ES2660698T3 - Síntesis de HMO - Google Patents
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Abstract
Una célula bacteriana para ser cultivada de forma estable en un medio para la producción de oligosacáridos, siendo dichos oligosacáridos fucosil-lactosa, transformándose la célula para comprender al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una fucosil-transferasa, caracterizada por que la célula se transforma además para comprender al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la familia de Transportadores de Eflujo de Azúcar (SET), proteína la cual se sobreexpresa, conduciendo la sobreexpresión a una exportación de los oligosacáridos.
Description
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Ejemplo 1: Síntesis de oligosacáridos y transporte al interior de una célula bacteriana gramnegativa
La Fig. 1 muestra una sección de una célula bacteriana gramnegativa 10. Una célula bacteriana gramnegativa 10 según la invención comprende una membrana externa 11, una membrana plasmática 12, un espacio periplásmico 13, situado entre dicha membrana externa 11 y dicha membrana plasmática 12, y un citosol 14, encerrado en dicha membrana plasmática 12. La membrana externa comprende porinas a través de las cuales pueden pasar compuestos solubles en agua desde el medio 16 al espacio periplásmico 13, y viceversa.
Según una realización de la presente invención, la membrana plasmática comprende FucP, que sirve como un primer transportador 17 de educto, LacY, que sirve como un segundo transportador 18 de educto, y SetA, que sirve como un exportador de producto.
Además, en el citosol 14 están comprendidos Fkp, que sirve como una nucleotidiltransferasa 20, y FutAco, que sirve como una glucosiltransferasa 21.
Según esta realización, cuando se suministran al medio 16 fucosa, como un primer educto 22, y lactosa, como un segundo educto 23, entran en el espacio periplásmico 13 a través de la porina 15. Después, el primer educto 22 es transportado por el primer transportador 17 de educto al citosol 14. En el citosol, el primer educto 22 es modificado por la nucleotidiltransferasa 20, dando como resultado un primer educto 24 nucleotidilado, GDP-fucosa.
El segundo educto 23 es importado al citosol 14 por el segundo importador 15 de educto.
Después, la glucosiltransferasa 21 cataliza una reacción entre el primer educto nucleotidilado, la GDP-fucosa, y el segundo educto, lactosa, dando como resultado un oligosacárido 25, 3-fucosil-lactosa, y GDP (no mostrado).
Subsiguientemente, el oligosacárido 25 es exportado desde el citosol 14 por el exportador 19 de producto (SetA) al espacio periplásmico 13, y puede abandonar el espacio periplásmico 13 vía las porinas 15, entrando al medio 16.
Ejemplo 2: Material ymétodos
2.1. Construcción de plásmidos de expresión y desarrollo de cepas de E. coli
Para el desarrollo de la cepa de producción de E. coli, se usó como cepa hospedante inicial JM109(DE3) (Promega; www.promega.com). Todos los cebadores oligonucleotídicos usados para los procedimientos de clonación se dan en la Tabla 1. Los plásmidos pACYC-lacY y pACYC-lacY-setA se construyeron como sigue: los genes lacY (corresponde al número de acceso de GenBank ACB02461) (GenBank; www.ncbi.nlm.nih.gov) y setA (corresponde al número de acceso de GenBank YP_025293) (GenBank) se amplificaron a partir de ADN genómico de E. coli TOP10 (Invitrogen; www.invitrogen.com) usando cebadores lacY NcoI directo/lacY EcoRI inverso y setA NdeI directo/setA XhoI inverso. Los productos de la PCR se sometieron a digestión de restricción con las enzimas indicadas, y se ligaron con el vector de expresión digerido correspondientemente pACYCDuet-1 (Novagen; www.merckbiosciences.co.uk).
Los plásmidos resultantes se comprobaron mediante digestión de restricción, electroforesis en gel de agarosa, así como secuenciación con los cebadores pACYCduetUP1, DuetDOWN-1-Primer, DuetUP2-Primer y T7-Terminator-Primer, para la inserción correcta de los genes (dato no mostrado). Los plásmidos pCOLA-fkp-fucP y pET-futAco se han construido previamente (Parkot et al., 2008). Para obtener las cepas JM00, JM01 y JM02, se introdujeron diferentes combinaciones de plásmidos en E. coli JM109(DE3) mediante electroporación (Dower et al., 1988). Todos los plásmidos y cepas bacterianas se dan en la Tabla 2.
2.2. Inactivación del catabolismo de fucosa en E. coli:
Para evitar la degradación de fucosa suministrada externamente, se suprimió del cromosoma de E. coli JM109(DE3) el gen fucA que codifica la enzima catabólica clave L-fuculosa-1-fosfato aldolasa. Todos los cebadores oligonucleotídicos usados para los procedimientos de mutagénesis se dan en la Tabla 1. Para la construcción del mutante de supresión de fucA, se aplicó la metodología de Datsenko y Wanner (Datsenko y Wanner, 2000), usando los cebadores fucA-knock-f y fucA-knock-r. La supresión correcta de fucA se confirmó mediante PCR usando los cebadores fucA-control-f y fucA-control-r que flanquean el sitio de inserción cromosómica, y el fenotipo negativo para fucosa se verificó colocando las bacterias en placas en agar mínimo M9 (Sambrook y Russell, 2001) con fucosa suplementada como la única fuente de carbono (dato no mostrado).
