CN101268199A - 核酸扩增的检测 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用具有靶互补片段和可检测标签的探针检测靶多核苷酸序列的方法。通过切割可检测标签并将所述标签和偶联至电极的标签互补物结合，可检测与标签：标签互补物络合物的存在有关的电化学信号。

Description

核酸扩增的检测

本申请基于2005年7月15日提交的序列号60/699,950的美国临时专利申请和2005年12月9日提交的序列号60/749,003的美国临时专利申请，并根据美国法典第35编第119条要求它们的权益，由此它们各自通过引用并入本申请。

引言

核酸检测可通过多种测定形式进行。所述测定可为定性的，例如当用于评估生物样品时。然而，许多种生物应用可通过检测靶核酸的能力得以改进而不需要麻烦的印迹技术或光学方法通常所需的昂贵和精密的仪器。

附图简述

图1是根据本发明的一个实施方案描述与作为扩增子模板的多核苷酸序列杂交的示例扩增探针的示意图。

图2是描述切割来自杂交的核酸络合物的侧翼部分(flap moiety)的示意图。

图3是根据本发明的一个实施方案描述使用检测寡核苷酸检测聚合酶链式反应(PCR)的示意图。

图4是根据本发明的一个实施方案描述在扩增过程中能够自身引发其自身延伸的核酸序列的用途的示意图。

图5是根据本发明的一个实施方案描述包括含有标签序列的发夹环的核酸序列的示意图。

图6是根据本发明的一个实施方案描述在扩增过程中与检测寡核苷酸互补的可切割标签序列的用途的示意图。

图7是描述借助于切割的标签和电极表面的相互作用检测远距离切割位点的标签序列的示意图。

图8是根据本发明的一个实施方案的微流体系统的示意图。

图9显示了通过与对照反应比较进行的扩增子的电泳分析所证实的，标签序列的存在不影响靶序列的PCR扩增，如实施例1所述。

图10显示了标签序列的电化学检测，如实施例1所述。

图11显示了标签序列的电化学检测的另一个实例，如实施例2所述。

图12是描述在电极上经静电结合的氧化还原反应(redox)中心的标签检测的示意图，如实施例4所述。

图13是描述介导剂化合物的电化学反应的伏安图，如实施例7所述。

图14是化合物1和7的整合电荷(integrated charge)与DNA浓度的曲线图，如实施例7所述。

图15显示了化合物21的扩增探针的循环伏安图，如实施例10所述。

图16显示了化合物7的扩增探针的循环伏安图，如实施例10所述。

图17显示了标签序列1、2和3的切割和未切割的标签序列的检测之间的差异，如实施例11所述。

各实施方案的说明

该说明涉及用于检测靶多核苷酸序列的系统的方法。所述方法可包括在有效使探针形成探针-靶络合物的条件下使所述探针与包含至少一种靶多核苷酸序列的样品接触，其中所述探针自身包含靶互补片段和可检测标签。然后可从所述探针切割所述可检测标签，随后释放的标签与偶联至电极的标签互补物结合。由于固定化的标签：固定在电极上的标签互补物络合物而检测的电化学信号可与样品中靶多核苷酸序列的存在相关联。

在某些实施方案中，该说明包括一种用于检测核酸扩增的方法。在该方法中，参考图1，扩增探针10与作为用于多核苷酸扩增过程的扩增子模板或靶的多核苷酸序列12杂交。扩增探针10包括互补多核苷酸序列14和一个或多个检测标签16。在扩增过程中，酶作用切割互补序列的一个或多个检测标签。对切割的检测标签的检测又检测切割事件，并因此检测扩增子模板的复制，如图1所示。

本文所使用的“杂交”，是指两个多核苷酸序列通过两个序列的碱基间的氢键结合形成稳定的双链结构。即使两个序列非完全和严格互补，但其中一个序列可被认为“互补”于另一序列，条件是这两个序列包括足以使所产生的杂交物在标准实验室条件下稳定的互补区域。能够与扩增子模板至少大体上选择性杂交的任何互补序列是用于该方法目的的合适的互补序列。通常，所述互补序列由核苷酸和/或其类似物组成，具有足以赋予扩增探针至少一些结合特异性的长度。所述互补序列可包括RNA或DNA，或其混合物或杂交物。所述互补序列可包括天然核酸聚合物(生物来源)或合成的核酸聚合物(人工修饰或制备的)。

所述互补序列可具有任何合适的天然和/或人工结构。核酸可包括磷酸二酯骨架，使得核酸在中性pH的水溶液中具有负电荷。磷酸二酯骨架通常包括交替的糖和磷酸根部分(phosphate moieties)的糖-磷酸根骨架，核苷酸碱基(通常，嘌呤或嘧啶基团)与各糖部分(sugar moiety)连接。骨架中可包括任何糖，其中包括核糖(对于RNA)、脱氧核糖(对于DNA)、阿拉伯糖、己糖、2′-氟代核糖和/或糖的结构类似物。本发明教导内容中的核酸分析物和/或探针可为包括任何合适的可选骨架的类似物。示例的可选骨架可带有比磷酸二酯骨架少的负电荷并且可基本不带电荷(不带正电荷也不带负电荷)。示例的可选骨架可包括磷酰胺、磷硫酰、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺(methylphosphoroamidite)、肽核酸(包括N-(2-氨乙基)甘氨酸骨架单元)、锁核酸(参见，例如Koshkin等，Tetrahedron 54：3607-30(1998)，WO 98/39352，WO 99/14226，WO 00/56746，以及WO 99/60855，由此它们各自通过引用并入本申请)、带正电荷的骨架、非核糖骨架等。带有人工骨架和/或部分(moieties)的核酸可适于例如增加或减小总电荷，增加或减小碱基配对稳定性，增加或减小化学稳定性，或改变被试剂作用的能力，等等。在示例的实施方案中，带有减小的负电荷的核酸探针(例如肽核酸)可用于基于磷酸二酯的分析物以增加用于检测所述分析物的光学元件的灵敏度。

所述互补序列任选含有一个或多个修饰的碱基或连接键或含有非共价或共价连接的标记。例如，所述修饰的碱基可为天然存在的修饰的碱基或合成的改变的碱基。在核酸包括修饰的核苷酸碱基的情况中，所述碱基包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、肌苷、2-氨基腺嘌呤、2-硫胸腺嘧啶、3-甲基腺嘌呤、C5-溴尿嘧啶、C5-氟尿嘧啶、C5-碘尿嘧啶、C5-甲基胞嘧啶、7-去氮腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、8-氧腺嘌呤、8-氧鸟嘌呤、2-硫胞嘧啶、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿甙、2′-O-甲基胞苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2′-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖Q核苷、2′-O-甲基鸟苷、N6-异戊烯腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿苷、β-D-甘露糖基Q核苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲硫嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基氨甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷-4-硫尿苷、5-甲基尿苷N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-氨甲酰基)苏氨酸、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、wybutosine、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷以及(acp3)u。

除了存在一个或多个检测标签，所述探针还可包括反应性官能团，或被偶联的物质取代，以便于例如未切割的探针从组分混合物部分或完全去除。特别地，所述探针可被修饰以便于未切割的探针从切割的检测标签分离。例如，所述互补探针可在3′端使用生物素被修饰，使得切割的互补探针可被链霉亲和素修饰的表面或基质固定化。

