ES2712402T3

ES2712402T3 - Variantes de xilanasa y polinucleótidos que las codifican

Info

Publication number: ES2712402T3
Application number: ES15734528T
Authority: ES
Inventors: Brian R Scott; Mark Wogulis; Sven Pedersen; James Lavigne
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2019-05-13
Anticipated expiration: 2035-06-25
Also published as: DK3161133T3; US20170096687A1; WO2015200659A1; US10370682B2; EP3161133B1; EP3161133A1

Abstract

Variante de xilanasa, que comprende una sustitucion al menos en una posicion correspondiente a la posicion 87 del polipeptido de la SEQ ID no: 3, en la que la variante tiene actividad de xilanasa y tiene una tolerancia incrementada a los inhibidores de xilanasa en comparacion con la xilanasa de la SEQ ID no: 3; y en la que la variante tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID no: 3 y en la que la sustitucion es H87Y

Description

d e s c r ip c io n

Variantes de xilanasa y polinucleotidos que las codifican

Referencia a un listado de secuencias

[0001] Esta solicitud contiene un Listado de Secuencias en formato legible por ordenador.

Antecedentes de la invencion

Campo de la invencion

[0002] La presente invencion se refiere a variantes de xilanasa, polinucleotidos que codifican las variantes, metodos para producir las variantes y metodos para usar las variantes.

Descripcion de la tecnica relacionada.

[0003] Los polisacaridos de la pared celular vegetal constituyen aproximadamente el 90% de la pared celular vegetal y se pueden dividir en tres grupos: celulosa, hemicelulosa y pectina. La celulosa representa el componente principal de los polisacaridos de la pared celular. Las hemicelulosas son el segundo constituyente mas abundante de las paredes celulares vegetales. El principal polimero de hemicelulosa es el xilano.

[0004] El xilano es un polimero de D-xilosa unido por enlaces beta-1,4-xilosidicos. El xilano se puede degradar a xilosa y xilo-oligomeros por hidrolisis acida o enzimatica. La hidrolisis enzimatica de xilano produce azucares libres sin los subproductos formados con acido (p.ej., furanos).

[0005] Las enzimas capaces de degradar el xilano y otros polisacaridos de la pared celular vegetal son importantes para la industria alimentaria, principalmente para la panaderia y en el procesamiento de frutas y verduras como la produccion de zumos de frutas o la elaboracion de vino, donde se utiliza su capacidad para catalizar la degradacion de la cadena principal o las cadenas laterales del polisacarido de la pared celular vegetal (Visser et al., Xylans and Xylanases, Proceedings of an International Symposium, Wageningen, The Netherlands, Elsevier Science Publishers, 1992). La biodegradacion de la cadena principal de xilano depende de dos clases de enzimas: endoxilanasas y beta-xilosidasas. Las endoxilanasas (EC 3.2.1.8) dividen la cadena principal del xilano en oligosacaridos mas pequenos, que pueden degradarse mas a xilosa por las beta-xilosidasas (EC 3.2.1.37). Otras enzimas involucradas en la degradacion del xilano incluyen, por ejemplo, la acetilxilano esterasa, arabinasa, alfaglucuronidasa, feruloil esterasa y esterasa de acido p-cumarico.

[0006] Otras aplicaciones para las xilanasas son la descomposicion enzimatica de desechos agricolas para la produccion de combustibles alcoholicos, el tratamiento enzimatico de piensos para animales para la hidrolisis de pentosanos, la fabricacion de pulpas para disolver que producen celulosa y el bioblanqueo de pulpa de madera [Detroym R. W. In: Organic Chemicals from Biomass, (c Rc Press, Boca Raton, Fla., 1981) 19-41; Paice y Jurasek, J. Wood Chem. Tecnol. 4: 187-198; Pommier y Fuentes, 1989, Tappi Journal 187-191.; Senior et al., 1988, Biotechnol. Letters 10: 907-9121].

[0007] El xilano es abundante en las paredes celulares vegetales. El arabinoxilano, en particular, es abundante en los cereales, como el trigo, la cebada y el centeno. Las formas solubles de arabinoxilano hacen que las pulpas acuosas de estos granos sean altamente viscosas. Las xilanasas descomponen el (arabino)xilano y liberan azucares de cadena corta solubles. Las xilanasas, como las de las familias GH 5, 8, 10 y/u 11, pueden usarse en aplicaciones de bioetanol para reducir la viscosidad y mejorar los rendimientos de azucares fermentables. Sin embargo, los granos de cereal producen proteinas inhibidoras que se unen a muchas xilanasas microbianas y las vuelven ineficaces.

[0008] EP695349 describe una xilanasa GH10 de Aspergillus aculeatus.

[0009] WO2006/078256 describe una xilanasa GH10 de Aspergillus fumigatus.

[0010] La presente invencion proporciona variantes de una xilanasa con propiedades mejoradas en comparacion con su enzima progenitora.

Resumen de la invencion

[0011] En particular, la presente invencion proporciona una variante de la xilanasa de Aspergillus fumigatus de tipo salvaje descrita en WO 2006/078256 con una tolerancia mejorada a los inhibidores en comparacion con la enzima de tipo salvaje.

La presente invencion se refiere a una variante de xilanasa, que comprende una sustitucion al menos en una posicion correspondiente a la posicion 87 del polipeptido de la SEQ ID n°: 3, en la que la variante tiene actividad de xilanasa y tiene una tolerancia incrementada a inhibidores de xilanasa en comparacion con la xilanasa de la SEQ ID n° 3; y

en la que la variante tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID N°: 3; y en donde la sustitucion es H87Y.

[0012] La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos aislados que codifican las variantes; construcciones de acidos nucleicos, vectores y celulas hospedadoras o plantas transgenicas que comprenden los polinucleotidos; y metodos de produccion de las variantes.

[0013] Otro aspecto de la invencion se refiere a un proceso para producir un producto de fermentacion a partir de material que contiene almidon que comprende las etapas de: (a) licuar material que contiene almidon en presencia de una alfa amilasa; (b) sacarificar el material licuado; y (c) fermentarlo con un organismo fermentador; donde la variante de xilanasa de la invencion esta presente durante la etapa (a).

[0014] Otro aspecto de la invencion se refiere a un proceso para producir un producto de jarabe a partir de material que contiene almidon, que comprende la etapa de: (a) mezclar el material que contiene almidon seco con agua para formar una pulpa, (b) licuar el material que contiene almidon en presencia de una alfa amilasa; (c) sacarificar el material licuado en presencia de una glucoamilasa, donde la variante de xilanasa de la invencion esta presente durante la etapa (a) y/o (b).

[0015] Otro aspecto de la invencion se refiere a un proceso para producir un producto de fermentacion, que comprende:

(a) sacarificacion de un material celulosico o que contiene xilano con una composicion enzimatica en presencia de la variante de xilanasa de la invencion;

(b) fermentar el material celulosico sacarificado o que contiene xilano con uno o mas microorganismos de fermentacion para producir el producto de fermentacion; y

(c) recuperar el producto de fermentacion de la fermentacion.

[0016] Otro aspecto de la invencion se refiere a una composicion que comprende la variante de la invencion.

[0017] Otro aspecto de la invencion se refiere a un proceso para degradar un material que contiene xilano, que comprende: tratar el material de xilano con una composicion enzimatica de la invencion.

[0018] Otro aspecto de la invencion se refiere a una formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular, que comprende la variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

Breve descripcion de las figuras

[0019]

La Figura 1 muestra los perfiles de termoactividad des xilananasas GH10 de Aspergillus fumigatus (AfumGH10) y Aspergillus aculeatus (AacuGH10). Las xilanasas se incubaron con arabinoxilano de trigo durante 1 hora a varias temperaturas en citrato de sodio 50 mM, pH 5,0. La actividad se midio utilizando una tecnica de cuantificacion de azucares reductores por DNS. Las actividades que se muestran a cada temperatura son relativas a la actividad maxima para cada xilanasa. La GH10 de A. fumigatus conserva una fraccion mucho mayor de su actividad maxima a temperaturas mas altas, lo que indica que es mas termoactiva y/o mas termoestable que la GH10 de A. aculeatus.

La Figura 2 muestra que la AfumGH10 de tipo salvaje se ve notablemente afectada por los inhibidores derivados del trigo, mientras que los efectos sobre la AacuGH10 fueron insignificantes en estas condiciones. Las xilanasas se incubaron previamente con varias diluciones de inhibidores derivados del trigo durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se analizaron para determinar su actividad en arabinoxilano de trigo a 50 °C, pH 5,0.

La Figura 3 muestra que la variante H87Y es significativamente mas tolerante a los inhibidores derivados del trigo que la AfumGH10 de tipo salvaje. Las enzimas se preincubaron primero con varias diluciones de una preparacion de inhibidores del trigo y luego se analizaron para determinar la actividad residual en arabinoxilano de trigo.

La Figura 4 demuestra que la mutacion H87Y no confiere efectos negativos sobre la termoestabilidad de la AfumGH10. Las enzimas se incubaron con arabinoxilano de trigo durante 1 h a las temperaturas indicadas y luego se midieron las concentraciones de xilosa utilizando una tecnica de determinacion de azucares reductores. Esta figura tambien muestra que la AfumGH10, tanto la variante de tipo salvaje como la H87Y, tiene una termoactividad mas alta que la actividad de xilanasa en la enzima de procesamiento de cereales comercial Optimash TBG.

Definiciones

[0020] Actividad de xilanasa: El termino "xilanasa" se define aqu como una 1,4-beta-D-xilano-xilanohidrolasa (E.C. 3.2.1.8) que cataliza la endohidrolisis de los enlaces 1,4-beta-D-xilosidicos en los xilanos. Para los fines de la presente invencion, la actividad de xilanasa se determina con arabinoxilano de trigo al 0,5% en tampon de citrato de sodio 100 mM, pH 5,0 a 50 °C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1,0 |_imol de equivalentes de xilosa producidos por minuto a 50 °C, pH 5,0 de arabinoxilano al 0,5% como sustrato en tampon de citrato de sodio 100 mM, pH 5,0. En algunos casos, la actividad de xilanasa se mide durante incubaciones a temperaturas mas altas con arabinoxilano de trigo, condiciones en las que la xilanasa puede inactivarse durante el ensayo. En este caso, la actividad se denomina actividad de xilanasa "aparente". En una realizacion, los polipeptidos de la presente invencion tienen al menos el 75%, preferiblemente al menos el 80%, mas preferiblemente al menos el 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, y aun mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende ademas la sustitucion H87Y, y donde la variante de xilanasa tiene al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97% , al menos 98%, o al menos 99%, pero menos de 100% de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3.

[0021] En una realizacion, la actividad de xilanasa se determina como actividad relativa en presencia de inhibidores de xilanasa extraidos del trigo como se describe en los ejemplos.

