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ES2678060T3 - Anticuerpos, en particular, anticuerpos humanos, que se unen a CD22 y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos, en particular, anticuerpos humanos, que se unen a CD22 y usos de los mismos Download PDF

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ES2678060T3
ES2678060T3 ES07854887.2T ES07854887T ES2678060T3 ES 2678060 T3 ES2678060 T3 ES 2678060T3 ES 07854887 T ES07854887 T ES 07854887T ES 2678060 T3 ES2678060 T3 ES 2678060T3
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antibody
acc
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ES07854887.2T
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English (en)
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David John King
Alison Witte
Heidi N. Leblanc
Richard Theolis
Asna Masood
Mark Yamanaka
Kyra D. Zens
Sara R. Dwiggins
Tim Sproul
Chetana Rao-Naik
David Passmore
Kristopher Toy
Dawn M. Tanamachi
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Original Assignee
ER Squibb and Sons LLC
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se une a CD22 humano, que comprende: (a) una región variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoácidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:2; (b) una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoácidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:60; (c) una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoácidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 10; (d) una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoácidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 14; (e) una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoácidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:20; y (f) una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoácidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:26.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos, en particular, anticuerpos humanos, que se unen a CD22 y usos de los mismos Antecedentes
CD22 es una glicoproteina de la superficie celular de tipo I de la familia de las sialoadhesinas. CD22 tambien se conoce en la tecnica como BL-CAM, B3, Leu-14 y Lyb-8, entre otros nombres. CD22 esta inicialmente caracterizada por los anticuerpos dirigidos contra S-HCL-1 (Schwarting, R. et al. (1985) Blood 65:974-983), HD39 (Dorken, B. et al. (1986) J. Immunol. 136:4470-4479) y RFB4 (Campana, D. et al. (1985) J. Immunol. 134:1524-1530). CD22 se ha definido como una molecula de adhesion analoga a lectina que se une a ligandos que tienen acido sialico con enlace alfa2,6, y es un regulador de la senalizacion del antigeno de linfocitos B (BCR, por sus siglas en ingles). Estructuralmente, existen diferentes variantes de corte y empalme para CD22, pero la forma predominante en seres humanos tiene una region extracelular que contiene varios dominios analogos a inmunoglobulinas.
Se ha demostrado que los linfocitos B expresan especificamente CD22, y es funcionalmente importante como regulador negativo de la activacion de los linfocitos B (revisado por Nitschke, L. (2005) Curr. Opin. Immunol. 17:290297 y Tedder, T.F. et al (2005) Adv. Immunol. 88:1-50). En estudios que utilizaron ratones con direccionamiento genico que expresaban moleculas de CD22 mutante que no interaction con ligandos de acido sialico alfa2,6, se determino que algunas funciones (tales como la expresion en la superficie celular de CD22, IgM y la clase II de MHC en linfocitos B maduros, mantenimiento de las poblaciones de linfocitos B de la zona marginal, proliferacion optima de linfocitos B inducida por el receptor de antigenos y tasas de renovacion de linfocitos B) estan regulados por la union del ligando CD22, mientras que otras funciones (tales como la fosforilacion de CD22, la regulacion negativa de la movilizacion del calcio despues del enlace de BCR realizada por CD22, el reclutamiento de SHP-1 en CD22 y la migracion de linfocitos B) no necesitan implicacion del ligando (Poe, J.C. et al. (2004) Nat. Immunol. 5:1078-1087).
CD22 se considera un correceptor inhibidor que modula por defecto la senalizacion de BCR estableciendo un umbral de la senalizacion que evita la estimulacion excesiva de los linfocitos B. La activacion de dicho correceptor inhibidor se produce mediante la fosforilacion en los ITIM (motivos de inhibicion del receptor basados en tirosina, por sus siglas en ingles) citoplasmicos, seguido por el reclutamiento de la tirosina fosfatasa SHP-1 o la fosfatasa lipida SHIIP (revisado en Nitschke, L. (2005) Curr. Opin. Immunol. 17:290-297), Adicionalmente, se ha descubierto que CD22 tiene un papel fundamental en el bucle de regulacion que controla la ruta de amplificacion CD19/CD21-Src-familia de la proteina tirosina quinasa (PTK) que regula los umbrales de la senalizacion basal e intensifica la activacion de Src- familia quinasa tras la union de BCR (revisado en Tedder, T.F. et al (2005) Adv. Immunol. 88:1-50).
Aproximadamente un 60-80 % de neoplasias de linfocitos B malignas expresan CD22, convirtiendola por tanto en una posible diana para la inmunoterapia pasiva (vease por ejemplo, Cesano, A. y Gayko, U. (2003) Semin. Oncol. 30:253-257). Ademas, la modulation selectiva de la actividad de los linfocito B. mediante el direccionamiento de CD22 se ha sugerido como un medio para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias (vease por ejemplo, Steinfeld, S.D. y Youinou, P. (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6:943-949). Se ha descrito un anticuerpo monoclonal de murino dirigido contra CD22 (documento WO 03/072736 A2). Un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD22 humanizado, epratuzumab, se ha descrito (Coleman, M. et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9:3991S-3994S; documento WO00/74718). Ademas, se ha descrito epratuzumab conjugado con una citotoxina (Dijoseph, J.F. et al. (2004) Blood. 103(5): 1807-1814; Carnahan, J. et al. (2006) Mol. Immunol. 44:1331-1341; Leonard, J.P. et al. (2007) Oncogene 26(25):3704-3713). Sin embargo, siguen siendo necesarios reactivos contra CD22.
Sumario
La presente invention se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o porciones de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo se une a CD22 humano, que comprende:
(a) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia en la SEQ ID NO:2;
(b) una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia en la SEQ ID NO:6 o 60;
(c) una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia en la SEQ ID NO:10;
(d) una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia en la SEQ ID NO:14;
(e) una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia en la SEQ ID NO:20; y
(f) una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia en la SEQ ID NO:26.
Los anticuerpos de la invencion, o las porciones de union a antigeno de los mismos, se describen mas detalladamente en lo sucesivo.
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Los anticuerpos de la invention presentan numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen elevada afinidad de union a CD22, la capacidad de internalizarse en celulas CD22+, la capacidad de mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), la capacidad de potenciar la muerte celular de celulas Ramos inducida mediante estimulacion del receptor de linfocitos B (BCR), y/o de inhibir el crecimiento de celulas que expresan CD22 in vivo cuando se conjugan con una citotoxina. Los anticuerpos de la invencion se pueden utilizar, por ejemplo, para tratar neoplasias malignas de linfocitos B CD22+ y/o para tratar diferentes trastornos inflamatorios o autoinmunitarios.
En un aspecto, el anticuerpo monoclonal humano aislado, o portion de union a antlgeno del mismo, presenta al menos una de las siguientes propiedades:
(a) se internaliza en celulas CD22+;
(b) presenta citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra celulas CD22+;
(c) potencia la muerte celular de celulas Ramos inducida mediante estimulacion del receptor de linfocitos B (BCR); y
(d) inhibe el crecimiento de celulas que expresan CD22 in vivo cuando se conjugan con una citotoxina.
En otra realization, el anticuerpo presenta al menos dos de las propiedades (a), (b), (c) y (d). En otra realization mas, el anticuerpo presenta tres de las propiedades (a), (b), (c) y (d).
En otra realizacion, el anticuerpo presenta las cuatro propiedades (a), (b), (c), y (d). En determinadas realizaciones, el anticuerpo no tiene un efecto antiproliferativo directo en celulas Ramos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo no induce el flujo de calcio en celulas Ramos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo no media la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en celulas Ramos. Preferentemente, el anticuerpo se une a CD22 humana con elevada afinidad, por ejemplo, con una Kd de 1 x 10-7 M o menos o una Kd de 1 x 10-8 M o menos o una
9 *^*10 11
Kd de 1 x 10 M o menos o una Kd de 1 x 10 o menos o una Kd de 7 x 10 o menos.
Ademas, un anticuerpo monoclonal humano aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, se describe en el presente documento, que compite de forma cruzada por la union a CD22 con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende:
(a) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:32 o 61 y una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:36.
Preferentemente, este anticuerpo tambien tiene una o mas de las siguientes caracterlsticas: se internaliza en celulas CD22+, media la actividad ADCC y/o potencia la muerte celular de celulas Ramos inducida mediante estimulacion del receptor del BCR, y/o inhibe el crecimiento de celulas que expresan CD22 in vivo cuando se conjugan con una citotoxina.
Otros anticuerpos preferidos, o porciones de union a antlgeno del mismo, comprenden:
(a) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO:32 o 61; y (b) una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:36.
En otro aspecto de la presente description, se proporcionan anticuerpos, o porciones de union a antlgeno del mismo, que compiten por la union a CD22 con cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados.
Los anticuerpos de la invencion pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, de un isotipo IgG1 o IgG4. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, Fab' o Fab'2, o anticuerpos monocatenarios.
La presente invencion tambien proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invencion, o una porcion de union a antlgeno del mismo, unido a un agente terapeutico, tal como una citotoxina o un isotopo radioactivo. En una realizacion particularmente preferida, la invencion tambien proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invencion, o una porcion de union a antlgeno del mismo, unido a un compuesto "Citotoxina A" (por ejemplo, mediante un enlace tiol). La presente divulgation tambien proporciona una molecula biespeclfica que comprende un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la presente divulgacion, unido a un segundo resto funcional que tiene una especificidad de union diferente a la de dicho anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo.
Las composiciones que comprenden un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, o inmunoconjugado de la presente invencion y un vehlculo farmaceuticamente aceptable tambien estan comprendidos en el alcance de la presente invencion.
Las moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos, o porciones de union a antlgeno de los mismos, de la
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presente invencion, tambien estan incluidos en la presente invention, as! como los vectores de expresion que comprenden dichos acidos nucleicos y las celulas hospedadoras que comprenden dichos vectores de expresion. Los metodos para preparar anticuerpos dirigidos contra CD22 usando celulas hospedadoras que comprenden dichos vectores de expresion tambien estan comprendidos en el alcance de la invencion y pueden incluir las etapas de (i) expresar el anticuerpo en la celula hospedadora y (ii) aislar el anticuerpo de la celula hospedadora.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere al anticuerpo, o portion de union a antlgeno del mismo, de la invencion para su uso en metodos para inhibir el crecimiento de una celula tumoral que expresa CD22. El metodo comprende poner en contacto la celula tumoral que expresa CD22 con un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion, de tal forma que el crecimiento de la celula tumoral que expresa CD22 queda inhibido. La celular tumoral puede ser, por ejemplo, un linfoma de linfocitos B, tal como un linfoma no de Hodgkin. En determinadas realizaciones, el anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, esta conjugado con un agente terapeutico, tal como una citotoxina.
Otro aspecto de la invencion se refiere al anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion para su uso en metodos para tratar un trastorno inflamatorio o autoinmunitario en un sujeto. El metodo comprende administrar al sujeto un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion, de tal forma que el trastorno inflamatorio o autoinmunitario del sujeto se trate. El trastorno autoinmunitario puede ser, por ejemplo, lupus eritematoso sistemico o artritis reumatoide.
La presente invencion tambien proporciona conjugados de molecula ligando-anticuerpo dirigido contra CD22 aislado que comprende el anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion que se unen especlficamente a CD22 con elevada afinidad. Algunos de estos conjugados de molecula ligando-anticuerpo pueden internalizarse en celulas que expresan CD22 y son capaces de mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. La presente invencion tambien proporciona el conjugado de molecula ligando-anticuerpo dirigido contra CD22 para su uso en metodos para tratar canceres, tales como el linfoma de linfocitos B, tal como un linfoma no de Hodgkin, mediante el uso de un conjugado de molecula ligando-anticuerpo dirigido contra CD22 divulgado en el presente documento.
En otro aspecto, la invencion proporciona el anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion para su uso en un metodo para tratar un trastorno inflamatorio o autoinmunitario en un sujeto. El metodo comprende administrar al sujeto un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion, de tal forma que el trastorno inflamatorio o autoinmunitario del sujeto se trate. Los ejemplos no limitativos de trastornos autoinmunitarios preferidos incluyen lupus eritematoso sistemico y artritis reumatoide. Otros ejemplos de trastornos autoinmunitarios incluyen la enfermedad inflamatoria del intestino (incluidas la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn), diabetes de tipo I, esclerosis multiple, slndrome de Sjogren, tiroiditis autoinmunitaria (incluidas la enfermedad de Grave y la tiroiditis de Hashimoto), psoriasis y glomerulonefritis.
Las composiciones que comprenden el anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion conjugada con una molecula ligando de la presente invencion tambien se proporcionan. Las moleculas ligando que se pueden conjugar ventajosamente con el anticuerpo del conjugado de molecula ligando-anticuerpo, tal como se divulgan en el presente documento, incluyen, aunque no de forma limitativa, moleculas como farmacos, toxinas, moleculas marcadoras (por ejemplo, radioisotopos), protelnas y agentes terapeuticos. Tambien se divulgan en el presente documento composiciones que comprenden conjugados de molecula ligando-anticuerpo y vehlculos farmaceuticamente aceptables.
En un aspecto, dichos conjugados de molecula ligando-anticuerpo se conjugan mediante enlazadores qulmicos. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador peptidllico, y se representa graficamente en el presente documento como (L4)p—F—(L1 )m. Otros enlazadores incluyen enlazadores de hidrazina y disulfuro, y se representa graficamente en el presente documento como (L4)p—H—(L1)m o (L4)p—J—(L1)m, respectivamente. Ademas de los enlazadores que se unen al ligando, la presente invencion proporciona tambien brazos conectores escindibles que son adecuados para su union a practicamente cualquier especie molecular.
En otro aspecto, la invencion se refiere al conjugado de molecula ligando-anticuerpo de la invencion para su uso en un metodo de inhibir el crecimiento de una celula tumoral que expresa CD22. El metodo comprende poner en contacto la celula tumoral que expresa CD22 con un conjugado de molecula ligando-anticuerpo de la divulgation de forma que se inhiba el crecimiento de la celula tumoral que expresa CD22. En una realization preferida, la molecula ligando es un agente terapeutico, tal como una citotoxina. Las celulas tumorales que expresan CD22 especialmente preferidas son linfomas de linfocitos B, tal como un linfoma no de Hodgkin. Otros tipos de celulas tumorales que expresan CD22 incluyen linfoma de Burkitt y leucemias linfoclticas cronicas de linfocitos B. En otras realizaciones adicionales, la celula tumoral que expresa CD22 procede de un cancer seleccionado del grupo que consiste en linfomas de Burkitt y leucemias linfoclticas cronicas de linfocitos B.
En otro aspecto, la invencion se refiere al conjugado de molecula ligando-anticuerpo de la invencion para su uso en un metodo para tratar el cancer en un sujeto. El metodo comprende administrar al sujeto un conjugado de molecula ligando-anticuerpo de la divulgacion de tal forma que se trate el cancer del sujeto. En una realizacion preferida, la
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molecula ligando es un agente terapeutico, tal como una citotoxina. Los canceres especialmente preferida para el tratamiento son los linfomas de linfocitos B, tal como un linfoma no de Hodgkin. Otros tipos de canceres incluyen linfomas de Burkitt y leucemias linfoclticas cronicas de linfocitos B.
Otras caracterlsticas y ventajas de la presente divulgacion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y los ejemplos, que no deben considerarse limitantes.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:41) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:31) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 12C5. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:1), CDR2 (SEQ ID NO:5) y cDr3 (SEQ ID NO:9) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V, D, y J de la llnea germinal.
La Figura 1B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:45) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:35) de la region variable de la cadena ligera lambda del anticuerpo monoclonal humano 12C5. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:13), CDR2 (SEQ ID NO:19) y CDR3 (SEQ ID NO:25) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la llnea germinal.
La Figura 2A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:42) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:32) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 19A3, y la secuencia de aminoacidos y la secuencia de nucleotidos de la region variable de la cadena pesada de anticuerpo recombinante CD22.1. Las secuencias de la region variable de la cadena pesada de 19A3 son identicas a las de CD22.1. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:2), CDR2 (SEQ ID NO:6) y CDR3 (SEQ ID NO:10) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V, D, y J de la llnea germinal.
La Figura 2B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:46) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:36) de la region variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 19A3, y las secuencias de aminoacidos y de nucleotidos de la region variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano CD22.1 recombinante. Las secuencias de la region variable de la cadena ligera kappa de CD22.1 y CD22.2 son identicas a las de 19A3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:20) y CDR3 (SEQ ID NO:26) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la llnea germinal.
La Figura 2C muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:62) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:61) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano CD22.2 recombinante. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:2), CDR2 (sEq ID NO:60) y CDR3 (SEQ ID NO:10) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la llnea germinal.
La Figura 3A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:43) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:33) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 16F7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:3), CDR2 (SEQ ID NO:7) y CDR3 (SEQ ID NO:11) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V, D, y J de la llnea germinal.
La Figura 3B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:47) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:37) de la region variable de la cadena ligera kappa Vk.1 del anticuerpo monoclonal humano 16F7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:15), CDR2 (SEQ ID NO:21) y CDR3 (SEQ ID NO:27) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la llnea germinal.
La Figura 3C muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:48) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:38) de la region variable de la cadena ligera kappa Vk.2 del anticuerpo monoclonal humano 16F7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:16), CDR2 (SEQ ID NO:22) y CDR3 (SEQ ID NO:28) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la llnea germinal.
La Figura 4A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:44) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:34) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 23C6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:4), CDR2 (SEQ ID NO:8) y cDr3 (SEQ ID NO:12) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V, D, y J de la llnea germinal.
La Figura 4B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:49) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:39) de la region variable de la cadena ligera kappa Vk.1 del anticuerpo monoclonal humano 23C6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:17), CDR2 (SEQ ID NO:23) y CDR3 (SEQ ID NO:29) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la llnea germinal.
La Figura 4C muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:50) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:40) de la region variable de la cadena ligera kappa Vk.2 del anticuerpo monoclonal humano 23C6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:18), CDR2 (SEQ ID NO:24) y CDR3 (SEQ ID NO:30) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la llnea germinal.
La Figura 5A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada de 12C5 (SEQ ID NO:31) con la secuencia de aminoacidos de VH 7-4.1 de la llnea germinal humana (SEQ ID NO:51).
La Figura 5B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 12C5 (SEQ ID NO:35) con la secuencia de aminoacidos de Va 2b2 de la llnea germinal humana (SEQ ID NO:55).
La Figura 6A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada de 19A3/CD22.1 (SEQ ID NO:32) con la secuencia de aminoacidos de Vh 4-34 de la llnea germinal humana (SEQ ID NO:52).
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La Figura 6B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena ligera de 19A3/CD22.1/CD22.2 (SEQ ID NO:36) con la secuencia de aminoacidos de VK L6 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:56).
La Figura 6C muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de CD22.2 (SEQ ID NO:61) con la secuencia de aminoacidos de Vh 4-34 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:52).
La Figura 7A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada de 16F7 (SEQ ID NO:33) con la secuencia de aminoacidos de Vh 5-51 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:53).
La Figura 7B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera Vk.1 de 16F7 (SEQ ID NO:37) de la secuencia de aminoacidos de Vk A27 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:57).
La Figura 7C muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera Vk.2 de 16F7 (SEQ ID NO:38) de la secuencia de aminoacidos de Vk A10 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:57).
La Figura 8A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada de 23C6 (SEQ ID NO:34) con la secuencia de aminoacidos de VH 1-69 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:54).
La Figura 8B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera Vk.1 de 23C6 (SEQ ID NO:39) y la region variable de la cadena ligera Vk.2 de 23C6 (SEQ ID NO:40) de la secuencia de aminoacidos de Vk L6 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:56).
La Figura 9 es un grafico de barras que muestra la internalizacion de los anticuerpos dirigidos contra CD22 humana 12C5, 19A3, 16F7 y 23C6 en celulas Raji.
La Figura 10A es un grafica que muestra la actividad ADCC (medida segun el % lisis) de los anticuerpos dirigidos contra CD22 humana 12C5, 19A3, 16F7 y 23C6 contra celulas Daudi.
La Figura 10B es un grafico que muestra la actividad ADCC (medida segun el % lisis) de los anticuerpos dirigidos contra CD22 humana 12C5, 19A3, 16F7 y 23C6 contra celulas Raji.
La Figura 11 es un grafico de barras que muestra el efecto de los anticuerpos dirigidos contra CD22 humana inmovilizados 12C5, 19A3, 16F7 y 23C6 en celulas Ramos estimuladas con BCR, medido segun el % muerte celular.
La Figura 12 es un grafico que muestra la union del ECD de CD22 mediante los anticuerpos CD22.1 y CD22.2 humanos recombinantes dirigidos contra CD22 en comparacion con el anticuerpo precursor 19A3 humano.
La Figura 13 es un grafico que muestra la union de CD22 expresada sobre la superficie de celulas CHO mediante los anticuerpos CD22.1 y CD22.2 humanos recombinantes dirigidos contra CD22.
La Figura 14 es un grafico que muestra la union de CD22 expresada sobre la superficie de celulas Raji mediante los anticuerpos CD22.1 y CD22.2 humanos recombinantes dirigidos contra CD22.
La Figura 15 es un grafico de barras que muestra la union de los dominios 1 y 2 del extremo N del ECD de CD22 mediante los anticuerpos 12C5, 19A3, 16F7 y 23C6, y mediante los anticuerpos CD22.1 y CD22.2 humanos recombinantes dirigidos contra CD22.
La Figura 16 muestra el efecto in vivo de los conjugados de anticuerpo-farmaco CD22.1-Citotoxina A y CD22.2- Citotoxina A sobre el tamano del tumor en celulas Raji en ratones SCID.
La Figura 17A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:87) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:81) del anticuerpo 4G6 humano. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:63), CDR2 (SEQ ID NO:66) y CDR3 (SEQ ID NO:69) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V, D, y J de la linea germinal.
La Figura 17B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:90) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:84) de la region variable de la cadena ligera kappa Vk1 del anticuerpo monoclonal humano 4G6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:72), CDR2 (SEQ ID NO:75) y CDR3 (SEQ ID NO:78) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la linea germinal.
La Figura 17C muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:91) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:85) de la region variable de la cadena ligera kappa VK2 del anticuerpo monoclonal humano 4G6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:73), CDR2 (SEQ ID NO:76) y CDR3 (SEQ ID NO:79) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la linea germinal.
La Figura 18A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:88) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:82) de la region variable de la cadena pesada Vh1 del anticuerpo monoclonal humano 21F6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:64), CDR2 (SEQ ID NO:67) y CDR3 (SEQ ID NO:70) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V, D, y J de la linea germinal.
La Figura 18B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:89) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:83) de la region variable de la cadena pesada Vh2 del anticuerpo monoclonal humano 21F6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:65), CDR2 (SEQ ID NO:68) y CDR3 (SEQ ID NO:71) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V, D, y J de la linea germinal.
La Figura 18C muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NOs:92) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:86) de la region variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal 21F6 humano. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO:74), CDR2 (SEQ ID NO:77) y CDR3 (SEQ ID NO:80) estan resaltadas, y se indican las derivaciones V y J de la linea germinal.
La Figura 19A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada de 4G6 (SEQ ID NO:81) con la secuencia de aminoacidos de Vh 1-69 de la linea germinal humana (SEQ
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ID NO:54).
La Figura 19B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera Vk.1 kappa de 4G6 (SEQ ID NO:84) con la secuencia de aminoacidos de Vk L18 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:93).
La Figura 19C muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera Vk.2 kappa de 4G6 (SEQ ID NO:85) con la secuencia de aminoacidos de Vk A27 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:57).
La Figura 20A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada Vh1 de 21F6 (SEQ ID NO:82) con la secuencia de aminoacidos de Vh 4-34 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:52).
La Figura 20B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada h2 de 21F6 (SEQ ID NO:83) con la secuencia de aminoacidos de Vh 4-34 con la linea germinal humana (SEQ ID NO:52).
La Figura 20C muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera kappa de 21F6 (SEQ ID NO:86) con la secuencia de aminoacidos de Vk L6 de la linea germinal humana (SEQ ID NO:56).
La Figura 21 es un grafico que muestra la union de CD22 expresada sobre la superficie de celulas CHO mediante el anticuerpo dirigido contra CD22 humana 4G6.
La Figura 22 es un grafico que muestra la union de CD22 expresada sobre la superficie de celulas CHO mediante el anticuerpo dirigido contra CD22 humana 21F6.
La Figura 23 es un grafico que muestra la union de CD22 expresada sobre la superficie de celulas Raji mediante el anticuerpo dirigido contra CD22 humana 21F6.
Descripcion detallada de las presentes divulgaciones
La presente divulgacion se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o porciones de union a antigeno del mismo, en el que el anticuerpo se une a CD22 humano, que comprende:
(g) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:2;
(h) una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:6 o 60;
(i) una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 10;
(j) una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:14;
(k) una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:20; y
(l) una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:26.
El anticuerpo de la invencion, o la porcion de union a antigeno del mismo, se describe mas detalladamente en lo sucesivo.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos se derivan de secuencias especificas de las cadenas ligeras y pesadas de la linea germinal, y comprenden rasgos estructurales y comprenden rasgos estructurales especificos tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoacidos especificas. La invencion proporciona anticuerpos aislados, conjugados de inmuno-molecula ligando, moleculas biespecificas, aficuerpos, anticuerpos de dominio, nanocuerpos y unicuerpos, metodos para fabricar dichas moleculas, y composiciones farmaceuticas que comprenden dichas moleculas y vehiculos farmaceuticos. La divulgacion se refiere tambien a metodos para usar las moleculas, tales como para detectar CD22, asi como a los anticuerpos de la invencion para su uso en un metodo para modular la actividad de los linfocitos B en enfermedades o trastornos asociados con la expresion de CD22 o que implican la regulation de linfocitos B, tales como tumores CD22+ y trastornos inflamatorios o autoinmunitarios. La invencion tambien proporciona metodos para utilizar los anticuerpos dirigidos contra CD22 de la presente invencion para inhibir el crecimiento de celulas tumorales CD22+, por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra CD22 de la presente invencion para su uso en un metodo para tratar linfomas de linfocitos B. Adicionalmente, la invencion proporciona anticuerpos dirigidos contra CD22 de la presente invencion para su uso en metodos de utilizar los anticuerpos dirigidos contra CD22 para tratar trastornos inflamatorios o autoinmunitarios.
Para que la presente invencion pueda entenderse mas facilmente, se definen en primer lugar determinados terminos. Se proporcionan definiciones adicionales a lo largo de la descripcion detallada.
Los terminos "CD22," "BL-CAM", "B3", "Leu-14" y "Lyb-8" se utilizan indistintamente, e incluyen variantes, isoformas, y especies homologas de CD22. Por consiguiente, los anticuerpos humanos de la presente divulgacion pueden, en determinados casos, reaccionar en cruzado con CD22 procedentes de especies no humanas. En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden ser totalmente especificos de la CD22 humana, y es posible que no presente
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otras especies u otros tipos de reactividad cruzada de tipo no humano. La secuencia de aminoacidos completa de una Cd22 humana ilustrativa tiene el numero de registro de GenBank NP_001762 (SEQ ID NO:59).
La secuencia CD22 humana puede diferir de la secuencia CD22 humana de la SEQ ID NO:59 por tener, por ejemplo, mutaciones conservadas o mutaciones en regiones no conservadas, y la CD22 tiene practicamente la misma funcion biologica que la CD22 humana de la SEQ ID NO:59. Por ejemplo, una funcion biologica de la CD22 humana es tener un epltopo en el dominio extracelular de CD22 que se une especlficamente a un anticuerpo de la presente divulgacion o una funcion biologica de la CD22 humana es modular la senalizacion del BCR.
Una secuencia de CD22 humana concreta sera generalmente al menos un 90 % identica en su secuencia de aminoacidos a la CD22 humana de la SEQ ID NO:59 y contiene los restos de aminoacidos que identifican la secuencia de aminoacidos como humana cuando se compara con las secuencias de aminoacidos de CD22 de otras especies (por ejemplo, de murino). En determinados casos, una CD22 humana puede ser al menos un 95 %, o incluso al menos un 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % identica en su secuencia de aminoacidos a la CD22 de la SEQ ID NO:59. En determinadas realizaciones, una secuencia de CD22 humana no mostrara mas de 10 diferencias en sus aminoacidos respecto de la CD22 de la SEQ ID NO:59. En determinadas realizaciones, la CD22 humana puede no presentar mas de 5, o incluso no mas de 4, 3, 2, o 1 diferencias de aminoacidos respecto de la CD22 de la SEQ ID NO:59. El porcentaje de identidad puede determinarse como se describe en el presente documento.
El termino "respuesta inmunitaria" se refiere a la accion de, por ejemplo, linfocitos, celulas presentadoras de antlgenos, fagocito, granulocitos, y macromoleculas solubles producidas por las anteriores celulas o el hlgado (incluidos anticuerpos, citoquinas, y complemento) que da como resultado un dano selectivo en, la destruccion de, o la eliminacion del cuerpo humano de patogenos invasores, celulas o tejidos infectados con patogenos, celulas cancerosas, o, en casos de auto inmunidad o inflamacion patologica, celulas o tejidos humanos normales.
Una "ruta de transduccion de la senal" se refiere a la relacion bioqulmica entre varias moleculas de transduccion de la senal que tienen un papel en la transmision de una senal desde una parte de una celula a otra parte de una celula. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "receptor de la superficie celular" incluye, por ejemplo, moleculas y complejos de moleculas capaces de recibir una senal y la transmision de dicha senal a traves de la membrana plasmatica de una celula. Un ejemplo de un "receptor de la superficie celular" de la presente divulgacion es la protelna CD22.
El termino "anticuerpo" tal como se cita en el presente documento incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de union a antlgeno (es decir, "porcion de union a antlgeno) o sus cadenas individuales. Un anticuerpo se refiere a una glicoprotelna que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) conectadas entres si mediante enlaces disulfuro, o una porcion de union a antlgeno del mismo. Cada cadena pesada comprende una region variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como Vh) y una region constante de la cadena pesada. La region constante de la cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una region variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como Vl) y una region constante de la cadena ligera. La region constante de la cadena ligera comprende un dominio, Cl. Las regiones Vh y Vl se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR, del ingles complementarity determining regions), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada una de las Vh y Vl esta compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas en el siguiente orden, desde el extremo amino al extremo carboxi: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interactua con el antlgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la union de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, incluidas diferentes celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clasico.
La expresion "porcion de union a antlgeno" de un anticuerpo (o simplemente la "porcion del anticuerpo"), tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse especlficamente a un antlgeno (por ejemplo, CD22). Se ha demostrado que la funcion de union a antlgeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union abarcados en la expresion "porcion de union a antlgeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la region de bisagra (vease Fundamental Immunology (Paul ed., 3a ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios VHy Ch1; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh; (vii) una region determinante de la complementariedad (CDR) aislada; y (viii) un nanocuerpo, una region variable de la cadena pesada que contiene un unico dominio variable y dos dominios constantes. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes independientes, estos se pueden unir, usando metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que les permite conformar una sola cadena de protelna en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenarias (scFv); veanse, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tambien se pretende que dichos anticuerpos
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monocatenarios esten comprendidos en la expresion "porcion de union a antlgeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas de los expertos en la materia y se seleccionan segun su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.
La abreviatura "Vk", tal como se usa en el presente documento, se refiere al dominio variable de una cadena ligera kappa, mientras que la abreviatura "Va", tal como se usa en el presente documento, se refiere al dominio variable de una cadena ligera lambda. La abreviatura "Vl", tal como se usa en el presente documento, se refiere al dominio variable de una cadena ligera de inmunoglobulina y por tanto abarca ambas cadenas ligeras Vk y Va.
Un "anticuerpo aislado", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que esta practicamente exento de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une de manera especifica a CD22 esta practicamente exento de anticuerpos que se unen de manera especifica a antlgenos que no sean CD22). Un anticuerpo aislado que se une especlficamente a CD22 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antlgenos, tales como moleculas CD22 procedentes de otras especies. Ademas, un anticuerpo aislado puede estar practicamente exento de otros materiales celulares y/o qulmicos.
Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composicion de anticuerpo monoclonal" como se usan en el presente documento se refieren a una preparacion de moleculas de anticuerpos de composicion molecular unica. Una composicion de anticuerpo monoclonal muestra una especifidad y afinidad de union unicas para un epltopo concreto.
Se pretende que el termino "anticuerpo humano", tal como se usa en el presente documento, incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones del marco como las regiones CDR se deriven de secuencias de inmunoglobulinas de la llnea germinal humana. Ademas, si el anticuerpo contiene una region constante, la region constante tambien se deriva de secuencias de inmunoglobulinas de la llnea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la presente divulgacion pueden incluir restos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria y dirigida a sitio in vitro o mediante mutacion somatica in vivo). Sin embargo, el termino "anticuerpo humano", tal como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos en los que las secuencias de la CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamifero, tal como un raton, se han injertado en secuencias marco humanas.
La expresion "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que expresan una unica especificidad de union, que tiene regiones variables en las que tanto las regiones marco como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de la linea germinal humana. En una realizacion, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal transgenico no humano, por ejemplo, un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera fusionados a una celula inmortalizada.
Se pretende que la expresion "anticuerpo humano recombinante", tal como se usa en el presente documento, incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para los genes de las inmunoglobulinas humanas o un hibridoma preparado a partir de las mismas (descrito con mayor detalle mas adelante), (b) anticuerpos aislados a partir de una celula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulinas humanas en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones del marco y las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de la llnea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagenesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgenico para secuencias de Ig humanas, mutagenesis somatica in vivo) y de esta manera, las secuencias de aminoacidos de las regiones de Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan y estan relacionadas con las secuencias de Vh y Vl de una llnea germinal humana, pueden no existir de manera natural en el repertorio de anticuerpos de la linea germinal humana in vivo.
Tal como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que esta codificada por los genes de la region constante de la cadena pesada.
Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antigeno" y "un anticuerpo especifico de un antigeno" se utilizan de manera indistinta en el presente documento con el termino "un anticuerpo que se une especlficamente a un antigeno".
La expresion "derivados de anticuerpos humanos" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.
Se pretende que el termino "anticuerpo humanizado" se refiera a anticuerpos en los que las secuencias de la CDR
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derivadas de la ilnea germinal de otra especie de mamlfero, tal como un raton, se han injertado en secuencias marco humanas. Se pueden realizar modificaciones adicionales en la region marco dentro de las secuencias del marco humanas.
