ES2704685T3 - Método para la detección de proteínas - Google Patents

Abstract

Un sistema de detección para detectar electroquímicamente el antígeno de cáncer 125 (CA-125), que comprende: un microelectrodo que incluye un enlazador en su superficie, en donde el enlazador se une a un anticuerpo o fragmento de este capaz de unirse al CA-125, el microelectrodo tiene un diámetro de 100 micras o menos; y un indicador redox capaz de transferir electrones con el microelectrodo, en donde la unión de CA-125 al anticuerpo o fragmento de este impide la transferencia de electrones entre el indicador redox y el microelectrodo.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la detección de proteínas

Antecedentes de la invención

El desarrollo de plataformas para la medición sensible y directa de los niveles de proteínas en muestras clínicas es un objetivo importante que facilitará el uso expandido de biomarcadores de proteínas en el diagnóstico de enfermedades. Para proporcionar información útil, los esquemas de detección deben exhibir niveles altos de especificidad, límites bajos de detección y un rendimiento robusto en fluidos biológicos como sangre y suero. Dada la aparición de señales de identificación de proteínas múltiples para el cáncer y otras enfermedades, la multiplexación también es un elemento valioso. La inclusión de controles y calibradores internos y externos, críticos para el desarrollo de análisis de diagnóstico precisos, también requiere la multiplexación.

Está en desarrollo una variedad de plataformas de detección de proteínas de alto rendimiento, y muchas de las más específicas y sensibles usan micro y nanomateriales en sus esquemas de detección. Las nanopartículas con código de barras, los transistores de nanocables, las perlas marcadas con enzimas y las inmunomatrices de microfluidos usadas con la lectura electroquímica son prometedoras para el desarrollo de analizadores de biomarcadores.

Ejemplos de plataformas para la detección de proteínas se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos núm.

2009/061451, y por Shun-Qui Hu y otros, (Analytica Chimica Acta, 458, 2002, 297-304), Gent y otros (Electrochimica Acta, 53, 2008, 4663-4668). Además, Yun y otros analizan un inmunosensor de matriz de nanotubos para la detección electroquímica directa de la unión antígeno-anticuerpo (Yun y otros "A nanotube array immunosensor for direct electrochemical detection of antigen-antibody binding", Sensors and Actuators B: Chemical: International Journal Devoted to Research and Development of Physical and Chemical Transducers, Elsevier BV, NL vol. 123, núm. 1. 20 de marzo de 2007, páginas 177-182). La solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2006/160100 describe un método de ensayo electroquímico para detectar una molécula objetivo, por ejemplo, una proteína, en una muestra, que implica el uso de una monocapa protectora y un polímero redox para formar una bicapa inmovilizada en un electrodo.

Sin embargo, aún quedan desafíos relacionados con el desarrollo de sistemas de análisis simples que sean lo suficientemente rentables y robustos para el uso clínico.

Breve descripción de la invención

Se proporcionan en la presente descripción sistemas de detección para detectar electroquímicamente un analito proteico. En un aspecto de la invención, se proporciona un sistema de detección de acuerdo con la reivindicación 1. Además se proporcionan, en un ejemplo, sistemas de detección que comprenden un electrodo que comprende un enlazador en su superficie, en donde el enlazador se une a un anticuerpo o fragmento de este capaz de unirse a un analito proteico; y un indicador redox.

En algunos ejemplos de los sistemas proporcionados en la presente descripción, el enlazador comprende un grupo funcional capaz de acoplarse directa o indirectamente al anticuerpo o fragmento de este. En otros ejemplos, el enlazador comprende un grupo amino funcional. En aún otros ejemplos, el enlazador comprende un grupo ácido carboxílico funcional. En otros ejemplos, el enlazador es cistamina, cisteamina, ácido mercapto propiónico o 4-aminotiofenol. En aún otros ejemplos, el enlazador se une al anticuerpo o fragmento de este mediante un segundo enlazador. En algunos casos, el segundo enlazador es glutaraldehído o formaldehído. En ejemplos adicionales, el enlazador se une a múltiples copias de un anticuerpo o fragmento de este.

En algunos ejemplos de los sistemas proporcionados en la presente descripción, el anticuerpo o fragmento de este se selecciona del grupo que consiste en antisuero policlonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2, fragmento Fv, anticuerpo de cadena sencilla, péptido de CDR y diacuerpos.

En algunos ejemplos de los sistemas en la presente descripción, el indicador redox es capaz de generar una señal electroquímica con el electrodo cuando se aplica un potencial. En otros ejemplos, el indicador redox genera una corriente faradaica. En aún otros ejemplos, el indicador redox es capaz de transferencia de electrones interfacial. En ejemplos adicionales, el indicador redox es ferricianuro/ferrocianuro o ferroceno. En aún otros ejemplos, el indicador redox es hexacloroiridato (IV)/hexacloroiridato (III).

En algunos ejemplos de los sistemas proporcionados en la presente descripción, el electrodo es de un metal noble. En otros ejemplos, el electrodo es de carbono. En aún otros ejemplos, el electrodo es de óxido de indio y estaño. En otros ejemplos, el electrodo es de oro, paladio o platino.

En algunos ejemplos de los sistemas proporcionados en la presente descripción, el electrodo es un microelectrodo. En ciertos ejemplos de los sistemas proporcionados en la presente descripción, el electrodo es un microelectrodo nanoestructurado. En algunos ejemplos, el electrodo es de menos de aproximadamente 500 micras. En otros ejemplos, el electrodo es de menos de aproximadamente 250 micras. En aún otros ejemplos, el electrodo es de menos de aproximadamente 100 mieras. En aún otros ejemplos, el electrodo es de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mieras. En otros ejemplos, el electrodo es de menos de aproximadamente 10 micras. En ejemplos adicionales, el electrodo está en un chip microfabricado. En otros ejemplos están presentes una pluralidad de electrodos dispuestos en un sustrato.

En algunos ejemplos de los sistemas proporcionados en la presente descripción, el analito proteico es un biomarcador para una enfermedad, trastorno o afección. En algunos casos, el biomarcador es un biomarcador del cáncer. En ciertos casos, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste en BRCA1, BRCA1, Her2/neu, alfafetoproteína, microglobulina beta-2, antígeno de tumor de vejiga, antígeno de cáncer 15-3, antígeno de cáncer 19-9, gonadotropina coriónica humana, antígeno de cáncer 72-4, antígeno de cáncer 125 (CA-125), calcitonina, antígeno carcinoembrionario, EGFR, receptores de estrógenos, receptores de progesterona, inmunoglobulinas monoclonales, enolasa específica de las neuronas, NMP22, tiroglobulina, receptores de progesterona, antígeno prostático específico (PSA, por sus siglas en inglés), antígeno de membrana específico de próstata, fosfatasa ácida prostática, S-100 y TA-90, o una porción, variación o fragmento de estos. En otros casos, el biomarcador es un biomarcador para las infecciones bacterianas por Staphylococcus o Streptococcus.

Además, se proporcionan en la presente descripción métodos para la detección electroquímica de un analito proteico. En un aspecto de la invención, se proporciona un método para la detección electroquímica de acuerdo con la reivindicación 9. Además se proporcionan, en un ejemplo, métodos que comprenden poner en contacto un electrodo que comprende un enlazador en su superficie, en donde el enlazador se une a un anticuerpo o fragmento de este capaz de unirse a un analito proteico con una muestra y un indicador redox; medir una señal electroquímica generada por el electrodo marcado con anticuerpo y el indicador redox cuando se aplica un potencial; y comparar la señal electroquímica con una señal de una muestra control que no comprende analito proteico; en donde un cambio de la señal detectada con relación a una señal de una muestra control que no comprende analito proteico es indicativo de la presencia del analito proteico en la muestra.

En algunos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente descripción, el enlazador comprende un grupo funcional capaz de acoplamiento directo o indirecto al anticuerpo o fragmento de este. En otros ejemplos, el enlazador comprende un grupo amino funcional. En aún otros ejemplos, el enlazador comprende un grupo ácido carboxílico funcional. En otros ejemplos, el enlazador es cistamina, cisteamina, ácido mercapto propiónico o 4-aminotiofenol. En aún otros ejemplos, el enlazador se une al anticuerpo o fragmento de este mediante un segundo enlazador. En algunos casos, el segundo enlazador es glutaraldehído o formaldehído. En ejemplos adicionales, el enlazador se une con múltiples copias de un anticuerpo o fragmento de este.

En algunos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente descripción, el anticuerpo o fragmento de este se selecciona del grupo que consiste en antisuero policlonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2, fragmento Fv, anticuerpo de cadena sencilla, péptido de CDR y diacuerpos.

En algunos ejemplos de los sistemas en la presente descripción, el indicador redox genera una corriente faradaica. En otros ejemplos, el indicador redox es capaz de transferencia de electrones interfacial. En ejemplos adicionales, el indicador redox es ferricianuro/ferrocianuro o ferroceno. En aún otros ejemplos, el indicador redox es hexacloroiridato (IV)/hexacloroiridato (III).

