selección para aislar aquellas células que hayan captado y estén expresando el gen transferido. Estas células después se suministran a un sujetó.
En esta realización, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Dicha introducción puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector vírico o bacteriófago, que contenga las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, efe. En este campo, se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes foráneos en las células (véase, por ejemplo, Loeffler et al. (1993) "Gene Transfer Into Primary And Established Mammalian Cell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA", Meth. Enzymol. 217:599-618, Cotten et al. (1993) "Receptor-Mediated Transport Of DnA Into Eukaryotic Cells", Meth. Enzymol. 217: 618-644) y se puede usar, con la condición de que no se alteren las funciones necesarias para el desarrollo y fisiológicas de las células receptoras. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico pueda ser expresado por la célula y preferentemente pueda ser heredado y expresado por su progenie de células.
Las células recombinantes resultantes pueden suministrarse a un sujeto mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, las células madre o progenitoras hematopoyéticas) preferentemente pueden administrarse por vía intravenosa. La cantidad de células previstas para su uso depende del efecto deseado, del estado del paciente, etc. y puede ser determinada por un experto en la materia.
Las células en las que se puede introducir un ácido nucleico para fines de terapia génica abarcan tipo de célula disponible deseado e incluyen pero sin limitación, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, los fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular, células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, obtenidas a partir de médula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.
En una realización preferida, la célula usada para la terapia génica puede ser autóloga para el sujeto.
En una realización en la que se usan células recombinantes en terapia génica, las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o una proteína de fusión se introducen en las células de modo que éstas puedan ser expresadas por las células o su progenie, y las células recombinantes entonces pueden administrarse in vivo para un efecto terapéutico. En una realización específica, se usan células madre o progenitoras. Cualquier célula madre y/o progenitora que pueda ser aislada y mantenida in vitro puede usarse potencialmente (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 94/08598; Stemple et al. (1992) "Isolation Of A Stem Cell For Neurons And Glia From The Mammalian Neural Crest", Cell 7 1:973-985; Rheinwald (1980) "Serial Cultivation Of Norma1Human Epidermal Keratinocytes", Meth. Cell Bio. 21A:229-254; y Pittelkow et al. (1986) "New Techniques For The In Vitro Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients With Extensive Burns", Mayo Clinic Proc. 61:771-777).
En una realización específica, el ácido nucleico que va a introducirse con los fines de la terapia génica puede comprender un promotor inducible operativamente unido a la región codificante, de modo que pueda controlarse la expresión del ácido nucleico controlando la presencia o ausencia del inductor de la transcripción apropiado.
5.9.3 KITS
También se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más envases llenados con las moléculas de la divulgación. Adicionalmente, también se puede incluir uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad también en el paquete o kit farmacéutico. También se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Opcionalmente asociado con dicho recipiente o recipientes puede ser un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de agentes farmacéuticos o productos biológicos, cuyo aviso refleja la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana.
También se describen kits que pueden usarse en los métodos anteriores. En una realización, un kit comprende una o más moléculas de la divulgación. En otra realización, un kit comprende además uno o más agentes profilácticos o terapéuticos diferentes útiles para el tratamiento del cáncer, en una o más recipientes. En otra realización, un kit comprende además uno o más anticuerpos citotóxicos que se unen a uno o más antígenos del cáncer asociados con el cáncer. En determinadas realizaciones, el otro agente profiláctico o terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico. En otras realizaciones, el agente profiláctico o terapéutico puede ser un agente terapéutico biológico u hormonal.
5.10 c a r a c te r iza c ió n y DEMOSTRACIÓN DE LA UTILIDAD te r a p é u t ic a
Varios aspectos de las composiciones farmacéuticas, los agentes profilácticos o terapéuticos descritos en el presente documento, preferentemente se pueden ensayar in vitro, en un sistema de cultivo celular, y en un organismo de modelo animal, tal como un sistema de modelo animal de roedor, para determinar la actividad terapéutica deseada antes de usarlos en seres humanos. Por ejemplo, los ensayos que pueden usarse para determinar si la administración de una composición farmacéutica específica es la deseada incluyen ensayos en cultivos celulares en los que se cultiva una muestra de tejido del paciente, y se expone a o se pone en contacto de otro modo con una composición farmacéutica descrita en el presente documento, y se observa el efecto de dicha composición en la muestra de tejido. La muestra de tejido puede obtenerse por biopsia del paciente. Esta prueba permite realizar la identificación de la/s molécula/s profiláctica/s o terapéutica/s más eficaces para cada paciente. En diversas realizaciones específicas, se pueden llevar a cabo ensayos in vitro con células representativas de los tipos de células implicados en un trastorno autoinmunitario o inflamatorio (por ejemplo, linfocitos T), para determinar si una composición farmacéutica descrita en el presente documento tiene un efecto deseado en dichos tipos de células.
Pueden ensayarse combinaciones de los agentes profilácticos y/o terapéuticos en sistemas de modelos animales apropiados antes de su uso en seres humanos. Dicho sistema de modelos animales incluyen, pero sin limitación, ratas, ratones, pollo, vacas, monos, cerdos, perros, conejos, etc. Se puede usar cualquier sistema animal bien conocido en la técnica. Pueden ensayarse combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos en un sistema de modelo de ratón. Dichos sistemas modelo se usan ampliamente y son bien conocidos por el experto. Los agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden administrarse en dosis repetidas. Algunos aspectos del procedimiento pueden variar. Dichos aspectos pueden ser el régimen temporal de administración de los agentes profilácticos y/o terapéuticos y si dichos agentes pueden administrarse por separado o como una mezcla.
Los modelos animales preferidos que se usan en los métodos descritos en el presente documento son, por ejemplo, ratones transgénicos que expresen los FcyR humanos en células efectoras de ratón, por ejemplo, puede usarse cualquier modelo de ratón descrito en la patente de EE.ÜÜ. n.25.877.396. Los ratones transgénicos para uso en los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, ratones portadores de FcyRIIIA humano; ratones portadores de FcyRIIA humano; ratones portadores de FcyRIIB humano y FcyRIIIA humano. ratones portadores de FcyRIIB humano y FcyRIIA humano. Preferentemente, las mutaciones que muestren los niveles más altos de actividad en los ensayos funcionales descritos anteriormente se ensayarán para usarlas en estudios de modelos animales antes de su uso en seres humanos. Pueden prepararse cantidades suficientes de anticuerpos para usarlos en modelos animales usando los métodos descritos anteriormente, por ejemplo, usando sistemas de expresión de mamífero y métodos de purificación desvelados e ilustrados en el presente documento.
Pueden usarse modelos de xenoinjerto de ratón para examinar la eficacia de los anticuerpos de ratón generados contra una diana específica del tumor, basándose en la afinidad y especificidad de los dominios de unión a epítopo de las moléculas de diacuerpo de la divulgación y en la capacidad del diacuerpo para generar una respuesta inmunitaria (Wu et al. (2001) "Mouse Models For Multistep Tumorigenesis", Trends Cell Biol. 11: S2-9). Los ratones transgénicos que expresan los FcyR humanos en células efectoras de ratón son únicos y son modelos animales diseñados para ensayar la eficacia de las interacciones de Fc-FcyR humanos. Se pueden usar pares de estirpes de ratones transgénicos FcyRIIIA, FcyRIIIB y FcyRIIA generados en el laboratorio del Dr. Jeffrey Ravetch (mediante un acuerdo de licencia con Rockefeller Ü. y Sloan Kettering Cáncer center) tales como los enumerados en la siguiente tabla 11.
Tabla 11: Ce as de ratones
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La actividad antiinflamatoria de las terapias combinadas se puede determinar usando diversos modelos animales experimentales de artritis reumatoide conocidos en la técnica descritos en Crofford L. J. y Wilder R. L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", en Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Capítulo 30 (Lee y Febiger, 1993). También se pueden usar modelos animales experimentales y espontáneos de artritis inflamatoria y enfermedades reumáticas autoinmunes para evaluar la actividad antiinflamatoria de las terapias de combinación de la invención. Los siguientes son algunos ensayos proporcionados como ejemplos, y no como limitación.
Los principales modelos animales para la artritis o enfermedad inflamatoria conocidos en la técnica y ampliamente usados incluyen: modelos de rata con artritis inducida por adyuvantes, modelos de rata y ratón de artritis inducida por colágeno y modelos de rata, conejo y hámster de artritis inducida por antígeno, todos descritos en Crofford L. J. y Wilder R. L., "Arthritis and Autoimmunity in Animals", en Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCarty et al.(eds.), Capítulo 30 (Lee y Febiger, 1993).
La actividad antiinflamatoria de las terapias combinadas puede evaluarse usando un modelo de rata de artritis inducida por carragenanos. La artritis inducida por carragenanos también se ha usado en conejo, perro y cerdo en estudios de artritis o inflamación crónicas. Para determinar la eficacia terapéutica se usa la evaluación histomorfométrica cuantitativa. Los métodos para usar dicho modelo de artritis inducida por carragenanos se describen en Hansra P. et al. (2000) "Carrageenan-induced Arthritis ln The Rat", Inflamación, 24(2): 141-155. También se usan comúnmente modelos animales de inflamación inducida por zimosano como se sabe y se describe en la técnica.
La actividad antiinflamatoria de las terapias combinadas también se puede evaluar midiendo la inhibición del edema de la pata inducido por carragenanos en la rata, usando una modificación del método descrito en Winter C. A. et al. (1962) "Carrageenan-Induced Edema ln Hind Paw Of The Rat As An Assay For Anti-lnflammatory Drugs" Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547. Este ensayo se ha usado como examen in vivo primario para la actividad antiinflamatoria de la mayoría de los AINE, y se considera predictivo de la eficacia en seres humanos. La actividad antiinflamatoria de los agentes profilácticos o terapéuticos que se va a ensayar se expresa como el porcentaje de inhibición del aumento del peso de la pata trasera del grupo que se va a ensayar con respecto al grupo de control dosificado con vehículo.
Adicionalmente, se pueden usar modelos animales para la enfermedad inflamatoria del intestino para evaluar la eficacia de las terapias combinadas (Kim et al. (1992) "Experimental Colitis ln Animal Models", Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537; Strober (1985) "Animal Models Of Inflammatory Bowel Disease--An Overview", Dig. Dis. Sci. 30(12 Supl):3S-10S). La colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn son enfermedades inflamatorias del intestino humanas que se pueden inducir en animales. Los polisacáridos sulfatados, incluyendo, pero sin limitación, amilopectina, carragenina, sulfato de amilopectina y sulfato de dextrano o irritantes químicos, incluyendo, pero sin limitación, ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) y ácido acético pueden administrarse a animales por vía oral para inducir enfermedades inflamatorias del intestino.
También se pueden usar modelos animales para trastornos autoinmunes para evaluar la eficacia de las terapias combinadas. Se han desarrollado modelos animales para trastornos autoinmunes tales como diabetes de tipo 1, autoinmunidad de la tiroides, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis (Flanders et al. (1999) "Prevention Of Type 1 Diabetes From Laboratory To Public Health", Autoimmunity 29:235-246; Rasmussen et al. (1999) "Models To Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity", Biochimie 81:511-515; Foster (1999) "Relevance Of Systemic Lupus Erythematosus Nephritis Animal Models To Human Disease", Semin. Nephrol. 19:12-24).
Además, se puede usar cualquiera de los ensayos conocidos por los expertos en la materia para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de las terapias combinadas desveladas en el presente documento para enfermedades autoimunes y/o inflamatorias.
La toxicidad y eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos descritos en el presente documento se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de la dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Se prefieren agentes profilácticos y/o terapéuticos que presenten altos índices terapéuticos. Aunque es posible usar agentes profilácticos y/o terapéuticos que presenten efectos secundarios tóxicos, ha de tenerse cuidado de diseñar un sistema de suministro que dirija dichos agentes al sitio de tejido afectado para minimizar el daño potencial a células no infectadas y, de este modo, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y de estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación de los agentes profilácticos y/o terapéuticos para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos agentes se encuentra preferentemente dentro del intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier agente utilizado en el método descrito en el presente documento, puede estimarse inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante en plasma que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) según se determina en cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar de manera más precisa las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.
La actividad antineoplásica de las terapias usadas también se puede determinar usando diversos modelos animales experimentales para el estudio del cáncer, tal como puede ser el modelo de ratón SCID o ratón transgénico o ratón atímico con xenoinjertos humanos, modelos animales, tales como hámsteres, conejos, conocidos en la técnica y descritos en "Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development" (1999, eds. Fiebig y Burger); "Contributions to Oncology" (1999, Karger); "The Nude Mouse in Oncology Research" (1991, eds. Boven y Winograd); y "Anticancer Drug Development Guide" (1997 ed. Teicher).
Los modelos animales preferidos para determinar la eficacia terapéutica de las moléculas de la divulgación son modelos de xenoinjerto de ratón. Las estirpes celulares tumorales que pueden usarse como fuente de tumores para el xenoinjerto incluyen, pero sin limitación, células SKBR3 y MCF7, que pueden derivarse de pacientes con adenocarcinoma de mama. Estas células tienen receptores de erbB2 y prolactina. Las células SKBR3 se han usado habitualmente en la técnica como modelos tumorales de ADCC y xenoinjerto. Como alternativa, se pueden usar células OVCAR3 derivadas de adenocarcinoma de ovario humano como fuente para tumores de xenoinjerto.
Los protocolos y las composiciones de la divulgación preferentemente se ensayan in vitro y luego in vivo, para determinar la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de usarlos en seres humanos. Los agentes y los métodos terapéuticos se pueden explorar usando células de una estirpe celular tumoral o maligna. Se pueden usar muchos ensayos convencionales en la técnica para evaluar tal supervivencia y/o el crecimiento; por ejemplo, la proliferación de células se puede ensayar midiendo la incorporación de 3H-timidina, mediante el recuento directo de células, detectando los cambios en la actividad de transcripción de genes conocidos tales como los protooncogenes (por ejemplo, fos, myc) o marcadores del ciclo celular; la viabilidad celular se puede evaluar mediante tinción con azul tripano, la diferenciación se puede evaluar visualmente basándose en los cambios en la morfología, la disminución del crecimiento y/o la formación de colonias en agar blando o la formación de redes tubulares en membrana basal tridimensional o la preparación de la matriz extracelular, etc.
Los compuestos para su uso en terapia se pueden ensayar en sistemas de modelos animales apropiados antes de ensayarlos en seres humanos, incluyendo, pero sin limitación, ratas, ratones, pollo, vacas, monos, conejos, hámsteres, etc., por ejemplo, los modelos animales anteriormente descritos. Los compuestos pueden usarse luego en ensayos clínicos apropiados.
Además, puede usarse cualquiera de los ensayos conocidos por los expertos en la materia para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de las terapias combinadas desveladas en el presente documento para el tratamiento o la prevención del cáncer, trastorno inflamatorio o enfermedad autoinmune.
6. Ejemplos
6.1 d is e ñ o y c a r a c t e r iz a c ió n de d ia c u e r p o s b ie s p e c Ífic o s c o v a le n te s
Se construyeron un diacuerpo covalente monoespecífico y un diacuerpo covalente biespecífico para evaluar las características de producción recombinante, purificación y unión de cada uno. Las moléculas de diacuerpo purificadas por afinidad que se produjeron mediante los sistemas de expresión recombinante descritos en el presente documento se encontraron mediante análisis de SDS-PAGE y SEC que consistían en especies diméricas simples. Los análisis de ELISA y SPR revelaron además que el diacuerpo biespecífico covalente presentaba afinidad por ambos antígenos diana y que podía unirse a ambos antígenos simultáneamente.
Materiales y métodos:
Construcción y diseño de moléculas poliDeptídicas: se diseñaron vectores de expresión de ácido nucleico para producir cuatro construcciones polipeptídicos, representadas esquemáticamente en la FIG. 2. Construcción 1 (SEQ ID NO: 9) compuesta del dominio VL del anticuerpo 2B6 humanizado, que reconoce FcyRIIB, y el dominio VH del anticuerpo 3G8 humanizado, que reconoce a FcyRIIIA. Construcción 2 (SEQ ID NO: 11) compuesta por el dominio VL del anticuerpo Hu3G8 y el dominio VH de Hu2B6. Construcción 3 (SEQ ID NO: 12) compuesta por el dominio VL del anticuerpo Hu3G8 y el dominio VH de Hu3G8. Construcción 4 (SEQ ID NO: 13) compuesta por el dominio VL del anticuerpo Hu2B6 y el dominio VH de Hu2B6.
PCR y construcción del vector de expresión: Las secuencias codificantes de los dominios VL y VH se amplificaron a partir del ADN molde usando cebadores directos e inversos diseñados para que los productos iniciales de PCR contuvieran secuencias solapantes, permitiendo que la PCR solapante generara las secuencias codificantes de las construcciones polipeptídicas deseadas.
Amplificación inicial por PCR del ADN molde: Aproximadamente 35 ng del ADN molde, por ejemplo, la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo de interés; 1 ul de cebadores directos e inversos 10 uM; 2,5 ul de tampón 10x pfuUltra (Stratagene, Inc.); 1 ul de dNTP 10 mM; 1 ul de 2,5 unidades/ul de ADN polimerasa pfuUltra (Stratagene, Inc.); y agua destilada hasta un volumen total de 25 ul se mezclaron suavemente en un tubo de microcentrifugación, y se centrifugaron brevemente en una microcentrifugadora para recogerse la mezcla de reacción en el fondo del tubo. Se realizaron las reacciones de PCR usando el sistema de PCR GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystem) y los siguientes parámetros: 94 °C, 2 minutos; 25 ciclos de 942C, cada 15 segundos; 58 °C, 30 segundos; y 72 °C, 1 minuto.
El dominio VL del anticuerpo Hu2B6 se amplificó a partir de la cadena ligera del anticuerpo Hu2B6 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, respectivamente. El dominio VH del anticuerpo Hu2B6 se amplificó a partir de cadena pesada del anticuerpo Hu2B6 usando cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, respectivamente. El dominio VL del anticuerpo Hu3G8 se amplificó a partir de la cadena ligera del anticuerpo Hu3G8 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 59, respectivamente. El dominio VH del anticuerpo Hu3G8 se amplificó a partir de cadena pesada del anticuerpo Hu3G8 usando cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61, respectivamente.
Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1 % durante 30 minutos a 120 voltios. Los productos de PCR se cortaron del gel y se purificaron usando el kit de extracción MinElute GEI (Qiagen, Inc.).
PCR solapante: Se combinaron los productos iniciales de la PCR como se describe más adelante y se amplificaron usando las mismas condiciones de PCR descritas para la amplificación del ADN molde. Los productos de la PCR solapante también se purificaron como se ha descrito anteriormente.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 1, SEQ ID NO: 9 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 2) se amplificó combinando los productos de la PCR de las amplificaciones del dominio VL de Hu2B6 y el dominio VH de Hu3G8, y los cebadores directo e inverso SEQ ID nO:55 y SEQ ID NO:61, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 2, SEQ ID NO: 11 (mostrada esquemáticamente en la FIG.
2) se amplificó combinando los productos de la PCR de las amplificaciones del dominio VL de Hu3G8 y el dominio VH de Hu2B6, y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:58, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 3, SEQ ID NO: 12 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 2) se amplificó combinando los productos de la PCR de las amplificaciones del dominio VL de Hu3G8 y el dominio VH de Hu3G8, y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:61, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 4, SEQ ID NO: 13 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 2) se amplificó combinando los productos de la PCR de las amplificaciones del dominio VL de Hu2B6 y el dominio VH de Hu2B6, y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:58, respectivamente.
Los cebadores directos de los dominios VL (es decir, SEQ ID NO: 55) y cebadores inversos de los dominios VH (es decir, La SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 61) contenían sitios de restricción únicos para permitir la clonación del producto final en un vector de expresión. Los productos de la PCR superpuestos purificados se digirieron con las endonucleasas de restricción Nhe I y EcoR I, y se clonaron en el vector de expresión de mamíferos pCIneo (Promega, Inc.). Los plásmidos que codifican las construcciones se designaron como se identificaron en la Tabla 12:
Tabla 12. CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDO
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Expresión de polipeptidil-diacuerpo: pMGX0669, que codifica la construcción 1, se cotransfectó con pMGX0667, que codifica la construcción 2, en células HEK-293 usando Lipofectamine 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). La cotransfección de estos dos plásmidos fue diseñada para dirigir la expresión de un diacuerpo biespecífico covalente (CBD) inmunoespecífico para FcyRIIB y FcyRIIIA (el diacuerpo h2B6-h3G8). pMGX0666 y pMGX0668, que codifican las construcciones 3 y 4, respectivamente, se cotransfectaron por separado en células HEK-293 para la expresión de un diacuerpo monoespecífico covalente (CMD), inmunoespecífico para FcyRIIIA (el diacuerpo h3G8) y FcyRIIB (el diacuerpo h2B6), respectivamente. Tras tres días en cultivo, se purificaron los productos secretados del medio condicionado.
