ES2685502T3 - Proceso y microorganismos para la producción de lípidos - Google Patents

Abstract

Un proceso para producir lipidos, que comprende: - cultivar celulas bacterianas del genero Streptomyces en un medio que comprende material lignocelulosico como fuente o fuentes de carbono y/o de nutrientes, en donde dicho material lignocelulosico se anade al medio de cultivo sin la hidrolisis de los polisacaridos; - recuperar los lipidos de las celulas de dichas bacterias o del medio de cultivo.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Proceso y microorganismos para la producción de lípidos

La presente invención se refiere a un proceso para producir lípidos para biocombustible o aplicaciones de lubricante y cepas microbianas usables en el proceso.

Antecedentes de la invención

El uso de material biológico renovable para la producción de biocombustibles está motivado generalmente por disminuir los impactos del cambio climático, asegurando el suministro de combustibles, y por factores económicos. Sin embargo, el uso de cosechas comestibles para crear combustibles en lugar de refinarlas adicionalmente en alimento para aumentar la población humana tiene cada vez una vida éticamente más corta. Por lo tanto, las fuentes biológicas que no pueden usarse para alimentar a la gente o al ganado y que pueden fabricarse de forma ambientalmente amigable, son de interés creciente.

La BCC Research (
http://www.bccresearch.com/) estima que el mercado global para los biocombustibles líquidos valió 30.300 millones de $ en 2008. Esto debería aumentar a 42.800 millones de $ en 2013, para una tasa de crecimiento anual de compuesto (CAGR) del 7,2 %. Otra perspectiva del mercado es el volumen. En 2008 la capacidad de producción de biocombustible a lo largo de los 21 países considerados en el informe del estudio de la Unión Europea fue un total de 10.900 millones de litros de biocombustible y 66.600 millones de litros de bioetanol. Sobre el 99 % de esta producción se considera el denominado biocombustible de primera generación, incluyendo bioetanol basado tanto en azúcar como en almidón y combustible basado en aceite de semillas y aceite de desecho. El biocombustible puede estar hecho de cosechas de aceite de semillas, de grasas animales o de grasas recicladas. Ya que se conoce que las algas y algunos microorganismos son capaces de producir y/o acumular lípidos, también se ha sugerido su uso como la fuente de aceite para biocombustible. Estos aceites basados en microorganismos se denominan a menudo aceites de células únicas. Campbell 2008 y Strobel et al., 2008 han descrito la optimización de las condiciones de cultivo de algas y hongos en diferentes tipos de biorreactores para maximizar los rendimientos de los lípidos y los ácidos grasos para el refinado de biocombustibles.

Una opción alternativa a la producción fotosintética de lípidos es utilizar organismos heterótrofos que producen lípidos a partir de moléculas orgánicas (tales como azúcares) sin necesidad de luz. El proceso de producción de aceite de célula única usando microorganismos heterótrofos comprende cultivar microorganismos en biorreactores aireados, permitiendo que las células acumulen lípidos, cosechando células ricas en lípidos y recuperando el aceite de las células (Ratledge et al., 2005, Meng et al., 2009).

Los aceites de célula única se han usado tradicionalmente como productos especiales, por ejemplo, en alimentos sanos, no como productos químicos básicos. En estas clases de procesos de producción de aceite de célula única los volúmenes de producto son relativamente pequeños y el producto es caro. Por lo tanto, la estructura de coste de estos procesos permite la utilización de materias primas de suministro y funciones unitarias caras. También se han descrito clases similares de procesos de producción para la producción de lípidos para la producción de biocombustible (Ratledge y Cohen 2008; Meng et al. 2009). Sin embargo, ya que el producto es un producto químico básico barato, los costes de proceso no deben estar en el nivel de los costes de proceso de productos especiales. Además, el rendimiento del lípido por microorganismos heterótrofos es normalmente muy bajo, menos del 20 % en peso del azúcar de suministro (Ratledge y Cohen 2008).

Se han sugerido materias primas menos caras para su uso en la producción de lípidos por microorganismos heterótrofos en algunas publicaciones de patente recientes. El documento WO 2009/034217 A1 ha descrito un método de fermentación para fabricar parafinas, ácidos grasos y alcoholes mediante materiales de desecho y microbios. El documento WP 2009/046375 A2 sugiere la conversión de polisacáridos derivados de biomasa en monosacáridos u oligosacáridos y convertirlos en biocombustibles usando microorganismos recombinantes que comprenden genes exógenos que permiten que el microorganismo crezca en el polisacárido como una única fuente de carbono. El documento US 2009/0064567 A1 desvela la producción de aceites biológicos por fermentación heterótrofa haciendo crecer microorganismos del reino Stramenophile usando materia prima que contiene celulosa como una fuente principal de carbono. El documento WO2009/011480 A1 desvela la producción de aceites biológicos a partir de material celulósico despolimerizado por microalgas y hongos. El documento US 2009/0148918 A1 desvela un método de fabricación de lípidos cultivando una microalga en glicerol como una fuente de carbono. Además el documento WO 2009/009391 A2 desvela la producción de ésteres grasos produciendo primero una composición de alcohol y proporcionándola a un hospedador de producción de éster graso.

Ya que la economía de la producción de aceites de células únicas para biocombustibles es de importancia clave, todavía son de interés creciente nuevos procesos baratos para la producción lipídica para biocombustibles.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un proceso barato para producir lípidos para biocombustible o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

para aplicaciones de lubricantes.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos microorganismos que puedan usarse en dicho proceso.

La invención descrita en el presente documento proporciona, en un aspecto, un proceso para producir lípidos para biocombustible o para lubricante. La invención se basa en el descubrimiento de que las bacterias Streptomyces son capaces de producir lípidos eficazmente en un medio que comprende desecho o desechos y/o residuo o residuos orgánicos.

El proceso comprende cultivar células bacterianas del género Streptomyces en un medio que comprende desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos o mezclas de los mismos como fuente o fuentes de carbono y/o nutrientes. El proceso comprende la recuperación de lípidos de las células de las bacterias o del medio de cultivo y el uso de los lípidos o una fracción de los mismos como biocombustible y/o lubricante o como material de partida para la producción de biocombustible y/o lubricante.

En diversas realizaciones de la invención el medio de cultivo puede comprender desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos de la industria, incluyendo agricultura, desechos municipales o residuos microbianos.

Adicionalmente, el medio de cultivo puede comprender fuente o fuentes de carbono adicionales, tales como glicerol o una fracción de la industria de azúcar o de almidón.

En una realización de la invención el proceso puede usar medio de cultivo no estéril.

En otra realización de la invención el proceso puede usar medio de cultivo pasteurizado.

En algunas realizaciones de la invención el medio de cultivo puede comprender inhibidores de la lipasa. Los inhibidores de la lipasa pueden usarse para retardar o impedir la hidrólisis de acilgliceroles o la degradación de lípidos formados en el proceso.

En una realización de la invención el cultivo se lleva a cabo como una fermentación en lote.

En otra realización de la invención el cultivo se lleva a cabo como una fermentación semicontinua.

Como se desvela en el presente documento el proceso produce lípidos que comprenden principalmente TAG (triacilgliceroles). Normalmente la cantidad de TAG en el medio de cultivo empleado es al menos 1 g/litro del medio.

Pueden usarse diversos Streptomyces en la invención. Pueden seleccionarse del grupo que comprende Streptomyces roseosporus, Streptomyces griseus, Streptomyces albus, Streptomyces peucetius, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces avermitilis y Streptomyces lydicus.

Las cepas de Streptomyces pueden seleccionarse del grupo que comprende cepas de Streptomyces roseosporus GAL4111, Streptomyces roseosporus G011, Streptomyces griseus GAL1005, Streptomyces albus GAL1001, Streptomyces peucetius D2, GAL4082, Streptomyces peucetius P55 GAL4081, Streptomyces aureofaciens GAL1004, Streptomyces lividans GAL1002, Streptomyces coelicolor GAL1003, Streptomyces hygroscopicus GAL4051, Streptomyces avermitilis GAL1006 y Streptomyces lydicus GAL1007.

Son ventajosas en el proceso de la presente invención las especies o cepas de Streptomyces que no producen o solo muy pocas cantidades de metabolitos bioactivos.

En una realización específica de la invención las especies o cepas de Streptomyces pueden hacerse deficientes en la producción de metabolitos bioactivos. Los ejemplos de metabolitos bioactivos son por ejemplo agentes antibióticos, tales como antibióticos lipopeptídicos, por ejemplo daptomicina o agentes quimioterapéuticos, tales como daunomicina.

Las cepas que producen bajas cantidades de compuestos bioactivos o que se hacen deficientes en la producción de compuestos bioactivos son por ejemplo cepas seleccionadas del grupo que comprende Streptomyces roseosporus GAL4111, Streptomyces roseosporus g011, Streptomyces griseus GAL1005, Streptomyces albus GAL1001, Streptomyces peucetius P55 GAL4081 y Streptomyces peucetius D2 GAL4082.

En un aspecto la invención proporciona un cultivo de Streptomyces, que comprende

(a) una población de bacterias del género Streptomyces; y (b) un medio de cultivo que comprende desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos o mezclas de los mismos como fuente o fuentes de carbono y/o nutrientes.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En otro aspecto de la invención, la presente invención proporciona nuevos hospedadores Streptomyces genéticamente modificados capaces de una producción eficaz de lípidos.

En una realización de la invención las células hospedadoras de Streptomyces pueden modificarse genéticamente para expresar al menos un gen de la ruta de biosíntesis de los lípidos. En particular, el gen puede ser un gen que codifica la diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) y/o un gen que codifica la proteína vehículo 3-cetoacil-acil sintasa III (FabH).

En una realización de la invención las células hospedadoras de Streptomyces pueden modificarse genéticamente para expresar uno o más genes seleccionados del grupo que comprende

(a) sco0958 (SEQ ID NO: 1) y/o sco5888 (SEQ ID NO: 2);

(b) el homólogo más cercano de dichos genes en una especie de Streptomyces;

(c) una secuencia de nucleótidos que hibrida a al menos uno de dichos genes o dichos homólogos en condiciones de rigurosidad;

(d) una secuencia de nucleótidos que causa la misma o una función equivalente a la que tienen los productos génicos ID 101096381 o ID 101101330; y/o

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 60 % de identidad a SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

En particular, las cepas genéticamente modificadas adecuadas son cepas seleccionadas del grupo que comprende G009, G010, G012, G013, G014, G015, G016, G017 y G019.

En una realización específica de la presente invención se proporcionan nuevas cepas de Streptomyces seleccionadas del grupo que comprende G009, G010, G013 y G017.

En un aspecto adicional la presente invención proporciona el uso de cualquiera de las células hospedadoras, los cultivos o las cepas de Streptomyces para producir lípidos y usar los lípidos como biocombustible o como un material de partida para la producción de biocombustible y/o lubricante.

Además, en un aspecto la invención proporciona productos obtenidos usando el proceso de acuerdo con esta divulgación.

Se obtienen ventajas considerables por los medios de la presente invención. Por medio del proceso y los microorganismos presentados en este punto, es posible producir eficazmente lípidos para biocombustible y/o lubricante, o como material de partida para la producción de biocombustible y/o lubricante. Las ventajas de la presente invención pueden resumirse como sigue:

En la presente invención se ha descubierto sorprendentemente que los estreptomicetos pueden producir altas cantidades de lípidos cuando se cultivan en un medio que comprende desecho o desechos y/o residuo o residuos orgánicos. El uso de desecho o desechos y/o residuo o residuos orgánicos como una fuente o fuentes de carbono y/o de nutrientes reduce los costes del medio de cultivo, en particular porque el desecho o desechos y/o residuo o residuos orgánicos son baratos y no necesitan o solo poco pretratamiento antes de su uso. Los componentes de los materiales de desecho o residuales no necesitan necesariamente separarse, hidrolizarse (despolimerizarse) y/o purificarse antes de que se añadan al medio de cultivo.

El rendimiento de los lípidos producidos por Streptomyces en el proceso puede aumentarse además usando inhibidores de lipasa en el medio de cultivo. Los inhibidores de lipasa son capaces de retardar o impedir la hidrólisis de acilgliceroles o la degradación de lípidos formados en el proceso.

El proceso como se describe en este punto produce lípidos que comprenden principalmente TAG (triacilgliceroles). Los compuestos preferidos adecuados para el procesamiento químico para la producción de biocombustible son los TAG.

La eficiencia de las especies o las cepas de Streptomyces para producir lípidos puede mejorarse además haciendo a las especies o cepas deficientes en la producción de metabolitos bioactivos, tales como agentes antibióticos. La cepa hospedadora modificada tiene más capacidad para producir lípidos, cuando no produce metabolitos bioactivos.

La eficiencia de la producción de lípidos puede aumentarse además produciendo nuevos hospedadores de Streptomyces genéticamente modificados que pueden modificarse genéticamente para expresar al menos un gen de la ruta de biosíntesis de lípidos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En lo siguiente, la invención se examinará más estrechamente con la ayuda de una descripción detallada y con referencia a algunos ejemplos funcionales.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta el esquema de proceso.

La Figura 2 representa el perfil de TLC (cromatografía en capa fina) de la cepa G009.

La Figura 3 muestra los cambios de PMV, masa celular y dispersión de lípidos en fracciones sólidas y líquidas en cultivos de 5 días de la cepa G009 en medio TSB líquido. El ciclo de crecimiento es de aproximadamente 36 horas después de lo que tiene lugar la lisis celular. La acumulación de TAG tiene lugar inmediatamente después de la fase de crecimiento rápido en 24 a 48 horas.

La Figura 4 presenta un ejemplo de la acumulación de TAG en diferentes medios por G009. Las muestras de izquierda a derecha son medio E05-14 después de 0, 2, 5 y 7 días, medio E05-15 después de cultivo de 0, 2, 5 y 7 días, patrones COD (octadecanato de colesterol), C (colesterol) y GTM (trimiristato de glicerilo), medio E05-16 después de 0, 2, 5 y 7 días, medio E05-17 después de cultivo de 0, 2, 5 y 7 días.

La Figura 5 presenta un ejemplo de la acumulación de TAG en diferentes medios por las cepas G017, G016, G013 y G011. Las muestras de izquierda a derecha son patrón GTM en concentraciones de 40, 20, 10 y 5 g/l, muestras de G017 después de 0, 1, 2 y 5 días de cultivo, muestras de G016 después de 2, 3 y 6 días de cultivo, muestras de G013 después de 1, 2, 5 y 6 días de cultivo, muestras de G011 después de 2, 3 y 6 días de cultivo.

Descripción detallada de la invención

“Biocombustible” se refiere a combustible sólido, líquido o gaseoso derivado principalmente de biomasa o biodesecho y es diferente de combustibles fósiles, que derivan de restos orgánicos de microorganismos, plantas y animales prehistóricos.

De acuerdo con la directiva de la UE 2003/30/EU “biodiesel” se refiere a un metil-éster producido a partir de aceite vegetal o aceite animal, de calidad diésel para su uso como biocombustible. Más ampliamente, biodiesel se refiere a ésteres de alquilo de cadena larga, tales como ésteres de metilo, etilo o propilo, a partir de aceite vegetal o aceite animal de calidad diésel. El biodiesel también puede producirse a partir de lípidos de microorganismos, por lo que los lípidos de microorganismos pueden originarse a partir de una bacteria, un hongo (una levadura o un moho), un alga u otro microorganismo.

“Diésel renovable” se refiere a un combustible que se produce por un tratamiento de hidrógeno de lípidos de un origen animal, vegetal o de microorganismo, o sus mezclas, por lo que un lípido de microorganismo puede originarse a partir de una bacteria, un hongo (una levadura o un moho), un alga u otro microorganismo. El diésel renovable puede producirse también a partir de ceras derivadas de biomasa por gasificación y síntesis de Fischer-Tropsch. Opcionalmente, además del tratamiento de hidrógeno, pueden realizarse isomerización u otras etapas de procesamiento. Los procesos de diésel renovable también pueden usarse para producir combustible a reacción y/o gasolina. La producción de diésel renovable se ha descrito en las solicitudes de patente EP 1396531, EP1398364, EP 1741767 y EP1741768.

El biodiesel o el diésel renovable pueden mezclarse con diésel basado en aceite mineral. Pueden añadirse aditivos adecuados, tales como conservantes y antioxidantes, al producto de combustible.

“Lubricante” se refiere a una sustancia, tal como grasa, lípido o aceite, que reduce la fricción cuando se aplica como recubrimiento para mover partes. Dos funciones principales distintas de un lubricante son la retirada de calor y disolver impurezas. Las aplicaciones de los lubricantes incluyen, pero no se limitan a usos en los motores de combustión interna como aceites de motor, aditivos en combustibles, en dispositivos dirigidos por aceite tales como bombas y equipo hidráulico o en diferentes tipos de aspectos. Normalmente los lubricantes contienen un 75-100 % de aceite base y el resto son aditivos. Los aditivos adecuados son por ejemplo detergentes, estabilizantes de almacenamiento, antioxidantes, inhibidores de corrosión, eliminadores de la turbidez, desemulsionantes, agentes antiespumantes, codisolventes y aditivos de la lubricidad (véase por ejemplo el documento US 7.691.792). El aceite base para el lubricante puede originarse a partir de aceite mineral, aceite vegetal, aceite animal o de una bacteria, un hongo (una levadura o un moho), un alga u otro microorganismo. El aceite base también puede originarse de ceras derivadas de biomasa por gasificación y síntesis de Fischer-Tropsch. El índice de viscosidad se usa para caracterizar el aceite base. SE prefiere normalmente un índice de viscosidad alto.