Se pretende que el termino "anticuerpo quimerico" se refiera a anticuerpos en los que las secuencias de la region variable se derivan de una especie y las secuencias de la region constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo, en el que las secuencias de la region variable se derivan de un anticuerpo de raton y las secuencias de la region constante se derivan de un anticuerpo humano.
La expresion "mimetico de anticuerpo" pretende referirse a moleculas capaces de imitar la capacidad de un anticuerpo para unirse a un antlgeno, pero que no esta limitado a las estructuras de anticuerpos naturales. Los ejemplos de dichos mimeticos de anticuerpo incluyen, aunque no de forma limitativa, aficuerpos, DARPins, anticalinas, avlmeros, y versacuerpos, donde todos ellos emplean estructuras de union que, aunque imitan la union de los anticuerpos tradicionales, se generan a partir de, y funcionan, por mecanismos diferentes.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "molecula ligando" se refiere a la entidad con la que se conjuga un anticuerpo en un conjugado de anticuerpo-molecula ligando. Los ejemplos de moleculas ligando incluyen farmacos, toxinas, moleculas marcadoras (incluidos, aunque no de forma limitativa, marcadores peptldicos o de molecula pequena tales como marcadores fluorocromos, as! como marcadores monoatomicos tales como radioisotopos), protelnas y agentes terapeuticos.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que un anticuerpo se "une especlficamente a una protelna CD22 humana" se refiera a un anticuerpo que se une a una CD22 humana (y posiblemente una CD22 de una o mas especies humanas) pero que no se une sustancialmente a protelnas no cD22. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgacion se une especlficamente a la CD22 humana de la SEQ ID NO:59 o una variante de la misma. Preferentemente, el anticuerpo se une a la CD22 humana con una KD de 1 x 10-7 M o menos, mas preferentemente 1 x 10-8 M o menos, mas preferentemente 5 x 10-9 M o menos, mas preferentemente 1 x 10-9 M o menos, incluso mas preferentemente 5 x 10-10 M o menos, e incluso mas preferentemente 7 x 10-11 o menos.
El termino "no se une sustancialmente" a una protelna o celulas, tal como se usa en el presente documento, significa que no se une o no se une con elevada afinidad a la protelna o las celulas, es decir, se une a la protelna o las celulas con una KD de 1 x 10-6 M o mas, mas preferentemente 1 x 10-5 M o mas, mas preferentemente 1 x 10-4 M o mas, mas preferentemente 1 x 10-3 M o mas, incluso mas preferentemente 1 x 10-2 M o mas.
Se pretende que el termino "Kasoc" o "Ka", tal como se usa en el presente documento, se refiera a la velocidad de asociacion de una interaccion anticuerpo-antlgeno concreta, mientras que se pretende que el termino "Kdis" o "Kd," tal como se usa en el presente documento, se refiera a la velocidad de disociacion de una interaccion anticuerpo- antlgeno concreta. Se pretende que el termino "Kd", tal como se usa en el presente documento, se refiera a la primera constante de disociacion, que se obtiene a partir de la relacion de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentracion molar (M). Los valores de Kd se pueden determinar para anticuerpos utilizando metodos bien establecidos en la materia. Un metodo preferido para determinar la Kd de un anticuerpo es utilizar la resonancia de plasmon superficial, preferentemente mediante el uso de un sistema de biodeteccion tal como el sistema Biacore®.
Tal como se usa en el presente documento, El termino "elevada afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 1 x 10-7 M o menos, mas preferentemente 5 x 10-8 M o menos, incluso mas preferentemente 1x10-8 M o menos, incluso mas preferentemente 5 x 10-9 M o menos e incluso mas preferentemente 1 x 10-9 M o menos para un antlgeno diana. Sin embargo, la union con "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, la union con "elevada afinidad" para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-6 M o menos, mas preferentemente 10-7 M o menos, incluso mas preferentemente 10-8 M o menos.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El termino "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamlferos y no mamlferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
El slmbolo "-", ya se utilice como un enlace o se muestre perpendicular a un enlace, indica el punto en el cual resto mostrado esta unido al resto de la molecula, soporte solido, etc.
El termino "alquilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, significa, salvo que se indique de otra forma, una cadena lineal o ramificada, o un radical hidrocarburo clclico, o una combinacion de los mismos, que puede estar completamente saturado, monosaturado o polinsaturado y puede incluir radicales divalentes y multivalentes, que tiene el numero de atomos de carbono designado (es decir C1-C10 significa de uno a diez atomos de carbono). Los ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen, aunque no de forma limitativa, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homologos e isomeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o mas enlaces dobles o enlaces triples. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen,
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aunque no de forma limitativa, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4- pentadienilo), etinilo, 1-propinilo y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homologos e isomeros superiores. El termino "alquilo", a menos que se indique otra cosa, pretende tambien incluir aquellos derivados de alquilo definidos con mayor detalle a continuacion, tal como heteroalquilo. Los grupos alquilo, que estan limitados a grupos hidrocarburo, se denominan "homoalquilo".
El termino "alquileno" por si mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, como se ilustra, aunque no de forma limitativa, por -CH2CH2CH2CH2-, e incluye adicionalmente aquellos grupos descritos a continuacion como "heteroalquileno". Normalmente, un grupo alquilo (o alquileno) tendra de 1 a 24 atomos de carbono, prefiriendose en la presente invention aquellos grupos que tienen 10 o menos atomos de carbono. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena mas corta, que generalmente tiene ocho o menos atomos de carbono.
El termino "heteroalquilo", por si mismo o junto con otro termino, significa, salvo que se indique de otra forma, una cadena lineal o ramificada estable, o un radical hidrocarburo clclico, o combinaciones de los mismos, que consiste en el numero indicado de atomos de carbono y al menos un heteroatomo seleccionado entre el grupo que consiste en O, N, Si, y S, y en el que el los atomos de nitrogeno, carbono y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroatomo de nitrogeno puede estar opcionalmente cuaternizado. Los heteroatomo(s) O, N, S, y Si pueden colocarse en cualquier position interior del grupo heteroalquilo o en la position en la cual el grupo alquilo esta unido al resto de la molecula. Los ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, - CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, - CH2-CH=N-OCH3, y -CH=CH-N(CH3)-CH3. Hasta dos heteroatomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3 y -CH2-O-Si(CH3)3. De manera similar, el termino "heteroalquileno" por si mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, como se ilustra, aunque no de forma limitativa por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroatomos tambien pueden ocupar cualquiera o ambos extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino, y similares). Los terminos "heteroalquilo" y "heteroalquileno" abarcan poli(etilenglicol) y sus derivados (vease, por ejemplo, Shearwater Polymers Catalog, 2001). Adicionalmente, para los grupos enlazantes de alquileno y heteroalquileno, ninguna orientation del grupo de enlace esta impllcita en la direction en la que se escribe la formula del grupo de enlace. Por ejemplo, la formula -C(O)2R'- representa tanto - C(O)2R'- como -R'C(O)2-.
El termino "inferior" junto con los terminos "alquilo" o "heteroalquilo" se refieren a un resto que tiene de 1 a 6 atomos de carbono.
Los terminos "alcoxi", "alquilamino", "alquilsulfonilo", y "alquiltio" (o tioalcoxi) se usan en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos al resto de la molecula a traves de un atomo de oxlgeno, un grupo amino, un grupo SO2 o un atomo de azufre, respectivamente. El termino "arilsulfonilo" se refiere a un grupo arilo unido al resto de la molecula mediante un grupo SO2, y el termino "sulfhidrilo" se refiere a un grupo SH.
En general, un "sustituyente acilo" tambien se selecciona entre el grupo que se ha definido anteriormente. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "sustituyente acilo" se refiere a los grupos unidos, y que cumplen la valencia, de un carbono carbonilo que esta unido directa o indirectamente al nucleo policlclico de los compuestos de la presente invencion.
Los terminos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por si mismos o junto con otros terminos, representan, salvo que se indique de otra forma, versiones clclicas de "alquilo" sustituido o no sustituido y "heteroalquilo" sustituido o no sustituido, respectivamente. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroatomo puede ocupar la posicion en la que el heterociclo se une al resto de la molecula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, aunque no de forma limitativa, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, aunque no de forma limitativa, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3- piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofurano-2-ilo, tetrahidrofurano-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien- 3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo y similares. Los heteroatomos y los atomos de carbono de las estructuras clclicas estan opcionalmente oxidados.
Los terminos "halo" o "halogeno", por si mismos o como parte de otro sustituyente, significan, salvo que se indique de otra forma, un atomo de fluor, cloro, bromo, o yodo. Adicionalmente, se pretende de terminos tales como "haloalquilo" incluyan monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, se pretende que el termino "haloalquilo(C1-C4)" incluya, aunque no de forma limitativa, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo, y similares.
El termino "arilo" significa, salvo que se indique de otra forma, un sustituyente hidrocarburo aromatico poliinsaturado sustituido o no sustituido que puede tener un unico anillo o multiples anillos (preferentemente, de 1 a 3 anillos) que estan condensados entre si o unirse covalentemente. El termino "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) arilo que contienen de uno a cuatro heteroatomos seleccionados entre N, O, y S, en el que los atomos de nitrogeno, carbono y azufre estan opcionalmente oxidados y el atomo o atomos de nitrogeno estan opcionalmente cuaternizados. Un grupo heteroarilo se puede unir al resto de la molecula a traves de un heteroatomo. Los ejemplos no limitantes de
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grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2- imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4- isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4- piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo,
2- quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan entre el grupo de sustituyentes aceptables descritos a continuacion. "Arilo" y "heteroarilo" tambien abarcan sistemas de anillo en los que uno o mas sistemas de anillos no aromaticos se condensan, o se unen de otra manera, a un sistema de anillo de arilo o heteroarilo.
En resumen, el termino "arilo" cuando se usa junto con otros terminos (por ejemplo, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye anillos de arilo y heteroarilo como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, se pretende que el termino "arilalquilo" incluya aquellos radicales en los que un grupo arilo esta unido a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares) incluidos aquellos grupos alquilo en los que un atomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) se ha sustituido por, por ejemplo, un atomo de oxlgeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-pi ridiloximetilo,
3- (1-naftiloxi)propilo, y similares).
Cada uno de los terminos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo incluyen formas tanto sustituidas como no sustituidas del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan a continuacion.
Los sustituyentes de los radicales alquilo y heteroalquilo (incluidos aquellos grupos denominados a menudo como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, y heterocicloalquenilo) se denominan de forma general como "sustituyentes alquilo" y "sustituyentes heteroalquilo", respectivamente, y pueden ser uno o mas de varios grupos seleccionados entre, aunque no de forma limitativa: - OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogeno, -SiR'R"R"', -OC(O)R' -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", - NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R' -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', - S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2 en un numero comprendido entre cero y (2m'+1), donde m' es el numero total de atomos de carbono en dicho radical. Cada uno de R', R", R''' y R'''' se refiere independientemente a hidrogeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, por ejemplo, arilo sustituido por 1-3 halogenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invencion incluye mas de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente para cada grupo R', R", R'" y R"" cuando mas de uno de estos grupos esta presente. Cuando R' y R'' estan unidos al mismo atomo de nitrogeno, se pueden combinar con el atomo de nitrogeno para formar un anillo de 5, 6, o 7 miembros. Por ejemplo, se entiende que -NR'R" incluye, aunque no de forma limitativa, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. Segun el anterior analisis de los sustituyentes, un experto en la materia comprendera que se entiende que el termino "alquilo" pretende incluir grupos que incluyen atomos de carbono unidos a grupos diferentes a los grupos hidrogeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, y similares).
Analogamente a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes arilo y los sustituyentes heteroarilo se denominan generalmente como "sustituyentes arilo" y "sustituyentes heteroarilo", respectivamente, y son una variedad y se seleccionan entre, por ejemplo: halogeno, -OR', =O, =Nr', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogeno, - SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR- CCNR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN y -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcoxi(C1-C4, y fluoroalquilo (C1-C4), en un numero comprendido entre cero y el numero total de valencias disponibles en el sistema de anillo aromatico; y donde R', R", R''' y R'''' se seleccionan independientemente entre hidrogeno, alquilo (CrCs) y heteroalquilo, arilo y heteroarilo no sustituido, (arilo no sustituido)-alquilo(C1-C4), y (arilo no sustituido)oxi-alquilo(C1- C4). Cuando un compuesto de la invencion incluye mas de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente para cada grupo R', R", R'" y R"" cuando mas de uno de estos grupos esta presente.
Dos de los sustituyentes arilo en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente por un sustituyente de formula -T-C(O)-(CRR')q-U-, en la que T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'- o un enlace simple, y q es un numero entero de 0 a 3. Como alternativa, dos de los sustituyentes de los atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente por un sustituyente de formula -A-(CH2)r-B- , en la que A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- o un enlace simple, y r es un numero entero de 1 a 4. Uno de los enlaces simples del nuevo anillo as! formado puede sustituirse opcionalmente por un doble enlace. Como alternativa, dos de los sustituyentes en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos con un sustituyente de formula -(CRR')s-X-(CR"R'")D-, en la que s y d son independientemente numeros enteros de 0 a 3, y X es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, o -S(O)2nR'-. Preferentemente, los sustituyentes R, R', R" y R'" se seleccionan independientemente entre hidrogeno o alquilo (C1- C6) sustituido o no sustituido.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "difosfato" incluye, aunque no de forma limitativa, un ester de acido fosforico que contiene dos grupos fosfato. El termino "trifosfato" incluye aunque no de forma limitativa un ester de acido fosforico que contiene tres grupos fosfato. Por ejemplo, los farmacos concretos que tienen un difosfonato o un trifosfato incluyen:
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Tal como se usa en el presente documento, el termino "heteroatomo" incluye oxlgeno (O), nitrogeno (N), azufre (S) y silicio (Si).
El slmbolo "R" es una abreviatura general que representa un grupos sustituyente que se ha seleccionado entre alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y grupos heterociclilo sustituidos o no sustituidos.
Diversos aspectos de la presente divulgacion se describen con mas detalle en los siguientes subapartados. Anticuerpos dirigidos contra CD22
Los anticuerpos de la presente divulgacion se caracterizan por rasgos funcionales particulares o propiedades de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen especlficamente a CD22 humana. Preferentemente, un anticuerpo de la invencion se une a CD22 humana con elevada afinidad, por ejemplo, con una Kd de 1 x 10-7 M o menos.
Los anticuerpos dirigidos contra CD22 de la presente divulgacion presentan preferentemente una o mas de las siguientes caracterlsticas:
(a) se internalizan en celulas CD22+;
(b) presentan citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra celulas CD22+;
(c) potencian la muerte celular de celulas Ramos inducida mediante estimulacion del receptor de linfocitos B (BCR), e
(d) inhibe el crecimiento de celulas que expresan CD22 in vivo cuando se conjugan con una citotoxina.
En realizaciones preferidas, el anticuerpo presenta al menos dos de las propiedades (a), (b), (c) y (d). En otra realizacion mas, el anticuerpo presenta tres de las propiedades (a), (b), (c) y (d). En otra realizacion, el anticuerpo presenta las cuatro propiedades (a), (b), (c), y (d).
Aunque los anticuerpos dirigidos contra CD22 de la divulgacion presentan determinadas propiedades funcionales, en determinadas realizaciones, otro rasgo de los anticuerpos es que no presentan otras propiedades funcionales concretas. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el anticuerpo no tiene un efecto antiproliferativo directo en celulas Ramos. En otras realizaciones, el anticuerpo no induce el flujo de calcio en celulas Ramos. En otras realizaciones mas, el anticuerpo no media la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en celulas Ramos.
Se indica que se ha notificado que un anticuerpo dirigido contra CD22 humanizado, epratuzumab, carece de un efecto antiproliferativo directo y de actividad cDc contra llneas de celulas de linfoma no de Hodgkin, aunque el anticuerpo medio efectos citotoxicos contra las llneas de celulas por otros medios (vease Carnahan, J. et al. (2006) Mol. Immunol. 44:1331-13411.
Preferentemente, un anticuerpo de la presente divulgacion se une a CD22 humana con una Kd de 1 x 10-7 M o menos, se une a CD22 humana con una Kd de 1 x 10-8 M o menos, se une a CD22 humana con una Kd de 5 x 10-9 M o menos, se une a CD22 humana con una Kd de 3 x 10-9 M o menos, se une a CD22 humana con una Kd de 1 x 10-9 M o menos, o se une a CD22 humana con una Kd de 5 x 10-10 M o menos, o se une a CD22 humana con una Kd de 1 x 10-10 o se une a CD22 humana con una Kd de 7 x 10-11 M o menos.
Se conocen en la tecnica ensayos normalizados para evaluar la afinidad de union de los anticuerpos frente a CD22 humana, incluyendo, por ejemplo, analisis ELISA y BIAcore con CD22 recombinante (vease el Ejemplo 3). Los Ejemplos tambien proporcionan descripciones detalladas de ensayos adecuados para evaluar la internalizacion de anticuerpo (Ejemplo 4), actividad ADCC (Ejemplo 5), potenciacion de la muerte celular inducida por la estimulacion de BCR (Ejemplo 7), efectos antiproliferativos directos de los anticuerpos (Ejemplo 8), induccion del flujo de calcio (Ejemplo 6), y actividad CDC (Ejemplo 9), y efectos antiproliferativos de los inmunoconjugados de anticuerpo- farmaco sobre la proliferacion de celulas de tumores solidos in vivo (Ejemplo 10).
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Anticuerpos monoclonales 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6
Los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento son los anticuerpos monoclonales humanos 12C5, 19A3, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6, y los anticuerpos monoclonales humanos recombinantes CD22.1, CD22.2, todos ellos aislados y estructuralmente caracterizados como se describe en los Ejemplos 1 y 2.
Los anticuerpos preferidos de la presente invencion son los anticuerpos monoclonales humanos 19A3, CD22.1 y CD22.2.
Las secuencias de aminoacidos de la Vh de 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs: 31, 32, 61, 33, 34, 81, 82 y 83, respectivamente, en donde las cadenas pesadas de 19A3 y CD22.1 son identicas y corresponde a la SEQ ID NO:32 y la cadena pesada Vh de 21F6 corresponde a cualquiera de las SEQ ID NO:82 o 83.
Las secuencias de aminoacidos de la Vl de 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs:35, 36, 37, 38, 39, 40, 84, 85 y 86, respectivamente, en la que las cadenas ligeras kappa de 19A3, CD22.1 y CD22.2 son identicas y corresponden a la SEQ ID NO:36, la cadena ligera kappa de 16F7 corresponde a cualquiera de las SEQ ID NO:37 o 38, la cadena ligera kappa de 23C6 corresponde a cualquiera de las SEQ ID NO:39 o 40, y la cadena ligera kappa de 4G6 corresponde a cualquiera de las SEQ ID NO: 84 o 85.
Dado que cualquiera de estos anticuerpos puede unirse a CD22, las secuencias de Vh y Vl se pueden "mezclar y emparejar" para crear otras moleculas de union a CD22. La union a CD22 de dichos anticuerpos "mezclados y emparejados" se pueden analizar usando los ensayos de union anteriormente descritos y en los Ejemplos (por ejemplo ELISA o citometrla de flujo). Preferentemente, cuando las cadenas Vh y Vl se mezclan y se emparejan, una secuencia Vh de un emparejamiento Vh/Vl concreto se sustituye por una secuencia Vh estructuralmente similar. Asimismo, preferentemente, una secuencia Vl de un emparejamiento Vh/Vl concreto se sustituye por una secuencia Vl estructuralmente similar.
Por consiguiente, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, en el que el anticuerpo se une especlficamente a CD22 humana, que comprende: una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:32 o 61 y una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:36. En otro aspecto, los anticuerpos comprenden las CDR1, CDR2, y CDR3 de las cadenas ligera y pesada de 19A3, CD22.1 o CD22.2.
Las secuencias de aminoacidos de las CDR1 de Vh de 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs: 1-4 y 63-65, respectivamente (en las que las CDR1 de las secuencias Vh de 19A3, CD22.1 y CD22.2 son identicas y se muestran en las SEQ iD NO:2, y las CDR1 de las secuencias Vh1 y Vh2 de 21F6 son identicas y se muestran en las SEQ ID NOs: 64 y 65, respectivamente.
Las secuencias de aminoacidos de las CDR2 de Vh de 12C5, 19A3, CD22.1, 16F7, 23C6, CD22.2, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs: 5-8, 60, y 66-68, respectivamente (en las que las CDR2 de las secuencias Vh de 19A3 y CD22.1 son identicas y se muestran en las SEQ ID NO:6, la CDR2 de la secuencia Vh de CD22.2 se muestra en la SEQ ID NO:60, y las CDR2s de las secuencias Vh1 y Vh2 de 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs:67 y 68).
Las secuencias de aminoacidos de las CDR3 de Vh de 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs: 9-12 y 69-71, respectivamente (en las que las CDR3 de las secuencias Vh de 19A3, CD22.1 y CD22.2 son identicas y se muestran en la SEQ ID NO:10, y las CDR3 de las secuencias Vh1 y Vh2 de 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs:70 y 71).
Las secuencias de aminoacidos de las CDR1 de Vl de 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs: 13-18 y 72-74, respectivamente (en las que las CDR1 de las secuencias Vk de 19A3, CD22.1 y CD22.2 son identicas, y se muestran en la SEQ ID NO:14, las CDR1 de las secuencias Vk.1 y Vk.2 de 16F7 se muestran en las SEQ ID NOs: 15 y 16, las CDR1 de las secuencias Vk.1 y Vk.2 de 23C6 se muestran en las SEQ ID NOs: 17 y 18, y las CDR1 de las secuencias Vk.1 y Vk.2 de 4G6 se muestran en las SEQ ID NOs 72 y 73).
Las secuencias de aminoacidos de las CDR2 de Vl de 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs: 19-24 y 75-77, respectivamente (en las que las CDR2 de las secuencias Vk de 19A3, CD22.1 y CD22.2 son identicas, y se muestran en la SEQ ID NO:20, las CDR2 de las secuencias Vk.1 y Vk.2 de 16F7 se muestran en las SEQ ID NOs: 21 y 22, las CDR2 de las secuencias Vk.1 y Vk.2 de 23C6 se muestran en las SEQ ID NOs: 23 y 24, y las CDR2 de las secuencias Vk.1 y Vk.2 de 4G6 se muestran en las SEQ ID NOs: 75 y 76).
Las secuencias de aminoacidos de las CDR1 de Vl de 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs: 25-30 y 78-80, respectivamente (en las que las CDR3 de las secuencias Vk de 19A3, CD22.1 y CD22.2 son identicas, y se muestran en la SEQ ID NO:26, las CDR3 de las secuencias Vk.1 y Vk.2 de 16F7 se muestran en las SEQ ID NOs: 27 y 28, las CDR3 de las secuencias Vk.1 y Vk.2 de 23C6 se muestran en las SEQ ID NOs: 29 y 30, y las CDR3 de las secuencias Vk.1 y Vk.2 de 4G6 se muestran en las SEQ ID NOs: 78 y 79).
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Las regiones CDR estan delineadas mediante el sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion NIH N.° 913242).
Dado que cada uno de estos anticuerpos se puede unir a CD22 y que la especificidad de union al anticuerpo se proporciona principalmente mediante las regiones CDR1, CDR2, y CDR3, las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 de VH y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 de VL se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, CDR2, y CDR3 de Vh y una CDR1, CDR2, y CDR3 de Vl) para crear otras moleculas de union a CD22. La union a CD22 de estos anticuerpos "mezclados y emparejados" se puede estudiar mediante los ensayos de union descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, analisis ELISA, Biacore®). Preferentemente, cuando las secuencias CDR de Vh se mezclan y emparejan, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vh concreta se sustituye por una o varias secuencias de CDR estructuralmente similares. Asimismo, cuando las secuencias CDR de Vl se mezclan y emparejan, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vh concreta preferentemente se sustituye por una o varias secuencias de CDR estructuralmente similares. Sera muy evidente para una persona normalmente experta en la tecnica que se pueden crear novedosas secuencias para VH y VL sustituyendo una o mas secuencias de una region CDR de VH y/o VL por secuencias estructuralmente similares procedentes de secuencias CDR divulgadas en el presente documento para las CDR1 de anticuerpo de los anticuerpos monoclonales de 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6.
Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal aislado de la invencion, o porcion de union a antlgeno del mismo, comprende:
(a) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO:2;
(b) una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende las SEQ ID NO:6 o 60;
(c) una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO:10;
(d) una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO:14;
(e) una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO:20; y
(f) una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO:26.
Es bien conocido en la materia que el dominio CDR3, independientemente de los dominio(s) CDR1 y/o CDR2, en solitario, puede determinar la especificidad de union de un anticuerpo por un antlgeno homologo y que se pueden generar de forma predecible multiples anticuerpos que tienen la misma especificidad de union basandose en la secuencia de CDR3 comun. Veanse, por ejemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (que describe la produccion de un anticuerpo humanizado dirigido contra CD30 usando solamente el dominio variable CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo murino dirigido contra CD30, Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833849 (2000) (que describe anticuerpos de la glicoprotelna epitelial 2 (EGP-2) recombinante usando solamente la secuencia de CDR3 del anticuerpo murino precursor MOC-31 dirigido contra EGP-2); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US. A. 95:8910-8915 (1998) (que describe un panel de anticuerpos dirigidos contra integrina avp3 humanizados que usan un dominio variable CDR3 de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo dirigido contra integrina avp3 de murino, LM609 en el que cada anticuerpo miembro comprende una secuencia diferente fuera del dominio CDR3 y capaz de unirse al mismo epltopo que el anticuerpo murino precursor con afinidades tan altas o mas altas que el anticuerpo murino precursor); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (que divulga que el dominio CDR3 proporciona la contribucion mas significativa a union con el antlgeno); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (que describe el injerto de las secuencias de CDR3 de la cadena pesada de tres Fabs (SI-1, SI-40, y SI-32) contra aDn placentario humano sobre la cadena pesada de un Fab del toxoide contra la toxina tetanica que sustituye el CDR3 de cadena pesada existente y que demuestran que el dominio CDR3 en solitario confiere especificidad de union); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (que describe estudios de injerto en los que la transferencia de solamente la CDR3 de la cadena pesada de un Fab poliespeclfico precursor, LNA3, a una cadena pesada de un Fab p313 de un anticuerpo IgG monoespeclfico de union al toxoide tetanico era suficiente para retener la especificidad de union del Fab precursor); Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001) (que describe mimeticos peptldicos basados en la CDR3 de un anticuerpo monoclonal dirigido contra HER2; Igarashi et al, J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995) (que describe un polipeptido sintetico de 12 aminoacidos correspondientes al dominio CDR3 de un anticuerpo dirigido contra fosfatidilserina); Bourgeois et al, J. Virol 72:807-10 (1998) (que muestra que un unico peptido derivado del dominio CDR3 de la cadena pesada de un anticuerpo dirigido contra el virus sincitial respiratorio (RSU) era capaz de neutralizar el virus in vitro), Levi et al, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993) (que describe un peptido basado en el dominio CDR3 de la cadena pesada de un anticuerpo dirigido contra VIH murino); Polymenis y Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) (que describe como se posibilita la union de un scFv mediante el injerto de la region CDR3 de la cadena pesada de un anticuerpo de union a Z-ADN) y Xu y Davis, Immunity 13:37-45 (2000) (que describe que la diversidad de la CDR3 de la cadena pesada es suficiente para permitir que moleculas de IgM por otra parte identicas distingan entre varios haptenos y antlgenos proteicos). Veanse tambien, las patentes de Estados Unidos numeros 6.951.646; 6.914.128; 6.090.382; 6.818.216; 6.156.313; 6.827.925; 5.833.943; 5.762.905 y 5.760.185, que describen anticuerpos patentados definidos mediante un unico dominio CDR.
Entre otros aspectos, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas
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dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera procedente de un anticuerpo humano, tales como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido a partir de un animal no humano, en el que el anticuerpo puede unirse especlficamente a CD22 humana. Entre otros aspectos, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios cDR3 de la cadena pesada y/o ligera procedente de un primer anticuerpo humano, tales como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido a partir de un animal no humano, en el que el primer anticuerpo humano puede unirse especlficamente a CD22 y en el que el dominio CDR3 procedente del primer anticuerpo humano sustituye un dominio CDR3 de un anticuerpo humano que carece de especificidad de union a CD22 para generar un segundo anticuerpo humano que es capaz de unirse especlficamente a CD22. En algunas realizaciones, dichos anticuerpos de la invencion que comprenden uno o mas dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera procedentes del primer anticuerpo humano (a) son capaces de competir por la union; (b) retienen las caracterlsticas funcionales; (c) se unen al mismo epltopo; y/o (d) tienen una similar afinidad de union similar a la del correspondiente primer anticuerpo humano precursor.
Anticuerpos que tienen secuencias especificas de la linea germinal
En determinadas realizaciones, se describe un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada procedente de un gen de la cadena pesada de una inmunoglobulina de la linea germinal concreta y/o una region variable de la cadena ligera procedente de un gen de la cadena ligera de una inmunoglobulina de la linea germinal concreta.
Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, comprende una region variable de la cadena pesada que es el producto o que se deriva de un gen de Vh 7-4.1 humano, un gen de Vh 4-34 humano, un gen de Vh 5-51 humano, o un gen de Vh 1-69 humano, en el que el anticuerpo se une especlficamente a CD22.
En otro ejemplo, un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antigeno del mismo, comprende una region variable de la cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen de Va 2b2 humano, un gen de Vk L6 humano, un gen de Vk A27 humano, un gen de Vk A10, o un gen de Vk L18 humano, en el que el anticuerpo se une especlficamente a CD22.
En otro ejemplo mas, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen de Vh 7-4.1 humano y comprende una region variable de la cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen Va 2b2 humano, en el que el anticuerpo se une especlficamente a CD22, preferentemente CD22 humana.
En otro ejemplo mas, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen de Vh 4-34 humano y comprende una region variable de la cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen Vk L6 humano, en el que el anticuerpo se une especlficamente a CD22, preferentemente CD22 humana.
En otro ejemplo mas, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen de Vh 5-51 humano y comprende una region variable de la cadena ligera que es el producto o se
deriva de un gen Vk A27 o A10 humano, en el que el anticuerpo se une especlficamente a CD22, preferentemente
CD22 humana.
En otro ejemplo mas, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen de Vh 1-69 humano y comprende una region variable de la cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen Vk L6 humano, en el que el anticuerpo se une especlficamente a CD22, preferentemente CD22 humana.
En otro ejemplo mas, el anticuerpo comprende una region variable de la cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen de Vh 1-69 humano y comprende una region variable de la cadena ligera que es el producto o se
deriva de un gen Vk A27 o L18 humano, en el que el anticuerpo se une especlficamente a CD22, preferentemente
CD22 humana.
Dichos anticuerpos tambien pueden tener una o mas de las caracteristicas funcionales descritas con mas detalle anteriormente, tales como internalizacion en celulas CD22+, actividad ADCC contra celulas CD22+ y/o potenciacion de la muerte celular de celulas Ramos inducida por la estimulacion de BCR con citotoxina.
Un ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 7-4.1 y Va 2b2, respectivamente, es el anticuerpo 12C5. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 4-34 y Vk L6, respectivamente, es el anticuerpo 19A3. Otro ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 4-34 y Vk L6, respectivamente, es el anticuerpo CD22.1. Otro ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 4-34 y Vk L6, respectivamente, en el que la cadena Vh incluye una mutacion N57Q, es el anticuerpo CD22.2. Otro ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 4-34 y Vk l6 de la linea germinal, respectivamente, es el anticuerpo 21F6. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 5-51 y Vk A27 o A10, respectivamente, es el anticuerpo 16F7. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 1-69 y
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Vk L6, respectivamente, es el anticuerpo 23C6. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene Vh y Vl de Vh 1-69 y Vk A27 o L18, respectivamente, es el anticuerpo 4G6.
Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "se deriva" de una secuencia especlfica de la llnea germinal si las regiones variables del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de la llnea germinal humana. Dichos sistemas incluyen inmunizar un raton transgenico que contiene genico de la inmunoglobulina humana con el antlgeno de interes o cribar una genoteca de inmunoglobulina humana expresada en fagos con el antlgeno de interes. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva" de una secuencia de inmunoglobulina de llnea germinal humana se puede identificar como tal comparando la secuencia de aminoacidos del anticuerpo humano con la secuencia de aminoacidos de las inmunoglobulinas de la llnea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de llnea germinal humana con la secuencia mas proxima (es decir, mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva" de una secuencia de inmunoglobulina de llnea germinal especlfica puede contener diferencias en los aminoacidos si se compara con la secuencia de la llnea germinal debido a, por ejemplo, mutaciones somaticas que se producen de forma natural o la introduccion intencionada de una mutacion dirigida a sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado es al menos un 90 % identico en su secuencia de aminoacidos a una secuencia de aminoacidos codificada por un gen de inmunoglobulina de llnea germinal humana y contiene restos de aminoacidos que identifican el anticuerpo humano como humano cuando se compara con las secuencias de aminoacidos de inmunoglobulinas de la llnea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la llnea germinal de murino). En determinados casos, un anticuerpo humano puede ser al menos un 95 %, o incluso al menos un 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % identico en su secuencia de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos que codifica un gen de inmunoglobulina de la llnea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia especlfica de la llnea germinal humana no presentara mas de 10 diferencias en sus aminoacidos con respecto a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de llnea germinal humana. En determinados casos, el anticuerpo humano puede presentar no mas de 5, o incluso no mas de 4, 3, 2, o 1 diferencias de aminoacidos con respecto a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de la inmunoglobulina de llnea germinal humana.
Anticuerpos homologos
Se describe en el presente documento un anticuerpo que comprende regiones variables de las cadenas pesada y ligera que son homologas de las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento, y en el que los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos dirigidos contra CD22 de la presente divulgacion.
Por ejemplo, se describe en el presente documento un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende una region variable de la cadena pesada y una region variable de la cadena ligera, en el que:
(a) la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 80 % homologa con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:31-34, 61 y 81-83;
(b) la region variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos un 80 % homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:35-40 y 8486;
(c) el anticuerpo se une especlficamente a CD22 humana.