[0022] La variante de la invencion tiene un aumento en la actividad relativa de xilanasa sobre la xilanasa de tipo salvaje de al menos un factor 7x, particularmente 8x, particularmente 8,5x, mas particularmente 9x, en presencia de inhibidores de xilanasa de trigo, particularmente XlP-1, en cantidades que reduciran la actividad de xilanasa de tipo salvaje a menos del 10%.

[0023] Inhibidor de xilanasa: El termino "inhibidor de xilanasa" se define en el presente documento como proteinas inhibidoras producidas en granos de cereales (gramineas cuyas semillas se usan para alimentos). En particular, el grano de cereal es el trigo. Mas particularmente, las proteinas inhibidoras se seleccionan de un grupo que comprende proteina inhibidora de la xilanasa (XIP), inhibidor de xilanasa de T. aestivum (TAXI) e inhibidor de xilanasa de tipo taumatina (TLXI). Los inhibidores proteicos de las xilanasas que se encuentran en cereales distintos del trigo son similares en estructura y propiedades a la XIP y al TAXI del trigo y se denominan proteinas de tipo XIP y tipo TAXI. XIP comprende un grupo de proteinas homologas codificadas por diferentes genes, entre las que XIP-I es la mas abundante. De manera similar, TAXI no es una unica proteina, sino que comprende dos proteinas, TAXI-I y TAXI-II. Ademas, los inhibidores TAXI y de tipo TAXI tienen cada uno dos isoformas que resultan del procesamiento proteolitico de la proteina madura. Se les conoce como TAXI-IA, TAXI-IB, TAXI-IIA y TAXI-IIB. Aun mas particularmente, las proteinas inhibidoras se seleccionan de un grupo que comprende XIP-I, TAXI-IA, TAXI-IB, TAXI-IIA, TAXI-IIB y TLXI de trigo y sus homologas en otros cereales.

[0024] Las xilanasas microbianas difieren en su sensibilidad y especificidad a XIP, TAXI y TLXI (descrito por Gusakov, Biochemistry (Moscu), 2010). Los inhibidores de XIP-I o de tipo XIP-I inhiben muchas xilanasas fungicas de la familia 11 y 10, mientras que generalmente no inhiben las xilanasas GH11 bacterianas. Se han publicado (Payan et al., 1994) estructuras cristalinas de XIP-I en complejo con una xilanasa GH10 de Aspergillus nidulans y una xilanasa GH11 de Pencillium funiculosum. Las proteinas TAXI, o de tipo TAXI, inhiben las xilanasas fungicas y bacterianas de la Familia 11, pero por lo general no afectan a las de la Familia GH 10.

[0025] Familia 10 o Familia GH10 o GH10: El termino "Familia 10" o "Familia GH10" o "GH10" se define en este documento como un polipeptido que se incluye en la Familia 10 de glucosido hidrolasas segun Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat y Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

[0026] Material que contiene xilano: El termino "material que contiene xilano" se define en este documento como cualquier material que comprenda xilano como constituyente. El xilano es un polisacarido de la pared celular vegetal que contiene una cadena principal de residuos de xilosa con enlaces beta-1,4. Las cadenas laterales de acido 4-O-metilglucuronico y arabinosa estan generalmente presentes en cantidades variables, junto con grupos acetilo y feruloilo. El xilano es un componente importante de la hemicelulosa.

[0027] Variante alelica: el termino "variante alelica" significa cualquiera de dos o mas formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosomico. La variacion alelica surge de manera natural a traves de mutacion, y puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones geneticas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipeptido codificado) o pueden codificar polipeptidos que tienen secuencias de aminoacidos alteradas. Una variante alelica de un polipeptido es un polipeptido codificado por una variante alelica de un gen.

[0028] ADNc: el termino "ADNc" significa una molecula de ADN que se puede preparar por transcripcion inversa a partir de una molecula de ARNm maduro empalmado obtenida a partir de una celula eucariotica o procariotica. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genomico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a traves de una serie de pasos, incluyendo corte y empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.

[0029] Secuencia codificante: el termino "secuencia codificante" significa un polinucleotido que especifica directamente la secuencia de aminoacidos de una variante. Los limites de la secuencia codificante se determinan generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza con un codon de inicio tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codon de terminacion tal como, TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genomico, ADNc, ADN sintetico, o una combinacion de los mismos.

[0030] Secuencias de control: el termino "secuencias de control" significa secuencias de acidos nucleicos necesarias para la expresion de un polinucleotido que codifica una variante de la presente invencion. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, procedente del mismo gen) o extrana (es decir, procedente de un gen diferente) respecto al polinucleotido que codifica la variante o nativas o extranjeras entre si. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un lider, secuencia de poliadenilacion, secuencia de propeptido, promotor, secuencia de peptido senal, y terminador de transcripcion. Como minimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y senales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlazadores con el fin de introducir sitios de restriccion especificos que facilitan la ligacion de las secuencias de control con la region codificante del polinucleotido que codifica una variante.

[0031] Expresion: el termino "expresion" incluye cualquier paso implicado en la produccion de una variante, incluyendo, pero sin limitarse a, transcripcion, modificacion postranscripcional, traduccion, modificacion postraduccional y secrecion.

[0032] Vector de expresion: el termino "vector de expresion" significa una molecula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleotido que codifica una variante y esta operativamente enlazado a secuencias de control que permiten su expresion.

[0033] Fragmento: el termino "fragmento" significa un polipeptido con uno o mas (por ejemplo, varios) aminoacidos ausentes del terminal amino y/o carboxilo de un polipeptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de xilanasa.

[0034] Condiciones de alta astringencia: el termino "condiciones de alta astringencia" significa, para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, Sd S al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 50%, siguiendo procedimientos Southern blot estandar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 65°C.

[0035] Celula hospedadora: el termino "celula hospedadora" significa cualquier tipo de celula que es susceptible a una transformacion, transfeccion, transduccion, o similar con un construccion de acido nucleico o vector de expresion que comprende un polinucleotido de la presente invencion. El termino "celula hospedadora" abarca cualquier descendiente de una celula progenitora que no es identica a la celula progenitora debido a mutaciones que ocurren durante la replicacion.

[0036] Propiedad mejorada: el termino "propiedad mejorada" significa una caracteristica asociada a una variante que esta mejorada en comparacion con la progenitora. Tales propiedades mejoradas incluyen, pero de forma no limitativa, una termoestabilidad mejorada.

[0037] Aislado: el termino "aislado" significa una sustancia en una forma o entorno que no se da en la naturaleza. Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no este presente de forma natural, (2) cualquier sustancia incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier enzima, variante, acido nucleico, proteina, peptido o cofactor, que se extrae al menos parcialmente de uno o mas o todos los constituyentes de origen natural a los que esta asociada en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por el ser humano con respecto a esa sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los cuales se asocia naturalmente (p.ej., produccion recombinante en una celula hospedadora; copias multiples de un gen que codifica la sustancia; y el uso de un promotor mas fuerte que el promotor asociado naturalmente con el gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentacion; p.ej. una celula hospedadora puede modificarse geneticamente para expresar el polipeptido de la invencion. El caldo de fermentacion de esa celula hospedadora comprendera el polipeptido aislado.

[0038] Condiciones de baja astringencia: el termino "condiciones de baja astringencia" significa, para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 25%, siguiendo procedimientos Southern blot estandar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 50°C.

[0039] Polipeptido maduro: el termino "polipeptido maduro" significa un polipeptido en su forma final tras la traduccion y cualquier modificacion postraduccional, tal como procesamiento en el extremo N-terminal, truncamiento en el extremo C-terminal, glicosilacion, fosforilacion, etc. En un aspecto, el polipeptido maduro es los aminoacidos 20 a 397 de la SEQ ID n°: 2. Los aminoacidos 1 a 19 de la SEQ ID n°: 2 son un peptido senal. Se sabe en la tecnica que una celula hospedadora puede producir una mezcla de dos o mas polipeptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoacido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresados por el mismo polinucleotido. El polipeptido maduro se describe en este documento como SEQ ID n°: 3.

[0040] Secuencia codificante de polipeptido maduro: el termino "Secuencia codificante de polipeptido maduro" significa un polinucleotido que codifica un polipeptido maduro que tiene actividad de xilanasa. En un aspecto, la secuencia codificante de polipeptido maduro es los nucleotidos 58 a 1194 de la SEQ ID n° 1. Los nucleotidos 1 a 57 de la SEQ ID n°1 codifican un peptico senal.

[0041] Condiciones de astringencia media: el termino "Condiciones de astringencia media" significa, para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 35%, siguiendo procedimientos Southern blot estandar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 55°C.

[0042] Condiciones de astringencia media-alta: el termino "condiciones de astringencia media-alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 35%, siguiendo procedimientos Southern blot estandar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando 2X SSC, SDS al 0,2% a 60°C.

[0043] Mutante: el termino "mutante" significa un polinucleotido que codifica una variante.

[0044] Construccion de acido nucleico: el termino "construccion de acido nucleico" significa una molecula de acido nucleico, o bien mono o bicatenaria, que se ha aislado de un gen de origen natural o que se ha modificado para contener segmentos de acidos nucleicos de una manera que no existiria de otro modo en la naturaleza o que es sintetica, que comprende una o mas secuencias de control.

[0045] Operativamente enlazado: el termino "operativamente enlazado" significa una configuracion en la que una secuencia de control esta situada en una posicion apropiada respecto a la secuencia codificante de un polinucleotido de modo que la secuencia de control dirige la expresion de la secuencia codificante.

[0046] Progenitor o glucoamilasa progenitora: el termino "progenitor" o "glucoamilasa progenitora" significa una glucoamilasa a la que se realiza una alteracion para producir las variantes enzimaticas de la presente invencion. El progenitor puede ser un polipeptido (de tipo salvaje) de origen natural o una variante o fragmento del mismo.

[0047] Identidad de secuencia: la relacion entre dos secuencias de aminoacidos o entre dos secuencias de nucleotidos se describe por el parametro "identidad de secuencia".

[0048] Para los fines de la presente invencion, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoacidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como esta implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la version 5.0.0 o posterior. Los parametros usados son penalizacion por apertura de espacio de 10, penalizacion por extension de espacio de 0,5, y la matriz de sustitucion EBLOSUM62 (version de Em BOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado "longest identity" (identidad mas larga) (obtenido utilizando la opcion -nobrief) se usa como la identidad porcentual y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos identicos x 100)/(Longitud de alineamiento - Numero total de espacios en alineamiento)

[0049] Para los fines de la presente invencion, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleotidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como esta implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente la version 5.0.0 o posterior. Los parametros usados son penalizacion por apertura de espacio de 10, penalizacion por extension de espacio de 0,5, y la matriz de sustitucion EDNAFULL (version de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado "longest identity" (identidad mas larga) (obtenido utilizando la opcion -nobrief) se usa como la identidad porcentual y se calcula de la siguiente manera:

(Desoxirribonucleotidos identicos x 100)/(Longitud de alineamiento - Numero total de espacios en alineamiento)

[0050] Subsecuencia: el termino "subsecuencia" significa un polinucleotido con uno o mas (por ejemplo, varios) nucleotidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante de polipeptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad de xilanasa.