En algunos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente descripción, el electrodo es de un metal noble. En otros ejemplos, el electrodo es de carbono. En aún otros ejemplos, el electrodo es de óxido de indio y estaño. En otros ejemplos, el electrodo es de oro, paladio o platino.

En ciertos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente descripción, el electrodo es un microelectrodo nanoestructurado. En otros ejemplos, el electrodo es de menos de aproximadamente 100 micras. En aún otros ejemplos, el electrodo es de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 micras. En otros ejemplos, el electrodo es de menos de aproximadamente 10 micras. En ejemplos adicionales, el electrodo está en un chip microfabricado.

En algunos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente descripción, el analito proteico es un biomarcador para una enfermedad, trastorno o afección. En algunos casos, el biomarcador es un biomarcador del cáncer. En ciertos casos, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste en BRCA1, BRCA1, Her2/neu, alfafetoproteína, microglobulina beta-2, antígeno de tumor de vejiga, antígeno de cáncer 15-3, antígeno de cáncer 19-9, gonadotropina coriónica humana, antígeno de cáncer 72-4, antígeno de cáncer 125 (CA-125), calcitonina, antígeno carcinoembrionario, EGFR, receptores de estrógenos, receptores de progesterona, inmunoglobulinas monoclonales, enolasa específica de las neuronas, NMP22, tiroglobulina, receptores de progesterona, antígeno prostático específico (PSA), antígeno de membrana específico de próstata, fosfatasa ácida prostática, S-100 y TA-90, o una porción, variación o fragmento de estos. En otros casos, el biomarcador es un biomarcador para las infecciones bacterianas por Staphylococcus o Streptococcus.

Además, se proporcionan en la presente descripción métodos para la detección electroquímica multiplexada de una pluralidad de analitos proteicos. En un ejemplo, los métodos comprenden poner en contacto un primer electrodo que comprende un enlazador en su superficie, en donde el enlazador se une a un primer anticuerpo o fragmento de este capaz de unir un analito proteico con una muestra y un indicador redox; medir una primera señal electroquímica generada por el primer electrodo marcado con anticuerpo y el indicador redox cuando se aplica un potencial; poner en contacto un segundo electrodo que comprende un enlazador en su superficie, en donde el enlazador se une a un segundo anticuerpo o fragmento de este capaz de unirse a un analito proteico con una muestra y un indicador redox; medir una segunda señal electroquímica generada por el segundo electrodo marcado con anticuerpo y el indicador redox cuando se aplica un potencial; y comparar las señales electroquímicas primera y segunda con señales respectivas generadas por el primer y segundo electrodo marcado con anticuerpo en una muestra control que no comprende analito proteico; en donde un cambio de la primera y segunda señales electroquímicas detectadas con relación a las señales respectivas de una muestra control que no comprende analito proteico es indicativo de la presencia del analito proteico en la muestra.

En algunos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente descripción, el primer y el segundo electrodo están ambos en un chip microfabricado. En otros ejemplos, el primer y segundo electrodo están en diferentes chips microfabricados.

En algunos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente descripción, el segundo electrodo marcado con anticuerpo es un control de referencia con respecto al primer electrodo marcado con anticuerpo. En otros ejemplos, el segundo electrodo marcado con anticuerpo detecta una proteína sérica abundante.

Además, se proporcionan en la presente descripción métodos para monitorear la progresión o respuesta en un sujeto que tiene un cáncer. En un aspecto de la invención, se proporciona un método para monitorear la progresión o respuesta en un sujeto que tiene un cáncer de acuerdo con la reivindicación 18.

Además se proporcionan, en un ejemplo, métodos que comprenden obtener una muestra biológica del sujeto; poner en contacto un electrodo que comprende un enlazador en su superficie, en donde el enlazador se une a un anticuerpo o fragmento de este capaz de unirse a un analito proteico con la muestra y un indicador redox en donde el anticuerpo o fragmento de este se une a un analito proteico; medir una señal electroquímica generada por el electrodo marcado con anticuerpo y el indicador redox cuando se aplica un potencial; y comparar la señal electroquímica con una señal de una muestra control que no contenga analito proteico; en donde un cambio de la señal detectada con relación a una señal de una muestra control que no comprende analito proteico es indicativo de la presencia del analito proteico en la muestra.

En algunos ejemplos de los métodos proporcionados en la presente descripción, el analito proteico es un biomarcador para una enfermedad, trastorno o afección. En algunos casos, el biomarcador es un biomarcador del cáncer. En ciertos casos, el biomarcador se selecciona del grupo que consiste en BRCA1, BRCA1, Her2/neu, alfafetoproteína, beta-2 microglobulina, antígeno de tumor de vejiga, antígeno de cáncer 15-3, antígeno de cáncer 19-9, gonadotropina coriónica humana, antígeno de cáncer 72-4, antígeno de cáncer 125 (CA-125), calcitonina, antígeno carcinoembrionario, EGFR, receptores de estrógenos, receptores de progesterona, inmunoglobulinas monoclonales, enolasa específica de las neuronas, NMP22, tiroglobulina, receptores de progesterona, antígeno prostático específico (PSA), antígeno de membrana específico de próstata, fosfatasa ácida prostática, S-100 y TA-90, o una porción, variación o fragmento de estos. En otros casos, el biomarcador es un biomarcador para las infecciones bacterianas por Staphylococcus o Streptococcus.

Además, se proporcionan en la presente descripción kits para la detección electroquímica de un analito proteico. En un ejemplo, los kits comprenden un electrodo que comprende un enlazador en su superficie, en donde el enlazador se une a un anticuerpo o fragmento de este capaz de unirse a un analito proteico; y un indicador redox capaz de generar una señal electroquímica con el electrodo cuando se aplica un potencial.

Las modalidades preferidas de la invención en cualquiera de sus varios aspectos son como se describen más abajo o como se definen en las sub reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención se obtendrá por referencia a la siguiente descripción detallada que expone las modalidades ilustrativas, en las que se usan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos en las que:

Figura 1a. Fotografía (izquierda) de un chip de sensor multiplexado que muestra un chip microfabricado con aberturas de 5 |jm para la deposición electroquímica de electrodos y una ilustración (centro) de la abertura. Un patrón de oro (Au) se deposita sobre una oblea de silicio mediante el uso de fotolitografía convencional y después se cubre con una capa de SiÜ2; después se graban aberturas de 5 jm a través de esta capa superior para exponer una sección circular de Au. Ilustración esquemática de la generación de electrodos de Au por electrodeposición de Au (derecha).

Figura 1b. Esquema de funcionalización del electrodo; (izquierda) se forma un enlazador de cistamina en la estructura de Au; (centro) reacción con un enlazador bifuncional glutaraldehído para introducir grupos aldehído en la superficie del sensor; (derecha) adición del anticuerpo anti CA-125 o el anticuerpo anti-albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés) para preparar sensores de electrodos modificados con anticuerpos.

Figura 1c. Vista esquemática de la detección electroquímica del antígeno CA-125. La unión antígeno-anticuerpo impide la reacción de transferencia de electrones interfacial de [Fe(CN)a]3-/4-.

Figura 1d. Voltametría de pulso diferencial (DPV, por sus siglas en inglés) que muestra la disminución de la señal observada después de la incubación del CA-125 (10 U/ml en suero) durante 40 min.

Figura 2. Imágenes SEM y voltamogramas cíclicos característicos de tres sensores de electrodos AU de diferentes tamaños. Imágenes SEM de (a) sensor de 100 micras. Esta estructura se fabricó mediante el uso de amperometría de potencial DC a un potencial aplicado de 0 mV durante 200 s, (c) sensor de 30 micras. Esta estructura se fabricó mediante el uso de amperometría de potencial DC a un potencial aplicado de 150 mV durante 200 s, y (e) sensor de 8 micras. Esta estructura se fabricó mediante el uso de cronopotenciometría a una corriente aplicada de 30 nA durante 50 s. Se obtuvieron voltamogramas cíclicos característicos de los tres sensores en una solución tampón de fosfato 10 mM que contenía [Fe(CN)a]3-/4- 2,5 mM y KCl 0,1 M a una velocidad de barrido de 100 mV/s en sensores con tamaño (b) 100 micras, (d) 30 micras, y (f) sensores de 8 micras. El inserto de la fig. 2 (f) muestra la vista ampliada del voltamograma cíclico. (g) Corriente capacitiva de tres sensores que reflejan el área de superficie para cada tamaño de sensor. Se obtuvieron voltamogramas cíclicos en una solución tampón de fosfato 10 mM que contenía KCl 0,1 M a una velocidad de barrido de 100 mV/s en sensores con tamaño 100 micras (curva exterior), 30 micras (curva central) y 8 micras (curva interior).

Figura 3. Comparación de las sensibilidades y límites de detección de los inmunosensores generados en tres estructuras de Au de diferentes tamaños. Las AAI (%) con concentración de CA-125 en PBS se obtuvieron con (a) sensor de 100 micras, (b) sensor de 30 micras y (c) sensor de 8 micras.