De manera adicional o alternativa, el anticuerpo puede tener una o mas de las siguientes propiedades funcionales:
(a) se une a CD22 humana con una KD de 1x10-7 M o menos; (b) se internaliza en celulas CD22+; (c) presenta actividad ADCC en celulas CD22+; (d) potencia la muerte celular de celulas Ramos inducida mediante, por ejemplo, estimulacion del BCR; y/o (e) inhibe el crecimiento de celulas que expresan CD22 in vivo cuando se conjuga con una citotoxina.
En diversas realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.
En otras realizaciones, las secuencias de aminoacidos de Vh y/o Vl pueden ser un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homologas a las secuencias que se han definido anteriormente. Un anticuerpo que tiene regiones Vh y Vl que tienen elevada homologla (es decir, 80 % o mas) con las regiones Vh y Vl de las secuencias que se han definido anteriormente, se pueden obtener por mutagenesis (por ejemplo, mutagenesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de las moleculas de acido nucleico que codifican las sEq ID nOs:41-44, 62, o 87-89, o las SEQ ID NOs:45-50 o 90-92, seguido por el analisis del anticuerpo codificado alterado para determinar la retencion de la funcion (es decir, las funciones anteriormente definidas) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el porcentaje de homologla entre dos secuencias de aminoacidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias
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es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, (es decir, % homologla = n.° de posiciones identicas/n.° de posiciones totales x 100), teniendo en cuenta el numero de huecos, y la longitud de cada hueco, que deben introducirse para un alineamiento optimo de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determination del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede llevarse a cabo con un algoritmo matematico, como se describe en los ejemplos no limitantes siguientes.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar mediante el uso del algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de ponderacion de residuo PAM 120, una penalization por longitud de hueco de 12, y una penalization de hueco de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar mediante el uso del algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), que se ha incorporado al programa GAP del paquete informatico GCG (disponible en
www.gcg.com), usando bien una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y una ponderacion de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y una ponderacion de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
De manera adicional o alternativa, las secuencias de protelna de la presente invention puede usarse ademas como una "secuencia de interrogation" para realizar una busqueda en bases de datos publicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Dichas busquedas se pueden llevar a cabo usando el programa XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de protelnas por BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, puntuacion = 50, valor de W = 3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de anticuerpo de la presente divulgation. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, son de utilidad los parametros predeterminados de ambos programas (por ejemplo XBLAST y NBLAST). Vease
www.ncbi.nlm.nih.gov.
Anticuerpos con modificaciones conservativas
Se describe ademas un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una region variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en el que una o mas de estas secuencias de CDR comprende secuencias de aminoacidos especlficas basadas en los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento (es decir, 19A3, CD22.1, y CD22.2), o modificaciones conservativas de los mismos, y en el que los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos dirigidos contra CD22 de la presente divulgacion. Se entiende en la tecnica que pueden realizarse determinadas modificaciones conservativas en la secuencia que no eliminan la union al antlgeno. Veanse, por ejemplo, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8 (que describe el analisis de mutaciones en el dominio CDR3 de la cadena pesada de anticuerpos especlficos de Salmonella); de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41 (que describe estudios de mutaciones en anticuerpos dirigidos contra UAI); Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870 (que muestran que las mutaciones en la parte central de HCDR3 eliminan la afinidad o bien la disminuyen); Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12 (que describe que un unico cambio de aminoacidos en la region CDR3 elimina la actividad de union); Kelley y O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35 (que describe la contribution de restos Tyr en la union al antlgeno); Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 (que describe el efecto de la hidrofobicidad en la union) y Beers et al (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43 (que describe aminoacidos mutantes en HCDR3).
Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal aislado descrito, o portion de union a antlgeno del mismo, comprende una region variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una region variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en el que:
(a) la secuencia de la region variable CDR3 de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos
seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 9-12, 69-71 y
modificaciones conservativas de la misma;
(b) la secuencia de la region variable CDR3 de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos
seleccionada entre el grupo que consiste en la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 25-30, 79-80, y
modificaciones conservativas de la misma; y
(c) el anticuerpo se une especlficamente a CD22 humana.
De manera adicional o alternativa, el anticuerpo puede tener una o mas de las siguientes propiedades funcionales: (a) se une a CD22 humana con una KD de 1x10-7 M o menos; (b) se internaliza en celulas CD22+; (c) presenta actividad ADCC en celulas CD22+; y/o (d) potencia la muerte celular de celulas Ramos inducida mediante estimulacion del BCR; y/o (e) inhibe el crecimiento de celulas que expresan CD22 in vivo cuando se conjuga con una citotoxina.
En una realization preferida, la secuencia de la region variable CDR2 de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NOs:5-8, 60, 66-68, y modificaciones conservativas de la misma; y la secuencia de la region variable CDR2 de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias
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de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 19-24, 75-77, y modificaciones conservativas de la misma. En otra realizacion preferida, la secuencia de la region variable CDR1 de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NOs:1-4, 63-65, y modificaciones conservativas de la misma; y la secuencia de la region variable CDR1 de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 13-18, 72-74, y modificaciones conservativas de la misma.
En diversas realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quimericos.
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que la expresion " modificaciones conservativas de la secuencia" se refiere a modificaciones de aminoacidos que no afectan o alteran significativamente las caracterlsticas de union del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoacidos. Dichas modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoacidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de presente invencion mediante tecnicas normalizadas conocidas en la materia, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoacidos conservativas son aquellas en las que el resto de aminoacido se sustituye por un resto de aminoacido que tiene una cadena secundaria similar. Las familias de restos de aminoacidos que tienen cadenas secundarias similares se han definido en la tecnica. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas secundarias basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas secundarias acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas secundarias polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistelna, triptofano), cadenas secundarias no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas secundarias beta- ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas secundarias aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por lo tanto, uno o mas restos de aminoacidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la presente divulgacion se pueden sustituir con otros restos de aminoacido de la misma familia de cadenas secundarias y el anticuerpo alterado se puede analizar para comprobar que se ha retenido la funcion (es decir, las funciones anteriormente definidas) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
Anticuerpos que se unen al mismo epitopo que los anticuerpos dirigidos contra CD22
La presente divulgacion tambien proporciona anticuerpos que se unen al mismo eplteto de la CD22 humana que reconoce cualesquiera de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD22 de la presente divulgacion (es decir, anticuerpos que tienen la capacidad de competir de forma cruzada para la union con CD22 con cualesquier otros anticuerpos monoclonales de la presente divulgacion). Preferentemente, el anticuerpo de referencia para los estudios de competition cruzada pueden ser el anticuerpo monoclonal 19A3 o el anticuerpo monoclonal CD22.1 o el anticuerpo monoclonal CD22.2 (que tiene las secuencias Vh y Vl que se muestran en las SEQ ID NOs:32/61 y 36, respectivamente).
Dichos anticuerpos que compiten de forma cruzada se pueden identificar basandose en su capacidad para competir de forma cruzada con 19A3, CD22.1 y CD22.2 en un ensayo de union a CD22 convencional. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo ELISA normalizado en el que CD22 recombinante se inmoviliza sobre la placa, uno de los anticuerpos se marcar de forma fluorescente, y se evalua la capacidad de los anticuerpos no marcados para desplazar por competicion el anticuerpo marcado. De manera adicional o alternativa, se pueden utilizar el analisis BIAcore para evaluar la capacidad de los anticuerpos para competir de forma cruzada, como se describe en el Ejemplo 3, (con respecto al agrupamiento del epitopo de 19A3, CD22.1 y CD22.2). La capacidad de un anticuerpo de ensayo para inhibir la union de, por ejemplo, 19A3, CD22.1 y CD22.2 a la CD22 humana demuestra que el anticuerpo de ensayo puede competir con 19A3, CD22.1 y CD22.2 por la union a CD22 humana y, por tanto, se une al mismo epitopo de la CD22 humana que el que reconocen 19A3, CD22.1 y CD22.2. Tal como se describe en detalle en el Ejemplo 3, los anticuerpos 19A3, CD22.1 y CD22.2, se unen, cada uno de ellos, a un epitopo diferente de CD22 y por tanto pertenecen a grupos de epitopo diferentes. El anticuerpo que se une al mismo epitopo en 19A3, CD22.1 y CD22.2 es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en los Ejemplos.
Anticuerpos genomanipulados y modificados
Un anticuerpo de la presente divulgacion se puede preparar ademas usando un anticuerpo que tenga una o mas de las secuencias de Vh y/o Vl divulgadas en el presente documento como material de partida para genomanipular un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas con respecto al anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede genomanipular modificando uno o mas restos en una o ambas regiones variables (es decir, Vh y/o Vl), por ejemplo, en una o mas regiones CDR y/o en una o mas regiones marco. De manera adicional o alternativa, un anticuerpo se puede genomanipular modificando los restos de la(s) region(es) constante(s), por ejemplo, para alterar la(s) funcion(es) efectora(s) del anticuerpo.
En determinadas realizaciones, el injerto de la CDR se puede usar para genomanipular regiones variables de anticuerpos. Los anticuerpos interactuan con antigenos diana predominantemente a traves de restos de aminoacidos que se localizan en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y la
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cadena ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoacidos de las CDR son mas diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias CDR son responsables de la mayoria de las interacciones anticuerpo-antigeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos de origen natural construyendo vectores de expresion que incluyen secuencias CDR del anticuerpo especifico de origen natural injertadas en las secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (veanse,por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525: Queen, C. et al. (1989)Proc. Natl: Acad. See. U.S.A. M: 10029-10033; la patente de Estados Unidos n.° 5.225.539 de Winter, y las patentes de Estados Unidos con numeros 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.)
Por lo tanto, dichos anticuerpos contienen las secuencias CDR de Vh y Vl de los anticuerpos monoclonales 19A3, CD22.1 y CD22.2, aunque pueden contener secuencias marco diferentes a las de dichos anticuerpos.
Dichas secuencias marco pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN publicas o referencias publicadas que incluyen las secuencias genicas de anticuerpos de la linea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la linea germinal para los genes de la region variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la linea germinal humana "VBase" (disponible en Internet en
www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), asi como en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion de NIH N.° 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline Vft Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germline Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836. Como ejemplo adicional, se pueden encontrar las secuencias de ADN de la linea germinal de los genes de la region variable de la cadena pesada y ligera en la base de datos Genbank. Por ejemplo, las siguientes secuencias de la linea germinal de la cadena pesada que se encuentran en el raton HCo7 HuMAb estan disponibles con los numeros de registro del Genbank adjuntos: 1-69 (NG 0010109, NT 024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 y NT 024637). Como ejemplo adicional, las siguientes secuencias de la linea germinal de la cadena pesada que se encuentran en el raton HCo12 HuMAb estan disponibles con los numeros de registro del Genbank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT 024637 y BC070333), 5-51 (NG0010109 y NT 024637), 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) y 3-23 (AJ406678).
Las secuencias proteicas del anticuerpo se comparan con una base de datos compilada de secuencias de proteina usando uno de los metodos de busqueda de similitud de secuencia denominado Gapped BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), que es bien conocido de los expertos en la materia. BLAST es un algoritmo heuristico en el que un alineamiento estadisticamente significativo entre la secuencia del anticuerpo y la secuencia de la base de datos probablemente contiene pares de segmentos de alta puntuacion (HSP) de palabras alineadas. Los pares de segmentos cuyas puntuaciones no se pueden mejorar por extension o recorte se denominan un hallazgo. Brevemente, las secuencias de nucleotidos con origen en VBASE (
http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php) se traducen, y la region comprendida y que incluye la region marco de la FR1 a la FR3 se retiene. Las secuencias de la base de datos tienen una longitud promedio de 98 restos. Las secuencias duplicadas que sean emparejamientos exactos para la totalidad de la longitud de la proteina se eliminan. Una busqueda BLAST de proteinas mediante el programa blastp con los parametros convencionales preconfigurados, salvo el filtro de baja complejidad, que se desactiva, y la matriz de sustitucion de BLOSUM62, filtra los 5 hallazgos principales, proporcionando emparejamientos de secuencia. Las secuencias de nucleotidos se traducen para los seis marcos y el marco que no tiene codones de terminacion en el segmento emparejado de la secuencia de la base de datos se considera el hallazgo potencial. A su vez, esto se confirma usando el programa de BLAST tblastx, que traduce la secuencia del anticuerpo para los seis marcos y compara dichas traducciones con las secuencias de nucleotidos de VBASE traducidas de forma dinamica para los seis marcos.
Las identidades son correspondencias de aminoacidos exactas entre la secuencia del anticuerpo y la base de datos de proteinas para la longitud completa de la secuencia. Los positivos (identidades + emparejamiento con sustitucion) no son identicos, sino que tiene sustituciones de aminoacidos guiadas mediante la matriz de sustitucion BLOSUM62. Si la secuencia del anticuerpo se corresponde con dos de las secuencias de la base de datos con la misma identidad, el hallazgo con mas positivos se considerara el hallazgo de la secuencia correspondiente.
Las secuencias marco preferidas para su uso con los anticuerpos de la presente divulgacion son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco usadas por los anticuerpos seleccionados de la presente divulgacion, por ejemplo, similar a la secuencia marco de Vh 4-34 (SEQ ID NO:52) y/o la secuencia marco de Vk L6 (SEQ ID NO:56) usada por los anticuerpos monoclonales preferidos de la presente divulgacion. Las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 de VH y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDr3 de Vk, se pueden injertar en regiones marco que tienen una secuencia identica a la encontrada para el gen de inmunoglobulina de la linea germinal de la que deriva la secuencia marco, o las secuencias de las CDR se pueden injertar en regiones marco que contienen una o mas mutaciones en comparacion con las secuencias de la linea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que, en determinados casos, es beneficioso mutar restos dentro de las regiones marco para conservar o potenciar la capacidad de union al antigeno del anticuerpo (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos numeros 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).
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Otro tipo de modification de la region variable es la mutation de restos de aminoacidos en las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de Vh y/o Vl para mejorar de este modo una o mas propiedades de union (por ejemplo, la afinidad) del anticuerpo de interes. La mutagenesis dirigida a sitio o la mutagenesis mediada por PCR se pueden realizar para introducir la(s) mutacion(es), y el efecto sobre la union del anticuerpo, u otra propiedad de interes, se puede evaluar en ensayos in vitro o in vivo como se describe en el presente documento y se proporciona en los Ejemplos. Se introducen modificaciones preferentemente conservativas (como se ha descrito anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos, pero preferentemente son sustituciones. Ademas, normalmente, no se alteran mas de uno, dos, tres, cuatro o cinco restos en una region CDR.
Por consiguiente, se describen anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD22 aislados, o porciones de union a antlgeno de los mismos, que comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende: (a) una region variable CDR1 de Vh que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-4 o 63-65, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs: 1-4 o 63-65; (b) una region variable CDR2 de Vh que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:5-8, 60 o 66-68, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs:5-8, 60 o 66-68; (c) una region variable CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID Nos:9-12 o 69-71, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs:9-12 o 69-71; (d) una region variable CDR1 de Vl que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID Nos:13-18 o 7274, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs: 13-18 o 72-74; (e) una region variable CDR2 de Vl que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 19-24 o 75-77, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs: 19-24 o 75-77; y (f) una region variable CDR3 de Vl que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID Nos:25-30 o 78-80, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs:25-30 o 78-80.
Los anticuerpos genomanipulados de la invention incluyen aquellos en los que se han hecho modificaciones en los restos de la region marco de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, dichas modificaciones de la region marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "retromutar" uno o mas restos de la region marco a la correspondiente secuencia de la llnea germinal. Mas especlficamente, un anticuerpo que se ha sometido a una mutation somatica puede contener restos de la region marco que difieren de la secuencia de la llnea germinal de la que deriva el anticuerpo. Tales restos se pueden identificar mediante la comparacion de las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la llnea germinal de la que proviene el anticuerpo.
Por ejemplo, para la region 12C5 de Va, las posiciones de aminoacidos 40 y 68 de la region marco (usando el sistema de numeration de Kabat) difieren de la llnea germinal. Una o ambas de estas posiciones se pueden retromutar a las secuencias de la llnea germinal haciendo una o ambas de las siguientes sustituciones: L40Q y R68K.
Ademas, para las regiones 19A3 y CD22.1 de Vh, la position de aminoacido 27 de la region marco (usando el sistema de numeration de Kabat) difiere de la llnea germinal. Esta position se puede retromutar a la secuencia de la llnea germinal haciendo la siguiente sustitucion: R27G,
Ademas, para la region CD22.2 de VH, las posiciones de aminoacidos 27 y 57 de la region marco (usando el sistema de numeration de Kabat) difieren de la llnea germinal. Esta position se puede retromutar a la secuencia de la llnea germinal haciendo las siguientes sustituciones: R27G y Q57N.
Ademas, para la region 16F7 de Vh, la position de aminoacido 28 de la region marco (usando el sistema de numeration de Kabat) difiere de la llnea germinal. Esta position se puede retromutar a la secuencia de la llnea germinal haciendo la siguiente sustitucion: N28S.
Ademas, para la region 16F7 de VK.2, la position de aminoacido 85 de la region marco (usando el sistema de numeration de Kabat) difiere de la llnea germinal. Esta position se puede retromutar a la secuencia de la llnea germinal haciendo la siguiente sustitucion: A85T.
Ademas, para la region 23C6 de Vh, las posiciones de aminoacidos 14, 79 y 88 de la region marco (usando el sistema de numeration de Kabat) difieren de la llnea germinal. Una, dos o las tres posiciones se pueden retromutar a las secuencias de la llnea germinal realizando una, dos o las tres de las siguientes sustituciones: T14P, V79A y A88S.
Ademas, para la region 4G6 de Vh, las posiciones de aminoacidos P, D, F, D, T, Y, y F de la region marco (usando el
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sistema de numeracion de Kabat) difieren de la ilnea germinal. Esta posicion se puede retromutar a la secuencia de la ilnea germinal haciendo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o las siete de las siguientes sustituciones: P?A; D?G; N?S;. F?Y; D?E; T?S; Y?R; F?S.
Ademas, para la region 4G6 de Vk1, las posiciones T y D de la region marco (usando el sistema de numeracion de Kabat) difieren de la llnea germinal. Estas posiciones se pueden retromutar a la secuencia de la llnea germinal haciendo una o dos de las siguientes sustitucion: T?K y D?E.
Ademas, para la region 21F6 de Vh1, las posiciones de aminoacidos S e I de la region marco (usando el sistema de numeracion de Kabat) difieren de la llnea germinal. Estas posiciones se puede retromutar a la secuencia de la llnea germinal haciendo la siguiente sustitucion: S?P e I?V.
Ademas, para la region 21F6 de Vh2, las posiciones S y M de la region marco (usando el sistema de numeracion de Kabat) difieren de la llnea germinal. Estas posiciones se puede retromutar a la secuencia de la llnea germinal haciendo la siguiente sustitucion: S?P y M?V.
Otro tipo de modificacion en la region marco implica mutar uno o mas restos en la region marco o incluso en una o mas regiones CDR, para eliminar epltopos de linfocitos T para reducir de este modo la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Esta estrategia tambien se denomina "desinmunizacion" y se describe con mas detalle en la publicacion de patente de Estados Unidos N.° 2003/0153043 de Carr et al.
De forma adicional o alternativa a las modificaciones realizadas en la region marco o en las regiones CDR, los anticuerpos de la presente divulgacion se pueden genomanipular para incluir modificaciones en la region Fc, normalmente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijacion del complemento, la union al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antlgeno. Ademas, un anticuerpo de la presente divulgacion se puede modificar qulmicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o mas restos qulmicos al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilacion, de nuevo para alterar una o mas propiedades del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con mas detalle a continuacion. La numeracion de los restos de la region Fc es la del Indice de la UE de Kabat.
En una realizacion, la region bisagra de CH1 se modifica de manera que se altera el numero de restos cistelna en la region bisagra, por ejemplo, se aumenta o se disminuye. Esta estrategia se describe con mas detalle en la patente de Estados Unidos N.° 5.677.425 de Bodmer et al. El numero de restos cistelna en la region bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realizacion, la region bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biologica del anticuerpo. Mas especlficamente, se introducen una o mas mutaciones de aminoacidos en la region de la interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento bisagra-Fc de manera que el anticuerpo tiene una union a la protelna A estafilococica (SpA) deteriorada comparada con la union a SpA de Fc-bisagra natural. Esta aproximacion se describe en mayor detalle en la patente de Estados Unidos N.° 6.165.745 de Ward y col.
En otra realizacion, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biologica. Son posibles diversas estrategias. Por ejemplo, se pueden introducir una o mas de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 6.277.375 de Ward. Como alternativa, para aumentar la semivida biologica, el anticuerpo se puede alterar en la region CH1 o CL para que contenga un epitope de union al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una region Fc de una IgG, tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al.
En otras realizaciones mas, la region Fc se altera sustituyendo al menos un resto de aminoacido por un resto de aminoacido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados de entre los restos de aminoacidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 se pueden sustituir por un resto de aminoacido diferente de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero mantenga la capacidad de union a antigeno del anticuerpo precursor. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Esta estrategia se describe en detalle en las patentes de Estados Unidos con numeros 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.
En otro ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados de los restos de aminoacidos 329, 331 y 322 se pueden sustituir por un resto de aminoacido diferente de manera que el anticuerpo tenga una union a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o eliminada. Esta estrategia se describe en detalle en la patente de Estados Unidos n.° 6.194.551 de Idusogie et al.
En otro ejemplo, uno o mas restos de aminoacidos en las posiciones de aminoacidos 231 y 239 se alteran para modificar de esta forma la capacidad del anticuerpo de fijarse al complemento. Esta estrategia se describe en detalle en la publicacion PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.
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En otro ejemplo mas, la region Fc esta modificada para aumentar la capacidad del anticuerpo de mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy

modificando uno o mas aminoacidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265,

267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307,

309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388,
389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Esta estrategia se describe adicionalmente en la publicacion PCT WO 00/42072 de Presta. Ademas, los sitios de union sobre la IgG1 humana para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han cartografiado y se han descrito variantes con union mejorada (vease Shields, R.L. et al (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Se ha demostrado que mutaciones especlficas en posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la union a FcyRIII. Adicionalmente, se ha mostrado que los siguientes mutantes combinados mejoran la union a FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.
En otra realizacion adicional, se modifica la glicosilacion de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilacion). La glicosilacion puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antlgeno. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, la alteracion de uno o mas sitios de glicosilacion en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden generar una o mas sustituciones de aminoacidos que dan como resultado la eliminacion de uno o mas sitios de glicosilacion en la region marco variable para eliminar de este modo la glicosilacion en ese sitio. Dicha aglicosilacion puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antlgeno. Dicho enfoque se describe con mas detalle en las patentes de Estados Unidos numeros 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al. Enfoques adicionales para alterar la glicosilacion se describen con mayor detalle en la patente de Estados Unidos 7.214.775 de Hanai et al, la patente de Estados Unidos n.° 6.737.056 de Presta, la pub. estadounidense n.° 20070020260 de Presta, la Publicacion PCT n.° WO/2007/084926 de Dickey et al., la Publicacion PCT n.° WO/2006/089294 de Zhu et al., y la Publicacion PCT n.° WO/2007/055916 de Ravetch et al.
En una realizacion ilustrativa, un sitio de glicosilacion en la region CDR2 de la cadena VH del anticuerpo 19A3 se elimino mediante la introduccion de una mutacion N57Q (vease el Ejemplo 1), para proporcionar el anticuerpo recombinante CD22.2 que tiene la secuencia de aminoacidos de Vh que se muestra en la SEQ ID NO:61.
De manera adicional o alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tiene un tipo de glicosilacion alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de restos fucosilo o un anticuerpo que tiene que tiene estructuras GlcNAc bisectadas en mas cantidad. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilacion alterada aumentan la capacidad ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de hidratos de carbono se pueden lograr mediante, por ejemplo, la expresion del anticuerpo en una celula hospedadora con maquinaria de glicosilacion alterada. Las celulas con la maquinaria de glicosilacion alterada se han descrito en la materia y se pueden usar como celulas hospedadoras en las que expresar anticuerpos recombinantes de la presente divulgacion para producir de este modo un anticuerpo con glicosilacion alterada. Por ejemplo, las llneas de celulas Ms704, Ms705, y Ms709 carecen del gen de la fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), de tal manera que los anticuerpos expresados en las llneas de celulas Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus hidratos de carbono. Las llneas de celulas Ms704, Ms705, y Ms709 FUT8-/- se crearon mediante perturbacion dirigida del gen FUT8 en celulas CHO/DG44 usando dos vectores de sustitucion (veanse la publicacion de patente de Estados Unidos n.° 20040110704) de Yamane et al y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como ejemplo adicional, el documento EP 1.176.195 de Hanai et al describe una llnea de celulas con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosiltransferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en dicha llnea de celulas presentan hipofucosilacion al reducir o eliminar la enzima relacionada con el enlace alfa-1,6. Hanai et al describen tambien llneas de celulas que tienen una baja actividad enzimatica para anadir fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la region Fc del anticuerpo o que no tiene actividad enzimatica, por ejemplo, la llnea de celulas YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662). La publicacion PCT WO 03/035835 de Presta describe una variante de la llnea de celulas CHO, las celulas Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a los hidratos de carbono unidos a Asn(297), que tambien da como resultado una hipofucosilacion de anticuerpos expresados en dicha celula hospedadora (vease tambien Shields, R.L. et al (2002) J, Biol Chem. 277:26733-26740). Pueden producirse tambien anticuerpos con un perfil de glicosilacion modificado en huevos de pollo, tal como se describe en la publicacion de patente WO n.° WO 2006/089231. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos con un perfil de glicosilacion modificado en celulas vegetales, tales como Lemna. La publicacion PCT WO 99/54342 de Umana et al describe llneas de celulas genomanipuladas para expresar glicosiltransferasas modificadoras de glucoprotelnas (por ejemplo la beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera que tales anticuerpos expresados en las llneas de celulas genomanipuladas presentan mas estructuras GlcNac bisectadas, lo que da como resultado una actividad ADCC aumentada de los anticuerpos (vease tambien Umana et al, 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180). Como alternativa, los restos fucosa del anticuerpo pueden escindirse utilizando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa elimina restos fucosilo de los anticuerpos (Tarentino, A.L. et al (1975) Biochem. 14:5516-23).
De manera adicional o alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tiene un tipo de glicosilacion alterado, en el que dicha alteracion esta relacionada con el nivel de sialilacion del anticuerpo. Dichas alteraciones se describen en la Publicacion PCT n.° WO/2007/084926 de Dickey et al, y en la Publicacion PCT n.° WO/2007/055916 de Ravetch et al. Por ejemplo, se puede emplear una reaccion enzimatica con sialidasa, tales como, por ejemplo, sialidasa de
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Arthrobacter ureafacens. Las condiciones de dicha reaccion se describen de una forma general en la patente de Estados Unidos n.° 5.831.077. Otros ejemplos no limitantes de enzimas adecuadas son la neuraminidasa y la N- Glicosidasa F, como se describe en Schloemer et al., J. Virology, 15(4), 882-893 (1975) y en Leibiger et al., Biochem J., 338, 529-538 (1999), respectivamente. Los anticuerpos desialados se pueden purificar adicionalmente mediante cromatografla de afinidad. Como alternativa, se pueden emplear metodos para aumentar el nivel de sialilacion, tal como mediante el uso de enzimas sialiltransferasas. Las condiciones de dicha reaccion se describen de una forma general en Basset et al., Scandinavian Journal of Immunology, 51(3), 307-311 (2000).
Otra modificacion de los anticuerpos del presente documento que se contempla en la presente divulgacion es la pegilacion. Se puede pegilar un anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la semivida biologica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar normalmente con polietilenglicol (PEG), tal como un ester reactivo o un derivado de aldehldo de PEG, en condiciones en las que uno o mas grupos PEG quedan unidos al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilacion se lleva a cabo mediante una reaccion de acilacion o una reaccion de alquilacion con una molecula de PEG reactiva (o un pollmero soluble en agua reactivo analogo). Tal como se usa en el presente documento, el termino "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras protelnas, tales como monoalcoxi (C1-C10) o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Los metodos para pegilar protelnas son conocidos en la materia y se pueden aplicar a los anticuerpos de la presente divulgacion. Vease, por ejemplo, el documento EP 0 154 316 de Nishimura et al y el documento EP 0 401 384 de Ishikawa et al.
Fragmentos de anticuerpo y mimeticos de anticuerpo
La presente invencion no se limita a anticuerpos tradicionales y se puede llevar a la practica mediante el uso de fragmentos de anticuerpo. Como se detalla a continuacion, actualmente se ha desarrollado una amplia variedad de tecnologlas de fragmentos de anticuerpos y mimeticos de anticuerpo y son ampliamente conocidas en la materia. Aunque numerosas de estas tecnologlas, tales como anticuerpos de dominio, nanocuerpos, y unicuerpos, utilizan fragmentos, u otras modificaciones de, estructuras de anticuerpos tradicionales, tambien existen tecnologlas alternativas, tales como aficuerpos, DARPins, anticalinas, avlmeros, y versacuerpos que utilizan estructuras de union que, aunque imitan la union de los anticuerpos tradicionales, se generan a partir de, y funcionan, por mecanismos diferentes.
Los anticuerpos de dominio (dAb) son las unidades de union funcionales mas pequenas de anticuerpos, que se corresponden con las regiones variables de cualquiera de las cadenas pesadas (VH) o ligeras (VL) de los anticuerpos humanos. Los anticuerpos de dominio tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Domantis ha desarrollado una serie de bibliotecas grandes y muy funcionales de dAb de Vh y VL humanos (mas de diez mil millones de secuencias diferentes en cada biblioteca) y usa estas bibliotecas para seleccionar los dAb que son especlficos para dianas terapeuticas. Al contrario de muchos anticuerpos convencionales, los anticuerpos de dominio se expresan bien en sistemas bacterianos, de levaduras y de celulas de mamlfero. Los detalles adicionales de los anticuerpos de dominio y los metodos de produccion de los mismos se pueden obtener como referencia en las patentes de Estados Unidos 6.291.158; 6.582.915; 6.593.081; 6.172.197; 6.696.245; el documento de Estados Unidos con N.° de serie 2004/0110941; la solicitud de patente europea n.° 1433846 y las patentes europeas 0368684 y 0616640; los documentos WO05/035572, W004/101790, W004/081026, WO04/058821, W004/003019 y W003/002609.
Los nanocuerpos son protelnas terapeuticas derivadas de anticuerpos que contienen las propiedades estructurales y funcionales unicas de los anticuerpos de cadena pesada de origen natural. Estos anticuerpos de cadena pesada contienen un unico dominio variable (VHH) y dos dominios constantes (CH2 y CH3). Es importante destacar que, el dominio VHH clonado y aislado es un polipeptido perfectamente estable que alberga la capacidad completa de union a antlgeno del anticuerpo de cadena pesada original. Los nanocuerpos tienen una alta homologla con los dominios VH de los anticuerpos humanos y se pueden humanizar de manera adicional sin ninguna perdida de actividad. Es importante destacar que, los nanocuerpos tienen bajo potencial inmunogenico, lo que se ha confirmado en estudios realizados en primates con compuestos que llevan nanocuerpos.
Los nanocuerpos combinan las ventajas de los anticuerpos convencionales con caracterlsticas importantes de los farmacos de molecula pequena. Al igual que los anticuerpos convencionales, los nanocuerpos presentan una alta especificidad con la diana, una alta afinidad por su diana y una baja toxicidad inherente. Sin embargo, al igual que los farmacos de molecula pequena, pueden inhibir enzimas y acceder facilmente a las hendiduras del receptor. Ademas, los nanocuerpos son extremadamente estables, se pueden administrar por medios diferentes a una inyeccion (vease, por ejemplo, el documento WO 04/041867) y son faciles de fabricar. Otras ventajas de los nanocuerpos incluyen el reconocimiento de epltopos no comunes o escondidos como resultado de su pequeno tamano, la union a cavidades o sitios activos de dianas proteicas con alta afinidad y selectividad debido a su flexibilidad tridimensional unica de formato de farmaco, el ajuste de la vida media y la facilidad y velocidad de descubrimiento de farmacos.
Los nanocuerpos se codifican por genes unicos y se producen de manera eficaz en casi todos los hospedadores
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procariotas y eucariotas, por ejemplo, E. coli (vease, por ejemplo, el documento 6.765.087), mohos (por ejemplo, Aspergillus o Trichoderma) y levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula o Pichia) (vease, por ejemplo, el documento U.S. 6.838.254). El proceso de produccion es escalable y se han producido nanocuerpos en cantidades de varios kilogramos. Dado que los nanocuerpos presentan una estabilidad superior en comparacion con los anticuerpos convencionales, se pueden formular como una solucion de larga vida util y facil de usar.
El metodo del nanoclon (vease, por ejemplo, el documento WO 06/079372) es un metodo patentado para generar nanocuerpos contra una diana deseada, basado en una seleccion automatizada de linfocitos B de alto rendimiento.
Los unicuerpos son otra tecnologla de fragmentos de anticuerpo, sin embargo, esta se basa en la elimination de la region bisagra de los anticuerpos IgG4. La deletion de la region bisagra da como resultado una molecula que tiene practicamente la mitad del tamano de los anticuerpos IgG4 tradicionales y tiene una region de union univalente en lugar de la region de union bivalente de los anticuerpos IgG4. Tambien es bien sabido que los anticuerpos IgG4 son inertes y, por lo tanto, no interaccionan con el sistema inmunitario, lo que puede ser ventajoso para el tratamiento de enfermedades donde no se desea una respuesta inmunitaria, y esta ventaja se consigue con los unicuerpos. Por ejemplo, los unicuerpos pueden funcionar para inhibir o silenciar, pero no eliminar, las celulas a las que se unen. Adicionalmente, la union de los unicuerpos a celulas cancerosas no estimula su proliferation. Ademas, dado que los unicuerpos tienen aproximadamente la mitad del tamano de los anticuerpos IgG4 tradicionales, pueden presentar una mejor distribucion sobre tumores solidos mas grandes con una eficacia potencialmente ventajosa. Los unicuerpos se eliminan del cuerpo a una tasa similar a la de los anticuerpos IgG4 completos y son capaces de unirse con una afinidad por sus antlgenos similar a la de los anticuerpos completos. Los detalles adicionales de los unicuerpos se pueden obtener con referencia a la solicitud de patente WO2007/059782.