[0051] Variante: El termino "variante" significa un polipeptido que tiene actividad de xilanasa que comprende una alteracion, es decir, una sustitucion, insercion y/o delecion, en una o mas (p.ej., varias) posiciones. Una sustitucion significa el reemplazo del aminoacido que ocupa una posicion con un aminoacido diferente; una delecion significa la delecion del aminoacido que ocupa una posicion; y una insercion significa agregar un aminoacido adyacente e inmediatamente despues del aminoacido que ocupa una posicion.

[0052] Condiciones de astringencia muy alta: el termino "condiciones de astringencia muy alta" significa, para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN esperma de salmon fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 50%, siguiendo procedimientos Southern blot estandar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 70°C.

[0053] Condiciones de astringencia muy baja: el termino "condiciones de astringencia muy baja" significa, para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en SSPE 5x , SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon fragmentado y desnaturalizado, y formamida al 25%, siguiendo procedimientos Southern blot estandar durante 12 a 24 horas. El material portador finalmente se lava tres veces, cada una durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 45°C.

[0054] Xilanasa de tipo salvaje: El termino xilanasa "de tipo salvaje" significa una xilanasa expresada por un microorganismo natural, como una bacteria, levadura o hongo filamentoso que se encuentra en la naturaleza.

Convenciones para la designacion de variantes

[0055] Para los fines de la presente invencion, el polipeptido maduro descrito en la SEQ ID N°: 3 se usa para determinar el residuo de aminoacido correspondiente en otra xilanasa. La secuencia de aminoacidos de otra xilanasa se alinea con el polipeptido maduro descrito en la SEQ ID n°: 3 y, en funcion del alineamiento, el numero de posicion del aminoacido correspondiente a cualquier residuo de aminoacido en el polipeptido maduro descrito en la SEQ ID n°: 3 es determinado utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) segun esta implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la version 5.0.0 o posterior. Los parametros utilizados son la penalizacion por apertura de espacio de 10, la penalizacion por extension de espacio de 0,5 y la matriz de sustitucion EBLOSUM62 (version de EMBOSS de BLOSUM62).

[0056] La identificacion del residuo de aminoacido correspondiente en otra xilanasa se puede determinar mediante un alineamiento de multiples secuencias polipeptidicas usando varios programas informaticos que incluyen, pero no se limitan a, MUSCLE (comparacion de multiples secuencias por log-expectativa; version 3.5 o posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (version 6.857 o posterior; Katoh y Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518.; Katoh y Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: _39-64.; Katoh y Toh, 2010, Bioinformatics 26: _1899-1900), y EMBOSS EMMA empleando ClustalW (1.83 o posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), utilizando sus respectivos parametros por defecto.

[0057] Cuando la otra enzima se ha diferenciado del polipeptido maduro descrito en la SEQ ID n°: 3, de modo que la comparacion tradicional basada en secuencias no detecta su relacion (Lindahl y Elofsson, 2000, J. Mol. Biol.

295: 613-615), se pueden usar otros algoritmos de comparacion de secuencias por pares. Se puede lograr una mayor sensibilidad en la busqueda basada en secuencias utilizando programas de busqueda que utilizan representaciones probabilisticas de familias de polipeptidos (perfiles) para buscar en las bases de datos. Por ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a traves de un proceso de busqueda de base de datos iterativo y es capaz de detectar homologos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Incluso se puede lograr una mayor sensibilidad si la familia o la superfamilia del polipeptido tiene uno o mas representantes en las bases de datos de estructuras de proteinas. Programas como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol.

287: 797-815; McGuffin y Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan informacion de una variedad de fuentes (PSI-BLAST, prediccion de estructuras secundarias, perfiles de alineamiento estructural y potenciales de solvatacion) como entrada a una red neuronal que predice el plegamiento estructural para una secuencia de consulta. Del mismo modo, el metodo de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, se puede usar para alinear una secuencia de estructura desconocida con los modelos de superfamilias presentes en la base de datos SCOP. Estos alineamientos se pueden usar a su vez para generar modelos de homologia para el polipeptido, y se puede evaluar la precision de dichos modelos utilizando una variedad de herramientas desarrolladas para ese proposito.

[0058] Para protemas de estructura conocida, estan disponibles varias herramientas y recursos para recuperar y generar alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias de protemas SCOP han sido alineadas estructuralmente, y esas alineaciones son accesibles y descargables. Se pueden alinear dos o mas estructuras de protemas utilizando una variedad de algoritmos, como la matriz de alineamiento de distancias (Holm y Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o extension combinatoria (Shindyalov y Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y la implementacion de estos algoritmos se puede utilizar adicionalmente para consultar bases de datos de estructuras con una estructura de interes con el fin de descubrir posibles homologos estructurales (por ejemplo, Holm y Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[0059] Al describir las variantes de la presente invencion, la nomenclatura que se describe a continuacion se adapta para facilitar la referencia. Se emplea la abreviatura aceptada por la IUPAC de una sola letra o de tres letras de aminoacidos.

[0060] Sustituciones. Para una sustitucion de aminoacidos, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoacido original, posicion, aminoacido sustituido. Por consiguiente, la sustitucion de treonina en la posicion 226 con alanina se designa como "Thr226Ala" o "T226A". Las mutaciones multiples estan separadas por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg Ser411Phe" o "G205R S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) con arginina (R) y serina (S) con fenilalanina (F), respectivamente.

[0061] Deleciones. Para una delecion de aminoacidos, se utiliza la siguiente nomenclatura: Aminoacido original, posicion, *. Por consiguiente, la eliminacion de glicina en la posicion 195 se designa como "Gly195*" o "G195*". Las deleciones multiples estan separadas por signos de suma ("+"), p.ej., "Gly195* Ser411*" o "G195* S411*".

[0062] Inserciones. Para una insercion de aminoacidos, se utiliza la siguiente nomenclatura: aminoacido original, posicion, aminoacido original, aminoacido insertado. Por consiguiente, la insercion de lisina despues de glicina en la posicion 195 se designa "Gly195GlyLys" o "G195GK". Una insercion de multiples aminoacidos se denomina [aminoacido original, posicion, aminoacido original, aminoacido insertado #1, aminoacido insertado #2; etc.]. Por ejemplo, la insercion de lisina y alanina despues de glicina en la posicion 195 se indica como "Gly195GlyLysAla" o "G195GKA".

[0063] En tales casos, el/los residuo(s) de aminoacidos insertado(s) se numera(n) mediante la adicion de letras minusculas al numero de posicion del residuo de aminoacidos que precede al/los residuo(s) de aminoacidos insertado(s). En el ejemplo anterior, la secuencia seria asi:

[0064] Multiples alteraciones. Las variantes que comprenden multiples alteraciones estan separadas por signos de suma ("+"), por ejemplo, "Arg170Tyr Gly195Glu" o "R170Y G195E" que representan una sustitucion de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195 con tirosina y acido glutamico, respectivamente.

[0065] Diferentes alteraciones. Cuando se pueden introducir diferentes alteraciones en una posicion, las diferentes alteraciones se separan mediante una coma, por ejemplo, "Arg170Tyr,Glu" representa una sustitucion de arginina en la posicion 170 con tirosina o acido glutamico. Por lo tanto, "Tyr167Gly,Ala Arg170Gly,Ala" designa las siguientes variantes:

"Tyr167Gly Arg170Gly", "Tyr167Gly Arg170Ala", "Tyr167Ala Arg170Gly", y "Tyr167Ala Arg170Ala".

Descripcion detallada de la invencion

[0066] La presente invencion se refiere a una variante de xilanasa, que comprende una sustitucion al menos en una posicion correspondiente a la posicion 87 del polipeptido de la SEQ ID n°: 3, en la que la variante tiene actividad de xilanasa y tiene una tolerancia incrementada a inhibidores de xilanasa en comparacion con la xilanasa de la SEQ ID n° 3; y en el que la variante tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con la polipeptido de la SEQ ID n°: 3; y en donde la sustitucion es H87Y.

La SEQ ID n°: 3 es el polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 2. Los numeros de posicion a los que se hace referencia en este documento corresponden a los numeros de posicion de la SEQ ID n°: 3.

Variantes

[0067] La presente invencion proporciona variantes de xilanasa, que comprenden una alteracion, en particular una sustitucion, al menos en una posicion correspondiente a la posicion 87 de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene actividad de xilanasa.

[0068] En una realizacion, la variante esta aislada.

[0069] En una realizacion, la alteracion es una sustitucion. Mas particularmente, el aminoacido presente en una posicion correspondiente a la posicion 87 esta sustituido con Tyr (Y). En una realizacion, las sustituciones son H87Y.

[0070] Las variantes de xilanasa de la invencion tienen propiedades mejoradas en comparacion con la enzima progenitora. En particular, las variantes tienen un aumento de la tolerancia a inhibidores de xilanasa sobre la enzima progenitora. Se ha demostrado en este caso que la sustitucion especifica aumenta la tolerancia a inhibidores de xilanasa de la variante xilanasa en comparacion con la xilanasa de la SEQ ID n°: 3.

[0071] En una realizacion particular, el inhibidor de xilanasa son proteinas inhibidoras, particularmente proteinas presentes en granos de cereales. En una realizacion, el grano de cereal es trigo.

[0072] Mas particularmente, las proteinas inhibidoras se seleccionan de un grupo que comprende proteina inhibidora de la xilanasa (XIP), inhibidor de xilanasa de T. aestivum (TAXI) e inhibidor de xilanasa de tipo taumatina (TLXI). Los inhibidores proteicos de las xilanasas que se encuentran en cereales distintos del trigo son similares en estructura y propiedades a XIP y a TAXI del trigo y se denominan proteinas de tipo XIP y tipo TAXI. XIP comprende un grupo de proteinas homologas codificadas por diferentes genes, entre las que XIP-I es la mas abundante. De manera similar, TAXI no es una unica proteina, sino que comprende dos proteinas, TAXI-I y TAXI-II. Ademas, los inhibidores TAXI y de tipo TAXI tienen cada uno dos isoformas que resultan del procesamiento proteolitico de la proteina madura. Se les conoce como TAXI-IA, TAXI-IB, TAXI-IIA y TAXI-IIB. Aun mas particularmente, las proteinas inhibidoras se seleccionan de un grupo que comprende XIP-I, TAXI-IA, TAXI-IB, TAXI-IIA, TAXI-IIB y TLXI de trigo y sus homologas en otros cereales.

[0073] Asi, en un aspecto, la presente invencion se refiere a una variante de xilanasa, que comprende al menos una sustitucion en una posicion correspondiente a la posicion 87 del polipeptido de la SEQ ID n°: 3, en la que la variante tiene actividad de xilanasa y en la que la variante tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y donde que la variante tiene tolerancia aumentada a inhibidores de xilanasa.

[0074] En un aspecto, el numero de alteraciones en las variantes de la presente invencion es de 1-20, por ejemplo, 1-10 y 1-5, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 alteraciones. En otro aspecto, la variante consiste en una sustitucion en la posicion correspondiente a la posicion 87 de la SEQ ID n°: 3, particularmente 87Y.