Purificación: Los diacuerpos fueron capturados del medio condicionado usando los antígenos pertinentes acoplados a Sepharose 4B activada con CNBr. La resina de Sepharose de afinidad se equilibró en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 antes de cargarla. Tras la carga, se lavó la resina con tampón de equilibrado antes de la elución. Se eluyeron los diacuerpos de la resina lavada usando glicina 50 mM pH 3,0. Los diacuerpos eluidos fueron inmediatamente neutralizados con Tris/HCl 1 M pH 8,0 y se concentraron usando un concentrador del tipo de centrifugación. Los diacuerpos concentrados se purificaron además mediante cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superdex 200 equilibrada en PBS.
SEC: Se usó la cromatografía de exclusión molecular para analizar el tamaño aproximado y la heterogeneidad de los diacuerpos eluidos de la columna. El análisis de SEC se realizó en una columna Superdex 200HR 10/30 de GE Healthcare equilibrada con PBS. Para la comparación, se usaron como controles los perfiles de elución de una IgG de longitud completa (-150 kDa), un fragmento Fab (-50 kDa) y un Fv monocatenario (-30 kDa)).
ELISA: La unión de los diacuerpos eluidos y purificados se caracterizó mediante el ensayo ELISA, como se describe en 5.4.2. Se usaron 50 ul/pocillo de una solución 2 ug/ml de sCD32B-Ig para recubrir una placa de 96 pocilios Maxisorp en tampón de carbonato a 4 °C durante la noche. Se lavó la placa tres veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y se bloqueó con BSA al 0,5 % en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, Se diluyeron CBD h2B6-h3G8, CMD h2B6 o CMD h3G8 en el tampón de bloqueo en una serie de diluciones de factor de dilución de dos para generar un intervalo de concentraciones de diacuerpos, De 0,5 gg/ml a 0,001 gg/ml. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar con PBS-T tres veces, se añadieron 50 ul/pocillo de sCD16A-biotina a 0,2 ug/ml a cada pocilio. Se volvió a incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar con PBS-T tres veces, se usaron para la detección 50 ul/pocillo de una dilución 1:5.000 de estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech). Se dejó incubar el conjugado de HRP-estreptavidina durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se lavó la placa con PBS-T tres veces y se desarrolló usando 80 ul/pocillo del sustrato TMB. Tras una incubación de 10 minutos, se detuvo la reacción DE HRP-TMB añadiendo 40 ul/pocillo de H2SO4 al 1 %. La D0450 nm se leyó utilizando un lector de placas de 96 pocilios y el software SOFTmax, y los resultados se representaron utilizando el software GraphPadPrism 3.03.
Ensayo BIAcore: Los parámetros cinéticos de la unión de los diacuerpos eluidos y purificados se analizaron usando un ensayo BIAcore (BIAcore Instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, N. J.) y el software asociado como se describe en el apartado 5.4.3.
Se inmovilizaron sCD16A, sCD32B o sCD32A (control negativo) en una de las cuatro celdas de flujo (la célula de flujo 2) de una superficie de una microplaca de sensor mediante química de acoplamiento de aminas (mediante la modificación de los grupos carboximetilo con mezcla de NHS/EDC) de modo que, en la superficie, se inmovilizaron aproximadamente 1.000 unidades de respuesta (UR) de cualquier receptor. Después de esto, se “desprotegieron” los ésteres activos que no reaccionaron con una inyección de Et-NH2 1M. Una vez preparada una superficie apropiada, se hicieron pasar diacuerpos biespecíficos covalentes (CBD h2B6-h3G8) o los diacuerpos monoespecíficos covalentes (CMD h2B6 o CMB h3G8) sobre la superficie mediante inyecciones de 180 segundos de una solución 6,25-200 nM a un caudal de 70 ml/min. A modo comparativo, también se ensayó el sFv de h3G8. Una vez recogido todo el conjunto de datos, se ajustaron las curvas de unión resultantes de manera global usando algoritmos de cálculo suministrados por el fabricante, BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ). Estos algoritmos calculan las constantes Kon and Koff, a partir de las que se deduce la constante de unión en equilibrio aparente, Kd se deduce como el cociente de las dos constantes de velocidad (es decir, Koff/Kon). Se pueden encontrar tratamientos más detallados de cómo se derivan cada una de las constantes de velocidad en el manual del software BIAevaluation (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).
Las fases de asociación y disociación se ajustaron por separado. La constante de velocidad de disociación se obtuvo para el intervalo de 32-34 s de la fase de disociación de 180 s; el ajuste de la fase de asociación se obtuvo mediante un modelo de Langmuir 1:1 y se escogió el ajuste de base de acuerdo con los criterios Rmáx y chi2 para los diacuerpos biespecíficos y el scFv; para la unión del CMD, se usó un ajuste de analito bivalente.
Resultados
El análisis de SDS-PAGE en condiciones no reductoras reveló que el producto purificado de los sistemas de expresión de CMD h3G8, CMD h2B6 y CBD h2B6-h3G8 fue una sola especie con un peso molecular estimado de aproximadamente 50 kDa (FIG. 3, carriles 4, 5 y 6, respectivamente). En condiciones reductoras, el producto purificado de cualquiera de los sistemas de expresión de CMD se desplazó como una sola banda (carriles 1 y 2), mientras que el producto purificado a partir del sistema de CBD h2B6-h3G8 fue revelado como 2 proteínas diferentes (FIG. 3, carril 3). Todos los polipéptidos purificados a partir del sistema de expresión y visualizados mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras migraron a aproximadamente 28 kDa.
El análisis SEC de cada uno de los productos del sistema de expresión también reveló una única especie molecular (Figura 4B), cada una de las cuales se eluyó al mismo tiempo aproximado que un fragmento Fab de IgG (~50 kDa) (Figura 4A). Los resultados indican que el producto purificado por afinidad fue un dímero covalente homogéneo para el caso del sistema de expresión de CMD y un heterodímero covalente homogéneo para el caso de CBD h2B6-h3G8.
Se usó un ensayo ELISA de tipo sándwich para ensayar la unión de CBD h2B6-h3G8 para determinar la especificidad hacia cualquiera o ambas moléculas CD32B y/o CD16A (FIG. 5). CD32B sirvió como antígeno diana y se usó CD16A como sonda secundaria. La señal positiva del ensayo ELISA reveló que el CBD h2B6-h3G8 heterodimérico tenía especificidad hacia ambos antígenos. Ensayos similares del CMD h3G8 (que no se unió a CD32B) no mostraron señal alguna.
El análisis de SPR indicó que el CMD h3G8 reconoció de manera inmunoespecífica sCD16, pero no sCD32B, que el CMD h2B6 reconoció de manera inmunoespecífica sCD32B, pero no sCD16, y que el CBD h2B6-h3G8 reconoció de manera inmunoespecífica ambas moléculas sCD16 y sCD32B (FIG. 6A-B). Ninguno de los diacuerpos ensayados se unió al receptor de control, sCD32A (FIG. 6C).
El análisis de SPR también se usó para estimar las constantes cinéticas y de equilibrio de los CMD y del CBD h2B6-h3G8 hacia sCD16 y/o sCD32B. Los resultados se compararon con las mismas constantes calculadas para un fragmento scFV de h3G8. Las FIG. 7A-E muestran los resultados gráficos del análisis de SPR. Las velocidades cinéticas de asociación y disociación, así como la constante de equilibrio, calculadas a partir de Ios resultados que se representan en la FIG. 7 se proporcionan en la Tabla 13.
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De acuerdo con los resultados de los análisis de ELISA, los estudios confirman que el heterodímero covalente h2B6-h3G8 conservó la especificidad hacia CD32B y CD16, y fue capaz de unirse a ambos antígenos simultáneamente. La molécula se representa esquemáticamente en la FIG. 8.
6.2 d is e ñ o y c a r a c t e r iz a c ió n de d ia c u e r p o s b ie s p e c Ífic o s c o v a le n t e s q u e c o m p r e n d e n d o m in io s Fc
En un esfuerzo por crear una molécula de tipo IgG, es decir, que comprende un dominio Fc, se modificó uno de los polipéptidos que comprenden la molécula CBD heterodimérica presentada en el Ejemplo 6.1 para que comprendiera además un dominio Fc (creando una cadena ‘más pesada’ y una ‘más ligera’, análogas a una cadena pesada y ligera de un anticuerpo). La molécula biespecífica heterodimérica entonces contendría un dominio Fc que se dimerizaría con una molécula homóloga, formando una molécula de tipo IgG tetramérica con tetravalencia (es decir, formada por dimerización a través de los dominios Fc de las moléculas biespecíficas heterodiméricas). De forma interesante, dichas moléculas tetraméricas no se detectaron en los medios condicionados de los sistemas de expresión recombinante usando los ensayos funcionales, por ejemplo, analizando los medios condicionados para la unión inmunoespecífica a los antígenos diana. En su lugar, solo una molécula dimérica, que comprende monómeros que consisten en un dominio VL, VH y Fc, se detectó en dichos ensayos funcionales. Para ensayar si la estabilidad de la estructura tetramérica teórica era el problema, los polipéptidos que comprendían el dominio Fc fueron modificados por ingeniería para que comprendieran además una región bisagra, mientras que los polipéptidos que comprendían la cadena ‘más ligera’ fueron modificados por ingeniería para que comprendieran además los 6 aminoácidos C-terminales del dominio constante de cadena ligera kappa humana. Cuando se coexpresaron cadenas "más pesadas" y "más ligeras" rediseñadas en los sistemas de expresión recombinantes, los ensayos funcionales detectaron moléculas de diacuerpo que eran capaces de unirse de manera inmunoespecífica a los antígenos diana y los anticuerpos anti-Fc.
Materiales y métodos
Construcción y diseño de moléculas polipeptídicas: Se diseñaron vectores de expresión de ácido nucleico para producir versiones modificadas de las construcciones 1 y 2 que se presentan en el Ejemplo 6.1. La construcción 5 (SEQ ID NO: 14) y 6 (SEQ ID NO: 15), se crearon modificando por ingeniería las construcciones 1 y 2, respectivamente, para que comprendieran además un dominio Fc. La construcción 7 (SEQ ID NO: 16) se creó modificando por ingeniería la construcción 1 para que comprendiese adicionalmente la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23) en su extremo C-terminal. La construcción 8 (SEQ ID NO: 18) se creó modificando por ingeniería la construcción 2 para que comprendiera además una región bisagra y un dominio Fc (que comprendía la mutación V215A). La representación esquemática de las construcciones 5-8 se encuentra en la FlG. 9.
PCR y construcción del vector de expresión: Todos los protocolos de PCR y de purificación de los productos de PCR fueron como se describe en el Ejemplo 6.1 Los plásmidos pMGX0669 y pMGX0667 sirvieron como moldes para las secuencias codificantes de las construcciones 1 y 2, respectivamente. Las secuencias codificantes para el dominio Fc y/o el dominio bisagra de HulgG fueron SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. Las secuencias codificantes de los ADN molde se amplificaron usando cebadores directos e inversos para que los productos de PCR tuvieran secuencias solapantes, permitiendo a la PCR solapante generar las secuencias codificantes de los productos deseados.
La secuencia codificante de la construcción 1 se amplificó a partir de pMGX0669 usando cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 62, respectivamente. La secuencia codificante de la construcción 2 se amplificó a partir de pMGX0667 usando cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 63, respectivamente. El bisagra-Fc de HulgG se amplificó usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, respectivamente. La construcción 7 (SEQ ID NO: 16) se amplificó a partir de pMGX0669 usando los cebadores directo e inverso SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 67.
PCR solapante: Los productos iniciales de PCR se combinaron como se describe más adelante, y se amplificaron y se purificaron como se describe en el Ejemplo 6.1.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 5, SEQ ID NO: 14 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 9) se amplificó combinando los productos de la PCR de las amplificaciones de la construcción 1 y Fc de HulgG y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:64, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 6, SEQ ID NO: 15 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 9) se amplificó combinando los productos de la PCR de las amplificaciones de la construcción 2 y Fc de HuIgG y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:66, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 8, SEQ ID NO: 18 (mostrada esquemáticamente en la FIG. 9) se amplificó combinando los productos de la PCR de las amplificaciones de la construcción 2 y bisagra-Fc de HuIgG y los cebadores directo e inverso SEQ ID NO:55 y SEQ ID NO:66, respectivamente.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) como se ha descrito anteriormente. Los plásmidos codificantes de las construcciones fueron diseñados como se identifica en la tabla 14:
Tabla 14. CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDO
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: Cuatro cotransfecciones separadas en células HEK-293 usando Lipofectamine 2000, como se describe en la sección 6.1, fueron realizadas: pMGX0669 y pMGX0674, que codifican las construcciones 1 y 6, respectivamente; pMGX0667 y pMGX0676, que codifican las construcciones 2 y 5, respectivamente; y pMGX0677 y pMGX0678, que codifican las construcciones 7 y 8, respectivamente.
La cotransfección de estos dos plásmidos fue diseñada para conducir a la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con estructura de tipo IgG, inmunoespecífico de FcyRIIB y FcyRIIIA. También se realizó una cotransfección adicional: pMGX0674 y pMGX0676, que codifican las construcciones 6 y 5, respectivamente. Tras tres días en cultivo, se recogió el medio condicionado. La cantidad de producto secretado en el medio condicionado fue cuantificada mediante análisis de ELISA anti-Fc de IgG usando el Fc purificado como patrón. A continuación, se normalizaron las concentraciones del producto en las muestras basándose en la cuantificación, y las muestras normalizadas se usaron para los ensayos restantes.
ELISA: Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo secretadas en el medio mediante ELISA de tipo sándwich como se ha descrito anteriormente citado. A menos que se indique de otro modo, se usó CD32B para recubrir la placa, es decir, como proteína diana, y se usó CD16 conjugado con HRP como sonda.
Resultados
Se usó un ensayo ELISA para ensayar las muestras normalizadas de los sistemas de expresión recombinante que comprendían las construcciones 1 y 6 (pMGX669-pMGX674), las construcciones 2 y 5 (pMGX667-pNGX676) y las construcciones 5 y 6 (pMGX674-pMGX676) para la expresión de moléculas de diacuerpo con capacidad para la unión simultánea a CD32B y CD16A (FIG. 10). Los datos del ensayo ELISA indicaron que la cotransfección con las construcciones 1 y 6 y la cotransfección con las construcciones 2 y 5 no pudieron producir un producto que pudiera unirse a cualquiera o ambos antígenos (FIG. 10, □ y ▲, respectivamente). Sin embargo, la cotransfección de las construcciones 5 y 6 condujo a la secreción de un producto con capacidad de unión a ambos antígenos CD32B y CD16. El último producto fue un dímero de las construcciones 5 y 6, que contenía un sitio de unión para cada antígeno con una estructura como se representa esquemáticamente en la FIG. 11.
Con el fin de impulsar la formación de una estructura heterodimérica de tipo IgG, la secuencia codificante para seis aminoácidos adicionales se anexó al extremo C-terminal de la construcción 1, generando la construcción 7 (SEQ ID NO: 16 y mostrado esquemáticamente en la FIG. 9). Los seis aminoácidos adicionales, FNRGEC (SEQ ID NO: 23), fueron derivados del extremo C-terminal de la cadena ligera kappa e interactúan normalmente con el dominio bisagra superior de la cadena pesada en una molécula de IgG. A continuación, se modificó un dominio bisagra por ingeniería, obteniéndose la construcción 6, generando la construcción 8 (SEQ ID NO: 18 y FIG. 9). La construcción 8 además comprendía una mutación de aminoácidos en la región bisagra superior, A215V. Los plásmidos de expresión codificantes de la construcción 7 y la construcción 8, pMGX677 y pMGX678, respectivamente, fueron luego cotransfectados en células HEK-293 y expresados como se describe.
Las moléculas de diacuerpo producidas a partir del sistema de expresión recombinante que comprendía las construcciones 7 y 8 (pMGX0677 pMGX0678), se compararon en un ensayo ELISA para la unión a CD32B y CD16A a las moléculas de diacuerpo producidas a partir de los sistemas de expresión que comprendían las construcciones 1 y 6 (pMGX669 pMGX674), las construcciones 2 y 8 (pMGX669 pMGX678) y las construcciones 6 y 7 (pMGX677 pMGX674) (FIG, 12),
Como antes, la molécula producida por el sistema de expresión que comprendía las construcciones 1 y 6 (pMGX669 pMGX674) demostró incapacidad para unirse a CD32A y CD16a (FIG, 10 y FIG, 12), Por el contrario, el producto de la coexpresión de las construcciones 7 y 6 (pMGX0677 pMGX0674) o de la coexpresión de las construcciones 7 y 8 (pMGX0677-pMGX0678) pudieron unirse a CD32B y CD16 (FIG, 12), Se debe señalar que la construcción 7 es análoga a la construcción 1, a excepción de que la construcción 7 contiene la secuencia C-terminal FNRGEC (SEQ ID NO: 23); y que la construcción 8 es análoga a la construcción 6, salvo que la construcción 8 comprende un dominio bisagra y la mutación A215V, Los datos indican que la adición de los 6 aminoácidos adicionales a partir del extremo C-terminal de cadena ligera C-kappa (FNRGEC; SEQ ID NO: 23) a la cadena "más ligera" que no porta Fc ayudó a estabilizar la formación de las moléculas de diacuerpo tetraméricas similares a IgG, independientemente de si la cadena más pesada correspondiente comprendía un dominio de bisagra (es decir,, pMGX0677 pMGX0674 y pMGX0677-pMGX0678, FIG, 12), La adición del dominio de la bisagra al polipéptido "más pesado" que lleva Fc, sin la adición de la secuencia C-terminal de FNRGEC (SEQ ID NO: 23) a la cadena "más ligera" correspondiente, aparentemente no pudo efectuar una estabilización similar (es decir, falta de unión por producto de cotransfección de las construcciones 2 y 8 (pMGX669 pMGX678)), La estructura de la molécula de diacuerpo tetramérico se representa esquemáticamente en la FIG, 13,
6,3 EFECTO DEL ORDEN DE LOS DOMINIOS Y ENLACES DISULFURO ADICIONALES EN LA FORMACIÓN DE LA MOLÉCULA DE DIACUERPO DE TIPO IgG TETRAMÉRICA
El efecto de la estabilización adicional entre las cadenas polipeptídicas ‘más ligera’ y ‘más pesada’ de la molécula de diacuerpo de tipo IgG tetramérica se investigó mediante la sustitución de los restos seleccionados en las cadenas polipeptídicas por cisteínas, Los restos de cisteína adicionales permiten enlaces disulfuro adicionales entre las cadenas ‘más pesada’ y ‘más ligera’, Adicionalmente, se investigó el orden de los dominios sobre la actividad de unión moviendo el dominio Fc o el dominio bisagra-Fc desde el extremo C-terminal de la cadena polipeptídica al N-terminal, Aunque la actividad de unión de la molécula que comprendía los enlaces disulfuro adicionales no se modificó con respecto a las moléculas de diacuerpo anteriormente construidas con dichos enlaces, la transferencia del dominio Fc o bisagra-Fc al extremo N-terminal de la cadena polipeptídica ‘más pesada’ que comprendía el diacuerpo mejoró sorprendentemente la afinidad de unión y/o la avidez de la molécula biespecífica por uno o ambos de sus antígenos diana,
Materiales y métodos
Construcción y diseño de moléculas polipeptídicas: Se diseñaron vectores de expresión de ácido nucleico para producir versiones modificadas de las construcciones 5, 6 y 8 presentadas en el Ejemplo 6,2, La construcción 9 (SEQ ID NO: 19) y la construcción 10 (SEQ ID NO: 20) (ambas mostradas esquemáticamente en la FIG, 13) fueron análogas a las construcciones 8 y 6, a excepción de que el dominio Fc o el dominio bisagra-Fc, respectivamente, se desplazó del extremo C-terminal del polipéptido al N-terminal, Además, todos los dominios Fc usados eran dominios Fc de IgG1 de tipo natural, La construcción 11, SEQ ID NO: 21, (mostrada esquemáticamente en la FIG, 14) era análoga a la construcción 2 del Ejemplo 6,1, salvo que el extremo C-terminal fue diseñado para que comprendiera además la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO: 23), La construcción 12, SEQ ID NO: 22 (mostrada esquemáticamente en la FIG, 14) era análoga a la construcción 5 del Ejemplo 6,2, salvo que el dominio Fc comprendía además una región bisagra, Asimismo, para las construcciones 11 y 12, el dominio VL de 2B6 y el dominio VH de 2B6 comprendía una sola modificación de aminoácido (G105C y G44C, respectivamente) de modo que una glicina de cada dominio se reemplazó por cisteína,
PCR y construcción del vector de expresión: Todos los protocolos de PCR y de la purificación de los productos de PCR fueron como se describe en el Ejemplo 6,1 y 6,2,
PCR solapante: Los productos finales fueron construidos, amplificados y purificados usando los métodos que se describen en el Ejemplo 6,1 y el Ejemplo 6,2,
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc,) como se ha descrito anteriormente, Los plásmidos codificantes de las construcciones fueron diseñados como se identifica en la tabla 15:
Tabla 15. CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDO
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: Tres ootransfecoiones separadas en células HEK-293 usando Lipofeetamine 2000, como se describe en la sección 6.1, fueron realizadas: pMGX0669 y pMGX0719, que codifican las construcciones 1 y 9, respectivamente; pMGX0669 y pMGX0718, que codifican las construcciones 1 y 10, respectivamente; y pMGX0617 y pMGX0717, que codifican las construcciones 11 y 12, respectivamente. La cotransfección de estos dos plásmidos fue diseñada para conducir a la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con estructura de tipo IgG, inmunoespecífico para FcyRIIB y FcyRIIIA. Tras tres días en cultivo, se recogió el medio condicionado. La cantidad de producto secretado en el medio condicionado fue cuantificada mediante análisis de ELISA anti-Fc de IgG usando el Fc purificado como patrón. A continuación, se normalizaron las concentraciones del producto en las muestras basándose en la cuantificación, y las muestras normalizadas se usaron para los ensayos restantes.