El término “lípido se refiere a una sustancia grasa, cuya molécula contiene generalmente, como una parte, una cadena de hidrocarburo alifático, que se disuelve en disolventes orgánicos no polares pero que es escasamente soluble en agua. Los lípidos son un grupo esencial de grandes moléculas en las células vivas. Los lípidos son, por ejemplo, grasas, aceites, ceras, ésteres de cera, esteroles, terpenoides, isoprenoides, carotenoides,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

polihidroxialcanoatos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres de ácido graso, fosfolípidos, glucolípidos, esfingolípidos y acilgliceroles.

El término “acilglicerol” se refiere a un éster de glicerol y ácidos grasos. Los acilgliceroles se dan de forma natural como grasas y aceites grasos. Los ejemplos de acilgliceroles incluyen triacilgliceroles (TAG, triglicéridos), diacilgliceroles (diglicéridos) y monoacilgliceroles (monoglicéridos).

La presente invención se refiere a métodos para la producción eficiente de lípidos por estreptomicetos usando medios de cultivo que comprenden desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos o mezclas de los mismos como una fuente de carbono y/o nutriente. Además el medio de cultivo puede comprender otros componentes, tales como sales minerales usadas normalmente al cultivar dichos microorganismos. El cultivo se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la producción de lípidos. El cultivo se lleva a cabo normalmente en un fermentador usando agitación y aireación.

En algunas realizaciones de la invención el desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos pueden usarse como la única o principal fuente de carbono y/o de nutrientes, o en algunas realizaciones como (un) suplemento o suplementos. El desecho o residuo puede comprender uno o más desecho o desechos o residuo o residuos o mezclas de los mismos.

Si un desecho o residuo es la “fuente principal de carbono y/o nutrientes” en el medio, significa que basado en el peso, la cantidad de desecho es mayor en el medio que la cantidad de ingredientes puros (es decir, azúcar) en el medio.

Si una fracción de desecho o residuo se usa “como un suplemento” significa que en la base del peso, la cantidad de fracción de desecho o residuo es menor en el medio que la cantidad de ingredientes puros (es decir, azúcar) en el medio.

En la presente invención se ha descubierto sorprendentemente que las bacterias Streptomyces acumulan altas cantidades de lípidos y en particular de los triacilgliceroles (TAG) cuando se cultivan en materiales de desecho y/o residuos.

Las bacterias del género Streptomyces se conocen bien en la industria farmacéutica. Se sabe que los estreptomicetos producen pequeñas moléculas, enzimas útiles y diversos metabolitos distintos por metabolismo primario y secundario. Normalmente, los procesos de fermentación aerobia son adecuados para diversas especies de Streptomyces ya que se ha desarrollado la metodología en muchas circunstancias usando estas bacterias como organismos modelo. En los procesos de la técnica anterior los estreptomicetos se cultivan normalmente en medios complejos para potenciar la acumulación de metabolitos industrialmente útiles, tales como antibióticos. El coste de estos procesos de fermentación está fuertemente influenciado por los costes de material y de purificación. La esterilización necesaria para mantener la fermentación libre de contaminantes es extremadamente consumidora de energía y los costes de esterilización son altos. Además cuando se producen antibióticos a granel la energía necesaria para la esterilización del medio forma la mayor categoría de coste en el proceso, aunque se fabrican en tanques de fermentación grandes y sencillos.

En la presente invención se ha descubierto sorprendentemente que los estreptomicetos pueden producir altas cantidades de lípidos cuando se cultivan en materiales de desecho y residuales. Es remarcable que los componentes de los materiales de desecho o residuales no necesariamente necesitan separarse, hidrolizarse (despolimerizarse) y/o purificarse antes de que se añadan al medio de cultivo. Por lo tanto, en algunas realizaciones el material de desecho puede añadirse al medio de cultivo sin ninguna separación, hidrólisis (mecánica, química o enzimática) o purificación. Por ejemplo, los materiales lignocelulósicos pueden usarse en el cultivo y la producción de lípidos sin hidrólisis (despolimerización) de los polisacáridos. En otras realizaciones pueden añadirse en forma bruta, es decir, comprendiendo algo de purificación preliminar, pero no purificándose para separar componentes. Adicionalmente, el desecho o el residuo pueden añadirse como tales, o dependiendo de la estructura del material, pueden añadirse en forma molida o machacada al medio de cultivo. Los desechos y/o residuos pueden utilizarse también en forma parcial o completamente purificada, separada o hidrolizada (despolimerizada) para la producción de lípidos por Streptomyces.

En la presente divulgación “desecho orgánico o residuo” se refiere en particular al material de desecho, del que los componentes no están, o al menos no completamente, separados, hidrolizados (despolimerizados) y/o purificados. El uso de desechos o material residual sin separación, hidrolización (despolimerización) y/o purificación de los componentes hace a los procesos de la presente invención más rentables en comparación con el uso de ingredientes puros. Sin embargo, en algunas realizaciones de la invención pueden usarse ingredientes puros en medios de cultivo como fuentes de carbono además del material o materiales de desecho.

“Desecho o residuo orgánico no estéril o medio de cultivo que comprende desecho o residuo” se refiere en particular a material o medio de desecho o residual, que no está esterilizado. En algunas realizaciones, el material o medio de desecho puede pasteurizarse.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Por esterilización se entiende que el material o medio de desecho o residual que comprende el material de desecho o residual se trata con alta temperatura, normalmente a 121 °C durante al menos 20 minutos.

“Pasteurización” se refiere al calentamiento de un material o medio de deshecho o residual que comprende material de desecho o residual a 60 °C - 75 °C durante 2 - 30 minutos. Como se describe en el presente documento incluso con alto contenido de fracciones de desecho o residuales hasta 200 g/l, no se detectaron células vivas o esporas en TSA (Agar de Soja Tríptico). En los cultivos donde se usaron medios pasteurizados en vez de medios esterilizados, no se encontraron diferencias en el crecimiento de los estreptomicetos. El medio de cultivo puede comprender desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos o su combinación con nutrientes puros.

En algunas realizaciones de la presente invención un medio de cultivo que contiene desecho o residuo orgánico puede usarse como tal, en algunas realizaciones sin esterilización por cualquier método, o sin pasteurización. Medio “no estéril” significa que el medio de cultivo con material de desecho o residual no se esteriliza por ningún método.

En la presente divulgación “desecho o residuo orgánico” e refiere en particular a desecho o residuo de la industria incluyendo agricultura, desechos municipales o residuos microbianos. Dicho desecho o residuo normalmente (i) no se usa como comida para personas o animales y (ii) se forma en grandes cantidades (normalmente en cientos o millones de toneladas al año globalmente). Un gran grupo de desechos orgánicos de la industria cumple estos criterios. “Desecho o residuo orgánico” se refiere a cualquier material o fracción de desecho o residual que es biológicamente degradable.

El desecho o residuo industrial puede comprender residuo de menudencias, residuo orgánico o residuo de la producción de comida o alimentación, por ejemplo de panadería, cervecería, por ejemplo, pasta, extracto de malta, matadero, por ejemplo residuo de menudencias, restos de carne o pescado, industria azucarera por ejemplo pulpa de remolacha azucarera, o materiales o residuos celulósicos o lignocelulósicos derivados de madera, o residuos agrícolas, tales como residuos de grano, por ejemplo, salvado, barcia, paja, tallos, bagazo de azúcar de caña u otras plantas tales como cultivos celulósicos, pasto varilla, hierba cinta, Miscanthus, fibra de sorgo, fibra de caña o residuos vegetales, tales como licor de maíz fermentado (CSL) o glicerol, por ejemplo, de la producción de biodiesel.

Los desechos municipales pueden comprender lodo municipal, papel de deshecho, biodesechos de cocina institucional o de los hogares, desechos orgánicos del jardín o desechos orgánicos de la producción de comida.

Los desechos microbianos pueden comprender células microbianas o restos celulares (por ejemplo, lactobacilos, estreptomicetos) por ejemplo de procesos industriales basados en el uso de microorganismos, o restos de algas (por ejemplo, Phaeodactylum, Chlorella, Dunaliella, Nannochloropsis).

El desecho o desechos o residuo o residuos preferidos son desechos o residuos lignocelulósicos de la agricultura y desechos o residuos de los procesos de la industria de la pulpa y el papel incluyendo cultivos celulósicos (de energía).

El desecho o desechos o residuo o residuos preferidos son también biodesechos de cocina institucional o de la industria de comida o alimentación.

El desecho o desechos o residuo o residuos preferidos son también desechos o residuos microbianos, en particular desechos o residuos de algas o bacterianos. Los materiales de desecho o residuos orgánicos se refieren en particular a cualquier desecho o residuo orgánico, que Streptomyces puede usar para crecer y/o para la producción de lípidos.

En algunas realizaciones de la invención los desechos o residuos orgánicos pueden suplementarse con una fuente de carbono adicional, tales como glicerol, una fracción de la industria del azúcar o del almidón, jarabe o jarabes de azúcar o de almidón o azúcar o azúcares purificados o cualquier mezcla de los mismos. Más específicamente los desechos o residuos orgánicos pueden suplementarse con productos brutos de la industria del azúcar y del almidón, tales como jarabes de azúcar, jarabes de almidón, jarabes de glucosa (dextrosa) o melazas. Además, los desechos pueden suplementarse con azúcar o azúcares únicos o mezclas de C6 o C5 tales como glucosa, fructosa, manosa, xilosa o arabinosa, dímeros de azúcares tales como sacarosa o lactosa o polímeros de azúcar tales como celulosa, almidón o xilano, El uso de suplementos de la industria del azúcar o el almidón u otros azúcares purificados puede aumentar y acelerar el crecimiento de los estreptomicetos y/o la acumulación de lípidos.

El término desecho o residuo orgánico abarca también la frase “fracción de desecho o residual”. La frase “fracción de desecho o residual” se refiere, por ejemplo, al desecho producido como un producto secundario (rama) o un producto secundario (rama) de un proceso industrial que produce algún otro producto como el producto principal.

Dentro del alcance de la presente invención está el uso de desechos orgánicos o residuos solos o en cualquier combinación o mezcla.

En términos de acumulación de lípidos en los cultivos es ventajoso usar el desecho o el residuo al jarabe de almidón

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

o jarabe de azúcar en la relación de 10/1 a 1/2, preferentemente de 5/1 a 1/1. Por ejemplo, se encontró una buena acumulación de lípidos en cultivos que contenían 10-50 g/l de desecho con 10 g/l de jarabe de azúcar.

Adicionalmente, como se describe en el presente documento, es beneficioso para el crecimiento celular suplementar el material de desecho o residual orgánico industrial con residuos microbianos, tales como restos celulares. Como se describe en el presente documento se encontró buen crecimiento por ejemplo en cultivos con restos celulares, en particular se usó de origen bacteriano o de algas junto con material de desecho orgánico, tal como CSL (Licor destilado de maíz) y/o con Farmamedia como medio de suplemento. Por ejemplo, pueden usarse en la invención los restos bacterianos de estreptomicetos o lactobacilos y/o restos de algas de Phaeodactylum, Chlorella, Dunaliella y Nannochloropsis. Otro suplemento beneficioso para el crecimiento celular de acuerdo con la presente invención es la soja.

El almidón es ventajoso para la acumulación de lípidos. Sin embargo, económicamente es beneficioso, si se reemplaza el almidón por residuos agrícolas, tales como bagazo, salvado, barcia o paja. Las células o los residuos de algas o microbianos, tales como restos bacterianos o de algas, biodesechos, carne, CSL, OVR (suministro proteico de grano (cebada)), alimentación de visón y/o menudencias pueden reemplazar los ingredientes basados en proteínas normalmente útiles en la fermentación de estreptomicetos, tales como extracto de levaduras, Farmamedia y/o soja.

En el medio de cultivo pueden usarse desechos o residuos en una amplia escala. En algunas realizaciones la cantidad de desecho o residuo en el medio de cultivo puede variar de 1 g/l a 400 g/l, normalmente de 2 g/l hasta 200 g/l, en algunas realizaciones de 20 a 150 g/l, en algunas otras realizaciones de 50 a 100 g/l. Se ha descubierto que los estreptomicetos usan eficazmente fracciones de desecho para el crecimiento y se ha descubierto que la acumulación de lípidos es similar cuando se compara con cultivos con nutrientes puros.

Como se describe en el presente documento el crecimiento celular puede seguirse usando el volumen de micelios empaquetados (PMV), los cambios de masa celular, colocando en placa y por análisis de microscopio y visuales.

El crecimiento celular de alta densidad se obtiene con varias fracciones de desecho. En diversas realizaciones varía de 1 a 200 g/l, normalmente de 10 a 130 g/l como masa de células secas.

Los valores de PMV con varias fracciones de desecho varían del 1 % al 80 %, normalmente del 6 % al 40 % en las condiciones de cultivo convencionales (28 °C, 150 rpm).

Está claro, sin embargo, que pueden obtenerse densidades celulares incluso mayores ajustando las condiciones de fermentación en consecuencia. Por otro lado la masa celular no se correlaciona directamente con las cantidades de lípidos acumuladas.

Dentro del alcance de la presente invención también está el uso de material de desecho en combinación con ingredientes puros.

El desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos hidrolizados o parcialmente hidrolizados (despolimerizados) son usables en la presente invención. Los desechos o residuos pueden hidrolizarse por hidrólisis (termo)mecánica, química o enzimática. Por ejemplo, el material de desecho o residual puede tratarse por enzimas adecuadas para digerir ingredientes brutos. Las enzimas adecuadas son por ejemplo celulasas, hemicelulasas, xilanasas y pectinasas. También pueden usarse en la invención estreptomicetos que posean tanto funciones de enzimas digestivas como que tengan la capacidad de acumular lípidos. De esta manera, no es necesario el procesamiento del desecho. Por ejemplo, las cepas adecuadas para este fin son aquellas que pertenecen a las especies S. roseosporus y S. albus.

Dentro del alcance de la presente invención están los cultivos en lote, semi-discontinuos y continuos.

En los cultivos con sustancias sólidas o semisólidas como materiales brutos (fuentes de carbono y/o nutrientes), la biomasa puede disminuir en los primeros días de cultivo debido a la utilización de materias primas por microorganismos que aumentan en los siguientes días.

En algunas realizaciones de la invención Streptomyces produce lípidos como se estima por la masa seca de extractos de cloroformo derivados de los cultivos al menos 0,1 g/litro, preferentemente al menos 0,5 g/litro, más preferentemente al menos 1 g/litro, aún más preferentemente al menos 5 g/litro del medio de cultivo gastado, en algunas realizaciones al menos 10 g/litro, normalmente 5 - 30 g/litro, en algunas otras realizaciones 10 a 25 g/litro hasta 150 g/litro estimados como masa seca de los extractos de cloroformo. Varía en algunas realizaciones en el intervalo de 1 - 200 g/litro, siendo normalmente 5-100 g/litro del medio de cultivo gastado.

En algunas realizaciones de la invención la concentración (título) de los TAG es generalmente al menos 0,1 g/l (0,1 kg/1000 litros), preferentemente al menos 0,5 g/l (0,5 kg/1000 litros), más preferentemente al menos 1 g/l (1 kg/1000 litros), aún más preferentemente al menos 5 g/l (5 kg/1000 litros) del medio de cultivo gastado. Habitualmente varía

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de 0,5 a 150 kg/1000 litros, en algunas realizaciones 1 a 100 kg/1000 litros, en algunas realizaciones distintas 1 a 70 kg/1000 litros, normalmente siendo aproximadamente 5 - 50 kg/1000 litros, en algunas realizaciones 10 a 30 kg/1000 litros, en algunas realizaciones distintas 15 a 25 kg/1000 litros de medio de cultivo gastado.

La mejora de la producción de TAG por las cepas genéticamente modificadas es generalmente al menos el 10 %, normalmente al menos el 30 %, en algunas realizaciones al menos el 50 % e incluso el 100 - 300 % en comparación con las cepas parentales.

“Medio de cultivo gastado” se refiere a un medio usado en el cultivo de microorganismos y que comprende los productos acumulados por los microorganismos. El medio de cultivo gastado puede denominarse también caldo de cultivo.

Adicionalmente, en diversas realizaciones de la invención la cantidad de lípidos totales es al menos un 10 % por su peso de masa celular seca, normalmente es el 20 - 60 % en su peso de masa celular seca.

En diversas realizaciones de la invención la fracción lipídica producida por los estreptomicetos comprende principalmente TAG. Esto significa que al menos el 30 % en peso, en algunas realizaciones al menos el 50 % en peso, en algunas realizaciones distintas al menos el 60 % en peso, todavía en algunas realizaciones adicionales al menos el 70 % en peso, todavía en algunas realizaciones adicionales al menos el 80 % en peso o todavía en algunas realizaciones adicionales al menos el 90 % en peso de la fracción lipídica es TAG.

El perfil lipídico característico de una cepa no modificada (cepa parental) o genéticamente modificada cultivada en azúcar puro normalmente comprende de aproximadamente el 70 al 95 % en peso de TAG y aproximadamente el 5 al 30 % en peso de oligómeros, diacilgliceroles y monocilgliceroles y ácidos grasos libres. Los ácidos grasos de cepas de Streptomyces no modificadas o genéticamente modificadas comprenden normalmente ácidos grasos de cadena ramificada y recta. La fracción de ácidos grasos ramificados puede estar entre el 20 y el 80 % en peso y normalmente está entre el 40 y el 70 % en peso. El contenido de ácidos grasos metil-ramificados puede estar entre el 45 y el 50 %. La mayoría de los ácidos grasos determinados eran saturados.

Además, los lípidos de Streptomyces también contienen escualeno o derivados de escualeno normalmente del 2 al 5 % en peso, que pueden usarse como aceites de base o material de partida para aceites de base para aplicaciones de lubricantes.