[0075] En otro aspecto, la alteracion en la variante comprende o consiste en una sustitucion en una posicion correspondiente a la posicion 87. En otro aspecto, el aminoacido en una posicion correspondiente a la posicion 87 esta sustituido con Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val, preferiblemente con Tyr. En otro aspecto, la alteracion variante comprende o consiste en la sustitucion H87Y del polipeptido de la SEQ ID n°: 3.

[0076] Las variantes pueden comprender ademas una o mas alteraciones adicionales en una o mas (por ejemplo, varias) posiciones adicionales.

[0077] Cabe senalar que, para todas las variantes especificas descritas, tal variacion adicional podria introducirse sin afectar significativamente a las propiedades de las variantes de xilanasa. En un aspecto, el numero de sustituciones en las variantes de la presente invencion ademas de las sustituciones especificas mencionadas en este documento es de 1 -20, por ejemplo, 1-10 y 1-5, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones.

[0078] Por lo tanto, el % de identidad del polipeptido variante comparado con el polipeptido progenitor de la SEQ ID n°: 3 puede ser al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94% , al menos el 95%, tal como al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3.

[0079] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa, y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 85%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0080] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa, y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 90%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0081] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa, y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos un 91%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0082] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa, y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 92%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0083] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 93%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0084] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa, y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 94%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0085] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 95%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0086] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 96%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0087] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa, y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 97%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0088] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa, y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 98%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0089] En una realizacion particular, las variantes tienen actividad de xilanasa, y comprenden la sustitucion H87Y, y la variante tiene al menos el 99%, pero menos del 100%, de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3, y en la que la variante tiene al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, incluso mas preferiblemente al menos el 90%, de la manera mas preferible al menos el 95%, e incluso mas preferiblemente al menos el 100% de la actividad de xilanasa del polipeptido de la SEQ ID n°: 3 que comprende la sustitucion H87Y.

[0090] Los cambios en los aminoacidos pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoacidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteina; pequenas deleciones, tfpicamente de 1-30 aminoacidos; pequenas extensiones amino o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal; un peptido enlazador pequeno de hasta 20-25 residuos; o una pequena extension que facilita la purificacion cambiando la carga neta u otra funcion, como una cola de polihistidina, un epttopo antigenico o un dominio de union.

[0091] Los ejemplos de sustituciones conservadoras estan dentro de los grupos de aminoacidos basicos (arginina, lisina e histidina), aminoacidos acidos (acido glutamico y acido aspartico), aminoacidos polares (glutamina y asparagina), aminoacidos hidrofobos (leucina, isoleucina y valina), aminoacidos aromaticos (fenilalanina, triptofano y tirosina), y aminoacidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoacidos que generalmente no alteran la actividad especifica son conocidas en la tecnica y estan descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, Nueva York. Las sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

[0092] Alternativamente, los cambios de aminoacidos son de tal naturaleza que se alteran las propiedades fisicoqwmicas de los polipeptidos. Por ejemplo, los cambios de aminoacidos pueden mejorar la estabilidad termica del polipeptido, alterar la especificidad del sustrato, cambiar el pH optimo y similares.

[0093] Los aminoacidos esenciales en un polipeptido pueden identificarse de acuerdo con los procedimientos conocidos en la tecnica, como la mutagenesis dirigida o la mutagenesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta ultima tecnica, se introducen mutaciones unicas de alanina en cada residuo de la molecula, y las moleculas mutantes resultantes se analizan para determinar la actividad de xilanasa para identificar residuos de aminoacidos que son fundamentales para la actividad de molecula. Vease tambien Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interaccion biologica tambien se puede determinar por analisis fisico de la estructura, segun lo determinado por tecnicas tales como resonancia magnetica nuclear, cristalografia, difraccion de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutacion de los aminoacidos del sitio de contacto putativo. Vease, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoacidos esenciales tambien se puede inferir de un alineamiento con un polipeptido relacionado.

[0094] En una realizacion, la variante tiene una tolerancia aumentada a inhibidores de xilanasa en comparacion con la enzima progenitora.

[0095] En una realizacion particular, la variante de xilanasa de la invencion tiene un aumento en la actividad relativa de la xilanasa sobre la xilanasa de tipo salvaje de al menos un factor 7x, particularmente 8x, particularmente 8,5x, mas particularmente 9x, en presencia de inhibidores de xilanasa de trigo, particularmente XIP-1, en cantidades que reduciran la actividad de la xilanasa de tipo salvaje a menos del 10%.

Xilanasa progenitora

[0096] La xilanasa progenitora puede ser (a) un polipeptido que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con el polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 2; (b) un polipeptido codificado por un polinucleotido que se hibrida en condiciones de astringencia media-alta con (i) la secuencia codificante del polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 1, o (ii) el complemento de longitud completa de (i); o (c) un polipeptido codificado por un polinucleotido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 1.

[0097] En un aspecto, el progenitor tiene una identidad de secuencia con el polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 2 de al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94% , al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100%, que tiene actividad de xilanasa. En un aspecto, la secuencia de aminoacidos del progenitor difiere en hasta 10 aminoacidos, p.ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, del polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 2.

[0098] En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID n°: 2. En otro aspecto, el progenitor comprende o consiste en el polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 3.

[0099] En otra realizacion, el progenitor es una variante alelica del polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 2.

[0100] En otro aspecto, el progenitor esta codificado por un polinucleotido que se hibrida en condiciones de alta astringencia, o condiciones de muy alta astringencia con (i) la secuencia codificante del polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 1, (ii) el complemento de longitud completa de (i ) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor, Nueva York).

[0101] El polinucleotido de la SEQ ID n°: 1 o una subsecuencia de la misma, asi como el polipeptido de la SEQ ID n°: 2 o un fragmento de la misma, pueden usarse para disenar sondas de acido nucleico para identificar y clonar el ADN que codifica un progenitor de cepas de diferentes generos o especies segun metodos ampliamente conocidos en la tecnica. En particular, tales sondas se pueden usar para la hibridacion con el ADN genomico o el ADNc de una celula de interes, siguiendo procedimientos de Southern blot estandar, para identificar y aislar el gen correspondiente. Dichas sondas pueden ser considerablemente mas cortas que la secuencia completa, pero deberian tener al menos 15, por ejemplo, al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleotidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de acido nucleico tiene una longitud de al menos 100 nucleotidos, por ejemplo, al menos 200 nucleotidos, al menos 300 nucleotidos, al menos 400 nucleotidos, al menos 500 nucleotidos, al menos 600 nucleotidos, al menos 700 nucleotidos, al menos 800 nucleotidos, o al menos 900 nucleotidos de longitud. Se pueden usar tanto sondas de ADN como de ARN. Las sondas suelen estar marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H 35S, biotina o avidina). Tales sondas estan abarcadas por la presente invencion.

[0102] Una biblioteca de ADNc o ADN genomico preparada a partir de tales otras cepas puede rastrearse en busca de ADN que se hibrida con las sondas descritas anteriormente y codifica un progenitor. El ADN genomico o de otro tipo de otras cepas puede separarse mediante electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida u otras tecnicas de separacion. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado puede transferirse e inmovilizarse en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Con el fin de identificar un clon o ADN que se hibrida con la SEQ ID n°: 1 o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en un Southern blot.

[0103] Para los fines de la presente invencion, la hibridacion indica que el polinucleotido se hibrida a una sonda de acido nucleico marcada correspondiente a (i) la SEQ ID n°: 1; (ii) la secuencia codificante del polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 1; (iii) su complemento integral; o (iv) una subsecuencia de la misma; en condiciones de astringencia muy baja a muy alta. Las moleculas con las que se hibrida la sonda de acido nucleico en estas condiciones pueden detectarse utilizando, por ejemplo, una pelicula radiografica o cualquier otro medio de deteccion conocido en la tecnica.

[0104] En otra realizacion, el progenitor esta codificado por un polinucleotido que tiene una identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipeptido maduro de la SEQ ID n°: 1 de al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%.

[0105] El polipeptido puede ser un polipeptido hibrido en el que una region de un polipeptido se fusiona en el extremo N o el extremo C terminal de una region de otro polipeptido.

[0106] El progenitor puede ser un polipeptido de fusion o un polipeptido de fusion escindible en el que otro polipeptido esta fusionado en el extremo N o el extremo C terminal del polipeptido de la presente invencion. Un polipeptido de fusion se produce fusionando un polinucleotido que codifica otro polipeptido a un polinucleotido de la presente invencion. Las tecnicas para producir polipeptidos de fusion son conocidas en la tecnica, e incluyen la union de las secuencias codificantes que codifican los polipeptidos para que esten dentro del marco y para que la expresion del polipeptido de fusion este bajo el control del/de los mismo(s) promotor(es) y terminador. Los polipeptidos de fusion tambien pueden construirse usando tecnologia de inteina en la que los polipeptidos de fusion se crean despues de la traduccion (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0107] Un polipeptido de fusion puede comprender ademas un sitio de escision entre los dos polipeptidos. Tras la secrecion de la proteina de fusion, el sitio se escinde liberando los dos polipeptidos. Los ejemplos de sitios de escision incluyen, entre otros, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotecnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al, 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488 3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381.; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512.; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[0108] En un aspecto, el progenitor es una xilanasa de Aspergillus, por ejemplo, la xilanasa de la SEQ ID n°: 2 o el polipeptido maduro de la misma.

Preparación de Variantes

[0109] Las variantes pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento de mutagenesis conocido en la tecnica, como mutagenesis dirigida, construccion de genes sinteticos, construccion de genes semisinteticos, mutagenesis aleatoria, barajado, etc.

[0110] La mutagenesis dirigida es una tecnica en la que una o mas mutaciones (por ejemplo, varias) se introducen en uno o mas sitios definidos en un polinucleotido que codifica el progenitor.

[0111] La mutagenesis dirigida se puede lograr in vitro por PCR, lo que implica el uso de cebadores oligonucleotidicos que contienen la mutacion deseada. Tambien se puede realizar mutagenesis dirigida in vitro por mutagenesis de casete que conlleva la escision por una enzima de restriccion en un sitio en el plasmido que comprende un polinucleotido que codifica el progenitor y la posterior ligadura de un oligonucleotido que contiene la mutacion en el polinucleotido. Normalmente, la enzima de restriccion que digiere el plasmido y el oligonucleotido es la misma, lo que permite que los extremos pegajosos del plasmido y el inserto se unan entre si. Vease, por ejemplo, Scherer y Davis, 1979, Proc. Natl Acad Sci. EE. UU. 76: 4949-4955; y Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[0112] La mutagenesis dirigida tambien se puede lograr in vivo mediante metodos conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. n° 2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773 776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; y Calissano y Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[0113] Cualquier procedimiento de mutagenesis dirigida se puede usar en la presente invencion. Hay muchos kits comerciales disponibles que se pueden usar para preparar variantes.