Figura 4. Cambio de corriente de los sensores con tamaño (a) 100 micras y (b) 8 micras antes de la incubación (barra gris) y después (barra negra) con diferentes concentraciones de CA-125 en PBS.

Figura 5. Detección de CA-125 en suero y sangre total. (a) Detección simultánea de CA-125 y HSA en muestras de suero enriquecido. La muestra contenía suero no diluido. Datos obtenidos con suero solo y suero enriquecido con diferentes concentraciones de CA-125. Las barras grises indican los datos obtenidos con los inmunosensores modificados con anticuerpos anti CA-125 y las barras negras representan los de los inmunosensores modificados con anticuerpos anti-HSA. El tamaño del sensor fue de 8 micras. (b) Detección de CA-125 en sangre total. Las muestras contenían sangre no diluida y sin procesar y las concentraciones de CA-125 indicadas.

Descripción detallada de la invención

I. Sistemas y métodos de detección electroquímica.

En la presente descripción se proporcionan sistemas y métodos para detectar electroquímicamente un analito objetivo en una muestra. La presencia de un analito se detecta mediante un cambio en una señal electrocatalítica. El uso de dicha lectura eléctrica proporciona un método económico, extremadamente sensible, fácil de miniaturizar y fácil de automatizar.

En un ejemplo de los sistemas y métodos de detección descritos en la presente descripción, se proporciona un electrodo en donde el electrodo comprende un enlazador y en donde el enlazador se une a un anticuerpo o fragmento de este. El anticuerpo o fragmento de este es capaz de unirse a un analito objetivo tal como una proteína. El electrodo está en presencia de un indicador redox.

Los indicadores redox adecuados para su uso en los sistemas y métodos descritos en la presente descripción son capaces de generar una señal eléctrica (por ejemplo, corriente faradaica) con el electrodo cuando se aplica un potencial. Puede usarse cualquier indicador redox que genere una corriente faradaica o que sea capaz de transferencia de electrones interfacial con el electrodo. Los indicadors redox no limitantes incluyen, peor no se limitan a, grupos redoxactivos pequeños, como ferricianuro/ferrocianuro, ferroceno y hexaclorairidato (IV)/hexacloroiridato (III).

Los sistemas de detección usan indicadores redox para generar señales eléctricas de referencia con el electrodo. Cuando está presente un analito objetivo que se une al anticuerpo o fragmento de este, la señal eléctrica se atenúa. Se contempla que la atenuación de la señal se debe a que el analito objetivo impide que el indicador redox acceda eficazmente a la superficie del electrodo. En otras palabras, la unión anticuerpo-analito impide la transferencia de electrones interfacial. Ver, solamente a manera de ejemplo, Figuras 1c y 1d.

En un aspecto, los cambios de señal correspondientes a la unión del analito objetivo al anticuerpo se calculan como un porcentaje de cambio en la corriente faradaica:

AI% = {(I0 media) - (Ic media)}/Iü media x 100

donde I0 media= corriente media a concentración del objetivo cero, Ic media= corriente media en cualquier concentración de objetivo). En ciertos ejemplos, el cambio de señal es al menos aproximadamente del 10 %, al menos aproximadamente del 15 %, aproximadamente del 25 %, aproximadamente del 30 %, aproximadamente del 40 %, aproximadamente del 50 %, aproximadamente del 65 %, aproximadamente del 75 %, aproximadamente del 85 %, aproximadamente del 90 %, aproximadamente del 95 %, aproximadamente más del 100 %, aproximadamente el doble, aproximadamente diez veces, aproximadamente cincuenta veces o más. En ciertos casos, un cambio de la señal indica que el analito se une al anticuerpo. Con el cambio en la corriente faradaica, los sistemas de detección y los métodos descritos en la presente descripción se usan en un aspecto para determinar la presencia de un analito objetivo.

En otro ejemplo, los sistemas y métodos de detección descritos en la presente descripción se usan para determinar la concentración de un analito objetivo en una muestra. En algunos ejemplos, esto se logra mediante la calibración del sistema de detección con estándares de concentración conocida del analito objetivo. Por ejemplo, una serie de muestras de control positivo, cada una con concentraciones específicas de analito, se usan para determinar el porcentaje de cambio en la corriente faradaica para la determinación de una cantidad desconocida de un analito en una muestra de prueba. Los rangos de detección para los sistemas y métodos de detección están en dependencia del anticuerpo, el analito y sus capacidades de enlace, así como también del indicador redox usado. En algunos ejemplos, los sistemas y métodos de detección descritos en la presente descripción detectan concentraciones de analito a aproximadamente 500 femtomolar (fM) o aproximadamente 100 pg/ml o menos.

En otro ejemplo, los sistemas y métodos de detección descritos en la presente descripción se multiplexan para detectar y/o determinar la concentración de una pluralidad de analitos objetivo. En algunos ejemplos, los sistemas y métodos multiplexados comprenden al menos dos electrodos, cada uno de los cuales comprende un enlazador con anticuerpos diferentes unidos a cada enlazador. En ciertos casos, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez electrodos, cada uno que comprende un enlazador con anticuerpos diferentes unidos a cada enlazador, se emplean en un sistema multiplexado. En algunos ejemplos, al menos tres, al menos cinco, al menos diez, al menos quince, al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, o al menos cincuenta o más electrodos se emplean en un sistema multiplexado, cada uno de los cuales comprende un enlazador con anticuerpos diferentes unidos a cada enlazador en cada electrodo. Alternativamente, más de un electrodo puede contener el mismo anticuerpo o clase de anticuerpos; por ejemplo, duplicados de cuatro electrodos, cada grupo que contiene uno de tres anticuerpos separados, pueden usarse en un sistema multiplexado de doce electrodos. Además, un electrodo puede contener más de un anticuerpo o clase de anticuerpos; por ejemplo, en un electrodo individual, puede combinarse más de un anticuerpo, y cada uno reconoce una región específica de una proteína o analito. En algunos casos, la detección se producirá solo si una proteína o un analito se une a todos los anticuerpos unidos al electrodo. En algunos casos, la detección se producirá si una proteína o un analito se une a al menos uno de los grupos de anticuerpos unidos al electrodo.

La multiplexación permite detectar una gran variedad de analitos simultáneamente, lo que crea de esta manera un "panel de analitos". Los paneles de analitos ilustrativos pueden contener analitos relacionados con un trastorno, enfermedad o afección, por ejemplo, biomarcadores relacionados para un cáncer determinado. Además, la multiplexación permite una mayor sensibilidad para un analito, tal como anticuerpos diferentes que se unen al mismo analito objetivo mediante los mismos o diferentes epítopos. El uso de anticuerpos diferentes, tal como, por ejemplo, el uso de un anticuerpo policlonal y uno monoclonal que se dirigen al mismo analito, permite que el sistema de detección sea más robusto y sensible que un sistema de análisis individual que usa solo un tipo de anticuerpo para detectar un analito. La multiplexación además permite la calibración interna del sistema para reducir los falsos positivos y negativos. Por ejemplo, el análisis de un analito objetivo puede realizarse en paralelo con un analito que se conoce que es estable, tal como una proteína sérica abundante.

En otro ejemplo, los sistemas y métodos de detección descritos en la presente descripción se emplean para detectar o diagnosticar un trastorno, enfermedad o afección o para monitorear la progresión o respuesta de un trastorno, enfermedad o afección. En algunos ejemplos, se obtiene una muestra de un paciente o sujeto y los sistemas y métodos de detección se usan para detectar la presencia y/o la concentración de un analito objetivo asociado con el trastorno, enfermedad o afección. Los trastornos, enfermedades o afecciones ilustrativas incluyen cánceres (por ejemplo, mama, ovario, próstata, páncreas, colorrectal, vejiga y similares), enfermedades infecciosas (por ejemplo, infecciones bacterianas por Staphylococcus o Streptococcus, MRSA, VISA, infecciones virales, infecciones fúngicas y similares), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, enfermedad de Graves, lupus, artritis, síndrome de Goodpasture y similares), patologías y trastornos metabólicos (por ejemplo, síndrome metabólico, resistencia a la insulina, diabetes tipo I y II, enfermedad de Crohn, síndrome del intestino irritable y similares), VIH/SIDA, enfermedades genéticas y afecciones asociadas con fármacos terapéuticos o materiales toxicológicos. La gravedad o estadío de un trastorno, enfermedad o afección se determinan en algunos ejemplos al detectar la concentración del analito objetivo, donde diferentes concentraciones indican la gravedad o estadío. Igualmente, en otros ejemplos, la progresión o respuesta de un trastorno, enfermedad o afección se determina mediante la detección de la concentración del analito objetivo en varios puntos temporales. La eficacia terapéutica de un tratamiento farmacológico, terapia o régimen puede, en algunos ejemplos, determinarse también mediante la detección de la concentración del analito objetivo en varios puntos de tiempo.