ELISA: Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo secretadas en el medio mediante ELISA de tipo sándwich como se ha descrito anteriormente citado. A menos que se indique de otro modo, se usó CD32B para recubrir la placa, es decir, como proteína diana, y se usó CD16 conjugado con HRP como sonda.
Transferencia Western: Se analizaron aproximadamente 15 ml de medio condicionado procedente de las tres cotransfecciones anteriormente descritas mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Se tiñó un gel con Simply Blue Safestain (Invitrogen) y se transfirió un gel idéntico a membranas de PVDF (Invitrogen) usando métodos de transferencia convencionales. Tras la transferencia, la membrana se bloqueó con leche desnatada en polvo al 5 % en 1X PBS. Luego se incubó la membrana en 10 ml de los fragmentos H+L de anticuerpo de cabra anti-IgG 1 humana, conjugados con HRP, diluidos 1:8.000 en leche en polvo al 2 % en 1XPBS/Tween 20 al 0,1 % a temperatura ambiente durante 1 h con agitación suave. Tras un lavado con 1X PBS/Tween 20 al 0,3 %, 2X 5 min cada uno, luego 20 min a temperatura ambiente, se reveló la membrana con el sistema de detección de transferencia Western ECL (Amersham Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La película se reveló en un procesador de rayos X.
Resultados
Los medios condicionados de los sistemas de expresión recombinante que comprendían las construcciones 1 y 9; las construcciones 1 y 10; y las construcciones 11 y 12 se analizaron mediante SDS-PAGE (en condiciones no reductoras) y análisis de transferencia Western (usando un anticuerpo anti-IgG como sonda). La transferencia Western reveló que el producto de los sistemas que comprendían las construcciones 11 y 12 o que comprendían las construcciones 9 y 1 formaron principalmente una sola especie de molécula de aproximadamente 150 kDa (FIG. 15, carriles 3 y 2, respectivamente). Ambos productos tienen enlaces disulfuro internos modificados por ingeniería entre las cadenas ‘más ligera’ y ‘más pesada’ que comprenden el diacuerpo. Por el contrario, la molécula sin enlaces disulfuro internos modificados por ingeniería entre las cadenas ‘más ligera’ y ‘más pesada’, formadas por las construcciones 10 y 1, formaron al menos dos especies moleculares de pesos moleculares aproximados de 75 -100 kDa (FIG. 15, carril 1).
A pesar de los resultados de la transferencia Western, se encontró que cada uno de los tres productos fue capaz de unirse a CD32A y CD16 (FIG. 16). Sorprendentemente, con respecto al producto que comprende un dominio Fcbisagra C-terminal (formado por las construcciones 11 y 12), el producto de ambos sistemas en donde el dominio Fc (o Fc-bisagra) estaba en el extremo amino de la cadena polipeptídica que contiene Fc (es decir,, la cadena "más pesada" (construcciones 9 1 y construcciones 10 1) demostró una afinidad y/o avidez mejoradas a uno o ambos de sus péptidos objetivo (es decir, CD32B y/o CD16).
6.4 EFECTO DEL SITIO DE ESCISIÓN INTERNO/EXTERNO SOBRE EL PROCESAMIENTO DEL PRECURSOR DE POLIPROTEÍNA Y LA EXPRESIÓN DEL DIACUERPO BIESPECÍFICO COVALENTE; DISEÑO Y c a r a c t e r iz a c ió n del d ia c u e r p o b ie s p e c íf ic o q u e c o m p r e n d e par tes de la c a d e n a la m b d a y EL DOMINIO BISAGRA DE IgG HUMANA
Como se describe en el presente documento, las cadenas polipeptídicas individuales del diacuerpo o la molécula de diacuerpo de la divulgación pueden expresarse como una sola molécula precursora de poliproteína. Se ensayó la capacidad de los sistemas recombinantes descritos en los Ejemplos 6.1-6.3 para procesar apropiadamente y expresar un CBD funcional a partir de dicho precursor de poliproteína modificando por ingeniería un ácido nucleico para que codificara tanto la primera como la segunda cadena polipeptídica de un CBD separadas por un sitio de escisión interno, en particular, un sitio de escisión de furina. El CBD funcional fue aislado del sistema recombinante que comprendía la molécula precursora de poliproteína.
Como se analiza en el Ejemplo 6,3, la adición de los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO: 23), resultó estabilizar la formación del diacuerpo, supuestamente mediante las interacciones entre cadenas potenciadas entre los dominios que comprendían SEQ ID NO: 23 y aquellos dominios que comprendían un dominio Fc o un dominio bisagra-Fc. El efecto estabilizador de esta interacción de tipo cadena lambda/Fc se ensayó en el CBD en el que ninguna cadena polipeptídica comprendía un dominio Fc. Se modificó una cadena polipeptídica del diacuerpo por ingeniería para que comprendiera la SEQ ID NO: 23 en su extremo C-terminal; la cadena polipeptídica asociada se modificó por ingeniería para que comprendiera la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77), que fue derivada del dominio bisagra de una IgG. La comparación de este CBD con el compuesto de las construcciones 1 y 2 (del Ejemplo 6.1) reveló que el CBD que comprendía los dominios derivados del dominio bisagra y la cadena lambda mostraron afinidad ligeramente mayor por uno o ambos de sus epítopos diana.
Materiales y métodos
• Construcción y diseño de moléculas polipeptídicas: Precursor de poliproteína: Se diseñaron vectores de expresión de ácido nucleico para producir 2 moléculas precursoras de poliproteína, ambas representadas esquemáticamente en la FIG. 17. La construcción 13 (SEQ ID NO: 95) compuesta del extremo N-terminal de la cadena polipeptídica, el dominio VL de 3G8, el dominio VH de 2.4G2 (que se une a mCD32B), un sitio de escisión de furina, el dominio VL de 2.4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótidos que codifica la construcción 13 se proporciona en la SEQ ID NO: 96. La construcción 14 (SEQ ID NO: 97) (FIG. 17), compuesta del extremo N- terminal de la cadena polipeptídica, el dominio VL de 3G8, el dominio VH de 2.4G2 (que se une a mCD32B), un sitio de escisión de furina, un sitio FMD (proteasa C3 del virus de la fiebre aftosa), el dominio VL de 2.4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótidos que codifica la construcción 14 se proporciona en la SEQ ID NO: 98.
Se diseñaron vectores de expresión de ácido nucleico para producir versiones modificadas de las construcciones 1 y 2 que se presentan en el Ejemplo 6.1. La construcción 15 (SEQ ID NO: 99) (FIG. 17) era análoga a la construcción 1 (SEQ ID NO: 9), presentada en el Ejemplo 6.1, salvo que el extremo C-terminal de la construcción 15 comprendía la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 23). La secuencia del ácido nucleico que codifica la construcción 15 se proporciona en la SEQ ID NO: 100. La construcción 16 (SEQ ID NO: 101) (FiG. 17) era análoga a la construcción 2, que se presenta en el Ejemplo 6.1, salvo que el extremo C-terminal de la construcción 16 comprendía la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 77). La secuencia del ácido nucleico que codifica la construcción 16 se proporciona en la SEQ ID NO: 102.
PCR y construcción del vector de expresión: Todos los protocolos de PCR y de la purificación de los productos de PCR fueron como se describe en el Ejemplo 6.1 y 6.2.
PCR solapante: Los productos finales fueron construidos, amplificados y purificados usando los métodos que se describen en el Ejemplo 6.1 y el Ejemplo 6.2 con cebadores apropiados.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.) como se ha descrito anteriormente. Los plásmidos codificantes de las construcciones fueron diseñados como se identifica en la tabla 16:
Tabla 16. CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDO
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Expresión del polipéptido/diacuerpo: Una transfección y una cotransfección en células HEK-293 usando Lipofectamine 2000, como se describe en la sección 6.1, fueron realizadas: individual: pMGX0750, que codifica la construcción 13; y cotransfección: pMGX0752 y pMGX0753, que codifican las construcciones 15 y 16, respectivamente. Tras tres días en cultivo, se recogió el medio condicionado y el producto secretado se purificó por afinidad como se describe.
ELISA: Se ensayó la unión de las moléculas de diacuerpo secretadas en el medio mediante ELISA de tipo sándwich como se ha descrito anteriormente citado. Se usó CD32B murino para recubrir la placa, es decir, como proteína diana, y se usó CD16A conjugado con HRP como sonda para el producto de la cotransfección de las construcciones 15 y 16. Se usó mCD32B como proteína diana y se usó CD16A conjugado a biotina como sonda para el sistema recombinante que comprendía la construcción 13.
Resultados
Se analizó el medio condicionado de los sistemas de expresión recombinante que comprendían las construcciones 13 mediante ELISA de tipo sándwich. El ensayo ELISA ensayó la unión del CBD para determinar la especificidad a cualquiera o ambas de las moléculas mCD32B y/o CD16 (FIG. 18). CD32B sirvió como antígeno diana y se usó CD16A como sonda secundaria. La señal positiva del ensayo ELISA reveló que el CBD h2.4G2-h3G8 heterodimérico producido a partir del precursor de poliproteína tenía especificidad hacia ambos antígenos.
De forma análoga, se ensayó el producto purificado generado mediante la cotransfección de los vectores codificantes de las construcciones 15 y 16 en un ensayo ELISA, y se comparó con el producto que comprendía las construcciones 1 y 2 (Ejemplo 6.1). CD32B sirvió como antígeno diana y se usó CD16A como sonda secundaria. Al igual que con el producto compuesto de las construcciones 1 y 2, se encontró que el producto de las construcciones 15 y 16 era capaz de unirse simultáneamente a CD32B y CD16A. De hecho, el producto de las construcciones 15 y 16 mostró afinidad ligeramente potenciada hacia uno o ambos antígenos diana, es decir, CD32B o CD16A. Esto quizás se deba a la estabilidad y/o a la fidelidad aumentada (con respecto a la interacción del dominio VH-VL de tipo silvestre) de la asociación intercatenaria producida por la interacción de la región de la cadena lambda, FNRGEC (SEQ ID NO: 23) y la región bisagra VEPKSC (SEQ ID NO: 77), que está ausente en el producto compuesto de las construcciones 1 y 2.
6.5 USO DE REACTIVOS DE REDIRECCIÓN DE AFINIDAD DOBLE ("DART") PARA UNIR ENTRE SÍ MÚLTIPLES AFINIDADES
También se describen nuevos reactivos de redireccionamiento de doble afinidad ("DART"), así como nuevas formas de vincular múltiples afinidades. Los "DART" pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos, etc., siendo capaces de este modo de unirse simultáneamente a uno, dos, tres o más epítopos diferentes (que pueden ser de antígenos iguales o diferentes). Las moléculas "DART" además pueden ser monovalentes, bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes, hexavalentes, etc., siendo capaces de este modo de unirse simultáneamente a uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más moléculas. Como se muestra en la figura 35, estos dos atributos de DART pueden combinarse, por ejemplo, para producir anticuerpos biespecíficos que sean tetravalentes, etc.
Un avance es el desarrollo de una molécula de DART que tenga afinidad por un receptor inmunitario prototipo, huCD32B, así como afinidad por un hapteno, fluoresceína. Esta molécula DART, denominada "2B6/4420", sirve como adaptador universal, capaz de coligar huCD32B con moléculas que interaccionan con las parejas de unión conjugadas a fluoresceína. CD32B es un receptor de Fc que tiene la capacidad de inactivar señales activadoras en virtud del agrupamiento con complejos inmunitarios de señalización de la activación. En su implementación inicial, esta tecnología permite realizar un examen rápido de diversas dianas biológicas para el agrupamiento con huCD32B sin la necesidad de generar nuevas construcciones de DART. La molécula de DART 2B6/4420 puede mezclarse simplemente con un anticuerpo marcado con fluoresceína contra un receptor de superficie celular y, con ello, imitar la acción de una molécula DART con afinidad por ese receptor (FIG. 20). Además, este reactivo permite la unión eficaz de reactivos de afinidad que no se expresen ni produzcan fácilmente, permitiendo superar limitaciones técnicas. Las moléculas de DART que contienen 2B6/4420 son evidentemente útiles como herramientas de investigación y también como candidatos clínicos. Las moléculas de DART 2B6/4420 producidas a partir de células HEK293 pueden unirse simultáneamente a CD32B y a fluoresceína en un ensayo ELISA. Adicionalmente, puede inhibir la proliferación celular mediante el reclutamiento de CD32B al complejo BCR a través de la coligación con CD79. El brazo de 2B6 de la molécula de DART puede sustituirse con una secuencia de anticuerpo diferente o una secuencia de unión que tenga otra especificidad importante.
Materiales y métodos:
Construcciones de plásmidos: La molécula 2B6/4420 se deriva de las secuencias del anticuerpo monoclonal mAb 2B6 humanizado (hu2B6, MGA321) y una versión quimérica Fv de ratón/Fc humano del mAb anti-fluoresceína, 4420. El DART completamente ensamblado consiste en dos polipéptidos, que dan lugar a la unión covalente de las dos regiones Fv. El primer polipéptido consiste en una secuencia señal de secreción seguida por el VL de hu2B6 producido como una proteína de fusión con 4420VH separado por un enlazador consisten en los restos de aminoácidos GGGSGGGG. La secuencia FNRGEC, derivada del extremo C-terminal de cadena ligera kappa, se anexa al extremo C-terminal de este polipéptido. El otro polipéptido consiste en la secuencia señal-4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VH, con la secuencia VEPKSC, derivada del extremo C-terminal del fragmento Fd de IgG1 humana, anexado al extremo C-terminal. Las cisteínas en las dos cadenas forman un enlace disulfuro, que une de manera covalente los dos polipéptidos entre sí (FIG. 20). Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos descritos se amplificaron por PCR a partir de los plásmidos existentes, se combinaron por PCR solapante y se clonaron en pCIneo (Promega) entre los sitios Nhe I y EcoR I. Por último, se usó como control una molécula de DART con afinidad por huCD32B y huCD16 (2B6/3G8) que se había construido previamente usando métodos similares a los descritos anteriormente.
Antibodies: Los anticuerpos monoclonales murinos anti-CD79b humano, CB3.1 y CB3.2 (hibridomas) se obtuvieron del Dr. Cooper MD, Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham AL. Se marcaron CB3.1 y CB3.2 con isotiocianato de fluoresceína (FITC) siguiendo las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford IL). El fragmento F(ab')2 de un fragmento Fc específico, de IgG de cabra anti-ratón (GAM) se obtuvo de Jackson Laboratories (West Grove, PA). El mAb de ratón anti-huCD32B, 3H7, se produjo y purificó de manera interna. El anticuerpo anti-2B6Fv de cabra se produjo inmunizando cabras con el anticuerpo completo hu2B6 y se purificó por afinidad contra la región Fv de hu2B6. Los anticuerpos HulgG, FITC-hulgG y anti-IgG de ratón conjugado a HRP se obtuvieron en Jackson Immunoresearch. El anticuerpo anti-cabra conjugado con HRP se obtuvo en Southern Biotech.
Expresión de DART: Se cotransfectaron plásmidos codificantes de cada cadena en células 293H (Invitrogen) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína secretada se recogió 3­ 4 veces en intervalos de tres días y se purificó por cromatografía de líquidos contra una forma soluble inmovilizada de CD32B.
ELISA: Se capturaron las moléculas de DART 2B6/4420 o 2B6/3G8 en placas MaxiSorp (Nalge Nunc) recubiertas con proteína S marcada con FITC (Novagen), IgG humana o FITC-huIgG. La detección se produjo uniendo el ectodominio de CD32B soluble, seguido de 3H7 (un anticuerpo monoclonal de ratón específico de CD32B), y por último, anticuerpo anti-ratón-HRP. Como alternativa, se realizó la detección uniendo un antisuero purificado por afinidad de un anticuerpo policlonal anti-Fv 2B6 de cabra, seguido de anticuerpo anti-cabra-HRP. Se detectó la actividad de HRP usando un sustrato TMB colorimétrico (BioFXy) y se leyó en un lector de placas para ELISA VersaMax.
Purificación y ensayo de la proliferación de los linfocitos B: Se separaron células mononucleares de sangre periférica mediante un método de gradiente de Ficoll/Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech. RU) usando sangre de donantes sanos. Se aislaron los linfocitos B usando el kit Dynal B Cell Negative Isolation (Dynal Biotechnology Inc., NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de los linfocitos B aislados (CD20) fue superior al 90 % como se estimó mediante análisis de FACS. Para el ensayo de proliferación, se sembraron linfocitos B purificados en medio RPMI 1640 completo en placas de microtitulación de 96 pocilios de fondo plano a una densidad celular de 1x105 células por pocilio en un volumen final de 200 gl y se incubaron durante 48 h en presencia y ausencia de anticuerpos y diacuerpos a 372C en CO2 al 5 %. Luego se añadió 1 gCi/pocillo de [3H]timidina (Perkin Elmer, Wellesley, MA) y se continuó la incubación durante otras 16-18 h antes de realizar la recogida. La incorporación de [3H]timidina se midió mediante recuento de centello líquido.
Resultados
Para demostrar que 2B6/4420 DART era activo y específico, se realizaron dos experimentos ELISA. En primer lugar, 2B6/4420 o 2B6/3G8 (como control negativo) se unió a una proteína conjugada con fluoresceína (proteína S) que había sido recubierta sobre placas para ELISA. A continuación, el brazo de 2B6 de DART fue acoplado por CD32B soluble. La unión se detectó mediante otro anticuerpo CD32B con un epítopo que no se solapa con el de 2B6, seguido de un anticuerpo secundario conjugado a HRP. Aunque DART 2B6/4420 es capaz de unirse simultáneamente a fluoresceína y a CD32B, DART 2B6/3G8 no tiene dicha capacidad (FIG. 21, Panel A). Cuando las moléculas de DART se capturan en placas recubiertas con CD32B soluble y se detecta la unión mediante un anticuerpo específico de Fv de hu2B6, ambas moléculas de DART muestran una buena unión. Para demostrar que DART 2B6/4420 fue capaz de unir la fluoresceína conjugada a IgG humana (dado que este es el contexto de la implementación inicial de este reactivo), HuIgG, no marcado o marcado con fluoresceína, se unió a placas para ELISA y se usó para capturar DART 2B6/4420. De nuevo, se usó DART 2B6/3G8 como control negativo. Se detectó la unión usando un anticuerpo específico de Fv de Hu2B6. DART 2B6/4420 se une claramente a FITC-HuIgG, pero no se une a HuIgG no marcado, lo que demuestra que esta molécula de DART es capaz de unir fluoresceína conjugada a un anticuerpo y que no hay unión significativa al anticuerpo solo. Como cabía esperar, no se detectó ninguna unión por parte de DART 2B6/3G8 en ninguno de estos contextos.