Las moleculas de aficuerpos representan una nueva clase de protelnas de afinidad basada en un dominio de protelna con 58 restos de aminoacidos, derivado de uno de los dominios de union a IgG de la protelna estafilococica A. Este dominio en forma de haz de tres helices se ha usado como estructura principal para la construction de bibliotecas combinatorias de fagemidos, a partir de la cual se pueden seleccionar variantes de aficuerpos que se dirigen a las moleculas deseadas usando tecnologla de expresion en fago (Nord K, Gunncriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55). La sencilla y solida estructura de las moleculas de aficuerpos junto con su bajo peso molecular (6 kDa) las convierte en adecuadas para una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, como reactivos de detection (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211) y para inhibir las interacciones con el receptor (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). Los detalles adicionales de los aficuerpos y los metodos de produccion de los mismos se pueden obtener como referencia en las patentes de Estados Unidos 5.831.012.
Los anticuerpos marcados tambien pueden ser de utilidad en aplicaciones de obtencion de imagenes para determinar la abundancia de las isoformas.
Las DARPin (protelnas disenadas con repeticiones de anquirina) son un ejemplo de la tecnologla de un mimetico de anticuerpo dRp (protelnas disenadas con repeticiones) que se ha desarrollado para aprovechar las capacidades de union de polipeptidos no de anticuerpos. Las protelnas con repeticiones tales como las protelnas con repeticiones ricas en anquirina o leucina, son moleculas de union ubicuas, que aparecen, a diferencia de los anticuerpos, intra y extracelularmente. Su arquitectura modular unica presenta unidades estructurales de repetition (repeticiones), que se apilan entre si para formar dominios de repeticion alargados que presentan superficies de union a la diana variables y modulares. Basandose en esta modularidad, se pueden generar bibliotecas combinatorias de polipeptidos con gran cantidad de especificidades de union. Esta estrategia incluye el diseno de consenso de repeticiones autocompatibles que presentan restos variables en la superficie y su ensamblaje aleatorio en dominios de repeticion.
Las DARPin se pueden producir en sistemas de expresion bacterianos con rendimientos muy altos y se trata de las protelnas mas estables conocidas. Se han seleccionado DARPin muy especlficas de alta afinidad para una amplia gama de protelnas diana, incluidos receptores humanos, proteasas humanas, virus, y protelnas de membrana. Se pueden obtener DARPin con afinidades en el intervalo nanomolar a picomolar de un solo dlgito.
Las DARPin se han utilizado en una amplia gama de aplicaciones, incluidas ELISA, ELISA en sandwich, analisis mediante citometrla de flujo (FACS), inmunohistoqulmica (IHC), aplicaciones en obleas, purification por afinidad o transferencia Western. Tambien se ha demostrado que las DARPin son muy activas en el compartimento intracelular, por ejemplo, como protelnas marcadoras intracelulares fusionadas con la protelna fluorescente verde (GFP). Las DARPin se han utilizado adicionalmente para evitar la entrada vlrica con valores de CI50 en el intervalo pM. Las DARPin no solo son ideales para bloquear las interacciones protelna-protelna, sino tambien para inhibir enzimas. Las proteasas, kinasa y vehlculos se han inhibido con exito, muy frecuentemente en el modo de inhibition
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alosterico. Los enriquecimientos muy rapidos y especlficos sobre el tumor y relaciones muy favorables de tumor a sangre convierten las DARPin en muy adecuadas para el diagnostico in vivo o para enfoques terapeuticos.
Se puede encontrar informacion adicional relativa a las DARPin y otras tecnologlas DRP se pueden encontrar en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2004/0132028 y en la publicacion de solicitud de patente de internacional n.° WO 02/20565.
Las anticalinas son una tecnologla de mimeticos de anticuerpo adicional, sin embargo, en este caso, la especificidad de union se deriva de las lipocalinas, una familia de protelnas de bajo peso molecular que se expresan de forma natural y abundantemente en los tejidos humanos y fluidos corporales. Las lipocalinas han evolucionado para realizar una gama de funciones in vivo asociadas con el transporte y almacenamiento fisiologico de compuestos qulmicamente sensibles o insolubles. Las lipocalinas tienen una estructura intrlnseca solida que comprende un cilindro p muy conservado que soporta cuatro bucles en un extremo de la protelna. Estos bucles forman la entrada a un bolsillo de union y proporcionan diferencias conformacionales en esta parte de la molecula que suponen la variacion en la especificidad de union entre las lipocalinas individuales.
Aunque la estructura global de los bucles hipervariables soportados por una estructura en p-lamina conservada es una reminiscencia de las inmunoglobulinas, las lipocalinas difieren notablemente de los anticuerpos en cuestion de tamano, estando compuestas por una unica cadena polipeptldica de 160-180 aminoacidos que marginalmente es mas grande que un unico dominios de inmunoglobulina.
Las lipocalinas se clonan, y sus bucles estan sometidos a genomanipulacion para crear anticalinas. Se han generado bibliotecas de anticalinas estructuralmente diferentes, y la expresion de anticalinas permite la seleccion y cribado de la funcion de union, seguido de la expresion y produccion de protelnas solubles para su analisis adicional en sistemas procariotas o eucariotas. Los estudios han demostrado con exito que se pueden desarrollar anticalinas que sean especlficas de practicamente cualquier protelna diana humana que se pueda aislar, y se pueden obtener afinidades de union en el intervalo nanomolar o superior.
Las anticalinas tambien se pueden formular como protelnas de diana doble, las denominadas duocalinas. Una duocalina se une a dos dianas terapeuticas diferentes en una protelna monomerica de produccion sencilla usando procesos de fabricacion convencionales que retienen la especificidad y la afinidad por la diana independientemente de la orientacion estructural de sus dos dominios de union.
La modulacion de multiples dianas mediante una sola molecula es especialmente ventajoso en enfermedades conocidas por implicar mas de un unico factor causante. Ademas, los formatos de union bivalente o multivalente tales como las duocalinas tienen un potencial significativo en el direccionamiento de moleculas de la superficie celular en una enfermedad, mediando efectos agonistas sobre las rutas de transduccion de la senal o induciendo efectos de internalizacion mediante la union y agrupacion de los receptores de la superficie celular. Ademas, la elevada estabilidad intrlnseca de las duocalinas es comparable a la de las anticalinas monomericas, ofreciendo una formulacion flexible y potencial de administracion para las duocalinas.
Se puede encontrar informacion adicional relativa a las anticalinas en la patente de Estados Unidos N.° 7.250.297 y en la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 99/16873.
Otra tecnologla de mimeticos de anticuerpo son los avlmeros. Los avlmeros han evolucionado a partir de una importante familia de dominios de receptores extracelulares humanos mediante reordenamiento de axones in vivo y expresion en fago, generando protelnas multidominio con propiedades inhibitorias y union. Se ha demostrado que la union de multiples dominios de union independientes crean avidez y dan como resultado una afinidad y especificidad mejoradas en comparacion con las protelnas de union de un solo epltopo convencionales. Otras ventajas potenciales incluyen la produccion simple y eficaz de moleculas especlficas multidiana en Escherichia coli, una termoestabilidad y resistencia a las proteasas mejorada. Se han obtenido avlmeros con afinidades submoleculares contra una gran variedad de dianas.
Se puede encontrar informacion adicional sobre los avlmeros en las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos con numeros 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301,2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756.
Los versacuerpos son otra tecnologla de mimeticos de anticuerpo que se podrla utilizar. Los versacuerpos son protelnas pequenas de 3-5 kDa con >15 % de cistelnas, que forman una estructura de disulfuro de alta densidad, sustituyendo el nucleo hidrofobo que tienen las protelnas tlpicas. La sustitucion de una gran cantidad de aminoacidos hidrofobos, que comprenden el nucleo hidrofobo, por una pequena cantidad de disulfuros da como resultado una protelna que es mas pequena, mas hidrofila (menos agregacion y union no especlfica), mas resistente a las proteasas y al calor, y tiene una menor densidad de epltopos de linfocitos T, puesto que los restos que mas contribuyen al complejo de presentacion MHC son hidrofobos. Es bien sabido que estas cuatro propiedades afectan la inmunogenicidad, y conjuntamente, se espera que produzcan una importante disminucion en la inmunogenicidad.
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La inspiracion de los versacuerpos procede de las sustancias biofarmaceuticas inyectables de origen natural producidas por sanguijuelas, serpientes, aranas, escorpiones, caracoles y anemonas, que se sabe que presentan una inmunogenicidad inesperadamente baja. A partir de familias de protelnas naturales seleccionadas, mediante el diseno y cribado por tamano, hidrofobicidad, procesamiento proteolltico de antlgenos, y densidad de epltopos, se minimizan hasta niveles bien por debajo del promedio para las protelnas inyectables naturales.
Dada la estructura de los versacuerpos, estos mimeticos de anticuerpo ofrecen un formato versatil que incluye multivalencia, multiespecificidad, diversos mecanismos de semivida, modulos de direccionamiento del tejido, y ausencia de la region Fc del anticuerpo. Ademas, los versacuerpos se fabrican en E. coli con altos rendimientos, y debido a su hidrofilicidad y pequeno tamano, los versacuerpos son muy solubles y se pueden formular en elevadas concentraciones. Los versacuerpos son excepcionalmente estables frente al calor (se pueden hervir) y ofrecen una duracion prolongada.
Se puede encontrar informacion adicional sobre los versacuerpos en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2007/0191272.
La descripcion detallada de las tecnologlas de fragmentos de anticuerpos y de mimeticos de anticuerpo que se ha proporcionado anteriormente no pretende ser una lista exhaustiva de todas las tecnologlas que podrlan utilizarse en el contexto del presente memoria descriptiva. Por ejemplo, y no de forma excluyente, tampoco, se podrla utilizar varias tecnologlas adicionales incluidas tecnologlas alternativas basadas en polipeptidos, tales como las fusiones de regiones determinantes del complemento como se resena en Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), as! como tecnologlas basadas en acidos nucleicos, tales como tecnologlas de aptameros de ARN como las descritas en las patentes de Estados Unidos numeros 5.789.157, 5.864.026, 5.712.375, 5.763.566, 6.013.443, 6.376.474, 6.613.526, 6.114.120, 6.261.774, y 6.387.620.
Propiedades fisicas de los anticuerpos
Los anticuerpos de la presente divulgacion se pueden caracterizar adicionalmente por las diferentes propiedades fisicas de los anticuerpos dirigidos contra CD22. Se pueden usar diferentes ensayos para detectar y/o diferenciar diferentes clases de anticuerpos basandose en estas propiedades fisicas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgacion pueden contener uno o mas sitios de glicosilacion en la region variable de la cadena ligera o bien de la cadena pesada. La presencia de uno o mas sitios de glicosilacion en la region variable puede dar como resultado un aumento en la inmunogenicidad del anticuerpo o una alteracion del pH del anticuerpo debido a la alteration de la union con el antigeno (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA y Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94: Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7: Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Se sabe que la glicosilacion se produce en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. La glicosilacion de la region variable se puede analizar utilizando un ensayo Glycoblot, que escinde el anticuerpo para producir un Fab, y a continuation ensaya la glicosilacion usando un ensayo que mide la oxidation del peryodato y la formation de base de Schiff. Como alternativa, la glicosilacion de la region variable se puede analizar usando cromatografia ligera Dionex (Dionex-LC), que escinde los sacaridos de un Fab en monosacaridos y analiza el contenido de sacaridos individuales. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo dirigido contra CD22 que no contiene glicosilacion de la region variable. Esto se puede conseguir bien seleccionando anticuerpos que no contienen motivos de glicosilacion en la region variable o haciendo mutar restos dentro del motivo de glicosilacion usando tecnicas convencionales bien conocidas en la materia.
En una realization preferida, los anticuerpos de la presente divulgacion no contienen sitios de isomerismo de asparagina. Se puede producir un efecto de desamidacion o acido isoaspartico en secuencias N-G o D-G, respectivamente. Los efectos de desamidacion o acido isoaspartico dan como resultado la creation de acido isoaspartico, que disminuye la estabilidad de un anticuerpo por creacion de una estructura retorcida en el extremo carboxi de una cadena secundaria en lugar de en la cadena principal. La creacion de acido isoaspartico se puede medir mediante un ensayo iso-quant, que utiliza una HPLC en fase invertida para analizar el acido isoaspartico.
Cada anticuerpo tendra un unico punto isoelectrico (pi), aunque generalmente los anticuerpos estaran comprendidos en un intervalo de pH entre 6 y 9,5. El pi de un anticuerpo IgG1 se encuentra normalmente en el intervalo de pH de 7-9,5, y el PI de un anticuerpo IgG4 se encuentra normalmente en el intervalo de pH de 6-8. Los anticuerpos pueden tener un pi no comprendido en dicho intervalo. Aunque los efectos son generalmente desconocidos, hay especulaciones de que los anticuerpos con un pi fuera del intervalo normal pueden tener cierto replegado e inestabilidad en condiciones in vivo. El punto isoelectrico se puede analizar usando un ensayo de centrado isoelectrico capilar, que crea un gradiente de pH y puede utilizar enfoque por laser para aumentar la precision (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo dirigido contra CD22 que contenga un valor de pl que se encuentre comprendido en el intervalo normal. Esto se puede conseguir bien seleccionando anticuerpos con un valor de pi en el intervalo normal, o por mutation de restos con superficie cargada usando tecnicas convencionales bien conocidas en la materia.
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Cada anticuerpo tendra una temperatura de fusion que es indicativa de la estabilidad termica (Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Una estabilidad termica mayor indica mayor estabilidad global del anticuerpo in vivo. El punto de fusion de un anticuerpo se puede medir usando tecnicas tales como calorimetrla de barrido diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1 indica la temperatura de desplegado inicial del anticuerpo. Tm2 indica la temperatura del desplegado completo del anticuerpo. En general, se prefiere que la Tm1 de un anticuerpo de la presente divulgacion sea mayor de 60°C, preferentemente mayor de 65°C, incluso mas preferiblemente mayor de 70°C. De forma alternativa, la estabilidad termica de un anticuerpo se puede medir usando dicrolsmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:3439).
En una realization preferida, se seleccionan los anticuerpos para que no se degraden rapidamente. La fragmentation de un anticuerpo dirigido contra CD22 se puede medir por electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS, como es bien sabido en la tecnica (Alexander AJ y Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
En otra realizacion preferida, los anticuerpos se seleccionan para que tengan efectos de agregacion mlnimos. La agregacion puede conducir a la estimulacion de una respuesta inmunitaria indeseada y/o alterada o a propiedades farmacocineticas desfavorables. En general, son aceptables anticuerpos con una agregacion del 25 % o menos, preferentemente del 20 % o menos, incluso mas preferentemente del 15 % o menos, incluso mas preferentemente del 10 % o menos e incluso mas preferentemente del 5 % o menos. La agregacion se puede medir por diferentes tecnicas bien conocidas en la materia, incluida la columna de exclusion por tamano (SEC), cromatografla llquida de alto rendimiento (HPLC), y dispersion de luz para identificar monomeros, dlmeros, trlmeros o multlmeros.
Metodos para genomanipular anticuerpos
Como se analiza anteriormente, los anticuerpos dirigidos contra CD22 cuyas secuencias de Vh y Vl se divulgan en el presente documento se pueden usar para crear nuevos anticuerpos dirigidos contra cD22 modificando las secuencias de Vh y/o Vl, o una o mas regiones constantes unidas a las mismas. Por lo tanto, en otro aspecto, los rasgos estructurales del anticuerpo dirigido contra CD22 de la presente invention, es decir, 19A3, CD22.1 y CD22.2, se utilizan para crear anticuerpos dirigidos contra CD22 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la presente invencion, tal como la union a cD22 humana. Por ejemplo, una o mas regiones CDR de 19A3, CD22.1 y CD22.2, o mutaciones de las mismas, se pueden combinar de forma recombinante con regiones marco y/u otras CDR para crear anticuerpos dirigidos contra CD22 adicionales genomanipulados de forma recombinante, como se ha analizado anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en el apartado anterior. El material de partida para el metodo de genomanipulacion es una o mas de las secuencias de Vh y/o Vl proporcionadas en el presente documento. Para crear el anticuerpo genomanipulado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresarlo como protelna) un anticuerpo que tenga una o mas de las secuencias Vh y/o Vl proporcionadas en el presente documento, o una o mas regiones cDr de las mismas. Mas bien, la information contenida en una o mas secuencias se utiliza como material de partida para crear una o varias secuencias de "segunda generation" derivadas de la una o varias secuencias originales y, a continuation, la una o varias secuencias de "segunda generacion" se expresa como protelna.
Por consiguiente, en otra realizacion, se describe un metodo para preparar un anticuerpo dirigido contra CD22 que comprende:
(a) proporcionar: (i) una secuencia de la region variable de la cadena pesada de un anticuerpo que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-4 y 63-65; (a) una secuencia CDR2 seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5-8, 60, y 66-68 y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 9-12 y 69-71; y/o (ii) una secuencia de la region variable de la cadena ligera de un anticuerpo que comprende una secuencia a CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 13-18 y 72-74; (a) una secuencia CDR2 seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 19-24 y 75-77; y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 25-30 y 78-80;
(b) alterar al menos un resto de aminoacido dentro de la secuencia de la region variable de la cadena pesada de un anticuerpo y/o la secuencia de la region variable de la cadena ligera de un anticuerpo para crear al menos una secuencia alterada del anticuerpo; y
(c) expresar la secuencia alterada del anticuerpo como una protelna.
Por ejemplo, se pueden utilizar tecnicas de biologla molecular convencionales para preparar y expresar la secuencia alterada del anticuerpo.
Preferentemente, el anticuerpo codificado por la una o mas secuencia alterada del anticuerpo es uno que retiene una, parte o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos dirigido contra CD22 descritos en el presente documento, donde las propiedades funcionales incluyen, aunque no de forma limitativa:
(a) se internalizan en celulas CD22+;
(b) presentan actividad ADCC en celulas CD22+;
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(c) potencian la muerte celular de celulas Ramos inducida mediante estimulacion del BCR (BCR);
(d) no tienen un efecto antiproliferativo directo en celulas Ramos;
(d) no inducen flujo de calcio en celulas Ramos;
(e) no median la actividad CDC en celulas Ramos; y/o
(f) inhibe el crecimiento de celulas que expresan cD22 in vivo cuando se conjugan con una citotoxina
Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar mediante ensayos normalizados disponibles en la materia y/o descritos en el presente documento, tales como los definidas en los Ejemplos.
En determinadas realizaciones de los metodos de anticuerpos genomanipulados de la presente divulgacion, se pueden introducir mutaciones de forma aleatoria o selectiva a lo largo todo o parte de la secuencia que codifica un anticuerpo dirigido contra CD22 y los anticuerpos dirigidos contra CD22 modificados resultantes se pueden cribar para determinar la actividad de union y/u otras propiedades funcionales como se describe en el presente documento. Se han descrito en la tecnica metodos mutacionales. Por ejemplo, la publicacion PCT WO 02/092780 de Short describe metodos para crear y cribar mutaciones de anticuerpos usando mutagenesis por saturacion, ensamblaje de ligadura sintetica, o una combinacion de los mismos. Como alternativa, la publicacion PCT WO 03/074679 de Lazar et al. describe metodos para utilizar metodos de cribado informaticos para optimizar las propiedades fisicoqulmicas de los anticuerpos.
Moleculas de acidos nucleicos que codifican anticuerpos de la presente invencion
Otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a las moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos de la presente invencion. Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas completas, en un lisado de celulas, o en una forma parcialmente purificada o practicamente pura. Un acido nucleico esta "aislado" o "convertido en practicamente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros acidos nucleicos o protelnas celulares, mediante tecnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, formacion de bandas de CsCl, cromatografla en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la materia. Veanse, F. Ausubel, et al, ed. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York. Un acido nucleico de la presente divulgacion puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede contener o no secuencias intronicas. En una realizacion preferida, el acido nucleico es una molecula de ADNc.
Los acidos nucleicos se pueden obtener usando tecnicas convencionales de biologla molecular. Para los anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgenicos que contienen genico de la inmunoglobulina humana como se describe mas detalladamente a continuacion), los ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo fabricados por el hibridoma se pueden obtener mediante amplificacion PCR convencional o tecnicas de clonacion del ADNc. Para los anticuerpos obtenidos a partir de una genoteca de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando tecnicas de expresion en fago), se puede recuperar un acido nucleico que codifica dichos anticuerpos de la genoteca.
Las moleculas de acidos nucleicos preferidas de la presente invencion son las que codifican las secuencias Vh y Vl de los anticuerpos monoclonales 19A3, CD22.1 y CD22.2. Las secuencias de ADN que codifican la Vh de l2C5, 19A3, CD22.1, 16F7, 23C6, CD22.2, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs: 41-44, 62 y 87-89, respectivamente (en la que las cadenas pesadas de 19A3 y CD22.1 son identicas y corresponden a la SEQ ID NO:42; la cadena pesada de CD22.2 corresponde a la SEQ ID NO:62; y las cadenas pesadas de 21F6 corresponden a las SEQ ID NOs:82 y 83). Las secuencias de ADN que codifican la Vl de 12C5, 19A3, CD22.1, CD22.2, 16F7, 23C6, 4G6 y 21F6 se muestran en las SEQ ID NOs: 45-50 y 90-92, respectivamente, en las que las cadenas ligeras kappa de 19A3, CD22.1 y CD22.2 son identicas y corresponden a la SEQ ID NO:46, la cadena ligera kappa de 16F7 corresponde a cualquiera de las SEQ ID NO:47 o 48, la cadena ligera kappa de 23C6 corresponde a cualquiera de las SEQ ID NO:49 o 50, y la cadena ligera kappa de 4G6 corresponde a cualquiera de las SEQ ID NO: 90 o 91).
Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos Vh y Vl, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante tecnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo, para convertir los genes de la region variable en genes de la cadena del anticuerpo de longitud completa, en los genes del fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica Vl o Vh se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra protelna, tal como una region constante de anticuerpo o un enlazador flexible. La expresion "unido operablemente", como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de tal manera que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco.
El ADN aislado que codifica la region Vh puede convertirse en un gen de la cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica VH a otra molecula de ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la region constante de la cadena pesada humana se conocen en la materia (vease por ejemplo, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, publicacion de NIH N.° 913242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificacion PCR
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convencional. La region constante de la cadena pesada puede ser una region constante de IgG1, IgQ1, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero lo mas preferible es una region constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de la cadena pesada de un fragmento Fab, el ADN que codifica Vh puede estar unido operativamente a otra molecula de ADN que codifica solo la region constante CH1 de la cadena pesada.
El ADN aislado que codifica la region Vl puede convertirse en un gen de la cadena ligera de longitud completa (as! como un gen de la cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL a otra molecula de ADN que codifica la region constante de la cadena ligera, CL. Se conocen en la tecnica las secuencias de los genes de la region constante de la cadena ligera humana (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, publication de NIH N.° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplification PCR convencional. En realizaciones preferidas, la region constante de la cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda.
Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican Vh y Vl estan unidos operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4-Ser)3, de tal manera que las secuencias Vh y Vl pueden expresarse como una protelna monocatenaria contigua, con las regiones Vl y Vh unidas por el enlazador flexible (vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426: Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Production de anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden producir mediante diferentes tecnicas, incluida metodologla convencional de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, la tecnica de hibridacion de celulas somaticas convencional de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque se prefieren los procedimientos de hibridacion de celulas somaticas, en principio, se pueden emplear otras tecnicas para producir anticuerpos monoclonales (por ejemplo, la transformation vlrica o mediante oncogenes de linfocitos B.
El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La produccion de hibridomas en el raton es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos de inmunizacion y las tecnicas de aislamiento de los esplenocitos inmunizados para su fusion son conocidos en la tecnica. Los ligandos de fusion (por ejemplo, celulas de mieloma de murino) y los procedimientos de fusion son tambien conocidos.
Se pueden preparar anticuerpos quimericos o humanizados basandose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal no humano preparado como se ha descrito anteriormente. El ADN que codifica las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina se pueden obtener a partir del hibridoma no humano de interes, y genomanipularse para contener secuencias de inmunoglobulina no murinas (por ejemplo, humanas) usando tecnicas convencionales de biologla molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimerico, regiones variables de murino se pueden unir a regiones constantes humanas usando metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.816.567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, se pueden insertar regiones CDR de murino en un marco humano usando metodos conocidos en la tecnica (veanse la patente de Estados Unidos n.° 5.225.539 de Winter, y las patentes de Estados Unidos con numeros 5.530.101; 5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).
En una realization preferida, los anticuerpos dirigidos de la presente invention son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CD22 humana se pueden generar utilizando ratones transgenicos o transcromosomicos que contienen partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de raton. Estos ratones transgenicos y transcromosomicos incluyen ratones denominados en el presente documento HuMAb Mouse® y KM Mouse®, respectivamente, y se denominan conjuntamente en el presente documento "ratones Ig humanos".
El HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) contiene miniloci de la inmunoglobulina humana que codifican secuencias de la cadena pesada (p y y) y la cadena ligera k no reordenadas humanas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de la cadena p y k endogenos (vease por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones presentan una expresion reducida de IgM o l de raton y, en respuesta a la inmunizacion, los transgenes de la cadena pesada y ligera introducidos experimentan cambio de clase y mutation somatica para generar anticuerpos monoclonales humanos IgGK de alta afinidad (Lonberg, N. et al (1994), citado anteriormente; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101: Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparation y uso del HuMAb Mouse®, y las modificaciones genomicas que lleva dicho raton, se describe adicionalmente en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993)EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Veanse ademas, las patentes de Estados Unidos numeros 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay; la patente de Estados
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Unidos n.° 5.545.807 de Turner et al.; las publicaciones PCT con numeros WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la Publication PCT n.° WO 01/14424 de Korman et al.
En otra realization, los anticuerpos humanos de la presente divulgation se pueden sensibilizar usando un raton que tiene secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas tal como un raton que tiene un transgen de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Este raton se denomina en el presente documento como un "KM mouse®", y se describe detalladamente en la publicacion PCT WO 02/43478 de Ishida et al.
Adicionalmente, sistemas de animales transgenicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana estan disponibles en la tecnica y se puede utilizar para sensibilizar los anticuerpos dirigidos contra CD22 de la presente divulgacion. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgenico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.); dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos numeros 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati et al.
Ademas, sistemas de animales transcromosomicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana estan disponibles en la tecnica y se puede utilizar para sensibilizar los anticuerpos dirigidos contra CD22 de la presente divulgacion. Por ejemplo, ratones que tienen tanto un transcromosoma de la cadena pesada humana como un transcromosoma de la cadenas ligera humana, denominados como "ratones TC" son de utilidad; dichos ratones se describe en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Ademas, se han descrito en la tecnica vacas que tienen transcromosomas de la cadena pesada y ligera humana (por ejemplo, Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 y en la solicitud PCT n.° wO 2002/092812) y se puede utilizar para sensibilizar los anticuerpos dirigidos contra CD22 de la presente divulgacion.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgacion tambien se pueden preparar usando metodos de expresion en fago para cribar genotecas de inmunoglobulina humana. Dichos metodos de expresion en fago para aislar anticuerpos humanos estan establecidos en la tecnica. Veanse, por ejemplo: las patentes de Estados Unidos numeros 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al.; las patentes de Estados Unidos con numeros 5.427.908 y 5.580.717.de Dower et al.; las patentes de Estados Unidos con numeros 5.969.108 y 6.172.197.de et al.; y las patentes de Estados Unidos con numeros 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgacion se pueden preparar tambien usando ratones SCID en los que se han reconstituido celulas inmunitarias humanas de tal manera que se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunizacion. Dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con numeros 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et al.
En otra realizacion, los anticuerpos dirigidos contra CD22 se preparan usando una combination de tecnicas de raton con Ig humana y tecnicas de expresion en fago, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6.794.132 de et al. De forma mas especlfica, el metodo implica en primer lugar sensibilizar una respuesta de anticuerpos contra CD22 en un raton con Ig humana (tal como un raton HuMab o un raton KM como se ha descrito anteriormente) por inmunizacion del raton con un antlgeno de CD22, seguido por aislamiento de los acidos nucleicos que codifican cadenas de anticuerpo humano procedentes de celulas linfaticas de raton, e introduction de estos acidos nucleicos en un vector de expresion (por ejemplo, un fago) para proporcionar una biblioteca de paquetes de expresion. Por lo tanto, cada elemento de la biblioteca comprende un acido nucleico que codifica una cadena de anticuerpo humano y cada cadena de anticuerpo se expresa a partir del paquete de expresion.
A continuation, la biblioteca se secuencia con un antlgeno de CD22 para aislar los elementos de la biblioteca que se unen especlficamente a CD22. A continuacion se alslan inserciones de acido nucleico de los elementos de la biblioteca seleccionados, que se secuencian por metodos convencionales para determinar las secuencias variable de la cadena ligera y pesada de los ligandos de CD22 seleccionados. Las regiones variables se pueden convertir en cadenas de anticuerpo de longitud completa mediante tecnicas convencionales de ADN recombinante, tal como la donation de las regiones variables en un vector de expresion que contiene las regiones constante de la cadena pesada y ligera humana de forma que la region Vh esta operativamente unida a la region Ch y la region Vl esta operativamente unida a la region Cl.
Inmunizacion de ratones con Ig humana
Cuando se usan ratones con Ig humana para sensibilizar los anticuerpos humanos de la presente divulgacion, dichos ratones se pueden inmunizar con una preparation purificada o enriquecida del antlgeno CD22 y/o CD22 recombinante, o celulas que expresan CD22, o una protelna de fusion CD22, como se describe en Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y en las publicaciones PCT Wo 98/24884 y WO 01/14424. Preferentemente, el raton tendra 6-16 semanas de edad durante la primera infusion. Por ejemplo, se puede usar una preparacion purificada o recombinante (5-50 pig) del antlgeno CD22 para inmunizar por via intraperitoneal los ratones con Ig humana. De la manera mas preferida, el inmunogeno
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utilizado para sensibilizar los anticuerpos de la presente divulgacion es una combinacion del dominio extracelular de CD22 recombinante humano y celulas CHO genomanipuladas para expresar la CD22 de longitud completa humana sobre la superficie celular (descrito mas detalladamente en el Ejemplo 1).
Los procedimientos detalladas para generar anticuerpo monoclonales completamente humanos contra CD22 se describen en el Ejemplo 1, mas adelante. La experiencia acumulada con varios antlgenos ha demostrado que el raton transgenico responde cuando se inmuniza inicialmente por via intraperitoneal (IP) con antlgeno en adyuvante completo de Freund, seguido por inmunizaciones IP en semanas alternas (hasta un total de 6) con antlgeno en adyuvante incompleto de Freund. Sin embargo, se ha descubierto que tambien son eficaces otros adyuvantes diferentes a los de Freund. Ademas, se ha descubierto que las celulas completas, en ausencia de adyuvante, son fuertemente inmunogenas. La respuesta inmunitaria se puede vigilar durante el protocolo de inmunizacion con muestras de plasma, que se obtiene mediante extraccion de sangre retroorbital. El plasma se puede cribar por ELISA (como se describe mas adelante), y los ratones con tltulos de inmunoglobulina humana contra cD22 suficientes se pueden usar en las fusiones. Se puede proporcionar un refuerzo por via intravenosa a los ratones con el antlgeno 3 dlas antes del sacrificio y extirpacion de los bazos. Se espera que sean necesarias 2-3 fusiones para cada inmunizacion. Para cada antlgeno se suelen inmunizar entre 6 y 24 ratones. Normalmente, se utilizan ambas cepas HCo7 y HCo12. Ademas, ambos transgenes HCo7 y HCo12 se pueden reproducir conjuntamente en un mismo raton que tenga dos transgenes de cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCo12). De manera alternativa o adicional, se pueden usar las cepas KM Mouse® y/o KM-AHAC, como se describe en el Ejemplo 1.
Generacion de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgacion
Para generar hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgacion, se pueden aislar esplenocitos y/o celulas de ganglios linfaticos de ratones inmunizados y fusionarse con una llnea de celulas inmortalizadas adecuadas, tal como una llnea de celula de mieloma de raton. Los hibridomas resultantes pueden cribarse para la produccion de anticuerpos especlficos de antlgenos. Por ejemplo, suspensiones monocelulares de linfocitos esplenicos procedentes de ratones inmunizados se pueden fusionar con un sexto de la cantidad de celulas P3X63-Ag8.653 de mieloma de raton no secretable (ATCC, CRL 1580) con 50 % PEG. Como alternativa, la suspension monocelular de linfocitos esplenicos procedentes de ratones inmunizados se puede fusionar usando un metodo de electrofusion basado en un campo electrico, usando un electroporador de fusion celular CytoPulse de camara grande (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland). Las celulas se sembraron en placas a aproximadamente 2 x 105 en placa de microtitulacion de fondo plano, seguido por una incubacion de dos semanas en medio selectivo que contiene suero de feto Clone al 20 %, medio condicionado "653" al 18 %, 5 % de origen (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato sodico 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma; el HAT se anade 24 horas despues de la fusion). Despues de aproximadamente dos semanas, las celulas se pueden cultivar en medio, donde el HAT se ha sustituido por HT. A continuacion, los pocillos individuales se cribaron mediante ELISA para buscar anticuerpos monoclonales humanos IgM e IgG. Una vez que ha producido un amplio crecimiento del hibridoma, el medio se puede observar por lo general despues de 10-14 dlas. Los hibridomas que secretan anticuerpos se pueden volver a sembrar en placas, cribarse de nuevo, y si sigue siendo positivos para la IgG humana, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse al menos dos veces mediante dilucion limitante. Los subclones estables se pueden cultivar despues in vitro para generar pequenas cantidades de anticuerpos en medio de cultivo de tejido para su caracterizacion.
Para purificar los anticuerpos monoclonales humanos, hibridomas seleccionados se pueden hacer crecer en matraces de centrlfuga a de dos litros para la purificacion del anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografla de afinidad con protelna A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografla llquida de alto rendimiento para garantizar pureza. La solucion tampon se puede intercambiar por PBS, y la concentration se puede determinar por DO28o usando un coeficiente de extincion de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se puede distribuir en allcuotas y almacenarse a -80° C.