II. Electrodos

Los electrodos para los sistemas y métodos de detección descritos en la presente descripción son materiales conductores eléctricamente con propiedades que permiten enlazadores en las superficies del electrodo. Los electrodos tienen la capacidad de transferir electrones hacia o desde un indicador redox y generalmente se conectan a un dispositivo electrónico de control y detección. En general, los metales nobles, tales como Ag, Au, Ir, Os, Pd, Pt, Rh, Ru y otros en su familia son materiales adecuados para electrodos. Los metales nobles tienen propiedades favorables lo que incluye estabilidad y resistencia a la oxidación, pueden manipularse en diversos métodos tales como la electrodeposición, y se unen a tioles y moléculas que contienen disulfuro, lo que permite de esta manera la unión de dichas moléculas. Además, pueden usarse otros materiales, tales como los compuestos conductores que contienen nitrógeno (por ejemplo, WN, TiN, TaN) o materiales basados en silicio/sílice, tales como el silano o el siloxano. En ciertos ejemplos, el electrodo es de oro, paladio o platino. En otros ejemplos, el electrodo es de carbono. En ejemplos adicionales, el electrodo es de óxido de indio y estaño.

En algunos ejemplos, el electrodo es un microelectrodo. En otros ejemplos, el microelectrodo es un microelectrodo nanoestructurado ("NME", por sus siglas en inglés). Los NME son microelectrodos que presentan superficies nanoestructuradas. La nanotextura superficial o las nanoestructuras proporcionan al electrodo un área superficial mayor, lo que permite una sensibilidad mayor, particularmente en aplicaciones de biosensores. La fabricación de NME puede realizarse mediante electrodeposición. Mediante la variación de parámetros tales como el tiempo de deposición, el potencial de deposición, el tipo de electrolito de soporte y las fuentes de iones metálicos, pueden generarse NME de diversos tamaños, morfologías y composiciones. En ciertos casos, los NME tienen una estructura dendrítica. La complejidad de la estructura dendrítica se logra mediante la variación de los parámetros de electrodeposición mencionados anteriormente. Los NME ilustrativos para su uso en los sistemas y métodos descritos en la presente descripción se describen en la Solicitud de Patente Internacional Núm. de serie PCT/CA2009/001212(publicada como documento WO/2010/025547).

Además, pueden usarse otras estructuras de electrodo en los sistemas y métodos de detección descritos en la presente descripción, lo que incluye superficies planas, alambres, tubos, conos y partículas. Los macro y micro electrodos disponibles comercialmente también son adecuados para los ejemplos descritos en la presente descripción.

Los electrodos tienen un tamaño, por ejemplo, de entre aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 5.000 micras de longitud o diámetro; entre aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 2.000 micras de longitud o diámetro; de entre aproximadamente 0,001 a aproximadamente 250 micras; de entre aproximadamente 0,01 a aproximadamente 200 micras; de entre aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 micras; de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 50 micras; de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 30 micras de longitud, o más abajo de aproximadamente 10 micras de longitud o diámetro. En ciertos ejemplos, los electrodos tienen un tamaño de aproximadamente 100 micras, aproximadamente 30 micras, aproximadamente 10 micras o aproximadamente 5 micras de longitud o diámetro. En otros ejemplos, los electrodos tienen un tamaño de aproximadamente 8 micras.

}En algunos ejemplos, los sistemas y métodos de detección descritos en la presente descripción comprenden un electrodo para la detección. En otros ejemplos, se usan múltiples electrodos. El uso de múltiples electrodos puede usarse en paralelo para detectar un analito objetivo mediante un tipo de anticuerpo unido a cada electrodo, en algunos ejemplos. Alternativamente, en otros ejemplos, se usan múltiples electrodos para el multiplexado como se describió anteriormente. Pueden configurarse múltiples electrodos en matrices de densidad alta o baja. En la Figura 1a se representa una matriz ilustrativa de 8 electrodos en un chip microfabricado para su uso en el multiplexado.

En otros ejemplos, un electrodo se ubica sobre un sustrato. El sustrato puede comprender una gama amplia de materiales, ya sea biológicos, no biológicos, orgánicos, inorgánicos o una combinación de cualquiera de estos. Por ejemplo, el sustrato puede ser una película de Langmuir Blodgett polimerizada, vidrio funcionalizado, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO2, SiN4, silicio modificado, o cualquiera de una variedad amplia de geles o polímeros tales como el (poli)tetrafluoroetileno, (poli)vinilidenodifluoruro, poliestireno, poliestireno reticulado, poliacrílico, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poli(láctido coglicólido), polianhídridos, poli(metacrilato de metilo), poli(acetato de etilen-co-vinilo), polisiloxanos, sílice polimérica, látex, polímeros de dextrano, epoxis, policarbonatos, o sus combinaciones.

Los sustratos pueden ser sustratos cristalinos planos tales como sustratos basados en sílice (por ejemplo, vidrio, cuarzo o similares), o sustratos cristalinos usados en, por ejemplo, las industrias de semiconductores y microprocesadores, tales como el silicio, el arseniuro de galio, el GaN dopado con indio y similares. Los aerogeles de sílice también pueden usarse como sustratos y pueden prepararse mediante cualquier método conocido. Los sustratos de aerogel pueden usarse como sustratos independientes o como un revestimiento de superficie para otro material de sustrato.

El sustrato puede tomar cualquier forma y típicamente es una placa, portaobjetos, perlas, gránulo, discos, partículas, micropartículas, nanopartículas, hebras, precipitados, gel poroso opcionalmente, láminas, tubos, esferas, contenedores, capilares, almohadillas, cortes, película, chip, placa o plato de múltiples pocillos, fibra óptica, etcétera. El sustrato puede ser cualquier forma que sea rígida o semirrígida. El sustrato puede contener regiones elevadas o deprimidas en las que se ubica un componente de ensayo. La superficie del sustrato puede grabarse mediante el uso de técnicas bien conocidas para proporcionar características de superficie deseadas, por ejemplo, zanjas, ranuras en V, estructuras mesa, o similares. El sustrato puede tomar la forma de un fotodiodo, un sensor optoelectrónico tal como un chip semiconductor optoelectrónico o un semiconductor optoelectrónico de película delgada, o un biochip. La(s) ubicación(es) del(de los) electrodo(s) en el sustrato puede ser direccionable; esto puede hacerse en formatos muy densos, y la(s) ubicación(es) puede ser microdireccionable o nanodireccionable. En algunos ejemplos, el(los) electrodo(s) están en un chip microfabricado.

Las superficies en el sustrato pueden estar compuestas del mismo material que el sustrato o pueden hacerse de un material diferente, y pueden acoplarse al sustrato por medios químicos o físicos. Dichas superficies acopladas pueden estar compuestas por cualquiera de una variedad amplia de materiales, por ejemplo, polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales basados en sílice, carbono, metales, vidrios inorgánicos, membranas o cualquiera de los materiales de sustratos enumerados anteriormente.

El sustrato y/o su superficie es resistente generalmente a, o se trata para resistir, las condiciones a las que debe exponerse en uso, y puede tratarse opcionalmente para eliminar cualquier material resistente después de la exposición a dichas condiciones.

III. Enlazadores

En un ejemplo, el electrodo comprende un enlazador en la superficie del electrodo. Los enlazadores, en algunos ejemplos, pueden formarse cuando las moléculas enlazadoras se absorben y se organizan en una capa molecular sobre una superficie. Los enlazadores adecuados para su uso con los electrodos descritos en la presente descripción tienen un "grupo principal" que se adsorbe químicamente con metales (por ejemplo, tioles y disulfuros) y una cola con un grupo funcional (por ejemplo, -OH, -NH2, -COOH, -CO, -OCH3, -NHNH2, -biotina, -NHS (N-hidroxisuccimida reactiva con aminas)). Los ejemplos de enlazadores incluyen alquiltioles de cadena simple o cadena ramificada con un grupo funcional. Otras moléculas enlazadoras incluyen tioles aromáticos tales como el tiofenol con un grupo funcional. Las moléculas enlazadoras adecuadas incluyen cualquier molécula con un grupo funcional que pueda unirse directa o indirectamente a un anticuerpo. Las moléculas enlazadoras ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, cistamina, cisteamina, ácido mercapto propiónico o 4-aminotiofenol. En algunos ejemplos, el enlazador es cistamina.

Los enlazadores se forman en la superficie del electrodo cuando el electrodo se sumerge en una solución de la molécula enlazadora. Las concentraciones típicas contienen aproximadamente 0,01 mM, 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 50 mM o más de la molécula enlazadora en una solución acuosa o etanólica. La inmersión es durante un período de tiempo que oscila desde unas pocas horas hasta días. En algunos ejemplos, la inmersión es de aproximadamente 4 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 5 días o aproximadamente 7 días. En algunos ejemplos, la inmersión es a temperatura ambiente. En otros ejemplos, la inmersión es por encima de la temperatura ambiente. En otros ejemplos, la inmersión es más baja que la temperatura ambiente.