Se realizaron experimentos para demostrar que DART 2B6/4420 era capaz de funcionar como reactivo de doble afinidad que podría tener un efecto sobre la señalización en el contexto de un ensayo basado en células. Se ha demostrado que la coagregación de CD32B con BCR inhibe la activación de los linfocitos B. Se exploró la capacidad de DART 2B6/4420 para coacoplarse con CD32B estando el BCR recubierto con anticuerpos aCD79b marcados con fluoresceína y para generar la inhibición de la proliferación celular. Se realizó una selección negativa de linfocitos B de sangre humana y se activaron a través del tratamiento usando concentraciones crecientes de anticuerpo de ratón anti-CD79b humano marcado con FITC, los clones CB3.1 y CB3.2, y mediante la adición de un fragmento F(ab’)2 de un GAM específico de Fc como reactivo secundario con el fin de reticular el BCR, junto con una concentración fija (5 gg/ml) de DART 2B6/4420 o una cantidad equivalente del DART 2B6/3G8, una molécula que no se dirige a ia fluoresceína, por lo tanto se utiliza como control. La proliferación celular, medida como la incorporación de [3H]-timidina, aumentó con concentraciones crecientes del activador del anticuerpo monoclonal anti-CD79b-FITC en ausencia de las moléculas de DART o en presencia de DART 2B6/3G8 de control. La presencia de DART 2B6/4420 produjo una reducción evidente de la proliferación de los linfocitos B a todas las concentraciones del anticuerpo monoclonal anti-CD79b humano-FITC (FIG. 22, Paneles A y B y FIG. 23, Panel A).
No se observó inhibición de la proliferación cuando las linfocitos B recubiertos con CB3.2 no marcado y activados usando las mismas condiciones experimentales se trataron con DART 2B6/4420 demostrando su especificidad hacia su diana (FIG. 23, Panel B). Estos datos demuestran que DART 2B6/4420 puede formar reticulación con CD32B y el BCR, y suministrar una señal inhibidora con capacidad para bloquear la activación de células inducida por el receptor del antfgeno.
6.6 DART INMUNOTERAPÉUTICO CONTRA TUMORES MALIGNOS DE LINFOCITOS B QUE EXPRESAN CD32B Actualmente, los tumores malignos de linfocitos B se tratan usando el anticuerpo anti-CD20 Rituxan®. Algunos tumores malignos de linfocitos B, no obstante, no expresan CD20 ni se vuelven resistentes a Rituxan. Las moléculas de DART de la presente divulgación proporcionan una inmunoterapia alternativa capaz de resolver los problemas asociados con el uso del anticuerpo anti-CD20 Rituxan®.
La molécula MGD261 es una molécula de redirección de afinidad doble (DART) que se une a hCD32B (a través del anticuerpo h2B6) y hCD16A y hCD16B (a través del anticuerpo h3G8).
La eficacia (agotamiento de linfocitos B) y la seguridad de MGD261 se probaron en mCD32-/- hCD16A+ C57BI/6, mCD32-/- hCD32B+ C57BI/6 y mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57BI/6. En este experimento con dosis repetidas, los ratones recibieron 6 inyecciones IV (dos veces a la semana durante 3 semanas). El agotamiento de los linfocitos B se controló mediante FACS. Se controló la seguridad mediante observación al lado de la jaula.
Los datos indican que MGD261 es capaz de producir el agotamiento de los linfocitos B en ratones doblemente transgénicos sin inducir algún efecto secundario significativo.
Datos: Se inyectaron a ratones C57BI/6 mCD32-/-hCD16 A+, C57BI/6 mCD32-/- hCD32B+ y ratones C57BI/6 mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ de la colonia de reproducción MacroGenics por vía IV en los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17 MGD261 (10, 3, 1 o 0,3 mg/kg), o un anticuerpo irrelevante (hE16 10 mg/kg). Se recogió la sangre en los días -19 (antes de la extracción de sangre), 4, 11, 18, 25 y 32 para el análisis de FACS. Tres veces a la semana se registró el estado de salud y la actividad de los animales.
Diseño:
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Método para el análisis de FACS: Las muestras de sangre completa se recogieron 18 días antes de la administración de h2B6-h3G8 y 4, 11, 18, 25 y 32 días tras el tratamiento. Se analizaron las muestras de sangre para determinar el efecto de la molécula h2B6-h3G8 sobre el recuento de linfocitos B mediante un ensayo basado en FACS. Se usó un protocolo sin lavado para recuentos de linfocitos B, linfocitos T y PMN mediante el uso de cuentas FlowCount, obtenidas de Beckman Coulter. El panel de anticuerpos que se usó para el análisis fue 1A8-FITC para PMN, CD3-PE para linfocitos T, CD19-APC para linfocitos B y CD45-PerCP para leucocitos totales.
Resultados
Los ratones tratados con hE16 o MGD261 (con cualquier concentración) no mostraron ningún signo de malestar en ningún momento durante el experimento.
Se observó el agotamiento de los linfocitos B en los ratones doblemente transgénicos hCD16A y hCD32B. El diacuerpo h2B6-3G8 se acopla a las células efectoras que expresan hCD16A y a los linfocitos B que expresan hCD32B; los acoplamientos fueron necesarios para la destrucción de los linfocitos B. El agotamiento de los linfocitos B no se observó en ratones unitransgénioos (FIG. 24). No hubo cambios importantes en Ios linfocitos T ni en el nivel de PMN durante el estudio.
Como una demostración adicional de los inmunoterapéuticos alternativos descritos en el presente documento, un sustituto de MGD261, denominado "2.4G2-3G8 DB" fue construido. La molécula 2.4G2-3G8 DB es una molécula de redirección de doble afinidad (DART) que se une a mCD32B (a través del anticuerpo 2.4G2) y a hCD16A y hCD16B (a través del anticuerpo h3G8).
La eficacia (agotamiento de linfocitos B) y seguridad del diacuerpo 2.4G2-3G8 se ensayó en ratones mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD16-/- hCD16B+ y mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+. En este experimento con dosis repetidas, los ratones recibieron 9 inyecciones IP (intraperitoneal) (tres veces a la semana durante 3 semanas). El agotamiento de los linfocitos B se controló mediante FACS. Se controló la seguridad mediante observación al lado de la jaula.
Los datos indican que el diacuerpo DB 2.4G2-3G8 es capaz de producir el agotamiento de los linfocitos B en ratones transgénicos hCD16 sin inducir ningún efecto secundario significativo.
Datos: Se inyectaron a ratones C57B1/6 mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+, mCD16-/- hCD16B+ y mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+ de la colonia de reproducción MacroGenics por vía IP en los días 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 y 18 el DB 2.4G2-3G8 (75 ug/ratón) o PBS. Se recogió la sangre en los días -10 (antes de la extracción de sangre), 4, 11 y 18 para el análisis de FACS. Tres veces a la semana se registró el estado de salud y la actividad de los animales.
Figure imgf000107_0001
Método para el análisis de FACS: Se extrajeron muestras de sangre completa 10 días antes de la administración de la molécula 2.4G2-3G8 y 4, 11 y 18 días después de iniciarse el tratamiento. Se analizaron las muestras de sangre para determinar el efecto de la molécula 2.4G2-3G8 sobre el recuento de linfocitos B mediante un ensayo basado en FACS. Se usó un protocolo sin lavado para recuentos de linfocitos B, linfocitos T y PMN mediante el uso de tubos TruCOUNT, obtenidos en BD Immunocytometry System. El panel de anticuerpos que se usó para el análisis fue 1A8-FITC para PMN, CD3-PE para linfocitos T, CD19-APC para linfocitos B y CD45-PerCP para leucocitos totales. Resultados
Los ratones tratados con hE16 o 2.4G2-3G8 no mostraron ningún signo de malestar en ningún momento durante el experimento.
Se observó el agotamiento de los linfocitos B en los ratones mCD16-/- hCD16A+ o mCD16-/- hCD16A+ hCD16B+, pero no en los ratones mCD16-/-. Estos datos indican que las células efectoras que portan hCD16A fueron necesarias para la destrucción de los linfocitos B (FIG. 25). No hubo cambios importantes en los linfocitos T ni en el nivel de PMN durante el estudio.
Modelo intravenoso (IV): Se ensayó la actividad antitumoral de la molécula MGD261 usando un modelo intravenoso (IV) de la estirpe celular tumoral humana Raji. La estirpe celular Raji es una estirpe celular de linfoma de Burkitt humano que expresa hCD32B. Cuando se inyectan por vía intravenosa en ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/-, las células tumorales se localizan en la columna vertebral y producen la parálisis de las patas traseras.
Los datos indican que MGD261 es capaz de bloquear el crecimiento de las células tumorales Raji in vivo en ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/-. Los datos indican que MGD261 puede usarse en el tratamiento de tumores malignos de linfocitos B que expresen CD32B en los seres humanos.
Datos: Se inyecté a ratones C57B1/6 mCD16-/-, hCD16A+, RAG1-/- de doce-veinte semanas de edad de la colonia de reproducción MacroGenics por vía IV en el día 05x106 células Raji, En los días 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 y 30 los ratones también fueron tratados por vía intraperitoneal (IP) con 250, 25 o 2,5 pg de MGD261 o con PBS (control negativo), Después se observó a los ratones a diario y se documentó el peso corporal dos veces a la semana, Los ratones que desarrollaron parálisis de las patas posteriores fueron sacrificados,
Resultados: Los ratones tratados con PBS murieron entre el día 25 y el día 50, Los ratones tratados con MGD261 sobrevivieron al menos hasta el día 90 (FIG, 26), El aumento de la supervivencia tiene significación estadística, Una comparación de las curvas de supervivencia usando la prueba de rangos logarítmicos dio una x2 de 96,46 (df9; valor de p< 0,0001),
6.7 e xpr esió n de d a r t en p r o c a r io ta s
Se realizaron experimentos para demostrar la capacidad para producir DART en hospedadores no mamíferos, Por consiguiente, se transformó Escherichia coli con un plásmido que expresaba DART, y se controló la expresión de DART,
Materiales y métodos:
Construcción del plásmido: 3G8 es un anticuerpo monoclonal humanizado contra HuCD16, La molécula de DART descrita en este caso consiste en dos cadenas unidas de manera covalente, cada una de las cuales tiene un dominio VL seguido de un espaciador, luego un VH seguido de un resto de Cys en un buen contexto para formar un enlace disulfuro con la cadena opuesta, La secuencia de DART que codifica 3G8VL-GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 10)-3G8VH-LeuGlyGlyCys se amplificó por PCR a partir de una construcción de expresión eucariota existente y se digirió con las enzimas Nco I y EcoR I, El vector diana fue pET25b (+) (Novagen), que contiene una secuencia líder pelB para la secreción en E. coli, Antes de la inserción de las secuencias de DART 3G8/3G8, el vector fue modificado de la siguiente manera: En primer lugar, El promotor T7 fue reemplazado por el promotor lac de menor actividad para favorecer la expresión soluble, aunque a menor nivel de proteínas bajo su control, Adicionalmente, se introdujeron dos mutaciones puntuales para eliminar dos codones Met internos presentes al principio del sitio de clonación múltiple (MCS) para favorecer el inicio en el Met presente al principio de la secuencia líder pelB, La molécula de DART que se produce con esta construcción consiste en dos brazos de región V que tienen la misma especificidad, en concreto, HuCD16,
Expresión: Se transformaron células BL21DE3 (Novagen) con el plásmido pET25b(+) T7-lac+ 3G8/3G8 y se usó una colonia resistente a la ampicilina para sembrar un caldo de cultivo, Cuando el cultivo alcanzó las 0,5 unidades de DO600, se añadió IPTG 0,5 mM para inducir la expresión, El cultivo se desarrolló a 30 °C durante 2 horas y se recogió medio libre de células,
Purificación: DART 3G8/3G8 se purificó en un proceso de dos etapas usando cromatografía de afinidad y de exclusión molecular, La molécula de DART fue capturada del medio condicionado usando cromatografía de afinidad, Específicamente, CD16A se acopló a Sepharose 4B (GE Healthcare) activado con CNBr, La resina CD16A-Sepharose se equilibró en Tris/HCl 20 mM, pH 8,0 antes de cargarla, Tras terminar la carga, se lavó la resina con tampón de equilibrado antes de realizar la elución de DART unido con glicina 50 mM a pH 3,0, La molécula de DART eluida se neutralizó de inmediato con Tris/HCl 1 M pH 8,0 y se concentró usando un concentrador de tipo centrifugación (Vivaspin 20, 10k MWCO PES, VivaScience Inc,), La molécula de DART concentrada además se purificó por cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada en PBS,
Resultados
1.7 litros del medio condicionado con el cultivo de E. coli fueron procesados a través de la columna CD16A-Sepharose, El rendimiento de DART fue de 0,12 mg, El análisis de DART purificado por SDS-PAGE y SEC demostró una compatibilidad con la molécula de DART de control expresada en células de mamífero (CHO) (FIG, 27),
Ensayo de unión de ELISA para la molécula de DART h3G8-h3G8 expresada en E. coli La expresión de DART h3G8-h3G8 en E. coli se midió usando un ensayo de ELISA, Se usaron 50 pl/pocillo de una solución 2 pg/ml del anticuerpo específico de Fv anti-h3G8, 2C11 para recubrir una placa de 96 pocilios Maxisorp en tampón carbonato a 4 2C durante la noche, Se lavó la placa tres veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y luego se bloqueó con BSA al 0,5 % en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadir la molécula de DART que se iba a ensayar, Durante el bloqueo, h3G8-h3G8 DART, h2B6-h3G8 DART y h2B6-h2B6 DART expresados en E. coli (control negativo) se diluyeron en 1 pg/ml y 0,3 pg/ml en PBST/BSA, Se añadieron 50 pl/pocillo de las moléculas de DART diluidas a cada pocilio, La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, Tras lavar con PBS-T tres veces, se añadieron a la placa 50 pl/pocillo de una solución 0,1 pg/ml de la proteína de fusión sCD16-Fc biotinilada, La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, Tras lavar con PBS-T tres veces, se usaron 50 pl/pocillo de una dilución 1:5000 de estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) para la detección y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, Se lavó la placa con PBS-T tres veces y se desarrolló usando 80 ul/pocillo del sustrato TMB. Tras 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo con 40 pl/pocillo de H2SO4 al 1 %. Se leyó la DO450 nm usando un lector de placas de 96 pocilios y el software SOFTmax. Se representó gráficamente la lectura usando el software GraphPadPrism 3.03 (FIG. 28).
6.8 MUERTE DE LINFOCITOS B HUMANOS INDUCIDA POR DART
Se incubaron células PBMC humanas durante una noche con: CD16-CD32B - hu3G8-hu2b6 (descrito anteriormente); ch2B6-aglyc - anticuerpo 2B6 quimérico aglicosilado (descrito en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos, pendiente de tramitación, publicada como US2005 / 0260213) y CD16-CD79. Las secuencias de ADN y de proteína codificada de CD16-CD79 son las siguientes:
H3G8VL-CB3.1VH
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 226):
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga 50
gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100
atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150
ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag 200
tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg 250
ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300
acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg 350
cggaggccag gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg 400
gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc 450
tactggatga actgggtgaa gcagaggcct ggacaaggcc ttgaatggat 500
tggtatggtt gatccttcag acagtgaaac tcactacaat caaatgttca 550
aggacaaggc cacattgact gttgacaaat cctccagcac agcctacatg 600
cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag 650
agctatgggc tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagttg 700
agcccaaatc ttgt 714
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:227)
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 50
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 100
TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLQQPGAEL VRPGASVKLS CKASGYTFTS 150
YWMNWVKQRP GQGLEWIGMV DPSDSETHYN QMFKDKATLT VDKSSSTAYM 200
QLSSLTSEDS AVYYCARAMG YWGQGTSVTV SSVEPKSC 238
CB3.1VL-h3G8VH
Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 228):
g a tg t t g tg a tg a c c c a g a c t c c a c tc a c t t t g t c g g t t a a c a ttg g a c a 50
a c c a g c c tc c a t c t c t t g t a a g tc a a g tc a g a g c c tc t ta g a ta c tg a tg 100
g a a a g a ca ta t t t g a a t t g g t t g t t a c a g a ggccaggcca g tc tc c a a a c 150
c g c c ta a tc t a t c t g g t g t c ta a a c tg g a c tc tg g a g tc c c tg a c a g g t t 200
c a c tg g c a g t g g a tca g g g a c a g a t t t c a c a c tg a a a a tc a g ca g a g tg g 250
a g g c tg a g g a t t t g g g a a t t t a t t a t t g c t g g ca a g g ta c a c a t t t t c c g 300
c tc a c g t t c g g tg c tg g g a c ca a g c tg g a g c tg a a a g g a g g c g g a tc c g g 350
aggcggaggc c a g g t ta c c c tg a g a g a g tc tg g c c c tg c g c tg g tg a a g c 400
ccacacaga c c c tc a c a c tg a c t t g t a c c t t c t c t g g g t t t t c a c tg a g c 450
a c t t c t g g t a tg g g tg ta g g c t g g a t t c g t c a g c c tc c c g g g a a g g c tc t 500
a g a g tg g c tg g c a c a c a t t t g g tg g g a tg a tg a ca a g cg c ta ta a tc c a g 550
ccc tg a a g a g c c g a c tg a c a a tc tc c a a g g a ta c c tc c a a a a a cca g g ta 600
g tc c tc a c a a tg a c c a a c a t g g a c c c tg tg g a ta c tg c c a c a ta c ta c tg 650
tg c tc a a a ta a a c c c c g c c t g g t t t g c t t a c tg g g g c c a a g g g a c tc tg g 700
tc a c tg tg a g c tc a t t c a a c aggggagag t g t 732
Secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:229)
DWMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS 150
TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV 200
VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSSFN RGEC 244
Se ensayó la apoptosis mediante análisis de FACS como el porcentaje de la población PI+anexina-V+ de linfocitos B (linfocitos CD20+) en la población total no regulada por FSC/SSC (FIG. 29).
6.9 DART 8B5-CB3.1
8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC
La molécula 8B5VL se amplificó usando H9 y Igh630R como cebadores, como molde, se usó ch8B5Lc. CB3.1VH se amplificó usando como cebadores Igh628F e Igh629R, como molde, se usó ch8B5Hc. Se incorporó la secuencia enlazadora a los cebadores Igh630R e Igh628F. El enlazador C-terminal y el codón de terminación fueron incorporados del cebador Igh629R. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron entre sí en una proporción equimolar, luego se amplificaron usando como cebadores H9 e Igh629R. El producto de PCR solapado se digirió luego con las endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo.
CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC
CB3.1 VL se amplificó usando H9 e Igh630R, que compartía la misma secuencia que 8B5VL en FR4, como cebadores, y como molde, chCB3.1 Lc. 8B5VH se amplificó usando como cebadores Igh631F e Igh640R, y como molde, ch8B5Hc. La secuencia enlazadora fue incorporada a los cebadores Igh630R e Igh631 F. El enlazador C-terminal y el codón de terminación fueron incorporados del cebador lgh640R. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron entre sí en una proporción equimolar, luego se amplificaron usando como cebadores H9 e lgh640R. El producto de PCR solapado se digirió luego con las endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo.
Marcador anti-flag-8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC
Se insertó un marcador anti-flag entre la secuencia señal y 8B5VL por PCR solapante. La secuencia señal y el marcador Flag se amplificaron usando como cebadores H9 e Igh647R, y como molde, ch8B5Lc. La molécula 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC se amplificó de nuevo usando como cebadores Igh647F e Igh629R, y como molde, 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron entre sí en una proporción equimolar, luego se amplificaron usando como cebadores H9 e Igh629R. El producto de PCR solapado se digirió luego con las endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo.
8B5VL-CB3.1VH-LGGC
Para generar un enlazador C-terminal diferente en la construcción 8B5VL-CB3.1 VH-VEPKSC, la construcción se amplificó de nuevo usando como cebadores H9 e Igh646R. El enlazador LGGC C-terminal fue integrado en el cebador igh646R. El producto de PCR se digirió luego con las endonucleasas de restricción Nhel/EcoRI y se clonó en el vector pCineo.
CB3.1VL-8B5VH-LGGC
Se usó la misma estrategia para crear CB3.1 VL-8B5 VH-LGGC. El enlazador LGGC C-terminal fue integrado en el cebador Igh648R, y se usó como molde CB3.1 VL-8B5 VH-FNRGEC. El producto de PCR se digirió luego con las endonucleasas de restricción Nhel/EcoRI y se clonó en el vector pCineo.
Marcador anti-flag-8B5VL-CB3.1VH-LGGC
También se usó la misma estrategia para crear el marcador anti-flag-8B5VL-CB3.1VH-LGGC. El enlazador LGGC C-terminal fue integrado en el cebador Igh648R, y se usó como molde el marcador anti-Flag-8B5VL-CB3.1 VH-VEPKSC. El producto de PCR se digirió luego con las endonucleasas de restricción NheI/EcoRI y se clonó en el vector pCIneo.