Los perfiles lipídicos de los estreptomicetos se han informado en la bibliografía por Olukoshi y Packter (1994), por Packter y Olukoshi (1995).

La composición del perfil lipídico cambia más probablemente cuando Streptomyces se cultiva en un medio que comprende desecho o desechos o residuo o residuos en lugar de azúcar puro, porque la extracción de lípidos puede comprender lípidos del desecho (por ejemplo se extraen fosfolípidos de membrana).

“Lípidos” se refiere generalmente en este punto a los lípidos producidos por Streptomyces durante el cultivo y a los lípidos contenidos en los componentes del medio de cultivo, en particular el material de desecho o residual en el medio de cultivo. “Una fracción lipídica” se refiere a una fracción de los lípidos, tales como TAG o ácidos grasos ramificados o escualenos.

En algunas realizaciones de la invención, los restos celulares e incluso los residuos de algas dan cantidades remarcables de lípidos dominando los TAG. La fuente de nutrientes y/o de C preferida de las algas son Chlorella y Dunaliella, que dieron la cantidad más alta de TAG en el medio de cultivo gastado.

Como se describe en el presente documento, los cultivos en lote prolongados de las cepas de Streptomyces en fracciones de desecho (normalmente excediendo 7 días) y en medio basado en ingredientes puros (normalmente excediendo 5 días) resultan en la desaparición de los TAG y algunos otros lípidos, sugiriendo que los lípidos se degradan.

En algunas realizaciones de la invención pueden añadirse inhibidores de lipasa al medio de cultivo. Los inhibidores de lipasa adecuados son por ejemplo iones plata (Lee & Lee, 2006) o sustancias catiónicas (Cote y Sharech, 2008). Usando inhibidores de lipasa es posible inhibir la degradación de los lípidos y potenciar la acumulación de TAG. Incluso concentraciones pequeñas de inhibidores, por ejemplo AgNO3 en concentración de 0,04 a 0,06 g/l, son útiles como se muestra en el Ejemplo 12.

En algunas realizaciones de la invención la inoculación del medio de cultivo se lleva a cabo por micelios o esporas de estreptomicetos. En realizaciones preferidas la inoculación se lleva a cabo usando esporas. La cantidad de esporas puede ser 107 - 109 esporas/un litro (por ejemplo 5 x 1012 esporas/500 litros).

En algunas realizaciones de la invención el cultivo puede llevarse a cabo en 1 a 21 días, normalmente en 2 a 14 días, preferentemente en 2 a 6 días. En algunas realizaciones los inhibidores de lipasa pueden añadirse en el medio

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(o después del inicio antes del final) del cultivo.

En diversas realizaciones de la invención la temperatura de cultivo es habitualmente de 20 a 36 °C, normalmente es 26-30 °C.

El cultivo de estreptomicetos para la producción de lípidos se lleva a cabo habitualmente en diversas realizaciones de la invención en un medio de cultivo líquido en un fermentador preferentemente en aireación y agitación adecuadas. La velocidad de mezclado varía normalmente de 0 a 800 rpm, siendo normalmente 150 - 600 rpm.

Ya que los desechos o residuos pueden contener lípidos es racional seguir el uso de los lípidos externos para determinar los lípidos formados por las cepas bacterianas. Como se describe en el presente documento la utilización de lípidos externos se siguió por los cambios en la masa sólida y los cambios en los perfiles lipídicos. Se mostró que la biomasa disminuyó hasta 36-48 horas desde el inicio del cultivo y empezó a aumentar después de eso. El tiempo del ciclo depende del grado de procesamiento del desecho en uso. Sin embargo, no se encontraron diferencias remarcables después de cinco días de cultivo cuando se siguió el cultivo hasta 8 días. Los lípidos fueron detectables en el sobrenadante en la muestra 0 y aumentaron en una fracción sólida hasta 4-5 días. Después de eso los lípidos se redujeron en la fracción celular y una parte de los lípidos se encontró en el sobrenadante y probablemente una parte de los lípidos acumulados se usó para el metabolismo. La Figura 3 demuestra el seguimiento de PMV, la masa celular y los lípidos de las fracciones sólidas y líquidas en un cultivo de 8 días. Puede concluirse que los lípidos detectados después de 3 días derivaron del metabolismo bacteriano.

Los rendimientos de los lípidos (gupidos/gglucosa) determinados al azúcar suministrado variaron en el intervalo del 10-55 %. Los rendimientos se determinaron basándose en el azúcar puro suministrado y no considerando el azúcar incluido en los desechos y los residuos. El máximo teórico del rendimiento lipídico a partir de glucosa es el 33 %. Sin embargo en la práctica el rendimiento lipídico máximo es el 20-22 % (Ratledge y Cohen 2008). De esta manera, los rendimientos lipídicos más altos del 22 % indican que se generaron (produjeron) lípidos a partir de los materiales de desecho y residuales.

Cepas de Streptomyces

Por bacterias Streptomyces se entiende en este punto cualquier especie o cepa que pertenezca al género Streptomyces.

Las especies preferidas en diversas realizaciones de la invención son especies seleccionadas del grupo que comprende Streptomyces roseosporus, Streptomyces griseus, Streptomyces albus, Streptomyces peucetius, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces avermitilis y Streptomyces lydicus. Las especies más preferidas son Streptomyces roseosporus, Streptomyces griseus, Streptomyces albus, Streptomyces peucetius y Streptomyces aureofaciens.

Más específicamente, la cepa de Streptomyces puede seleccionarse del grupo que comprende Streptomyces roseosporus GAL4111, Streptomyces roseosporus G011, Streptomyces griseus GAL1005, Streptomyces albus GAL1001, Streptomyces peucetius D2 gAl4082, Streptomyces peucetius P55 GAL4081, Streptomyces aureofaciens GAL1004, Streptomyces lividans GAL1002, Streptomyces coelicolor GAL1003, Streptomyces hygroscopicus GAL4051, Streptomyces avermitilis GAL1006 y Streptomyces lydicus GAL1007. Más preferentemente la cepa se selecciona del grupo que comprende Streptomyces roseosporus GAL4111, Streptomyces griseus GAL1005, Streptomyces albus GAL1001, Streptomyces peucetius D2 GAL4082 y Streptomyces aureofaciens GAL1004.

Se sabe que diversas especies de estreptomicetos pueden acumular triacilgliceroles (TAG) en pequeñas cantidades: S. albus (Álvarez y Steinbüchel, 2002); S. lividans (Packter ND Olukoshi, 1995, Álvarez y Steinbüchel, 2002); S. coelicolor (Arabolaza et al., 2008, Álvarez y Steinbüchel, 2002); S. hygroscopicus (Gesheva et al., 1997); S. aureofaciens (Béhal y Jílek, 1969); S. griseus (Suutari et al., 1992, Álvarez y Steinbüchel, 2002); S. avermitilis (Kaddor et al., 2009; Novák et al. 1992); y S. lydicus (Nagao et al., 1991). La publicación por Waltermann et al. (2006) caracteriza productos génicos implicados en la biosíntesis de lípidos neutros en bacterias. Sin embargo, la producción de lípidos adenso un proceso de fermentación típico de la técnica anterior es relativamente consumidor de energía y por lo tanto caro.

En esta divulgación las bacterias de Streptomyces se refieren en particular a cultivos puros de bacterias que pertenecen al género Streptomyces. En algunas realizaciones diferentes especies o cepas de Streptomyces en combinación pueden cultivarse posteriormente o juntas. Adicionalmente, en la presente divulgación las bacterias de Streptomyces se refieren en particular a especies y cepas de Streptomyces capaces de producir lípidos de forma natural. En algunas realizaciones de la invención la capacidad de las especies o cepas de Streptomyces puede mejorarse introduciendo secuencias de ácidos nucleicos responsables de la producción de lípidos en cepas de Streptomyces y expresar estas secuencias de ácidos nucleicos bajo elementos reguladores, tales como un promotor, reconocido por el hospedador Streptomyces.

5

10

15

20

25

30

35

40

También es posible mejorar las especies o cepas de Streptomyces usadas en la producción de lípidos haciendo a las cepas hospedadoras deficientes en la producción de productos bioactivos endógenos, tales como antibióticos lipopeptídicos. Esto puede llevarse a cabo por métodos de biología molecular bien conocidos en la técnica. Los métodos útiles son por ejemplo la deleción del gen responsable de producir productos bioactivos o diversos métodos de mutagenización, tales como mutagénesis dirigida al sitio.

“Hacer a un gen deficiente” se refiere bien a una modificación genética del hospedador Streptomyces para eliminar o truncar un gen específico o bien una modificación genética del hospedador Streptomyces dando como resultado una expresión reducida del gen o actividad reducida del producto génico por cualquier método adecuado. Por “inactivación” se entiende una modificación genética (habitualmente deleción) que resulta en la pérdida completa de actividad de un producto génico.

En el contexto del trabajo resultante en la presente invención, se estudiaron 11 cepas de Streptomyces para la acumulación de metabolitos incluyendo la fracción lipídica, los triacilglicéridos denominados TAG en el presente documento. Todas las cepas ensayadas acumularon cantidades detectables de TAG y sorprendentemente, cuatro fuera de las 11 cepas de Streptomyces ensayadas crecían muy rápido dando una masa celular en húmedo que excedía 200 g/l en dos a tres días (véase la Tabla 1). Estas cepas fueron Streptomyces aureofaciens GAL1004, Streptomyces roseosporus GAL4111 y el mutante derivado de ella, G011, Streptomyces griseus GAL1005 y Streptomyces albus GAL1001. Las cepas se cultivaron y analizaron además para la producción de TAG. Además, se verificó la capacidad de las cepas para retener su carácter no productor de metabolitos bioactivos durante el almacenamiento.

Como se describe en el presente documento se cultivaron 11 cepas de Streptomyces en condiciones típicas de cultivo para potenciar el crecimiento y también la acumulación de metabolitos secundarios. Los medios usados fueron TSB, 2*TY y E05. Las condiciones de cultivo en un agitador fueron, 28 °C, 30 °C y 34 °C con agitación de 150 y 300 rpm.

El contenido de los medios de cultivo fue:

TSB: 17 g/l de digestión pancreática de caseína, 3 g/l de digestión enzimática de alimento de soja, 2,5 g/l de dextrosa, 5 g/l de cloruro sódico, 2,5 g/l de fosfato dipotásico;

2*TY: 16 g/l de triptona peptona, 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl;

E05: 20 g/l de dextrosa, 20 g/l de almidón, 5 g/l de farmamedia, 2,5 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de MgSO4'7 H2O, 1 g/l de KH2PO4, 3 g/l de CaCOs, 3 g/l de NaCl.

La Tabla 1 muestra características de las cepas y los resultados relevantes de los cultivos realizados en medio TSB. Los TAG se estimaron por TLC en placa en comparación con patrón.

Tabla 1.

Código de Galileo

Cepa Características Tiempo de crecimiento en días (a partir de la curva de crecimiento) El PMV más alto Masa celular húmeda/seca g/l TAG (g/l)

GAL1001

S. albus Ciclo de crecimiento rápido y fácil de cultivar. No productor de metabolitos bioactivos. 2 10 275/42 0,15

GAL1002

S. lividans Ciclo de crecimiento rápido. 3 8 102/13 0,1

GAL1003

S. coelicolor Ciclo de crecimiento rápido. Cepa bien conocida. 2 10 3 días 127/14 0,1

GAL4051

S. hygroscopicus Ciclo de crecimiento rápido. 2 10 3 días 125/13 0,1

GAL1004

S. aureofaciens Ciclo de crecimiento rápido. 2 16 2 y 3 días 220/46 0,5

GAL1005

S. griseus Ciclo de crecimiento rápido. Produce compuestos bioactivos de diferentes clases químicas. Cepa bien conocida. 2-3 12 3 días 206/47 0,5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

GAL4111

S. roseosporus Ciclo de crecimiento rápido y fácil de cultivar. Produce lipopéptido cíclico donde la síntesis peptídica podría inactivarse. 1 10 280/40 0,5

GAL1006

S. avermitilis Ciclo de crecimiento rápido. 2-3 16 210/19 0,1

GAL1007

S. lydicus Ciclo de crecimiento rápido. 2 10 12/15 0,1

GAL4081

S. peucetius P55 Inactivado en la producción de metabolitos secundarios (antracina) 5 6 114/8 0,1

GAL4082

S. peucetius D2 Inactivado en la producción de metabolitos secundarios (antracina) 2 10 140/18 0,5

Las cepas que son capaces de crecer bien determinado por la masa celular húmeda y/o el valor de PMV y de acumular niveles detectables de lípidos en un tiempo de cultivo corto, son cepas preferibles para el desarrollo adicional que concierne mejora de cepas para la acumulación de lípidos y para el desarrollo de condiciones de fermentación.

Cepas diseñadas por ingeniería genética para la producción potenciada de aceite

La construcción de hospedadores recombinantes (es decir OGM cepas manipuladas genéticamente) que producen lípidos eficientemente se ejemplificó en el presente documento introduciendo genes implicados en la biosíntesis de lípidos en algunos hospedadores de Streptomyces que tienen la capacidad de acumular eficazmente los lípidos de forma natural.

Tanto las cepas originales como los clones que llevan los genes implicados en la biosíntesis de lípidos se cultivaron en una gran diversidad de materiales de desecho y residuales incluyendo biodesechos. Inesperadamente, las cepas fueron capaces de crecer y producir fracción lipídica en fracciones de desecho o residuales e incluso sin fuentes de carbono adicionales.

Los cultivos revelaron un tiempo de ciclo de crecimiento rápido: la fase estacionaria se alcanzó en 24 horas o incluso antes con acumulación de lípidos continuada incluso hasta 6 días en lo sucesivo. La masa celular seca/húmeda en el cultivo no aumentó remarcablemente por los clones en comparación con la cepa parental. Sin embargo, se observó un aumento remarcable en la acumulación de lípidos, incluso hasta el 300 % de mejora en comparación con las cepas parentales, en particular en la fracción principal de TAG.

Como se describe en el presente documento los hospedadores estreptomicetos que muestran propiedades adecuadas para procesos de fermentación de bio-combustible industriales útiles pueden mejorarse además por cualquier método de mejora de cepas conocido, tales como selección natural, mutagenización aleatoria y por ingeniería genética.

Los genes adecuados para mejorar la acumulación de lípidos comprenden diversos genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de ácidos grasos. Los genes adecuados son en particular el gen que codifica la diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) (EC 2.3.1.20) y el gen que codifica la proteína vehículo 3-cetoacil-acil sintasa III (FabH) (EC 2.3.1.41).

Un gen que codifica la función DGAT (EC 2.3.1.20) es, por ejemplo, sco0958 (SEQ ID NO: 1) y un gen que codifica la proteína vehículo 3-cetoacil-acil sintasa III (FabH) (EC 2.3.1.41) es, por ejemplo, sco5888 (SEQ ID NO: 2). El gen sco0958 (ID101096381) cataliza la última etapa en la biosíntesis de tAg (Arabolaza et al., 2008) y sco5888 (ID101101330) (Li et al., 2005) es responsable de la primera etapa de elongación en la biosíntesis de ácidos grasos. Los genes sco5888 y sco0958 se originan de S. coelicolor.

Dentro del alcance de la invención están también los homólogos más cercanos de dichos genes sco0958 y sco5888 en diversas especies de Streptomyces.

Dentro del alcance de protección están también las secuencias de nucleótido que hibridan con al menos uno de dichos genes o dichos homólogos en condiciones de rigurosidad.

Dentro del alcance de la invención están también las secuencias de nucleótido que provocan la misma o una función

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

equivalente a los productos génicos ID 101096381 o ID 101101330.

Dentro del alcance de la presente invención está también una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 60 % de identidad, preferentemente al menos un 65 %, preferentemente al menos un 70 %, preferentemente al menos un 75 %, preferentemente al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, aún más preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 98 % de identidad a las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

Dentro del alcance de la presente invención están las secuencias de nucleótido que provocan la misma función que o función equivalente a dichos genes sco0958 (ID 101096381) y sco5888 (ID 101101330). Dichas secuencias de nucleótido pueden ser fragmentos o derivados de dichos genes, los homólogos más cercanos de dichos genes en otras especies de Streptomyces o secuencias de nucleótido que hibridan a al menos uno de dichos genes o dichos homólogos.

La hibridación se lleva a cabo preferentemente en condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones rigurosas pueden definirse como hibridación a 65 °C en una concentración baja de sal, citrato sódico 1,5 mM, pH 7,0 y NaCl 0,015, de acuerdo con el manual de Boehringer Mannheim, “DIG System User's Guide for Filter hybridization”.

Es evidente que pequeñas variaciones en la secuencia de nucleótidos de un gen no cambian significativamente las propiedades catalíticas de la proteína codificada. Por ejemplo muchos cambios en la secuencia de nucleótidos no cambian la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. También una secuencia de aminoácidos puede tener variaciones, que no cambian las propiedades funcionales de una proteína, en particular no evitan que una enzima lleve a cabo su función catalítica. Dichas variaciones en la secuencia de nucleótidos o las moléculas de ADN o en la secuencia de aminoácidos se conocen como “equivalentes funcionales” porque no cambian significativamente la función del gen para codificar una proteína con una función particular, por ejemplo, catalizando una reacción particular o, respectivamente, cambiando la función particular de la proteína. Dentro del alcance de la presente invención están los equivalentes funcionales, incluyendo fragmentos o derivados, o los homólogos más cercanos de la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Los Streptomyces capaces de producir enzimas implicadas en la biosíntesis lipídica pueden detectarse, la actividad en diversos sustratos puede determinarse y la enzima caracterizarse. Las secuencias de nucleótidos que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de lípidos en diversos organismos pueden aislarse y las secuencias de aminoácidos pueden compararse con las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Un experto en la materia también puede identificar una región conservada en la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos y clonar un fragmento génico usando técnicas de PCR. Después de secuenciar el fragmento puede obtenerse el gen completo por ejemplo usando una biblioteca de ADNc en un vector. Puede identificarse una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima también por hibridación de ácidos nucleicos.