Los enlazadores pueden unirse directa o indirectamente a un anticuerpo mediante cualquier método conocido. La unión directa puede, en algunos ejemplos, lograrse a través de los grupos funcionales de las moléculas enlazadoras, tales como los grupos funcionales -CO que pueden reaccionar y unirse a los anticuerpos. Alternativamente, un segundo enlazador o espaciador puede conjugarse con el grupo funcional mediante el cual el segundo enlazador o espaciador puede unirse de esta manera al anticuerpo, en otros ejemplos. Por ejemplo, las moléculas enlazadoras con grupos funcionales -NH pueden reaccionar con un enlazador tal como el glutaraldehído o el formaldehído el cual a su vez puede unirse a los anticuerpos. En otros ejemplos, el anticuerpo puede derivarse para interactuar con el grupo funcional. Por ejemplo, un anticuerpo marcado con avidina puede unirse a un grupo funcional de biotina de un enlazador. Estos y otros ejemplos de enlace directo e indirecto se describen en la presente descripción.

IV. Anticuerpos

En un aspecto, se usa un anticuerpo para determinar la cantidad y/o concentración de un analito objetivo. Los anticuerpos pertenecen a una familia de proteínas plasmáticas llamadas inmunoglobulinas, cuya unidad estructural básica, el pliegue o dominio de inmunoglobulina, se usa en diversas formas en muchas moléculas del sistema inmunitario y en otros sistemas de reconocimiento biológico. Una inmunoglobulina típica tiene cuatro cadenas polipeptídicas, que contienen una región de unión a antígeno conocida como una región variable y una región no variable conocida como la región constante. Un anticuerpo que es adecuado para su uso en los presentes ejemplos en la presente descripción puede estar en cualquiera de una variedad de formas, lo que incluye sueros, una inmunoglobulina completa, un fragmento de anticuerpo tal como Fv, Fab y fragmentos similares, un anticuerpo de cadena única que incluye las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) del dominio variable, y formas similares, todas las cuales caen bajo el término amplio "anticuerpo", como se usa en la presente. Los presentes ejemplos en la presente descripción contemplan el uso de cualquier especificidad de un anticuerpo, policlonal o monoclonal, y no se limita a anticuerpos que reconocen e inmunorreaccionan con un antígeno específico. En algunos ejemplos en la presente descripción, en el contexto de los métodos terapéuticos y de selección, se usa un anticuerpo o fragmento de este que es inmunoespecífico para un analito objetivo.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos homogéneos sustancialmente, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigen contra un sitio antigénico único. Además, por el contrario de las preparaciones de anticuerpos convencionales policlonales, las que incluyen típicamente anticuerpos diferentes, dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales en la presente descripción incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Núm. 4,816,567; Morrison y otros Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855 (1984).

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región variable o de unión al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, llamado así por su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos fragmentos de unión al antígeno los cuales son capaces de reticular al antígeno, y otro fragmento residual (el cual se denomina pFc'). Los fragmentos adicionales pueden incluir diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena única y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Como se usa en la presente, "fragmento funcional" con respecto a anticuerpos, se refiere a los fragmentos Fv, F(ab) y F(ab')2.

Los fragmentos de anticuerpos conservan cierta capacidad para unirse selectivamente con su antígeno o receptor y se definen de la manera siguiente:

(1) Fab es el fragmento que contiene un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo. Un fragmento Fab puede producirse por digestión de un anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada.

(2) Fab' es el fragmento de una molécula de anticuerpo que puede obtenerse mediante el tratamiento del anticuerpo completo con pepsina, seguido por reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada. Se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.

(3) F(ab')2 es el fragmento de un anticuerpo que puede obtenerse mediante el tratamiento del anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción posterior. F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab' que se mantienen juntos mediante dos enlaces disulfuro.

(4) Fv es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y enlace de antígeno. Esta región consta de un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una ligera en una asociación estrecha y no covalente (dímero V^h V^l). Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V^h V^l. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de unión completo.

(5) Anticuerpo de cadena sencilla (SCA, por sus siglas en inglés), definida como una molécula modificada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada unidas por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula de cadena sencilla fusionada genéticamente. Dichos anticuerpos de cadena única también se denominan fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv". Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, eds. Rosenburg y Moore. Springer-Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994).

El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos núms. EP 404,097; WO 93/11161, y Hollinger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 6444-6448 (1993).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de complementariedad (CDR). Los péptidos de CDR ("unidades mínimas de reconocimiento") pueden obtenerse mediante la construcción de genes que codifiquen la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir de ARN de células productoras de anticuerpos. Ver, por ejemplo, Larrick, y otros, Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, página 106 (1991).

La generación y preparación de anticuerpos se realiza mediante cualquier método conocido. Ver, por ejemplo, Green, y otros, Production of Polyclonal Antisera, en: Immunochemical Protocols (Manson, ed.), página 15 (Humana Press); Coligan, y otros, Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats Mice and Hamsters, en: Current Protocols in Immunology, sección 2.4.1 (1992), para la generación y preparación de anticuerpos policlonales; Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975); Coligan, y otros, secciones 2.5.1-2.6.7; y Harlow, y otros, en: Antibodies: A Laboratory Manual, página 726 (Cold Spring Harbor Pub. (1988)), para la generación y preparación de anticuerpos monoclonales. Los métodos para generar fragmentos de anticuerpos pueden generarse de manera similar a los protocolos descritos en, por ejemplo, Harlowy Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (1988).

Los anticuerpos se unen al enlazador mediante cualquier método conocido. En algunos ejemplos, el anticuerpo puede unirse directamente a un grupo funcional seleccionado en el enlazador. En otros ejemplos, alternativamente, los anticuerpos pueden unirse indirectamente al enlazador mediante un segundo enlazador o espaciador.

V. Analitos detectables/biomarcadores y estados de enfermedad/usos

En un aspecto, el analito objetivo es una proteína. Existe un gran número de posibles analitos objetivo proteicos que pueden detectarse mediante el uso de los presentes ejemplos en la presente descripción. Por "proteínas" o equivalentes gramaticales en la presente descripción se entiende proteínas, oligopéptidos y péptidos, derivados y análogos, lo que incluye proteínas que contienen aminoácidos de origen no natural y análogos de aminoácidos, y estructuras peptidomiméticas. Las cadenas laterales pueden estar tanto en la configuración (R) como en la (S). En algunos ejemplos, los aminoácidos están en la configuración (S) o L.

Los analitos proteicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, (1) inmunoglobulinas, particularmente IgE, IgG e IgM, y anticuerpos particularmente terapéutica o diagnósticamente relevantes, lo que incluye, pero no se limita a, anticuerpos contra la albúmina humana, apolipoproteínas (lo que incluye la apolipoproteína E), gonadotropina coriónica humana, ^{cortisol, a-fetoproteína, tiroxina, hormona estimulante de la tiroides} (T^sH), ^{antitrombina, anticuerpos contra productos} farmacéuticos (lo que incluye fármacos antiepilépticos (fenitoína, primidona, carbariezepina, etosuximida, ácido valproico y fenobarbital) fármacos cardioactivos (digoxina, lidocaína, procainamida y disopiramida), broncodilatadores (teofilina), antibióticos (cloranfenicol, sulfonamidas), antidepresivos, inmunosupresores, drogas de abuso (anfetamina, metanfetamina, cannabinoides, cocaína y opiáceos) y anticuerpos contra cualquier número de virus (lo que incluye ortomixovirus, (por ejemplo, virus de la influenza), paramixovirus (por ejemplo, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, virus del sarampión), adenovirus, rinovirus, coronavirus, reovirus, togavirus (por ejemplo, virus de la rubéola), parvovirus, poxvirus (por ejemplo, virus de la viruela, virus vaccinia), enterovirus (por ejemplo, poliovirus, virus coxsackie), virus de la hepatitis (lo que incluye A, B y C), herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple, virus varicela zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr), rotavirus, virus de Norwalk, hantavirus, arenavirus, rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia), retrovirus (lo que incluye el VIH, HTLV-I y -II), papovavirus (por ejemplo, papilomavirus), poliomavirus y picornavirus y similares), y bacterias (lo que incluye una variedad amplia de procariotas patógenas y no patógenas de interés, lo que incluye Bacillus; Vibrio, por ejemplo V. cholerae; Escherichia, por ejemplo. E. coli enterotoxigénica, Shigella, por ejemplo, S. dysenteriae; Salmonella, por ejemplo, S. typhi, Mycobacterium por ejemplo M tuberculosis, M leprae; Clostridium, por ejemplo C. botulinum, C. tetani, C. difficile, C. perfringens; Corynebacterium, por ejemplo C. diphtheriae; Streptococcus, S. pyogenes, S. pneumoniae, Staphylococcus, por ejemplo, S. aureus; Haemophilus, por ejemplo H influenzae; Neisseria, por ejemplo N meningitidis, N gonorrhoeae; Yersinia, por ejemplo, G. lamblia, Y. pestis, Pseudomonas, por ejemplo, P. aeruginosa, P. putida; Chlamydia, por ejemplo C. trachomatis; Bordetella, por ejemplo, B. pertussis; Treponema, por ejemplo T. pallidum;; y similares); (2) enzimas (y otras proteínas), lo que incluye, pero no se limita a, enzimas usadas como indicadores de o tratamiento para enfermedades cardíacas, lo que incluye creatina quinasa, lactato deshidrogenasa, aspartato amino transferasa, troponina T, mioglobina, fibrinógeno, colesterol, triglicéridos, trombina, activador tisular del plasminógeno (tPA, por sus siglas en inglés); indicadores de enfermedad pancreática lo que incluye amilasa, lipasa, quimotripsina y tripsina; enzimas y proteínas de la función hepática lo que incluye colinesterasa, bilirrubina y fosfatasa alcalina; aldolasa, fosfatasa ácida prostática, desoxinucleotidil transferasa terminal y enzimas bacterianas y virales tales como la proteasa del VIH; (3) hormonas y citocinas (muchas de las cuales sirven como ligandos para los receptores celulares) tales como eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TPO), las interleucinas (lo que incluye IL-1 a IL-17), insulina, factores de crecimiento similares a la insulina (lo que incluye IGF-1 y -2), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento transformante (lo que incluye TGF-a y TGF-p, por sus siglas en inglés), hormona del crecimiento humana, transferrina, factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), lipoproteína de baja densidad, lipoproteína de alta densidad, leptina, VEGF, PDGF, factor neurotrófico ciliar, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH, por sus siglas en inglés), calcitonina, gonadotropina coriónica humana, cortisol, estradiol, hormona estimulante del folículo (FSH, por sus siglas en inglés), hormona estimulante de la tiroides (TSH, por sus siglas en inglés), hormona leutinizante (LH, por sus siglas en inglés), progesterona, testosterona; y (4) otras proteínas (lo que incluye las a-fetoproteínas, antígeno carcinoembrionario CEA, por sus siglas en inglés).