Generacion de trasfectomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgacion
Los anticuerpos de la presente divulgacion tambien se puede producir en un trasfectoma de celula hospedadora usando, por ejemplo, una combinacion de tecnicas de ADN recombinante y metodos de transfection genica como es bien conocido en la tecnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo del mismo, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa se pueden obtener por tecnicas convencionales de biologla molecular normalizadas (por ejemplo, amplification por PCR o donation de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interes) y los ADN se pueden introducir en vectores de expresion de tal forma que los genes esten operativamente unidos a secuencias control de la transcription y la traduction. En este contexto, se pretende que el termino "unido operativamente" signifique que un gen de un anticuerpo esta ligado en un vector de tal manera que las secuencias control de la transcripcion y la traduccion comprendidas en el vector sirvan para su funcion prevista de regular la transcripcion y la traduccion del gen del anticuerpo. El vector de expresion y las secuencias de control
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de la expresion se seleccionan para que sean compatibles con la celula hospedadora de expresion empleada.
El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en un vector separado o, mas normalmente, se insertan ambos genes en el mismo vector de expresion. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresion segun metodos convencionales (por ejemplo, ligamiento de sitios de restriccion complementarios en el fragmento genico del anticuerpo y el vector o mediante ligamiento de extremos romos en caso de que no haya sitios de restriccion). Las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden utilizar para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo introduciendo en los mismos los vectores de expresion que ya codifican las regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera del isotipo deseado de tal forma que el segmento Vh esta operativamente unido a uno o varios segmentos Ch del vector y el segmento Vl esta operativamente unido al segmento Cl dentro del vector. De manera adicional o alternativa, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido senal que facilita la secrecion de la cadena del anticuerpo de la celula hospedadora. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de tal manera que el peptido senal se une en marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El peptido senal puede ser un peptido senal de inmunoglobulina o un peptido senal heterologo (es decir, un peptido senal de una protelna no inmunoglobulina).
Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresion recombinante de la presente divulgacion llevan secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes de la cadena del anticuerpo en una celula hospedadora. Se pretende que el termino "secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o la traduccion de los genes de la cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Ca (1990)). Los expertos en la materia apreciaran que el diseno del vector de expresion, incluida la selection de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la election de la celula hospedadora a transformar, el nivel de expresion de protelna deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresion en celulas hospedadoras de mamlfero incluyen elementos vlricos que dirigen altos niveles de expresion de protelna en celulas de mamlfero, tales como los promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardlo principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Como alternativa, se pueden utilizar secuencias reguladoras no vlricas, tales como el promotor de la ubiquitina o el promotor de la globina p. Adicionalmente, elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes procedencias, tales como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias procedentes del promotor temprano de SV40 y la repetition terminal larga del virus de la leucemia de linfocitos Tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinante de la presente divulgacion pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replication del vector en celulas hospedadoras (por ejemplo, orlgenes de replication) y genes marcadores de seleccion. El gen marcador de seleccion facilita la seleccion de celulas hospedadoras en las que se ha introducido el vector (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con numeros 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, el gen marcador de seleccion confiere normalmente resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, a una celula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de seleccion preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en celulas hospedadoras dhfr- con seleccion/amplificacion en metotrexato) y el gen neo (para seleccion en G418).
Para la expresion de las cadenas ligeras y pesadas, el(los) vector(es) de expresion que codifica(n) las cadenas pesada y ligera se transfecta(n) en una celula hospedadora mediante tecnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del termino "transfection" abarquen una gran variedad de tecnicas comunmente usadas para la introduction de ADN exogeno en una celula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporation, precipitation con fosfato de calcio, transfeccion con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teoricamente posible expresar los anticuerpos de la presente divulgacion en celulas hospedadoras tanto procariotas como eucariotas, la expresion de anticuerpos en celulas eucariotas y, con maxima preferencia, en celulas hospedadoras de mamlfero, es lo mas preferido porque dichas celulas eucariotas y en particular las celulas de mamlfero, es mas probable que las celulas procariotas se ensamblen y secreten un anticuerpo plegado e inmunologicamente activo. Se ha notificado la expresion procariota de genes de anticuerpo es ineficaz para la production de elevados rendimientos de anticuerpos activos (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
Las celulas hospedadoras de mamlfero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la presente divulgacion incluyen ovario de hamster chino (celulas CHO) (incluidas las celulas CHO dhfr, descritos en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador de seleccion de DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol 159:601-621), celulas NSO de mieloma, celulas COS y celulas SP2. En particular, para su uso en celulas NSO de mieloma, otro sistema de expresion preferido es el sistema de expresion genica GS divulgado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 (de Bebbington) y EP 338.841 (de Bebbington). Cuando los vectores de expresion recombinantes que codifican genes de anticuerpos se introducen en celulas hospedadoras de mamlferos, se producen los anticuerpos cultivando las celulas hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas hospedadoras o, mas preferentemente, la secrecion del anticuerpo en el medio de cultivo
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en el que se hacen crecer las celulas hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando metodos de purification de protelnas convencionales.
Caracterizacion de la union del anticuerpo al antiaeno
Los anticuerpos de la invention se pueden analizar para determinar su union a CD22 mediante, por ejemplo, ELISA convencional. Brevemente, las placas de microtitulacion se revisten con CD22 purificado y/ recombinante (por ejemplo, ECD CD22 como se describe en el Ejemplo 1) a 0,25 pg/ml en PBS, y a continuation se bloquean con albumina de suero bovino al 5 % en PBS. Las diluciones del anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma procedente de ratones inmunizados con CD22) se anadieron a cada pocillo y se incubaron durante 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavaron con PBS/Tween y a continuacion se incubaron con reactivo secundario (por ejemplo, para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal especlfico de cabra dirigido contra IgG Fc humana) conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Tras el lavado, las placas se revelaron con sustrato pNPP (1 mg/ml), y se analizaron a una DO de 405-650. Preferentemente, los ratones que desarrollaron los tltulos mas altos tltuios se utilizaran en las fusiones.
Un ensayo ELISA, como se ha descrito anteriormente, tambien se puede utilizar para cribar hibridomas que muestran reactividad positiva con el inmunogena CD22. Los hibridomas que se unen con elevada avidez a CD22 se subclonaron y se caracterizaron adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las celulas precursoras (segun ELISA), se puede seleccionar para fabricar un banco de celulas en 5-10 viales almacenados a - 140°C, y para la purificacion del anticuerpo.
Para purificar los anticuerpos dirigidos contra CD22, hibridomas seleccionados se pueden hacer crecer en matraces de centrlfuga a de dos litros para la purificacion del anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografla de afinidad con protelna A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografla llquida de alto rendimiento para garantizar pureza. La solution tampon se puede intercambiar por PBS, y la concentration se puede determinar por DO280 usando un coeficiente de extincion de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden distribuir en allcuotas y almacenarse a -80° C.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD22 se unen a epltopos unicos, cada anticuerpo se puede biotinilar usando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL). Los estudios de competition con anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados se puede llevar a cabo con placas ELISA revestidas de CD22 como se ha descrito anteriormente. La union de los mAb biotinilados se puede detectar con una sonda estreptavidina-fosfatasa alcalina.
Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, se pueden llevar a cabo ELISA de isotipo usando reactivos especlficos para los anticuerpos de un isotipo en particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, los pocillos de las placas de microtitulacion se pueden revestir con 1 pg/ml de anticuerpo dirigido contra inmunoglobulina humana durante la noche a 4°C. Tras bloquear con BSA al 1 %, las placas se hicieron reaccionar con 1 pg /ml o menos de anticuerpos monoclonales de ensayo o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante una o dos horas. A continuacion, los pocillos se pueden hacer reaccionar con IgG1 humana o bien sondas especlficas de IgM humana conjugadas con fosfatasa alcalina. Las placas se revelaron y se analizaron como se ha descrito anteriormente.
Las IgG contra CD22 humana se pueden analizar adicionalmente para determinar su reactividad con el antlgeno CD22 mediante transferencia Western. Brevemente, CD22 se puede preparar y someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio. Tras la electroforesis, los antlgenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquearon con suero de feto de ternera al 10 %, y se sondearon con el anticuerpo monoclonal a analizar. La IgG humana unida se puede detectar usando anticuerpo dirigido contra IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina y revelarse con comprimidos de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
La especificidad de union de un anticuerpo de la presente divulgation tambien se puede determinar mediante la supervision de la union del anticuerpo a celulas que expresan CD22, por ejemplo, mediante citometrla de flujo. Una llnea de celulas que expresa naturalmente CD22, tal como una celula Daudi o una celula Raji, es de utilidad, o una llnea de celulas, tal como una llnea de celulas CHO, se puede transfectar con un vector de expresion que codifica una forma transmembrana de CD22. La protelna transfectada puede comprender una etiqueta, tal como una etiqueta myg, preferentemente en el extremo N, para la detection mediante un anticuerpo dirigido a la etiqueta. La union de un anticuerpo de la presente divulgation a CD22 se puede determinar mediante la incubation de las celulas transfectadas con el anticuerpo, y detectar el anticuerpo unido. La union de un anticuerpo a la etiqueta en la protelna transfectada se puede usar como control positivo.
Moleculas biespecificas
En otro aspecto, se describen moleculas biespecificas que comprenden un anticuerpo dirigido contra CD22, o un
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fragmento del mismo, de la presente divulgacion. Un anticuerpo de la presente divulgacion, o porciones de union a antlgeno del mismo, se puede derivatizar o unir a otra molecula funcional, por ejemplo, otro peptido o protelna (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando de un receptor) para generar una molecula biespeclfica que se une a al menos dos sitios de union o moleculas diana diferentes. El anticuerpo de la presente divulgacion puede derivatizarse o unirse, de hecho, a mas de una molecula funcional adicional para generar moleculas multiespeclficas que se unen a mas de dos sitios de union y/o moleculas diferentes; tambien se pretende que dichas moleculas biespeclficas quedes abarcadas por la expresion "molecula biespeclfica" tal como se usa en el presente documento. Para crear una molecula biespeclfica, un anticuerpo de la presente divulgacion se puede unir adicionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento qulmico, fusion genetica, asociacion no covalente o de otra manera) a una o mas moleculas de union diferentes, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, peptido o mimetico de union, de forma que se produzca una molecula biespeclfica.
Por consiguiente, las moleculas biespeclficas comprenden al menos una primera especificidad de union por CD22 y una segunda especificidad de union por un segundo epltopo diana. El segundo epltopo diana puede ser un receptor Fc, por ejemplo, FcyRI (CD64) humano o un receptor Fca humano (CD89). Por lo tanto, dichas moleculas biespeclficas son capaces de unirse a celulas efectoras que expresan FcyR o FcaR (por ejemplo, monocitos, macrofagos o celulas polimorfonucleares (PMN)) y a celulas diana que expresan CD22. Estas moleculas biespeclficas dirigen las celulas que expresan CD22 a celulas efectoras y disparan las actividades de las celulas efectoras mediadas por Fc, tales como la fagocitosis de las celulas que expresan CD22, citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC), liberacion de citoquinas, o generacion del anion superoxido.
En una realizacion en la que la molecula biespeclfica es multiespeclfica, la molecula puede incluir ademas una tercera especificidad de union, ademas de la especificidad de union contra Fc y una especificidad de union contra CD22. En una realizacion, la tercera especificidad de union es una porcion del factor antipotenciacion (EF), por ejemplo, una molecula que se une a una protelna superficial implicada en la actividad citotoxica y que aumenta por tanto la respuesta inmunitaria contra la celula diana. La "porcion del factor antipotenciacion" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional, o un ligando que se une a una molecula dada, por ejemplo, un antlgeno o un receptor, y de esta forma da como resultado una potenciacion del efecto de los determinantes de union por el receptor Fc o el antlgeno de una celula diana. La "porcion del factor antipotenciacion" se puede unir a un receptor Fc o a un antlgeno de una celula diana. Como alternativa, la porcion del factor antipotenciacion se puede unir a una entidad que es diferente de la entidad a la que se unen las primera y segunda especificidades de union. Por ejemplo, la porcion del factor antipotenciacion se puede unir a un linfocito T citotoxico (por ejemplo, mediante CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra celula inmunitaria que de como resultado una mayor respuesta inmunitaria contra la celula diana).
En una realizacion, las moleculas biespeclficas comprenden, como especificidad de union, al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluyen, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb o un Fv monocatenario. El anticuerpo tambien puede ser un dlmero de la cadena ligera o la cadena pesada, o cualquier fragmento mlnimo de las mismas, tal como un Fv o una construction monocatenaria como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.946.778 de Ladner et al.
En una realizacion, la especificidad de union por un receptor Fcy se proporciona mediante un anticuerpo monoclonal, cuya union no se bloquea mediante la inmunoglobulina G (IgG) humana. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena y situados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas del receptor transmembrana o soluble que se agrupan en tres clases del receptor de Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32), y FcyRIII (CD16). En una realizacion preferida, el receptor de Fcy es un receptor de FcyRI de alta afinidad humano. El FcyRI humano es una molecula de 72 kDa, que muestra una elevada afinidad para la IgG monomerica (108 - 109 M-1).
La production y caracterizacion de determinados anticuerpos monoclonales dirigidos contra Fcy se describe en la publication PCT WO 88/00052 y en la patente de Estados Unidos N.° 4.954.617 de Fanger et al. Estos anticuerpos se unen a un epltopo de FcyRI, FcyRII o FcyRIII en un sitio que es diferente del sitio de union a Fcy del receptor y, por lo tanto, su union no queda practicamente bloqueada por los niveles fisiologicos de IgG. Los anticuerpos dirigidos contra FcyRI utiles en la presente divulgacion son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce mAb 32 esta disponible de la American Type Culture Collection, n.° de registro ATCC HB9469. En otras realizaciones, el anticuerpo dirigido contra Fcy es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La produccion y caracterizacion del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y en la publicacion PCT WO 94/10332 de Tempest et al. La llnea de celulas que produce el anticuerpo H22 se deposito en la American Type Culture Collection con la designation HA022CL1 y tiene el n.° de registro CRL 11177.
En otras realizaciones adicionales, la especificidad de union para un receptor Fc se proporciona mediante un anticuerpo que se une al receptor de la IgA humana, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (FcaRl (CD89)), cuya union preferentemente no se bloquea mediante la inmunoglobulina A (IgA) humana. La expresion "receptor de IgA" pretende incluir el producto genico de un a-gen (FcaRl) situado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas transmembrana de corte y empalme alternativo de 55 a 110 kDa. FcaRl (CD89) se expresa
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constitutivamente en monocitos/macrofagos, granulocitos eosinofllicos y neutrofliicos, pero no en poblaciones de celulas efectoras. FcaRI tiene afinidad media (=5x 107 M-1) por IgA1 y IgA2, que aumenta tras la exposition a citoquinas tales como G-CSF o GMCSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Cuatro anticuerpos monoclonales especlficos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen a FcaRI fuera del dominio de union al ligando IgA, se han descrito (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).
FcaRI y FcyRI son receptores desencadentantes preferidos para su uso con las moleculas biespeclficas porque (1) se expresan principalmente en las celulas efectoras inmunitarias, por ejemplo, monocitos, PMN, macrofagos y celulas dendrlticas; (2) se expresan con altos niveles (por ejemplo, 5.000-100.000 por celula); (3) mediadores de actividades citotoxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); y (4) median la potenciacion de la presentation de antlgeno para los antlgenos, incluidos los autoantlgenos, dirigidos a los mismos.
Aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que se pueden emplear en las moleculas biespeclficas son anticuerpos monoclonales de murino, quimericos y humanizados.
Las moleculas biespeclficas se pueden preparar mediante conjugation de componentes de especificidades de union, por ejemplo, las especificidades de union contra FcR y contra CD22, usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, cada especificidad de union de la molecula biespeclfica se puede generar por separado y posteriormente conjugarse entre si. Cuando las especificidades de union son protelnas o peptidos, se puede usar varios agentes de acoplamiento o de reticulation para la conjugacion covalente. Los ejemplos de agentes de reticulation incluyen protelna A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(acido 2- nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y 4-(N- maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (veanse por ejemplo Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros metodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. n.° 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375), Los agentes de conjugacion preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de union son anticuerpos, se pueden conjugar mediante enlace sulfhidrilo en las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realization particularmente preferida, la region bisagra se modificada para contener un numero impar de restos sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la conjugacion.
Como alternativa, ambas especificidades de union se puede codificar en el mismo vector, y expresarse y ensamblarse en la misma celula hospedadora. Este metodo es especialmente util cuando la molecula biespeclfica es un mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x protelna de fusion Fab. Una molecula biespeclfica puede ser una molecula monocatenaria que comprende un anticuerpo monocatenario y un determinante de union, o una molecula biespeclfica monocatenaria que comprende dos determinantes de union. Las moleculas biespeclficas pueden comprender al menos dos moleculas monocatenarias. Los metodos para preparar moleculas biespeclficas se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. numeros 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; y 5.482.858.
La union de las moleculas biespeclficas a sus dianas especlficas se puede confirmar mediante, por ejemplo, enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), analisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibition del crecimiento) o ensayo por transferencia Western. Cada uno de estos ensayos detecta de forma general la presencia de complejos protelna-anticuerpo de especial interes, mediante el uso de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) especlfico del complejo de interes. Por ejemplo, los complejos FcR-anticuerpo se pueden detectar usando, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo unido a una enzima que reconoce y se une especlficamente a los complejos anticuerpo-FcR. Como alternativa, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de varios otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar radioactivamente y utilizarse en un radioinmunoensayo (RIA) (vease, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo de 1986). El isotopo radioactivo se puede detectar por medios tales como el uso de un contador y o un contador de centelleo o mediante autorradiografla.
Enlazadores
La presente invention proporciona conjugados de anticuerpo-ligando donde el anticuerpo esta unido al ligando mediante un enlazador qulmico. En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador de peptidilo, y se representa graficamente en el presente documento como (L4)p—F—(L1)m. Otros enlazadores incluyen enlazadores de hidrazina y disulfuro, y se representa graficamente en el presente documento como (L4)p—H—(L4)p o (L4)p—J—(L1)m, respectivamente. Ademas de los enlazadores que se unen al ligando, la presente invencion proporciona tambien brazos conectores escindibles que son adecuados para su union a practicamente cualquier especie molecular. Es aspecto del brazo del enlazador de la invencion se ilustra en el presente documento por referencia a su union a un resto terapeutico. Sin embargo, sera muy evidente para un experto en la materia que los enlazadores se pueden unir a diferentes especies entre las que se incluyen, aunque no de forma limitativa, agentes diagnosticos, agentes
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anallticos, biomoleculas, agentes de direccionamiento, marcas detectables, y similares.
El uso de peptidilo y otros enlazadores en conjugados de anticuerpo-ligando se describe en las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos con numeros 2003/0050331; 2003/0064984; 2006/0004081; 2006/0024317; y en la patente de Estados Unidos n.° 7.714.016 y en la patente de Estados Unidos n.° 6.989.452 y en la publicacion de Patente PCT n.° WO 2007/038658.
Se describen enlazadores adicionales en la patente de los Estados Unidos n.° 6.214.345 (Bristol-Myers Squibb), en la solicitud de patente de Estados Unidos 2003/0096743 y en la solicitud de patente de Estados Unidos 2003/0130189 (ambas de Seattle Genetics), de Groot et al., J. Med. Chem. 42, 5277 (1999); de Groot et al. J. Org. Chem. 43, 3093 (2000); de Groot et al., J. Med. Chem. 66, 8815, (2001); WO 02/083180 (Syntarga); Carl et al,, J. Med. Chem. Lett. 24, 479, (1981); Dubowchik y col., Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998).
Los enlazadores pueden ser utiles para unir grupos de direccionamiento a agentes terapeuticos y marcadores. Los enlazadores pueden transmitir estabilidad a los compuestos, reducir su toxicidad in vivo, o afectar favorablemente su farmacocinetica, biodisponibilidad, y/o farmacodinamica. Se prefiere por lo general que el enlazador se escinda, liberando el farmaco activo, una vez que el farmaco se administre a su sitio de accion. Por lo tanto, en una realizacion, los enlazadores son no trazables, de tal forma que una vez separado del agente terapeutico o marcador (tal como durante la activacion), no queda traza de la presencia del enlazador.
En otra realizacion, los enlazadores se caracterizan por su capacidad para escindirse en un sitio o cerca de la celula diana tal como en el sitio de la accion terapeutica o actividad de marcacion. Dicha escision puede ser de tipo enzimatico. Esta caracterlstica ayuda a reducir la activacion sistemica del agente terapeutico o marcador, reduciendo la toxicidad y los efectos secundarios sistemicos. Los grupos escindibles para escision enzimatica pueden incluir enlaces peptldicos, enlaces ester y enlaces disulfuro. En otras realizaciones, los enlazadores son sensibles al pH y se escinden mediante cambios en el pH.
Un aspecto importante es la capacidad para controlar la velocidad con la que se escinden los enlazadores. Frecuentemente, se desea un enlazador que se escinde rapidamente. En algunas realizaciones, sin embargo, se puede preferir un enlazador que se escinde mas lentamente. Por ejemplo, en una formulacion de liberation sostenida o en una formulacion con un componente tanto de liberacion rapida como de liberacion lenta, puede ser util proporcionar un enlazador que se escinde mas lentamente. El documento WO 02/096910 proporciona varios complejos de ligando-farmaco especlficos que tienen un enlazador de hidrazina. Sin embargo, no hay forma de "ajustar" la composition del enlazador dependiendo de la velocidad de ciclacion necesaria, y los compuestos concretos descritos escinden el ligando del farmaco a una velocidad mas lenta de lo preferido para muchos conjugados de farmaco-ligando. Por el contrario, los enlazadores de hidrazona proporcionan una gama de velocidades de ciclacion, desde muy rapida a muy lenta, permitiendo de esta forma la selection de un enlazador de hidrazina particular basado en la velocidad de ciclacion deseada.
Por ejemplo, se puede conseguir una ciclacion muy rapida con enlazadores de hidrazina que producen un anillo de 5 miembros tras la escision. Las velocidades de ciclacion preferidas para la administration dirigida de un agente citotoxico a celulas se consiguen usando enlazadores de hidrazina que producen, tras la escision, bien dos anillos de 5 miembros o un unico anillo de 6 miembros resultado de un enlazador que tiene dos metilos en la position geminal. Se ha mostrado que el efecto gem-dimetilo acelera la velocidad de la reaction de ciclacion, en comparacion con un unico anillo de 6 miembros sin los dos metilos en la posicion geminal. Esto procede de la cadena que se elimina del anillo. A veces, sin embargo, los sustituyentes pueden ralentizar la reaccion en lugar de acelerarla. Frecuentemente, los motivos del retraso se pueden deber al impedimento esterico. Por ejemplo, la sustitucion gem-dimetilo permite que se produzca una reaccion de ciclacion mucho mas rapida, en comparacion al caso donde el carbono geminal es CH2.
Es importante senalar, sin embargo, que en algunas realizaciones, se puede preferir un enlazador que se escinde mas lentamente. Por ejemplo, en una formulacion de liberacion sostenida o en una formulacion con un componente tanto de liberacion rapida como de liberacion lenta, puede ser util proporcionar un enlazador que se escinde mas lentamente. En determinadas realizaciones, se consigue una velocidad de ciclacion lenta usando un enlazador de hidrazina que produce, tras la escision, bien un unico anillo de 6 elementos, sin la sustitucion gem-dimetilo, o un unico anillo de 7 miembros.
Los enlazadores tambien sirven para estabilizar el agente terapeutico o el marcador contra la degradation mientras se encuentra en la circulation. Este rasgo proporciona un beneficio significativo porque dicha estabilizacion da como resultado una semivida en circulacion prolongada del agente o marcador adjunto. El enlazador tambien sirve para atenuar la actividad del agente o marcador adjunto, de forma que el conjugado es relativamente benigno mientras esta en la circulacion y tiene el efecto deseado, por ejemplo, es toxico, tras su activacion en el sitio de accion deseado. Para conjugados de agente terapeutico, este rasgo del enlazador sirve para mejorar el Indice terapeutico del agente.
Los grupos estabilizantes se seleccionan preferentemente para limitar el aclaramiento del agente terapeutico o el
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marcador por las enzimas que pueden estar presente en la sangre o en el tejido no diana, y se seleccionan adicionalmente para limitar el transporte del agente o marcador al interior de las celulas. Los grupos estabilizantes sirven para bloquear la degradacion del agente o marcador y tambien pueden actuar para proporcionar otras caracterlsticas flsicas del agente o marcador. El grupo estabilizante tambien puede mejorar la estabilidad del agente o marcador durante almacenamiento en una manera tanto formulada como no formulada.
Idealmente, el grupo estabilizante es util para estabilizar un agente terapeutico o marcador si sirve para proteger el agente o marcador de la degradacion cuando se analiza durante el almacenamiento del agente o marcador en la sangre humana a 37 °C durante 2 horas y da como resultado menos de un 20 %, preferentemente menos de un 10 %, mas preferentemente menos de un 5 % e incluso mas preferentemente menos de un 2 %, de escision del agente o marcador por las enzimas presente en la sangre humana en las condiciones de ensayo dadas.
Se pueden usar profarmacos para el tratamiento de enfermedades, especialmente para la quimioterapia contra el cancer. El uso de los enlazadores descritos en el presente documento proporciona profarmacos que presentan una elevada especificidad de accion, una toxicidad reducida, y una estabilidad mejorada en sangre con respecto a profarmacos de estructura similar.
Los enlazadores descritos en el presente documento pueden estar presentes en varias posiciones dentro de la molecula ligando.
Por lo tanto, un enlazador puede contener cualquiera de varios grupos como parte de su cadena que se van a escindir in vivo, por ejemplo, en el torrente sangulneo, a una velocidad que esta mejorada con respecto a otras construcciones que carecen de dichos grupos. Tambien se describen conjugados de los brazos enlazadores con agentes terapeuticos y diagnosticos. Los enlazadores son utiles para formar analogos de profarmaco de agentes diagnosticos, y se unen de forma reversible un agente terapeutico o diagnostico a un agente de direccionamiento, una etiqueta detectable, o un soporte solido. Los enlazadores se pueden incorporar a complejos que incluyen las citotoxinas descritas en el presente documento.
Ademas del peptido escindible, hidrazina, o grupo disulfuro, uno o mas grupos enlazadores autoinmolables L1 se introducen opcionalmente entre la citotoxina y el agente de direccionamiento. Estos grupos enlazadores tambien se pueden describir como grupos separadores y contienen al menos dos grupos funcionales reactivos. Normalmente, una funcionalidad qulmica del grupo separador se une a una funcionalidad qulmica del agente terapeutico, por ejemplo, citotoxina, mientras que la otra funcionalidad qulmica del grupo separador se utiliza para unirse a una funcionalidad qulmica del agente de direccionamiento o del enlazador escindible. Los ejemplos de funcionalidades qulmicas de los grupos separadores incluyen grupos hidroxi, mercapto, carbonilo, carboxi, amino, cetona, y mercapto.
Los enlazadores autoinmolables, representados por L1, son generalmente alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido o un grupo heteroalquilo sustituido o no sustituido. En una realizacion, los grupos alquilo o arilo pueden comprender entre 1 y 20 atomos de carbono. Tambien pueden comprender un resto polietilenglicol.
Los grupos separadores ilustrativos incluyen, por ejemplo, 6-aminohexanol, 6-mercaptohexanol, acido 10- hidroxidecanoico, glicina y otros aminoacidos, 1,6-hexanodiol, p-alanina, 2-aminoetanol, cisteamina (2- aminoetanotiol), acido 5-aminopentanoico, acido 6-aminoheptanoico, acido 3-maleimidobenzoico, ftalida, ftalidas a- sustituidas, el grupo carbonilo, esteres de amina, acidos nucleicos, peptidos y similares.
El separador puede servir para introducir masa molecular y funcionalidades qulmicas adicionales en el complejo de agente de direccionamiento de citotoxinas. En general, la masa y funcionalidad adicionales alteraran la semivida en suero y otras propiedades del complejo. Por lo tanto, mediante una seleccion cuidadosa de los grupos separadores, se pueden producir complejos de citotoxina con varias semividas en suero.
El uno o varios separadores situados adyacentes al resto de farmaco tambien se denotan como (L1)m, en la que m es un numero entero seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Cuando estan presentes multiples separadores L1, se pueden usar separadores identicos o diferentes. L1 puede ser cualquier grupo autoinmolable.
L4 es un resto enlazador que transmite preferentemente mayor solubilidad o menos propiedades de agregacion a los conjugados utilizando un enlazador que contiene el resto o modifica la tasa de hidrolisis del conjugado. El enlazador L4 no tiene que ser autoinmolable. En una realizacion, el resto L4 es alquilo sustituido, alquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, o heteroalquilo no sustituido, cualquiera de los cuales puede ser lineal, ramificado o clclico. Las sustituciones pueden ser, por ejemplo, un alquilo inferior (C1-C6), alcoxi, alquiltio alquilamino o dialquilamino. En determinadas realizaciones, L4 comprende un resto no clclico. En otra realizacion, L4 comprende cualquier pollmero de aminoacido cargado positiva o negativamente, tal como polilisina o poliarginina. L4 puede comprender un pollmero tal como un resto polietilenglicol. Adicionalmente, el enlazador L4 puede comprender, por ejemplo, tanto un componente de pollmero como un resto qulmico pequeno.
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L4 puede comprender un resto polietilenglicol (PEG). La porcion PEG de L4 puede tener entre 1 y 50 unidades de longitud. Preferentemente, el PEG tendra 1-12 unidades de repeticion, mas preferentemente 3-12 unidades de repeticion, mas preferentemente 2-6 unidades de repeticion, o incluso mas preferentemente 3-5 unidades de repeticion y lo mas preferido 4 unidades de repeticion. L4 puede consistir solamente en el resto PEG, o tambien puede contener un alquilo o heteroalquilo sustituido o no sustituido adicional. Es util combinar PEG como parte del resto L4 para mejorar la solubilidad en agua del complejo. Adicionalmente, el resto PEG reduce el grado de agregacion que se puede producir durante la conjugacion del farmaco con el anticuerpo.
En algunas realizaciones, L4 comprende
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sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo. Cada R25, R25, R26, y R26' se selecciona independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; y s y t son independientemente numeros enteros de 1 a 6. Preferentemente, R20, R25, R25, R26 y R26 son hidrofobos. En alaunasi realizaciones, R 20 es H o alquilo (preferentemente alquilo inferior no sustituido). En algunas realizaciones, R25, R25, R26 y R26 son independientemente H o alquilo (preferentemente, alquilo C1 a C4 no sustituido). En algunas
realizaciones, R25, R2
R26 y R26' son todos H. En algunas realizaciones, t es 1 y s es 1 o 2.
Enlazadores peptidicos (F)
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Como se analiza anteriormente, los enlazadores peptidicos se pueden representar mediante la formula general: (L4)p-F-(L1)m, en la que F representa la porcion enlazador a que comprende el resto peptidilo.
En una realizacion, la porcion F comprende uno o mas enlazadores autoinmolables adicionales, L2, y un grupo carbonilo. En otra realizacion, la porcion F comprende un grupo amino y uno o mas grupos separadores opcionales, L3.
Por consiguiente, en una realizacion, el conjugado que comprende el enlazador de peptidilo comprende una estructura de la siguiente formula (a):
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En esta realizacion, L1 es un enlazador autoinmolable, como se ha descrito anteriormente, y L4 es un resto que transmite preferentemente mayor solubilidad, o menores propiedades de agregacion, o modifica la tasa de hidrolisis, como se ha descrito anteriormente. L2 representa uno o mas enlazadores autoinmolables. Ademas, m es 0, 1, 2, 3, 4, 5, o 6; y o y p son independientemente 0 o 1. AA1 representa uno o mas aminoacidos naturales, y/o a- aminoacidos no naturales; c es un numero entero de 1 a 20. En algunas realizaciones, c esta en el intervalo de 2 a 5 o c es 2 o 3.
En los enlazadores peptidicos de la anterior formula (a), AA1 esta unido, por su extremo amino, bien directamente a L4 o, cuando L4 esta ausente, directamente al grupo X4 (es decir, el agente de direccionamiento, marca detectable grupo funcional reactivo protegido, o grupo funcional reactivo no protegido). En algunas realizaciones, cuando L4 esta presente, L4 no comprende un grupo acilcarboxilico unido directamente al extremo N de (AA1)C. Asi, no es necesario en estas realizaciones que haya una unidad de acilcarboxilico directamente unida entre cualquiera de L4 o X4 y AA1, como es necesario en los enlazadores peptidicos de la patente de Estados Unidos n.° 6.214.345.
En otra realizacion, el conjugado que comprende el enlazador de peptidilo comprende una estructura de la siguiente formula (b):
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En esta realizacion, L4 es un resto que transmite preferentemente mayor solubilidad, o menores propiedades de agregacion, o modifica la tasa de hidrolisis, como se ha descrito anteriormente; L3 es un grupo separador que comprende una amina primaria o secundaria o un grupo funcional de carboxilo, y cualquier amina de L3 forma un enlace amida con un grupo funcional de carboxilo colgante de D, o el carboxilo de L3 forma un enlace amida con un grupo funcional de amina de D; y o y p son independientemente 0 o 1. AA1 representa uno o mas aminoacidos naturales, y/o a-aminoacidos no naturales; c es un numero entero de 1 a 20. En esta realizacion, L1 esta ausente (es decir, m es 0 en la formula general).
En los enlazadores peptldicos de la anterior formula (b), AA1 esta unido, por su extremo amino, bien directamente a L4 o, cuando L4 esta ausente, directamente al grupo X4 (es decir, el agente de direccionamiento, marca detectable grupo funcional reactivo protegido, o grupo funcional reactivo no protegido). En algunas realizaciones, cuando L4 esta presente, L4 no comprende un grupo acilcarboxllico unido directamente al extremo N de (AA1)c. Asl, no es necesario en estas realizaciones que haya una unidad de acilcarboxllico directamente unida entre cualquiera de L4 o X4 y AA1, como es necesario en los enlazadores peptldicos de la patente de Estados Unidos n.° 6.214.345.
El enlazador autoinmolable L2
El enlazador autoinmolable L2 es un resto qulmico bifuncional que es capaz de unir covalentemente entre si dos restos qulmicos separados en una molecula tripartita normalmente estable, liberando uno de dichos restos qulmicos separados de la molecula tripartita mediante escision enzimatica; y despues de dicha escision enzimatica, escindir espontaneamente el resto de la molecula para liberar el otro de dichos restos qulmicos separados. De acuerdo con la presente invencion, el separador autoinmolable esta unido covalentemente por uno de sus extremos al resto peptldico y unido covalentemente por el otro extremo al sitio qulmicamente reactivo del resto de farmaco cuya derivatizacion inhibe la actividad farmacologica, de forma que separa y une covalentemente entre si el resto peptldico y el resto de farmaco en una molecula tripartita que es estable y farmacologicamente inactivos en ausencia de la enzima diana, pero que se puede escindir enzimaticamente por dicha enzima diana en el enlace que une covalentemente el resto separador y el resto peptldico para realizar de esta forma la liberacion del resto peptldico desde la molecula tripartita. Dicha escision enzimatica, a su vez, activara el caracter autoinmolable del resto separador e iniciara la escision espontanea del enlace que une covalentemente el resto separador con el resto de farmaco, para realizar de esta manera la liberacion del farmaco en una forma farmacologicamente activa.