通过检测切割的检测标签，可检测靶扩增子的复制。可使用适于本发明目的的任何方法进行探针切割。用于进行探针切割的示例的非限制性实例包括如本文进一步详细描述的5′-核酸酶方法(例如Gelfand等，美国专利5,210,015和5,487,972)，INVADER^TM方法(例如，Prudent等，美国专利5,985,557、5,994,069以及6,090,543)，以及FEN-LCR方法(例如Bi等，美国专利6,511,810)。在INVADER类格式中，提供了一对寡核苷酸，所述寡核苷酸结合靶多核苷酸中的邻近序列而形成切割络合物，其中第一寡核苷酸的靶互补部分的3′端与第二寡核苷酸的靶互补部分的5′端紧邻或重叠。该络合物被含有侧翼内切核酸酶活性(还已知为5′核酸酶活性)的酶识别，所述酶在邻近第一探针的靶互补片段的3′端核苷酸的5′端互补核苷酸的5′侧切割第二寡核苷酸。在其中第一探针含有与其靶互补序列的3′端连接的一个或多个互补的核苷酸的实施方案中，在5′端互补核苷酸的3′侧发生第二探针的切割。在某些实施方案中，切割的第二探针可被新的未切割的探针可取代而产生另外的切割的探针。在FEN-LCR方法中，第一和第二寡核苷酸可在第二寡核苷酸被切割以后连接在一起，产生线性或指数扩增的扩增子的新拷贝。可用于本发明的其他方法包括例如Walder(美国专利5,403,711)和Duck(美国专利5,011,769)所公开的探针切割方法，例如，其中使用RNA酶H切割含有RNA的探针，或其中可通过合适的内切核酸酶例如大肠杆菌(E.coli)的内切核酸酶IV切割含有无碱基(abasic)亚单位的探针。探针切割方法的另一个实例是当其被修饰包括可切割的探针与扩增的靶结合时的重组酶聚合酶扩增(RPA)，例如Piepenburg等(PLoSBiology 4：1115-1121(2006))和coworkers(例如，美国专利公布2005/0112631和PCT公布WO 03/072805)所描述的。其他切割方法和酶还公开于美国专利5,869,245(Yeung)和5,698,400(Cotton等)中。在所有情况中，探针切割产生可检测标签，所述标签含有一个或多个电化学部分、一个或多个用于随后检测的结合对，或者可使用例如本文所述的与可检测标签相互作用的电化学部分检测。

检测标签可包括一个或多个可检测标记18。对于可检测标记，是指可被检测和/或定量的任何部分。检测标签可被直接或间接检测。在检测标签被直接检测的情况中，检测标签任选包括可检测标记，例如电化学部分。

可选地，检测标签可被间接检测，例如通过检测标签与另外的检测试剂相互作用。例如，检测标签可包括特异性结合对的成员，例如标记抗体的半抗原，或被互补序列标记的核酸序列。检测标签可包括例如地高辛部分，其可用作电化学部分标记的抗体的靶。另外的检测试剂可包括电化学部分，使得所述试剂与检测标签的结合便于检测标签的电化学检测。

在某些实施方案中，本发明包括任选在电化学部分的存在下经电化学检测的靶扩增。所述电化学部分可作为检测标签上的标记被结合，或作为与检测标签相互作用的检测试剂存在。所述电化学部分可为可将电子转移至电极或自电极转移电子的任何部分。部分的选择取决于所选探针的特定组成。特别优选的部分包括过渡金属络合物。合适的过渡金属络合物包括例如，Ru²⁺(2，2′-二吡啶)₃(Ru(bpy)₃ ²⁺)，Ru²⁺(4，4′-二甲基-2，2′-二吡啶)₃(Ru(Me₂-bpy)₃ ²⁺)，Ru²⁺(5，6-二甲基-1，10-菲咯啉)₃(Ru(Me₂-phen)₃ ²⁺)，Fe²⁺(2，2′-二吡啶)₃(Fe(bpy)₃ ²⁺)，Fe²⁺(5-氯菲咯啉)₃(Fe(5-Cl-phen)₃ ²⁺)，Os²⁺(5-氯菲咯啉)₃(Os(5-Cl-phen)₃ ²⁺)，Os²⁺(2，2′-二吡啶)₂(咪唑基)，二氧化铼¹⁺磷化氢，以及二氧化铼¹⁺吡啶(ReO₂(Py)₄ ¹⁺)。某些可用作部分的阴离子络合物为：Ru(bpy)((SO₃)₂-bpy)₂ ^2-和Ru(bpy)((CO₂)₂-bpy)₂ ^2-，某些可用作部分的两性离子络合物为Ru(bpy)₂((SO₃)₂-bpy)和Ru(bpy)₂((CO₂)₂-bpy)，其中，(SO₃)₂-bpy₂-为4，4′-二磺酸根合-2，2′-二吡啶，(CO₂)₂-bpy₂-为4，4′-二羧基-2，2′-二吡啶。吡啶、联吡啶(bypyridine)以及菲咯啉基团的合适的取代衍生物可与任何前面的金属一起应用于络合物中。其中，合适的取代衍生物包括但不限于4-氨基吡啶、4-二甲基吡啶、4-乙酰基吡啶、4-硝基吡啶、4，4′-二氨基-2，2′-二吡啶、5，5′-二氨基-2，2′-二吡啶、6，6′-二氨基-2，2′-二吡啶、4，4′-二乙烯二胺-2，2′-二吡啶、5，5′-二乙烯二胺-2，2′-二吡啶、6，6′-二乙烯二胺-2，2′-二吡啶、4，4′-二羟基-2，2′-二吡啶、5，5′-二羟基-2，2′-二吡啶、6，6′-二羟基-2，2′-二吡啶、4，4′，4″-三氨基-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三乙烯二胺-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三羟基-2，2′，2′-三吡啶、4，4′，4″-三硝基-2，2′，2″-三吡啶、4，4′，4″-三苯基-2，2′，2″-三吡啶、4，7-二氨基-1，10-菲咯啉、3，8-二氨基-1，10-菲咯啉、4，7-二乙烯二胺-1，10-菲咯啉、3，8-二乙烯二胺-1，10-菲咯啉、4，7-二羟基-1，10-菲咯啉、3，8-二羟基-1，10-菲咯啉、4，7-二硝基-1，10-菲咯啉、3，8-二硝基-1，10-菲咯啉、4，7-二苯基-1，10-菲咯啉、3，8-二苯基-1，10-菲咯啉、4，7-二精胺-1，10-菲咯啉、3，8-二精胺-1，10-菲咯啉、二吡啶并[3，2-a：2′，2′-c]吩嗪，以及6，6′-二氯-2，2′-二吡啶。

为了便于检测，由探针切割产生的检测标签可从未切割的探针分离。分离步骤可通过简单的扩散，其中检测标签或互补序列在适当的位置连接或结合，使得切割的产物可扩散。可选地，或另外，一种或多种切割的产物，或未切割的探针可从反应混合物机械分离。一方面，互补序列包括官能团，例如生物素，其便于从反应混合物去除互补序列，并因此去除未切割的探针。在使用生物素部分官能化互补序列的情况中，将反应混合物与链霉亲和素包被的珠混合，或使反应混合物通过链霉亲和素修饰的基质，可例如捕获互补序列和未切割的探针并便于检测未切割的检测标签。

在某些实施方案中，检测标签包括标签序列。所述标签序列可包括多核苷酸，并可包括上述用于互补序列的任何核酸组合物。在某些实施方案中，选择所述标签序列使得其不与扩增子模板杂交或与其结合。另外，所述标签序列通常通过由酶作用切割的连接与互补探针连接。优选地，所述标签序列可通过便于核酸扩增、特别是扩增子模板的扩增例如PCR的酶切割。例如，可通过DNA聚合酶的5′核酸酶活性容易地从探针切割所述标签序列。在某些实施方案中，所述标签序列和所述互补序列均为DNA序列。例如，所述标签序列可包括约14至约40个碱基。可选地，所标签序列可包括约14至约20个碱基。在该方法的一个特别方面，所述标签序列为19个碱基长。

在某些实施方案中，可使用含有5′-内切核酸酶或5′-外切核酸酶活性的酶从合适的杂交络合物去除侧翼部分而产生所述标签序列，所述酶例如具有所述活性的侧翼内切核酸酶或DNA聚合酶。例如，所述络合物可具有图2所示的方案中A示例的形式。

图2中被指定为A的络合物(“切割络合物”)包括作为或含有靶序列(“扩增子模板”)的多核苷酸链(“靶链”)，本文以从左至右的3′至5′方向描述。与扩增子模板的3′侧杂交的是具有络合物A左侧的5′端和3′端(未标记)的上游多核苷酸。在某些实施方案中，上游多核苷酸可在聚合酶链式反应(PCR)过程中通过引物延伸原位产生。在其他实施方案中，上游多核苷酸可作为无进一步修饰或延伸的完整物质提供。在扩增子模板的右(5′)侧杂交的是含有结合模板的片段和标签序列(或简单地称“标签”)的可切割探针，其中，结合模板的片段与扩增子模板中的互补序列杂交，标签序列不与扩增子模板杂交而与可切割探针的结合模板的片段的5′端连接。如上所述的切割络合物与合适的酶的反应提供了包括扩增子模板、上游多核苷酸以及来自可切割探针的结合模板的片段的切割络合物(图2中指定为B)。还产生了标签序列，如本文进一步所述，其可从用于随后检测的络合物释放。