Secuencia de nucleótidos de 8B5-CB3.1-VEPKSC (SEQ ID NO: 230):
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50
aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100
gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150
gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200
tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250
cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400
a g c t g t c c t g c a a g g c t t c t g g c ta c a c c t t c a c c a g c t a c tg g a tg a a c 450
tg g g tg a a g c a g a g g c c tg g a c a a g g c c t t g a a t g g a t t g g t a t g g t t g a 500
t c c t t c a g a c a g tg a a a c tc a c ta c a a tc a a a t g t t c a a g g a c a a g g c c a 550
c a t t g a c t g t t g a c a a a t c c tc c a g c a c a g c c ta c a tg c a g c tc a g c a g c 600
c t g a c a t c t g a g g a c t c t g c g g t c t a t t a c tg tg c a a g a g c t a t g g g c t a 650
c tg g g g tc a a g g a a c c tc a g t c a c c g t c t c c t c a g t t g a g c c c a a a t c t t 700
gt 702
Secuencia de aminoácidos de 8B5-CB3.1-VEPKSC (SEQ ID NO: 231):
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC 234
Secuencia de nucleótidos de CB3.1-8B5-FNRGEC (SEQ ID NO: 232):
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgtt caacagggga gagtgt 726
Secuencia de aminoácidos de CB3.1-8B5-FNRGEC (SEQ ID NO: 233):
DWMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150
DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200
VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSFNRG EC 242
8B5VL-CB3.1VH-LGGC
Se amplificó 8B5VL usando como cebadores H9 e Igh694R, como molde, se usó ch8B5Lc. 8B5VH se amplificó usando como cebadores Igh695F e Igh696R, como molde, se usó ch8B5Hc. La secuencia enlazadora fue incorporada a los cebadores Igh694R e Igh695F. La molécula HuIgG1Fc se amplificó usando como cebadores Igh355F e Igh366R, como molde, se usó ch8B5Hc. Los productos de PCR se purificaron en gel y se mezclaron entre sí en una proporción equimolar, luego se amplificaron usando como cebadores H9 e lgh366R. El producto de PCR solapado se digirió luego con las endonucleasas de restricción NheI/EcoRI, y se clonó en el vector pCIneo.
Secuencia de nucleótidos de 8B5VL-CB3.1VH-LGGC (SEQ ID NO: 234):
gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50 aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250 cagactatta etgtctacaa tattttagtt atccgctcac gtteggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tecggaggcg gaggccaggt 350 ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400 agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550 cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600 ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650 ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
Secuencia de aminoácidos de 8B5VL-CB3.1VH-LGGC (SEQ ID NO: 235):
DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50
ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100
GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200
LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLG GC 232
Secuencia de nucleótidos de CB3.1-8B5-LGGC (SEQ ID NO: 236):
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50
accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100
gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150
cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200
cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250
aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350
aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450
gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500
ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600
gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650
ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700
tctcctcgct gggaggctgc 720
Secuencia de aminoácidos de CB3.1-8B5-LGGC (SEQ ID NO: 237):
DWMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150
DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200
VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSLGGC 240
Cebadores:
Lgh628F (SEQ ID NO: 238):
ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtc caactgcagc agcctgg 47
Lgh629R (SEQ ID NO: 239):
tttgaattct aacaagattt gggctcaact gaggagacgg tgactgagg 49
Lgh630R (SEQ ID NO: 240):
gcctccgcct ccggatccgc ctcctttcag ctccagcttg gtccc 45
Lgh631 F (SEQ ID NO: 241):
ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgagg agtctgg 47
Lgh640R (SEQ ID NO: 242):
tttgaattct aacactctcc cctgttgaac gaggagactg tgagagtgg 49
Lgh644R (SEQ ID NO: 243):
tttgtcgtca tcatcgtctt tgtagtcgga gtggacacct gtggagag 48
Lgh646R (SEQ ID NO: 244):
tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgactg ag 42
Lgh647F (SEQ ID NO: 245):
caaagacgat gatgacgaca aagacattca gatgacacag tctcc 45
Lgh648R (SEQ ID NO: 246):
tttgaattct agcagcctcc cagcgaggag actgtgagag tgg 43
Expresión: Las construcciones 5 y 6, o 6 y 7, u 8 y 9, o 9 y 10, los plásmidos de expresión codificados (FIG. 30) se cotransfectaron en células HEK-293 para expresar el DART 8B5-CB3.1 con o sin marcador anti-flag usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El medio condicionado se recogió cada tres días tres veces. El medio condicionado se purificó luego usando la columna por afinidad de CD32B.
ELISA: Se realizó el ensayo ELISA de la siguiente manera: Se usaron 50 pl/pocillo de 2 ug/ml de CD32B-Fc para recubrir una placa de 96 pocilios Maxisorp en tampón de carbonato a 4 °C durante la noche. Se lavó la placa tres veces con pBs -T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y luego se bloqueó con BSA al 0,5 % en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadir la proteína de fusión de Fc monocatenaria que se iba a ensayar. Durante el bloqueo, se diluyó DART 8B5-CB3.1 en una serie de diluciones dobles comenzando con 2 pg/ml. Se transfirieron 25 pl/pocillo de la molécula de DART diluida mezclados con 25 pl/pocillo de ch8B5 a 50 ng/ml de la placa de dilución a la placa para ELISA. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar con PBS-T tres veces, se añadieron a la placa 50 pl/pocillo de F(ab’)2 de cabra anti-F(ab’)2 de IgG humana conjugado a HRP diluido a 1:10.000 (Jackson ImmunoResearch). La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó la placa con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 pl/pocillo del sustrato TMB. Tras 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo con 40 pl/pocillo de H2SO4 al 1 %. Se leyó la D0450 nm usando un lector de placas de 96 pocilios y el software SOFTmax. Se representó gráficamente la lectura usando el software GraphPadPrism 3.03 (FIG. 31).
6.10 d iseñ o y c a r a c t e r iz a c ió n de d ar t t e t r a v a le n t e DE TIPO Ig
Se emplearon cuatro cadenas polipeptídicas para producir una especie de DART de tipo Ig que tuviera sitios de unión al antígeno tetravalentes (FIG. 32; FIG. 33). La especie de DART de tipo Ig tiene propiedades únicas, puesto que sus dominios pueden estar diseñados para unirse al mismo epítopo (para formar una molécula de DART de tipo Ig específica de un epítopo, tetravalente, con la capacidad de unirse a cuatro moléculas de antígeno idénticas), o a diferentes epítopos o antígenos. Por ejemplo, sus dominios pueden diseñarse para unirse a dos epítopos del mismo antígeno (para formar un tetravalente, específico de mono-antígeno, bi-epítopo específico DART similar a Ig), o a epítopos de diferentes moléculas de antígeno para formar un DART similar a tetravalente que tiene un par de sitios de unión específicos para un primer antígeno y un segundo par de sitios de unión específicos para un segundo antígeno ). Se pueden producir fácilmente moléculas híbridas que tengan combinaciones con dichos atributos.
Para ilustrar las características de dicha especie de DART de tipo Ig, se produjo una molécula de DART de tipo Ig tetravalente ilustrativa que tenía un par de sitios de unión específicos de CD32 y un segundo par de sitios de unión específicos de CD16A. Esta especie de DART de tipo Ig se produjo usando las cuatro siguientes cadenas polipeptídicas:
Secuencia de nucleótidos de 2.4G2-3G8-hKappa
(SEQ ID NO: 247):
gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga 50 aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc aagtatttag 100 cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat 150 gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc 200 tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg 250 gactctatta ctgtcaacag cattatgaat atccagccac gttcggttct 300 gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc cagaccctca 400 gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt 450 gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca 500 catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac 550 tgacaatctc caaggatacc tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc 600 agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc 650 cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctcac 700 tgggaggctg cggcggaggg agccgtacgg tggctgcacc atcggtcttc 750 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt 800 gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg 850 tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 900 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa 950 agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 1000 gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 1044
Secuencia de aminoácidos codificada de 2.4G2-3G8-hKappa
(SEQ ID NO: 248):
DVQMTQSPSN LAASPGESVS INCKASESIS KYLAWYLQKP GKANKLLMYD 50
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTIRSLEP EDFGLYYCQQ HYEYPATFGS 100
GTKLEIKGGG SGGGGQVTLK ESGPGILQPS QTLSLTCSFS GFSLRTSGMG 150
VGWIRQPSGK GLEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SSNQVFLKIA 200
SVDTADTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSLGGCGGG SRTVAAPSVF 250
IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ 300
DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 350
Secuencia de nucleótidos de 3G8-2,4G2-hG1
(SEQ ID NO: 249):
g a c a c tg tg c tg a c c c a a tc t c c a g c t t c t t t g g c t g t g t c tc ta g g g c a 50 gagggccacc a tc tc c tg c a aggccagcca a a g tg t t g a t t t t g a t g g t g 100 a t a g t t t t a t g a a c tg g ta c caacagaaac caggacagcc a c c c a a a c tc 150 c t c a t c t a t a c ta c a tc c a a t c t a g a a t c t g g g a tc c c a g c c a g g t t ta g 200 tg c c a g tg g g tc tg g g a c a g a c t t c a c c c t c a a c a tc c a t c c tg tg g a g g 250 aggag ga tac tg c a a c c ta t ta c tg tc a g c a a a g ta a tg a g g a tc c g ta c 300 a c g ttc g g a g gggggaccaa g c tg g a a a ta aaaggaggcg g a tccg g a g g 350 cggaggcgag g tg g a g c ta g tg g a g tc tg g g g g a g g c tta g tg c a g c c tg 400 g a a g g tc c c t g a a a c tc tc g tg tg c a g c c t c a g g a ttc a c t t t c a g tg a c 450 t a t t a c a tg g c c tg g g tc c g g c a g g c tc c a a c g a c g g g tc tg g a g tg g g t 500 c g c a tc c a t t a g t ta tg a tg g tg g tg a c a c tc a c ta tc g a g a c tc c g tg a 550 a g g g c c g a tt t a c t a t t t c c a g a g a ta a tg caaaaagcag c c ta ta c c tg 600 ca a a tg g a ca g tc tg a g g tc tg a g g a ca cg g c c a c t t a t t a c tg tg c a a c 650
a g a g a c ta cg g g a a ta c c ta c a g g tg t t a t g g a tg c c tg g g g tca a g g a g 700 t t t c a g t c a c t g t c t c c t c a c tg g g a g g c t gcggcggagg g a g c g c c tc c 750 accaagggcc c a t c g g t c t t c c c c c tg g c a c c c tc c tc c a a g a g c a c c tc 800 tg g g g g ca ca g c g g c c c tg g g c tg c c tg g t c a a g g a c ta c t tc c c c g a a c 850 c g g tg a c g g t g tc g tg g a a c tc a g g c g c c c tg a cca g cg g c g tg c a c a c c 900 t t c c c g g c tg tc c ta c a g tc c tc a g g a c tc ta c t c c c t c a g c a g c g tg g t 950 g a c c g tg c c c tc c a g c a g c t tg g g c a c c c a g a c c ta c a tc tg c a a c g tg a 1000 a tc a c a a g c c cagcaaca cc aagg tg g a ca a g a g a g ttg a g c c c a a a tc t 1050 tg tg a c a a a a c tc a c a c a tg c c c a c c g tg c c c a g c a c c tg a a c tc c tg g g 1100 g g g a c c g tc a g t c t t c c t c t tc c c c c c a a a acccaaggac a c c c tc a tg a 1150 tc tc c c g g a c c c c tg a g g tc a c a tg c g tg g tg g tg g a c g t gagccacgaa 1200 g a c c c tg a g g tc a a g t tc a a c tg g ta c g tg g a cg g cg tg g a g g tg c a ta a 1250 tg cca a g a ca aagccgcggg agga g ca g ta caacagcacg ta c c g tg tg g 1300 tc a g c g tc c t c a c c g tc c tg c a c c a g g a c t g g c tg a a tg g ca a g g a g ta c 1350 aag tg ca a g g tc tc c a a c a a a g c c c tc c c a g c c c c c a tc g a g a a a a cca t 1400 c tc c a a a g c c aaagggcagc cccgagaa cc a c a g g tg ta c a c c c tg c c c c 1450 c a tc c c g g g a tg a g c tg a c c aagaaccagg tc a g c c tg a c c tg c c tg g tc 1500 a a a g g c t tc t a tc c c a g c g a c a tc g c c g tg gag tgg gaga g c a a tg g g ca 1550 gccggagaac a a c ta ca a g a c c a c g c c tc c c g tg c tg g a c tc c g a c g g c t 1600 c c t t c t t c c t c ta c a g c a a g c tc a c c g tg g acaagagcag g tg g ca g ca g 1650 g g g a a c g tc t t c t c a t g c t c c g tg a tg c a t g a g g c tc tg c a c a a c c a c ta 1700 cacgcagaag a g c c tc tc c c tg tc tc c g g g ta a a 1734
Secuencia de aminoácidos codificada de 3G8-2-4G2- hG1
(SEQ ID NO: 250):
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 50
LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLN1H PVEEEDTATY YCQQSNEDPY 100
TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VELVESGGGL VQPGRSLKLS CAASGFTFSD 150
YYMAWVRQAP TTGLEWVASI SYDGGDTHYR DSVKGRFTIS RDNAKSSLYL 200
QMDSLRSEDT ATYYCATETT GIPTGVMDAW GQGVSVTVSS LGGCGGGSAS 250
TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT 300
FPAVLQSSGL YSLSSWTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS 350
CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE 400
DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY 450
KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 500
KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 550
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 578
Los preparados de moléculas de DART de tipo lg con las secuencias anteriores se obtuvieron de diferentes aislados de plásmidos y se denominaron "lg DART 1" e "lg DART 2", Se comparó la capacidad de estas especies de DART de tipo lg para unirse a mCD32-hCD16A en un ensayo de ELISA con la del medio solo, una molécula de DART que tenía un solo sitio de unión a CD32 y un solo sitio de unión a CD16A ("DART"), y el anticuerpo mAb anti-ch-mCD32 de control (FIG. 34). Se encontró que la molécula de DART de tipo lg de la presente divulgación tiene mucho mayor afinidad de unión al antígeno que cualquier DART o anticuerpo de control.
6.11 DlSEÑO Y CARACTERlZAClÓN DE LOS DlACUERPOS BlESPECÍFlCOS CD32B-CD79-1 Y CD32B-CD79-2 Los genes que codifican CD79VL-CD32B VH (Secuencia 1), CD32BVL-CD79VH-1 (Secuencia 2) y CD32BVL-CD79VH-2 (Secuencia 3) se clonaron en el vector de expresión pEE13, obteniéndose las construcciones de expresión 1, 2 y 3, respectivamente. El plásmido de expresión de la construcción 1 se cotransfectó junto con el plásmido de expresión 2 o 3 en células HEK-293 para preparar diacuerpos biespecíficos CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2, respectivamente. El medio condicionado se recogió cada tres días tres veces. El medio condicionado se purificó luego usando la columna por afinidad de CD32B.
Se realizó el ensayo ELlSA de la siguiente manera: Se usaron 50 pl/pocillo de 2 pg/ml de CD32B-Fc para recubrir una placa de 96 pocilios Maxisorp en tampón de carbonato a 4 °C durante la noche. Se lavó la placa tres veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,1 %) y luego se bloqueó con BSA al 0,5 % en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadir la proteína de fusión de Fc monocatenaria que se iba a ensayar. Durante el bloqueo, se diluyó el diacuerpo biespecífico CD32B-CD79-1 o CD32B-CD79-2 en una dilución en serie de factor de dilución de dos comenzando con 2 pg/ml. Se mezclaron 25 pl/pocillo del diacuerpo biespecífico diluido con 25 pl/pocillo de 50 ng/ml del anticuerpo anti-CD32B, y se añadieron a una placa para ELlSA. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar con PBS-T tres veces, se añadieron a la placa 50 pl/pocillo de F(ab’)2 de cabra anti-F(ab’)2 de lgG humana conjugado a HRP diluido a 1:10.000 (Jackson lmmunoResearch). La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavó la placa con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 pl/pocillo del sustrato TMB. Tras 5 minutos de incubación, la reacción se detuvo con 40 pl/pocillo de H2SO4 al 1 %. Se leyó la DO450 nm usando un lector de placas de 96 pocilios y el software SOFTmax. Se representó gráficamente la lectura usando el software GraphPadPrism 3.03. El experimento reveló que los diacuerpos biespecíficos CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2 eran capaces de unirse de manera inmunoespecífica a CD32-Fc con una afinidad equivalente a la del anticuerpo de control anti-CD32B. A continuación, se proporcionan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificadas de las construcciones descritas anteriormente:
Secuencia 1 - secuencia de nucleótidos de CD79VL-CD32BVH
(SEQ lD NO: 251):
g a tg t t g tg a tg a c tc a g tc t c c a c tc t c c c tg c c c g tc a c c c t tg g a c a 50 g c c g g c c tc c a tc tc c tg c a a g tc a a g tc a g a g c c tc t ta g a ta g tg a tg 100 g a a a g a ca ta t t t g a a t t g g t t tc a g c a g a ggccaggcca a tc tc c a a a c 150 c g c c t a a t t t a t c t g g t g t c ta a a c tg g a c tc tg g g g tc c c a g a c a g a tt 200 ca g cg g ca g t g g g tca g g ca c t g a t t t c a c a c tg a a a a tc agcag g g tg g 250 aggc tg a g g a t g t t g g g g t t t a t t a c t g c t g g ca a g g ta c a c a t t t t c c g 300 c tc a c g t t c g gcggagggac c a a g c ttg a g a tca a a g g a g g c g g a tc c g g 350 aggcggaggc g a a g tg a a g c t tg a g g a g tc tggagg aggc t tg g tg c a a c 400 c tg g a g g a tc c a tg a a a c tc t c t t g tg a a g c c t c t g g a t t c a c t t t t a g t 450 g a c g c c tg g a tg g a c tg g g t c c g tc a g tc t ccagagaagg g g c t tg a g tg 500 g g t tg c tg a a a tta g a a a c a aagc ta a a a a tc a tg c a a c a t a c ta tg c tg 550 a g tc tg tg a t a g g g a g g ttc a c c a tc tc a a g a g a tg a t tc c a a a a g ta g t 600 g tc ta c c tg c aaa tg a a ca g c t ta a g a g c t g a a g a ca c tg g c a t t t a t t a 650 c tg tg g g g c t c tg g g c c t tg a c ta c tg g g g ccaaggca cc a c tc tc a c a g 700 t c t c c t c g c t g g g a g g c tg c 720
Secuencia 2 - Secuencia de aminoácidos de CD79VL-CD32BVH
(SEQ ID NO: 252):
DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240
Secuencia 3 - secuencia de nucleótidos de CD32BVL-CD79VH-1
(SEQ ID NO: 253):
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatce aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 t c a g c tg g tg c a g tc tg g a g c tg a g g tg a a g a a g c c tg g c g c c tc a g tg a 400 a g g tc tc c tg c a a g g c t tc t g g t ta c a c c t t ta c c a g c ta c tg g a tg a a c 450 tg g g tg c g a c a g g c c c c tg g a c a a g g g c tt g a g tg g a tc g g a a tg a t tg a 500 tc c t t c a g a c a g tg a a a c tc a c ta c a a tc a a a tg t tc a a g g a ca g a g tca 550 c c a tg a c c a c a g a c a c a tc c acgagcacag c c ta c a tg g a g c tg a g g a g c 600 c tg a g a tc tg acgacacggc c g t g t a t t a c tg tg c g a g a g c ta tg g g c ta 650 c tg g g g g ca a gggaccacgg tc a c c g tc t c c tc a c tg g g a g g c tg c 696 Secuencia 4 - secuencia de aminoácidos de CD32BVL-CD79VH-1
(SEQ ID NO: 254):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232
Secuencia 5 - secuencia de nucleótidos de CD32BVL-CD79VH-2
(SEQ ID NO: 255):
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tGCttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
Secuencia 6 - secuencia de aminoácidos de CD32BVL-CD79VH-2
(SEQ ID NO: 256):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232
6.12 c o n s tr u c c ió n Y OPTIMIZACIÓN DE LOS DIACUERPOS BI-FUNCIONALES H8B5-HBCRC
Se construyó un diacuerpo que contiene regiones variables capaces de unirse a CD32 y al complejo del receptor de linfocitos B ("BCRC").