[0114] La construccion de genes sinteticos conlleva la sintesis in vitro de una molecula polinucleotidica disenada para codificar un polipeptido de interes. La sintesis de genes se puede realizar utilizando varias tecnicas, como la tecnologia multiplex basada en microchip descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) y tecnologias similares en las que los oligonucleotidos se sintetizan y ensamblan sobre chips microfluidicos fotoprogramables.

[0115] Se pueden realizar y probar sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoacidos simples o multiples utilizando metodos conocidos de mutagenesis, recombinacion y/o barajado, seguidos de un procedimiento de seleccion relevante, como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl Acad Sci. EE. UU. 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros metodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a error, presentacion de fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente de EE. UU. n° 5,223,409; WO 92/06204) y mutagenesis dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0116] Los metodos de mutagenesis/barajado pueden combinarse con metodos de seleccion automatizada de alto rendimiento para detectar la actividad de polipeptidos mutagenizados clonados expresados por las celulas hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moleculas de ADN mutagenizadas que codifican polipeptidos activos pueden recuperarse de las celulas hospedadoras y secuenciarse rapidamente usando metodos estandar en la tecnica. Estos metodos permiten la rapida determinacion de la importancia de los residuos de aminoacidos individuales en un polipeptido.

[0117] La construccion de genes semisinteticos se logra combinando aspectos de la construccion de genes sinteticos, y/o mutagenesis dirigida, y/o mutagenesis aleatoria, y/o barajado. La construccion semisintetica se caracteriza por un proceso que utiliza fragmentos de polinucleotidos que se sintetizan, en combinacion con tecnicas de PCR. Se pueden sintetizar regiones definidas de genes de novo, mientras que otras regiones pueden amplificarse utilizando cebadores mutagenicos especificos, mientras que otras regiones pueden someterse a una amplificacion por PCR propensa a error o por PCR no propensa a error. Las subsecuencias polinucleotidicas pueden entonces barajarse.

Polinucleotidos

[0118] La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos que codifican una variante de la presente invencion.

Construcciones de acido nucleico

[0119] La presente invencion tambien se refiere a construcciones de acido nucleico que comprenden un polinucleotido que codifica una variante de la presente invencion unido operativamente a una o mas secuencias de control que dirigen la expresion de la secuencia de codificacion en una celula hospedadora adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control.

[0120] El polinucleotido puede manipularse de diversas maneras para proporcionar la expresion de una variante. La manipulacion del polinucleotido antes de su insercion en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresion. Las tecnicas para modificar polinucleotidos utilizando metodos de ADN recombinante son ampliamente conocidas en la tecnica.

[0121] La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleotido que es reconocido por una celula hospedadora para la expresion del polinucleotido. El promotor contiene secuencias de control transcripcional que median la expresion de la variante. El promotor puede ser cualquier polinucleotido que muestre actividad transcripcional en la celula hospedadora, incluidos los promotores mutantes, truncados e hibridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipeptidos extracelulares o intracelulares, ya sea homologos o heterologos a la celula hospedadora.

[0122] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripcion de las construcciones de acido nucleico de la presente invencion en una celula hospedadora bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen de penicilinasa (PenP) de Bacillus licheniformis, el gen de amilasa maltogenica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, el gen de levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), el operon lac de E. Coli, el promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, y el gen de betalactamasa procariotica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl Acad Sci. EE. UU. 75: 3727-3731), asi como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl Acad Sci. EE. UU. 80: 21-25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al. 1989, supra. Ejemplos de promotores en tandem se describen en WO 99/43835.

[0123] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripcion de las construcciones de acido nucleico de la presente invencion en una celula hospedadora fungica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable al acido de Aspergillus niger, glucoamilasa( glaA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamori, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum ( WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, asi como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de alfa-amilasa neutral de Aspergillus en el que el lider no traducido ha sido reemplazado por un lider no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutral de Aspergillus niger en el que el lider no traducido ha sido reemplazado por un lider no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e hibridos de los mismos.

[0124] En un hospedador de levadura, se obtienen promotores utiles de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneina (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores utiles para celulas hospedadoras de levadura estan descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0125] La secuencia de control tambien puede ser un terminador de transcripcion, que es reconocido por una celula hospedadora para terminar la transcripcion. La secuencia del terminador esta unida operativamente al extremo 3' terminal del polinucleotido que codifica la variante. Se puede usar cualquier terminador que sea funcional en la celula hospedadora.

[0126] Los terminadores preferidos para celulas hospedadoras bacterianas se obtienen de los genes para proteasa alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, y ARN ribosomico (rrnB) de Escherichia coli.

[0127] Los terminadores preferidos para celulas hospedadoras fungicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0128] Los terminadores preferidos para celulas hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores utiles para celulas hospedadoras de levadura son descritos por Romanos et al. 1992, supra.

[0129] La secuencia de control tambien puede ser una region estabilizadora de ARNm en direccion hacia 3' respecto de un promotor y en direccion hacia 5' de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresion del gen.

[0130] Ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas se obtienen de un gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[0131] La secuencia de control tambien puede ser una lider, una region no traducida de un ARNm que es importante para la traduccion por la celula hospedadora. La secuencia Hder esta unida operativamente al extremo 5' del polinucleotido que codifica la variante. Se puede usar cualquier lider que sea funcional en la celula hospedadora.

[0132] Los lideres preferidos para las celulas hospedadoras fungicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.

[0133] Los lideres adecuados para celulas hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (En O-1), 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[0134] La secuencia de control tambien puede ser una secuencia de poliadenilacion, una secuencia operativamente unida al extremo 3' terminal de la secuencia codificante de la variante y, cuando se transcribe, es reconocida por la celula hospedadora como una senal para agregar residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Se puede usar cualquier secuencia de poliadenilacion que sea funcional en la celula hospedadora.

[0135] Las secuencias de poliadenilacion preferidas para celulas hospedadoras fungicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0136] Secuencias de poliadenilacion utiles para celulas hospedadoras de levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol. Biol celular. 15: 5983-5990.

[0137] La secuencia de control tambien puede ser una region de codificacion de peptido senal que codifica un peptido senal enlazado al extremo N terminal de una variante y dirige la variante a la via secretora de la celula. El extremo 5' de la secuencia de codificacion del polinucleotido puede contener inherentemente una secuencia de codificacion de peptido senal enlazada naturalmente en el marco de lectura de traduccion con el segmento de la secuencia de codificacion que codifica la variante. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia de codificacion puede contener una secuencia de codificacion de peptido senal que es ajena a la secuencia de codificacion. Puede requerirse una secuencia de codificacion de peptido senal extrana cuando la secuencia de codificacion no contiene naturalmente una secuencia de codificacion de peptido senal. Alternativamente, una secuencia de codificacion de peptido senal extrana puede simplemente reemplazar la secuencia de codificacion de peptido senal natural para aumentar la secrecion de la variante. Sin embargo, se puede usar cualquier secuencia codificante de peptido senal que dirija la variante expresada hacia la via secretora de una celula hospedadora.

[0138] Las secuencias codificantes de peptidos senal eficaces para celulas hospedadoras bacterianas son las secuencias codificantes de peptidos senal obtenidas de los genes para amilasa maltogenica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, betalactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, y prsA de Bacillus subtilis. Otros peptidos senal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiology Reviews 57: 109-137.

[0139] Las secuencias codificantes de peptidos senal eficaces para celulas hospedadoras fungicas filamentosas son las secuencias codificadoras de peptidos senal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa, y proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei.

[0140] Los peptidos senal utiles para celulas hospedadoras de levadura se obtienen de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes de peptidos senal utiles estan descritas por Romanos et al. 1992, supra.

[0141] La secuencia de control tambien puede ser una secuencia codificante de un propeptido que codifica un propeptido situado en el extremo N terminal de una variante. El polipeptido resultante se conoce como proenzima o propolipeptido (o zimogeno en algunos casos). Un propolipeptido es generalmente inactivo y se puede convertir en un polipeptido activo por escision catalitica o autocatalitica del propeptido a partir del propolipeptido. La secuencia codificante del propeptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, proteasa neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacasa de Myceliophthora thermophila (w O 95/33836), proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei, y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0142] Cuando las secuencias tanto del peptido senal como del propeptido estan presentes, la secuencia del propeptido se coloca junto al extremo N terminal de la variante y la secuencia del peptido de senal se coloca junto al extremo N terminal de la secuencia del propeptido.

[0143] Tambien puede ser deseable anadir secuencias reguladoras que regulen la expresion de la variante en relacion con el crecimiento de la celula hospedadora. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan que la expresion del gen se active o desactive en respuesta a un estimulo quimico o fisico, incluida la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procarioticos incluyen los sistemas de operones lac, tac y trp. En el caso de levaduras, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En los hongos filamentosos, se pueden usar el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae, y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten la amplificacion de genes. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneina que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleotido que codifica la variante estaria unido operativamente con la secuencia reguladora.

Vectores de expresion

[0144] La presente invencion tambien se refiere a vectores de expresion recombinantes que comprenden un polinucleotido que codifica una variante de la presente invencion, un promotor y senales de parada transcripcional y traduccional. Las diversas secuencias de nucleotidos y control pueden unirse para producir un vector de expresion recombinante que puede incluir uno o mas sitios de restriccion convenientes para permitir la insercion o sustitucion del polinucleotido que codifica la variante en dichos sitios. Alternativamente, el polinucleotido puede expresarse insertando el polinucleotido o una construccion de acido nucleico que comprende el polinucleotido en un vector apropiado para la expresion. Al crear el vector de expresion, la secuencia codificante se ubica en el vector de modo que la secuencia codificante este unida operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresion.

[0145] El vector de expresion recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plasmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresion del polinucleotido. La eleccion del vector dependera tipicamente de la compatibilidad del vector con la celula hospedadora en la que se va a introducir el vector. El vector puede ser un plasmido lineal o circular cerrado.

[0146] El vector puede ser un vector de replicacion autonoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomica, cuya replicacion es independiente de la replicacion cromosomica, por ejemplo, un plasmido, un elemento extracromosomico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicacion. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la celula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el/los cromosoma(s) en el/los que se ha integrado. Ademas, se puede usar un solo vector o plasmido o dos o mas vectores o plasmidos que, juntos, contienen el ADN total que se introducira en el genoma de la celula hospedadora, o un transposon.

[0147] El vector contiene preferiblemente uno o mas marcadores seleccionables que permiten una facil seleccion de celulas transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o resistencia viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxotrofos y similares.

[0148] Ejemplos de marcadores bacterianos seleccionables son los genes dal de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia a los antibioticos como ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina, espectinomicina o resistencia a la tetraciclina. Los marcadores adecuados para celulas hospedadoras de levadura incluyen, pero no se limitan a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Los marcadores seleccionables para su uso en una celula hospedadora fungica filamentosa incluyen, entre otros, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), asi como sus equivalentes. Para su uso en una celula de Aspergillus se prefieren los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus.