在某些实施方案中，标签序列可在5′核酸酶聚合酶链式反应中产生。提供了含有与待扩增的双链体靶序列的相对末端互补的第一引物和第二引物的反应混合物，使得第一引物可通过聚合酶介导的引物延伸引发与第一引物所杂交的扩增子模板链互补的链的合成，并且第二引物可通过聚合酶介导的引物延伸引发扩增子模板链或其拷贝的聚合酶介导的合成。所述反应混合物还包括如上所述的切割探针，所述切割探针具有结合扩增子模板的片段，所述片段结合位于第一和第二引物结合的序列之间的扩增子模板中的互补序列。当存在三磷酸核苷酸时，优选在其3′端致使所述切割探针非可延伸，例如通过使用氢、氟、氨基或其他非羟基部分取代3′端核苷酸亚单位的核糖或脱氧核糖的3′羟基，或通过使用封闭基团例如3′氨基、3′氟、3′H、3′-磷酸根、3′甲基、3′叔丁基或3′三苯甲基封闭3′羟基。

例如，当第一引物和切割探针均与扩增子模板链杂交时，可在三磷酸核苷酸(NTP)例如ATP、CTP、GTP或TTP或其类似物的存在下使用具有5′核酸酶活性的依赖模板的DNA聚合酶延伸所述引物。当延伸所述引物使得其3′端与所述切割探针的5′端邻近或重叠时(见上述A的方案I)，聚合酶的核酸酶活性切割所述探针，由此从所述切割络合物释放侧翼部分(见B的方案II)。由于所述引物延伸通过和经过所述切割的切割探针，聚合酶可在其他位点切割探针的结合模板的片段，直至所述结合模板的片段的剩余部分从扩增子模板解离。然后，所延伸的引物可作为第二引物的模板起作用以复制原始(最初的)扩增子模板链。

在上述PCR实施例中使用的引物和探针可具有适于产生本发明方法检测的可检测侧翼的多种长度和构象中的任何长度和构象。通常，引物可为约18至约30个核苷酸长度，或20至25个核苷酸长度，但是也可以使用在这些范围之外的长度。例如，当引物含有相对于所使用的DNA或RNA具有增强的碱基配对亲和力的一个或多个核苷酸类似物(例如锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)时，可使用较短的长度。探针的结合模板的片段可同样为任何合适的长度，例如，通常在8和30个核苷酸之间。当探针还含有多核苷酸侧翼部分时，根据所需的检测特异性和灵敏度，所述侧翼部分可含有任何长度的多核苷酸序列，例如10至40个核苷酸。

可将第一引物和第二引物设计成产生任何所需长度的扩增产物，通常至少30或至少50个核苷酸长度，并且达200、300、500、1000或更多个核苷酸长度。可以以任何合适的浓度提供探针和引物。例如，可以以通常少于或等于500nM的浓度提供正向引物和反向引物，例如从20nM至500nm，或50至500nM，或从100至500nM，或从50至200nM。

在某些实施方案中，通常以小于或等于1000nM的浓度提供探针，例如，从20nM至500nM，或50至500nM，或从100至500nM，或从50至200nM。对于NTP、酶、引物和探针的浓度的示例条件还可见于美国专利No.5,538,848(由此通过引用并入)，或可使用可商购获得的反应成分实现(例如，可从Applied Biosystems，Foster City，CA获得)。

在该方法的一方面，通过使其与可检测标签结合而修饰所述标签序列。可使用电化学活性部分或特异性结合对成员在5′端标记所述标签序列。可选地，所述标签序列在被切割后可与检测试剂结合或以其它方式变得与检测试剂结合。如上所述，所述切割的标签序列可于溶液中检测或在捕获或固定后检测。任选地，该方法包括防止未切割的标签序列干扰切割的标签序列检测的分离步骤。前述教导方法还应用于不含有多核苷酸序列的标签。

在该方法的一方面，在酶切割之后，所述标签序列被捕获和/或固定。在所述标签序列包括可检测标签的情况中，然后检测可检测标签。在随后使用检测试剂标记标签序列的情况中，所述检测试剂可标记固定化的标签序列或与其络合。

所述标签序列可由于特异性或非特异性相互作用而被固定。例如，所述标签序列可使用特异性结合对成员衍生，所述特异性结合对成员特异性结合或互补于特异性结合对的其他成员的特定空间和极性结构。典型的特异性结合对可包括配体和受体，并且可包括但不限于下列配对：抗原-抗体、生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素、IgG-A蛋白、IgG-G蛋白、碳水化合物-凝集素、酶-酶底物、DNA-反义DNA，以及RNA-反义RNA。

在所述标签序列是或包括核酸序列的情况中，所述标签序列自身可被基本与所述标签序列互补的标签互补物序列捕获和/或固定。例如，所述切割的标签序列可被自身固定于表面或其他基质的捕获反义寡核苷酸捕获和固定。

反义寡序列作为捕获序列(标签互补物)使用，可使得该方法多种多样，例如，通过设计多种互补探针，各探针具有特征性标签序列。各自和分别互补于所选的标签序列的捕获寡核苷酸的阵列可用于在多个分离的检测区集中和捕获各标签序列。

在与靶序列21互补的互补序列20包括互补多核苷酸序列22的情况中，所述标签序列可配制成包括与图3所示的另外的检测寡核苷酸23的序列互补的另外的序列。通过在PCR循环过程中允许PCR反应混合物冷却，另外的检测寡核苷酸可与切割的标签序列以及可仍旧与互补探针结合的标签序列杂交。新形成的切割的标签序列和另外的检测寡核苷酸的双链体24在自由3′端延伸，导致形成较稳定的双链DNA，而带有未切割的标签序列的双链体仍旧无生产性，且只是在随后温度增加后解离。

所述标签序列的延伸产生与在远距离的检测部分固定化的序列互补的新序列。一方面，固定化的序列26是肽核酸(PNA)序列，使得它可不干扰PCR过程。可如上所述通过标签序列自身(通常在3′或5′端)上的可检测标签28的存在，或通过随后可检测标签和标签序列的结合，或标签序列与固定化序列的结合，来检测延伸的标签序列的结合。另外，图3还用于非PCR实施方案。

一方面，固定化的序列是固定化于金电极30上的PNA序列，切割的和延伸的标签序列的存在借助于所述标签序列的5′端的可检测有电活性的标记28来检测。

另一方面，标签序列32包括所选的形成稳定的环-茎结构34的反向重复序列，如图4所示。因此，当从互补探针切割标签序列时，所述标签序列的3′端能够自引发其自身延伸36。自引发过程可产生与固定化序列38互补的新序列，所述固定化序列38可为PNA序列并可固定化于电极40。

另一方面，本发明公开内容提供了使用含有包括zipcode序列的发夹环的探针。其示意图示于图5A-5C。探针41使用具有电极活性的标记42标记并可包括通过间隔子(spacer)43连接在一起的两个多核苷酸序列。探针3′端的羟基通常被3′封闭基团例如乙酰基或磷酸根基团保护免受3′外切核酸酶消化(如图5A所示)。探针还可包括标签序列，所述标签序列被5′核酸酶活性(例如在PCR过程中的DNA聚合酶的5′核酸酶活性)切割而产生未结合的标签序列(如图5B所示)。切割的侧翼具有3′-OH基团。随后，切割的侧翼的3′端可被3′外切核酸酶消化，例如外切核酸酶III(如图5C所示)。外切核酸酶III具有双链特异性3′-5′脱氧核糖核酸外切酶活性但还作用于具有少于4个碱基的3′突出端。如果需要，在消化步骤之后，外切核酸酶III可通过在80℃加热而失活。3′外切核酸酶消化在间隔子43终止，所述间隔子43可仅为例如有机连接子。在所述间隔子的另一侧是探针独有的标签序列44。因此，在切割的侧翼上的标签序列成为单链之后，它可与互补的固定化序列45杂交，例如结合电极表面46的互补的固定化序列(如图5D所示)。未切割的探针的标签序列由于具有发夹环不能用于杂交。因此，在检测之前不需要分离切割和未切割的探针。在热循环之后，可将3′端外切核酸酶添加至PCR反应，或者可将其储存于包括电极的检测室。如本文所述，可于的电极上电化学检测捕获的侧翼。