En algunos ejemplos, un analito proteico es un biomarcador para una enfermedad, trastorno o afección. Los biomarcadores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, (por ejemplo, PSA, BRCA1, BRCA1, Her2/neu, AFP (a-feto proteína), B2M (p-2 microglobulina), BTA (antígeno de tumor de vejiga), CA 15-3 (Antígeno de cáncer 15-3), CA 19-9 (antígeno de cáncer 19-9), hCG (gonadotropina coriónica humana), CA 72-4 (antígeno de cáncer 72-4), CA-125 (antígeno de cáncer 125), calcitonina, CEA (antígeno carcinoembrionario), EGFR (Her-1), receptores de estrógeno, receptores de progesterona, inmunoglobulinas monoclonales, NSE (enolasa específica de neuronas), NMP22, tiroglobulina, inmunoglobulinas monoclonales, NSE (enolasa de neuronas específicas), receptores de progesterona PSA (Antígeno prostático específico), total y libre, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA, por sus siglas en inglés), fosfatasa ácida prostática (PAP, por sus siglas en inglés), S-100 y TA-90, o una porción o variación o fragmento de estos. En ciertos casos, el biomarcador es un biomarcador para el cáncer. En otros casos, el biomarcador es un biomarcador para infecciones bacterianas. En otros casos, el biomarcador es un biomarcador para las infecciones bacterianas por Staphylococcus o Streptococcus.

VI. Muestras

Las muestras para los sistemas y métodos de detección descritos en la presente descripción pueden ser cualquier material sospechoso de contener un analito. En algunos ejemplos, la muestra puede ser cualquier fuente de material biológico que comprenda proteínas que puedan obtenerse a partir de un organismo vivo directa o indirectamente, lo que incluye células, tejidos o líquidos, y los depósitos dejados por ese organismo, lo que incluye virus, micoplasmas y fósiles. Típicamente, la muestra se obtiene o se dispersa en un medio acuoso predominantemente. Los ejemplos no limitantes de la muestra incluyen sangre, orina, semen, leche, esputo, moco, un hisopo bucal, un hisopo vaginal, un hisopo rectal, un aspirado, una biopsia con aguja, una sección de tejido obtenida, por ejemplo, mediante cirugía o autopsia, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secreciones externas de la piel, tracto respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, tumores, órganos, muestras de constituyentes de cultivos de células in vitro (lo que incluye, pero no se limita a, medios condicionados resultantes del crecimiento de células en medio de cultivo celular, células infectadas supuestamente por virus, células recombinantes y componentes celulares), y una biblioteca recombinante que comprende proteínas, péptidos y similares.

La muestra puede ser una muestra de control positivo que se conoce que contiene un analito objetivo. Además, puede usarse una muestra de control negativo que, aunque no se espera que contenga el analito, se sospecha que lo contiene (a través de la contaminación de uno o más de los reactivos) u otro componente capaz de producir un falso positivo, y se prueba para confirmar la falta de contaminación por el analito objetivo de los reactivos usados en un ensayo dado, así como también para determinar si un conjunto dado de condiciones de ensayo produce falsos positivos (una señal positiva incluso en ausencia de analito objetivo en la muestra).

La muestra puede diluirse, disolverse, suspenderse, extraerse o tratarse de cualquier otra manera para solubilizar y/o purificar cualquier analito objetivo presente o para hacerla accesible a los reactivos que se usan en un esquema de amplificación o a los reactivos de detección. Cuando la muestra contiene células, las células pueden lisarse o permeabilizarse para liberar los polinucleótidos dentro de las células. Pueden usarse tampones de permeabilización de una etapa para lisar células que permiten realizar etapas adicionales directamente después de la lisis, por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa.

VII. Dispositivos para el uso, sistemas de tres electrodos, métodos de escaneo

La transferencia de electrones se inicia generalmente de manera electrónica, con la aplicación de al menos un primer potencial eléctrico aplicado al sistema que comprende el electrodo y el indicador redox. El control preciso y las variaciones en el potencial aplicado pueden ser a través de un potenciostato y un sistema de tres electrodos (uno de referencia, una muestra (o de trabajo) y un contraelectrodo) o un sistema de dos electrodos (una muestra y un contraelectrodo). En algunos ejemplos, un potenciostato con un sistema de tres electrodos se emplea con un electrodo de referencia Ag/AgCl y un electrodo auxiliar de alambre de platino. Las señales eléctricas pueden medirse mediante voltametría cíclica o mediante voltametría de pulso diferencial. En ciertos casos, las señales eléctricas se miden mediante voltametría cíclica a una velocidad de exploración de aproximadamente 50 m/v, de aproximadamente 80 m/v, de aproximadamente 100 m/v, de aproximadamente 120 m/v, o de aproximadamente 150 m/v. En otros casos, las señales eléctricas se miden mediante voltametría de pulso diferencial con una etapa potencial de aproximadamente 1-5 mV o aproximadamente 2-10 mV, amplitud de pulso de aproximadamente 25-50 mV o aproximadamente 40-75 mV, pulso de aproximadamente 25-50 ms o aproximadamente 40-75 ms, y un período de pulso de aproximadamente 10-100 ms o aproximadamente 25-150 ms o aproximadamente 50-200 ms.

En otros casos, pueden usarse otros medios para detectar potenciales electroquímicos, lo que incluye, pero no se limita a, potenciométricos, amperométricos, voltametría de pulso, voltametría cíclica, respuesta de frecuencia de banda ancha, impedancia u otros métodos electroquímicos para transducir señales de salida a partir de los electrodos modificados electroquímicamente de los sistemas y métodos descritos en la presente descripción.

VIII. Kits

Además, se proporcionan kits que comprenden componentes para los sistemas descritos y para realizar los métodos descritos. En algunos ejemplos, un kit comprende uno o más de los siguientes componentes lo que incluye un electrodo, reactivos para formar un enlazador en la superficie del electrodo, uno o más anticuerpos y un indicador redox. Los componentes de un kit pueden retenerse mediante una carcasa. Las instrucciones para usar el kit para realizar un método descrito pueden proporcionarse con la carcasa y pueden proporcionarse en cualquier medio fijo. Las instrucciones pueden ubicarse dentro de la carcasa o fuera de la carcasa, y pueden estar impresas en el interior o exterior de cualquier superficie que forme la carcasa que haga que las instrucciones sean legibles. Un kit puede estar en forma de multiplex para la detección de uno o más analitos objetivo diferentes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación de electrodos y enlazadores

Los chips se limpian por sonicación en acetona durante 5 min, se enjuagan con alcohol isopropílico y agua desionizada durante 30 s, y se secan con un flujo de aire. La electrodeposición se realiza a temperatura ambiente; se usan aberturas de 5 |jm en los electrodos fabricados como electrodos de trabajo y se ponen en contacto mediante el uso de las almohadillas de unión expuestas. Los sensores de oro (Au) se fabrican mediante el uso de una solución de deposición que contiene una solución 20 mM de HAuCU y HCl 0,5 M. Los sensores de Au se forman mediante el uso de amperometría de potencial de DC a aproximadamente 0-250 mV durante aproximadamente 100-300 s. Alternativamente, las estructuras de Au también pueden formarse mediante el uso de cronopotenciometría, por ejemplo a aproximadamente 15-40 nA durante aproximadamente 25-60 s.