Los métodos de biología molecular convencionales pueden usarse en la clonación de los genes, es decir, en el aislamiento y los tratamientos enzimáticos del ADN, en transformaciones en E. coli, el aislamiento de un fragmento que comprende el gen por amplificación en una reacción de PCR (Coen D M, 2001) y en las técnicas para el cambio de codones. Los métodos básicos usados se describen en los manuales de biología molecular convencionales, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001). La inserción de la secuencia de nucleótidos bajo un promotor fuerte en un vector de expresión, la transferencia del vector en células hospedadoras adecuadas y el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que provocan la producción de dicha enzima. Los métodos para la producción de proteínas por tecnología recombinante en diferentes sistemas hospedadores se conocen bien en la técnica (Gellissen, 2005).

Modificar genéticamente un hospedador Streptomyces para expresar un gen endógeno o exógeno puede llevarse a cabo por ejemplo introduciendo en un hospedador Streptomyces un gen exógeno de otra especie de Streptomyces o una copia o copias adicionales de un gen endógeno. El gen puede expresarse bajo un promotor reconocido por el hospedador Streptomyces. En algunas realizaciones el gen puede expresarse bajo otro promotor dando como resultado una expresión aumentada del gen. Alternativamente el hospedador Streptomyces puede modificarse genéticamente de tal manera que bien el gen se exprese más abundantemente o bien que la actividad del producto génico se aumente.

La frase “gen endógeno” se refiere en este punto a un gen que es natural al hospedador Streptomyces.

La frase “gen exógeno” se refiere en este punto a un gen que no es natural al hospedador Streptomyces.

El “homólogo más cercano de un gen de S. coelicolor”, en otras especies de Streptomyces se refiere en este punto a un gen con el porcentaje más alto de nucleótidos idénticos en alineación de secuencias del gen de S. coelicolor y los genes de las otras especies, o un gen cuyo producto proteico tiene el porcentaje más alto de aminoácidos idénticos al producto proteico codificado por el gen de S. coelicolor’. Por “homólogo más cercano” se entiende en particular un gen o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 60 %, preferentemente al menos el 80 %,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

preferentemente al menos el 85 %, más preferentemente al menos el 90 %, todavía más preferentemente al menos el 95 %, más y más preferentemente al menos el 98 % de identidad de secuencia de nucleótidos o de aminoácidos en comparación con un gen específico de S. coelicolor (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) o un producto de dicho gen (SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4).

El término “identidad” se refiere a la identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, respectivamente comparadas entre sí desde el primer ácido nucleico hasta el último ácido nucleico o desde el primer aminoácido codificado por el gen correspondiente hasta el último aminoácido. La identidad de las secuencias de longitud completa pueden medirse usando el programa de alineación global Needleman-Wunsch en el paquete de programa EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice et al., 2000). La versión del programa puede ser 2.9.0 y los parámetros: EMBLOSUM62, penalización por hueco 10,0, penalización de extensión 0,5.

“Modificación genética” de un hospedador Streptomyces significa en este punto cualquier método de modificación genética por el que un hospedador Streptomyces se modifica para expresar un gen endógeno o exógeno específico y/o para ser deficiente en un gen o genes específicos.

Los métodos de modificación genética para un hospedador Streptomyces están disponibles y son bien conocidos por un experto en la materia y se desvelan por ejemplo en Kieser et al., 2000.

Como se describe en el presente documento un método adecuado para introducir un gen en un hospedador Streptomyces es por ejemplo la transformación de protoplasto.

Los vectores para la introducción de las secuencias génicas, normalmente por ejemplo los fragmentos de PCR, en las cepas hospedadoras pueden seleccionarse entre cualquier vector que sea capaz de introducir el fragmento clonado en la cepa hospedadora. Los vectores de integración, el número medio de copias y los vectores de alto y bajo número de copias para introducir los fragmentos en hospedadores adecuados pueden usarse exitosamente.

Los vectores adecuados para transferir los fragmentos de ácidos nucleicos en hospedadores Streptomyces son por ejemplo pIJE486 (Ylihonko et al., 1996) y pHJL401 (Kieser et al., 2000).

Las cepas hospedadoras más preferidas son cepas de estreptomicetos mostradas en la Tabla 1, en particular las cepas GAL1001 y GAL4111 o cualquier cepa mutante derivada de dichas cepas.

Sin embargo, es ventajoso usar cepas mutantes incapaces de acumular compuestos bioactivos en el caldo de cultivo para la producción comercial de bio-combustibles. Para este fin las cepas más preferidas son GAL1001 y G011.

Como se describe en el presente documento S. roseosporus GAL4111 y un derivado del mismo deficiente en la producción de productos bioactivos endógenos, S. roseosporus G011 y GAL1001 se modificaron genéticamente usando genes implicados en la biosíntesis de lípidos.

Hay varios genes implicados en el metabolismo lipídico en bacterias. En la presente divulgación se ha demostrado que los genes sco0958 y sco5888 bien separadamente o en combinación aumentaron sorprendentemente las cantidades de TAG acumulados por los estreptomicetos. sco0958 es responsable de la reacción terminal en la biosíntesis de triacilglicérido (TAG) siendo una esterificación de diacilglicerol (DAG) de una molécula de ácido graso (Arabolaza et al., 2003). sco5888 es proteína vehículo 3-cetoacil acil que codifica la primera etapa de elongación de la biosíntesis de ácidos grasos (Li et al., 2005). Los genes pueden clonarse usando cualquier método de clonación adecuado. De acuerdo con una realización de la invención la clonación se lleva a cabo por PCR a partir del ADN cromosómico usando cebadores homólogos.

Los genes se introdujeron en dichas cepas por transformación de protoplasto. Las cepas que llevan estos genes separadamente o en combinación mostraron acumulación aumentada de TAG.

Las cepas OGM seleccionadas y designadas G009, G010, G013, G014, G015, G012, G016, G017 y G019 llevan un plásmido intacto que retiene las propiedades de cultivo y la acumulación de lípidos tras varios pasajes.

Las mejores cepas para la acumulación de fracciones lipídicas enriquecidas en TAG fueron los clones derivados de GAL1001, designados G009, G013 y G017.

Como se describe en el presente documento los vectores pIJE486 (Ylihonko et al., 1996) y pHJL401 (Kieser et al., 2000) se usaron para introducir los genes sco0958 y sco5888 en hospedadores Streptomyces GAL1001, GAL4111 y G011. En el Ejemplo 2 la Tabla 3 muestra los códigos usados para las cepas genéticamente modificadas. Todas las cepas produjeron más lípidos en comparación con las cepas parentales. Los cultivos se llevaron a cabo en temperaturas que varían de 20 a 36 °C, variando la agitación de 0 a 800 rpm y pH 5-8,5.

Las cepas OGM G009, G010, G013, G014, G015, G012, G016, G017 y G019 con sus cepas parentales, GAL1001,

5

10

15

20

25

30

GAL4111 y G011, como controles se cultivaron en una amplia diversidad de medios de cultivo. El rendimiento lipídico se estimó como (gupidos/gglucosa) * 100. Las cepas parentales GAL1001 y G011 produjeron lípidos como se estima por la masa seca de extractos de cloroformo y por análisis de TLC refiriéndose a patrones que son 0,1 - 0,5 g/l del caldo de cultivo, respectivamente. Los extractos de cloroformo de fracciones celulares de los transformantes dieron una masa en el intervalo de 5,9 - 25,2 g/l mientras que el contenido de TAG se estimó como 3 a 23 g/l. La mejor mejora se obtuvo por G009. Sorprendentemente, la fracción lipídica en TLC fue muy similar en todos los transformantes y > 70 % de los lípidos detectables estaba en la fracción TAG.

En los cálculos anteriores el contenido de azúcar se calculó ser 10 g/l en los medios ensayados que contenían 20 g/l de licor destilado de maíz, 10 g/l de Nutrisoy y 10 g/l de jarabe de dextrosa. Los cultivos se llevaron a cabo en matraces durante 5 días a 28 °C, 150 rpm, los lípidos se extrajeron de las células y el sobrenadante separadamente con el mismo volumen de cloroformo-metanol (2:1) agitando durante 1 hora. Se aplicó una muestra de la fracción de cloroformo en la placa de TLC y se evaporó una fracción de cloroformo a sequedad para la determinación de la masa.

Para que la composición lipídica obtenida sea adecuada para el procesamiento adicional en la fabricación de biocombustible, la naturaleza química de estos compuestos es crítica. Aunque diferentes formas de grasas son adecuadas para el procesamiento químico para la producción de biocombustible los compuestos preferidos son los TAG. Hay varios métodos conocidos para caracterizar adicionalmente los metabolitos además de analíticas por TLC (cromatografía en capa fina), por ejemplo GC (cromatografía de gases). El análisis por GC puede llevarse a cabo por un procedimiento convencional (ISO15304). Puede usarse HPLC para determinar el perfil lipídico de glicéridos de las cepas. Por ejemplo, el perfil lipídico característico de una cepa parental (ejemplificado por GAL1001) y de una cepa genéticamente modificada (ejemplificada aquí por G009) se da en la Tabla 2.

Tabla 2. Perfil glicérido de los lípidos como valor en porcentaje derivado de GAL1001 y G009 como se analiza por

HPLC.

La naturaleza de los lípidos

GAL1001 G009

TAG

95 88,6

Oligómeros

N.D. 5,2

Diacilgliceroles

N.D. 4,3

Monoacilgliceroles

N.D. 0,3

Ácidos grasos libres

5 1,7

*N.D. = no disponible

La mayoría de los lípidos en los estreptomicetos consistía en triglicéridos.

Tabla 3. Ejemplos de la distribución de ácidos grasos (% de los ácidos grasos totales) de S. roseosporus GAL4111 y

S. albus GAL1001 como se determina por GC-MS. Las dichas cepas se cultivaron durante 2 días en medio de desecho celular; 10 g/l de CSL y 50 g/l de desecho celular (restos celulares de estreptomicetos) sin suplementos

adicionales a 28 °C, 150 rpm.

GAL4111 GAL1001

n-C10:0

0,02 0,03

n-C10:1

0,01 0,00

iso-C11:0

0,03 0,00

anteiso-C11:0

0,06 0,00

n-C11:0

0,05 0,07

iso-C12:0

0,23 0,28

anteiso-C12:0

0,09 0,09

n-C12:0

0,11 0,12

iso-C13:0

0,25 0,29

anteiso-C13:0

0,45 0,55

n-C13:0

0,15 0,10

n-C13:1

0,00 0,00

iso-C14:0

6,41 7,32

anteiso-C14:0

0,27 0,33

n-C14:0

1,25 1,03

n-C14:1

0,06 0,00

iso-C15:0

3,94 4,34

anteiso-C15:0

13,20 14,66

n-C15:0

N.D. N.D.

n-C15:1

0,85 0,30

iso-C16:0

16,98 18,65

anteiso-C16:0

0,11 0,13

n-C16:0

14,78 14,30

n-C16:1

4,05 2,79

iso-C17:0

1,40 1,37

anteiso-C17:0

4,67 4,92

n-C17:0

0,61 0,58

n-C17:1

3,40 3,43

iso-C18:0

0,29 0,25

n-C18:0

1,78 1,54

n-C18:1

8,52 8,44

n-C18:2

13,06 11,43

n-C18:3

0,79 0,63

n-C19:1

0,47 0,46

n-C20:0

0,20 0,19

n-C22:0

0,71 0,99

n-C23:0

0,31 0,19

n-C24:0

0,14 0,12

Alcoholes grasos

0,12 0,09

Otros ácidos grasos

0,18 0,00

* N.D. = No disponible

El aceite de los estreptomicetos estaba saturado y la mayoría de ácidos grasos determinados (~70 %) eran saturados. Además, el aceite de estreptomicetos contenía un contenido significativo de ácidos grasos metil- ramificados (45 al 50 % en este caso).

5

Tabla 4. Ejemplo de la composición lipídica de S. roseosporus GAL4111 y S. albus GAL1001 como se determina por

GC-MS.

GAL 4111 GAL1001

Ácidos grasos*

84,8 89,5

Alcoholes grasos

0,3 0,1

Escualenos

4,3 2,5

Otros lípidos

0,2 0,0

Lípidos sin identificar

10,3 7,9

*Los ácidos grasos incluyen los acilgliceroles y los ácidos grasos libres

10 La mayoría de los lípidos consistía en ácidos grasos (incluido cualquier acilglicerol y ácidos grasos libres). Los

lípidos también contenían escualenos (2,5 y 4,3 % de los lípidos totales). Los escualenos en GAL4111 y GAL1001 estaban compuestos por escualeno, tetrahidroescualeno, dihidroescualeno (componentes principales), hexahidroescualeno y octahidroescualeno.

15 De acuerdo con la presente invención, hay varias alternativas para cultivar cepas de Streptomyces adecuadas para

la acumulación de lípidos. Se probaron diferentes condiciones incluyendo la diversidad de fuentes de carbono y/o de nutrientes y las condiciones de crecimiento.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Para tener un proceso industrialmente factible, las cepas que acumulan lípidos de forma natural, tales como G009, G013 y G017, deben ser adecuadas para la fermentación aeróbica y los procesos de fermentación deben ser rentables. Los costes de los procesos de fermentación se afectan gravemente por los componentes del medio, el consumo de energía, los costes de desecho y la mano de obra.

Aunque es posible usar el medio derivado de ingredientes puros y por ejemplo aquellos descritos en el presente documento, TSB, 2*TY y E05, es más rentable seleccionar cualquier fracción de desecho sin separación, hidrólisis y/o purificación de los componentes como materias primas. Los requisitos son que las bacterias en uso sean ricas en enzimas digestivas para facilitar el crecimiento por ingredientes brutos incluidos en los desechos. Por lo tanto, la presente invención contempla además el uso de la fracción de desecho industrial o una combinación de ingredientes puros con el desecho. Como se describe en el presente documento se realizó una serie de ensayos comprensivos con una amplia diversidad de desechos o residuos orgánicos de la industria incluyendo la agricultura, los desechos municipales y los residuos microbianos. Los métodos adecuados para su uso en la presente invención para generar azúcares libres y una fuente de nutriente a utilizarse para crecer a partir de fracciones de desecho son aquellos que se conocen generalmente tales como el uso de enzimas adecuadas para digerir ingredientes brutos. Sin embargo, es preferible el cultivo de bacterias que poseen estas funciones de enzimas digestivas teniendo capacidades para la acumulación de dichos lípidos. Las cepas adecuadas para este fin son en consecuencia las cepas S. roseosporus y S. albus. Las cepas preferidas son G009, G010, G013, G014, G015, G012, G016, G017 y G019 con sus cepas parentales, GAL1001, GAL4111 y G011.

Las cepas implicadas en esta divulgación y preferentemente las cepas G009, G010, G013 y G017 pueden cultivarse en el desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos. Los usos de restos celulares derivados por ejemplo del lote anterior son fuentes de nutrientes muy adecuadas para producir lípidos de manera rentable. En estos cultivos los cambios en la masa celular se detectaron disminuir en los primeros dos a tres días aumentando 5-20 g/l en los siguientes tres a cuatro días. La masa seca de extractos de cloroformo derivada de estos cultivos estaba en el intervalo de 7-65 g/l reflejando la cantidad de TAG como 2-23 g/l como se analiza en TLC.

Incluso aunque todas estas funciones unitarias y materias primas descritas en las realizaciones de la presente invención, bien solas o en combinación, son efectivas en la producción de aceites para biocombustibles, el proceso preferido usa las cepas G009, G010, G013 o G017. La inoculación se lleva a cabo preferentemente usando esporas. La cantidad de esporas es de forma ventajosa aproximadamente 1010 esporas/1 litro a 5*1012 esporas/500 litros. El cultivo se lleva a cabo preferentemente durante 2 a 6 días. La temperatura del cultivo es aproximadamente 28 °C. El cultivo se lleva a cabo como una fermentación en lote o semi-discontinua. Se usa agitación adecuada durante el cultivo. Adicionalmente se recomienda usar pasteurización del medio en lugar de esterilización para evitar alto consumo de energía. El proceso puede continuarse, por ejemplo, durante 6 días sin ningún suplemento o inhibidor de lipasa, tales como iones plata añadidos a baja concentración el 6to día de cultivo. Al final del cultivo la masa celular se recolecta. Esta es de forma típica aproximadamente 65 kg/500 l de lote. Los lípidos se recuperan de la biomasa celular o del caldo de cultivo por un método adecuado. El rendimiento con extracto basado en disolvente o por dispersión física es normalmente al menos 5 kg de TAG por 1000 litros de medio de cultivo gastado, normalmente 10 a 70 kg de TAG por 1000 litros, de forma habitual aproximadamente 30 kg de TAG a partir de un lote de 1000 l.

Recuperación del aceite

En diversas realizaciones de la invención, el aceite, o los precursores para el aceite, pueden recuperarse de la biomasa celular o del caldo de cultivo usando cualquier método conocido en la técnica o desarrollado en el futuro. Por ejemplo, las bacterias pueden separarse del medio usando una filtración o técnicas de decantación. Alternativamente, la centrifugación con centrífugas comerciales a escala industrial de gran capacidad de volumen pueden usarse para separar los productos deseados.

En algunas realizaciones de la invención, las células bacterianas pueden romperse para facilitar la separación del aceite y otros componentes. Puede usarse cualquier método conocido para la ruptura celular, tales como someter a ultrasonidos, choque osmótico, fuerza de cizalla mecánica, presión fría, choque térmico, autolisis catalizada por enzimas o auto-dirigida. El aceite puede recuperarse de las células mediante extracción con disolventes orgánicos o por cualquier método conocido en la técnica o desarrollado en el futuro.