另一方面，添加与标签序列54互补但较长的检测寡核苷酸52，并且当进行标签序列切割时，在使用检测寡核苷酸对切割的标签序列进行退火后，所产生的3′-OH基团可以被延伸与检测寡核苷酸互补，如图6中杂交络合物56所示。可检测标记可连接至标签序列(如图3中28所示)或可检测标记可连接至检测寡核苷酸(如图6中58所示)。如上所述，新序列可互补于并因此结合固定化序列60，所述固定化序列60可为PNA序列并且可固定于电极62。

标签：标签互补物络合物可通过多种合适的机制中的任何机制检测。通常，在检测条件下选择通过特异性共价或非共价相互作用(例如通过氢键结合、离子配对或范德华吸引力)与标签互补物结合或形成络合物的标签，所述特异性共价或非共价相互作用与仅被动相互作用或扩散进入或扩散通过尺寸排阻孔基质或屏障相对。标签和标签互补物之间的这种特异性相互作用可提供额外的特异性水平以增加信噪比。另外，检测条件还可任选包括来自电化学部分的信号可由其扩增的电化学介质或基质。在电化学活性部分存在于标签或标签互补物的情况中，这样的部分可作为介质起作用。可选地，一种或多种电化学介质可存在于溶液中。这样的介质的实例为抗坏血酸。然而，当电化学部分自身提供合适的信号时，所述介质不为本发明的操作所需。

在某些实施方案中，探针共价连接至与其中发生探针切割的溶液接触的表面或基质。在PCR实施方案中，变性的扩增子能够与互补探针杂交。然后，合适的引物可退火至扩增子，并且扩增子序列的延伸可继续。在延伸过程中，酶活性可导致互补探针切割。例如，在通过PCR进行扩增的情况中，互补探针由聚合酶的内切核酸酶活性切割。

在使用一种或多种标签序列标记互补探针的情况中，互补探针的切割导致标签序列的释放。然后，反应的程度可通过反应溶液中标签序列的存在或定量来测定。在标签序列是或包括电化学活性标记的情况中，反应的进展可电化学检测。

在于远距离位点检测标签序列的情况中，以增加远距离检测位点和标签序列之间相互作用的方式修饰标签序列、远距离位点或二者是有帮助的。在标签序列包括电化学活性标记的情况中，远距离检测位点可为电极表面。可选地，标签序列可集中于远距离表面，并随后与电化学活性标记结合。例如，在标签序列包括多核苷酸的情况中，电化学活性标记可选择性结合多核苷酸，例如在电化学活性部分掺入结合多核苷酸的插入剂的情况中(如实施例2所述)。

在标签序列包括电化学活性标记的情况中，可直接检测所述标记，或经一个或多个中间氧化还原(redox)活性物检测所述标记。所述氧化还原活性物可使电子从电极表面穿梭至电化学活性标记，或使电子穿梭至另一种氧化还原活性穿梭物。

标签序列可通过包括一个或多个捕获部分而修饰，以增强与远距离部位的相互作用。一方面，所述远距离部位包括金金属表面，并且所述捕获部分包括巯基或二硫化物官能团。含硫基团和金表面之间的亲和力导致标签序列的结合。标签序列可包括聚合结构或树枝状结构，包括多个含巯基的官能团，以使与金表面的结合最大化。电化学活性基团可掺入巯基化的标签序列，或可在吸附至金表面之前或之后与标签序列结合(见实施例7)。

例如，如图7A所示，可使用PCR室64，其中所述室包括惰性固体基质66和远离固体基质的电极67。与所需扩增子互补的多个核酸链58可结合或以其它方式固定于固体基质。所述互补链可被聚阴离子部分70官能化，其中所述聚阴离子部分可掺入多个巯基或二硫化物官能团，或表现结合金表面亲和力的其他官能团。

如图7B所示，在扩增过程中，互补链68与扩增子72杂交，聚阴离子部分70从所述链被切割，并自发进行至金电极表面的化学吸附，如图7C所示。然后，随后检测试剂74的添加可用于将电化学部分运输至所吸附的巯基化标签序列，如图7D所示。

例如，电化学活性基团可掺入基于聚氧化乙烯的亲水树枝状聚合物。所述树枝状聚合物可掺入多个氧化还原活性位点(参见实施例6)。另一方面，电化学活性部分可掺入多个正电荷以经离子和/或静电相互作用与固定化的核酸序列相互作用(参见实施例3)。

本发明所选方法可设计成用于实时检测(例如监测在选择的时间段内或多个扩增循环内的检测信号，或检测在各循环中或之后的选定点的信号)，或用于终点检测，其中在扩增完成之后检测信号，并将其与初始信号或阈信号比较以确定靶多核苷酸的存在、不存在或量。例如，图3所述通过7的实施方案可有利于实时检测或终点检测，而其他实施方案可较适于终点检测。

另外，尽管本文描述了使用固定于表面的探针的某些方案，这些方案还可适用于溶液中，如实施例8所述。用于电化学检测的化合物和方法的其他指导原则可见于欧洲专利EP 733058 B和EP 871642 B以及PCT公布WO 98/20162(Meade，Kayyam，等)。

微流控技术

本文公开的方法和材料可结合多种仪器或设备中的任何仪器或设备使用。在本发明的有利方面，所公开的方法可结合微流控设备实施。微流控设备是利用纳升或甚至皮升水平的小体积流体的设备。微流控设备可利用以不同几何形状设置的多种微通道、微孔和/或阀，以制备、运输和/或分析样品。这些微通道、微孔和/或阀可具有毫米(mm)至微米(μm)或甚至纳米(nm)范围的尺寸。非限制地，微流控设备还可称为“中尺度”设备，或“微型机械”设备。微流控设备可依赖多种力来使流体运输通过所述设备，其中所述力包括注射、泵、施加的抽吸、毛细管作用、渗透作用以及热膨胀和收缩等。在一个实施例中，微流体设备可依赖于有效的电渗以有助于含水样品、试剂以及缓冲液的运输。多种微流体设备描述于授予Kricka等的美国专利No.5,296,375(1994)，授予Wilding等的美国专利No.5,498,392(1996)，以及Wilding等的国际公布No.WO 93/22053，它们各自通过引用并入本申请。

可用于检测靶多核苷酸序列的微流体设备通常包括其中形成多个微流体室和通道的基质，以及附着于所述基质表面的覆盖物。该设备通常包括入口和一个或多个室，所述入口设置成接收含有至少一种靶多核苷酸序列的样品，所述室设置用于使探针与生物样品接触，其中所述探针含有如上所述的靶互补片段和可检测标签。所述微流体设备可包括一个或多个室，所述室设置用于使所述样品经受聚合酶链式反应、从所述探针切割可检测标签以及使释放的标签与偶联至电极的标签互补物结合以形成固定化的标签：标签互补物络合物。通常通过设置成用于检测与标签：标签互补物络合物的存在相关联的电化学信号的仪器来检测和/或定量标签：标签互补物络合物；并且被检测/定量的信号与所述样品中的靶多核苷酸序列的存在/量有关联。

适于靶核酸聚合物的扩增和随后的检测的典型微流体设备示于图8。图示描述了微流体设备162，为了简单，其不包括可存在于所述微流体系统的所有微通道和微孔。微流体设备162包括电极组件164以及控制器166，控制器166设置成以控制应用于电极组件164的电位。所述控制器通常用作电源和实施电流测量的仪器。

电极组件164的上游是设置以制备感兴趣的样品溶液的微流体设备的样品制备区168。样品制备区168包括设置以供应可用于样品制备过程的试剂的试剂库170。微流体设备的各室经适于通过该设备运输试剂、样品溶液以及反应产物的微流体通道系统172互联，并且特别将这些物质运输至电极组件164或自电极组件164运输这些物质。