Ejemplo 2: Acoplamiento de anticuerpos a enlazadores

Se aplica una solución acuosa que contiene 1-50 mM de 4-aminotiofenol o ácido mercapto propiónico durante 10-20 h a temperatura ambiente en sensores AU. Después, los sensores se lavan con agua DI 2-3 veces durante 2-4 minutos. Los sensores tratados se dejaron reaccionar a temperatura ambiente con glutaraldehído al 1,5-3,0 % en agua durante 1 h seguido de lavado con agua DI 2-3 veces durante 2-4 minutos. Después, los sensores funcionalizados se hacen reaccionar con PBS que contiene 5-25 jg/ml de anticuerpo a temperatura ambiente durante 1-2 h. Los sensores se lavan con PBS 2-3 veces durante 3-6 minutos. Los grupos aldehído sin reaccionar se bloquean con PBS que contiene albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) al 1 % (P/V) durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Después, los sensores se lavan 3-4 veces con PBS durante 4-7 minutos.

Ejemplo 3: Detección de biomarcadores de cáncer. CA-125

El desarrollo de plataformas para la medición sensible y directa de los niveles de proteínas en muestras clínicas es un objetivo importante que facilitará el uso expandido de biomarcadores de proteínas en el diagnóstico de enfermedades. Para proporcionar información útil, los esquemas de detección deben exhibir niveles altos de especificidad, límites bajos de detección y un rendimiento robusto en fluidos biológicos como sangre y suero. Dada la aparición de señales de identificación de proteínas múltiples para el cáncer y otras enfermedades, la multiplexación también es un elemento valioso. La inclusión de controles internos y externos y calibradores también requiere multiplexación.

El CA-125 es un antígeno epitelial que se ha usado como marcador para la detección del cáncer de ovario. Se han desarrollado varios ensayos para detectar el CA-125, pero la mayoría no es ideal debido a la falta de sensibilidad o la complejidad del procedimiento de detección. El inmunoensayo para CA-125 disponible comercialmente tiene un límite de detección de 15 U/ml, que es suficiente para detectar niveles de CA-125 que se correlacionan con la presencia de la enfermedad (35 U/ml), pero no permite estudiar con precisión la relevancia de niveles significativamente más bajos. El sistema para la detección de proteínas descrito en la presente descripción se adaptó para detectar electroquímicamente un biomarcador de cáncer CA-125 presente comúnmente en los cánceres de ovario, mediante un sensor de microelectrodo en un diseño en un solo chip. Los chips del sensor permiten la comparación de sensores de electrodos de diferentes tamaños, así como también la determinación de un límite de detección expuesto hasta 0,1 U/ml. La lectura se realizó en una sola etapa que involucró la introducción de un grupo indicador redox unido de forma no covalente. El sistema de detección informado presentado fue específico, con análisis del CA-125 en suero humano. La multiplexación del sistema permitió que el análisis del biomarcador se realizara en paralelo con una proteína sérica abundante, la albúmina sérica humana (HSA), para la calibración interna.

Materiales. El antígeno CA-125 y suero humano de donantes AB, anticuerpo anti-albúmina sérica humana (HSA), solución de HAuCU, ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]), ferrocianuro de potasio trihidratado (K2[Fe(CN)6.3H2O), glutaraldehído al 50 % (p/p) y la cistamina se adquirieron en Sigma-Aldrich. El anticuerpo anti-CA-125 se obtuvo de KalGene Pharmaceuticals Inc., Canadá. La acetona de grado ACS y el alcohol isopropílico (IPA, por sus siglas en inglés) se obtuvieron de EMD (EE.UU.); el ácido clorhídrico 6 N se adquirió de VWR (EE.UU.). La solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4, IX) se obtuvo de Invitrogen. La sangre entera humana se obtuvo de Bioreclaimation (Westbury, NY).

Fabricación de chips y electrodos: Los chips se fabricaron en el Canadian Photonics Fabrication Center. En resumen, las obleas de silicio de tres pulgadas se pasivaron mediante el uso de una capa gruesa de dióxido de silicio crecido térmicamente. Una capa de oro de 350 nm se depositó en el chip mediante el uso de evaporación de oro asistida por haz de electrones. La película de oro se modeló mediante el uso de fotolitografía estándar y un proceso de levantamiento (lift-off). Se depositó una capa de dióxido de silicio aislante de 500 nm mediante el uso de deposición química de vapor; se imprimieron aberturas de 5 jm en los electrodos mediante el uso de fotolitografía estándar y se expusieron almohadillas de unión de 2 mm x 2 mm mediante el uso de fotolitografía estándar. La Figura 1a representa una fotografía de un chip de sensor ilustrativo (izquierda) y capas representativas (derecha).

Los chips se limpiaron mediante sonicación en acetona durante 5 min, se enjuagaron con alcohol isopropílico y agua DI durante 30 s y se secaron con un flujo de aire. La electrodeposición se realizó a temperatura ambiente; se usaron aberturas de 5 jm en los sensores de electrodos fabricados como electrodos de trabajo y se pusieron en contacto mediante el uso de las almohadillas de unión expuestas. Se fabricaron tres sensores de electrodo de oro diferentes mediante el uso de una solución de deposición que contiene una solución de HAuCU 20 mM y HCl 0,5 M mediante el uso de un proceso similar al procedimiento como se describió en la Solicitud Internacional núm. de serie PCT/CA2009/001212 (publicada como documento WO 2010/025547). Las estructuras de los electrodos de oro de 100 micras y 30 micras se formaron mediante el uso de una amperometría de potencial DC a 0 mV durante 200 s y 150 mV durante 200 s, respectivamente; y se formaron estructuras de electrodo de oro de 8 micras mediante el uso de cronopotenciometría a 30 nA durante 50 s. Las Figuras 2a, 2c y 2e representan imágenes SEM de las estructuras de los electrodos de oro de 100 micras, 30 micras y 8 micras, respectivamente.

Determinación del área superficial de los sensores. El área superficial de los sensores de Au se calculó mediante la integración del área del pico de reducción de óxido de Au obtenida del voltamograma cíclico en H2SO450 mM. En el barrido inicial, se forma una monocapa de oxígeno adsorbido químicamente y después se reduce en el barrido inverso. La carga de reducción por área de unidad microscópica se ha determinado experimentalmente como 500 pC/cm2 geométrico. El área superficial se calculó mediante la integración del pico de reducción (aprox. 0,812 V frente a Ag/AgCl) para obtener la carga de reducción, y la división de esta por 500 pC/cm2 geométrico.

Modificación de anticuerpos de los electrodos: Se aplicó una solución acuosa que contenía cistamina 10 mM durante 16 horas a temperatura ambiente en sensores de electrodo de oro para formar un enlazador uniforme en la superficie de los electrodos. Después, los electrodos se lavaron con agua DI dos veces durante 2 minutos. Se dejó reaccionar el enlazador a temperatura ambiente con glutaraldehído al 2,5 % en agua durante 1 h, seguido de lavado con agua DI dos veces durante 2 minutos. Los electrodos funcionalizados se hicieron reaccionar con PBS que contenía 10 pg/ml de anticuerpo anti-CA-125 o anticuerpo anti-albúmina sérica humana (HSA) a temperatura ambiente durante 1 h. Los electrodos se lavaron con PBS dos veces durante 5 minutos. Los grupos de aldehído sin reaccionar se bloquearon con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1 % (P/V) (BSA). Después, los electrodos se lavaron tres veces con PBS durante 5 min. Se aplicaron soluciones que contenían diferentes concentraciones de CA-125 en PBS o suero al electrodo modificado con anticuerpo durante 40 min a 37 °C. Los electrodos se lavaron con PBS antes de la lectura electroquímica.

Análisis electroquímico y microscopía electrónica de barrido (SEM, por sus siglas en inglés): Los experimentos electroquímicos se llevaron a cabo mediante el uso de un potenciostato Epsilon de Bioanalytical Systems con un sistema de tres electrodos que presenta un electrodo de referencia Ag/AgCl y un electrodo auxiliar de alambre de platino. Las señales electroquímicas se midieron en solución tamponada de fosfato 10 mM (pH 7) que contenía K3[Fe(CN)6] 2,5 mM, K2[Fe(CN)6] 2,5 mM y KCl 0,1 M. La voltametría cíclica (CV) se obtuvo con una velocidad de barrido de 100 mV/s y las señales de voltametría diferencial (DPV, por sus siglas en inglés) se obtuvieron con una etapa potencial de 5 mV, una amplitud de pulso de 50 mV, un pulso de 50 ms y un período de pulso de 100 ms. Los cambios de señal correspondientes a la unión de la proteína objetivo al anticuerpo se calcularon de la manera siguiente: AI% = {(I0 media) - (Ic media)}/Iü media * 100 (donde I0 media= corriente media a concentración de objetivo cero, Ic media= corriente media en cualquier concentración de objetivo). Las imágenes SEM se obtuvieron mediante el uso de un Hitachi SEM S-3400.