Clonación. Las construcciones se construyeron utilizando PCR estándar/PCR solapante:
h8B5VL-G3SG4-hBCRCVH M48I-LGGC:
Se amplificó un 8B5 VL completamente humanizado (que reconoce a CD32) utilizando lgh321F e lgh788R como cebadores. Se amplificó hBCRCVH M48I utilizando lgh784F e lgh386R como cebadores. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se mezclaron y se amplificaron utilizando lgh321F y lgh386R. El fragmento de la PCR solapante se clonó posteriormente en pEE6 en el sitio Xbal-EcoRI. "G3SG4" es un enlazador que tiene la secuencia: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10).
hBCRCVL R45N-G3SG4-h8B5VH -LGGC
hBCRCVL R45N se amplificó utilizando lgh321 F e lgh785R como cebadores. h8B5VH se amplificó utilizando lgh787F e lgh786R como cebadores. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se mezclaron y se amplificaron utilizando lgh321F y lgh786R. El fragmento de la PCR solapante se clonó posteriormente en pEE13 en el sitio Xbal-EcoRI.
Construcción de un solo vector. El pEE6hHBCRCVL R45N-h8B5VH se digirió en los sitios Bgl Il-Sal I y se purificó un fragmento de 3,3 kb y se insertó en pEE13hHBCRCVL 45N-h8B5VH en los sitios BamHI-SalI. Bgl II y el BamH I comparten extremos cohesivos compatibles. La secuencia del DART y los cebadores utilizados para construir el DART se muestran a continuación:
hHBCRCVL, Secuencia de nucleótidos de R45N-h8B5VH-LGGC
(SEQ ID NO: 257):
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720
hHBCRCVL. Secuencia de aminoácidos de R45N-h8B5VH-LGGC
(SEQ ID NO: 258):
DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240
Secuencia de nucleótidos de H8B5VL-hHBCRCVH M48I-LGGC
(SEQ ID NO: 259):
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696
Secuencia de aminoácidos de H8B5VL-HBCRCVH M48I-LGGC
(SEQ ID NO: 260):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232
Cebador Lgh321 F (SEQ ID NO: 261):
cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac 36
Cebador Lgh386R (SEQ ID NO: 262):
tttgaattet agoagootoo eagtgaggag aoggtgaoog tggte 45
Cebador Lgh784F (SEQ ID NO: 263):
ggoggatoog gaggoggagg ooaggttoag otggtgoag 39
Cebador Lgh785R (SEQ ID NO: 264):
ootooggato ogootoottt gatotoaago ttggtooo 38
Cebador Lgh786R (SEQ ID NO: 265):
tttgaattot agoagootoo oaggotggag aoggtoaooa gg 42
Cebador Lgh787F (SEQ ID NO: 266):
ggaggoggat ooggaggogg aggogaagtg oagottgtgg agto 44
El plásmido de expresión Hu3G8VL 1-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGC se ootransfeotó junto oon Hu2B6VL 5-G3SG4-Hu3G8VH 5-LGg C en las células HEK-293 para producir el diacuerpo biespeoífioo Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 que reconoce a CD32 y a CD79. Al mismo tiempo, Hu2B6VL 5-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGC y Hu3G8VL 1-G3SG4-Hu3G8VH 5-LGGC se transfeotaron individualmente en células HEK-293 para hacer producir los diacuerpos Hu2B6 4.5 y Hu3G8 5.1. Después de tres días en cultivo, se recogieron los medios condicionados y se caracterizaron mediante ELISA de unión. Los resultados de ese experimento se muestran en la figura 36.
Diseño experimental: Se recubrieron 100 ng / pocilio de FcRIIb-G2-Agly soluble en una placa Maxisorp de 96 pocilios en tampón de carbonato a 40 ° C durante la noche. La placa se lavó tres veces oon PBS / Tween20 al 0,1% y luego se bloqueó oon BSA al 0,5% en PBS / Tween 20 al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de añadir los diacuerpos. Una serie de dilución doble de medio acondicionado de diacuerpos biespeoífioos Hu2B64.5-Hu3G85.1, el diacuerpo Hu2B64.5 y el diacuerpo hu3G85.1 se añadió a cada pocilio partiendo a 25 ng/pocillo. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar oon PBS/Tween20 al 0,1% tres veces, Se añadieron 10 ng/pocillo de FcRIIIa-G2-Biotina a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar oon PBS/Tween20 al 0,1% tres veces, se usaron para la detección 50 ul de una dilución 1:5.000 de estreptavidina conjugada oon HRP (Amersham Pharmacia Biotech). Después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente, la placa se lavó oon PBS/Tween20 al 0,1% tres veces y se reveló utilizando un sustrato TMB. Tras 10 minutos de incubación, la reacción se detuvo oon 1% de H2SO4. La DO450 nm se leyó mediante el programa SOFTmax. Se representó gráficamente la lectura usando el software GraphPadPrism 3.03.
6.13 CONSTRUCCIÓN DE DIACUERPOS IgDART
Se construyeron diacuerpos IgDART que contienen regiones variables capaces de unirse a CD32 y al complejo receptor de linfooitos B ("BCRC"). El primer diacuerpo empleó un enlazador LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) entre las secuencias VH y las secuencias Fo de la molécula. El segundo diacuerpo empleó un enlazador LEIK que tiene la secuencia: LEIK (SEQ ID NO: 268) o un enlazador TVSS que tiene la secuencia TVSS (SEQ ID NO: 269). Las secuencias de las cadenas de estos diacuerpos y polinucleótidos codificantes se muestran a continuación:
H8B5VL-HiBCRCVH M48I, M62K_LGGCG3S_hKappa
(SEQ ID NO: 270):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GCGGGSRTVA APSVFIFPPS 250
DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS 300
TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC 343
Las secuencias de H8B5VL se fusionan oon las secuencias de hBCRCVH mediante el enlazador GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) ubicado en la posición 108-115. Las secuencias hBCRCVH se fusionan oon las secuencias Fo mediante el enlazador LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) ubicado en la posición 229-236 (ambas se muestran subrayadas anteriormente). El polinucleótido que codifica la secuencia de H8B5VL-HiBCRCVH M48I, M62K_LGGCG3S_hKappa es:
(SEQ ID NO: 271):
g a c a tc c a g a tg a c c c a g tc t c c a t c c t c c t t a t c t g c c t c tg tg g g a g a 50
ta g a g tc a c c a t c a c t t g t c g g g ca a g tca g g a a a t ta g t g g t t a c t t a a 100
g c tg g c tg c a gcagaaacca ggcaaggccc c ta g a c g c c t g a tc ta c g c c 150
g c a tc c a c t t ta g a t t c tg g tg t c c c a tc c a g g t tc a g tg g c a g tg a g tc 200 tg g g a ccg a g t t c a c c c tc a c c a tc a g c a g c c t t c a g c c t g a a g a t t t t g 250
c a a c c ta t ta c tg tc ta c a a t a t t t t a g t t a tc c g c tc a c g ttc g g a g g g 300 gggaccaagg tg g a a a ta a a aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350
tc a g c tg g tg c a g tc tg g a g c tg a g g tg a a g a a g c c tg g c g c c tc a g tg a 400
a g g tc tc c tg c a a g g c t tc t g g t ta c a c c t t ta c c a g c ta c tg g a tg a a c 450
tg g g tg c g a c a g g c c c c tg g a c a a g g g c tt g a g tg g a tc g g a a tg a t tg a 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatea aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgcggcg 700 gagggagccg aactgtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct 750 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 800 cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc 850 aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 900 acctacagcc tcagcagcac ectgacgetg agcaaagcag actacgagaa 1000 acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 1050 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 1082
donde las secuencias codifican Ios enlazadores: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) y LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) están ubicadas en las posiciones 322-345 y 685-708, respectivamente (ambas se muestran subrayadas arriba).
HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hGl
(SEQ ID NO: 272):
DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC GGGSASTKGP 250
SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 300
LQSSGLYSLS SWTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT 350
HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV 400
KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV 450
SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY 500
PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF 550
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK 574
Las secuencias hBCRCVL se fusionan con las secuencias H8B5VH mediante el enlazador GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) ubicado en la posición 113-120. Las secuencias de H8B5VH se fusionan con las secuencias Fc mediante el enlazador LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) ubicado en la posición 237-244 (ambas se muestran subrayadas arriba). El polinucleótido que codifica la secuencia HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hGl es: (SEQ ID NO: 273):
g a tg t t g tg a tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50
g c c g g c c tc c atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100
g a a a g a ca ta tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150
c g c c t a a t t t atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200
c a g cg g ca g t gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250
aggc tg a g g a tgttggggtt tattactget ggcaaggtac a c a t t t t c c g 300
c tc a c g t t c g gcggagggac caagcttgag a tc a a a ggag g c g g a tc c g g 350
aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400
c tg g a g g a tc cctgagaetc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450
g a cg cc tg g a tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500
g g t tg c tg a a attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550
a g t c t g t g a t agggaggttc a c c a tc tc a a gagatgacgc caaaaacagt 600
c tg ta c c tg c a a a tga acag c t ta a g a g c t g a a g a ca c tg c c g t g t a t t a 650
c tg tg g g g c t c tg g g c c t tg a c ta c tg g g g ccaaggcacc c tg g tg a c c g 700
t c tc c a q c c t g g g a g g c tg c ggcggaggga g c q c c tc c a c caagggccca 750
t c g g t c t t c c c c c tg g c a c c c tc c tc c a a g a g c a c c tc tg ggggcacagc 800
g g c c c tg g g c tg c c tg g tc a a g g a c ta c t t ccccg a a ccg g tg a c g g tg t 850
c g tg g a a c tc a g g c g c c c tg accagcggcg tg c a c a c c t t c c c g g c tg tc 900
c ta c a g tc c t c a g g a c tc ta c tc c c tc a g c a g c g tg g tg a c c g tg c c c tc 950
c a g c a g c ttg ggcacccaga c c ta c a tc tg c a a c g tg a a t cacaagccca 1000
gcaacaccaa g g tg g a ca a g a g a g ttg a g c c c a a a tc t tg tg a c a a a a c t 1050
c a c a c a tg c c c a c c g tg c c c a g c a c c tg a a c tc c tg g g g g g a c c g tc a g t 1100
c t t c c t c t t c ccccca a a a c ccaaggacac c c tc a tg a tc tc c c g g a c c c 1150
c tg a g g tc a c a tg c g tg g tg g tg g a c g tg a gccacgaaga c c c tg a g g tc 1200
a a g t tc a a c t g g ta c g tg g a cg g cg tg g a g g tg c a ta a tg ccaagacaaa 1250
gccgcgggag g a g ca g ta ca a ca g c a c g ta c c g tg tg g tc a g c g tc c tc a 1300
c c g tc c tg c a cca g g a c tg g c tg a a tg g c a aggag ta ca a g tg c a a g g tc 1350
tcca a ca a a g c c c tc c c a g c c c c c a tc g a g a a a a c c a tc t ccaaagccaa 1400
agggcagccc cgagaaccac a g g tg ta c a c c c tg c c c c c a tc c c g g g a tg 1450
a g c tg a cca a g a a c c a g g tc a g c c tg a c c t g c c tg g tc a a a g g c t t c t a t 1500
cccagcgaca tc g c c g tg g a g tggga gagc a a tg g g ca g c cggagaacaa 1550
c ta c a a g a c c a c g c c tc c c g tg c tg g a c tc c g a c g g c tc c t t c t t c c t c t 1600
a c a g ca a g c t c a c c g tg g a c a agag cagg t ggcagcaggg g a a c g tc t tc 1650
tc a tg c tc c g tg a tg c a tg a g g c tc tg c a c a a c c a c ta c a cgcagaagag 1700
c c tc t c c c tg tc tc c g g g ta aa 1722
donde las secuencias codifican Ios enlazadores: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) y LGGCGGGS (SEQ ID NO: 267) están ubicadas en las posiciones 337-360 y 709-732, respectivamente (ambas se muestran subrayadas arriba).
H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hKappa (SEQ ID NO: 274):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50
ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150
WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200
LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 250
ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 300
TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC 335
Las secuencias de H8B5VL se fusionan con las secuencias de HBCRCVH mediante el enlazador GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) ubicado en la posición 108-115. Las secuencias HBCRCVH se fusionan con las secuencias Fc mediante el enlazador LEIK (SEQ ID NO: 268) ubicado en la posición 225-228 (ambas mostradas subrayadas anteriormente). El polinucleótido que codifica la secuencia de H8B5VL-HB-CRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hKappa es:
(SEQ ID NO: 275):
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcctggagat caagcgaact gtggctgcac 700 catcggtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 750 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt 800 acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg 850 tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 900 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 950 cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag 1000 agtgt 1005
donde las secuencias codifican Ios enlazadores: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) y LEIK (SEQ ID NO: 268) están ubicadas en las posiciones 322-345 y 673-684, respectivamente (ambas se muestran subrayadas arriba).
HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hG1 = HBCRCVL R45N-h8B5VH_-hG1
(SEQ ID NO: 276):
DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50
RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100
LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150
DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200
LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS 250
SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 300
LSSWTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA 350
PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG 400
VEVHNAKTKP REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP 450
IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 500
ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSC SVMHEA 550
LHNHYTQKSL SLSPGK 566
Las secuencias HBCRCVL se fusionan con las secuencias h8B5VH mediante el enlazador GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) ubicado en la posición 113-120, Las secuencias de h8B5VH se fusionan con las secuencias Fc mediante el enlazador TVSS (SEQ ID NO: 269) ubicado en la posición 233-236 (ambas se muestran subrayadas arriba), El polinucleótido que codifica HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hG1 es:
(SEQ ID NO: 277):
g a tg t t g tg a tg a c tc a g tc t c c a c tc t c c c tg c c c g tc a c c c t tg g a c a 50 g c c g g c c tc c a tc tc c tg c a a g tc a a g tc a g a g c c tc t ta g a ta g tg a tg 100
g a a a g a ca ta t t t g a a t t g g t t tc a g c a g a ggccaggcca a tc tc c a a a c 150
c g c c t a a t t t a t c t g g t g t c ta a a c tg g a c tc tg g g g tc c c a g a c a g a tt 200 ca g cg g ca g t g g g tca g g ca c t g a t t t c a c a c tg a a a a tc agcag g g tg g 250 aggc tg a g g a t g t t g g g g t t t a t t a c t g c t g g ca a g g ta c a c a t t t t c c g 300
c tc a c g t t c g gcggagggac c a a g c ttg a g a tc a a a ggag gcggatccgg 350 aggcggaggc g a a g tg ca g c t tg tg g a g tc tggagg aggc t tg g tg c a a c 400
c tg g a g g a tc c c tg a g a c tc t c t t g t g c c g c c t c t g g a t t c a c t t t t a g t 450
g a c g c c tg g a tg g a c tg g g t c c g tc a g g c c ccaggcaagg g g c t tg a g tg 500
g g t tg c tg a a a tta g a a a c a aagc ta a a a a tc a tg c a a c a ta c ta tg c tg 550
a g tc tg tg a t a g g g a g g ttc a c c a tc tc a a g a g a tg a cg c ca a a a a ca g t 600
c tg ta c c tg c a a a tg a a ca g c t ta a g a g c t g a a g a ca c tg c c g t g t a t t a 650
c tg tg g g g c t c tg g g c c t tg a c ta c tg g g g ccaaggcacc c tg g tg accg 700 tctccaqcgc c tc c a c c a a g g g c c c a tc g g t c t t c c c c c t g g c a c c c tc c 750
tcca a g a g ca c c tc tg g g g g cacagcggcc c tg g g c tg c c tg g tc a a g g a 800
c ta c t t c c c c g a a ccg g tg a c g g tg tc g tg g a a c tc a g g c g c c c tg a c c a 850
g c g g c g tg c a c a c c t tc c c g g c tg tc c ta c a g tc c tc a g g a c tc ta c t c c 900
c tc a g c a g c g tg g tg a c c g t g c c c tc c a g c a g c ttg g g c a c c c a g a c c ta 950
c a tc tg c a a c g tg a a tc a c a agcccagcaa c a cca a g g tg gacaagagag 1000
ttg a g c c c a a a t c t t g t g a c a a a a c tca ca c a tg c c c a c c g tg c c c a g c a 1050
c c tg a a c tc c tg g g g g g a cc g t c a g t c t t c c t c t t c c c c c caaaacccaa 1100
g g a c a c c c tc a tg a tc tc c c g g a c c c c tg a g g tc a c a tg c g tg g tg g tg g 1150
a c g tg a g cca c g a a g a c c c t g a g g tc a a g t tc a a c tg g ta c g tg g a cg g c 1200
g tg g a g g tg c a ta a tg c c a a gacaaagccg cgggaggagc a g ta ca a ca g 1250
c a c g ta c c g t g tg g tc a g c g tc c tc a c c g t c c tg c a c c a g g a c tg g c tg a 1300
a tggca a g g a g ta c a a g tg c a a g g tc tc c a a c a a a g c c c t ccca g c c c c c 1350
a tcga g a a a a c c a tc tc c a a agccaaaggg cagccccgag a a cca ca g g t 1400
g ta c a c c c tg c c c c c a tc c c g g g a tg a g c t gaccaagaac c a g g tc a g c c 1450
tg a c c tg c c t g g tca a a g g c t t c t a t c c c a g c g a c a tc g c c g tg g a g tg g 1500
g a g a g ca a tg ggcagccgga g a a c a a c ta c aagaccacgc c tc c c g tg c t 1550
g g a c tc c g a c g g c t c c t t c t tc c tc ta c a g c a a g c tc a c c g tg g a ca a g a 1600
g ca g g tg g ca gcaggggaac g t c t t c t c a t g c tc c g tg a t g c a tg a g g c t 1650
c tg c a c a a c c a c ta c a c g c a g a a g a g c c tc t c c c t g t c t c cg g g ta a a 1698
donde las secuencias codifican Ios enlazadores: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 10) y TVSS (SEQ ID NO: 269) están ubicadas en las posiciones 337-360 y 697-708, respectivamente (ambas se muestran subrayadas arriba),
6.14 OPTIMIZACIÓN DE ENLAZADORES
Como se ha analizado anteriormente, los diacuerpos IgDART de la presente descripción contienen preferentemente enlazadores entre las secuencias VH y las secuencias Fc de la molécula. Se realizaron experimentos para optimizar los enlazadores con el fin de maximizar el rendimiento y la actividad. Se emplearon los siguientes enlazadores.
Figure imgf000124_0001
continuación
Figure imgf000125_0003
Los enlazadores anteriores se introdujeron en los plásmidos para producir un conjunto de diacuerpos IgDART que tienen diferentes combinaciones de enlazadores:
Figure imgf000125_0001
Se determinaron las propiedades de agregación de los IgDARTS producidos.
Figure imgf000125_0002
continuación
Figure imgf000126_0001
Los datos mostraron inesperadamente que las construcciones que tienen enlazadores, tales como los empleados en 901A/901B; 903A/903B; y 908A/908B dieron resultados dramáticamente superiores (menos oligomerización y/o menos producción de fragmentos) que las construcciones que tienen enlazadores, tales como 910A/911B.
6.15 DART DE BUCLE E/BUCLE K
Como se apreciará en vista de lo anterior, los polipéptidos individuales de un DART biespecffico pueden formar dos especies de homodfmeros y una especie de heterodfmero. En una realización de la presente divulgación, puede agregarse un polipéptido cargado al extremo C-terminal de uno o más preferentemente, ambos polipéptidos DART. Mediante la selección de polipéptidos de carga opuesta para los polipéptidos individuales del DART biespecffico, la inclusión de dichos polipéptidos cargados favorece la formación de heterodfmeros y disminuye la formación de homodfmeros. Preferentemente, un polipéptido cargado positivamente contendrá un contenido sustancial de arginina, glutamina, histidina y/o lisina (o mezclas de dichos aminoácidos) y un polipéptido cargado negativamente contendrán un contenido sustancial de aspartato o glutamato (o una mezcla de dichos aminoácidos). Los polipéptidos cargados positivamente que contienen un contenido sustancial de lisina y los polipéptidos cargados negativamente que contienen un contenido sustancial de glutamato son particularmente preferidos. Con el fin de maximizar la atracción electrostática entre dichos polipéptidos con carga opuesta, se prefiere emplear polipéptidos capaces de asumir espontáneamente una conformación helicoidal.
Por lo tanto, en una realización preferida, se agregará un "bucle E" cargado positivamente a uno de los polipéptidos que se usan para formar un DART biespecffico y se agregará un "bucle K" cargado negativamente al segundo de los polipéptidos del DART (Figura 37).