[0149] El vector contiene preferiblemente un elemento(s) que permite(n) la integracion del vector en el genoma de la celula hospedadora o la replicacion autonoma del vector en la celula independiente del genoma.

[0150] Para la integracion en el genoma de la celula hospedadora, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleotido que codifica la variante o cualquier otro elemento del vector para la integracion en el genoma por recombinacion homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener polinucleotidos adicionales para dirigir la integracion por recombinacion homologa en el genoma de la celula hospedadora en una(s) ubicacion(es) precisa(s) en el/los cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integracion en una ubicacion precisa, los elementos de integracion deben contener un numero suficiente de acidos nucleicos, como de 100 a 10000 pares de bases, de 400 a 10000 pares de bases y de 800 a 10000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de la secuencia con la secuencia deseada correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinacion homologa. Los elementos de integracion pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia deseada en el genoma de la celula hospedadora. Ademas, los elementos de integracion pueden ser polinucleotidos no codificantes o codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la celula hospedadora mediante recombinacion no homologa.

[0151] Para la replicacion autonoma, el vector puede comprender ademas un origen de replicacion que permita que el vector se replique de manera autonoma en la celula hospedadora en cuestion. El origen de replicacion puede ser cualquier replicador de plasmido que medie la replicacion autonoma que funciona en una celula. El termino "origen de replicacion" o "replicador de plasmido" significa un polinucleotido que permite que un plasmido o vector se replique in vivo.

[0152] Ejemplos de origenes de replicacion bacterianos son los origenes de replicacion de los plasmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicacion en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMpi, que permiten la replicacion en Bacillus.

[0153] Ejemplos de origenes de replicacion para su uso en una celula hospedadora de levadura son el origen de replicacion de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinacion de ARS1 y CEN3, y la combinacion de ARS4 y CEN6.

[0154] Ejemplos de origenes de replicacion utiles en una celula fungica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67.; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construccion de plasmidos o vectores que comprenden el gen se puede lograr de acuerdo con los metodos descritos en WO 00/24883.

[0155] Mas de una copia de un polinucleotido de la presente invencion puede insertarse en una celula hospedadora para aumentar la produccion de una variante. Se puede obtener un aumento en el numero de copias del polinucleotido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la celula hospedadora o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleotido, donde las celulas que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, por lo tanto, copias adicionales del polinucleotido, se pueden seleccionar cultivando las celulas en presencia del agente seleccionable apropiado.

[0156] Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresion recombinantes de la presente invencion son ampliamente conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook). et al., 1989, supra).

Celulas hospedadoras

[0157] La presente invencion tambien se refiere a celulas hospedadoras recombinantes, que comprenden un polinucleotido que codifica una variante de la presente invencion unido operativamente a una o mas secuencias de control que dirigen la produccion de una variante de la presente invencion. Una construccion o vector que comprende un polinucleotido se introduce en una celula hospedadora para que la construccion o vector se mantenga como un integrante cromosomico o como un vector extracromosomico autorreplicante como se ha descrito anteriormente. El termino "celula hospedadora" abarca cualquier progenie de una celula progenitora que no sea identica a la celula progenitora debido a las mutaciones que se producen durante la replicacion. La eleccion de una celula hospedadora dependera en gran medida del gen que codifique la variante y su fuente.

[0158] La celula hospedadora puede ser cualquier celula util en la produccion recombinante de una variante, por ejemplo, una procariota o una eucariota.

[0159] La celula hospedadora procariota puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa. Las bacterias grampositivas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, y Streptomyces. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero no se limitan a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, y Ureaplasma.

[0160] La celula hospedadora bacteriana puede ser cualquiera celula de Bacillus incluyendo, pero sin limitarse a, celulas de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmas, Bacillus Lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis.

[0161] La celula hospedadora bacteriana tambien puede ser cualquier celula de Streptococcus incluyendo, pero sin limitarse a, celulas de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, y Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0162] La celula hospedadora bacteriana tambien puede ser cualquier celula de Streptomyces, incluyendo, pero sin limitarse a, celulas de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.

[0163] La introduccion de ADN en una celula de bacillus puede efectuarse por transformacion de protoplastos (vease, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformacion celular competente (vease, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporacion (vease, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugacion (vease, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introduccion de ADN en una celula de E. coli puede efectuarse por transformacion de protoplastos (vease, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporacion (vease, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127 6145). La introduccion de ADN en una celula de Streptomyces puede efectuarse por transformacion de protoplastos, electroporacion (vease, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugacion (vease, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o transduccion (vease, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl Acad Sci. EE. UU. 98: 6289-6294). La introduccion de ADN en una celula de Pseudomonas puede efectuarse por electroporacion (vease, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Metodos 64: 391-397), o conjugacion (vease, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Reinar. Microbiol. 71: 51 57). La introduccion de ADN en una celula de Streptococcus puede ser efectuada por competencia natural (vease, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformacion de protoplastos (vease, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporacion (vease, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Reinar. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugacion (vease, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409 436). Sin embargo, se puede usar cualquier metodo conocido en la tecnica para introducir ADN en una celula hospedadora.

[0164] La celula hospedadora tambien puede ser una eucariota, como una celula de un mamifero, un insecto, una planta o un hongo.

[0165] La celula hospedadora puede ser una celula fungica. "Hongos", como se usa en el presente documento, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, asi como Oomycota y todos los hongos mitosporicos (como los define Hawksworth et al., en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edicion, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).

[0166] La celula hospedadora fungica puede ser una celula de levadura. "Levadura" como se usa en este documento incluye las levaduras ascosporogenas (Endomycetales), las levaduras basidiosporogenas y las levaduras pertenecientes a los hongos imperfectos (Blastomycetes). Dado que la clasificacion de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invencion, las levaduras se definiran como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0167] La celula hospedadora de levadura puede ser una celula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, como una celula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica.

[0168] La celula hospedadora fungica puede ser una celula fungica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivision Eumycota y Oomycota (como los define Hawksworth). et al. 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacaridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongacion de hifas y el catabolismo del carbono es necesariamente aerobico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras como Saccharomyces cerevisiae es por brote de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

[0169] La celula hospedadora fungica filamentosa puede ser una celula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.

[0170] Por ejemplo, la celula hospedadora fungica filamentosa puede ser una celula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

[0171] Las celulas fungicas pueden transformarse mediante un proceso que involucra la formacion de protoplastos, la transformacion de los protoplastos y la regeneracion de la pared celular de una manera conocida de por si. Procedimientos adecuados para la transformacion de celulas hospedadoras de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl Acad Sci. EE. UU. 81: 1470-1474 y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Metodos adecuados para la transformacion de especies de Fusarium se describen en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156y WO 96/00787. La levadura puede transformarse utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 75: 1920.

Metodos de produccion

[0172] La presente invencion tambien se refiere a metodos para producir una variante, que comprenden: (a) cultivar una celula hospedadora recombinante de la presente invencion en condiciones adecuadas para la expresion de la variante; y (b) recuperar la variante.

[0173] Las celulas hospedadoras se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la produccion de la variante utilizando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la celula se puede cultivar mediante cultivo en matraz agitado, o fermentacion a pequena o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lote, por lote alimentado o en estado solido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan expresar y/o aislar la variante. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrogeno y sales inorganicas, utilizando procedimientos conocidos en la tecnica. Los medios adecuados estan disponibles en proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con las composiciones publicadas (por ejemplo, en los catalogos de la American Type Culture Collection). Si la variante se secreta en el medio nutritivo, la variante se puede recuperar directamente del medio. Si la variante no se secreta, se puede recuperar de lisados celulares.

[0174] La variante puede detectarse utilizando metodos conocidos en la tecnica que son especificos para las variantes. Estos metodos de deteccion incluyen, entre otros, el uso de anticuerpos especificos, la formacion de un producto enzimatico o la desaparicion de un sustrato enzimatico. Por ejemplo, puede usarse un ensayo enzimatico para determinar la actividad de la variante.

[0175] La variante puede recuperarse usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la variante puede recuperarse del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales que incluyen, entre otros, recoleccion, centrifugacion, filtracion, extraccion, secado por pulverizacion, evaporacion o precipitacion.

[0176] La variante se puede purificar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica, que incluyen, entre otros, cromatografia (por ejemplo, de intercambio ionico, de afinidad, hidrofobica, cromatoenfoque y exclusion por tamano), procedimientos electroforeticos (por ejemplo, enfoque isoelectrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitacion con sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extraccion (vease, por ejemplo,Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener variantes sustancialmente puras.

[0177] En un aspecto alternativo, la variante no se recupera, sino que se utiliza como fuente de la variante una celula hospedadora de la presente invencion que expresa la variante. Por lo tanto, en un aspecto, la invencion se refiere a una formulacion de caldo completo o cultivo de celulas, que comprende la variante de la invencion.

Composiciones

[0178] La presente invencion tambien se refiere a composiciones que comprenden una variante de la presente invencion. Preferiblemente, las composiciones estan enriquecidas en tal variante. El termino "enriquecido" significa que la actividad de xilanasa de la composicion se ha incrementado, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de 1,1.

[0179] La composicion puede comprender una variante como el principal componente enzimatico, por ejemplo, una composicion mono-componente. Alternativamente, la composicion puede comprender multiples actividades enzimaticas, tales como una alfa-galactosidasa, alfa-glucosidasa, aminopeptidasa, alfa-amilasa, betagalactosidasa, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, mylchym, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, glucoamilasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolitica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolitica, ribonucleasa, transglutaminasa, u otra xilanasa.

[0180] En una realizacion particular, la composicion comprende la xilanasa de la invencion y una alfa-amilasa. Se prefieren las alfa-amilasas bacterianas, que normalmente son estables a las temperaturas utilizadas durante la licuefaccion. En una realizacion preferida, la alfa-amilasa se deriva de Bacillus stearothermophilus. La alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus puede ser una de tipo salvaje madura o una variante madura de la misma. Las alfaamilasas maduras de Bacillus stearothermophilus se pueden truncar naturalmente durante la produccion recombinante. Por ejemplo, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus se puede truncar de manera que tenga alrededor de 491 aminoacidos (en comparacion con la SEQ ID n°: 3 de WO 99/19467. Se prefieren las alfaamilasas de Bacillus, especialmente las alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus, que tienen una doble delecion correspondiente a una delecion de las posiciones 181 y 182 y ademas comprenden una sustitucion N193F (tambien denominada I181*+G182*+N193F) en comparacion con la secuencia de aminoacidos de alfa-amilasa BSG de tipo salvaje de la SEQ ID n°: 3 descrita en WO 99/19467. La alfa-amilasa bacteriana tambien puede tener una sustitucion en una posicion correspondiente a S239 en la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEQ ID N°: 4 de WO 99/19467, o una variante S242 de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus de la SEQ ID N°: 3 en WO 99/19467. En una realizacion preferida, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus:

I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E;

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S;

I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V; y I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S (usando la SEQ ID n°: 3 descrita en WO 99/19467 para la numeracion).