Las cepas, los métodos, las condiciones de cultivo, los ingredientes para la fermentación y el esquema de proceso desvelado y reivindicado en el presente documento se refieren a tecnología que soporta gran escala y el cultivo económico de bacterias Streptomyces. Esta tecnología es útil para soportar la fabricación industrial de los diversos productos relacionados. Esta tecnología puede ser de uso para soportar económicamente el cultivo masivo y la cosecha de los estreptomicetos.

Producción de biocombustible

Los lípidos producidos con el método descrito en el presente documento pueden usarse como materia prima de suministro para la producción de biodiesel, diésel renovable, combustible a reacción o gasolina. El biodiesel consiste

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

en metil ésteres de ácidos grasos y se produce normalmente por transesterificación. En la transesterificación, los acilgliceroles se convierten en alquil (metil, etil o propil) ésteres de ácido graso de cadena larga. El diésel renovable se refiere a combustible que se produce por tratamiento de hidrógeno (hidrogenación o hidroprocesamiento) de lípidos. En el tratamiento de hidrógeno, los acilgliceroles se convierten en alquenos (parafinas) correspondientes. Los alcanos (parafinas) pueden modificarse además por isomerización o por otras alternativas de proceso. El proceso de diésel renovable puede usarse también para producir combustible a reacción y/o gasolina. Además, puede realizarse el craqueo de los lípidos para producir biocombustibles. Además, los lípidos pueden usarse como biocombustibles directamente en ciertas aplicaciones.

Los lípidos de Streptomyces son beneficiosos para la producción de biocombustible. Los ácidos grasos de Streptomyces contienen normalmente ácidos grasos de cadena metil-ramificada, que son beneficiosos para aplicaciones de biocombustible y lubricante. Los ácidos grasos ramificados tienen un intervalo de liquidez más amplio, haciéndolos de interés para aplicaciones a baja temperatura y su baja tensión superficial provoca buena extensibilidad (Gunstone et al. 2007). La ramificación de los ácidos grasos mejora las propiedades en frío de los biocombustibles, tales como el biodiesel o el diésel renovable. El aceite de Streptomyces tiene un grado de saturación relativamente alto (contiene altas cantidades de ácidos grasos saturados). Esta propiedad es una ventaja especial para los procesos de diésel renovable, ya que la saturación de los ácidos grasos disminuye la cantidad de hidrógeno necesaria en la hidrogenación. El alto grado de saturación de los lípidos puede mejorar también la estabilidad y la capacidad de almacenamiento del aceite y reducir la necesidad de antioxidantes en el almacenamiento del aceite. Además, las longitudes de la cadena grasa principal son principalmente de C14 (14 carbonos) a C18 (18 carbonos), que es ventajoso para la utilización en aplicaciones de diésel.

Los lípidos producidos con el método pueden usarse como aceites base para lubricantes (aceites de lubricación) o como material de partida para la producción de aceites base para lubricantes. El aceite de Streptomyces contiene escualeno o derivados del escualeno (Grafe et al. 1985; Olukoshi y Packter 1994). Especialmente, el escualeno y los derivados del escualeno son adecuados para usos en aplicaciones de lubricante. Sin embargo, pueden usarse igualmente otros lípidos por Streptomyces para aplicaciones de lubricante.

El biocombustible que comprende la composición lipídica producida de acuerdo con la presente divulgación puede comprender propiedades ventajosas para el uso de biocombustible. Dichas propiedades incluyen por ejemplo ramificación de ácidos grasos que mejora las propiedades en frío. La saturación de los ácidos grasos es ventajosa especialmente para la producción de diésel renovable.

MICROORGANISMOS DEPOSITADOS

La cepa Streptomyces sp. G011 se depositó bajo el Tratado de Budapest el 15 de diciembre de 2009 en DSMZ- Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH y recibió el número de acceso DSM 23182. El material biológico depositado bajo el número de acceso DSM 23182 en DSMZ-Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH pos Galilaeus Oy de Kairiskulmantie 10, 20781 Kaarina, Finlandia. Galilaeus Oy autoriza que el solicitante se refiera al depósito biológico anteriormente dicho en la presente solicitud y las solicitudes/patentes reivindicando prioridad de esta solicitud y da su consentimiento sin reserva e irrevocable a que el material depositado se haga disponible al público de acuerdo con las leyes nacionales aplicables.

Las otras cepas presentadas en el presente documento muestran rasgos idénticos a las cepas disponibles en las colecciones de cultivo comerciales como se muestra en la Tabla 5. Las cepas como se listan en la Tabla 5 se identificaron en primer lugar de acuerdo con sus metabolitos secundarios cuando estaban disponibles, una secuencia parcial del ADNr 16S y por comparación de morfología de colonias. La identidad de secuencia de GAL1001, GAL1002, GAL1003, GAL4051, GAL1004, GAL1005, GAL4111, GAL1006, GAL1007, GAL4081, GAL4082 en el fragmento de ADN de aproximadamente 1,4 kb ha sido >98 % a las secuencias correspondientes de las cepas indicadas en la Tabla 5. Las secuencias usadas en comparación se encuentran en los Bancos Génicos.

La Tabla 5 muestra la identificación de las cepas

Código Galileo

Cepa Cepa correspondiente con número de colección Código génico del ARN ribosómico 16S Longitud génica del ARN ribosómico 16S

GAL1001

S. albus DSM 40313 Gl:219878476 1499 pb

GAL1002

S. lividans NRRL B16148 Gl:66379295 1449 pb

GAL1003

S. coelicolor DSM 40233 Gl:220961405 1396 pb

GAL4051

S. hygroscopicus NRLL 5491 G 1:228480526 1385 pb

GAL1004

S. aureofaciens DSM 40731 G 1:284022440 1402 pb

GAL1005

S. griseus ATCC 13273 Gl:196128028 1428 pb

GAL4111

S. roseosporus NRRL 11379 Gl:195979310 1431 pb

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

GAL1006

S. avermitilis NRRL8165 Gl:162960844 1529 pb

GAL1007

S. lydicus ATCC 25470 Gl:219846852 1481 pb

GAL4081

S. peucetius P55 Comparable con S. peucetius P55n.°SnorO; DSM 19075 Gl:219857135 1486 pb

GAL4082

S. peucetius D2 * Gl:219857135 1486 pb

* Estudios en una segunda y tercera ciclación de anillo en la biosíntesis de antraciclina. J. Antibiot (Tokio), Feb 2003; 56(2):143-53

Las cepas se identificaron con secuencias de ADNr 16S obtenidas por PCR usando los cebadores homólogos:

UNIfor 5' GGTGGAGCATGTGGTTTA 3' (SEQ ID NO: 5)

UNIrev 5' CCATT GT AGCACGT GT GT 3' (SEQ ID NO: 6)

Se describen a continuación diversas realizaciones de la invención con la ayuda de las siguientes cláusulas numeradas 1-36:

1. Un proceso para producir lípidos para biocombustible o lubricante, que comprende:

- cultivar células bacterianas del género Streptomyces en un medio que comprende desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos o mezclas de los mismos como fuente o fuentes de carbono y/o de nutrientes;

- recuperar los lípidos de las células o del medio de cultivo,

- usar los lípidos recuperados o una fracción de los mismos como biocombustible o como un material de partida para la producción de biocombustible y/o

- usar los lípidos recuperados o una fracción de los mismos como lubricante o como un material de partida para la producción de lubricantes.

2. El proceso de acuerdo con la cláusula 1, en el que el desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos comprende o comprenden desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos industriales, desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos agrícolas, desecho o desechos municipales o desecho o desechos o residuo o residuos microbianos, o cualquier mezcla de los mismos.

3. El proceso de acuerdo con la cláusula 1 o 2, en el que el medio de cultivo comprende un glicerol fuente de carbono adicional, una fracción de la industria del azúcar o del almidón, jarabe o jarabes de azúcar o almidón o azúcar o azúcares purificados o cualquier mezcla de los mismos.

4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 3, en el que la cantidad de triacilgliceroles en el medio de cultivo gastado es al menos 1 g/litro, preferentemente 5 g/litro.

5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 4, en el que los lípidos producidos comprenden principalmente triacilgliceroles.

6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 4, en el que los lípidos producidos se transesterifican para producir biodiesel o se tratan con hidrógeno para producir diésel renovable.

6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 5, en el que el medio de cultivo no es estéril.

7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 6, en el que el medio de cultivo se pasteuriza.

8. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 7, en el que el medio de cultivo comprende inhibidores de la lipasa.

9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 8, en el que el cultivo se lleva a cabo como una fermentación en lotes o una semi-discontinua.

10. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 9, en el que la especie de Streptomyces se selecciona del grupo de especies que comprenden Streptomyces roseosporus, Streptomyces griseus, Streptomyces albus, Streptomyces peucetius, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces avermitilis y Streptomyces lydicus.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11. El proceso de acuerdo con la cláusula 10, en el que la cepa de Streptomyces se selecciona del grupo que comprende cepas de Streptomyces roseosporus GAL4111, Streptomyces roseosporus G011, Streptomyces griseus GAL1005, Streptomyces albus GAL1001, Streptomyces peucetius D2, GAL4082, Streptomyces peucetius P55 GAL4081, Streptomyces aureofaciens GAL1004, Streptomyces lividans GAL1002, Streptomyces coelicolor GAL1003, Streptomyces hygroscopicus GAL4051, Streptomyces avermitilis GAL1006 y Streptomyces lydicus GAL1007.

12. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 11, en el que el hospedador Streptomyces está genéticamente modificado para expresar un gen endógeno o exógeno que codifica DGAT (EC 2.3.1.20) y/o proteína vehículo 3-cetoacil-acil sintasa III (EC: 2.3.1.41).

13. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 12, en el que el hospedador Streptomyces está genéticamente modificado para expresar uno o más genes seleccionados del grupo que comprende

(a) sco0958 (SEQ ID NO: 1) y/o sco5888 (SEQ ID NO: 2);

(b) el homólogo más cercano de dichos genes en una especie de Streptomyces;

(c) una secuencia de nucleótidos que hibrida a al menos uno de dichos genes o dichos homólogos a 65 °C en citrato sódico 1,5 mM, pH 7,0 y NaCl 0,015;

(d) una secuencia de nucleótidos que provoca la misma o una función equivalente que la que tienen los productos génicos ID 101096381 o ID 101101330;

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 60 % de identidad a SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

14. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 13, en el que el hospedador Streptomyces se ha hecho deficiente en la producción de metabolitos bioactivos, tales como agentes antibióticos.

15. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 14, en el que la cepa de Streptomyces se selecciona del grupo que comprende G009, G010, G013, G014, G015, G012, G016, G017 y G019.

16. Un cultivo de Streptomyces para la producción de lípidos, que comprende

(a) una población de bacterias del género Streptomyces; y

(b) un medio de cultivo que comprende desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos o mezclas de los mismos como fuente o fuentes de carbono y/o nutrientes.

17. El cultivo de acuerdo con la cláusula 16, en el que la cantidad de triacilgliceroles en el medio de cultivo gastado es al menos 1 g/litro, preferentemente 5 g/litro.

18. El proceso de acuerdo con la cláusula 16 o 17, en el que la fracción lipídica producida comprende principalmente triacilgliceroles.

19. El cultivo de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 16 a 18, en el que el medio de cultivo comprende inhibidores de la lipasa.

20. El cultivo de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 16 a 19, en el que el medio de cultivo no es estéril o está pasteurizado.

21. El cultivo de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 16 a 20, en el que la especie de Streptomyces se selecciona del grupo de especies que comprenden Streptomyces roseosporus, Streptomyces griseus, Streptomyces albus, Streptomyces peucetius, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces avermitilis y Streptomyces lydicus.

22. El cultivo de acuerdo con la cláusula 21, en el que la cepa de Streptomyces se selecciona del grupo que comprende cepas de Streptomyces roseosporus GAL4111, Streptomyces roseosporus G011, Streptomyces griseus GAL1005, Streptomyces albus GAL1001, Streptomyces peucetius D2, GAL4082, Streptomyces peucetius P55 GAL4081, Streptomyces aureofaciens GAL1004, Streptomyces lividans GAL1002, Streptomyces coelicolor GAL1003, Streptomyces hygroscopicus GAL4051, Streptomyces avermitilis GAL1006 y Streptomyces lydicus GAL1007.

23. El cultivo de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 16 a 22, en el que el hospedador Streptomyces

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

está genéticamente modificado para expresar al menos un gen de la ruta de síntesis lipídica.

24. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 16 a 23, en el que el hospedador Streptomyces está genéticamente modificado para expresar un gen endógeno o exógeno que codifica DGAT (EC 2.3.1.20) y/o proteína vehículo 3-cetoacil-acil sintasa III (EC: 2.3.1.41).

25. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 16 a 24, en el que el hospedador Streptomyces está genéticamente modificado para expresar uno o más genes seleccionados del grupo que comprende

(a) sco0958 (SEQ ID NO: 1) y/o sco5888 (SEQ ID NO: 2);

(b) el homólogo más cercano de dichos genes en una especie de Streptomyces;

(c) una secuencia de nucleótidos que hibrida a al menos uno de dichos genes o dichos homólogos a 65 °C en citrato sódico 1,5 mM, pH 7,0 y NaCl 0,015;

(d) una secuencia de nucleótidos que provoca la misma o una función equivalente que la que tienen los productos génicos ID 101096381 o ID 101101330;

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 60 % de identidad a SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

26. El cultivo de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 16 a 25, en el que el hospedador Streptomyces se ha hecho deficiente en la producción de metabolitos bioactivos, tales como agentes antibióticos.

27. El cultivo de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 16 a 26, en el que la cepa de Streptomyces se selecciona del grupo que comprende G009, G010, G013, G014, G015, G012, G016, G017 y G019.

28. Un hospedador Streptomyces genéticamente modificado para expresar un gen endógeno o exógeno que codifica actividad DGAT (EC 2.3.1.20) y/o proteína vehículo 3-cetoacil-acil sintasa III (EC: 2.3.1.41), o una secuencia de nucleótidos que provoca la misma o una función equivalente que la que tienen los productos génicos ID 101096381 o ID 101101330.

29. El hospedador de acuerdo con la cláusula 28, en el que la célula hospedadora se selecciona del grupo de especies que comprende Streptomyces roseosporus, Streptomyces griseus, Streptomyces albus, Streptomyces peucetius, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces avermitilis y Streptomyces lydicus, preferentemente seleccionada del grupo de especies que comprenden Streptomyces roseosporus y Streptomyces albus.

30. El hospedador de acuerdo con la cláusula 28 o 29, en el que el hospedador está genéticamente modificado para expresar uno o más genes seleccionados del grupo que comprende

(a) sco0958 (SEQ ID NO: 1) y/o sco5888 (SEQ ID NO: 2);

(b) el homólogo más cercano de dichos genes en una especie de Streptomyces;

(c) una secuencia de nucleótidos que hibrida a al menos uno de dichos genes o dichos homólogos a 65 °C en citrato sódico 1,5 mM, pH 7,0 y NaCl 0,015;

(d) una secuencia de nucleótidos que provoca la misma o una función equivalente que la que tienen los productos génicos ID 101096381 o ID 101101330;

(e) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 60 % de identidad a SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.

31. El hospedador de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 28 a 30, en el que la cepa se selecciona del grupo que comprende las cepas G009, G010, G013, G014, G015, G012, G016, G017 y G019.

32. Una composición lipídica producida de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 15.

33. Uso de los lípidos o la composición lipídica producida por células bacterianas del género Streptomyces, o una fracción de los lípidos o la composición lipídica como biocombustible y/o lubricante, o como material de partida para la producción de biocombustible y/o lubricante.

34. Uso de los lípidos o la composición lipídica producida por células bacterianas del género Streptomyces para la producción de biodiesel o diésel renovable.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

35. Biocombustible que comprende los lípidos o la composición lipídica producida de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 15, o una fracción de los lípidos o la composición lipídica, y opcionalmente aditivos adecuados para el uso de biocombustible.

36. Biocombustible que comprende los lípidos o la composición lipídica producida de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas 1 a 15, o una fracción de los lípidos o la composición lipídica, y opcionalmente aditivos adecuados para el uso de lubricante.

Ejemplos

Los siguientes métodos para el análisis se usaron en los experimentos implicados en los Ejemplos si no se indica de otra manera en el texto.

Métodos:

Detección de la masa celular húmeda: La masa celular húmeda se midió tomando 10 ml de muestra de caldo de cultivo a un tubo Falcon tarado y se centrifugó durante 10 minutos a 4000 rpm. Después de la centrifugación el sobrenadante se descartó y se pesó el tubo Falcon para obtener la masa de la fracción celular. La masa celular se dio como gramos por 1 litro del caldo de cultivo.

Detección de la masa celular seca: La masa celular húmeda se secó a 70 °C durante dos días después de los que se determinó la masa pesando. La masa celular se dio como gramos por 1 litro del caldo de cultivo.

Detección del PMV: El volumen de los micelios empaquetados se midió tomando 10 ml del caldo de cultivo y se centrifugó durante 10 minutos a 4000 rpm después de lo que se midió el volumen de la fase celular como cifra en %.

Análisis visual del cultivo: Los cultivos bacterianos se analizaron visualmente por colonias separadas en placa de agar, estudiando cultivos líquidos y por análisis microscópico.