Tres estructuras diferentes se fabricaron en chips mediante el uso de diferentes métodos y condiciones electroquímicas. Se generaron sensores de 100 micras (Figura 2a), 30 micras (Figura 2c) y 8 micras (Figura 2e) mediante la variación de las condiciones de electrodeposición. Las áreas superficiales de los sensores se midieron mediante barrido en ácido sulfúrico y mediante la medición de la cantidad de óxido formado y eliminado de la superficie, y se obtuvieron áreas de aproximadamente 4x10'6 cm2 (sensor de 8 micras), 3x10'5 cm2 (sensor de 30 micras), y 1x10'4 cm2 (sensor de 100 micras). Las corrientes capacitivas medidas en solución tampón (Figura 2g) fueron consistentes con estos valores. Antes de probar los sensores para la detección de proteínas, se obtuvieron voltamogramas cíclicos para cada estructura en una solución que contenía ferrocianuro y ferricianuro (Fig. 2b, 2d y 2f). El sensor de 100 micras mostró corrientes limitadas por la difusión y los sensores de 8 y 30 micras mostraron corrientes de meseta consistentes con las esperadas para los microelectrodos.

Los límites de detección de los inmunosensores formados en los tres sensores de tamaños diferentes se evaluaron mediante la medición de voltamogramas de pulso diferencial (DPV) de soluciones de [Fe(CN)6]3-/4- antes y después de la incubación con CA-125 durante 40 minutos. Con los sensores más grandes (Figura 3a), se requerían concentraciones de 10 U/ml para cambios de señal apreciables. Con los sensores intermedios de 30 micras, el límite de detección se acercó a 1 U/ml (Figura 3b). Con los sensores más pequeños, de 8 micras, se detectaron 0,1 U/ml de CA-125 (Figura 3c). 0,1 U/ml de antígeno CA-125 es equivalente a ~ 500 fM de CA-125 o 100 pg/ml.

Para evaluar el sistema de detección ilustrativo con fluidos biológicos, se realizó la detección de muestras de CA-125 en suero humano. El suero es un fluido biológico altamente complejo que contiene cantidades grandes de proteínas y otras moléculas. La albúmina sérica humana (HSA) se eligió como un estándar interno debido a las concentraciones constantes y altas de HSA en el suero humano. En un chip de sensor de multiplexado, se desarrollaron inmunosensores para CA-125 y HSA mediante la formación de una capa de anticuerpo anti-CA-125 y anticuerpo anti-HSA respectivamente (Figura 1a). Se aplicó suero humano enriquecido con concentraciones diferentes de CA-125 al inmunosensor multiplexado y se registraron los DPV en una solución mixta de ferrocianuro y ferricianuro. La Fig. 5a muestra los valores de AI% (con respecto al suero con CA-1250 U/ml) obtenidos para suero humano enriquecido con concentraciones diferentes de CA-125. El AI% para sensores modificados con anticuerpo anti-CA-125 aumentó con concentraciones crecientes de CA-125, mientras que el AI% para HSA fue constante esencialmente para los inmunosensores modificados con anticuerpo anti-HSA. La detección de CA-125 en paralelo con una proteína sérica es un medio útil para proporcionar mediciones absolutas del biomarcador del cáncer.

El rendimiento de este sistema de detección también se investigó en sangre completa, sin procesar. Las muestras de sangre se enriquecieron con CA-125 y el análisis se realizó de la misma manera que los estudios con suero y tampón. Curiosamente, se obtuvo el mismo límite de detección, con 0,1 U/ml resuelto claramente sobre los niveles de fondo como se muestra en la Figura 5b. Este nivel de sensibilidad alcanzado con una muestra de sangre sin procesar indica que este sencillo y directo ensayo electroquímico de detección de proteínas también es notablemente robusto.

La tabla siguiente muestra el límite de detección aproximado de CA-125 para varios tamaños de electrodos:

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Aunque las modalidades preferidas de la presente invención se demostraron y describieron en la presente descripción, será obvio para aquellos expertos en la técnica que dichas modalidades se proporcionan sólo a manera de ejemplo. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se le ocurrirán ahora a los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las modalidades de la invención descritas en la presente en la práctica de la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que estén cubiertos de ese modo los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de detección para detectar electroquímicamente el antígeno de cáncer 125 (CA-125), que comprende:

un microelectrodo que incluye un enlazador en su superficie, en donde el enlazador se une a un anticuerpo o fragmento de este capaz de unirse al CA-125, el microelectrodo tiene un diámetro de 100 micras o menos; y un indicador redox capaz de transferir electrones con el microelectrodo, en donde la unión de CA-125 al anticuerpo o fragmento de este impide la transferencia de electrones entre el indicador redox y el microelectrodo.

2. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, en donde el enlazador comprende un grupo funcional capaz de acoplarse directa o indirectamente al anticuerpo o fragmento de este.

3. El sistema de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el enlazador se une al anticuerpo o fragmento de este mediante un segundo enlazador.

4. El sistema de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el enlazador se une con múltiples copias de un anticuerpo o fragmento de este.

5. El sistema de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el indicador redox es capaz de generar una señal electroquímica con el microelectrodo cuando se aplica un potencial.

6. El sistema de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el indicador redox es capaz de transferencia de electrones interfacial.

7. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además:

una unidad de detección configurada para, mediante voltametría, medir una primera señal de línea base que tiene una primera magnitud en ausencia de CA-125 y una segunda señal después de la unión de CA-125 al anticuerpo, en donde la segunda señal tiene una magnitud menor que la primera señal.

8. El sistema de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el microelectrodo tiene un tamaño de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 50 micras.

9. Un método para la detección electroquímica del antígeno de cáncer 125 (CA-125), que comprende:

proporcionar un primer microelectrodo que incluye un enlazador en su superficie, el enlazador se une a un anticuerpo o fragmento de este;

poner en contacto el primer microelectrodo con una muestra que incluye CA-125 y con un indicador redox, en donde la unión de CA-125 al anticuerpo o fragmento de este impide la transferencia de electrones entre el indicador redox y el primer microelectrodo, el primer microelectrodo tiene un diámetro de 100 micras o menos, el microelectrodo tiene un límite de detección para CA-125 de 0,1 U/ml a 10 U/ml;

aplicar un potencial al primer microelectrodo;

medir, en respuesta al potencial aplicado, una primera señal electroquímica generada por el primer microelectrodo; y

comparar la primera señal electroquímica con una muestra control;

en donde un cambio de la primera señal electroquímica detectada con relación a la señal control es indicativo de la presencia de CA-125 en la muestra.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el enlazador incluye un grupo funcional capaz de acoplarse directa o indirectamente con el anticuerpo o fragmento de este.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde el microelectrodo se marca con múltiples copias del anticuerpo o fragmento de este.

12. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el microelectrodo es un microelectrodo nanoestructurado.

13. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde el microelectrodo tiene un tamaño de entre aproximadamente 1 a 50 micras.

14. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en donde la etapa de medición es mediante voltametría.

15. El método de conformidad con la reivindicación 9, que comprende además:

proporcionar un segundo microelectrodo que incluye un segundo enlazador en su superficie, el segundo enlazador se une a un segundo anticuerpo o fragmento de este;

poner en contacto el segundo microelectrodo con la muestra y con el indicador redox, el segundo enlazador se une al segundo anticuerpo o fragmento de este y es capaz de unirse a un segundo analito proteico de la muestra, y este segundo analito proteico es diferente al CA-125;

aplicar el potencial al segundo microelectrodo;

medir, en respuesta al potencial aplicado, una segunda señal electroquímica generada por el segundo microelectrodo; y

comparar la segunda señal electroquímica con respecto a una segunda señal control;

en donde un cambio de la segunda señal electroquímica detectada con relación a la segunda señal control es indicativo de la presencia del segundo analito proteico en la muestra.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde el primer y segundo microelectrodo están ambos en un chip microfabricado.

17. El método de conformidad con las reivindicaciones 15 o 16, en donde el segundo microelectrodo nanoestructurado es un control de referencia con respecto al primer microelectrodo marcado con anticuerpo.

18. Un método para monitorear la progresión o respuesta en un sujeto que tiene un cáncer mediante detección electroquímica del antígeno de cáncer 125 (CA-125) en una muestra biológica del sujeto, que comprende: proporcionar un microelectrodo que incluye un enlazador en su superficie, el enlazador se une a un anticuerpo o fragmento de este;

poner en contacto el microelectrodo con la muestra biológica y con un indicador redox, en donde la unión de CA-125 al anticuerpo o fragmento de este impide la transferencia de electrones entre el indicador redox y el microelectrodo, el microelectrodo tiene un diámetro de 100 micras o menos, el microelectrodo tiene un límite de detección para CA-125 de aproximadamente 0,1 U/ml a aproximadamente 10 U/ml;

aplicar un potencial al microelectrodo;

medir, en respuesta al potencial aplicado, una señal electroquímica generada por el microelectrodo; y comparar la señal electroquímica con respecto a una muestra control;

en donde un cambio de la señal electroquímica detectada con relación a la señal control es indicativo de la presencia de CA-125 en la muestra.