Un bucle E particularmente preferido tiene la secuencia: (EVAALEK)4í
SEQ ID NO: 299 EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
Un bucle K particularmente preferido tiene la secuencia: (KVAALKE)4:
SEQ ID NO: 300 KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE
Un polipéptido DART preferido que posea dicho bucle E tendrá la secuencia general: [Dominio VL]-[GGGSGGGG]-[Dominio VH]-[(EVAa LeK)4]-GGGnS, donde VL es el dominio de Ig variable ligero de DART, g GGs GGGG es la SEQ ID NO: 10, VH es el dominio de Ig variable pesado de DART, (EVAALEK)4 es la SEQ ID NO: 299 y GGGNS es la SEQ ID NO: 301. Un polipéptido DART preferido que posea dicho bucle K tendrá la secuencia general: [Dominio VL]-[GGGSGGGG]-[Dominio Vh ]-[(KVAALKE)4]-GGGNS, donde VL es el dominio de Ig variable ligero de DART, GGGSGGGG es la SEQ ID NO: 10, VH es el dominio de Ig variable pesado de DART, (KVAALKE)4 es la SEQ ID NO: 300, y GGGNS es la SEQ ID NO: 301.
6.16 DART QUE CONTIENEN Fc DE BUCLE E/BUCLE K
En una realización adicional, las regiones Fc se pueden ligar a los bucles E y/o K de los DART de bucle E o K. La ampliación de la separación entre las regiones Fc y el dominio VH del DART de un DART que contiene Fc es deseable en los casos en los que una disposición menos separada de dichos dominios da como resultado una interacción reducida entre dichos dominios y sus ligandos de unión o interfiere de otro modo con el ensamblaje del DART. Aunque pueden emplearse separadores de cualquier secuencia de aminoácidos, es preferible emplear separadores que formen bucles de hélice a, para extender y proyectar al máximo el dominio Fc lejos de los dominios variables (Figura 37). Debido a que los polipéptidos enrollados de carga opuesta anteriormente descritos, además, se combinan para promover la formación de heterodfmeros, dichas moléculas son separadores particularmente preferidos. Dichas moléculas de Fc-DART que contienen bucles proporcionan beneficios similares a los de los Fc-DART, incluyendo una semivida en suero y un reclutamiento de la función efectora mejorados. Los polipéptidos bucle E y bucle K descritos anteriormente son particularmente preferidos para este propósito.
Por lo tanto, en una realización preferida, el DART de bucle E que contiene Fc tendrá la secuencia general: [Dominio VL]-[GGGSGGGG]-[Dominio VH]-[(EVa Al EK)4]-GGG-FC dominio que comienza con D234 (numeración de Kabat), donde VL es el dominio de lg variable ligero de DART, GGGSGGGG es la SEQ ID NO: 10, VH es el dominio de lg variable pesado de DART y (EVAALEK)4 es la SEQ ID NO: 299.
De forma análoga, en una realización preferida, el DART de bucle K que contiene Fc tendrá la secuencia general:
[Dominio VL]-[GGGSGGGG]-[Dominio VH]-[(KVAALKE)4]-GGG-dominio Fc que comienza con D234 (numeración Kabat), donde VL es el dominio de lg variable ligero de dArT, GGGSGGGG es la SEQ ID NO: 10, VH es el dominio de lg variable pesado de DART y (KVAALKE)4 es la SEQ ID NO: 300.
Como se indica anteriormente, una molécula de DART que contiene bucle o una molécula de DART que contiene Fc que contiene bucle puede contener solo uno de dichos separadores de bucle o puede contener más de uno de dichos separadores (por ejemplo, dos separadores, preferentemente de carga opuesta, de los cuales uno está ligado a cada uno de los dominios VH de los polipéptidos de DART). Al unir la región Fc a dichas moléculas separadoras, la capacidad para producir versiones bivalentes, tetravalentes, etc., de las moléculas de Fc-DART se mejora mediante el intercambio de cadenas (Figura 39). Como se muestra en la figura 39, se pueden producir moléculas Fc-DART que forman monómeros o dímeros, dependiendo de si el dominio Fc está ligado a uno o a ambos dominios DART VH.
6.17 ACTIVIDAD FUNCIONAL DE DART QUE CONTIENEN FC DE BUCLE E/BUCLE K
Se produjeron especies de Fc-DART de bucle E y/o bucle K a partir de moléculas de DART biespecíficas que tienen: (1) las regiones variables ligeras y pesadas del anticuerpo que reacciona con CD79b (complejo BCR), CB3 y (2) las regiones variables ligeras y pesadas de una variante de baja afinidad (denominada variante "YA") del anticuerpo que reacciona con CD32B, 2B6. Esta región variable de la cadena ligera de este anticuerpo difiere de la del anticuerpo 2B6 en que contiene mutaciones: N50Y y V51A. Por lo tanto, El anticuerpo YA2B6 tiene una secuencia de región variable de cadena ligera:
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRTSQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASE
SISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNTWPFTFGGGTKVEI
K (SEQ ID NO: 302).
La secuencia de la región variable de la cadena pesada de este anticuerpo es:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWMGVIDP
SDTYPNYNKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYS
GMDYWGQGTTVTVSS (SEO ID NO: 303);
o
Se seleccionó el anticuerpo de baja afinidad ya que se unirá preferentemente a CD32B in cis En células que expresan CD79b (linfocitos B). Como tal, la configuración disminuirá la interacción con otras células que expresan CD32B (monocitos, células endoteliales, hígado), así como la interacción en trans no deseable.
Se prepararon derivados de bucle E y/o de bucle K y derivados que contenían Fc de bucle E y/o K de dichos DART h2B6YAhCB3. Se usó cromatografía de exclusión por tamaños para analizar el tamaño aproximado y la heterogeneidad de las moléculas producidas. Como se muestra en la figura 40, los dímeros se formaron a partir de DART de bucle E/bucle K que tienen una única región Fc unida a un dominio de bucle K así como de DART de bucle E/bucle K que tienen una única región Fc enlazada a un dominio de bucle E. El monómero deseado, así como las moléculas de dímero se recuperaron de las preparaciones en las que las regiones Fc se unieron a los bucles E y K de la misma molécula DART, siendo el monómero el producto mayoritario formado. La figura 41 muestra la posible estructura de las moléculas de dímero producidas.
Las fracciones de cromatografía de exclusión por tamaños se analizaron utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida SDS para analizar más a fondo las estructuras de las moléculas producidas (Figura 42). Los derivados de DART de bucle E/bucle K (sin región Fc) migraron en forma de dos bandas predominantes, cada una de aproximadamente 28 kD (correspondientes al polipéptido que contiene KFc y un polipéptido que contiene EFc ligeramente más pequeño) y una banda menos prominente a aproximadamente 49 kD (correspondiente al DART de bucle E/bucle K). Las fracciones de monómero de los derivados de DART que contienen Fc de bucle E/bucle K (EFc/K o E/KFc) de la cromatografía de exclusión por tamaños mostraron solo la banda de peso molecular mayor o menor a aproximadamente 28 kD (correspondiente a si el DART fue el DART que contiene KFc (banda de mayor peso molecular) o el DART que contiene EFc (banda de menor peso molecular). El material predominantemente migró a aproximadamente 49 kD (correspondiente al DART de bucle E/bucle K). También se observaron bandas significativas de peso molecular más alto.
Se preparó un ELISA de unión biespecífica para caracterizar las moléculas producidas. Se dispuso CD79 sobre una placa de ELISA. Después, se ligaron los DART a la placa. La unión a DART se detectó utilizando sCD32B-biotina seguido de incubación con estreptavidina-HRP. Como se muestra en la figura 43, Los derivados de DART h2B6YAhCB3 de bucle E/bucle K que contienen Fc (EFc/K o E/KFc) mostraron una mejora significativa de la unión relativa a un DART h2B6YAhCB3, o un derivado de DART EFc/KFc h2B6YAhCB3.
La reticulación de anticuerpos que se han unido a CD79b conduce a la activación de las linfocitos B (Van Kooten, C. et al. (1997) "Cross-Linking Of Antigen Receptor Via Ig-B (B29, CD79b) Can Induce Both Positive And Negative Signals In CD40-Activated Human B Cells," Clin. Exp. Immunol. 110:509-515). Dado que las moléculas de DART h2B6YAhCB3 son capaces de unirse tanto a CD79b como al receptor inhibidor de CD32B, tienen la capacidad de "reclutar" CD32B a sitios de unión a CD79b, y de ese modo bloquear la proliferación de linfocitos B. Para demostrar esta habilidad, los DARTS se incubaron con linfocitos B que habían sido expuestos a anticuerpos capaces de reticular los anticuerpos anti-CD79b unidos. Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 44. Los resultados muestran que los anticuerpos dirigidos únicamente contra CD79b o CD32B (Ch2B6N297Q y ChCB3.1N297Q, respectivamente) no pudieron inhibir la proliferación de linfocitos B. Los derivados de EFc/KFc h2B6YA x hCB3 DART fueron sustancialmente más efectivos en la inhibición de la proliferación de linfocitos B, al igual que h2B6YA x hCB3 DART y el control h2B6YA x hCB3 VF. Se encontró que los DARTS de bucle E/bucle K que tienen solo una región Fc unida (E/KFc h2B6YA x hCB3 DART derivados y EFc/K h2B6YA x hCB3 DART derivados) ejercen la mayor inhibición en la proliferación de linfocitos B.
6.18 MODIFICACIONES DE DART PARA ALTERAR LA SEMIVIDA IN VIVO
Como se ha analizado anteriormente, las moléculas de anticuerpo recombinante pequeñas, tales como moléculas monocatenarias biespecíficas (por ejemplo, que poseen una masa molecular de aproximadamente 55 kDa) se eliminan rápidamente de la circulación. Los estudios farmacocinéticos in vivo de moléculas DART en ratones mostraron la semivida terminal corta de aproximadamente 2 horas.
En algunas realizaciones, como en el tratamiento de una afección inflamatoria aguda, se desea dicha semivida tan corta, sin embargo, en otras realizaciones tales como en el tratamiento del cáncer y enfermedades y afecciones crónicas, se prefiere que las moléculas de DART de la presente divulgación muestren semividas más largas.
Para mejorar las propiedades farmacocinéticas in vivo de las moléculas de DART para dichos usos, pueden modificarse las moléculas de DART para que contengan una porción polipeptídica de una proteína de unión al suero en uno o más de los extremos de la molécula de DART. Muy preferiblemente, dicha porción de polipéptido de una proteína de unión al suero se instalará en el extremo C-terminal de la molécula de DART. Una porción de polipéptido particularmente preferida de una proteína de unión al suero para este propósito es el dominio de unión a la albúmina (ABD) de la proteína G del estreptococo. El dominio de unión a la albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa G148 de Streptococcus es particularmente preferido.
El dominio de unión a albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa G148 de Streptococcus consiste en 46 restos de aminoácidos que forman un haz estable de tres hélices y tiene una amplia especificidad de unión a la albúmina (Johansson, MU et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). La albúmina es la proteína más abundante en plasma y tiene una semivida de 19 días en humanos. La albúmina posee varios sitios de unión de moléculas pequeñas que le permiten unirse de forma no covalente a otras proteínas y, por lo tanto, prolongar sus semividas en suero.
Para demostrar la capacidad de una porción polipeptídica de una proteína sérica para prolongar la semivida de un DART, el dominio ABD3 de la proteína G del estreptococo se fusionó con un DART biespecífico recombinante (inmunorreactivo con los antígenos hCD16 y hCD32B) para generar una molécula de anticuerpo recombinante, hCD16-hCD32B ABD-DART (Figura 45). Este ABD-DART mostró una unión específica con ambos antígenos, así como con la albúmina sérica humana (HSA) y fue capaz de redirigir las células efectoras in vitro. Comparado con el DART de control, este ABD-DART mostró un fuerte aumento de la semivida en suero en ratones. Este enfoque puede utilizarse como una ruta viable para aumentar la semivida de productos farmacéuticos potencialmente importantes como DART a más de 90 minutos, más de 2 horas, más de 5 horas, más de 10 horas, más de 20 horas, y más preferentemente, más de 30 horas.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Diseño y construcción de ABD DART: Se preparó ABD DART hCD16-hCD32B utilizando como cadena 1: hCD16VL-G3SG4-hCD32BVH-bucle K [(KVAALKE)^ donde CD16VL denota el 3G8 CD16VL, G3SG4 indica la SEQ ID NO: 10, hCD32BVH denota el 2B6 CD32BVH, y (KVAALKE)4 denota la SEQ ID NO: 300;
y como cadena 2:
hCD32BVL-G3SG4-hCD16VH-GGCGGG-bucle E [(EVAALEK)4]-GGGNS-ABD
donde CD32BVL denota CD32BVL, G3SG4 indica la SEQ ID NO: 10, hCD16VH denota CD16VH, GGCGGG es Ios restos 2-7 de la SEQ ID NO: 267, bucle E [(EVAALEK^] es la SEQ ID NO: 299, GGGNS es la SEQ ID NO: 301, y ABD es: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALID EILAALP (SEQ ID NO: 304)
Por consiguiente, la secuencia de la cadena 1 (h3G8VL1-G3SG4-h2B6VH4-bucle K-GGGNS) es:
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL
LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY
TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN
YWIHWVRQAP GQGLEWIGVI DPSDTYPNYN KKFKGRVTMT VVVSTSTAYM
ELRSLRSDDT AVYYCARNGD SDYYSGMDYW GQGTTVTVSS GGCGGGKVAA
LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKEGGGNS (SEQ ID NO: 305)
Un polinucleótido preferido que codifica la cadena 1 (h3G8VL1 -G3SG4-h2B6VH4-bucle K-GGGNS) es:
gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga agatccgtac acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggccag gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt ctggttacac ctttaccaac tactggatac actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc ttgagtggat tggagtgatt gatccttctg atacttatcc aaattacaat aaaaagttca agggcagagt caccatgacc gtagtcgtat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag aaacggtgat tccgattatt actctggtat ggactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggaggatgtg gcggtggaaa agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag agggcggcgg gaattct (SEQ ID NO: 306)
Por consiguiente, La secuencia de la cadena 2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-bucle E-GGGNS-ABD) es:
EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT FTCRTSQSIG TN1HWYQQKP DQSPKLLIKE
VSESISGVPS RFSGSGSGTD FTLTINSLEA EDAATYYCQQ SNTWPFTFGG
GTKVEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSGMG
VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SKNQWLTMT
NMDPVDTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKGGG NSLAEAKVLA NRELDKYGVS DYYKNLINNA
KTVEGVKALI DEILAALP (SEQ ID NO: 307)
Un polinuoleótido preferido que codifica la cadena 2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-bucle E-GGGNS-ABD) es:
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc ttcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacatac actggtacca gcagaaacca gatcagtctc caaagctcct catcaaggag gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt taccctgaga gagtctggcc ctgcgctggt gaagcccaca cagaccctca cactgacttg taccttctct gggttttcao tgagcacttc tggtatgggt gtaggctgga ttcgtcagcc tcccgggaag gctctagagt ggctggcaca catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg a a g a g ccg a c t g a c a a t c t c c a a g g a ta c c tc c a a a a a c c a g g ta g tc c t c a c a a tg a c c a a c a tg g a c c c tg tg g a ta c tg c c a c a ta c t a c t g t g c t c a a a ta a a c c c c g c c t g g t t t g c t t a c tg g g g c ca a g g g a c t c t g g t c a c t g tg a g c tc c g g a g g a tg tg g c g g tg g a g a a g tg g c c g c a c tg g a g a a a g a g g t t g c t g c t t tg g a g a a g g a g g tc g c tg c a c t tg a a a a g g a g g tc g c a g c c c tg g a g a a a g g cg g cg g g a a t t c t c t g g ccg a a g ca a a a g tg c tg g c c a a c c g c g a a c tg g a ta a a ta tg g c g tg a g c g a t t a t t a t a a g a a c c tg a t ta a c a a c g c a a a g a c c g tg g a a g g c g tg a a a g c a c tg a t t g a tg a a a t t c tg g c c g c c c t g c c t
(SEQ ID NO: 308)
Cada segmento VL y VH se amplificó por PCR utilizando el DART hCD16-hCD32B como plantilla. Para la cadena 2, las secuencias de nucleótidos que contenían el bucle E y ABD se formaron mediante un dímero de cebador y luego se subclonaron en el extremo C-terminal de la región VH de hCD16 utilizando la digestión de restricción y la ligadura. Ambas cadenas se clonaron en el vector pCIneo (Promega, inc.) En los sitios Nhei-Notii. Los plásmidos individuales que albergan la cadena1 respectiva digerida en NgoMIV-Nhei y los casetes de expresión de la cadena2 digeridos en BstBI-Pmei se clonaron en un solo plásmido para la transfección en células CHO para generar líneas celulares estables.
Expresión y purificación de proteínas: Para la transfección estable, las células CHO-S se transfectaron con ADNc de plásmido de ECD ABD-Da Rt de hCD16-hCD32B. La proteína ABD-DART se purificó por cromatografía de afinidad utilizando la versión soluble del antígeno FcRIIB acoplado a la Sefarosa 4B activada con CNBr. La proteína concentrada se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaños usando Superdex 200HR 10/30.
Ensayo de unión por ELISA: Para la captura basada en CD-16, las placas se recubrieron con antígeno FcRIIB a una concentración de 2 pg/ml a 4 °C durante la noche. Las placas se bloquearon con Peptona al 0,5% en PBS-T. Las proteínas purificadas diluidas en una dilución en serie de dos veces se unieron a la placa durante 1 hora a temperatura ambiente. Por último, la detección se realizó utilizando CD32B biotinilado (50 ng/ml) seguido de estreptavidina conjugada con HRP (1/1000, BD-Pharm). La actividad de HRP se midió mediante la adición de TMB y la placa se leyó en un lector de placas a DO 450nm.
Para la captura de seroalbúmina humana (HSA), las placas se recubrieron con HSA a una concentración de 2pg/ml a 4 °C durante toda la noche. Después de eso, se siguieron los mismos procedimientos para realizar el ELISA de doble afinidad.
Ensayo de ADCC mediado por células mononucleares de sangre periférica: La citotoxicidad se midió mediante un ensayo de liberación de LDH. Se purificaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre humana completa (Lonza Walkersville, Inc, Gaithersburg, MD) mediante centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se sembraron 2 x 104 células diana en cada pocilio de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocilios de fondo redondo. Se agregan de una a cuatro diluciones en serie de diferentes DART o moléculas de anticuerpos a las células en la placa. Después de eso, se agregan 6 x 105 PBMC a los mismos pocilios. La placa se incuba luego durante la noche en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2. La placa se hace girar a 1200 rpm durante 5 minutos, Se transfieren 50 pl de sobrenadante a una placa ELISA de fondo plano. Se añaden 50 pl de solución de sustrato de LDH (Promega) a cada pocilio y la placa se incuba durante 30 min en oscuridad a temperatura ambiente. Luego, se agregan 50 pl de solución de parada a cada pocilio y la placa se lee a 490 nm en una hora. El porcentaje de citotoxicidad de cada pocilio se calcula con la lectura de Do en bruto como
(Muestra - AICC)/(diana máxima - diana espontánea) x 100
donde AICC es la citotoxicidad celular independiente del anticuerpo. La curva de respuesta a la dosis se genera utilizando el software Prism.
Estudio farmacocinético: Se inyecté a ratones C57B1/6 una única inyección intravenosa de hCD16-hCD32B DART a 5 mg/kg. El suero de ratón se recogió antes de la dosis, 2, 30 min; 1, 3, 6, 24 y 72 h. Se cuantificaron las concentraciones de hCD16-hCD32B DART en suero. Los cálculos farmacocinéticos de hCD16-hCD32B DART se realizaron mediante el paquete de software farmacocinético WinNonlin Professional 5.1 (Pharsight Corporation, EE. UU.). Los parámetros se determinaron mediante análisis no compartimental (NCA). El análisis no compartimental se basó en un modelo (Modelo 201) que requiere una inyección intravenosa del medicamento. El método trapezoidal lineal se utilizó para el cálculo de parámetros.
RESULTADOS
Estudio de expresión y unión por ELISA: ABD-DART hCD16-hCD32B se expresó de manera eficaz a una concentración de 6,5 mg por litro en células CHO-S de mamíferos. La actividad de unión de la proteína ABD-DART purificada a los antígenos respectivos se evaluó mediante ELISA. Los resultados mostraron que ABD-DART hCD16-hCD32B se une simultáneamente con ambos antígenos, CD16, así como con CD32B (Figura 46A). El perfil de unión coincide con el control de la unión a la proteína DART hCD16-hCD32B. La afinidad de ABD-DART hCD16-hCD32B purificado a la albúmina sérica humana (HSA) también se demostró mediante ELISA (Figura 46B). El resultado mostró una fuerte unión de la fusión ABD DART a HSA, mientras que no se observó unión con el control hCD16-hCD32B DART.