[0181] En otra realizacion particular, la composicion comprende la xilanasa de la invencion, una alfa amilasa y una proteasa termoestable. En una realizacion preferida, la proteasa termoestable es una variante de la metaloproteasa descrita como la parte madura de la SEQ ID n°: 2 descrita en WO 2003/048353 o la parte madura de la SEQ ID n°: 1 en WO 2010/008841 con las siguientes mutaciones:

D79L+S87P+A112P+D142L;

D79L+S87P+D142L; o

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[0182] En otra realizacion, la proteasa termoestable se deriva de una cepa de la bacteria Pirocoscus, como una cepa de Pyrococcus furiosus (proteasa pfu)

[0183] En una realizacion, la proteasa es la que se muestra como SEQ ID n°: 1 la patente de EE. UU. 6,358,726-B1.

[0184] En otra realizacion particular, la composicion comprende la xilanasa de la invencion, una alfa amilasa, una proteasa termoestable y una glucoamilasa termoestable. En una realizacion especifica, la glucoamilasa termoestable es de una cepa del genero Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum, en particular la glucoamilasa de Penicillium oxalicum divulgada como la SEQ ID n°: 2 de WO 2011/127802. En una realizacion preferida, la glucoamilasa es una variante de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como la SEQ ID n°: 2 en WO 2011/127802 con una sustitucion K79V y descrita en WO 2013/036526.

[0185] Las composiciones pueden prepararse de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica y pueden estar en forma de una composicion liquida o seca. Por ejemplo, la composicion puede estar en forma de granulado o microgranulado. La variante puede estabilizarse de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica.

[0186] A continuacion se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de la invencion. La dosificacion de la composicion de la invencion y otras condiciones en las que se usa la composicion se pueden determinar sobre la base de metodos conocidos en la tecnica.

Usos

[0187] Una variante de la presente invencion se puede usar en varias aplicaciones para degradar o convertir un material que contiene xilano que comprenden tratar el material con la variante (vease, por ejemplo, WO 2002/18561). En consecuencia, la presente invencion tambien se refiere a metodos para degradar un material que contiene xilano, que comprenden tratar el material que contiene xilano con un polipeptido de este tipo que tiene actividad de xilanasa. La dosificacion de los polipeptidos de la presente invencion y otras condiciones en las que se usa la preparacion pueden determinarse sobre la base de metodos conocidos en la tecnica.

[0188] Un uso preferido de la variante de la invencion es para la reduccion de la viscosidad en un proceso para licuar un material que contiene almidon. Las fuentes del material que contiene almidon pueden seleccionarse de granos enteros, maiz, trigo, cebada, centeno, milo, sagu, yuca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, frijoles y batatas, o mezclas de los mismos, o cereales, o materias primas que contienen azucar, como melazas, frutas, cana de azucar o remolacha azucarera, patatas.

[0189] La licuefaccion se realiza en presencia de al menos una alfa amilasa y la variante de xilanasa de la invencion. La licuefaccion puede ir seguida de sacarificacion y, opcionalmente, de fermentacion para generar un producto de fermentacion, preferiblemente etanol.

[0190] En un aspecto, la invencion se refiere a un proceso para producir un producto de fermentacion a partir de material que contiene almidon que comprende las etapas de: (a) licuar material que contiene almidon en presencia de una alfa amilasa; (b) sacarificar el material licuado; y (c) fermentar con un organismo fermentador; donde la variante de xilanasa de la invencion esta presente durante la etapa (a).

[0191] La sacarificacion y la fermentacion se pueden realizar simultaneamente. El producto de fermentacion es preferiblemente alcohol, mas preferiblemente etanol.

[0192] En otra realizacion, la invencion se refiere a un proceso para producir un producto de jarabe a partir de material que contiene almidon, que comprende la etapa de: (a) mezclar el material que contiene almidon seco con agua para formar una pulpa, (b) licuar material que contiene almidon en presencia de una alfa amilasa; (c) sacarificar el material licuado en presencia de una glucoamilasa, donde la variante de xilanasa de la invencion esta presente durante la etapa (a) y/o (b).

[0193] El material que contiene almidon se selecciona preferiblemente de entre los cereales, es decir, pastos cuyas semillas se utilizan como alimento. En una realizacion particular, el material que contiene almidon se selecciona de trigo o cebada. Mas particularmente, es trigo.

[0194] Las variantes de la presente invencion tambien se pueden usar en la degradacion de la biomasa lignocelulosica o la conversion a azucares fermentables para la produccion de, por ejemplo, combustibles, etanol potable y/o productos de fermentacion (por ejemplo, acidos, alcoholes, cetonas, gases, y similares). Las variantes se usan preferiblemente en combinacion con otras enzimas que degradan el xilano y una composicion de celulasa (endoglucanasa(s), celobiohidrolasa(s) y beta-glucosidasa(s)).

[0195] En otra realizacion, la invencion se refiere a un proceso para producir un producto de fermentacion, que comprende:

(a) sacarificacion de un material celulosico o que contiene xilano con una composicion enzimatica en presencia del polipeptido que tiene actividad de xilanasa de la invencion;

(c) recuperar el producto de fermentacion de la fermentacion.

[0196] En un aspecto, la composicion comprende ademas una o mas enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa.

Plantas

[0197] La presente invencion tambien se refiere a plantas, por ejemplo, una planta, parte de planta o celula vegetal transgenica, que comprende un polinucleotido de la presente invencion para expresar y producir la variante en cantidades recuperables. La variante puede ser recuperada de la planta o parte de planta. Alternativamente, la planta o la parte de planta que contiene la variante se puede usar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso. por ejemplo, mejorando el valor nutricional, la palatabilidad y las propiedades reologicas, o para destruir un factor antinutritivo.

[0198] La planta transgenica puede ser dicotiledonea (dicot) o monocotiledonea (monocot). Algunos ejemplos de plantas monocotiledoneas son las gramineas, como la espiguilla (pasto azul de Kentucky, Poa), hierba forrajera como la Festuca, Lolium, pasto templado, como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maiz.

[0199] Tambien se incluyen dentro del alcance de la presente invencion la progenie de tales plantas, partes de plantas y celulas vegetales.

[0200] La planta transgenica o celula vegetal que expresa una variante puede construirse de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica. En resumen, la planta o la celula vegetal se construye incorporando una o mas construcciones de expresion que codifican una variante en el genoma de la planta hospedadora o el genoma del cloroplasto y propagando la planta modificada o la celula vegetal resultante en una planta o celula transgenica.

[0201] La construccion de expresion es convenientemente una construccion de acido nucleico que comprende un polinucleotido que codifica una variante operativamente unida con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresion del polinucleotido en la planta o parte de planta elegida. Ademas, la construccion de expresion puede comprender un marcador seleccionable util para identificar celulas vegetales en las que se ha integrado la construccion de expresion y las secuencias de ADN necesarias para la introduccion de la construccion en la planta en cuestion (esto ultimo depende del metodo de introduccion de ADN que se utilice).

[0202] La eleccion de las secuencias reguladoras, como las secuencias promotora y terminadora y, opcionalmente, las secuencias de senal o de transito, se determina, por ejemplo, en funcion de cuando, donde y como se desea expresar la variante. Por ejemplo, la expresion del gen que codifica una variante puede ser constitutiva o inducible, 0 puede ser especifica para el desarrollo, el estadio o el tejido, y el producto genico puede dirigirse a un tejido especifico o parte concreta de una planta, como las semillas o las hojas. Las secuencias reguladoras estan, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[0203] Despues de la transformacion, los transformantes que han incorporado la construccion de expresion se seleccionan y regeneran en plantas completas de acuerdo con metodos ampliamente conocidos en la tecnica. A menudo, el procedimiento de transformacion esta disenado para la eliminacion selectiva de los genes de seleccion durante la regeneracion o en las siguientes generaciones utilizando, por ejemplo, la cotransformacion con dos construcciones de ADN-T separadas o la escision especifica del sitio del gen de seleccion por una recombinasa especifica.

[0204] La presente invencion tambien se refiere a metodos para producir una variante de la presente invencion que comprende: (a) cultivar una planta transgenica o una celula vegetal que comprende un polinucleotido que codifica la variante en condiciones propicias para la produccion de la variante; y (b) recuperar la variante.

[0205] La presente invencion se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

e j e m p l o s

Cepa

[0206] La cepa de Aspergillus oryzae MT3568 segun se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N°: US20110111453 se utilizo como un hospedador de expresion para la xilanasa GH10A de Aspergillus fumigatus y sus variantes.

Medios y reactivos

[0207] La solucion de metales traza AMG estaba compuesta por 14,3 g de ZnSO4- 7 H2O, 2,5 g de CuSO4- 5 H2O, 0,5 g de N iC ^ 6 H2O, 13,8 g de FeSO4- 7 H2O, 8,5 g de MnSO4- H2O, 3 g de acido citrico, y agua desionizada a 1 litro.

[0208] El medio MDU2BP (pH 5,0) estaba compuesto por 135 g de maltosa, 3 g de MgSO4- 7 H2O, 3 g de NaCl, 6 g de K2SO4, 36 g de KH2PO4, 21 g de extracto de levadura, 6 g de urea, 1,5 ml de solucion de metales traza AMG y agua desionizada hasta 1 litro.

[0209] La solucion de PEG estaba compuesta por 6 g de polietilenglicol 4000 (PEG 4000), 100 pl de Tris 1M pH 7,5, 100 |_il de CaCl21 M, y agua desionizada hasta 10 ml.

[0210] Las placas de agar 2XYT estaban compuestas por 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 15 g de agar Bacto y agua desionizada hasta 1 litro.

[0211] Las placas de agar 2XYT+Amp estaban compuestas de agar 2XYT suplementado con 100 pg de ampicilina por ml.