Análisis por TLC: 5 |jl de extracto de cloroformo concentrado diez veces se pipeteó en una placa de TLC (gel de sílice 60 F254 Merck 1,05729) y se ejecutó en hexano:éter dietílico:ácido acético (80:20:2). Los lípidos se colorearon con yodo después de la ejecución o se quemaron a carbón. La quema de lípidos se realizó sumergiendo la placa en H2SO4 al 50 % y calentando la placa 1 hora a 180 °C. Se usaron colesterol (C), octadecanato de colesterol (COD), ácido decanoico, trimiristato de glicerilo (GTM) y L-a-fosfatidiletanolamina como patrones en la TLC. Los lípidos se detectaron visualmente en placas de TLC como manchas amarillas (yodo) o negras (carbón).

Análisis de las manchas de TLC: Los lípidos se detectaron visualmente en placas de TLC como manchas amarillas (yodo) o negras (carbón). Más claramente las manchas coloreadas de yodo se vieron en la luz UV. Las manchas de muestra se compararon con los patrones para estimar las cantidades en g/l. Los valores (-, +/-, +, ++, +++ o 0-3) se dieron basándose en la intensidad de las manchas si se realizó comparación entre las muestras en el mismo ensayo de ejecución.

Además los valores en g/l de los TAG se estimaron por análisis de imágenes usando el programa Image J (
http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html). La curva patrón se preparó usando la escala de concentración de 1 g/l hasta 40 g/l y el título de los lípidos en el caldo de cultivo se midió contra la curva patrón.

Extracción de muestras: El caldo de cultivo entero (cultivos de fase sólida) o los micelios separados se extrajeron con un volumen igual de cloroformo-metanol (Clf-MeOH; 2:1). Los tubos se incubaron en un agitador a TA durante 1 hora. Después de la centrifugación la muestra se tomó del extracto y se analizó por TLC y/o por GC.

Detección del peso de extracción seco: El peso de extracto seco se determinó secando 1-5 ml de extracto a TA durante un día en aire soplado después de lo que se determinó la masa pesando. La masa se dio como gramos por 1 litro del caldo de cultivo.

Ejemplo 1. Detección de estreptomicetos para la acumulación de lípidos

Las especies de Streptomyces de la colección de cultivo local (Tabla 1) se ensayaron para el crecimiento en condiciones de cultivo convencionales para elucidar el tiempo de ciclo, la masa celular y la acumulación de lípidos. Las cepas se cultivaron en caldo típico en caldo de triptófano soja TSB (Difco) durante dos a tres días en un agitador (100-300 rpm, 26-34 °C). Las siguientes cepas se encontraron dar una alta masa celular y acumulación de lípidos en cantidades remarcables en las condiciones de cultivo convencionales: GAL4111 (Streptomyces roseosporus), GAL1005 (Streptomyces griseus), GAL1001 (Streptomyces albus) y GAL4082 (Streptomyces peucetius D2).

Se usó una alícuota de la suspensión de esporas en un bucle de micelios de cada cepa para inocular 50 ml de medio TSB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. La incubación con agitación se dejó continuar durante tres días y se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

tomó una muestra de 10 ml en cada día de cultivo, por ejemplo, en intervalos de 24 horas. Se analizaron las siguientes características: determinación de la masa celular húmeda y seca, PMV, seguimiento de pH y análisis visual por muestreo para definir el ciclo celular, extracción de la fracción de lípidos en cloroformo y análisis por TLC de los extractos de cloroformo.

Condiciones de cultivo típicas:

Temperatura: 22-36 °C pH: 5,0-8,5

agitación: 100-300 rpm (tanda de 1,905-2,54 cm)

forma de inóculo: micelios vegetativos, micelios del sustrato, esporas

tasa de transferencia: 0,5 - 50 %

medio convencional en uso: TSB, 2*YT, E05

TSB es Caldo de triptona soja de Difco que contiene 17 g/l de digestión pancreática de caseína, 3 g/l de digestión enzimática de alimento de soja, 2,5 g/l de dextrosa, 5 g/l de cloruro sódico, 2,5 g/l de fosfato dipotásico; 2*TY contiene 16 g/l de triptona peptona, 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y E05 contiene los siguientes ingredientes: 20 g/l de dextrosa, 20 g/l de almidón, 5 g/l de farmamedia, 2,5 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de MgSO4-7 H2O, 1 g/l de KH2PO4, 3 g/l de CaCOs, 3 g/l de NaCl.

Características del cultivo de Streptomyces:

Tiempo para el crecimiento exponencial: 12-64 h Tiempo para acumular lípidos: 24-64 h La fracción principal de lípidos: TAG

El contenido de TAG en la fracción de metabolitos como se estima por TLC: 20-80 %

El contenido de aceite en el extracto como se mide por GC es el 25-80 %, el contenido de TAG es el 50-95 % en la fracción oleaginosa

La masa del extracto de cloroformo: > 10 g/l del caldo de cultivo La fracción de TAG del extracto de cloroformo: 10-80 %

Masa celular húmeda: > 100 g/l Masa celular seca: > 8 g/l El intervalo del PMV: 6-16 %

Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 3 g/l (tiempo para el valor más alto 3 días) Ejemplo 2. Construcción de cepas genéticamente modificadas

Se usaron dos cepas, GAL4111 y GAL1001, como los hospedadores de la ingeniería genética aunque los mismos métodos son útiles para GAL1005 y GAL4082 y para varios estreptomicetos distintos. Además, se generó un mutante GAL4111 bloqueado en la producción de daptomicina para evitar la producción de antibióticos en los cultivos y se designó G011. De forma interesante, todas las demás propiedades de cultivo de G011 fueron las mismas encontradas en GAL4111 excepto la carencia de acumulación de antibióticos de lipopéptido en cantidades detectables en G011. G011 acumula TAG y los otros lípidos en cantidades similares en las mismas condiciones de cultivo que GAL4111.

Si se hace referencia a los métodos convencionales en la construcción de cepas genéticamente modificadas, éstos se encuentran en Streptomyces manual por Kieser et al., 2000 para estreptomicetos y en Sambrook y Russell, 2001 para E. coli.

Construcciones de plásmidos:

Los genes que están implicados en la biosíntesis de ácidos grasos denominados sco0958 y sco5888 se clonaron a partir del ADN genómico de S. coelicolor en el vector pIJE486 para dar pIJEsco0958 y pIJEsco5888, respectivamente. Usando los mismos sitos de restricción los genes se clonaron en un vector de bajo número de copias pHJL401 para dar pHJLsco0958 y pHJLsco5888, respectivamente. Los genes se combinaron también en la misma construcción para dar pIJEsco5888+0958 y pHJLsco0958+5888, respectivamente. Los genes sco5888 y sco0958 se obtuvieron por PCR usando los cebadores homólogos:

Sco5888for 5’ ATT TCTAGA AAA CCG TCC ATC ACG CGA G 3’ (SEQ ID NO:7)

Xba1

Sco5888rev 5' ATT AAGCTT ACTAGT ATG GTC GTC CTT GGT TCA TC 3'

Hindlll Spel

(SEQ ID NO:8)

y

Sco0958for 5' ATT TCTAGA ACTAGT GAT CGT ACT TGA CCG TAA TC 3'

Xbal Spel

(SEQ ID NO:9)

Sco0958rev 5' ATT AAGCTT GCTAGC CGA ACA GCG GAT TTT ATT CAG 3'

Hindlll Nhel

(SEQ ID NO:10)

Los fragmentos obtenidos por PCR se clonaron en el vector pIJE486 usando los sitios de restricción 5 correspondientes. Para la introducción de ADN en las cepas GAL4111 y GAL1001, se usó la transformación de protoplasto. Se usó un método de transformación convencional asistido por PEG. Las mezclas de transformación se colocaron en laca en placas R2YE y se incubaron a 30 °C. Después de la incubación durante toda la noche se extendieron 20 |jg/ml de tioestreptona en agua para la selección de cepas que contienen el plásmido. La incubación se continuó durante 3-5 días después de lo que los transformantes se recogieron de las placas.

10

Los fragmentos descritos anteriormente se ligaron y se clonaron en E. coli por un procedimiento convencional para transferirlos a las especies de Streptomyces.

Los productos de PCR se verificaron por secuenciación. Los plásmidos de los transformantes se aislaron y se 15 digirieron para verificar el plásmido transformado.

Las siguientes cepas genéticamente modificadas se crearon y se ensayaron para la acumulación aumentada de lípidos como se muestra en la Tabla 6.

20 ________________Tabla 6. La designación de los clones usados en la presente invención.________________

Código

Plásmido Cepa hospedadora

G009

plJEsco0958 GAL1001

G010

plJEsco0958 GAL4111

G013

plJEsco5888 GAL1001

G014

plJEsco5888 GAL4111

G015

plJEsco5888+0958 GAL4111

G012

plJEsco0958 G011

G016

pHJLsco5888 GAL1001

G017

pHJLsco0958+5888 GAL1001

G019

pHJLsco5888 G011

5

10

15

20

25

30

35

pIJE486 es un plásmido de alto número de copias que se replica en estreptomicetos (Ylihonko et al., 1996) pHJL401 es un plásmido de bajo número de copias que se replica en estreptomicetos (Kieser et al., 1996)

Ejemplo 3. Cultivo a pequeña escala de estreptomicetos OGM para la acumulación de lípidos

Las cepas G009, G010, G012, G013, G013, G014, G015, G016, G017 y G019 se cultivaron en las condiciones como se describe anteriormente. Las cepas hospedadoras, G011, GAL4111 y GAL1001 se usaron como controles en los cultivos.

Condiciones de cultivo típicas:

Temperatura: 22-36 °C pH: 5,0-8,5 agitación: 0-330 rpm

forma de inóculo: micelios vegetativos, micelios del sustrato, esporas tasa de transferencia: 0,5 - 50 %

medio en uso: TSB, E05 como se da en el Ejemplo 1 y diferentes clases de medios de desecho o residuales como se describe en el ejemplo 4.

La acumulación de TAG se comparó con aquella del tipo silvestre, GAL1001 y GAL4111 por análisis de TLC. La Figura 5 demuestra un ejemplo de la acumulación de TAG en diferentes medios por las cepas G017, G016, G013 y G011. Hubo un aumento claro en la acumulación de lípidos y especialmente TAG en las cepas OGM que llevan el gen sco0958 y un aumento en aquellos clones (cepas) que llevan sco5888 en diferentes vectores plasmídicos. Los resultados se dan aquí:

Tabla 7. La designación de las cepas OGM usadas.

Código

Aumento o disminución del % de masa celular (peso húmedo) Fracción de TAG por TLC (g/l) Mejora -% de TAG en comparación con el parental.

G009

-1 % 29 300

G010

-25 % 18 50

G013

-77 % 11 300

G014

+ 14% 20 11

G015

+ 12 % 25 100

G011

+ 16 % 1 0

G012

-26 % 12 30

G016

-45 % 24 230

G017

+ 13 % 20 300

G019

+ 121 % 17 40

Ejemplo 4. Contenido del caldo de cultivo: uso del desecho para el crecimiento

Para potenciar el crecimiento máximo y la acumulación de TAG en condiciones de cultivo económicas, de bajo coste, se usaron varios desechos y/o fracciones como fuentes de carbono y/o de nutrientes en los cultivos. Sorprendentemente, todos los estreptomicetos ensayados de acuerdo con el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2 fueron capaces de crecer y acumular lípidos en un gran espectro de desechos. Las fracciones de desechos se ensayaron solas y con azúcar y en combinación con otros nutrientes. Las siguientes fracciones de desecho en la Tabla 8 se usaron exitosamente como se indicará por el crecimiento celular y la acumulación de TAG. Los siguientes datos derivaron de cultivos de G009 en cada desecho no hidrolizado (despolimerizado) (50 g/l) + jarabe de dextrosa (DX75) (10 g/l).

Tabla 8. La designación de los materiales principalmente desechos o residuos usados en la presente invención como fuentes de carbono y/o de nutrientes y su influencia en el crecimiento y acumulación de TAG.

Material

Crecimiento en UFC (UFC/ml) Acumulación de lípidos (aumento en %) en comparación con el cultivo en TSB

Salvado y barcia

104 + 140

Soja

107 + 100

Licor destilado de maíz (CSL)

106 + 150

5

10

15

20

25

Jarabe de dextrosa

106 ND

Jarabe de almidón

ND ND

Desecho celular bacteriano (lípidos extraídos)

107 +94

Melazas

103 + 120

Pasta

104 + 115

Lodo

103 +20

Suministro OVR

< 10 ND

Farmamedia

104 + 120

Bagazo

102 ND

Paja

ND +50

Alimentación de visón

ND + 10

Menudencias

103 + 10

Huesos

105 +20

Desechos orgánicos (bio desechos) vegetales

107 + 150

Desechos orgánicos de jardín

104 + 146

Desechos orgánicos de panadería

107 + 139

Biomasa de algas

107 +203

* Estimado a partir de muestra de 5 días - muestra de 2 días

Ejemplo 5. Fermentaciones de las cepas seleccionadas en las condiciones controladas

Las cepas GAL1001, GAL4111, G009 y G010 se cultivaron en las condiciones de fermentación controlada en el siguiente intervalo:

Temperatura: 22-36 °C pH: 5,0-8,5

agitación: velocidad de la punta de 0 - 4 m/s aireación: 0-2 vvm

forma de inóculo: micelios vegetativos, micelios del sustrato, esporas

pasajes: 0-2 siembras

tasa de transferencia: 0,5 - 50 %

volumen: 1,5 l de volumen de trabajo

Medio básico: TSB, 2*YT, E05 (el contenido de estos medios se da en el Ejemplo 1 y varios medios de desecho como se muestra en la Tabla 9.

___________________Tabla 9. Medios de desecho o residuales usados en la fermentación.___________________

CSL, 30 g/l; Jarabe de dextrosa 10 g/l_____________________________________________________________

CSL, 5-20 g/l; Carne 15-20 g/l____________________________________________________________________

CSL, 5-20 g/l; salvado de avena 15-20 g/l__________________________________________________________

CSL, 15 g/l; jarabe de dextrosa 10 g/l______________________________________________________________

CSL 30 g/l y menudencias (clase 2) 30 g/l__________________________________________________________

CSL, 10 g/l; desecho celular 50 g/l________________________________________________________________

CSL, 10 g/l; jarabe de dextrosa 10 g/l; Desecho celular 50 g/l___________________________________________

Jarabe de dextrosa 10 g/l; desecho celular 50 g/l_____________________________________________________

CSL 20 g/l, Soja 20 g/l, jarabe de dextrosa 10 g/l_____________________________________________________

Jarabe de glucosa 20 g/l, almidón o paja o bagazo 20 g/l, bio desecho 2,5-50 g/l, algas 50 g/l, MgSO4'7 H2O 1 g/l, KH2PO4 1 g/l, CaCO3 3 g/l.______________________________________________________________________

Características del cultivo de Streptomyces:

Tiempo para el crecimiento exponencial: 12-64 h

Tiempo para acumular lípidos: 24-64 h

La fracción principal de lípidos basada en TLC: TAG

El contenido de TAG en la fracción de metabolitos como se estima por TLC: >8 g/l La masa del extracto de cloroformo: > 15 g/l del caldo de cultivo La fracción de TAG del extracto de cloroformo: 10-80 %

Masa celular húmeda: > 200 g/l Masa celular seca: > 20 g/l

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El intervalo del % de PMV: 10-40

Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 4 g/l (tiempo para el valor más alto 6 días) Ejemplo 6a. Fermentación en lotes de la cepa G009

La dicha cepa se cultivó a los volúmenes de fermentación de 1,5, 20 y en 500 litros. El siguiente procedimiento da información detallada del proceso de fermentación fácilmente repetible.

Inoculación: esporas o un tapón de cultivo en placa de agar Tasa de transferencia: 4 %

Etapas de siembra: 2 Temperatura: 28 °C Aireación: 0,5 vvm Agitación: 100-280 rpm Presión de vuelta: 50 kPa (0,5 bar) pH antes de la esterilización: 7 Tiempo de ciclo: 96 horas

Estado estacionario alcanzado: 24 horas (la DO es 0 después de 24 horas de cultivo)

Medio de cultivo: varios medios de desecho y/o residuales como se da en el Ejemplo 5, E05, los ingredientes del medio E05 básico se dan aquí y los materiales que pueden usarse para reemplazarlos (Tabla 10).

Tabla 10. Los ingredientes que se usan para reemplazar materiales del medio E05 básico

Ingrediente

Reemplazable g/l

Dextrosa

Jarabe (5-20 g/l) 20,00

Almidón

Bagazo o paja 20,00

Farmamedia

Bio desecho* (2,5-50 g/l), restos de algas** (2,5-100 5,00

Extracto de levadura

g/l), restos de células bacterianas*** (50-200 g/l) 2,50

MgSO4-7 H2O

Esencial 1,00

KH2PO4

No esencial 1,00

CaCO3

No esencial 3,00

NaCl

No esencial 3,00

* = desecho compostable como doméstico, de panadería, de jardín, vegetales, masa), menudencias o mezclas de éstos; composiciones varias ** = Phaeodactylum, Chlorella y Dunaliella *** = cualquier masa celular, por ejemplo lactobacilos y estreptomicetos

cervecería (por ejemplo,

Masa celular (húmeda): 348 g/l PMV: 30 %

Extracto de cloroformo seco: 28 g/l TAG obtenidos basándose en TLC: 23 g/l TAG en extracto de cloroformo: 82 %

Relación de azúcar suministrado convertido en TAG: de 40 g/l a 23 g/l = 57,5 % (azúcar adicional del desecho) (el rendimiento se calculó basándose en azúcar puro (dextrosa y almidón) añadido solamente). El máximo teórico es el 33 %. El rendimiento más alto que el máximo teórico significa que los lípidos se producen a partir de azúcares incluidos en los materiales de desecho.

Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 10,2 g/l (tiempo para el valor más alto 6 días) Ejemplo 6b. Fermentación en lotes de la cepa GAL1001

La dicha cepa se cultivó a los volúmenes de fermentación de 1,5, 20 l y en 500 l. El procedimiento explicad dado en el ejemplo 6a da información detallada del proceso de fermentación fácilmente repetible.

Las cifras indicativas de cultivos:

Masa celular (húmeda): 267 g/l PMV: 25 %

Extracto de cloroformo seco: 10 g/l TAG obtenidos: 5 g/l

Relación de azúcar suministrado convertido en TAG: de 40 g/l a 5 g/l = 12,5 %

Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 2,1 g/l (tiempo para el valor más alto 3 días)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Ejemplo 7. Fermentación semi-discontinua de la cepa G009

La dicha cepa se cultivó a los volúmenes de fermentación de 1,5, 20 y en 500 litros. Los parámetros son como se describe en el Ejemplo 6a. El suministro de dextrosa empezó después de 1-2 días de cultivo, cuando se consumió principalmente la glucosa primaria y se continuó hasta el final del cultivo. La cantidad de azúcar suministrado es 40 g/l como un total de manera que la cantidad total de azúcar añadido al caldo de cultivo fue 60 g/l.

Los resultados por un litro del caldo de cultivo obtenido en fermentaciones de 4 días:

Masa celular (húmeda): 356 g/l PMV: 36 %

Extracto de cloroformo seco: 14 g/l TAG obtenidos: 6 g/l

Relación de azúcar suministrado convertido en TAG: de 60 g/l a 6 g/l = 10 % Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 3,6 g/l (tiempo para el valor más alto 3 días)

Los ejemplos indican que el cultivo semi-discontinuo puede usarse en la producción de lípidos por Streptomyces.

Ejemplo 8. Combinación de diferentes desechos en el caldo; algas y biodesechos

La cepa G009 se cultivó en las condiciones controladas en un caldo hecho combinando diferentes tipos de desechos y en los siguientes parámetros:

Temperatura: 28 °C pH: 7 al inicio del cultivo agitación: 300 rpm aireación: 0,5 vvm

forma de inóculo: micelios vegetativos, micelios del sustrato, esporas pasajes: 2

tasa de transferencia: 2 % volumen: 1,5 l de volumen de trabajo

Tabla 11. Desechos y/o residuos usados en la fermentación.

Biodesecho (panadería y vegetales (50:50)), contenido no definido; 10 g/l

Algas (Dunaliella) 50 g/l

Fuente de azúcar principal: bagazo

Azúcar (total) 40 g/l (jarabe de glucosa y almidón/bagazo/paja)

Características del cultivo de G009:

Tiempo para el crecimiento exponencial: 97 h Tiempo para acumular lípidos: 144 h La fracción principal de lípidos: TAG

El contenido de TAG en la fracción de metabolitos como se estima por TLC: > 70 % % La Figura 4 demuestra la acumulación de TAG en diferentes medios por G009.

La masa del extracto de cloroformo: > 22 g/l del caldo de cultivo La fracción de TAG del extracto de cloroformo: 68,9 %

TAG como se determina por Image J: 15,3 g/l PMV: 39 %

Rendimiento lipídico (azúcar puro suministrado total sin desechos): 55 %

Masa celular seca: > 20 g/l

Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 4,6 g/l (tiempo para el valor más alto 3 días)

El ejemplo indica que pueden proporcionarse diversos desechos y residuos como mezclas en la producción de lípidos por Streptomyces. El rendimiento lipídico excedió el valor teórico del 33 % indicando que los azúcares se usan a partir de los desechos.

Ejemplo 9. Reúso de cultivos bacterianos de los que se han extraído los lípidos como fuente de nutrientes en la fermentación

Las cepas G016, G013 y G009 se cultivaron en las condiciones controladas en una fermentación en lotes de 1,5 litros. Las células se cosecharon por filtración y se extrajeron por el volumen igual de cloroformo (1:1). Después de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

eso los restos celulares que quedan se secaron adicionalmente para retirar los residuos de cloroformo a 60 °C durante 10 min para suministrarse al medio de fermentación con o sin fuentes de azúcar adicionales, tales como 10 g/l de jarabe de dextrosa.

Temperatura: 22-36 °C pH: 5,0-8,5

agitación: velocidad de la punta de 0 - 4 m/s aireación: 0-2 vvm

forma de inóculo: micelios vegetativos, micelios del sustrato, esporas

pasajes: 0-2 siembras

tasa de transferencia: 0,5 - 50 %

volumen: 0,05-1,5 l de volumen de trabajo

Características del cultivo G016:

Tiempo para el crecimiento exponencial: 20-144 h PMV: 33 %

Tiempo para acumular lípidos: hasta 72 h La fracción principal de lípidos: TAG

El contenido de TAG en la fracción de metabolitos como se estima por TLC: > 80 %

La masa del extracto de cloroformo: > 27,4 g/l

TAG calculados a partir de la cantidad de cloroformo en el extracto: 14 g/l Rendimiento lipídico (a partir del azúcar puro suministrado total sin desechos): 51 %

Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 1,6 g/l (tiempo para el valor más alto 3 días)

Características del cultivo G013:

Tiempo para el crecimiento exponencial: 20-144 h PMV: 33 %

Tiempo para acumular lípidos: hasta 144 h La fracción principal de lípidos: TAG

El contenido de TAG en la fracción de metabolitos como se estima por TLC: > 80 %

La masa del extracto de cloroformo: > 20,5 g/l

TAG calculados a partir de la cantidad de cloroformo en el extracto: 10 g/l Rendimiento lipídico (a partir del azúcar puro suministrado total sin desechos): 49 %

Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 2,6 g/l (tiempo para el valor más alto 3 días)

Características del cultivo G009:

Tiempo para el crecimiento exponencial: 6-50 h PMV: 20 %

Tiempo para acumular lípidos: hasta 48 h La fracción principal de lípidos: TAG

El contenido de TAG en la fracción de metabolitos como se estima por TLC: > 90 %

La masa del extracto de cloroformo: > 14 g/l

TAG calculados a partir de la cantidad de cloroformo en el extracto: 7,0 g/l Rendimiento lipídico (a partir del azúcar puro suministrado total sin desechos): 50 %

Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 3 g/l (tiempo para el valor más alto 3 días)

El ejemplo indica que las células de Streptomyces a las que se les ha extraído los lípidos pueden re-usarse como una fuente de nutrientes en la producción de lípidos por Streptomyces.

Ejemplo 10. Pasteurización de los medios

En paralelo al esquema de fermentación típico, se llevó a cabo el cultivo sin esterilización de los caldos usados. La esterilización a 121 °C durante 20 minutos se reemplazó calentando hasta 60 °C 10-30 min y 75 °C durante 2-10 minutos tanto de los caldos de siembra como de producción. Los cultivos se estudiaron diariamente por microscopio y colocando en placa una muestra de 100 pl en placas de TSA (agar de triptona soja) permitiendo el crecimiento de un gran espectro de microbios. Normalmente no se encontraron contaminaciones en los cultivos incluso con el tiempo de calentamiento más corto y los cultivos fueron similares a los cultivos paralelos en medios estériles.

Inoculación: esporas o un tapón de cultivo en placa de agar Tasa de transferencia: 4 %

Etapas de siembra: 2 Temperatura: 28 °C Aireación: 1 vvm

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Agitación: velocidad de la punta 1,3 m/s Presión de vuelta: 50 kPa (0,5 bar) pH antes de la esterilización: 7 Tiempo de ciclo: 96 horas Estado estacionario alcanzado: 24 horas

Medio de cultivo: varios medios de desecho como se da en el Ejemplo 5, E05, 20 g/l de menudencias + 20 g/l de jarabe de dextrosa.

Resultados:

Masa celular (húmeda): 178 g/l PMV: 16 %

Tiempo para acumular lípidos: hasta 72 h La masa del extracto de cloroformo: 9 g/l TAG obtenidos (estimados por TLC): 5 g/l Tiempo para acumular lípidos: hasta 96 horas La fracción principal de lípidos: TAG

El contenido de TAG en la fracción de metabolitos como se estima por TLC: > 90 %

Aumento de TAG (cantidad más alta - muestra cero) por Image J: 1,8 g/l (tiempo para el valor más alto 6 días)

Los resultados indican que la esterilización del medio puede reemplazarse por la pasteurización del medio para la producción de lípidos por Streptomyces.

Ejemplo 11. Determinación del crecimiento celular para la lisis

En las condiciones de cultivo descritas en los Ejemplos 1-7 anteriores, el estado estacionario se alcanzó normalmente en 10-48 horas de incubación. La fase estacionaria continúa durante aproximadamente 48-72 horas después de las que tuvo lugar la lisis celular. Los TAG desaparecen en el cultivo prolongado. Solamente fueron detectables cantidades minoritarias de TAG - si había - en TLC en las muestras derivadas de caldos de cultivo de 7 días. Los lípidos y especialmente los TAG disminuyeron gradualmente alrededor del 4° día de cultivo como se detectó por TLC. La lisis celular puede haber liberado la acción de las lipasas dando como resultado la hidrólisis de TAG como se vio en los experimentos de cultivo. Por lo tanto, la fermentación se detuvo antes de la autolisis o se añadió un inhibidor de las lipasas al caldo de cultivo.

Ejemplo 12. Prevención de la degradación de TAG

Las esporas de la cepa G009 se cultivaron en el medio que contenía las siguientes materias primas en 1 l de agua del grifo, pH 7: Dextrosa 75 20 g, Bagazo 20 g, Biodesechos de panadería y jardín (1:1) 5 o 10 g, Algas 25 a 50 g, MgSO4'7 H2O 1 g, KH2PO4 1 g y CaCO3 3 g. Las condiciones de cultivo fueron 28 °C, 300 rpm durante 11 días. Después de 6 días de cultivos, 0,05 g/l de AgNO3 o 0,4 % de solución de TritonX100 que contiene 0,05 g/l de CaCO3. Los matraces sin los dichos suplementos se consideraron controles para el estudio de tratamiento de inhibición de la lipasa. El cultivo se continuó en las mismas condiciones durante 5 días más.

Las muestras se tomaron después de 7, 8 y 11 días de cultivos de acuerdo con los protocolos de muestreo generales usados en la presente invención y los resultados del muestreo se muestran en este punto. Los cultivos paralelos se realizaron con dos concentraciones tanto de desechos de algas como de biodesechos y la fila superior de cada condición de ensayo dio un resultado con concentración más alta de ambas fracciones de desecho.

Tabla 10. Los resultados del ensayo ^ de inhibición de lipasa

Los suplementos

Peso del extracto de cloroformo (g/l) Cantidad de TAG g/l por Image J

7 días 11 días 7 días 8 días 11 días

No; control

7,6 6,1 5 4,9 0,5

AgNO3

7,7 8,5 4,8 4,8 4,8

TritonX100 + CaCO3

10,3 10,1 5 5 4,9

El efecto de los inhibidores de lipasa se vio bien en la masa de los lípidos (extracto de cloroformo) que fue ligeramente en aumento o estable. Se observó la diferencia remarcable en los cambios de la cantidad de TAG en comparación con el control.

Ejemplo 13. Caracterizaciones de las cepas OGM

La caracterización de las cepas se llevó a cabo por los estudios en la morfología de las colonias, el tiempo de ciclo y la producción de metabolitos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los productos de PCR usados para construir cepas OGM se verificaron por secuenciación. Los plásmidos de las cepas se aislaron y digirieron para verificar los plásmidos transformados.

Las características de las cepas en placas de agar ISP4 e ISP2 en cultivos sumergidos en TSB y en E05 con variantes de desecho se dan aquí.

G009 es la cepa Streptomyces albus GAL1001 que lleva pIJEsco0958 y designada clon 2. No produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos y como GAL1001 se sugiere que está bloqueada en la biosíntesis de metabolitos secundarios debido a una mutación aleatoria. Morfología de colonias: En agar ISP4 G009 forma esporas con pigmento blanco mientras que en el lado inverso de la placa de agar, las colonias son marrones rodeadas por una fina zona clara. En un agar rico, ISP2, las colonias G009 forman micelios de sustrato amarillos e hifas aéreas amarillentas. Las esporas de pigmento blanco son ligeramente visibles. La morfología típica en cultivo sumergido es gránulos o micelios dispersados. La cepa forma esporas también en cultivos sumergidos por ejemplo en TSB y en E05. Las características relevantes de acuerdo con la presente divulgación son masa celular aumentada en comparación con la cepa parental y la acumulación de TAG en diversas condiciones de cultivo hasta 30 g/l. Las características de la cepa son estables en pasajes hasta 20 veces probadas hasta el momento.

G013 es una cepa Streptomyces albus GAL1001 que lleva pIJEsco5888. No produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos y como GAL1001 se sugiere que está bloqueada en la biosíntesis de metabolitos secundarios debido a una mutación aleatoria. La morfología de las colonias en cultivos sólidos y sumergidos es muy similar a aquella descrita para G009 aunque el crecimiento no es tan bueno como el encontrado para G009. El tamaño de colonias es de alguna manera más pequeño que el encontrado en los cultivos de G009 en agar sólido. La característica relevante de acuerdo con la presente divulgación es la acumulación de TAG en diversas condiciones de cultivo hasta 11 g/l.

G016 es una cepa Streptomyces albus GAL1001 que lleva pHJLsco5888. No produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos y como GAL1001 se sugiere que está bloqueada en la biosíntesis de metabolitos secundarios debido a una mutación aleatoria. La morfología de las colonias en cultivos sólidos y sumergidos es muy similar a aquella descrita para G009 aunque el crecimiento no es tan bueno como el encontrado para G009 pero ligeramente mejor que el encontrado para G013. La característica relevante de acuerdo con la presente divulgación es la acumulación de TAG en diversas condiciones de cultivo hasta 24 g/l.

G011 es un mutante de GAL4111 y no produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos característico a su cepa parental. GAL4111 se ha identificado ser Streptomyces roseosporus basándose en los patrones idénticos de la secuencia de ADN, las características de las colonias y la capacidad de producir pequeñas cantidades, algunos miligramos por litro de análogos de Daptomicina. Morfología de colonias: en agar ISP4 G011 forma esporas con pigmento blanco/rojo mientras que en el lado inverso de la placa de agar, los micelios de sustratos son de rojizos a marrones y es visible una fina zona transparente alrededor de estas colonias rojas/marrones indicando una actividad amilasa. En un agar rico, ISP2, las colonias de G011 son marrones, se ve esporulación ligera con pigmento blanco/rojo. Los micelios de sustrato en ISP2 son ligeramente rojos con hifas aéreas marronáceas. En cultivos sumergidos proporciona gránulos rojizos o micelios dispersados. La cepa forma esporas también en cultivos sumergidos por ejemplo en TSB y en E05. Las características relevantes de acuerdo con esta divulgación son masa celular aumentada en comparación con la cepa parental y la acumulación de TAG 1 g/l.

G012 es una cepa de Streptomyces roseosporus G011 que lleva pIJEsco0958 y no produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos como su cepa parental G011. La morfología de las colonias es idéntica a aquella descrita para G011. El crecimiento no es, sin embargo, tan bueno como se encuentra para G011. El tamaño de colonias es de alguna manera más pequeño que el encontrado en cultivos de G011 en agar sólido mientras que las colonias no podrían distinguirse basándose en eso. La característica relevante de acuerdo con la presente divulgación es la acumulación de TAG 12 g/l.

G017 es una cepa de Streptomyces roseosporus G011 que lleva pHJLsco0958+5888 y no produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos como su cepa parental G011. La morfología de las colonias es idéntica a aquella descrita para G011. El crecimiento es muy similar al que se encuentra para G011. Las características relevantes de acuerdo con la presente divulgación son la masa celular aumentada en comparación con la cepa parental y la acumulación de TAG 20 g/l.

G019 es una cepa de Streptomyces roseosporus G011 que lleva pHJLsco5888 y no produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos similar a su cepa parental G011. La morfología de las colonias es idéntica a aquella descrita para G011. El crecimiento es muy similar al que se encuentra para G011. Las características relevantes de acuerdo con la presente divulgación son la masa celular aumentada en comparación con la cepa control GAL4111 y la acumulación de TAG 17 g/l.

G010 es una cepa de Streptomyces roseosporus GAL4111 que lleva pIJEsco0958 y no produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos a diferencia de su cepa parental GAL4111. La morfología de las colonias es idéntica a aquella descrita para G011. El crecimiento no es, sin embargo, tan bueno como se encuentra para G011.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La característica relevante de acuerdo con la presente divulgación es la acumulación de TAG 18 g/l.

G014 es una cepa de Streptomyces roseosporus GAL4111 que lleva pIJEsco5888 y no produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos a diferencia de su cepa parental GAL4111. La morfología de las colonias es idéntica a aquella descrita para G011. El crecimiento es muy similar a aquel encontrado para G011. Las características relevantes de acuerdo con la presente divulgación son masa celular aumentada en comparación con la cepa parental GAL4111 y la acumulación de TAG 20 g/l como G017.

G015 es una cepa de Streptomyces roseosporus GAL4111 que lleva pIJEsco5888+0958 y no produce cantidades detectables de metabolitos bioactivos a diferencia de su cepa parental GAL4111. La morfología de las colonias es idéntica a aquella descrita para G011. La tasa de crecimiento es muy similar a aquella encontrada para G011. Las características relevantes de acuerdo con la presente divulgación son masa celular aumentada en comparación con la cepa parental GAL4111 y la acumulación de TAG 25 g/l.

LISTADO DE REFERENCIAS

Álvarez, H.M., Steinbüchel A. (2002) Triacylglycerols in Prokaryotic microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol 60: 367-376.