Citotoxicidad in vitro de ABD-DART: Para demostrar la unión simultánea de este ABD-DART biespecífico a dos antígenos, uno en la célula efectora y uno en la célula diana, se realizó el ensayo de destrucción de células redirigidas. Utilizando PBMC humanas como células efectoras, ABD-DART hCD16-hCD32B indujo una potente citotoxicidad dependiente de la dosis contra líneas de linfocitos B positivas para CD32B, Daudi (Figura 47). El resultado mostró que la potencia de ABD-DART era equivalente a la de DART precursor.
Propiedades farmacocinéticas de ABD-DART: Las propiedades farmacocinéticas de ABD-DART hCD16-hCD32B se analizaron mediante ELISA de muestras de suero después de una dosis única de inyección i.v. en ratones C57B1/6 (Figura 48). Ambas proteínas, DART y ABD-DART mostraron eliminación bifásica de la circulación. El estudio PK de ABD-DART mostró un tiempo de circulación prolongado, con una semivida terminal aumentada de 35,1 h en comparación con 1,2 h para DART regular (Figura 48, Tabla 17). La mejora de las propiedades farmacocinéticas también se demostró mediante la comparación del área bajo la curva (ABC). Para la construcción ABD-DART, el ABC aumentó en un factor de casi 30 después de la fusión con ABD (Tabla 17).
Figure imgf000131_0001
En resumen, se diseñó y produjo exitosamente un dominio de unión a la albúmina fusionado proteína DART (denominado ABD-DART). Se observó que el ABD-DART hCD16-hCD32B conserva las especificidades de sus dos determinantes antigénicos reconocidos: CD16 y CD32B. Se encontró que ABD-DART muestra una alta afinidad con la albúmina sérica humana. La fusión de ABD no redujo la actividad biológica (es decir,, la potencia del DART para la muerte de células tumorales redirigidas). La fusión de la molécula de DART con ABD llevó a una mejora sustancial (aumento) en su semivida in vivo y logró este objetivo sin un aumento dramático en el tamaño. La capacidad de mantener un tamaño pequeño es significativa y ventajosa, ya que facilita la capacidad del DART para difundirse en los tejidos tumorales.
6.19 DART PARA Her2/RECEPTOR DE LINFOCITOS B
Se construyó un diacuerpo IgDART que contenía regiones variables capaces de unirse a Her2/neu y al receptor de linfocitos T ("TCR").
Como se ha analizado anteriormente, el TCR se expresa de forma nativa por los linfocitos T CD4+ o CD8+ y permite que dichas células reconozcan los péptidos antigénicos que están unidos y presentados por las proteínas de MHC de clase I o clase II de las células presentadoras de antígeno. El reconocimiento de un complejo de pMHC (péptido-MHC) por un TCR inicia la propagación de una respuesta inmunitaria celular que da lugar a la producción de citocinas y a la lisis de la célula presentadora de antígenos. HER2/neu, un miembro importante de la familia ErbB, se ha investigado exhaustivamente debido a su papel en varios carcinomas humanos y en el desarrollo de los mamíferos. (Hynes y Stern (1994) Biochim. Et Biophys. Acta 1198:165-184; y Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al, (1995) Nature 378:394-398). El gen HER2/neu y la proteína HER2/neu se describen en Semba et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82: 6497-6501 y Yamamoto et al. (1986) Nature 319: 230-234 y la secuencia está disponible en GenBank como el número de referencia X03363. HER2/neu comprende cuatro dominios: un dominio extracelular al que se une el ligando; un dominio transmembrana lipófilo; un dominio de tirosina cinasa intracelular conservado; y un dominio de señalización carboxilo-terminal que alberga varios restos de tirosina que pueden fosforilarse. (Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750). La secuencia del dominio extracelular de HER2/neu (ECD) fue descrita por Franklin et al. (2004) Cáncer Cell. 5 (4): 317-328, y está disponible en Protein DataBank Record 1S78 (2004).
HER2/neu funciona como un receptor del factor de crecimiento y a menudo se expresa por tumores como el cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de células de vejiga, cáncer de ovario y cáncer de pulmón. HER2/neu está sobreexpresado en 25-30% de los cánceres de mama y ovario en humanos, y se asocia con una progresión clínica agresiva y un pronóstico desfavorable en estos pacientes. (Slamon et al. (1987) Science 235:177-182; Slamon et al. (1989) Science 244:707-712). La sobreexpresión de HER2/neu también se ha observado en otros carcinomas, incluidos los carcinomas del estómago, endometrio, glándulas salivales, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas y vejiga. (Véase, por ejemplo, King et al. (1985) Science 229:974; McCann et al. (1990) Cáncer 65:88-92; Yonemura et al. (1991) Cáncer Research 51:1034).
Se han desarrollado varios anticuerpos monoclonales e inhibidores de tirosina cinasa de molécula pequeña que se dirigen a HER-1 o HER2/neu, incluyendo, en particular, una variante humanizada de un anticuerpo monoclonal murino conocido como 4D5 (HERCEpTIN®, Genentech, Inc.) que reconoce un epítopo extracelular (aminoácidos 529 a 627) en el dominio II rico en cisteína de HER2/neu, que reside muy cerca de la región transmembrana de la proteína. Los estudios han demostrado que en las células de cáncer de mama que sobreexpresan HER2/neu, el tratamiento con anticuerpos específicos contra HER2/neu en combinación con agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, cisplatino, doxoubicina, taxol) provoca una mayor respuesta citotóxica que el tratamiento con quimioterapia sola. (Hancock et al. (1991) Cáncer Res. 51:4575-4580; Arteaga et al. (1994) Cáncer 54:3758-3765; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838). Un posible mecanismo por el cual los anticuerpos contra HER2/neu podrían mejorar la respuesta a los agentes quimioterapéuticos es a través de la modulación de la expresión de la proteína HER2/neu o interfiriendo con la reparación del ADN. (Stancovski et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695; Bacus et al. (1992) Cell Growth & Diff. 3:401-411; Bacus et al. (1993) Cáncer Res. 53:5251-5261; Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109; Klapper et al. (2000) Cáncer Res. 60:3384-3388; Arteaga et al. (2001) J Clinical Oncology 19(18s):32s-40s. Aunque en ciertos casos, los anticuerpos anti-HER2/neu como HERCEPTIN® proporcionan un beneficio terapéutico a los pacientes, la mayoría de cánceres de mama y otros pacientes exhiben respuestas refractarias a dichos anticuerpos. Estas respuestas reflejan, en parte, diferencias en el alcance de la sobreexpresión de HER2/neu por las células cancerosas del paciente.
Como consecuencia de contener regiones variables capaces de unirse a Her2/neu y al receptor de linfocitos T ("TCR"), el DART tiene la capacidad de unirse a las células que expresan HER2 y, por lo tanto, de unir a dichas células un dominio capaz de unirse al receptor de linfocitos T. Cuando dichos linfocitos T se unen a este dominio, se activan para iniciar una respuesta inmune que conduce a la destrucción de las células que expresan HER2.
Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos para dicho DART se proporcionan a continuación, mostrándose en texto plano las secuencias de VL y VH, mostrándose el enlazador VL-VH en texto subrayado y la secuencia que codifica el motivo de heterodimerización C-terminal (SEQ ID NO: 313: GFNRGEC o SEQ ID NO: 314: GVEPKSC) mostrada en negrita y cursiva.
secuencia de aminoácidos de TCRVL-HER2VH (SEQ ID NO: 315)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ
SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD
KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSSGFNRGE
C
secuencia de ácido nucleico que codifica TCRVL-HER2VH (SEQ ID NO: 316)
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggattcaa caggggagag tgt
secuencia de aminoácidos de HER2VL-TCRVH (SEQ ID NO: 317)
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD
RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV
QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK
GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGVEPFT
se
secuencia de ácido nucleico que codifica HER2VL-TCRVH (SEQ ID NO: 318)
gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat cgcttcactg geageagate tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctcc ggagt tgagcccaaa tcttgt
En una realización preferida, dichas construcciones se modifican para contener un dominio de bucle E o de bucle K que facilita la formación de heterodímeros (es decir,, dímeros de TCRVL-HER2VH x HER2VL-TCRVH). Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos para dicho DART se proporcionan a continuación, mostrándose las secuencias de VL y VH en texto plano, mostrándose el enlazador VL-VH en el texto subrayado y la secuencia que codifica el enlazador que contiene Cys para la dimerización (GGCGGG; restos 2-7 de la SEQ ID NO: 267) mostrada en cursiva. El bucle E del dominio de heterodimerización del bucle K está doblemente subrayado (la secuencia preferida del "bucle E" es de 4 repeticiones heptaméricas de EVAALEK; SEQ ID NO: 299; la secuencia preferida del "bucle K" es de 4 repeticiones heptaméricas de r KVAALKE (SEQ ID NO: 300). La secuencia que sigue al bucle E o el bucle K no tiene función asignada.
secuencia de aminoácidos de TCRVL-HER2VH-bucle E (SEQ ID NO: 319)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ
SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTY1HW VKQRPEQGLE WIGRIYFTNG YTRYDPKFQD
KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSSGGCGGG
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GNS
secuencia de ácido nucleico que codifica TCRVL-HER2VH-bucle E (SEQ ID NO: 320)
g a a a t t g t g t tg a c a c a g tc tc c a g c c a c c c t g t c t t t g t c tc c a g g g g a a a g a g c c a c c c t c t c c t g c a g tg c c a c c tc a a g tg ta a g t t a c a t g c a c t g g ta tc a g c a g a a a cca g g g a a a g c c c c ta a g c g c tg g a t c ta tg a c a c a tc c a a a c tg g c t t c t g g g g t c c c a tc a a g g t t c a g c g g c a g tg g a tc tg g g a c a g a a t t t a c tc tc a c a a tc a g c a g c c t g c a g c c tg a a g a t t t t g c a a c t t a t t a c t g tc a g c a g tg g a g ta g ta a c c c g c t c a c g t t tg g c c a g g g g a c c a a g c t tg a g a tc a a a g g a g g c g g a tc c g g cg g cg g a g g c c a g g t tc a g c tg c a g c a g tc tg g g c c a g a g c t tg tg a a g c c a g g g g c c t c a c t c a a g t t g t c c t g t a c a g c t t c t g g c t t c a a c a t t a a a g a c a c c ta t a t a c a c tg g g tg a a a c a g a g g c c tg a a c a g g g c c tg g a a tg g a t tg g a a g g a t t t a t c c t a c g a a tg g t t a t a c t a g a t a tg a c c c g a a g t tc c a g g a c a a g g c c a c ta ta a c a g c a g a c a c a tc c t c c a a c a c a g c c t a c c tg c a g g t c a g c c g c c tg a c a tc tg a g g a c a c tg c c g t c t a t t a t t g t t c ta g a tg g g g a g gg gacgg c t t c t a t g c t a tg g a c ta c t g g g g tc a a g g a g c c tc g g tc a c c g tg a g c t c c g g a g g a tg tg g c g g tg g a g a a g tg g c c g c a c tg g a g a a a g a g g t tg c t g c t t t g g a g a a g g a g g tc g c t q c a c t t q a a a a q q a q q tc q c a q c c c tq q a qaa a q q cq q c g g g a a t t c t
Secuencia de aminoácidos de HER2VL-TCRVH-bucle K (SEQ ID NO: 321)
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD
RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV
QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK
GRVTITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGGCGG
GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKEG GGNS
secuencia de ácido nucleico que codifica HER2VL-TCRVH-bucle K (SEQ ID NO: 322)
g a c a tc g tg a tg a c c c a g tc c c a c a a g t tc a t g t c c a c c t c tg tg g g c g a ta g g g tc a g c a tc a c c tg c a a g g c c a g c c a g g a tg tg a a t a c tg c tg ta g c c tg g ta t c a g ca g a a a cca g g a c a t t c t c c c a a a c tg c t g a t t t a c t c c g c a t c c t t c c g g ta c a c tg g a g t c c c tg a t c g c t t c a c t g g c a g c a g a tc tg g g a c a g a t t t c a c t t t c a c c a tc a g c a g t g tg c a g g c t g a a g a c c tg g c a g t t t a t t a c tg tc a g c a a c a t t a t a c t a c a c c tc c c a c c t tc g g a g g g g g ta c c a a g g tg g a g a tc a a aggag g cg g a tc c g g c g g c g g a g g c c a g g t t c a g c tg g tg c a g tc tg g a g c tg a g g tg a a g a a g c c tg g g g c c tc a g tg a a g g t c t c c t g ca a g g c c a g c
g g t ta c a a g t t t a c c a g c t a c g tg a tg c a c tg g g tg c g a c a g g c c c c tg g a c a a g g g c t t g a g tg g a tc g g a t a t a t t a a t c c t t a c a a t g a t g t t a c t a a g ta c a a tg a g a a g t tc a a a g g c a g a g tc a c g a t ta c c g c g g a c a a a tc c a c g a g ca ca g c c ta c a tg g a g c tg a g c a g c c tg a g a tc c g a g g a ca cg g c c g tg c a c ta c tg tg c g a g a g g g a g c ta c ta tg a t ta c g a c g g g t t t g t t t a c tg g g g c c a a g g g a c tc tg g t c a c tg tg a g c tc c g g a g g a tg tg g c g g t g g a a a a g tg g c c g p a c tg a a g g a g a a a g tt gctgctttga a a q a q a a q q t c q c c q c a c t t aaqqa aaaqq tc q c a q c c c t q a a a q a q qqc g g c g g g a a t t c t
Las moléculas de DART que tienen dominios de unión al receptor de linfocitos T y Her2 (TCR) se probaron para determinar su capacidad para mediar la citotoxicidad en múltiples líneas celulares de cáncer de colon y cáncer de vejiga que se habían caracterizado previamente por presentar bajos niveles de expresión de HER2 (y por lo tanto son refractarias al tratamiento con el anticuerpo anti-Her2/neu, Herceptin®. Las líneas celulares de cáncer de mama analizadas son ZR75-1 (HER22+) (FIG. 49A), MCF-7 (HER2 1+) (FIG. 49B) y MDA-MB468 (HER2-ve) (FIG. 49C).

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de dlacuerpo que comprende una primera cadena pollpeptfdlca y una segunda cadena pollpeptfdlca, estando las cadenas polipeptídicas unidas covalentemente entre sí, en donde:
I. la prlmera cadena de pollpéptldo comprende: (l) un prlmer domlnlo que comprende una reglón de unlón de un domlnlo varlable de cadena Ilgera de una prlmera lnmunoglobullna (VL1) específlca para un epítopo (1), (ll) un segundo domlnlo que comprende una reglón de unlón de un domlnlo varlable de cadena pesada de una segunda lnmunoglobullna (VH2) específlca para un epítopo (2) y (lll) un tercer domlnlo que comprende:
(1) un domlnlo Fc; o
(2) un domlnlo blsagra; o
(3) una reglón constante de cadena Ilgera (CL);
estando el prlmer domlnlo y el segundo domlnlo unldos covalentemente, de tal forma que el prlmer domlnlo y el segundo domlnlo no se asoclan entre sí para formar un sltlo de unlón a epítopo (1) o un sltlo de unlón a epítopo (2);
II. la segunda cadena pollpeptídlca comprende: (l) un cuarto domlnlo que comprende una reglón de unlón de un domlnlo varlable de cadena Ilgera de la segunda lnmunoglobullna (VL2) específlca para el epítopo (2), (ll) un qulnto domlnlo que comprende una reglón de unlón de un domlnlo varlable de cadena pesada de la prlmera lnmunoglobullna (VH1) específlca para el epítopo (1) y (lll) un sexto domlnlo que comprende:
(1) un domlnlo Fc, donde el tercer domlnlo comprende un domlnlo Fc; o
(2) una porclón peptídlca que comprende la secuencla de amlnoácldos FNRGEC (SEQ ID NO: 23), donde el tercer domlnlo comprende un domlnlo Fc o un domlnlo blsagra; o
(3) una reglón constante 1 (CH1) de cadena pesada, una reglón blsagra, una reglón constante 2 (CH2) de cadena pesada y una reglón constante 3 (CH3) de cadena pesada, donde el tercer domlnlo comprende una reglón constante de cadena llgera (CL);
estando el cuarto domlnlo y el qulnto domlnlo unldos covalentemente, de tal forma que el cuarto domlnlo y el qulnto domlnlo no se asoclan entre sí para formar un sltlo de unlón a epítopo (1) o un sltlo de unlón a epítopo (2);
en donde el prlmer domlnlo y el qulnto domlnlo se asoclan entre sí para formar un sltlo de unlón (VL1 )(VH1) que se une al epítopo (1);
en donde el segundo domlnlo y el cuarto domlnlo se asoclan entre sí para formar un sltlo de unlón (VL2)(VH2) que se une al epítopo (2); y
en donde:
(1) los domlnlos segundo y tercero; y/o
(2) los domlnlos qulnto y sexto;
están unldos entre sí medlante un enlazador pollpeptídlco lntermedlo que conslste en una secuencla que se selecclona entre el grupo que conslste en las SEQ ID NO:278, 280, 281,283, 284, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 293, 295 y 297.
2. La molécula de dlacuerpo de la relvlndlcaclón 1, en donde el tercer domlnlo es un domlnlo Fc y el sexto domlnlo es un domlnlo Fc.
3. La molécula de dlacuerpo de la relvlndlcaclón 2, en donde el tercer domlnlo comprende además un domlnlo blsagra.
4. La molécula de dlacuerpo de la relvlndlcaclón 1, en donde el tercer domlnlo es un domlnlo Fc y el sexto domlnlo comprende una porclón peptídlca que comprende la secuencla de amlnoácldos FNRGEC (SEQ ID NO: 23).
5. La molécula de dlacuerpo de la relvlndlcaclón 1, en donde el tercer domlnlo es un domlnlo blsagra y el sexto domlnlo comprende una porclón peptídlca que comprende la secuencla de amlnoácldos FNRGEC (SEQ ID NO: 23).
6. La molécula de dlacuerpo de la relvlndlcaclón 1, en donde el tercer domlnlo comprende una reglón constante de cadena Ilgera (CL) y el sexto domlnlo comprende una reglón constante 1 (CH1) de cadena pesada, una reglón blsagra, una reglón constante 2 (CH2) de cadena pesada y una reglón constante 3 (CH3) de cadena pesada.
7. La molécula de dlacuerpo de la relvlndlcaclón 6, en donde la molécula comprende adlclonalmente una tercera cadena pollpeptídlca y una cuarta cadena pollpeptídlca, estando las cadenas pollpeptídlcas adlclonales unldas covalentemente entre sí, en donde:
III. la tercera cadena polipeptídica comprende: (í) un séptimo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una tercera inmunoglobulina (VL3) específica para un epítopo (3); (íí) un octavo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una cuarta inmunoglobulina (VH4) específica para un epítopo (4); y (iii) un noveno dominio que comprende una región constante de cadena ligera (CL); estando el séptimo dominio y el octavo dominio unidos covalentemente, de tal forma que el séptimo dominio y el octavo dominio no se asocian entre sí para formar un sitio de unión a epítopo (3) o un sitio de unión a epítopo (4);
IV. la cuarta cadena de polipéptido comprende: (i) un décimo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la cuarta inmunoglobulina (VL4) específica para el epítopo (4); (íí) un undécimo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la tercera inmunoglobulina (VH3) específica para el epítopo (3); y (iii) un duodécimo dominio que comprende una región constante 1 de cadena pesada (CH1);
estando el décimo dominio y el undécimo dominio unidos covalentemente, de tal forma que el décimo dominio y el undécimo dominio no se asocian entre sí para formar un sitio de unión a epítopo (3) o un sitio de unión a epítopo (4); en donde el séptimo dominio y el undécimo dominio se asocian entre sí para formar un sitio de unión (VL3)(VH3) que se une al epítopo (3);
en donde el octavo dominio y el décimo dominio se asocian entre sí para formar un sitio de unión (VL4)(VH4) que se une al epítopo (4);
en donde el noveno dominio y el duodécimo dominio se asocian entre sí mediante un enlace disulfuro para formar un CH1;
en donde la región bisagra, la región constante 2 (CH2) de cadena pesada y la región constante 3 (CH3) de cadena pesada de las cadenas de polipéptido segunda y cuarta se asocian entre sí para formar una región Fc;
y
en donde:
(1) los dominios octavo y noveno; y/o
(2) los dominios undécimo y duodécimo;
están unidos entre sí mediante un enlazador polipeptídico intermedio que consiste en una secuencia que se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:278, 280, 281,283, 284, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 293, 295 y 297.
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