样品(通常生物样品)可经入口174引入微流体设备。样品可通过注射、毛细管作用或任何其他合适的引入方法引入。所述微流体设备任选包括预处理孔或室176。如果需要，预处理室176允许生物样品与用于样品消化、液化或稀释的试剂混合。所述预处理可用于提供流动性足以提高下游过程的有效性的生物样品。

在该预处理之后，通常可通过电渗透泵经过过滤器178将样品运输至反应室180。过滤器178可用于去除可干扰下游反应的大颗粒。所述过滤器可为可与所研究的生物样品相容的任何合适的过滤剂。例如，过滤器178可包括具有较大孔径例如约100μm的膜过滤器，或多孔玻璃过滤器。

反应室180可用于样品的裂解和变性。如图8所示，用于裂解和/或变性过程的试剂可经阀184从试剂库182添加。裂解和/或变性过程可通过经加热单元86加热来加速。加热单元86可包括一个或多个加温灯、加热旋管、流体热交换器或任何其他合适的加热装置以及风扇、吹风器、热交换器或其他用于冷却反应室180的合适的冷却装置。

在裂解和/或变性之后，将样品途经过滤器190运输至PCR室188。与较粗的过滤器178不同，选择约5-10μm孔径大小的过滤器190，意于去除裂解/变性过程的不想要的副产物。一旦样品到达PCR室188，经阀194从PCR试剂库192将可用于PCR过程的试剂添加至PCR室188。在本发明的一方面，添加至反应室的试剂包括如上所述的本发明的探针，其含有与靶多核苷酸互补的片段和可切割的可检测标签。可通过加热单元196加热PCR室188。与加热单元186相似，加热单元196可为便于PCR过程的任何合适的加热装置，并且通常包括冷却装置，使得可于PCR室188中实现加热循环。所选择的合适的热循环装置描述于授予Wittwer等的美国专利No.5,455,175(1995)，由此该专利通过引用并入本申请。应理解PCR室可用于等温模式，用于不需要热循环的应用。

在完成PCR之后，将样品通过另一个具有约5-10μm孔径的过滤器198运输至电解室197。电解室197包括由控制器控制的电极200。尽管图8中描述为电连接于控制器166，但电极200的控制器可与电极164的控制器相同或不同。合适的试剂可经阀204从试剂库202添加至电解室197。然后，在PCR过程中由核酸酶活性从探针切割的标签可与偶联至电极164的标签互补物结合，其中任选经一种或多种电化学介质的存在检测与标签：标签互补物络合物的存在相关联的电化学信号。

在完成扩增之后，可将电位施加于电解微孔197的电极200和电解微孔208的电极206之间。通常，将电极200保持在阴极电位，电极206保持在阳极电位，使得结合薄层交联聚丙烯酰胺凝胶208经凝胶210发生电泳。当发生电泳时，电极164通常为电中性。

聚丙烯酰胺凝胶通常使用低度交联制备。在这些电泳条件下，除了已络合和杂交的DNA外的所有核酸片段均迁移至电解室210。较大的核酸络合物由于其大尺寸和相对不能穿透薄层交联聚丙烯酰胺凝胶而落后。

尽管已经描述了电泳分离，但任何合适的分离方法均可用于分离切割的标签，包括例如机械分离、尺寸排阻色谱法、使用衍生的珠或基质(例如包括磁珠或链霉亲和素修饰的基质)分离。

如上文和下面的实施例所述，一旦标签：标签互补物络合物与电极表面结合，可检测和/或定量存在于络合物中的可检测标签。

试剂盒

根据本发明的方法，本文公开的探针可以以用于检测靶多核苷酸序列的试剂盒的形式提供。这些试剂盒任选包括含有与所选的靶多核苷酸序列互补的片段和可检测标签的一种或多种探针。所述试剂盒可包括对许多独立且不同的靶多核苷酸序列具有选择性的探针。所述试剂盒可包括各自具有不同的且可单独检测的标签的探针。所述试剂盒任选包括当从所述探针切割标签时形成标签：标签互补物络合物的一种或多种标签互补物。所述试剂盒任选包括对应于所述试剂盒中存在的探针的靶多核苷酸序列的样品，例如用于校准目的。所述试剂盒任选包括一种或多种适于制备探针溶液和/或靶多核苷酸序列溶液的缓冲液或缓冲剂。

所述试剂盒任选掺入其他试剂，包括但不限于电化学校准标准品、酶、酶底物、核酸染色剂、标记抗体和/或其他另外的检测试剂。本发明的探针任选可作为低压冻干的固体或作为浓缩的母液或准备用于适当测定的预稀释的溶液存在。通常，所述试剂盒被设计成适用于自动和/或高通量测定，并且因此被设计成完全适于微流体方法和/或其他自动高通量方法。

电化学组合物

本发明还提供了例如本文所述的电化学化合物。所述化合物可用于多种电化学用途，包括但不限于检测本文所述的靶多核苷酸序列的方法。

例如，本发明公开内容提供了下文方案5所述形式的双锇(bis-osmium)化合物。

本发明还公开了方案10所示化合物21形式的化合物和方案10所述的可使用可选的芳香烷基胺反应物产生的结构相关的化合物。

本发明还公开了方案6(例如化合物10和11)、方案7(例如化合物14和15)、方案15(例如化合物2)、方案16(例如化合物4)、方案17(例如化合物6)以及方案18至20所述形式的聚锇(poly-osmium)化合物，及其类似物和衍生物。

实施例

实施例1：DNA扩增探针的制备

制备对食物病原体产单核细胞李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的李斯特氏菌细胞溶解素(Hly)基因的扩增具有选择性的探针。互补探针(或引物)在序列的5′端被生物素化。互补探针还含有位于最后的dT残基处的生物素，以及防止PCR过程中探针延长的3′端氨基。互补序列被下列粗体字显示的19个碱基的标签序列修饰。

5′-CACGAATCAAAGCTCTCAACGCCTGCAAGTCC^*AAGACGCCA-3′NH₂

其中T^*标记生物素化的碱基。生物素化允许使用链霉亲和素修饰的珠去除互补序列。

标签序列的存在不影响靶序列的PCR扩增，如通过与对照反应比较的扩增子的电泳分析所证实的。

PCR过程中使用的正向和反向引物如下：

5′-CATGGCACCACCAGCATCT和

5′-ATCCGCGTGTTTCTTTTCGA，其中各引物的5′端还被生物素化，用于使用链霉亲和素珠去除。

在95℃进行PCR反应10分钟，然后在含有6mM MgCl₂的PCR缓冲液A(Applied Biosystems，Ca#N808-0228)中进行(95℃15秒钟，63℃1分钟)x40个循环。引物和探针浓度分别为200nM和400nM。使用7％ACN(乙腈)+93％TEAA(0.1M醋酸三乙醇胺，pH6.8)平衡来自Waters公司的HPLC柱XTerroMSC18(2.5mmx50mm)。分三步进行梯度洗脱(0.3ml/分钟，60C)：步骤1：7％ACN+93％TEAA，7分钟；步骤2：10％ACN+90％TEAA，10分钟；步骤3：35％ACN+65％TEAA，10分钟。(ACN-乙腈，TEAA-0.1M-pH6.8的醋酸三乙醇胺)。在95℃进行PCR 10分钟，然后分别在200nM引物和400nM探针浓度进行(95℃15秒钟，63℃1分钟)x40个循环。

在完成聚合酶链式反应(PCR)之后，通过添加NaCl溶液将反应混合物调整至1M盐。然后将反应混合物与链酶亲和素包被的磁珠一起温育15分钟。生物素化的互补探针，包括仍旧含有未切割的标签序列的互补探针，吸附于磁珠并从反应混合物去除。生物素化的扩增子相似地从混合物去除，溶液中保留切割的标签序列。

使用在5′端使用荧光标记(荧光素)标记的标签序列进行扩增和切割，然后通过HPLC进行鉴定，显示产生20个碱基长度的切割产物，并且使用链霉亲和素包被的珠消耗反应混合物去除了未切割的探针。如图9所示，以3000拷贝的李斯特氏菌DNA的起始材料切割约50％探针，而无模板对照不含有切割的寡核苷酸，然而，在反应混合物中产生3拷贝模板之后，该方法足够灵敏地产生可检测的切割产物。