Arabolaza, A, Rodríguez, E, Altabe, S, Álvarez, H y Gramajo, H (2008) Multiple pathways for triacylglyserol biosynthesis in Streptomyces coelicolor. Appl Env Microb 79: 2573-2582.

Béhal, V, Jílek, M. (1969) Regulation of biosynthesis of secondary metabolites. Vil. Dynamics of fatty acid content during fermentation in Streptomyces aureofaciens. Folia Microbiol (Praha) 14:211-4.

Campbell, M. N. (2008) Algae as a Renewable Source for Liquid Fuel; Biodiesel: Algae as a Renewable Source for Liquid Fuel. Guelph Engineering Journal, (1), 2 - 7. 1916-1107.

Coen, D.M. 2001 The polymerase Chain reaction, published in Ausubel F M, Brent R, Kingston R E, More D, Seidman J G, Smith K. y Struhl K (eds.) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons. Inc., Hoboken, USA).'

Cole, A, Shareck, F. (2008), Cloning, purification and characterization of two lipases from Streptomyces coelicolor A3(2), Enzyme and microbial technology 42: 381 - 388.

Gellissen, G., (ed). (2005). Production of recombinant proteins. Novel microbial and eukaryotic expression systems. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. Weinheim, Alemania.

Gesheva, V., Rachev, R., Bojkova, S. (1997) Fatty acid composition of Streptomyces hygroscopicus strains producing antibiotics Lett Appl Microbiol 24: 109-112.

Gráfe, U., Reinhardt, G., Hanel, F., Schade, W., Gumpert, J. (1985). Occurrence or squalene and dehydrosqualene in streptomycets. J. Basic Microbiol. 25(8):503-507

Gunstone, F.D., Harwood, J.L., Dijkstra, A.J. (eds) (2007) The lipid handbook, 3rd edn. CRC Press, Boca Ratón.

Kaddor, C., Biermann, K., Kalscheuer, R., Steinbüchel, Al. (2009) Analysis of neutral lipid biosynthesis in Streptomyces avermitilis MA-4680 and characterization of an acyltransferase involved herein. Applied Microbioloqy and Biotechnoloqy. Volumen 84, Número 1, Agosto 2009, pp. 143-155.

Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., Hopwood, D. A. (2000) Growth and preservation of Streptomyces. In Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation.

Le, S.Y., Lee, B.H. (2006). Esterolytic and Lipolytic Activities of Lactobacillus Casei-subsp-Casei LLG. Journal of Food Science 55: 119 - 122.

Li, Y., Florova, G., Reynolds, A. (2005). Alteration of the fatty acid profile of Streptomyces coelicolor by replacement of the initiation enzyme 3-ketoacyl acyl carrier protein synthase III (FabH). J Bacteriology 187: 37953799.

Meng, X., Yang, J., Xu, X., Zhang, L., Nie, Q., Xian, M. (2009). Biodiesel production from oleaginous microorganisms, Renew. Energ. 34:1-5.

Nagao, A, Ishida, N. y Terao, J. (1991) Synthesis of 6-phosphatidyl-L-ascorbic acid by phospholipase D. Lipids 26: 390-394.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Novák, J., Hájek, P., Rezanka, T., and Vanék, Z. (1992) Nitrogen regulation of fatty acids and avermectins biosynthesis in Streptomyces avermitilis. FEMS Microbiol Lett.72(1):57-61.

Olukoshi, E.R., Packter, N.M. (1994). Importance of stored triacylglycerols in Streptomyces: possible carbon source for antibiotics. Microbiology 140:931-943

Packter, N. M. y Olukoshi, E. R. (1995) Ultrastructural studies of neutral lipid localisation in Streptomyces. Arch Microbiol 164: 420-427.

Ratledge, C., Cohen, Z. 2008. Microbial and algal oils: Do they have a future for biodiesel or as commodity oils. Lipid Technology 20:155-160.

Ratledge, C., Seekstra, H., Cohen, Z., Fichtali, J. 2005. Down-stream processing, extraction, and purification of single cell oils. In Single Cell Oils. Cohen Z, Ratledge C (eds). AOCS Press, Champaign, IL, U.S. 202-219.

Rice, P., Longden, I. y Bleasby, A. (2000) EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite, Trends Genet, 16, 276-277.

Soror, S.H., Verma, V., Rao, R., Rasool, S., Koul, S., Qazi, G.N., Cullum J. 2007. A cold-active esterase of Streptomyces coelicolor A3(2): from genome sequence to enzyme activity Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34:525-531.

Strobel, G. A., Knighton, B. Kluck, K., Ren, Y., Livinghouse, T., Griffin M, Spakowicz, D. y Sears, J. (2008) The production of myco-diesel hydrocarbons and their derivatives by the endophytic fungus Gliocladium roseum (NRRL 50072). Microbiology 154 (2008), 3319-3328; DOI 10.1099/mic.0.2008/022186-0.

Suutari, M. y Laakso, S. (1992) Changes in fatty acid branching and unsaturation of Streptomyces griseus and Brevibacterium fermentans as a response to growth temperatura. Appl Env Microb 58: 2338-2340.

Waltermann, M., Stoveken, T y Steinbüchel. A. (2007). Key enzymes for biosynthesis of neutral lipid storage compounds in prokaryotes: Properties, function and occurrence of wax ester synthases/acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferases. Biochimie 89: 230-242.

Ylihonko, K, Tuikkanen, J, Jussila, S, Cong, L y Mantsala, P (1996) A gene cluster involved in nogalamycin biosynthesis from Streptomyces nogalater. sequence analysis and complementation of early-block mutations in the anthracycline pathway. Mol Gen Genet 251:113-120.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Neste Oil Oyj

<120> Proceso y microorganismos para la producción de lípidos <130> BP201627 <160> 10

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211 > 1860

<212> ADN

<213> Streptomyces coelicolor

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1860)

<400> 1

gtgcggtaga tgtgcgaggt ggcccggcgg agctcgtcga gttccttcag tacgtcgagg gggccgtacg cggacgccgc cacctcgtcc atcgccgctg ccgttccctg gtcaccgtcg agcggatttt attcagcgcg cggcgtggat cgtgagcaac gtctccacct cctcggccac cgccttcgcg tcggcgagca ggccgtagtg cgccagggag tggccgcggg ccagcggggc gcccagccgc agcccgaggc tgggcagggg ccgggcggcc ccggagacca gtggcccgcc ggcgagcagg gcgacggctc cggcgccgcg ggcggcgcgg accgtgccga ggcgggcgag caggtacccg gagagccggt ttccctgggg ggggatcagg gcccggggcg cgacgccctc gcgcagggcg cccgcgacga ccgcgatcag gcggacgtgg tgcacgtcgt cgaggtcgac ggacgcggcg gtgagcgcgg gcgaggaacg accgatgtcc agggcgcgcc cggcgtcgga gcgcacgtcc ggcaggagtc cgcgcggcgg gtccatcggg tccaggacac ccgcggccag gtggtggaac ttgaacagca cggcgaagga ctcccacggc ggccgtccgc gttccagggg gaagtccgtg gccggggcgt gcagccgcac ctcgcgggtc gcgccgccga acgcgaacgg gtcccggatc ctcatccgca gtccgggcac cgcgagcgcg cccgcggtgg gcgagtcggc ggggtgctcg gcggactcga tgttccagaa agtcaagggc ttgcctcgca aggacgacgc gcagtcaatc gctctccgac gattacggtc gagattaaaa gtcccgcccc tttcgacagg gtgctcgcgt cggctcaggt cagcggcggc

5 <210>2

<211> 1380

<212> ADN

<213> Streptomyces coelicolor

accgcgatcg cgtcggggtg gtcgacgtcc 60 cagagcgcca gccgttcggg gtcgataccg 120 gtggtcgccg caccgtcctg tgtcaccgtc 180 cggcgctccg ggaggcgacc gctgtcgaac 240 ccaaacccgc cggggtcagg gacggcacgc 300 cgccacggcg agccggtcga ggtccggcac 360 gacccgcccg cggtacgtcg agacggccac 420 cagtggatag acctcggtga gcgggtgccc 480 gacgctggtg accaggaggt cgaaccagag 540 gagccggtgg ccgagcgccg ggacgtggtc 600 tccgggcccg gcgtccttgt tgcggtccat 660 cgggtcgggg tcgccgaccg gaagcctcat 720 gtgcgcgctg cgcgggcggc gcctggagac 780 gctgccgtcg ccgcgttcgt ccagccagcg 840 tacgtcgttg acggtgccgc cggtggtctt 900 ggacaccccc gcggtccggc gggtcccgga 960 cacgtcgagg gtggacaacg ccgcggcggc 1020 cagggcgccg cgcagccggt cgggcagggc 1080 ctgctcgggg cggggccggg gtgccggcag 1140 cgtcagggcg cgcagaccgt cggccagggc 1200 cccgccgtcc gcgcccggca gcacgtgcgc 1260 gcgttccatc aggcgcccgg cccgggcgtg 1320 gtggtcgagc gggtcgaagc gggggtcggg 1380 ccggcgcagg gccatcggcg gctgccaggt 1440 cgcgggggcg cgggccgcga gcaggtccgc 1500 ctcgaagacg ccgagcgcgc ccaggtgcat 1560 cgccaggtcg aggggagcga gcggatcggg 1620 atgggcggtg gatggacaac gggtggacaa 1680 aagtacgatc acgctacgca cagttaacaa 1740 ggcgggactg ctgtgactca tggggcgcct 1800 ggcaccgcct ctgtcccggt accccacccg 1860

10

<220>

<221> gen <222> (1 )..(1380)

<400>2

cagtgagccg tcagcgcccg

ggattcactc cccacacctg

ggtttcccgt ctccgccgcc

tgcccggtga cccgggcgtc

gtcaccaacg cggagctgga

acggggatcg cccagcgcta

ggcgcggccg agcgggcact

atcgtggcca ccaccactcc

cggctgggca ccggcccggt

tacggactcg ccacggggtc

atcggtgcgg agaccttctc

ttcggtgacg gcgccggcgc

ctcggcccgc tgcggctggg

ggcggaccgc cgcggccggg

atggagggca agcgggtctt

gtgctcgacc gggcgggctg

aaccaccgca tcaccgcccg

agcaacatcg ccgaggtggg

gcgcacgccc ggggcaccct

ggcctcacct ggggtgccgc

ccggccgggc ccggccgaag

ctcggaaact gatcaccgac

tggagccgga cacccccatc

<210>3 <211> 446 <212> PRT

<213> Streptomyces coelicolor <400> 3

gtcaggggcc

ccggccggca

gcaccaggcc

cgtgctgacc

gcggacgatg

cgtggccgaa

gaagtccgcc

ggaccggccc

cccggcgttc

cggtctgatc

ccgcatcctc

cgtcgtgctg

cagcgacggc

cgcggcggca

ctggctcgcc

gcgggtggcg

gctcgccgac

caacaccgcc

ccggcccggc

cgccctgacc

cgcgcgcaga

tacatcgccg

gcggagctga

ccggccagac

aaccgtccat

caccgcacac

ggcctcggtt

gacacctcgg

gagggcaccc

cgcctgacac

tgcccggcga

gacgtgtccg

gcgtccggag

aacccgcagg

cgcgccggcg

accggcgtgg

ccggacgatc

gtccagcgca

gacgtggact

gagatcggca

gccgcctcca

gaccgggtgc

tggcccgccg

cgaccgatga

acgcctggat

acatcatcga

tcggtgcggc

cacgcgagga

cgcggccgct

cctgtctgcc

acgagtggat

tcacctccga

cggacgagat

ccgcgccgac

cggtgtgctc

cggcggaacg

accgctccac

agccggggga

acctgatcac

tcgccgaccg

tgggcgagtg

ggctggtcag

tcccccgcga

tccccctcgc

tcctcaccgc

tcgatccggt

accaaggacg

gggcggcgac

ctccgccgcc

cggggggccc

gcacacacgt

ccgcgggcgg

gtcccggtgc

ccgggcccgt

cctggcggtg

cgacgcggtc

ggtggcggcc

cggcttcctc

ggtcctggtc

ctcggtgatc

gaccggtgcc

cgtgccggcc

ctacttcacc

cgcggagagc

ccaccaggcc

gcgcagcgtc

gctcgaccac

cttcggcggc

ctgagggcgg

accatgactc

gccgaaggcc

atcttcgacc

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un proceso para producir lípidos, que comprende:

   - cultivar células bacterianas del género Streptomyces en un medio que comprende material lignocelulósico como fuente o fuentes de carbono y/o de nutrientes, en donde dicho material lignocelulósico se añade al medio de cultivo sin la hidrólisis de los polisacáridos;

   - recuperar los lípidos de las células de dichas bacterias o del medio de cultivo.
2. 2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el material lignocelulósico comprende desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos industriales, desecho o desechos o residuo o residuos orgánicos agrícolas o cualquier mezcla de los mismos.
3. 3. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que el medio de cultivo comprende como fuente de carbono adicional glicerol, una fracción de la industria del azúcar o del almidón, jarabe o jarabes de azúcar o almidón o azúcar o azúcares purificados o cualquier mezcla de los mismos.
4. 4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad de triacilgliceroles en el medio de cultivo gastado es al menos de 1 g/litro.
5. 5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medio de cultivo no es estéril o pasteurizado.
6. 6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el medio de cultivo comprende inhibidores de la lipasa.
7. 7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la especie de Streptomyces se selecciona del grupo de especies que comprende Streptomyces roseosporus, Streptomyces griseus, Streptomyces albus, Streptomyces peucetius, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces avermitilis y Streptomyces lydicus.
8. 8. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células bacterianas se modifican genéticamente para expresar un gen endógeno o exógeno que codifica DGAT (EC 2.3.1.20) y/o la proteína vehículo 3-cetoacil-acil sintasa III (EC: 2.3.1.41).
9. 9. el proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las células bacterianas se hacen deficientes en la producción de agentes antibióticos.
10. 10. Un cultivo celular para la producción de lípidos, que comprende

    (a) una población de células bacterianas del género Streptomyces, en el que dichas células bacterianas se modifican genéticamente para expresar un gen endógeno o exógeno que codifica DGAT (EC 2.3.1.20) y/o la proteína vehículo 3-cetoacil-acil sintasa III (EC: 2.3.1.41), en donde la modificación genética del hospedador Streptomyces

    (i) se lleva a cabo introduciendo en el hospedador Streptomyces un gen exógeno de otra especie de Streptomyces o una copia o copias adicionales de un gen endógeno, o

    (ii) el gen se expresa bajo otro promotor dando como resultado una expresión aumentada del gen, o

    (iii) el hospedador Streptomyces está genéticamente modificado de tal manera que o bien el gen se expresa más abundantemente o bien aumenta la actividad del producto génico; y

    (b) un medio de cultivo que comprende material lignocelulósico como fuente o fuentes de carbono y/o nutrientes, en donde dicho material lignocelulósico se añade al medio de cultivo sin hidrólisis de los polisacáridos.
11. 11. El cultivo de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la especie de Streptomyces se selecciona del grupo de especies que comprenden Streptomyces roseosporus, Streptomyces griseus, Streptomyces albus, Streptomyces peucetius, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces avermitilis y Streptomyces lydicus.
12. 12. El cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que las células bacterianas están genéticamente modificadas para expresar uno o más genes seleccionados del grupo que comprende

    (a) sco0958 que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1 y/o sco5888 que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2;

    (b) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 60 % de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
13. 13. El medio de cultivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que las células bacterianas se hacen deficientes en la producción de antibióticos tales como antibióticos lipopeptídicos o agentes quimioterapéuticos tales como daunomicina.

    5 14. Un hospedador seleccionado del grupo de especies que comprende Streptomyces roseosporus, Streptomyces

    griseus, Streptomyces albus, Streptomyces peucetius, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces avermitilis, Streptomyces lydicus genéticamente modificado para expresar un gen endógeno o exógeno que codifica DGAT (EC 2.3.1.20) y/o la proteína vehículo 3-cetoacil-acil sintasa III (EC: 2.3.1.41), en donde la modificación genética del hospedador

    10 Streptomyces

    (i) se lleva a cabo introduciendo en el hospedador Streptomyces un gen exógeno de otra especie de Streptomyces o una copia o copias adicionales de un gen endógeno, o

    (ii) el gen se expresa bajo otro promotor dando como resultado una expresión aumentada del gen, o

    15 (iii) el hospedador Streptomyces está genéticamente modificado de tal manera que o bien el gen se expresa más abundantemente o bien aumenta la actividad del producto génico.
14. 15. El hospedador de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el hospedador se selecciona del grupo de especies que comprende Streptomyces roseosporus y Streptomyces albus.

    20

    imagen1

    imagen2

    imagen3

    ...

    ....

    Extracto de cloroformo seco, TAG y PMV

    masa de solidos g/l

    masa de sobrenadante g/l

    TAG g/l

    PMV %

    Oh 24 h 36 h 48 h 64 h 20 h

    Tiempo en h

    Fia, 3A

    Masa ce u ar húmeda de G009 en medio TSB

    200

    150

    g/H-Taull !$A$22

    100

    3B

    imagen4

    .' . V .' :V ■ : - i' 'i - : ■ iV.;■ :V' V." i■:: ■ . : 'i:: i' :; i .iiV' . ': i'

    :C- II

    Mk3Í$£

    II

    .

    ¡ss-kIS

    ■■■■■Hhííp

    —MU

    mmsm

    , ■ ■ ,• ■ + ■ W ■

    ■ ;■: -;-:■ :■; ■:■ ■; . ■:■ ■.;. ■:■ x -:-:■;

    :+x+!-x+x.x-frx-t+x- ■ ••: -:■ mx« v -> •• •■ ■:•:

    :: : :::

    -■¡'i;;

    :;5SgíWi

    Fig. 4

    Fig. 5