El enlazador autoinmolable L2 puede ser un grupo autoinmolable. Preferentemente, L2 es un alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido, arilo sustituido y no sustituido, y heteroarilo sustituido y no sustituido.
Un separador autoinmolables especialmente preferido L2 se puede representar mediante la formula (c):
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El anillo aromatico del grupo aminobencilo se puede sustituir por uno o mas grupos "K". Un grupo "K" es un sustituyente del anillo aromatico que sustituye a un hidrogeno por otra parte unido a uno de los cuatro atomos de carbono no sustituidos que forman parte de la estructura del anillo. El grupo "K" puede ser un solo atomo, tal como un halogeno, o puede ser un grupo multiatomico, tal como alquilo, heteroalquilo, amino, nitro, hidroxi, alcoxi, haloalquilo, y ciano. Cada K se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido heterocicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, halogeno, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, y OR21, en la que R21 y R22 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido y heterocicloalquilo no sustituido. Los sustituyentes K ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, F, Cl, Br, I, NO2, OH, OCH3, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3 y metilo. Para "K", i es un numero entero de 0, 1, 2, 3, o 4. En una realizacion preferida, i es 0.
El oxlgeno eter de la estructura anteriormente mostrada esta unido a un grupo carbonilo. La llnea entre la funcionalidad NR24 hacia el grupo aromatico indica que la funcionalidad amino puede estar unida a cualquiera de los
cinco atomos de carbono que a la vez forman el anillo y no estan sustituidos por el grupo -CH2-O-. Preferentemente, la funcionalidad NR24 de X esta covalentemente unida al anillo aromatico en la posicion para con respecto al grupo - CH2-O-. R24 es un elemento seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, y heteroalquilo no sustituido. En una realizacion especlfica, R24 es hidrogeno.
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Un enlazador peptldico puede tener la estructura de la anterior formula (a), en la que F comprende la estructura:
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10 donde R24 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, y heteroalquilo no sustituido. Cada K es un elemento seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, halogeno, NO2, NR2IR22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, y OR21 donde R21 y 15 R22 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido,
heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo no sustituido; e i es un numero entero de 0,1, 2, 3, o 4.
20 En otra realizacion, el enlazador peptldico de la anterior formula (a) comprende un -F-(L1)m- que comprende la estructura:
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25 donde cada R24 es un elemento seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, y heteroalquilo no sustituido.
En algunas realizaciones, el separador autoinmolable L1 o L2 incluye
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donde cada R , R , y R se selecciona independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido y arilo sustituido o no sustituido, y w es un numero entero de 0 a 4. En algunas realizaciones, R17 y R18 son independientemente H o alquilo (preferentemente, alquilo C1-4 no sustituido). 35 Preferentemente, R17 y R18 son alquilo C1-4, tal como metilo o etilo. En algunas realizaciones, w es 0. Sin desear quedar ligado a cualquier teorla en particular, se ha descubierto experimentalmente que este separador autoinmolable concreto se cicla relativamente rapido.
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En algunas realizaciones, L1 o L2 incluye
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El grupo separador L3 se caracteriza por que comprende una amina primaria o secundaria o un grupo funcional de carboxilo, y cualquiera de los grupos amina del L3 forma un enlace amida con un grupo funcional de carboxilo colgante de D o el carboxilo de L3 forma un enlace amida con un grupo funcional de amina colgante de D. L3 se puede seleccionar entre el grupo que consiste en alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido. L3 puede comprender un grupo aromatico. Mas preferentemente, L3 comprende un grupo de acido benzoico, un grupo anilina o un grupo indol. Los ejemplos no limitantes de estructuras que pueden servir como un separador -L3-NH- incluyen las siguientes estructuras:
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sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo.
Tras la escision del enlazador que contiene L3, el resto L3 permanece unido al farmaco, D. Por consiguiente, el resto L3 se selecciona de tal forma que su presencia unida a D no altere significativamente la actividad de D. En otra realizacion, una porcion del farmaco F funciona por si mismo como el separador L3. Por ejemplo, en una realizacion, el farmaco, D, es un derivado de duocarmicina en el que una parte del farmaco funciona como el separador L3. Los ejemplos no limitantes de dichas realizaciones incluyen aquellos en los que NH2-(L3)-D tiene una estructura seleccionada entre el grupo que consiste en:
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sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo; y donde el grupo NH2 de cada estructura reacciona con (AA1)c para formar -(AA1)c-NH-.
La secuencia peptitida AA1
El grupo AA1 representa un unico aminoacido o una pluralidad de aminoacidos que estan unidos entre si por enlaces amida. Los aminoacidos pueden ser aminoacidos naturales y/o a-aminoacidos no naturales.
La secuencia peptitida (AA1)c es, funcionalmente, el resto de amidificacion de un unico aminoacido (cuando c=1) o de una pluralidad de aminoacidos unidos entre si por enlaces amida. El peptido se selecciona para dirigir la escision catalizada por enzima del peptido por una enzima en un lugar de interes en un sistema biologico. Por ejemplo, para conjugados que se dirigen a una celula utilizando un agente de direccionamiento, pero que no se internalizan en dicha celula, se selecciona un peptido que se escinda mediante una o mas de las proteasas que puedan existir en la matriz extracelular, por ejemplo, debido a la liberacion de contenido celular desde celulas casi moribundas, de forma que el peptido se escinde extracelularmente. El numero de aminoacidos dentro del peptido puede estar comprendido en un intervalo de 1 a 20; pero mas preferentemente tendra 1-8 aminoacidos, 1-6 aminoacidos o 1, 2, 3 o 4 aminoacidos que comprenden (AA1)c. Las secuencias peptldicas que son susceptibles a la escision mediante enzimas o clases de enzimas especlficas son bien conocidas en la tecnica.
Muchas secuencias peptldicas que se escinden por enzimas del suero, hlgado, intestino, etc. son conocidas en la tecnica. Una secuencia peptldica ilustrativa incluye una secuencia peptldica que se puede escindir mediante una proteasa. La descripcion siguiente se centra en el uso de una secuencia sensible a proteasa para mayor claridad de la ilustracion.
Cuando la enzima que escinde el peptido es una proteasa, el enlazador generalmente incluye un peptido que contiene una secuencia de reconocimiento para escision por la proteasa. Una secuencia de reconocimiento para escision por una proteasa es una secuencia de aminoacidos reconocida por la proteasa durante la escision proteolltica. Se conocen en la tecnica muchos sitios de escision por proteasas, y estos y otros sitios de escision se pueden incluir en el resto enlazador. Veanse, por ejemplo, Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thomberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); Bouvier et al. Meth. Enzymol 248: 614 (1995), Hardy et al., en Amyloid Protein Precursor in Development, Aging, and Alzheimer's
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Disease, ed. Masters et al. pp. 190-198 (1994).
Los aminoacidos de la secuencia peptltida (AA1)c se seleccionan por su idoneidad para la escision enzimatica selectiva mediante moleculas concretas tales como proteasas asociadas a tumor. Los aminoacidos utilizados pueden ser aminoacidos naturales o aminoacidos no naturales. Pueden estar en la configuracion L o D. En una realizacion, se utilizan al menos tres aminoacidos diferentes. En otra realizacion, solo se utilizan dos aminoacidos.
La secuencia peptltida (AA1)c se selecciona preferentemente por su capacidad para escindirse mediante proteasas lisosomicas, cuyos ejemplos no limitantes incluyen catepsinas B, C, D, H, L y S. Preferentemente, la secuencia peptltida (AA1)g se puede escindir mediante la catepsina B in vitro, lo que se puede estudiar in vitro mediante ensayos de escision con proteasas conocidos en la materia.
En otra realizacion, la secuencia peptltida (AA1)c se selecciona por su capacidad para escindirse por una proteasa asociada a tumor, tal como una proteasa que se encuentra extracelularmente en la proximidad de celulas tumorales, cuyos ejemplos no limitantes incluyen la oligopeptidasa thimet (TOP) y CD10. La capacidad de un peptido para escindirse con TOP o CD 10 se puede estudiar in vitro mediante ensayos de escision con proteasas conocidos en la materia.
Los ejemplos adecuados, pero no limitantes, de secuencias peptldicas adecuadas para su uso en los conjugados de la invention incluyen Val-Cit, Cit-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-tosil-Arg, Phe-N9-nitro-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala- Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ. ID NO: 94), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ. ID NO: 95) y Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ. ID NO: 96), Val-Ala, Leu-Leu-Gly-Leu (SEQ. ID NO: 97), Leu-Asn-Ala, y Lys-Leu-Val. Las secuencias peptldicas preferidas son Val-Cit y Val-Lys.
En otra realizacion, el aminoacido situado mas cerca del resto de farmaco se seleccionada entre el grupo que consiste en: Ala, Asn, Asp, Cit, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, y Val. En otra realizacion mas, el aminoacido situado mas cerca del resto de farmaco se seleccionada entre el grupo que consiste en: Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, y Val.
Las proteasas se han implicado en la metastasis del cancer. Un aumento en la slntesis de la proteasa uroquinasa se correlaciono con una mayor capacidad para experimentar metastasis en muchos canceres. Uroquinasa activa la plasmina a partir del plasminogeno, que esta situada de forma ubicua en el espacio extracelular y su activation puede ocasionar la degradation de las protelnas de la matriz extracelular por las que invaden las celulas tumorales en metastasis. La plasmina tambien puede activar las colagenasas, estimulando de esta forma la degradacion del colageno en la membrana basal que rodea los capilares y el sistema linfatico, permitiendo de esta forma que las celulas tumorales invadan los tejidos diana (Dano, et al. Adv. Cancer. Res., 44:139 (1985)). Por lo tanto, una secuencia peptldica que se escinde mediante uroquinasa se puede usar como enlazador.
Tambien se pueden usar secuencias peptldicas que son sensibles a la escision por triptasas. Los mastocitos humanos expresan al menos cuatro triptasas diferentes, designadas a pl, pll, y pIII. Estas enzimas no estan controladas por los inhibidores de la proteinasa del plasma sangulneo y solamente escinden unos pocos sustratos fisiologicos in vitro. La familia triptasa de las serina proteasas se ha implicado en varias enfermedades alergicas e inflamatorias que implican los mastocitos, dados los elevados niveles de triptasa que se encuentran en los fluidos biologicos de pacientes con estos trastornos. Sin embargo, el papel exacto de la triptasa en la patofisiologla sigue sin estar claro. El ambito de las funciones biologicas y las correspondientes consecuencias fisiologicas de la triptasa estan practicamente definidas por su especificidad de sustrato.
La triptasa es un potente activador del activador del plasminogeno prouroquinasa (uPA), la forma zimogena de una proteasa asociada con metastasis e invasion tumoral. La activacion de la cascada del plasminogeno, que da como resultado la destruction de la matriz extracelular para la extravasation y migration celular, puede ser una funcion de la activacion por triptasa del activador del plasminogeno prouroquinasa en la secuencia P4-P1 de Pro-Arg-Phe-Lys (SEQ. ID NO: 98) (Stack, et al, Journal of Biological Chemistry 269 (13): 9416-9419 (1994)). El peptido intestinal vasoactivo, un neuropeptido que esta implicado en la regulation de la permeabilidad vascular, tambien se escinde mediante triptasa, principalmente en la secuencia Thr-Arg-Leu-Arg (SEQ. ID NO: 99) (Tam, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 3: 27-32 (1990)). El receptor acoplado a la protelna G PAR-2 se puede escindir y activar mediante triptasa en la secuencia Ser-Lys-Gly-Arg (SEQ. ID NO: 100) para impulsar la proliferation de fibroblastos, mientras que el receptor activado por trombina PAR-1 se inactiva mediante triptasa en la secuencia Pro-Asn-Asp-Lys (SEQ. ID NO: 101) (Molino et al., Journal of Biological Chemistry 272(7): 4043-4049 (1997)). Tomados en su conjunto, esta evidencia sugiere un papel fundamental de la triptasa en la remodelacion de los tejidos como consecuencia de la enfermedad. Esto es coherente con los profundos cambios observados en algunos trastornos mediados por mastocitos. Un hito del asma cronica y otras enfermedades respiratorias de larga duration es la fibrosis y el engrosamiento de los tejidos subyacentes que podrlan ser el resultado de la activacion de la triptasa en sus dianas fisiologicas. Analogamente, una serie de informes ha mostrado que la angiogenesis esta asociada con la densidad de mastocitos, actividad triptasa, y mal pronostico en varios canceres (Coussens et al, Genes and Development 13(11): 1382-97 (1999)); Takanami et al., Cancer 88(12): 2686-92 (2000); Toth-Jakatics et al., Human Pathology
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31(8): 955-960 (2000); Ribatti et al., International Journal of Cancer 85(2): 171-5(2000)).
Se conocen en la tecnica metodos para evaluar si una determinada proteasa escinde una secuencia peptldica seleccionada. Por ejemplo, el uso del sustrato peptldico fluorogenico 7-amino-4-metil cumarina (AMC) es un metodo bien establecido para la determinacion de la especificidad de proteasas (Zimmerman, M., et al., (1977) Analytical Biochemistry 78:47-51). La escision especlfica del enlace anilida libera el grupo saliente AMC fluorogenico, permitiendo la determinacion sencilla de las tasas de escision desde sustratos individuales. Mas recientemente, las matrices (Lee, D., et al., (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1667-72) y las bibliotecas de cribado por posicion (Rano, T.A., et al, (1997) Chemistry and Biology 4:149-55) de bibliotecas de sustratos peptldicos AMC se han utilizado par realizar un perfilado rapido de la especificidad del extremo N de las proteasas con muestreo de una amplia gama de sustratos en un unico experimento. Por lo tanto, un experto en la materia puede evaluar facilmente una matriz de secuencias peptldicas para determinar su utilidad en la presente invencion sin recurrir a experimentacion excesiva.
El conjugado de anticuerpo-ligando puede contener opcionalmente dos o mas enlazadores. Estos enlazadores pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, se puede usar un enlazador de peptidilo para conectar el farmaco con el ligando y un segundo enlazador de peptidilo puede vincular un agente diagnostico al complejo. Otros usos de los enlazadores adicionales incluyen unir agentes anallticos, biomoleculas, agentes de direccionamiento, y etiquetas detectables, al complejo de anticuerpo-ligando.
Los compuestos pueden ser especies polivalentes o multivalentes, que incluyen, por ejemplo, especies tales como dlmeros, trlmeros, tetrameros, y homologos superiores de los compuestos de la invencion, o reactivos analogos de los mismos tambien se han descrito. Las especies polivalentes y multivalentes se pueden ensamblar a partir de especies individuales o mas de una especie de la invencion. Por ejemplo, una construccion dimerica puede ser "homodimerica" o "heterodimerica". Ademas, se describen construcciones polivalentes y multivalentes en las que un compuesto de la invencion o un reactivo analogo del mismo se une a una estructura oligomerica o polimerica (por ejemplo, polilisina), dextrano, hidroxietil almidon, y similares). La estructura preferentemente es polifuncional (es decir, que tiene una matriz de sitios reactivos para unir los compuestos de la invencion). Ademas, la estructura se puede derivatizar con una especie individual o mas de una especie.
Ademas, los compuestos se pueden funcionalizar para proporcionar compuestos que tengan una solubilidad en agua mejorada con respecto a compuestos analogos que no se hayan funcionalizado de forma similar. Por lo tanto, cualquiera de los sustituyentes definidos en el presente documento se puede sustituir por radicales analogos que tengan una solubilidad en agua mejorada. Por ejemplo, un grupo hidroxilo se puede sustituir por un diol, o una amina se puede sustituir por una amina cuaternaria, hidroxiamina, o resto similar mas soluble en agua. Una solubilidad en agua adicional se transmite mediante la sustitucion en un sitio no esencial para la actividad frente al canal del ion de los compuestos definidos en el presente documento con un resto que potencia la solubilidad en agua de los compuestos precursores. Los metodos para mejorar la solubilidad en agua de los compuestos organicos son conocidos en la tecnica. Dichos metodos incluyen, aunque no de forma limitativa, funcionalizar un nucleo organico con un resto cargado permanentemente, por ejemplo, amonio cuaternario, o un grupo que esta cargado a un pH fisiologicamente relevante, por ejemplo, acido carboxllico, amina. Otros metodos incluyen, agregar al nucleo organico grupos que contienen hidroxilo o amina, por ejemplo, alcoholes, polioles, polieteres, y similares. Los ejemplos representativos incluyen, aunque no de forma limitativa, polilisina, polietilenimina, poli(etienglicol) y poli(propilenglicol). Se conocen en la tecnica las qulmicas y estrategias de funcionalizacion de estos compuestos. Veanse, por ejemplo, Dunn, R.L., et al, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991.
Enlazadores de hidrazina (H)
En una segunda realizacion, el conjugado de la invencion comprende un enlazador autoinmolable de hidrazina, en el que el conjugado tiene la estructura:
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en la que D, L1, L4, y X4 son como se han definido anteriormente y se describe adicionalmente en el presente documento, y H es un enlazador que comprende la estructura:
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en la que ni es un numero entero de 1 - 10; ri2 es 0, 1, o 2; cada R24 es un elemento seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo 5 sustituido, y heteroalquilo no sustituido; e I es bien un enlace (es decir, el enlace entre el atomo de carbono de la estructura principal y el nitrogeno adyacente) o:
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10 en el que n3 es 0 o 1, con la condicion de que cuando n3 = 0, n2 no es 0; y n4 es 1, 2, o 3, en la que cuando I es un enlace, n1 es 3 y n2 es 1, D no puede ser
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15 donde R es Me o CH2-CH2-NMe2.
En una realizacion, la sustitucion en el anillo de fenilo es una sustitucion en para. En realizaciones preferidas, n1 es 2, 3, o 4 o n1 es 3. En realizaciones preferidas, n2 es 1. En realizaciones preferidas, I es un enlace (es decir, el enlace entre el atomo de carbono de la estructura principal y el nitrogeno adyacente). En un aspecto, el enlazador de 20 hidrazina, H, puede formar un enlazador de 6 miembros autoinmolable tras la escision, por ejemplo, cuando n3 es 0 y n4 es 2. En otro aspecto, el enlazador de hidrazina, H, puede formar enlazadores de 5 miembros autoinmolables tras la escision. En otros aspectos mas, H forma un enlazador de 5 miembros autoinmolable, H forma un enlazador de 7 miembros autoinmolable, o H forma un enlazador de 5 miembros autoinmolable y un enlazador de 6 miembros autoinmolable, tras la escision. La tasa de escision se ve afectada por el tamano del anillo formado tras la escision. 25 Por lo tanto, dependiendo de la tasa de escision deseada, se puede seleccionar el tamano adecuado del anillo a formar tras la escision.
Enlazadores de hidrazina de cinco miembros
30 En una realizacion, el enlazador de hidrazina comprende un enlazador de hidrazina de 5 miembros, en la que H comprende la estructura:
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35 En una realizacion preferida, n1 es 2, 3, o 4. En otra realizacion preferida, n1 es 3.
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En la estructura anterior, cada R24 es un elemento seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, y heteroalquilo no sustituido. En una realizacion, cada R24 es independientemente H o un alquilo C1-C6. En otra realizacion, cada R24 es independientemente H o un alquilo C1-C3, mas preferentemente H o CH3. En otra realizacion, al menos un R24 es un grupo metilo. En otra realizacion, cada R24 es H. Cada R24 se selecciona para adaptar los efectos estericos de los compuestos y para alterar la solubilidad.
Los enlazadores de hidrazina de 5 miembros pueden experimentar una o mas reacciones de ciclacion que separan el farmaco del enlazador, y se pueden describir, por ejemplo, mediante:
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Una ruta de slntesis ilustrativa para preparar un enlazador de cinco miembros de la invencion es:
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El DMDA b protegido con Cbz se puede hacer reaccionar con acido 2,2-dimethil-malonico a en solucion con cloruro de tionilo para formar un acido Cbz-DMDA-2,2-dimetilmalonico c. El compuesto c se hace reaccionar con Boc-N- metil hidrazina d en presencia de EDC para formar DMDA-2,2-dimetilmalonico-Boc-N-metilhidrazina e.
Enlazadores de hidrazina de seis miembros
En otra realizacion, el enlazador de hidrazina comprende un enlazador de hidrazina de 6 miembros, en la que H comprende la estructura:
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En una realizacion preferida, ni es 3. En la estructura anterior, cada R24 es un elemento seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, y heteroalquilo no sustituido. En una realizacion, cada R24 es independientemente H o un alquilo C1-C6. En otra realizacion, cada R24 es independientemente H o un alquilo C1-C3, mas preferentemente H o CH3. En otra realizacion, al menos un R24 es un grupo metilo. En otra realizacion, cada R24 es H. Cada R24 se selecciona para adaptar los efectos estericos de los compuestos y para alterar la solubilidad. En una realizacion preferida, H comprende la estructura:
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En una realizacion, H comprende una sustitucion con dimetilo digeminal. En una realizacion de la estructura anterior, cada R24 es independientemente: un H o un alquilo sustituido o no sustituido.
Los enlazadores de hidrazina de 6 miembros experimentaran una reaccion de ciclacion que separa el farmaco del enlazador, y se pueden describir como:
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Una ruta de slntesis ilustrativa para preparar un enlazador de seis miembros de la invencion es:
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Dimetil alanina protegida con Cbz a en solucion con diclorometano, se hizo reaccionar con HOAt y CPI para formar una dimetilamina hidrazina protegida con Cbz b. La hidrazina b se desprotege por accion del metanol, formando el compuesto c.
Otros enlazadores de hidrazina
Se contempla que un enlazador tenga siete miembros. Probablemente, este enlazador no ciclarla tan rapidamente como los enlazadores de cinco o seis miembros, pero esto se puede preferir para algunos conjugados de anticuerpo- ligando. De manera similar, el enlazador de hidrazina puede comprender dos anillos de seis miembros o un enlazador de hidrazina que tenga un producto de ciclacion de seis miembros y uno de cinco miembros. Tambien se contemplan un enlazador de cinco y siete miembros, as! como un enlazador de seis y siete miembros.
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Otra estructura de hidrazina, H, tiene la formula::
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donde q es 0, 1,2, 3, 4, 5, o 6; y
cada R24 es un elemento seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, y heteroalquilo no sustituido. Esta estructura de hidrazina tambien puede formar anillos de seis o siete miembros, y se pueden anadir componentes adicionales para formar multiples anillos.
Enlazadores de disulfuro (J)
En otra realizacion mas, el enlazador comprende un grupo disulfuro enzimaticamente escindible. En una realizacion, un compuesto anticuerpo-ligando citotoxico tiene una estructura de acuerdo con la Formula (d):
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en la que D, L1, L4, y X4 son como se han definido anteriormente y se describen adicionalmente en el presente documento, y J es un enlazador de disulfuro que comprende la estructura:
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en la que cada R24 es un elemento seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, y heteroalquilo no sustituido; cada K es un elemento seleccionado independientemente entre el grupo que consiste en alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, halogeno, NO2, NR21R22, NRCOR, OCONRR, OCOR, y OR21 en la que R y R se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido y heterocicloalquilo no sustituido; i es un numero entero de 0, 1, 2, 3, o 4; y d es un numero entero de 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
El anillo aromatico del enlazador de disulfuro se puede sustituir por uno o mas grupos "K". Un grupo "K" es un sustituyente del anillo aromatico que sustituye a un hidrogeno por otra parte unido a uno de los cuatro atomos de carbono no sustituidos que forman parte de la estructura del anillo. El grupo "K" puede ser un solo atomo, tal como un halogeno, o puede ser un grupo multiatomico, tal como alquilo, heteroalquilo, amino, nitro, hidroxi, alcoxi, haloalquilo, y ciano. Los sustituyentes K ilustrativos incluyen independientemente, aunque no de forma limitativa, F, Cl, Br, I, NO2, OH, OCH3, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3 y metilo. Para "K/', i es un numero entero de 0, 1, 2, 3, o 4. En una realizacion especlfica, i es 0.
El enlazador comprende preferentemente un grupo disulfuro enzimaticamente escindible de la siguiente formula:
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En esta realizacion, las identidades de L4, X4, p, y R24 son como se han descrito anteriormente, y d es 0, 1,2, 3, 4, 5, o 6. En una realizacion particular, d es 1 o 2.
En la formula siguiente se muestra un enlazador de disulfuro mas especlfico:
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Un ejemplo especlfico de esta realizacion es el siguiente:
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Preferentemente, d es 1 o 2,
En la formula siguiente se muestra otro enlazador de disulfuro:
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Un ejemplo especlfico de esta realizacion es el siguiente:
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Preferentemente, d es 1 o 2.
En diversas realizaciones, los disulfuros son orto respecto a la amina. En otra realizacion especlfica, a es 0. R24 se selecciona preferentemente e independientemente entre H y CH3.
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Una ruta de slntesis ilustrativa para preparar un enlazador de disulfuro de la invencion es la siguiente:
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Aldritiol-2
Metanol
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Metanol
Metanol
Una solucion de acido 3-mercaptopropionico a se hace reaccionar con aldritiol-2 para formar yoduro de 3-metil benzotiazolio b. El yoduro de 3-metil benzotiazolio c se hace reaccionar con hidroxido de sodio para formar el compuesto d. Una solucion del compuesto d con metanol se hace reaccionar adicionalmente con el compuesto b para formar el compuesto e. El compuesto e desprotegido por la accion de cloruro de acetilo y metanol forman el compuesto f.
Para un analisis adicional sobre los tipos de citotoxinas, enlazadores y otros metodos para conjugar agentes terapeuticos con anticuerpos, veanse tambien la publicacion PCT WO 2007/059404 de Gangwar et al. y titulada "Cytotoxic Compounds And Conjugates " Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
Moleculas ligando
En un aspecto, la presente invencion presenta el anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion conjugado a una molecula ligando, en el que la molecula ligando es un agente terapeutico, tal como citotoxina, un farmaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Dichos conjugados tambien se denominan en el presente documento como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o mas citotoxinas reciben el nombre de "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las celulas (por ejemplo, las destruya).
Los ejemplos de moleculas ligando de la presente invencion incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procalna, tetracalna, lidocalna, propanolol y puromicina y analogos u homologos de los mismos. Los ejemplos de moleculas ligando tambien incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina-platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Otros ejemplos preferidos de moleculas ligando que se pueden conjugar con el anticuerpo de la invencion incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de los mismos. Un ejemplo de conjugado de calicamicina con anticuerpo esta comercialmente disponible (Mylotarg®; American Home Products).
Los ejemplos preferidos de molecula ligando son CC-1065 y las duocarmicinas. CC-1065 se aislo por primera vez de Streptomyces zelensis ein 1981 por la Upjohn Company (Hanka et al., J. Antibiot 31: 1211 (1978); Martin et al., J.
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Antibiot. 33: 902 (1980); Martin et al., J. Antibiot. 34: 1119 (1981)) y se ha descubierto que tiene una potente actividad antitumoral u antimicrobiana tanto in vitro como en animales experimentales (Li et al., Cancer Res. 42: 999 (1982)). CC-1065 se une a ADN B bicatenario dentro de la hendidura menor (Swenson et al., Cancer Res. 42: 2821 (1982)) con preferencia de secuencia en 5'-d(A/GNTTA)-3' y 5'-d(AAAAA)-3' y alquila la posicion N3 de la 3'-adenina en su unidad CPI de la izquierda presente en la molecula (Hurley et al., Science 226: 843 (1984)). A pesar de su potente y amplia actividad antitumoral, CC-1065 no se puede utilizar en seres humanos porque causa la muerte retrasada en animales experimentales.
Se conocen en la tecnica muchos analogos y derivados de CC-1065 y de las duocarmicinas. Se ha revisado la investigation sobre la estructura, slntesis, y propiedades de muchos de los compuestos. Veanse, por ejemplo, Boger et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996); y Boger et al., Chem. Rev. 97: 787 (1997).
Un grupo de Kyowa Hakko Kogya Co., Ltd. ha preparado numerosos derivados de CC-1065. Veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con numeros 5.101.038; 5.641.780; 5.187.186; 5.070.092; 5.703.080; 5.070.092; 5.641.780; 5.101.038; y 5.084.468; y la solicitud PCT publicada, WO 96/10405 y la solicitud europea publicada 0 537 575 A1.
La Upjohn Company (Pharmacia Upjohn) tambien ha dedicado actividad a preparar derivados de CC-1065. Veanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5.739.350; 4.978.757, 5.332, 837 y 4.912.227.
Se describe que un compuesto citotoxico tiene una estructura de acuerdo con la siguiente formula (e):
imagen33
en la que el sistema del anillo A es un miembro seleccionado entre grupos arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido. Los sistemas de anillo ilustrativo incluyen fenilo y pirrol.
Los slmbolos E y G se seleccionan independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, un heteroatomo, un enlace simple, o E y G se unen opcionalmente para formar un sistema de anillo seleccionado entre arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido.
El slmbolo X representa un miembro seleccionado entre O, S y NR23. R23 es un elemento seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo.
El slmbolo R3 representa un miembro seleccionado entre (=O), SR", NHR" y OR", en el que R1 1 es H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, monofosfatos, difosfatos, trifosfatos, sulfonatos,
,11
-,11
,11
,i 1
C(O)OR
12
C(O)NR12R13,
P(O)(OR12)2,
C(O)CHR12R13,
SR12 o SiR12R13R14.
Los slmbolos R12, R13,
acilo, C(O)R12 R13
y Rf4 representan independientemente H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido y arilo sustituido o no sustituido, donde R12 y R13 junto con el atomo de nitrogeno o de carbono al que estan unidos se
unen opcionalmente para formar un sistema del anillo de heterocicloalquilo que conteniendo opcionalmente dos o mas heteroatomos. Uno o mas de R12, R13 escindible dentro de su estructura.
tiene de 4 R14 pueden
a 6 miembros, incluir un grupo
R4, R4, R5 y R5 son miembros seleccionados independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, halogeno, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, y O(CH2)nN(CHa)2, donde n es un numero entero de 1 a 20, o cualquier par adyacente de R4, R4, R5 y R5, junto con los atomos de carbono a los que estan unidos, se unen para formar un sistema de anillo de cicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido que tiene de 4 a 6 miembros. R15 y R16 independientemente representan H, alquilo sustituido o no sustituido, sustituido,
heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido y peptidilo sustituido o no sustituido
donde R15 y R16 junto con
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el atomo de nitrogeno al que estan unidos se unen opcionalmente para formar un sistema del anillo de heterocicloalquilo que tiene de 4 a 6 miembros, conteniendo opcionalmente dos o mas heteroatomos. Una estructura ilustrativa es anilina.
R4, R4', R5, R3'
R , R , R , R y R contienen opcionalmente uno o mas grupos escindibles dentro de su estructura, tal como un enlazador escindible o un sustrato escindible. Los grupos escindibles ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, peptidos, aminoacidos, hidrazinas, disulfuros, y derivados de cefalosporina.
R15 y R16 se usa para unir el farmaco a un
En algunas realizaciones, al menos uno de R, R, R, R, R, R, R, enlazador o sustrato escindible por enzima, como se describe en el presente documento, por ejemplo, a L1, si esta presente, o a F, H, J, o X2, o J.
4 4' 5 5' 11 12 13 15 16
En otra realizacion adicional ilustrativa, al menos uno de R, R, R, R, R, R, R, R y R contiene un grupo reactivo adecuado para conjugar el compuesto. En una realizacion ilustrativa adicional, R, R, R, R, R , R , R , R15 y R16 se seleccionan independientemente entre H, alquilo sustituido y heteroalquilo sustituido y tiene un grupo funcional reactivo en los extremos libres del resto alquilo o heteroalquilo. Uno o mas de R4, R4, R5, R5, R11, R1, R13, R15 y R16 se pueden conjugar a otra especie, por ejemplo, agente de direccionamiento, marca detectable, soporte solido, etc.
R6 es un enlace simple que esta presente o ausente. Cuando R6 esta presente, R6 y R7 se unen para formar un anillo de ciclopropilo. R7 es CH2-X1 o -CH2-. Cuando R7 es -CH2- es un componente del anillo de ciclopropano. El slmbolo X1 representa un grupo saliente tal como un halogeno, por ejemplo Cl, Br o F. Las combinaciones de R6 y R7 se interpretan de forma que no se incumplan los principios de la valencia qulmica.
X1 puede ser cualquier grupo saliente. Los grupos salientes utiles incluyen, aunque no de forma limitativa, halogenos, azidas, esteres sulfonicos (por ejemplo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo), iones oxonio, percloratos de alquilo, esteres de amonio alcanosulfonato, alquilfluorosulfonatos, y compuestos fluorados (por ejemplo, triflatos, nonaflatos, tresilatos) y similares. Los halogenos particulares utiles como grupos salientes son F, Cl y Br. La eleccion de estos y otros grupos salientes adecuados para un conjunto concreto de condiciones de reaccion esta entre las capacidades del experto en la materia (veanse, por ejemplo, March J, Advanced Organic Chemistry, 2.a edicion, John Wiley and Sons, 1992; Sandler SR, Karo W, Organic Functional Group Preparations, 2.a edicion, Academic Press, Inc., 1983; y Wade LG, Compendium of Organic Synthetic Methods, John Wiley and Sons, 1980).
La llnea curvada dentro del anillo de seis miembros indica que el anillo puede tener uno o mas grados de insaturacion, y puede ser aromatico. Por lo tanto, las estructuras de anillo tales como las definidas a continuacion, y estructuras relacionadas, estan dentro del alcance de la Formula (f):
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sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido
27 27' 28 28'
o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido. En algunas realizaciones, R , R , R , y R son todos H. En algunas realizaciones, v es un numero entero de 1 a 3 (preferentemente, 1). Esta unidad se puede utilizar para separar los sustituyentes arilo del farmaco, y de esta forma resistir o evitar generar compuestos que sean sustratos para resistencia multifarmaco.