Ejemplo 1

Construccion de variantes de xilanasa GH10 de Aspergillus fumigatus

[0212] Se construyeron variantes de xilanasa GH10 de Aspergillus fumigatus (SEQ ID n°: 1) realizando una unica reaccion de mutagenesis dirigida en pHyGe001 como se describe en la patente de EE. UU. n° 7,960,160) utilizando un kit de mutagenesis dirigida QUIKCHANGE® II XL (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.). Se disenaron dos cebadores mutagenicos para insertar la mutacion deseada. La PCR estaba compuesta por 12,5 ng de cada cebador, aproximadamente 10 ng de plasmido molde, tampon de reaccion 1X QUIKCHANGE® (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.), 1 pl de la mezcla de QUIKCHANGE® II XL dNTP (Stratagene, La Jolla, CA , EE. UU.), y 1 pl de 2,5 U/pl Pfu de Enzima ULTRA™ (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.) en un volumen final de 50 pl. La reaccion de amplificacion se realizo utilizando un termociclador MASTERCYCLER® de EPPENDORF® (Eppendorf, Hauppauge, NY, EE. UU.) programado para un arranque en caliente a 95 °C; 1 ciclo a 95 °C durante 30 segundos; 16 ciclos cada uno a 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 9 minutos; y una retencion de 4 °C. Un microlitro de Dpn I se anadio directamente a la reaccion de amplificacion y se incubo a 37 °C durante 1 hora. Un volumen de 2 |_il de la la reaccion digerida por Dpn I se utilizo para transformar celulas ultracompetentes de E. Coli ONE SHOT® TOP10 (Life Technologies, Grand Island, NY, Ee . UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los transformantes de E. Coli se seleccionaron en placas de agar 2XYT+Amp. El ADN plasmidico de varios de los transformantes de E. Coli resultantes se preparo utilizando un BIOROBOT® 9600 (QlAGEN Inc., Valencia, CA, EE. UU.). El inserto se confirmo mediante secuenciacion de ADN utilizando un analizador genetico modelo 3130xL (Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.) y quimica de terminador marcado por tincion de un kit de secuenciacion de ciclo BIGDYE® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Para cada reaccion, se eligio uno de los clones con la mutacion deseada. Los cebadores utilizados en la reaccion para generar una variante de Aspergillus fumigatus especifica con la mutacion con la mutacion H87Y se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

Ejemplo 2:

Expresion de las variantes de xilanasa GH10 de Aspergillus fumigatus en Aspergillus oryzae MT3568

[0213] Se prepararon protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 de acuerdo con el metodo de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422, y se transformaron con 5 pg de cada uno de los vectores de expresion. Las transformaciones produjeron aproximadamente 1-10 transformantes para cada vector. Se aislaron hasta cuatro transformantes para cada transformacion en placas de APD individuales.

[0214] Las placas de APD confluentes de los transformantes se lavaron con 8 ml de TWEEN® 20 al 0,01% y se inocularon por separado en 1 ml de medio MDU2BP en placas de cultivo de tejidos esteriles de 24 pocillos y se incubaron a 34 °C. Cuatro dias despues de la incubacion, se analizaron 20 pl del caldo recolectado de cada cultivo utilizando geles de Tris-Glicina SDS-PAGE al 8-16% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los perfiles de SDS-PAGE de los cultivos mostraron que varios transformantes tenian una nueva banda principal de aproximadamente 45 kDa.

[0215] Una placa confluente de un transformante para cada transformacion (cultivada en APD) se lavo con 8 ml de TWe En® 20 al 0,01% y se inoculo en 125 ml de matraces de vidrio con deflectores que contenian 25 ml de medio MDU2BP y se incubo a 34°C con agitacion a 225 rpm para generar caldos para la caracterizacion de las variantes. Los matraces se recogieron el dia 4 y se filtraron utilizando una membrana GP Express plus de 0,22 pm (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.).

Ejemplo 3:

Termoactividad de las xilanasas GH10 de Aspergillus aculeatus y Aspergillus fumigatus

[0216] La xilanasa GH10 de Aspergillus fumigatus se expreso a partir de Aspergillus oryzae MT5668 como se describe en la solicitud de patente de EE. UU. US20110111453. La xilanasa de Aspergillus aculeatus probada en este caso es un producto comercial llamado Shearzyme 500 de Novozymes (SEQ ID n°: 4). Se analizo la actividad de ambas enzimas en arabinoxilano de trigo a temperaturas que oscilaban entre los 70 y 92 °C, como se describe a continuacion.

[0217] El sustrato se preparo humedeciendo primero 0,5 g de arabinoxilano de trigo de viscosidad media (Megazyme, Produce Code PWAXYM) con 4 ml de etanol en un vaso de precipitados y luego agregando 50 ml de citrato de sodio 100 mM, pH 5,0. El sustrato se agito con calentamiento suave en una placa caliente hasta que el sustrato se disolvio completamente. Se preparo una solucion DNS mediante la adicion de 20 g de NaOH, 4 g de fenol y 1 g de metabisulfilto de sodio a 900 ml de agua en una campana extractora. Se diluyeron muestras a una concentracion de proteina xilanasa final aproximada de 1 pg/ml en tampon de citrato en un tubo de ensayo de vidrio.

[0218] Se transfirieron 50 |_il de cada enzima diluida a todos los pocillos en tres filas sucesivas en una placa de PCR de 96 pocillos. Se agregaron 50 pL de soluciones estandar de xilosa de 20, 10, 5, 2,5, 1,2 y 0,6 mM, compuestas en tampon de citrato, a los pocillos 1 a 6 de la fila A y se agregaron 50 pL de tampon de citrato a los pocillos 7 a 12 de la fila A de la placa de PCR. Se agregaron 50 pL de sustrato a todos los pocillos y la placa de PCR se transfirio a un termociclador programado para un gradiente de temperatura de 70-92 °C y se incubo durante 1 h. Se agregaron 80 pL de DNS a cada pocillo y la placa se incubo a 95 °C durante 5 min. La placa se centrifugo luego a 1000 xg durante 1 min. Se transfirieron 130 pl de cada pocillo al pocillo correspondiente en una placa de microtitulacion y se midio la absorbancia a 560 nm. La pendiente (m) y la interseccion de y (b) de la absorbancia frente a los datos de concentracion de xilosa se analizaron mediante regresion lineal utilizando metodos conocidos por un experto en la tecnica. La concentracion de xilosa en cada pocillo de muestra se calculo mediante la siguiente ecuacion:

La actividad de xilanasa se calculo luego en pmol de equivalentes de xilosa producidos por minuto usando la siguiente ecuacion:

Los valores relativos de la actividad enzimatica se calcularon dividiendo la actividad de xilanasa a cada temperatura por la actividad maxima de la xilanasa medida para cada enzima. Estos valores se muestran representados en funcion de la temperatura en la Figura 1. La actividad mas alta de AacuGH10 se midio a 70 °C, mientras que la actividad mas alta de AfumGH10 se midio a 76 °C. Estos resultados demuestran que la xilanasa de Aspergillus fumigatus es mas activa a temperaturas mas altas que la xilanasa de Aspergillus aculeatus.

Ejemplo 4:

Produccion de inhibidores

[0219] Se extrajeron inhibidores proteicos de harina de trigo utilizando un metodo adaptado de McLauchlan et al. (A novel class of protein from wheat which inhibits xylanases. (1999), Biochem. J., 338: 441-446). Brevemente, se suspendieron 10 g de harina de trigo en 50 g de agua destilada, desionizada y se mezclaron a temperatura ambiente durante 30 min. Durante este paso, los inhibidores proteicos se disuelven, mientras que las fibras insolubles, como el xilano y la celulosa, y el almidon permanecen en gran parte insolubles. La suspension se filtro luego bajo vacio para separar los componentes insolubles residuales de la harina de trigo de los inhibidores proteicos en el filtrado. El filtrado se recogio y se lavo con 3 volumenes de citrato de sodio 50 mM, pH 5,0 utilizando columnas de centrifugacion Vivaspin 20 con 5000 MWCO (VIVA products, n° de catalogo 28-9323-59). El concentrado se uso para ensayos de inhibicion posteriores. Notese que el procedimiento utilizado en este caso no separa las diferentes clases de inhibidores de trigo (XIP1, TAXI, etc.).

Ejemplo 5:

Sensibilidad de las xilanasas GH10 de Aspergillus aculeatus y Aspergillus fumigatus a los inhibidores derivados del trigo

[0220] Se prepararon cinco diluciones en serie a 1/2 de la preparacion de inhibidor de trigo del Ejemplo 4 en tubos de ensayo combinando 2 ml de filtrado de trigo (o dilucion previa) y 2 ml de tampon de citrato. La preparacion del inhibidor y sus diluciones en serie se transfirieron a las filas B a G de una placa de PCR como se muestra a continuacion.

[0221] Disposicion en la placa de inhibidores de trigo y enzimas. Las diluciones 1-6 se refieren a diluciones crecientes (concentraciones relativas mas bajas) de los inhibidores de trigo.

Claims

r e iv in d ic a c io n e s

1. Variante de xilanasa, que comprende una sustitucion al menos en una posicion correspondiente a la posicion 87 del polipeptido de la SEQ ID n°: 3, en la que la variante tiene actividad de xilanasa y tiene una tolerancia incrementada a los inhibidores de xilanasa en comparacion con la xilanasa de la SEQ ID n°: 3; y en la que la variante tiene al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipeptido de la SEQ ID n°: 3 y en la que la sustitucion es H87Y.

2. Variante de xilanasa segun la reivindicacion 1, en la que el inhibidor de xilanasa es un inhibidor proteico derivado del trigo u otros cereales.

3. Variante segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la variante tiene un aumento en la actividad relativa de xilanasa sobre la xilanasa de tipo salvaje de al menos un factor 7x, particularmente 8x, particularmente 8,5x mas particularmente 9x, en presencia de inhibidores de xilanasa de trigo en cantidades que reduciran la actividad de xilanasa de tipo salvaje a menos del 10%.

4. Polinucleotido que codifica la variante de xilanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Construccion de acido nucleico que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 4.

6. Vector de expresion que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 4.

7. Celula hospedadora que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 4.

8. Metodo para producir una variante de xilanasa, que comprende: cultivar la celula hospedadora de la reivindicacion 7 en condiciones adecuadas para la expresion de la variante; y recuperar la variante.

9. Planta, parte de planta o celula vegetal transgenica que comprende el polinucleotido de la reivindicacion 4.

10. Proceso de produccion de un producto de fermentacion a partir de material que contiene almidon que comprende las etapas de: (a) licuar material que contiene almidon en presencia de una alfa amilasa; (b) sacarificar el material licuado; y (c) fermentarlo con un organismo fermentador; en el que la variante de xilanasa de las reivindicaciones 1-3 esta presente durante la etapa (a).

11. Proceso de produccion de un producto de jarabe a partir de material que contiene almidon, que comprende la etapa de: (a) mezclar el material que contiene almidon seco con agua para formar una pulpa, (b) licuar el material que contiene almidon en presencia de una alfa amilasa ; (c) sacarificar el material licuado en presencia de una glucoamilasa, en el que la variante de xilanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 esta presente durante la etapa (a) y/o (b).

12. Proceso de la reivindicacion 10 u 11, en el que el material que contiene almidon comprende trigo o cebada.

13. Proceso para producir un producto de fermentacion, que comprende:

(a) sacarificar un material celulosico o que contiene xilano con una composicion enzimatica en presencia del polipeptido que tiene actividad de xilanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3;

(c) recuperar el producto de fermentacion de la fermentacion.

14. Proceso segun las reivindicaciones 10 o 13, en el que el producto de fermentacion es etanol.

15. Composicion que comprende la variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

16. Composicion segun la reivindicacion 15, que comprende ademas una alfa-amilasa y una proteasa y, opcionalmente, una glucoamilasa.

17. Proceso para degradar un material que contiene xilano, que comprende: tratar el material de xilano con una composicion enzimatica de la reivindicacion 15.

18. Procedimiento segun la reivindicacion 17, en el que la composicion comprende ademas una o mas enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa.

19. Formulacion de caldo de cultivo completo o composicion de cultivo celular, que comprende la variante de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.