标签序列还可电化学检测。在于链霉亲和素包被的珠上消耗之后，含靶的样品和无模板对照溶液均暴露于分开的金电极，所述金电极被与切割的序列互补的固定化的捕获探针官能化。直接从珠分离步骤使得该溶液在45℃杂交1小时，然后，使用10mM Tris，100mM NaCl(pH＝8)漂洗。然后在电化学电池中将电极暴露于使用于10mM Tris，100mM NaCl(pH＝8)中的电催化锇2，2-双(二吡啶)(参见方案1的结构)标记的100μg/mL螺纹型插入剂(threading intercalator)溶液。在使用PBS缓冲液(20mM磷酸盐和100mM氯化钠，pH7)洗涤和于10％乙醇中的NaCl饱和的磷酸盐缓冲液洗涤之后，于200μL PBS中在0.2V vs Ag/AgCl获得基线电流。当添加800μL 6.25mM抗坏血酸基质时，电流以与插入剂的量成比例并由此与杂交的靶的量成比例地增加(见图10)。

靶电极和电化学装置。使用具有100埃Cr层、然后是2000埃金层(Lance Goddard Associates，Foster City，CA)的毯式溅射涂覆4″硅片(siliconwafer)来制备工作电极。然后手工切割硅片形成约1cmx1.5cm的片段。使用UV-Ozone清洁剂(Model 42，Jelight Company，Inc，Irvine，CA)清洗电极20分钟，然后将其暴露于无水乙醇20分钟。然后将电极暴露于于1M磷酸钾缓冲液(pH＝7)中的巯基化的DNA捕获探针的0.5μM溶液10分钟，然后5秒钟水漂洗。捕获探针序列紧接着示于如下：

5′(DTPA)(DTPA)(DTPA)AAA AAA TTG AGA GCT TTG ATT CGTG 3′

其中DTPA是方案20所述的含有二硫键的磷酸根连接键类型，其由二巯基亚磷酰胺制备(Glen Research，Sterling，VA)。然后将电极过夜暴露于巯基己醇的1mM水溶液，然后是30秒钟水漂洗。然后在氮气下干燥电极。

可在电化学电池中使用CHI型660B恒电位器(CH Instruments，Austin，TX)以1/8″ID O型圈限定工作电极区和Ag/AgCl对照电极(Cypress Systems，Lawrence，KS)以及铂线圈对应电极来进行电化学测量。

实施例2：使用二茂络铁(Fc)标记的探针进行PCR进程的电化学监测

在该实验中，反应混合物的成分和扩增方案与实施例1中的相同，除了所述探针在其5′端被二茂络铁部分取代(″Synthegene″，Houston，TX)并且100,000拷贝的李斯特氏菌DNA用作模板。将六个含有50μl等份的相同PCR反应混合物的试管放入9700热循环仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)。在扩增的20、26、29、32以及38个循环之后从热循环仪顺序取出试管。在38个循环之后取出对应于无模板对照(NTC)的试管。如实施例1所述，使用链霉亲和素磁珠从未切割的探针纯化切割的含二茂络铁的20-mer片段(可检测标签)。将30μl等份的纯化的Fe20-mer(于1M NaCl中)放置于金电极表面1小时使得与互补捕获寡核苷酸杂交。在使用PBS缓冲液快速漂洗电极之后，将各电极放入实施例1所述的室中。使用约100ul PBS缓冲液填充室，并如图11中所述进行电化学检测。

电化学信号幅度取决于所实施的PCR循环的数量。图11A显示了扩增子的凝胶电泳分析和密度计定量。图11B是扩增子数量与PCR循环数量的曲线图。图11C显示了电化学检测结果。图11D显示了电化学信号值(峰区)与PCR循环数量的曲线图。图11B和11D显示的曲线对应表明该方法允许定量监测PCR反应。

实施例3：电催化核酸插入剂的制备

检测试剂任选为作为核酸链插入剂的电化学部分。示例的插入剂具有下列方案1所示的式

方案1

并且通过类似于Tansil等(Anal Chem.2005，77(1)，126-134)的方法制备。将于3.0mL无水THF中的6.0mL(24.92mmol)1(3-氨丙基)咪唑溶液装入50mL双颈圆底烧瓶，所述烧瓶装有水冷凝结器、均衡压力添加漏斗以及1/4″磁性搅拌棒。反应方案于方案2中提供。

方案2

15分钟时段内，持续搅拌下向该溶液添加于3.0mL无水THF中的0.6058g(2.26mmol)1，4，5，8-萘四羧基二酐。于逆流加热该反应混合物24小时。反应混合物的颜色在30分钟内从亮淡黄橘色变为非常暗的棕色。在反应时间结束时，将反应混合物冷却至室温并在快速搅拌下添加20mL丙酮/水混合物(3∶1 v∶v)。使得该混合物在室温静置5分钟。倒出上清液层。向残留物中添加10mL甲醇，搅拌所产生的浆体。通过抽滤收集黄色结晶。使用甲醇快速洗涤过滤块并使用抽吸进行空气干燥。由20mL氯仿/乙醇混合物(1∶1 v∶v)重结晶沉淀，然后在40℃过夜真空干燥，产生0.236g(22％产率，先前报道的产率85％)的产物。产物的¹H-NMR光谱与文献中所报道的完全一致。方案3中提供了该反应的方案。

方案3

在10分钟时段内持续搅拌下，向于16.0mL乙二醇中的0.642g(0.52mmol)Os(bpy)₂Cl₂溶液中添加0.236g(0.25mmol)PIND(参见方案3左侧的结构)。在180℃的油浴温度加热最终的混合物30-40分钟。通过在60℃旋转蒸发去除乙二醇，产生粘稠的油性残留物。强力搅拌下向该粘稠的残留物中添加150mL TNF，形成最终的沉淀。通过抽滤收集沉淀，使用无水TNF漂洗，并经过滤器干燥，产生129.3mg(50％产率，先前报道的产率78％)极易溶于水和乙醇的暗紫色粉末产物。相比之下，起始材料(Os(bpy)₂Cl₂是不易溶于水并几乎不溶于乙醇的暗紫色粉末。该产物的UV可见光谱与文献中所报道的一致。

实施例4：聚阳离子电化学部分

在本发明公开的方法的选择方面，标签序列在检测前固定于远距离的电极。例如，在标签序列包括一个或多个含硫官能团(如巯基或二硫键)和所述电极包括金金属表面的情况中。在这些方面，可通过添加与所吸附的标签序列静电相互作用的电化学部分便于标签序列的检测。所述静电相互作用不依赖或需要表面多核苷酸探针与所述标签序列的杂交。

聚阳离子与巯基化的结合的标签序列的结合示于下列方案4中的简图：

方案4

其中，聚阳离子包括多个可逆性氧化还原中心。静电结合的氧化还原中心可介导在电极表面的检测，如图12所示。注意图12的“基质”可指可便于可检测标签的检测的任何氧化还原活性化合物或材料(这里结合的标签是为聚阳离子并与含有氧化还原活性部分的聚阳离子部分络合的ssDNA侧翼(例如锇络合物)，其中所述氧化还原活性部分的存在可通过图22所示的氧化还原循环检测)。

实施例3A.氧化还原可逆性聚阳离子可包括α，ω-二咪唑链烷的锇络合物，如下列方案5所示。

方案5

实施例3B.可选地，聚阳离子电化学部分可包括其他锇络合物，如下文所述。二锇络合物或四锇络合物通过分别使合适的二酸或四酸与亚硫酰氯反应而合成。除了其他方法外，所产生的酰基氯化合物可通过真空蒸馏纯化。在某些方面，酰基氯化合物可转化为其N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯相似物。NHS酯可在二异丙基乙胺(DIPEA)的存在下通过使用二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)处理酸而制备。反应策略示于方案6。

方案6

实施例3C.可选地，二锇络合物或四锇络合物可根据下文所述的方案进行制备。于含水乙醇中的2-(2-氨乙基)吡啶和Os(bpy)₂Cl₂反应，沉淀和纯化产物，产生所需的锇络合物。二酰基氯和四酰基氯化合物(包括它们的NHS酯类似物)可根据上述方案制备。合成策略示于方案7。