En una realizacion, R11 incluye un resto, X5, que se autocicla y une el farmaco a L1, si esta presente, o a F, H, J, o X2. El resto, X5, se puede escindir preferentemente usando una enzima y, cuando se escinde, proporciona el farmaco activo. Como ejemplo, R11 puede tener la siguiente estructura (donde el lado derecho se acopla a lo que queda del farmaco):
5
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En una realizacion ilustrativa, el sistema de anillo A de formula (e) es un anillo de fenilo sustituido o no sustituido. El sistema de anillo A puede estar sustituido con uno o mas sustituyentes del grupo arilo como se define en la seccion 10 de definiciones del presente documento. En algunas realizaciones, el anillo de fenilo esta sustituido con uno resto CN o metoxi.
En algunas realizaciones, al menos uno de R4 R4, R5, y R5 une dicho farmaco a L1, si esta presente, o a F, H, J, o X2, y R3 se selecciona entre SR11, NHR11 y OR11. R11 se selecciona entre -SO(OH)2, -PO(OH)2, -AAn, - 15 Si(CH3)2C(CH3)3, -C(O)OPhNH(AA)m,
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5 es cualquier numero entero en el intervalo de 1 a 4, p es cualquier numero entero en el intervalo de 1 a 6, y AA es
cualquier aminoacido natural o no natural. En algunas realizaciones, AAn o AAm se selecciona entre las mismas
secuencias de aminoacidos descritas anteriormente para los enlazadores peptldicos (F) y opcionalmente es la
misma que la secuencia de aminoacidos utilizada en la porcion enlazadora de R4, R4, R5 * * * * 10 * * * * 15, o R5. En al menos algunas
realizaciones, R3 es escindible in vivo para proporcionar un compuesto de farmaco activo. En al menos algunas
10 realizaciones, R3 aumenta la solubilidad in vivo del compuesto. En algunas realizaciones, la tasa de disminucion de
la concentracion del farmaco activo en la sangre es sustancialmente mas rapida que la tasa de escision de R3 para
proporcionar el farmaco activo. Esto puede ser especialmente util donde la toxicidad del farmaco activo es
notablemente mayor que la de la forma de profarmaco. En otras realizaciones, la tasa de escision de R3 para
proporcionar el farmaco activo es mas rapida que la tasa de disminucion de la concentracion del farmaco activo en la
15 sangre.
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En otro compuesto ilustrativo tiene una estructura de acuerdo con la Formula (g):
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En esta realizacion, las identidades de los sustituyentes R3, R4, R4, R5, R5, R6 R7 y X son sustancialmente como se ha descrito anteriormente para la Formula (a), as! como preferencias para realizaciones particulares. El slmbolo Z es un elemento seleccionado independientemente de O, S y NR23. El slmbolo R23 representa un miembro seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo. Cada R23 se selecciona independientemente. El slmbolo R1 representa H, alquilo inferior sustituido o no sustituido, o C(O)R8 o CO2R8. R8 es un elemento seleccionado entre alquilo sustituido, alquilo no sustituido, NR9R10, NR9NHR10 y OR9. R9 y R10 se
seleccionan independientemente entre H,
alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido.
es alquilo sustituido, el que la
R2 es H, o alquilo inferior sustituido o no sustituido. Se prefiere generalmente que cuando R2 sea diferente a perfluoroalquilo, por ejemplo, CF3. En una realizacion, R2 es un alquilo sustituido en sustitucion no es un halogeno. En otra realizacion, R2 es un alquilo no sustituido.
12 En algunas realizaciones, R es un resto ester, tal como CO2CH3. En algunas realizaciones, R es un grupo alquilo
inferior, que puede estar sustituido o no sustituido. Un grupo alquilo inferior actualmente preferido es CH3. En
algunas realizaciones preferidas, R1 es CO2CH3 y R2 es CH3.
En algunas realizaciones, R4, R4, R5, y R5 son miembros seleccionados independientemente entre H, halogeno, NH2, OMe, O(CH2)2N(R29)2 y NO2. Cada R29 es independientemente H o alquilo inferior (por ejemplo, metilo).
En algunas realizaciones, el farmaco se selecciona de forma que el grupo saliente X1 sea un elemento seleccionado entre el grupo que consiste en halogeno, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, y azida. En algunas realizaciones, X1 es F, Cl, o Br.
En algunas realizaciones, Z es O o NH. En algunas realizaciones, X es O.
Otros compuestos ilustrativos adicionales tienen una estructura de acuerdo con la Formula (h) o (i):
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Otra estructura preferida para el analogo de duocarmicina de Formula (e) es una estructura en la que el sistema de anillo A es un anillo de fenilo sustituido o no sustituido. Los sustituyentes preferidos sobre la molecula de farmaco anteriormente descrita en el presente documento para la estructura de Formula 7 cuando el sistema de anillo A es
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un pirrol son tambien sustituyentes preferidos cuando el sistema de anillo A es un anillo de fenilo sustituido o no sustituido.
Por ejemplo, el farmaco (D) comprende una estructura (j):
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En esta estructura, R3, R6, R7, X son como se han descrito anteriormente para la Formula (e). Ademas, Z es un
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elemento seleccionado entre O, S y NR , en la que R es un elemento seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo;
R1 es H, alquilo inferior sustituido o no sustituido, C(O)R8, o CO2R8, en la que R8 es un elemento seleccionado entre NR9R10 y OR9, en donde R9 y R10 son elementos seleccionados independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido;
1 88 910
R es H, alquilo inferior sustituido o no sustituido, o C(O)R , en la que R es un elemento seleccionado entre NR R y OR9, en donde R9 y R10 son elementos seleccionados independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido;
R2 es H, o alquilo inferior sustituido o no sustituido o heteroalquilo no sustituido o ciano o alcoxi; y R2 es H, o alquilo
inferior sustituido o no sustituido o heteroalquilo no sustituido.
Al menos uno de R4, R4', R5, R5', R11, R12, R
R15 o R16 une el farmaco a L1,
si esta presente, o a F, H, J, o X2
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Otro farmaco (D) comprende una estructura (k) donde R4 y R4 se han unido para formar un heterocicloalquilo:
imagen42
En esta estructura, R3, R5, R5, R6, R7, X son como se han descrito anteriormente para la Formula (e). Ademas, Z es
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un elemento seleccionado entre O, S y NR , en la que R es un elemento seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo;
R32 se selecciona entre Ff, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, halogeno, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, y O(CH2)nN(CH3)2, donde n es un numero entero de 1 a 20. R15 y R16 independientemente representan H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido y peptidilo sustituido o no sustituido, donde R15 y R16 junto con el atomo de nitrogeno al que estan unidos se unen opcionalmente para formar un sistema del anillo de heterocicloalquilo que tiene de 4 a 6 miembros, conteniendo opcionalmente dos o mas heteroatomos. R32 contiene opcionalmente uno o mas grupos escindibles dentro de su estructura, tal como un enlazador escindible o un sustrato escindible. Los grupos escindibles ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, peptidos, aminoacidos, hidrazinas, disulfuros, y derivados de cefalosporina. Ademas,
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cualquier seleccion de sustituyentes descrita en el presente documento para R4, R4, R5, R5, R15, y R16 es tambien aplicable a R32
Al menos uno de R5, R5, R11 menos algunas realizaciones,
R12, R13, R15, R16, o R32 une el farmaco a L1, si esta presente, o a F, H, J, o X2. En al R32 une el farmaco a L1, si esta presente, o a F, H, J, o X2.
Un compuesto preferido es:
imagen43
R1 es H, alquilo inferior sustituido o no sustituido, C(O)R8, o CO2R8, en la que R8 es un elemento seleccionado entre NR9R10 y OR9, en donde R9 y R10 son elementos seleccionados independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido;
1' 8 8 9 10
R es H, alquilo inferior sustituido o no sustituido, o C(O)R , en la que R es un elemento seleccionado entre NR R y OR9, en donde R9 y R10 son elementos seleccionados independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido y heteroalquilo sustituido o no sustituido;
R2 es H, o alquilo inferior sustituido o no sustituido o heteroalquilo no sustituido o ciano o alcoxi; y R2 es H, o alquilo inferior sustituido o no sustituido o heteroalquilo no sustituido.
Un compuesto adicional tiene la formula:
imagen44
En esta estructura, A, R6, R7, X, R4, R4, R5, y R5 son como se han descrito anteriormente para la Formula (e).
23 23
Ademas, Z es un elemento seleccionado entre O, S y NR , donde R es un elemento seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo;
R33 se selecciona entre H, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido, halogeno, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, y O(CH2)nN(CH3)2, donde n es un numero entero de 1 a 20. R15 y R16 independientemente representan H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido y peptidilo sustituido o no sustituido, donde R15 y R16 junto con el atomo de nitrogeno al que estan unidos se unen opcionalmente para formar un sistema del anillo de heterocicloalquilo que tiene de 4 a 6 miembros, conteniendo opcionalmente dos o mas heteroatomos. R33 une el farmaco a L1, si esta presente, o a F, H, J, o X2.
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Preferentemente, A es un fenilo sustituido o no sustituido o un pirrol sustituido o no sustituido. Ademas, cualquier selection de sustituyentes descrita en el presente documento para R11 es tambien aplicable a R33.
Ligandos
X4 representa un ligando seleccionado entre el grupo que consiste de grupos funcionales reactivos protegidos, grupos funcionales reactivos no protegidos, etiquetas detectable, y agentes de direccionamiento. Los ligandos preferidos son agentes de direccionamiento, tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos.
En algunas realizaciones, el grupo X4 se puede describir como un miembro seleccionado entre R29, COOR29,
29 29 1 29 1
C(O)NR , y C(O)NNR en la que R es un elemento seleccionado entre alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. En otra realization ilustrativa adicional, R29 es un elemento reactivo con tiol. En una realizacion ilustrativa adicional, R29 es un elemento reactivo con tiol seleccionado entre derivados de haloacetilo y haluros de alquilo, maleimidas, aziridinas, y derivados de acrilollo. El elemento reactivo con tiol anterior puede actuar como grupos protectores reactivos que se pueden hacer reaccionar con, por ejemplo, una cadena lateral de un aminoacido de un agente de direccionamiento, tal como un anticuerpo, para unir de esta forma el agente de direccionamiento al resto enlazador-farmaco.
Marcas detectables
La marca o grupo detectable particular que se puede utilizar junto con los compuestos y metodos de la invention no es generalmente un aspecto crltico de la invencion, siempre que no interfiera significativamente con la actividad o la utilidad del compuesto de la invencion. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad flsica o qulmica detectable. Dichas marcas detectables estan bien desarrolladas en el campo de los inmunoensayos y, en general, la mayorla de las posibles marcas utiles en dichos metodos se pueden aplicar a la presente invencion. Por lo tanto, una marca es cualquier composition detectable por metodos espectroscopicos, fotoqulmicos, bioqulmicos, inmunoqulmicos, electricos, opticos, o qulmicos. La marcas utiles en la presente invencion incluyen perlas magneticas (por ejemplo, DYNABEADS™), colorantes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluorescelna, rojo Tejas, rodamina, y similares), radiomarcas (por ejemplo 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, y otras habitualmente utilizadas en un ELISA), y marcas colorimetricas tales como oro coloidal o vidrio coloreado o perlas de plastico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, latex, etc.).
La marca se puede acoplar directa o indirectamente a un compuesto de la invencion de acuerdo con metodos bien conocidos en la materia. Como se ha indicado anteriormente, se puede utilizar una amplia variedad de marcas, donde la seleccion de la marca depende de la sensibilidad necesaria, facilidad de conjugation con el compuesto, requisitos de estabilidad, instrumentation disponible, y provisiones de elimination.
Cuando el compuesto de la invencion esta conjugado con una marca detectable, la marca es preferentemente un elemento seleccionado entre el grupo que consiste en isotopos radioactivos, agentes fluorescentes, precursores de agentes fluorescentes, cromoforos, enzimas y combinaciones de los mismos. Se conocen bien en la tecnica metodos para conjugar varios grupos con anticuerpos. Por ejemplo, una marca detectable que esta frecuentemente conjugada con un anticuerpo es una enzima, tal como peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, p- galactosidasa, y glucosa oxidasa.
Las marcas no radioactivas frecuentemente estan unidas por medios indirectos. En general, una molecula ligando (por ejemplo, biotina) esta unida covalentemente a un componente del conjugado. Seguidamente, el ligando se que a otras moleculas (por ejemplo, estreptavidina), que bien es detectable inherentemente o bien esta unida covalentemente a un sistema de senal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente o un compuesto quimioluminiscente.
Los componentes de los conjugados de la invencion tambien se pueden conjugar directamente con compuestos generadores de la senal, por ejemplo, mediante la conjugacion con una enzima o fluoroforo. Las enzimas de interes como marcas seran principalmente hidrolasas, especialmente las fosfatasas, esterasas y glicosidades, u oxidotasas, especialmente las peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluorescelna y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina y 2,3- dihidroftalazinadionas, por ejemplo, luminol. Para una revision de varios sistemas productores de etiquetas o senales que se pueden usar, vease, la patente de Estados Unidos n.° 4.391.904.
Los medios para obtener marcas detectables son bien conocidas de los expertos en la materia. Por lo tanto, por ejemplo, cuando la marca es una marca radioactiva, los medios de detection incluyen un contador de centelleo o una pellcula fotografica como en la autorradiografla. Cuando la marca es una marca fluorescente, se puede detectar por excitation del fluorocromo con la longitud de onda de la luz adecuada, y deteccion de la fluorescencia resultante. La fluorescencia se puede detectar visualmente, mediante una pellcula fotografica, mediante el uso de detectores electronicos tales como dispositivos de carga acoplada (CCD) o fotomultiplicadores y similares. De manera similar, las marcas enzimaticas se pueden detectar proporcionando los sustratos adecuados para la enzima y la deteccion
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del producto de reaccion resultante. Finalmente, las marcas colorimetricas simples se pueden detectar simplemente observando el color asociado a la marca. Por lo tanto, en varios ensayos con tiras reactivas, el oro conjugado aparece frecuentemente de color rosa, mientras que diferentes perlas conjugadas aparecen con el color de la perla.
En la actualidad se prefieren las marcas fluorescentes porque tienen la ventaja de necesitar pocas precauciones de manipulacion, y son adecuadas para tecnicas de visualizacion de alto rendimiento (analisis optico, incluida la digitalizacion de la imagen para el analisis en un sistema integrado que comprende un ordenador). Las marcas preferidas se caracterizan normalmente por uno o mas de los siguientes rasgos: elevada sensibilidad, elevada estabilidad, bajo fondo, baja sensibilidad ambiental y elevada especificidad en el marcado. Muchas marcas fluorescentes estan comercialmente disponibles de la empresa qulmica SIGMA (Saint Louis, MO), Molecular Probes (Eugene, OR), R&D systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LkB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), y Applied Biosystems (Foster City, CA), as! como otras muchas fuentes comerciales que conoce el experto. Ademas, el experto en la materia reconocera como seleccionar un fluoroforo adecuado para una aplicacion concreta y, si no esta facilmente disponible en el comercio, podra sintetizar el fluoroforo necesario de novo o modificar sinteticamente compuestos fluorescentes comercialmente disponibles para conseguir la marca fluorescente deseada.
Ademas de fluoroforos de molecula pequena, las protelnas fluorescentes naturales y analogos genomanipulados de dichas protelnas son utiles en la presente invention. Dichas protelnas incluyen, por ejemplo, protelnas fluorescentes verdes de cnidarios (Ward et al, Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982); Levine et al, Comp. Biochem. Physiol., 72B:77-85 (1982)), protelna fluorescente amarilla de una cepa de Vibrio fischeri (Baldwin et al, Biochemistry 29:5509-15 (1990)), Peridinina-clorofila del dinoflagelado Symbiodinium sp. (Morris et al, Plant Molecular Biology 24:673:77 (1994)), ficobiliprotelnas de cianobacterias marinas, tal como Synechococcus, por ejemplo, ficoeritrina y ficocianina (Wilbanks et al, J. Biol Chem. 268:1226-35 (1993)), y similares.
En general, antes de formar la union entre la citotoxina y el agente de direccionamiento (u otro agente) y, opcionalmente, el grupo separador, se activara al menos una de las funcionalidades qulmicas. El experto en la tecnica apreciara que varias funcionalidades qulmicas, incluidos los grupos hidroxilo, amino y carboxi, se pueden activar usando varios metodos y condiciones. Por ejemplo, un grupo hidroxilo de la citotoxina o agente de direccionamiento se puede activar mediante el tratamiento con fosgeno para formar el correspondiente cloroformiato, o p-nitrofenilcloroformiato par formar el correspondiente carbonato.
Un agente de direccionamiento ilustrativo incluye una funcionalidad de carboxilo. Los grupos carboxilo se pueden activar, por ejemplo, mediante conversion al correspondiente haluro de acilo o ester activo. Esta reaccion puede llevarse a cabo segun varias condiciones como se ilustra en March, mas arriba, pp. 388-89. En una realization ilustrativa, el haluro de acilo se prepara por reaccion del grupo que contiene carboxilo con cloruro de oxalilo. El agente activado se hacen reaccionar con una citotoxina o combination de brazo citotoxina-enlazador para formar un conjugado de la invencion. Los expertos en la materia apreciaran que el uso de los agentes de direccionamiento que contienen carboxilo es algo ilustrativo, y que agentes que tienen otros muchos grupos funcionales se pueden conjugar con los enlazadores descritos en el presente documento.
Grupos funcionales reactivos
Para mayor claridad de ilustracion, el siguiente analisis se centra en la conjugation de una citotoxina con un agente de direccionamiento. El punto central ilustra una realizacion a partir de la cual, el experto en la tecnica puede inferir rapidamente otras.
Los compuestos ilustrativos contienen un grupo funcional reactivo, que suele estar situado en una cadena de alquilo o heteroalquilo sustituida o no sustituida, permitiendo su facil union a otras especies. Una ubicacion comoda para el grupo reactivo es la position final de la cadena.
Los grupos reactivos y las clases de reacciones son generalmente aquellos que son bien conocidos en la tecnica de
la qulmica de bioconjugados. El grupo funcional reactivo puede estar protegido o no protegido, y la naturaleza
protegida del grupo se puede cambiar segun metodos conocidos en la tecnica de la slntesis organica. Las clases preferidas de reacciones disponibles para los Analogos de citoCitotoxina son los que tienen lugar en condiciones relativamente suaves. Estas incluyen, aunque no de forma limitativa, sustituciones nucleofilas (por ejemplo, reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, esteres activos), sustituciones electrofilas (por ejemplo,
reacciones de enamina) y adiciones a multiples enlaces carbono-carbono o carbono-heteroatomo (por ejemplo,
reaccion de Michael, adicion de Diels-Alder). Estas y otras reacciones utiles se analizan en, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 3a Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney et al, Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.
Los tipos de reaccion ilustrativos incluyen la reaccion de grupos carboxilo y varios derivados de los mismos que
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incluyen, aunque no de forma limitativa, esteres de N-hidroxisuccinimida, esteres de N-hidroxibenzotriazol, haluros de acido, acil imidazoles, tioesteres, esteres de p-nitrofenilo, alquilo, alquenilo, alquinilo y esteres aromaticos. Los grupos hidroxilo se pueden convertir en esteres, eteres, aldehldos, etc., Los grupos haloalquilo se convierten en nuevas especies por reaccion con, por ejemplo, una amina, un anion carboxilato, un anion tiol, carbanion, o un ion alcoxido. Los grupos dienofilos (por ejemplo, maleimida) participan en reacciones de Diels-Alder. Los grupos aldehldo o cetona se pueden convertir en iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o por mecanismos tales como reacciones de adicion de Grignard o adicion de alquil litio. Los haluros de sulfonilo reaccionan rapidamente con aminas, por ejemplo, para formar sulfonamidas. Los grupos amina o sulfhidrilo, por ejemplo, se acilan, alquilan u oxidan. Los alquenos se pueden convertir en una gama de nuevas especies usando cicloadiciones, acilacion, adicion de Michael, etc. Los epoxidos reaccionan rapidamente con aminas y compuestos de hidroxilo.
Un experto en la materia apreciara rapidamente que muchas de estas uniones se pueden producir de diferentes formas y usando varias condiciones. Para la preparacion de esteres, vease, por ejemplo, March, mas arriba en 1157; para los tioesteres, vease, March, mas arriba en 362-363, 491, 720-722, 829, 941, y 1172; para carbonatos, vease, March, mas arriba en 346-347; para carbamatos, vease, March, mas arriba en 1156-57; para amidas, vease, March, mas arriba en 1152; para ureas y tioureas, vease, March, mas arriba en 1174; para acetales y cetales, vease, Greene et al. mas arriba 178-210 y March mas arriba en 1146; para derivados de aciloalquilo, vease, Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery, K. B. Sloan, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1992; para esteres de enol, vease, March mas arriba en 1160; para N-sulfonilimidatos, vease, Bundgaard et al., J. Med. Chem., 31:2066 (1988); para anhldridos, vease, March mas arriba en 355-56, 636-37, 990-91, y 1154; para N-acilamidas, vease, March, mas arriba en 379; para bases de N-Mannich, vease, March mas arriba en 800-02, y 828; para esteres de hidroximetilcetona, vease, Petracek et al. Annals NY Acad, Sci, 507:353-54 (1987); para disulfuros, vease, March, mas arriba en 1160; y para esteres de fosfonato y fosfonamidatos.
Los grupos funcionales reactivos se pueden desproteger y seleccionar de forma que no participen en, o interfieran con, las reacciones. Como alternativa, un grupo funcional reactivo se puede proteger de participar en la reaccion mediante la presencia de un grupo protector. Los expertos en la materia entenderan como proteger un grupo funcional concreto de su interferencia con un conjunto de condiciones de reaccion. Para ejemplos de grupos protectores utiles, vease Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991.
Normalmente, el agente de direccionamiento esta unido covalentemente a una citotoxina utilizando tecnicas qulmicas convencionales mediante sus correspondientes funcionalidades qulmicas. Opcionalmente, el enlazador o agente se acopla al agente mediante uno o mas grupos separadores. Los grupos separadores pueden ser equivalentes o diferentes cuando se utilizan en combinacion.
En general, antes de formar la union entre la citotoxina y el grupo funcional reactivo y, opcionalmente, el grupo separador, se activara al menos una de las funcionalidades qulmicas. El experto en la tecnica apreciara que varias funcionalidades qulmicas, incluidos los grupos hidroxilo, amino y carboxi, se pueden activar usando varios metodos y condiciones. Un grupo funcional reactivo comprende una funcionalidad de carboxilo. Los grupos carboxilo se pueden activar como se han descrito anteriormente en el presente documento.
Sustrato escindible
Los sustratos escindibles descritos en el presente documento se representan graficamente como "X2". Preferentemente, el sustrato escindible es un sustrato escindible por enzima que se puede escindir mediante una enzima. Preferentemente, la enzima esta preferentemente asociada, directa o indirectamente, con el tumor u otras celulas diana a tratar. La enzima se puede generar por el tumo o por otras celulas diana a tratar. Por ejemplo, el sustrato escindible puede ser un peptido que se puede escindir preferentemente por una enzima que se encuentra alrededor o en el tumor o en otra celula diana. De manera adicional o alternativa, la enzima puede estar unido a un agente de direccionamiento que se une especlficamente a las celulas tumorales, tal como un anticuerpo especlfico de un antlgeno tumoral.
Como ejemplos de sustratos escindibles por enzima para su acoplamiento a los farmacos anteriormente descritos, las publicaciones de solicitud de patente PCT con numeros WO 00/33888, WO 01/95943, WO 01/95945, WO 02/00263, y WO 02/100353, divulgan la union de un peptido escindible a un farmaco. El peptido se puede escindir mediante una enzima, tal como una trouasa (tal como una thimet oligopeptidasa), CD 10 (neprilisina), una metaloproteasa de la matriz (tal como MMP2 o MMP9), una serina proteasa transmembrana de tipo II (tal como hepsina, testisina, TMPRSS4, o matriptasa/MT-SP1), o una catepsina, asociada con el tumor. En esta realizacion, un profarmaco incluye el farmaco que se ha descrito anteriormente, un peptido, un grupo estabilizante y, opcionalmente, un grupo enlazador entre el farmaco y el peptido. El grupo de estabilizacion esta unido al extremo del peptido para proteger el profarmaco de la degradacion antes de llegar al tumor u otra celula diana. Los ejemplos de grupos estabilizantes adecuados incluyen acidos nonamino, tales como el acido succlnico, acido diglicolico, acido maleico, polietilenglicol, acido piroglutamico, acido acetico, acido naftilcarboxllico, acido tereftalico y acido glutarico y derivados; as! como aminoacidos no geneticamente codificados o acido aspartico o acido glutamico unidos al extremo N del peptido en el grupo p-carboxi del acido aspartico o al grupo Y-carboxilo del acido glutamico.
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El peptido incluye de forma tlpica 3-12 (o mas) aminoacidos. La seleccion de los aminoacidos concretos dependera, al menos en parte, de la enzima que se va a usar para escindir el peptido, as! como, la estabilidad del peptido in vivo. Un ejemplo de un peptido escindible adecuado es p-AlaLeuAlaLeu. Este se puede combinar con un grupo estabilizante para formar succinil-p-AIaLeuAlaLeu. Otros ejemplos de peptidos escindibles adecuados se proporcionan en las referencias citadas anteriormente.
Como ejemplo ilustrativo, CD10, tambien conocido como neprilisina, endopeptidasa neutra (NEP), y antlgeno comun de la leucemia linfoblastica aguda (CALLA), es una metaloproteasa de tipo II de la superficial celular dependiente del cinc. Los sustratos escindibles adecuados para su uso con CD10 incluyen LeuAlaLeu y IleAlaLeu. Otros sustratos conocidos de CD10 incluye los peptidos de hasta 50 aminoacidos de longitud, aunque la eficiencia catalltica suele declinar a medida que el sustrato es mas largo.
Otro ejemplo ilustrativo se basa en las metaloproteasas de la matriz (MMP). Probablemente, las enzimas proteollticas mejor caracterizadas asociadas con tumores, existe una correlacion evidente de la activacion de las MMPs en los microentornos tumorales. En particular, las enzimas solubles de la matriz MMP2 (gelatinasa A) y MMP9 (gelatinasa B), se han estudiado ampliamente, y se ha demostrado que se activan de forma selectiva durante la remodelacion tisular, incluido el crecimiento tumoral. Las secuencias peptldicas disenadas para escindirse mediante MMP2 y MMP 9 se han disenado y sometido a ensayo para conjugados de dextrano y metotrexato (Chau et al., Bioconjugate Chem. 15:931-941 (2004)); PEG (polietilenglicol) y doxorrubicina (Bae et al., Drugs Exp. Clin. Res. 29:15-23 (2004)); y albumina y doxorrubicina (Kratz et al., Bioorg. Med. Chem. Lett 11:2001-2006 (2001)). Los ejemplos de secuencias adecuadas para su uso con las MMP incluyen, aunque no de forma limitativa, ProValGlyLeuIleGly (SEQ. ID NO. 102), GlyProLeuGlyVal (SEQ. ID NO. 103), GlyProLeuGlylleAlaGlyGln (SEQ. ID NO. 104), ProLeuGlyLeu (SEQ. ID NO. 105), GlyProLeuGlyMetLeuSerGln (SEQ. ID NO. 106), y GlyProLeuGlyLeuTrpAlaGln (SEQ. ID NO. 107). (Veanse, por ejemplo, las referencias citadas anteriormente as! como Kline et al., Mol. Pharmaceut. 1:9-22 (2004) y Liu et al, Cancer Res. 60:6061-6067 (2000).) Tambien se pueden usar otros sustratos escindibles.
Otro ejemplo mas son las serina proteasas transmembrana de tipo II. Este grupo de enzimas incluye, por ejemplo, hepsina, testisina, y TMPRSS4. GlnAIaArg es una secuencia de sustrato que es util con matriptasa/MT-SP1 (que se expresa en exceso en canceres de mama y ovario) y LeuSerArg es util con hepsina (que se expresa en exceso en cancer de prostata y otros tipos de tumores). (Veanse, por ejemplo, Lee et.al, J. Biol. Chem. 275:36720-36725 y Kurachi y Yamamoto, Handbook of Proeolytic Enzymes Vol. 2, 2a edicion (Barrett AJ, Rawlings ND & Woessner JF, eds) pp. 1699-1702 (2004).) Tambien se pueden usar otros sustratos escindibles.
Otro tipo de disposicion de sustrato escindible incluye preparar una enzima independiente capaz de escindir el sustrato escindible que queda asociado con los tumores o celulas. Por ejemplo, una enzima se puede acoplar a un anticuerpo especlfico de tumor (u otra entidad que se atrae preferentemente hacia el tumor o hacia otra celula diana tal como un ligando del receptor) y, a continuacion, el conjugado de enzima-anticuerpo se puede proporcionar al paciente. El conjugado de enzima-anticuerpo se dirige a, y se une con, antlgeno asociado al tumor. Posteriormente, el conjugado de farmaco-sustrato escindible se proporciona al paciente como profarmaco. El farmaco solamente se libera en la proximidad del tumor cuando el conjugado de farmaco-sustrato escindible interactua con la enzima que ha quedado asociada con el tumor, de forma que el sustrato escindible se escinde, y el farmaco se libera. Por ejemplo, las patentes de Estados Unidos numeros 4.975.278; 5.587.161; 5.660.829; 5.773.435; y 6.132.722, divulgan una disposicion de ese tipo. Los ejemplos de enzimas y sustratos adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, p-lactamasa y derivados de cefalosporina, carboxipeptidasa G2 y derivados de glutamico y aspartico folato.
En una realizacion, el conjugado de enzima-anticuerpo incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que se selecciona dependiendo de su especificidad por un antlgeno expresado en una celula diana, o en un sitio diana, de interes. Se ha proporcionado anteriormente en el presente documento un analisis de los anticuerpos. Un ejemplo de un complejo cefalosporina-sustrato escindible es
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Ejemplos de conjugados
Los enlazadores y sustratos escindibles descritos en el presente documento se pueden usar en conjugados que contienen varias moleculas ligando. Se describen con mas detalle a continuacion algunos ejemplos de conjugados. Salvo que se indique otra cosa, los sustituyentes se definen como se ha expuesto anteriormente en las secciones
relativas a citotoxinas, enlazadores, sustratos escindibles.
A. Coniuaados de enlazador
5 Un ejemplo de un conjugado adecuado es un compuesto de formula:
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en la que L1 es un enlazador autoinmolable; m es un numero entero 0,1, 2, 3, 4, 5, o 6; F es un enlazador que 10 comprende la estructura:
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en la que AA1 es uno o mas elementos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en 15 aminoacidos naturales y a-aminoacidos no naturales; c es un numero entero de 1 a 20; L2 es un enlazador autoinmolable y comprende
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20 en la que cada R , R , y R se selecciona independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido heteroalquilo sustituido o no sustituido y arilo sustituido o no sustituido, y w es un numero entero de 0 a 4; o es 1; L4 es un elemento enlazador; p es 0 o 1; X4 es un elemento seleccionado entre el grupo que consiste en grupos funcionales reactivos protegidos, grupos funcionales reactivos no protegidos, etiquetas detectable, y agentes de direccionamiento; y D comprende una estructura:
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en la que el sistema del anillo A es un miembro seleccionado entre grupos arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; E y G son elementos seleccionados 30 independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, un
heteroatomo, un enlace simple, o E y G se unen para formar un sistema de anillo seleccionado entre arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; X es un elemento seleccionado entre O, S y NR23; R23 es un elemento seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo; R3 es OR11, en el que R11 es un elemento seleccionado del grupo que 35 consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido,
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monofosfatos, difosfatos, trifosfatos, sulfonatos, acilo, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 y SiR12R13R14, R4, R4, R5 y R5 son elementos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, halogeno, NO2, NR15R16, NC(O)Rb, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16 y O(CH2)nN(CH3)2, o cualquier par adyacente de R4, R4, R5 y R5, junto con los atomos de carbono a los que estan unidos, se unen para formar un sistema de anillo de cicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido que tiene de 4 a 6 miembros; en la que n es un numero entero de 1 a 20; R15 y R16 se seleccionan independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido y peptidilo sustituido o no sustituido, en la que R15 y R16 junto con el atomo de nitrogeno al que estan unidos se unen opcionalmente para formar un sistema del anillo de heterocicloalquilo que tiene de 4 a 6 miembros, conteniendo opcionalmente dos o mas heteroatomos; R6 es un enlace simple que esta presente o ausente y, cuando esta presente, R6 y R7 se unen para formar un anillo de ciclopropilo; y R7 es CH2-X1 o -CH2- unidos en dicho anillo de ciclopropilo con R6, en la que X1 es un grupo saliente, en la que R11 une dicho farmaco a L1, si esta presente, o a F.
En algunas realizaciones, el farmaco tiene la estructura (c) o (f) anterior. Un ejemplo especlfico de un compuesto adecuado para su uso como conjugado es
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en la que L1 es un enlazador autoinmolable; m es un numero entero 0,1, 2, 3, 4, 5, o 6; F es un enlazador que comprende la estructura:
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en la que AA1 es uno o mas elementos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en aminoacidos naturales y a-aminoacidos no naturales; c es un numero entero de 1 a 20; L2 es un enlazador autoinmolable; o es 0 o 1; L4 es un elemento enlazador; p es 0 o 1; X4 es un elemento seleccionado entre el grupo que consiste en grupos funcionales reactivos protegidos, grupos funcionales reactivos no protegidos, etiquetas detectable, y agentes de direccionamiento; y D comprende una estructura:
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en la que el sistema del anillo A es un miembro seleccionado entre grupos arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; E y G son elementos seleccionados independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, un heteroatomo, un enlace simple, o E y G se unen para formar un sistema de anillo seleccionado entre arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; X es un elemento seleccionado entre O, S y NR23; R23 es un elemento seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo; R3 es un elemento seleccionado del grupo que consiste en (=O), SR11, NHR11 y OR11, en el que R11 es un elemento seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, monofosfatos, difosfatos trifosfatos, sulfonatos, acilo, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 y SiR12R13R, en la que R12, R13, y R14 son miembros seleccionados independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido y arilo sustituido o no sustituido, en la que R12 y R13 junto con el atomo de nitrogeno o de carbono al que estan unidos se unen opcionalmente para formar un sistema del anillo de heterocicloalquilo que tiene de 4 a 6 miembros, conteniendo opcionalmente dos o mas heteroatomos; R4, R4, R5 y R5 son elementos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, halogeno, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, y O(CH2)nN(CH3)2, o cualquier par adyacente de R4, R4, R5 y R5, junto con los atomos de carbono a los que estan unidos, se unen para formar un sistema de anillo de cicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido que tiene de 4 a 6 miembros, en la que n es un numero entero de 1 a 20; R15 y R16 se seleccionan independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido y peptidilo sustituido o no sustituido, en la que R15 y R16 junto con el atomo de nitrogeno al que estan unidos se unen opcionalmente para formar un sistema del anillo de heterocicloalquilo que tiene de 4 a 6 miembros, conteniendo opcionalmente dos o mas heteroatomos; en la que al menos uno de R4, R4, R5 y R5 une dicho farmaco a L1, si esta presente, o a F, y comprende
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alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; R6 es un enlace simple que esta presente o ausente y, cuando esta presente, R6 y R7 se unen para formar un anillo de ciclopropilo; y R7 es CH2-X1 o -CH2- unidos en dicho anillo de ciclopropilo con R6, en la que X1 es un grupo saliente.