方案7

实施例3D.在又一个实施例中，氧化还原可逆性聚阳离子可为包括多个电活性中心的聚合物，例如锇络合物。所述聚合的聚阳离子可通过根据类似于美国专利No.5,262,035(由此通过引用并入)所报道的方案处理聚(4-乙烯吡啶)和Os(bpy)₂Cl₂而制备。为了防止在高pH的α-消除，可使用甲基基团取代与吡啶环体系连接的2-氨基或2-羟乙基。合成策略示于方案8。

方案8

实施例3E.在所选择的可选实施方案中，聚阳离子电化学部分可如下文所述由聚(1-乙烯基咪唑)制备。聚合物骨架可通过在TEMED的存在下使用过硫酸铵作为引发剂进行1-乙烯基咪唑的溶液聚合而制备。1-乙烯基咪唑的自由基聚合也可通过水溶性偶氮化合物引发，例如2，2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二氢氯化物。所产生的聚合物18为水溶性并可通过例如透析进行纯化。使用例如于含水乙醇中的Os(bpy)₂Cl₂处理聚咪唑化合物导致多个氧化还原活性中心添加至聚合物上。在其中很少的咪唑环仍未被取代的高度转化的情况中，所产生的聚阳离子化合物可通过由THF沉淀分离和纯化。在某些方面，所需单体例如N，N-二甲基丙烯酰胺可使用乙烯咪唑化合物共聚，以使得所产生的聚合物的特定物理和化学特性根据需要而不同。合成策略示于方案9。

方案9

实施例3F.在所选的实施方案中，聚阳离子电化学部分可包括具有沿聚合物骨架的羟基氮杂环丁烷(hydroxylazetidinium)基团的水溶性聚合物，所述水溶性聚合物由N，N-二烯丙基-3-羟基氮杂环丁烷盐的聚合或共聚而制备。可选地，POLYCUP聚合物可通过使用己二酸聚酰胺和N，N-二(2-氨乙基)胺处理表氯醇而制备。聚合物20为高阳离子并且极易溶于水。氮杂环丁烷氯化物对于氨基和羧基具有高反应性。氧化还原可逆性咪唑基-Os(bpy)₂Cl可如所述掺入而产生21，所述21可通过由甲醇或TNF沉淀而分离并可通过透析纯化。

方案10

实施例3C.可选地，有电活性的二茂络铁络合物(而不是锇络合物)可通过20与2-氨乙基二茂络铁或醋酸二茂络铁反应而掺入。

实施例3D.在特定实施例中，将12％的POLYCUP聚合物20溶液的等份加入等量的多官能胺聚(乙烯亚胺)24的10％水溶液中。在50℃水浴中加热的15分钟内该反应混合物转化为固体凝胶，表明20中的氮杂环丁烷环对于胺官能团的高反应性。当多官能胺24被单官能胺3-氨基丙基咪唑25取代与20反应时，没有形成凝胶。参见方案11。

方案11

实施例5：1，1′-(1，6-己烷二基)双(咪唑)的制备

在搅拌下向250mL三颈圆底烧瓶装入3.0mL水和5.82g(103.7mmol)氢氧化钾，所述烧瓶装有磁性搅拌棒、添加漏斗以及Dean-Stark凝结器。当KOH分解时，添加100mL甲苯，然后添加6.81g(100.0mmol咪唑。当咪唑分解时，添加40.0mL的DMSO。

于133℃油浴中加热并搅拌该混合物，直到没有水再共馏出，或约4小时。产生约8mL水。

在反应混合物的温度降至低于90℃时，持续搅拌下滴加12.07g(49.5mmol)的1，6-二溴己烷。在添加过程中形成白色沉淀。

在85-90℃搅拌该混合物17小时。

通过过滤去除溴化钾。通过减压蒸馏(49℃，0.5mmHg)去除过滤液中的甲苯和DMSO产生粘稠的油状物。

真空蒸馏小量白色结晶固体(90℃，0.02mmHg)，并通过¹H-NMR光谱法鉴定为咪唑。使用1∶1 v∶v的二氯甲烷和甲醇混合物使残留的油状物经受色谱纯化，产生8.0g(74％产率)产物。该产物的¹H-NMR光谱与预期结构一致。合成方案示于方案12。

方案12

实施例6：锇取代的1，1′-(1，6-己烷二基)双(咪唑)的制备

向装有磁性搅拌棒和凝结器的500mL圆底烧瓶中添加2.0g(3.5mmol)二吡啶基二氯化锇、0.38g(1.76mmol)的1，6-双(咪唑)己烷、100.0mL乙醇以及100.0mL去离子水。于油浴中加热该反应混合物至温和逆流16小时，产生暗紫色溶液。然后，将该反应混合物冷却至室温，在减压下去除溶剂。

于60mL的THF中研磨残留物15分钟。通过抽滤收集沉淀物，使用THF漂洗去除1，6-双(咪唑)己烷，并抽吸空气干燥，产生暗紫色结晶粉末。

于55℃过夜真空干燥该产物，产生2.26g(94.5％产率)产物。该产物的¹H-NMR光谱与预期的结构一致。合成方案示于方案13。

方案13

实施例7：化合物7于DNA修饰的电极的反应

通过具有10nm铬层、然后是500nm金层的毯式溅射涂覆氧化硅片来制备工作电极。然后使用商业UV-Ozone清洁剂清洁该硅片的划线片段30分钟，然后于无水乙醇中浸泡20分钟。然后在氮气下干燥电极。使用PDMS垫圈限定暴露区，将不同浓度的DTPA修饰的25个碱基的DNA链置于电极表面20分钟(其中DTPA为方案20所示类型的含二硫键的磷酸酯连接子)，然后暴露于水中的1mM巯基己醇10分钟。在使用水漂洗之后，然后将电极暴露于于Millipore水中的7(参见方案14)的100μg/mL溶液1分钟，并于水中漂洗20分钟。

方案14

然后将电极装入具有3mm直径O形圈的电化学电池以限定电极区。使用电极在100mV/秒钟于10mM Tris缓冲液(pH8)使用铂对应电极和Ag/AgCl参考电极进行循环伏安图谱，如图13所示。

然后将检测的整合电荷相对于化合物1和7的DNA浓度进行绘图。所产生的曲线图示于图14。

实施例8：树枝状电化学部分

氧化还原可逆性介质可经四臂聚(氧化乙烯)琥珀酰亚胺终止的季戊四醇(通过Polymer Source(Quebec，Canada)商购获得)制备。如下文所述，赤藻糖醇中间物的反应产生一种然后与Os(bpy)₂)Cl₂反应产生四臂氧化还原部分的化合物。所产生的化合物具有亲水性，并对于化学吸附较不敏感。对于本文所述的各聚阳离子，平衡离子可经任何合适的离子交换方法例如离子交换树脂或在大于7的pH下透析而被取代。

制备四臂电化学部分的合成策略示于方案15。

方案15

氧化还原可逆性介质还制备成具有其他数量的臂。例如，六臂部分可相似地使用六臂聚(氧化乙烯)琥珀酰亚胺-终止的二季戊四醇(也可商购获得(Polymer Source，Quebec，Canada))来制备。如方案16所示，琥珀酰亚胺酯化合物与过渡金属的含胺络合物的反应产生六臂树枝状介质。

方案16

六臂树枝状电化学部分的可选实例可如下列方案17所列进行制备，其中六臂聚(氧化乙烯)琥珀酰亚胺终止的三羟甲基丙烷用于制备包括基于锇的氧化还原中心的六臂树枝状介质。

方案17

实施例8：包括锇氧化还原中心的检测标签的制备

可根据方案18的合成策略制备包括锇电活性部分的检测标签。

方案18

作为基于咪唑的检测标签的替代物，还可制备包括掺入吡啶环的锇中心的检测标签，如方案19中的合成策略所示。

方案19

掺入锇氧化还原中心和二硫键部分的检测标签如方案20的合成策略所示制备。

方案20

如上所述，二硫键标记的寡核苷酸起始材料自身可用作检测标签，这是由于二硫键部分便于吸附至金金属表面，而聚阴离子磷酸根基团便于与聚阳离子电化学部分相互作用。然而，末端氨基的存在允许检测标签被进一步修饰成包括锇电化学部分。