En alguna realization, el farmaco tiene la estructura (c) o (f) anterior. Un ejemplo especlfico de un compuesto adecuado para su uso como conjugado es
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Otro ejemplo de un conjugado adecuado es un compuesto de formula
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en la que L1 es un enlazador autoinmolable; m es un numero entero 0, 1, 2, 3, 4, 5, o 6; F es un enlazador que
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comprende la estructura:
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en la que AA1 es uno o mas elementos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en aminoacidos naturales y a-aminoacidos no naturales; c es un numero entero de 1 a 20; L3 es un grupo separador que comprende una amina primaria o secundaria, o un grupo funcional de carboxilo; en la que, cuando L3 esta presente, m es 0 y cualquier amina de L3 forma un enlace amida con un grupo funcional de carboxilo colgante de D, o el carboxilo de L3 forma un enlace amida con un grupo funcional de amina de D; o es 0 o 1; L4 es un elemento enlazador, en la que L4 comprende
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e H, alquilo sustituido o
no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo, cada R25, R25, R26, y R26' se selecciona independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; y s y t son independientemente numeros enteros de 1 a 6; p es 1; X4 es un elemento seleccionado entre el grupo que consiste en grupos funcionales reactivos protegidos, grupos funcionales reactivos no protegidos, etiquetas detectable, y agentes de direccionamiento; y D comprende una estructura:
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en la que el sistema del anillo A es un miembro seleccionado entre grupos arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; E y G son elementos seleccionados independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, un heteroatomo, un enlace simple, o E y G se unen para formar un sistema de anillo seleccionado entre arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, y heterocicloalquilo sustituido o no sustituido; X es un elemento seleccionado entre O, S y NR23; R23 es un elemento seleccionado entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, y acilo; R3 es un elemento seleccionado del grupo que consiste en (=O), SR11, NHR11 y OR11, en el que R11 es un elemento seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, heteroalquilo sustituido, heteroalquilo no sustituido, monofosfatos, difosfatos trifosfatos, sulfonatos, acilo, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 y SiR12R13R14, en la que R12, R13, y R14 son miembros seleccionados independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido y arilo sustituido o no sustituido, en la que R12 y R13 junto con el atomo de nitrogeno o de carbono al que estan unidos se unen opcionalmente para formar un sistema del anillo de heterocicloalquilo que tiene de 4 a 6 miembros, conteniendo opcionalmente dos o mas heteroatomos; R4, R4’, R5 y R5 son elementos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo sustituido, alquilo no sustituido, arilo sustituido, arilo no sustituido, heteroarilo sustituido, heteroarilo no sustituido, heterocicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo no sustituido, halogeno, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, y O(CH2)nN(CH3)2, o cualquier par adyacente de R4, R4, R5 y R5, junto con los atomos de
carbono a los que estan unidos, se unen para formar un sistema de anillo de cicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido o no sustituido que tiene de 4 a 6 miembros, en la que n es un numero entero de 1 a 20; R15 y R16 se seleccionan independientemente entre H, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido,
arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o sustituido, heterocicloalquilo sustituido o no sustituido y peptidilo sustituido o no sustituido, en la que R15 y R16 junto con el atomo de nitrogeno al que estan unidos se unen opcionalmente para formar un sistema del anillo de heterocicloalquilo que tiene de 4 a 6 miembros, conteniendo opcionalmente dos o mas heteroatomos; R6 es un enlace simple que esta presente o ausente y, cuando esta 5 presente, R6 y R7 se unen para formar un anillo de ciclopropilo; y R7 es CH2-X1 o -CH2- unidos en dicho anillo de ciclopropilo con R6, en la que X1 es un grupo saliente, en la que al menos uno de R4, R4, R5, R5, R15 o R16 une dicho farmaco a L1, si esta presente, o a F.
En alguna realization, el farmaco tiene la estructura (c) o (f) anterior. Un ejemplo especlfico de un compuesto 10 adecuado para su uso como conjugado es
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donde r es un numero entero en el intervalo de 0 a 24.
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Otros ejemplos de compuestos adecuados para su uso como conjugados incluyen:

Claims (32)

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    1. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antlgeno del mismo, en donde el anticuerpo se une a
    CD22 humano, que comprende:
    (a) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:2;
    (b) una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:60;
    (c) una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 10;
    (d) una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 14;
    (e) una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:20; y
    (f) una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:26.
  2. 2. El anticuerpo monoclonal, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de la reivindicacion 1, que comprende:
    (a) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:2;
    (b) una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:6;
    (c) una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 10;
    (d) una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 14;
    (e) una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:20; y
    (f) una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:26.
  3. 3. El anticuerpo monoclonal, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de la reivindicacion 1, que comprende:
    (a) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:2;
    (b) una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:60;
    (c) una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 10;
    (d) una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 14;
    (e) una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:20; y
    (f) una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO:26.
  4. 4. El anticuerpo, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de la reivindicacion 1, que comprende:
    (a) una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en las SEQ ID NO: 32 o 61; y
    (b) una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 36.
  5. 5. El anticuerpo, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de la reivindicacion 4, que comprende:
    (a) una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 32; y
    (b) una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 36.
  6. 6. El anticuerpo, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de la reivindicacion 4, que comprende:
    (a) una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 61; y
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    (b) una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen la secuencia definida en la SEQ ID NO: 36.
  7. 7. El anticuerpo, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.
  8. 8. Una composition que comprende el anticuerpo, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
  9. 9. Un inmunoconjugado, que comprende el anticuerpo, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y una molecula ligando, en el que la molecula ligando es un agente terapeutico, preferentemente una citotoxina.
  10. 10. El inmunoconjugado de la reivindicacion 9, en el que el agente terapeutico es un isotopo radioactivo.
  11. 11. El inmunoconjugado de las reivindicaciones 9 o 10, en el que la molecula ligando esta conjugada con el anticuerpo mediante un enlazador qulmico; preferentemente el enlazador qulmico se selecciona entre el grupo que consiste en enlazadores de peptidilo, enlazadores de hidrazina y enlazadores de disulfuro.
  12. 12. Una composicion que comprende el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
  13. 13. Un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  14. 14. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 13.
  15. 15. Una celula hospedadora que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 14.
  16. 16. Un metodo para preparar un anticuerpo dirigido contra CD22, o una porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende expresar el anticuerpo, o una porcion de union a antlgeno del mismo, en la celula hospedadora de la reivindicacion 15 y aislar el anticuerpo, o una porcion de union a antlgeno del mismo, de la celula hospedadora.
  17. 17. Uso del anticuerpo, o de la porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 en la fabrication de un medicamento para inhibir el crecimiento de una celula tumoral que expresa CD22 mediante la puesta en contacto de la celula tumoral que expresa CD22 con el anticuerpo, la porcion de union a antlgeno del mismo o el inmunoconjugado, de tal forma que el crecimiento de la celula tumoral que expresa CD22 queda inhibido.
  18. 18. El uso de la reivindicacion 17, en el que la celula tumoral es una celula de un linfoma de linfocitos B; preferentemente una celula de un linfoma no de Hodgkin.
  19. 19. Uso del anticuerpo, o de la porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o del inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio o autoinmunitario en un sujeto.
  20. 20. El uso de la reivindicacion 19, en donde el trastorno autoinmunitario es lupus eritematoso sistemico o artritis reumatoide.
  21. 21. El anticuerpo, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 para su uso en la inhibition del crecimiento de una celula tumoral que expresa cD22 mediante la puesta en contacto de la celula tumoral que expresa CD22 con el anticuerpo, la porcion de union a antlgeno del mismo o el inmunoconjugado, de tal forma que el crecimiento de la celula tumoral que expresa CD22 queda inhibido.
  22. 22. El anticuerpo, la porcion de union a antlgeno del mismo o el inmunoconjugado para el uso de la reivindicacion 21, en donde la celula tumoral es una celula de un linfoma de linfocitos B; preferentemente una celula de un linfoma no de Hodgkin.
  23. 23. El anticuerpo, o la porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio o autoinmunitario en un sujeto.
  24. 24. El anticuerpo, la porcion de union a antlgeno del mismo o el inmunoconjugado para el uso de la reivindicacion 23, en donde el trastorno autoinmunitario es lupus eritematoso sistemico o artritis reumatoide.
    segmento V: 7-4.1
    segmento D: 3.3
    segmento J:
    OVOlVQSae eiKKPGAEV 1 CAjG GTG CAG CTO GTS CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAC- CCT GOG GCC TC* GIG
    CDR1
    KVSCKASGYTFTSTAKHH 55 AAG Gn tec TGC AAG GCT TCT GGA TAG ACC TTC ACT AST TAT GCT ATG AAT TGG
    CDRJ
    VRQAPGQGLEHMGWINTH 105 GTG CCA (TAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA TOO ATC AAC ACC AAC
    CSR2
    tchptyaogftgrfvfsl 1GG ACT GGG AAC CCA ACC Tat CCC CAG GGC TTC ACA GGA CGG TtT GtC TTC TCC TTG
    DTSUSTArLQtCSLKAED 217 <JAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTG CAjG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAG GAC
    OR3
    TAVTVCAftLFYVYFGHDV 271 ACT CCC GTG TAT TAG TGT GCT AGG TTA TTC TAC TAC TAC TTC GGT ATC GAC GTC
    HGOGTTVTVHS 325 TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA
    FIGURA 1A
    imagen1
    Anti- CD22 19A3 VH Anti- CD22 CD22.1 VS
    segmento V: 4-34
    segmento D: 3-3
    segmento J: JH4b
    qV0LQQWGAGLLKP3ETL 2 CAG 0TO CAG CTA CAG GaG TGG GGC GCA GGA CTG TTG AAG CCT TCG GAG ACC CM
    CDRl
    SLTCAVVCR9FSSVYHSH S5 TCC CTC ACC TGC GcT GTC TAT CST ACC TCC TTC AGT ACT TAC TAC TGQ AGC TGG
    tDsa
    IftQPPGKGLEWlGDlWHS 10? ATC CGC CAG CCC CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG ATT GGG CAC ATC AAT CAT AGT
    CDR2
    GSTHYNPSLKSEtVTISVB 163 CGA AGC ACC AAC TAG AAC CCG TCC CTG AAG AGT CGA (JTC ACC ATA TtA OTA GAC
    TsKHQ?isLkLSsVtAaejt
    217 ACG TCC AAG AAC CAG TTC TCC CTG AAG CTG AGC TCT GTG ACC GCC GOG GAC ACG
    CDRi
    AVYYCAGTFYDI If T G Y IT P 271 GCT GTG TAT TAC TGT GCG GGA AOG TTT TAC GAT ATT TTG ACT GGT TAT TAT CCC
    CDRl
    LGYWGPGTtVTUSS 323 CTT GGG TAC TOG GGC CCG GGA ACC CTG GTC ACC GTG TCC TCA
    FIGURA 2A
    imagen2
    segmento V segmento D segmento J
    4-34
    3-9
    JH4b
    qVQLQQWCAGLLKPSETL 4 CAE GTC CAG CTA CAG CAS TCG GGC GCA GGA CTG TTC AAG GCT TCG GAG ACC CTG
    am
    SLTCXVY3ASFSSVYHBH 55 TCC CTC ACC TGC GCT GTC TAT GGT AGG TCC TTC AGT AjGT TAG TAG TOG AGC TCG
    OHt2
    irqppgkglewigdiohs 10S ATC CGG gag CCC CCA GGG AAG GGG CTG GAG TCG ATT GGG GAC ATC CA> CAT ACT
    CDH2
    GSTNYNPSLiKSRVTXGVD 1SG GGA ACC ACC AAC TAC AAC CCG TCC CTC AAjG ACT CGA GTC ACC ATA TCA GTA GAG
    T E Kfl'QFSLKGSSVTAADT 217 ACG TCC AAG AAC CAG TTC TCC CTG AAG CTG AGC TCT GTG ACC GCC GOG GAC ACG
    AVYlfCAGTFYDlLTGYYP 271 GCT GTG TAT TAC TGT GOG GGA ACG TTT TAC GAT ATT TTG ACT GGT TAT TAT CCC
    CT'KJ
    LGYHGpGTLUTVSS 525 CTI GGG TAC TCG GGC COG GGA ADC CTG GTC ACC GTC TCC TCA
    Cmtl
    FIGURA 2C
    segmento V segmento D segmento J"
    5-51
    3-10
    JK3b
    EVQiVQSGAEVKKPGESL 1 GAG GTG CAG CTO GTG GAG TCT GCA GCA GAG GTG AAA AAG CCC GCC GAG TCT CTG
    CDJU
    KlECKGSGYNfFTSlTWIGW 55 AAG ATC TCC TGT AAG GGT TCT GGA TAC AAC TTT ACC AGC TAG TGG ATC GGC TGG
    CDSi
    VRONFG^GLfcwMGIIVPG 109 GTG CGC CAjQ ATG CCC SGG AAA GGC CTG GAG TGG ATG GGG ATC ATC TAT CCT GGT
    dsotrvgpsfogqvtisa
    163 GAC TCT GAT ACC AGA TAC AGC CCG TCC TTC CAA GGC CAG GTC ACC ATC TCA GCC
    OKSISTAlTLQkSSLKASD 217 GAG AAG TCC ATC AGC ACC GCC TAC CTG CAG TGG AGC AGC CTG AAG GCC TCP GAC
    TAMY7CATPTTTFGSVAF 371 ACC GCC ATG TAT TAC TGT Ccc ACC COG ACG TAT TAC TTT GGT TOG GTG GCT TTT
    CDR3
    dgi ^ -t- m l.
    t i ngqctmvtvss 335 PAT ATC TGG GGC CAA CGG ACA ATG GlC ACC GTC TCT TCA
    CDS!
    CDB3
    FIGURA SA
    segmento V: A27
    segmento J: JK1
    eivltqspctlslspger
    1 GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA
    CDRl
    ATLSCRASQSVSSSYLAW 55 GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC AGC AGC TAC TTA GCC TGG
    CDR2
    YQQKPGQAPRLLIYGASS 109 TAC CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GGT GCA TCC AGC
    C0R2
    RATGI PDRFSGSGSGTDF 163 AGG GCC ACT GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC
    CDR3
    TLTISRLEPEDFAVYYCQ 217 ACT CTC ACC ATC AGC AGA CTG GAC CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT CAG
    CDR3
    QYGSSPPTFGQCTKVEIK 271 CAG TAT GGT AGC TCA CCT CCG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA
    FIGURA 3B
    imagen3
    segmento V: 1-69
    segmento D: 2-15
    segmento J: JH6b
    OVObVQSGABVK^TGSSV 1 CAG GTC CAG CTG GTG CAG TCT GGG GOT GAG GTG AAA AAG ACT GOG TCC TOG GTG
    CPU X
    kvsckasggtpssygihw
    S£ AAG GTC TOC TGC AAG GCT TCT GGA GGC ACC TTC AGO AGO TAT GGT ATC AAC TGG
    CDR i
    VAOAPGQGLEHMGE I IPX 109 GTG CGA CAG GcC CCT GGa CAA GGG CtT GAA TGG ATG GGA GAG ATC ATC COT atC
    CDR 2
    FGTAMVAOKFOGAVTXTA 162 ITT GGT ACA GCA AAC TAG GCA CAG AAG TTC CAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC GCG
    DE5T5TVYMELSSLRAED 217 GAC GAA. TCC ACG AGO ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC C7G AGA GCT GAG GAC
    CDR i
    tavyycardqgvvvvaat
    271 ACG HOC GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT CAG GGT GTA GTG GTG GTA CCT CCA ACC CDR 2
    fjYY YYGMDVWGQCTTVTV 325 CAC TAC TAC TAC TAC GGT ATG GAC GTC TUG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC
    S S
    275 TCC TCA
    FIGURA 4A
    segmento V: L6
    segmento J: -JKI
    EIVLT0SPATLSL5PGER 1 CAA ATT GTG TTG ACA CM TCT CCA OCC ACC CTG TCT ITS TCT CCA GGG GAA AGA
    COR 1
    atlscrasqsvssitlawy
    55 GCC ACC CTC TCC TGC AGO GCC ACT CAG ACT GTT AGO ACC TAG TTA GCC TOG TAC
    cpr a
    QGKFGQAFRLLIYDASWR 109 CAA CAG AAA CCT GGC CM GCT OCC AGO CTC CTC ATC TAT GAT GCA TCC AAC AGG
    CDR 2
    ATGI PARF3GSGSGTDFT 163 GCC ACT GGC ATC CCA GOC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GOG ACA GAG 7TC ACT
    CDA 3
    L.T XSSIjSPEDFAVlfirCQG 217 CTC ACC ATC AGC AGC CTA GAG OCT GAA GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG
    CUH 3
    RSMHPKTfGOGTKUEtK £71 CGT AGC AAC TGG CCG TGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG CAA ATC AAA
    FIGURA 4B
    imagen4
    158
    7-4.1lin.
    12C5 VH
    7-4.1 lin. 12C5 VH
    germinal OVQLVQSGSELKKFGASVKVSCKASGY
    ____
    TFTSYAMHWVR
    CDS2
    genninalo HPQQ0LENKGHI NTNTGNPTY A Q Q F T O RfVRSLDTSV
    *7-4.1 lin. germinal STAYLQISSLKAedtAVYYCAE
    OfHGb lin. germinal 12C5 VH
    _^CDR3______
    YYYYGMDVW
    G Q G T T
    JH4b lin. germinal V f V S 5 12C5 VH - . . , „
    cn
    CD
    2bS lin. germinal q & a 12C5 VX -
    LTCPASVSGSPGqs
    _CDI<’ 1________
    TISCTGTSSDVG
    Sbaiin. germinal SYNLVSWYQQMFGKAP 12CB VX -
    K L M
    I
    CDR2
    YEVSKfcPS
    G
    V
    2b3lin. germinal g 12C5 VX
    NStFSGSKSGMTASLTISGbOAED ' - ' - " - ■ E ■ - - - - - - - -
    E A D Y
    Y
    C
    _CDR3
    Sb2li_n. germinal "c S ~y" A G ~ g x-----------
    JLSlin. germinal VVFGQotKLTV
    12C5 VX - - - - M - - - L ---------
    L
    Anti- CD22 19*3 VH Anti- CD2Z CD2 2.1 VH
    4-34 lin. germinal 19*3 VI!
    m ^ am QVQLQQWGAGliIfXPSETt.SLTCAVYGGSPBGYYWS’W
    4-34 lin. germinal 19A3 VH
    CDR2 irgppgkglewigeihhsgsthynpsiiKsrvtibvd
    4-34lin. germinal 19A3 VH
    CER3 TSKNQPSLKLSSVTAADTAVYYCAR ...............................................CTFYDILtCVHP
    JH4blin. germinal 19A3 VH
    DYWGQGTLVTVES LG---P-- - - -- --
    Anti- CD22 19A3 VK Anti- am CD22.1 VK Anti- CD22 CH22.2 VK
    L6 lin. germinal 19A3 VK
    CDfil EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSS
    L6 lin. germinal 19A3 VK
    CDR.2 YLAWYQQKPGQAPRLtlYDASNRATGlPARF
    L6 lin. germinal 19A3 VK
    „ CDE3 sgsgsgtdftlxisslepedfavyycqqrsu
    LG lin. germinal JK1 lin. germinal 19A3 VK
    w p TFGOCTKVEIK
    Anti-CD22 19A3 1T57Q VH
    {CD22.2)
    secpnento V: 4-34 segmento D: 3-9 segmento J: JH4b
    4-34 lin. germinal CT322,2 VH
    qvgi>gqwgagllkpsetl
    4-34 lin. germinal CD22.2 VH
    CDR1 sltcavyggsfsgyywsvj ......................................R - - ■ S--------^
    4-34 lin. germinal CD22.2 VH
    CDR2 I R Q P PGEGIjBHIGEINHS ------------ D - Q - -
    4-34 lin. germinal CD22.2 VH
    CDR2 G3TWYHP3LKSRVTI3VD
    4-34 lin. germinal CD22,2 VH
    TSKNQPSLKLSSVTAADT
    4-34 lin. germinal CD22.2 VH
    CDR3 AVYYCU - - - - - -GTFYDlLTG'Yyp
    JH4b lin. germinal CD22.2 VH
    DYWGOGTLVTVSS
    FIGURA 6C
    163
    evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysft
    .................................---N -
    -- ZZlEZ— _CDR2______________
    SYKIGIIVROKPOKGIiEKIUJI i y p o d s d t r y
    5-El lin. germinal g 16F7 VH
    5-51 lin. germinal T JHlb lin. germinal 1SF7 VH
    PSFQGQVTI SADKfilSTAYL. QWSSLKA5D
    _CDR3
    A M Y Y C A R ' ---------------“
    AFDIWGQGTMVTVSS -_._^_TPTYYFGgv__ ........................... _
    5-51 lin. germinal 16F7 VH
    5-51 lin. germinal 16F? VH
    164
    Anti-CD22 1SF7
    VK1
    A27 lin. germinal 16F7 VEL
    „ „ „ _CDR1 EIVLTGSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYO
    A27 1in. germinal 1GF7 VK1
    _CDR2 QKPGQAPRLIfl'lfGASSRATGlPDRFSGSGSGTDFTLTI
    A27 lin. germinal JK1 lin. germinal 16F7 VK1
    CDS 3 SRLEPEDFAVYYCQQYGSSPP TFGQGTKVEIK
    165
    AID lin. germinal 15F7 VK2
    „ , CDRI EIVLTQSPDFQSVTFKEKVTIYCRA S Q S I G S
    AID lin. germinal 1SF7 VK2
    CDR2 SLttHYQQKPDQSPKLliIKYASQSFSGVPSRF
    A10 lin. germinal 16F7 VK2
    „ „ CDR3 SGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCH05SS
    AID lin. germinal lin. germinal 16F7 W2
    L P YTFGQGTKi/E IK
    166
    1“£S lin. germinal 23 C6 VH
    CDRl QVOLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISW
    1~69 lin. germinal 23C6 VH
    _CDR2 VRQAPGQGLEWMGGI I PIFGTANYAQKFQGRVTITA
    1*69 lin. germinal 2*15 lin. germinal 23C6 VH
    CDR3 DESTSXAYHELSSLRlSEDTAVYYCAR DTVVVVAAT ______ _ ^
    JjfCb lin. germinal 23CC VH
    CDR3 yyyygmdvwgqgttvtvss __________
    167
    _cdri____________
    1,$ lin. germinal EIVLTQSPATLSl.SP(;BRAlLSCRASQSVSS
    23CS VKl ................................. ............................

    2)Ot VK2 .................................................- -..................................H
    _______ CDR2
    L5 lin. germinal YLAWYOQKPGQAPRLIiIVDASNRATGI PARE

    23C6 VK1 ..........................................................................................................................................................-

    23C6 VK2 p- - - - - ------ -
    _C£>R3_____
    1,6 lin. germinal SGSGSGTDFTIfTISSLEFEDFAVYYCQQRSN
    23CG VX1 --------- ...........................................................................
    23CS VK3 ------------ ..............................................................................
    Lti lin. germinal OKI lin. germinal 23C6 VJU 23C6 VK2
    W P
    WTFGQGTKVEIK
    - P -.............................................
    FIGURA 8B
    168
    D
    —i
    LL
  25. 45.000. 000-
  26. 40.000. 000-
  27. 35.000. 000-
  28. 30.000. 000-
  29. 25.000. 000-
  30. 20.000. 000-
  31. 15.000. 000-
  32. 10.000. 000- 5.000.000-
    0
    imagen5
    Media
    P77IAb solamente dUAb+HumZap
    imagen6
    FIGURA 9
    T|
    (O'
    O
    CO
    imagen7
    Fig. 10A
    170
    imagen8
    imagen9
    19A3 23C6 12C5 15F7
    % muerte celular
    imagen10
    I
    2,0-i
    1,5-
    8 1,0- 0,5-
    0,0+~
    0,001
    ELISA vs CD22 ECD
    ♦
    imagen11
    A HulgG!
    T CD22.1.g1f ♦ CD22.2.g1f D 19 A3
    ^"l1 I ^ li |
    0,01 0,1 1 10
    Ab (ug/mJ)
    172
    Matriz FACS: celulas CHO-CD22
    imagen12
    ► CD22.1.g1f • CD22.2.g1f ■ HulgG1(1)
    173
    20000-
    15000-
    n
    s
    o 10000-
    <D
    o
    5000-
    04—
    0,001
    Matriz FACS: celulasRaji
    ♦ CD22.1.g1f
    * CD22.2.g1f u hlgG1
    imagen13
    0,01 0,1 1 10 Anticuerpo ug/ml
    imagen14
    “i
    100
    174
    Union a CD22 d1d2-mFc Formato ELISA indirecto
    imagen15
    Volumen tumoral (LWH/2)
    Volumen tumoral medio Raji 1416-001
    imagen16
    ■jVehiculo
    Ab-Citotoxina A 0.3 Control
    CD 2 2.2Ci to toxins A 0.3
    CD22.1-Citotoxm:t A 0.18
    Dias despiies de la dosis
    segmento V segmento D segmento J
    1-69
    7-27
    JH4b
    qVQLVQSGAEVKKPGSSV 1 CAG GTC CAG TTG CTG CM TCT GGG GCT GAG GTG SAG AAG OCT GGG TCC TOG GTC
    KVSCKPSGDTFSNTfAl S N 55 AAG GTC TCC TGC AAG CCT TCT GGA GAC ACC TTC AGC AAC TAT GCT ATC AjGC TGG
    vrqapgqglewmgriipi
    10£ GTC CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG GCA AGG ATC ATC CCT ATC
    L G M A I YAPKyQGRVTITA 163 CTT GGT ATG GCT ATC TAC GCA CCG AAG TTC CAG GGC AGA GTT ACG ATT ACC GCG
    OKSTHTAPMDLTStYPiJD 217 GAC AAA TCC ACG AAC ACA GCC TTC ATG GAT CTT ACC AGC CTG TAT TTT CAG GAC
    TAVYVCARAPTYHGSKDV 271 ACG GCC GTG TAT TAC TCT GCG AGA GCC CCA ACT TAC TGG GGA ICG AAG GAC TAC
    CDE3
    PDYWGQGTLVTVS5 325 TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA
    CDRl
    CDR3
    CDRJ
    CDR3
    FIGURA 17A
    imagen17
    imagen18
    segmento V segmento D segmento J
    4-34
    3-9
    JH4b
    QV0LQQWGAGLLKF5ETL 1 CAG GTG CAB CTA CAG CAG TGG GGC GCA GGA CTG TIG AAG CCT TCG GAG ACC CTG
    CDR1
    SLTCAVYGGSPSGHYWSW 55 TCC CTC ACC TGC GOT GTC TAT GGT GGG TCC TTC AGT GGT CAC TAC TGG AGC TGG
    cam
    JftQSPGKGLEWIGETPES 109 ATC CGC CAG TCC CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG ATT GGG GAA ACC CAT CAT AGT
    CDR2
    GSrtJYKFSIrKSRVTlSlG 163 GGA AGC ACC AAC TAC AAT CCG TCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA ATA GAC
    T3KVQFSLKLS5VTAADT 217 ACG TCC AAG AAT CAG TTC TCC CTG AAG CTG AGC TCT GTG ACC GCC GCG GAC ACG
    AVYYCARTVYDIlTDYYP 271 GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGG ACG TAT TAC GAT ATT TTG ACT GAT TAT TAC CCC
    CDR3
    F □ S UGOGTI-VTVS S 325 TTT GAC TCC TGG GGC CAG CGA AOC CTG GTC ACC GTC TCC TCA
    0133
    FIGURA ISA
    segmento V: 4-24
    segmento D : 3.-9
    segmento J: JTl4b
    QVO&QQWGAfl LLKFSETL 1 CAG GTS CAS CTA CAS CAS TGS GGC GCA GCA CTG TTG AAG CCT TOG SAG ACC CTG
    CDKl
    ScrCAVYGGSFSGfiYWSTl
    SS TCC CTC AOC TGC GCT CTC TAT GGT GGG TCC TTC AST GCT CAC TAC TGG ACC TGS
    CEE2
    I RQSAGKGLSWIGEIDHS ICS ATC CGC CAG TCC CCA GGS AAG GCA CTC GAG TGG ATT GGG GAA A?C CAT CAT ACT
    CDA2
    CaTHYHPSLKflRVTlSVD
    162 GCA AGC ACC AAC TAC AAT CCG TCC CTC AAG AGT CGA <JTC ACC ATA TCA GTA SAC
    TS knqfslklssvtaadt
    211 ACG TCC AAG AAC CAG TTC TCC CTG AAG CTG AGC TCT CTC ACC GCC GCG GAC ACS
    CDR3
    AMYVCARTYVDX LTDTVP 2 71 GCT ATG TAT TAC TGT GCG AOC ACS TAT TAC GAT ATT TTG ACT SAT TAT TAC CCC
    CER3
    FDSHGQST1VTVSS 325 TTT GAC TCC TGfl GCC CAS GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA
    FIGURA 1SB
    segmento V: secpnento J :
    L6
    JK4
    E IVtTQSPATLSLSFGER 1 GAA ATT GTG TTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA
    CDRl
    AT G 5 CftASQSVSGTLAWY 55 GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGT GTT AGC GGC TAC TTA GCC TGG TAC
    QUO
    GOKPGQAFRtL: Y D V S Y K
    109 CAA CAG AAA CCT GGC CAG GOT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GAT GTA TCC TAC AGG
    cuni
    A T G J tiVftPSGSGSGTDFT 163 GCC ACT GGC ATC CTA GTC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GCC ACA GAC TTC ACT
    CTR3
    I- TISSLEPEfiPAVYYCQQ 217 CTC ACC ATC AGC AGC CTA GAG CCT CAA GAT TTT GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAG
    CDR3
    RSWWPITFGGGTKVEIK 271 CCT AGC AAC TGG CCC ATC ACT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA
    FIGURA ISC
    182
    segmento Vt 1-69 segmento D: 7-27 segmento Ji
    _CDR 1___
    1-69 lin. germinal QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVS C K A S G (5 T f S S i A I SW 456 VH - -- --- - - - - - - - - - - - p - - D - - - N - - ~ - -
    C0R2
    1-6 9 lin. germinal VRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITA
    4G6 VH -----...........................................................................................................................
    _CDR3____________
    1-6 9 lin. germinal DKSTSTAYMELSSLRfiEDTAVYYCAR
    JH4blin. germinal Y
    4G6 VH - - - "N-“F-D“T - - Y F - - - - - » - - - -APTYWGSKD-
    VJH4blin. germinal FDYWGQGTLVTVS S
    456 VH --------------
    FIGURA 19A
    segmento V: segmento J:
    LIS
    JK2
    oo
    co
    Lie lin. VKl
    CDR1
    geminal AIQLTQSPSELSASVGDRVTITCRA S Q G I S S A L A MQQK .......................................................................................................................- - ’ D - - - G ^ -.........................
    CDR2
    LIS lin. germinal PGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL
    4G6 VKl
    LIS lin. germinal cJK2 lin. germinal 4G6 VKl
    CDR3
    QPEDfATYYCQQFNS
    YTFGQGTKLETK --D__._-___.-_FP-........................- - - - -
    FIGURA 19B
    imagen19
    4-34 lin. geminal QVQLQQWGAGLLKFS ETL 21F6 VHI ..........- - - - -.............
    CDR1
    4-34lin. geminal SLTCAVYGGSFSGYYWSW 21FS VHI h----
    _CDR2____
    4-34 lin. geminal IKQPPGKGLEWXGEIHHS 21F6 VHI - - g - - - - - - T D - -
    _CDR 2
    4-34 lin. geminal GSTHYW PSLKSEVTI SVD 21F6 VHI - -........- . - ..........t .
    4-34 lin. geminal T S K H fi F S L K L S S V T U D T 21.F6 VHI
    CDR3
    4-34 lin. geminal A V Y Y C A R ....
    21P6 VHI . - TYY0ILTDYYP
    JH4b lin. 21F6 VHI
    FIGURA 20A
    geminal FDYWGQGTLVTVS S - - S - - - - - ■----------- -
    imagen20
    187
    M lin. germinal 21F6 VK1
    eivltqspatls
    COR 1
    LSPGERATLSCRASQSVS
    L£ lin. germinal 2IF6 VK1
    __ COSP
    yoawyqqkpcqaprlliyda s“n r a t g I P A R F
    " ............................. ................-V-Y--------------L V - -
    LG lin. germinal 21FC VK1
    SGSGSGTDFTLTIS
    _CDR3_____
    SLEPEDFAVYYCQQRSN
    LG lin. germinal ft p
    JX4lin. germinal TFGGGTKVEIK
    21F6 VKl --r.--.____.
    FIGURA
    20C
    Q oo
    188
    Media Geo
    Figura 21
    imagen21
    log (concentration ug/ml)
    189
    Anticuerpo ug/'iul
    M Geo. de IF
    imagen22
    o
    a
    0
    1
    n
    u
    i*
    imagen23
    0)
    ro
    ro
    190
    . de IF
    Figura 23
    CelulasRaji
    SOOOn 8000- 7000- 6000- 5000- § 4000-
    O 3000- 2 2000- 1000-
    0+-----------1------------1----------1 ■ ’I------------1
    0,001 ty)1 0,1 1 10 100
    Anticuerpo ug/ml
    imagen24
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