实施例10：带电荷的标签于未修饰的金电极上的捕获

PCR条件与实施例中所述相同，除了具有下列序列的报告探针，其中DTPA是方案20所述的类型的含有二硫键的磷酸酯连接子，并且探针中的3个DTPA促进化学吸附至电极表面而无杂交事件：(DTPA)(DTPA)(DTPA)CAC GAA TCA AAG CTC TCA ACG CCT GCAAGT CCT AAG ACG CCA(生物素)

在PCR之后，然后使用上述用于链霉亲和素包被的Dynal磁珠的方案去除未切割的探针和扩增子。

如先前所述制备和清洁电极。在使用链霉亲和素包被的Dynal珠分离未切割的探针和扩增子之后，将溶液暴露于新清洁的金电极20分钟，然后是5秒钟水漂洗和暴露于巯基己醇的1mM水溶液10分钟。然后将电极暴露于指定的阳离子氧化还原报告分子的水溶液10分钟，并然后在水中漂洗20秒钟。记录800nM探针和化合物21(方案10所示)的溶液相对于Ag/AgCl参考电极和铂对应电极的循环伏安图谱，如图15所示。记录800nM探针和化合物7溶液相对于Ag/AgCl参考电极和铂对应电极的循环伏安图谱，如图15所示。

实施例11：在未切割的探针的存在下检测切割的标签

该实施例描述了下述实施方案：即其中标签互补物通过表现对结合金表面(如金电极)具有特异性的巯基部分(此处由DTPA部分提供)固定于电极，且可切割探针含有(i)连接至靶互补片段5′端的多核苷酸序列和(ii)可检测标签，其包括切割的标签被固定化的标签互补物捕获之后用于电化学检测的含锇的络合物。

可在未切割的探针的存在下通过选择合适的捕获探针(标签互补物)来检测和/或测定切割的探针，其中捕获探针通过选择性结合接近电极表面的未切割探针的标签使未切割的(完整的)探针的捕获不稳定。因此，较结合探针的未切割标签部分，捕获探针较稳定地与切割标签杂交。

制备50μl反应混合物，所述反应混合物含有：1X PCR缓冲液A(Applied Biosystems，P/N N808-0228)，6mM MgCl₂，200μM各dNTP，200nM正向和反向引物(见实施例1)，400nM 5′-Os标记的探针(见下列方案21用于偶联至各探针5′氨基的锇络合物标记剂)，0.05单位的GoldAmpliTaq^TM聚合酶和3,000拷贝的产单核细胞李斯特氏菌DNA。

检测了可切割探针和固定标签互补物的三种不同组合，如下文组合中所述，其中上面的序列(加下划线)表示待检测的锇标记的切割的探针，下面的序列表示通过3DIPA部分于其5′端连接电极并含有结合标签序列的标签互补物的捕获探针：

组合#1

标签1：5′-CACGAATCAAAGCTCTCAAX-3′

帽1：

3′GTGCTTAGTTTCGAGAGTTGTGTGAACTTAACGACCCCAAAAAAA5′

组合#2

标签1：5′-CACGAATCAAAGCTCTCAAX-3′

帽2：3′AAAAAAGTGCTTAGTTTCGAGAGTT(C18)5′

组合#3

标签2：5′-ATCAAAGCTCTCAAX-3′

帽2：3′AAAAAAGTGCTTAGTTTCGAGAGTT(C18)5′

其中X＝CGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA-3′(靶特异性片段)且C18＝(OCH₂CH₂)₆(DTPA)₃

在95℃进行热循环10分钟，然后(92℃15秒钟，66℃1分钟)x40个循环。然后，将PCR混合物装入电化学电池用于电化学检测，如实施例1和2所述。使用来自实施例2的杂交缓冲液在31℃(约低于上述组合#3的15-mer切割的标签序列的熔解温度10℃，如使用IDT网站：www.idt.com上的Tm计算器程序计算)进行检测。结果示于图16。

方案21

尽管已参考前述操作原理和优选实施方案展示和描述了本发明，但对于本领域技术人员来说显而易见的是在不背离本发明精神和范围的情况下可进行形式和细节上的各种改变。本发明意在涵盖所有这样的替换、修改和变化。

Claims (22)

1. 一种检测靶多核苷酸序列的方法，其包括：

使探针与包含至少一种靶多核苷酸序列的样品在有效使所述探针形成探针-靶络合物的条件下相接触，其中所述探针包含靶互补片段和可检测标签；

从所述探针切割所述可检测标签；

使被释放的标签与偶联至电极的标签互补物结合，以在电极上形成固定化的标签：标签互补物络合物；

检测与所述标签：标签互补物络合物的存在相关联的电化学信号；以及

使所检测的信号与所述样品中所述靶多核苷酸序列的存在相关联。

2. 权利要求1的方法，其还包括使所检测的信号与所述样品中所述靶多核苷酸序列的量相关联。

3. 权利要求1的方法，其中所述切割所述可检测标签包括酶作用切割所述可检测标签。

4. 权利要求3的方法，其中所述切割包括使用核酸酶切割杂交的探针。

5. 权利要求4的方法，其中在引物延伸过程中切割所述探针，所述方法还包括通过聚合酶链式反应扩增所述靶序列。

6. 权利要求3至5任一项的方法，其中所述切割由DNA聚合酶的5′核酸酶活性介导。

7. 权利要求3至5任一项的方法，其中所述探针包括RNA片段，且所述切割包括使所述探针-靶络合物与具有RNA酶H活性的酶结合。

8. 前述权利要求任一项的方法，其还包括：

使第二探针与所述靶多核苷酸杂交；以及

从杂交的探针切割第二可检测标签。

9. 前述权利要求任一项的方法，其中所释放的可检测标签包含非靶互补多核苷酸序列，且所述标签互补物包含与所述非靶互补多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

10. 前述权利要求任一项的方法，其中所释放的可检测标签包含L-DNA多核苷酸序列，且所述标签互补物包含与所释放的可检测标签中的所述L-DNA多核苷酸序列互补的L-DNA多核苷酸序列。

11. 前述权利要求任一项的方法，其中所述电化学信号是使用与所述标签：标签互补物络合物中双链区结合的电化学介质来产生的。

12. 前述权利要求任一项的方法，其中所释放的可检测标签包含能够与所述标签互补物形成络合物的多核苷酸部分。

13. 权利要求1-11任一项的方法，其中所释放的可检测标签包含能够与所述标签互补物形成络合物的非多核苷酸部分。

14. 权利要求13的方法，其中所述非多核苷酸部分带有负电荷，并且所述标签互补物带有正电荷。

15. 权利要求13的方法，其中所述标签互补物包含聚阳离子部分。

16. 权利要求15的方法，其中所述聚阳离子部分包含多个带有正电荷的含氮杂环部分。

17. 权利要求13的方法，其中所述非多核苷酸部分包含一个或多个巯基，并且所述标签互补物包含金。

18. 权利要求13的方法，其中所述非多核苷酸部分包含聚阴离子部分，并且所述电化学信号是使用静电结合至所述聚阴离子部分的聚阳离子电化学介质产生的。

19. 前述权利要求任一项的方法，其中所述切割在无所述标签互补物的情况下进行。

20. 前述权利要求任一项的方法，其中所述接触包括使所述样品与多种各自互补于不同靶多核苷酸序列的探针接触，并且所述检测包括检测至少两种不同的靶序列。

21. 前述权利要求任一项的方法，其中所述探针的浓度等于或小于800nM。

22. 一种用于检测权利要求1-21任一项所述的靶多核苷酸序列的微流体设备，其包括：

基质，其具有形成于其中的多个微流体室和通道；

覆盖物，其附着于所述基质表面；

入口，其设置成接收含有至少一种靶多核苷酸序列的样品；

一个或多个室，其设置用于使探针与所述样品接触，其中所述探针含有靶互补片段和可检测标签；

一个或多个室，其设置用于使所述样品经受温度控制、从所述探针切割所述可检测标签以及使所释放的标签与偶联至电极的标签互补物结合以形成固定化的标签：标签互补物络合物；以及

仪器，其设置成用于检测与标签：标签互补物络合物的存在相关联的电化学信号以及使所检测的信号与所述样品中所述靶多核苷酸序列的存在相关联。

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