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obtener tiempos de retención constantes, y después se regeneró con NaOH 10 mM durante 20 min. Para todas las muestras analizadas, se usaron 20 l de disoluciones diluidas con dH2O 1:2 para el análisis de HPAEC. El análisis vía HPAEC-PAD mostró tiempos de retención en la columna de HPLC usada de aproximadamente 3,5 min. para el patrón de L-fucosa, aprox. 15 min. para el patrón de lactosa, y aprox. 11-12 min. para el patrón de 3-fucosil-lactosa (dato no mostrado). Los patrones de las sustancias glicerol y glucosa, que se añaden al medio de cultivo como fuente de carbono, se registraron con un tiempo de retención de aprox. 1,5 min. y 7-8 min., respectivamente.
Ejemplo 3: Producción de 3-fucosil-lactosa y secreción dependiente de SetA en el medio de cultivo por E. coli recombinante
El objetivo de este experimento fue investigar la exportación de 3-fucosil-lactosa intracelular mediada por SetA. Para los experimentos de fermentación se usaron las cepas JM01 y JM02 de E. coli (véase la Tabla 2). Las cepas JM01 y JM02, que expresan ambas las enzimas Fkp y FutAco (1,3-fucosiltransferasa), así como las proteínas transportadoras FucP y LacY, difieren solamente en la expresión del transportador de SetA. JM01 no sobreproduce SetA, y JM02 sobreproduce SetA.
La Fig. 2 muestra las cantidades de 3-fucosil-lactosa en la masa celular húmeda y en el sobrenadante de los cultivos de JM01 y JM02 de E. coli, determinado mediante el análisis de HPAEC-PAD.
Para determinar el efecto de la sobreexpresión de SetA, se llevaron a cabo medidas a 7, 24 y 32 horas después de la inducción de la expresión de fkp, fucP, lacY, futAco y setA.
En la figura, las fracciones extracelulares de 3-fucosil-lactosa medida en E. coli JM01 (SetA no se sobreexpresó) se representan mediante las columnas I, representándose las fracciones intracelulares mediante las columnas II. En el caso de E. coli JM02 (sobreexpresión de SetA), las fracciones extracelulares de 3-fucosil-lactosa se representan mediante las columnas III, y las fracciones intracelulares se representan mediante las columnas IV. Todos los valores representan los valores medios de experimentos por duplicado, indicando las barras de error las desviaciones estándar respectivas.
Estas medidas muestran que la cepa JM01, que no sobreexpresa SetA, acumula 3-fucosil-lactosa en la fracción citosólica.
Por el contrario, la concentración intracelular de 3-fucosil-lactosa en el caso de la cepa JM002, que sobreexpresa setA, está por debajo del nivel de detección.
Además, los sobrenadantes procedentes de los cultivos de JM01 y JM02 exhiben un cierto contenido de 3-fucosillactosa. De ese modo, sin embargo, el contenido de 3-fucosil-lactosa encontrado en el sobrenadante del cultivo de JM02 está enormemente incrementado con respecto al contenido de 3-fucosil-lactosa encontrada en el sobrenadante del cultivo de JM01. Mientras que después de 32 h la concentración de 3-fucosil-lactosa en el sobrenadante de JM01 es aproximadamente 21 mg l-1, la concentración de 3-fucosil-lactosa en el caso de JM02 está por encima de 51 mg l-1 .
La comparación de las cantidades totales de 3-fucosil-lactosa en cultivos de E. coli JM01 y JM02 se representa en la Fig. 3.
Aquí, la cantidad total de 3-fucosil-lactosa en cultivos de E. coli JM01 está representada por las columnas I, y la cantidad total de 3-fucosil-lactosa en cultivos de E. coli JM02 está representada por las columnas II. Nuevamente, se representan los valores medios de experimentos por duplicado.
Después de 32 h de incubación, la cepa JM02 produce con 51,68 mg l-1 aproximadamente 57% más de 3-fucosillactosa en total que la cepa JM01 (32,99 mg l-1).
Ejemplo 4: Discusión
Los resultados experimentales del análisis de HPAEC-PAD muestran que existen fuertes diferencias en la síntesis y transporte de 3-fucosil-lactosa entre las cepas JM01, sin expresión de SetA, y JM02, que sobreexpresa SetA.
Para empezar, 3-fucosil-lactosa no es detectable en la masa húmeda celular del cultivo de JM02, mientras que la concentración de 3-fucosil-lactosa se puede medir en el sobrenadante.
Esto indica claramente que la sobreexpresión de SetA en E. coli conduce a una exportación extremadamente eficiente de 3-fucosil-lactosa desde la célula.
Por tanto, los inventores han mostrado que SetA, contrariamente a lo que se habría de esperar de la técnica anterior, puede exportar eficientemente oligosacáridos más grandes, presentando, en el presente caso, tres subunidades y una masa molecular de 488 g/mol.
Por el contrario, en la masa celular húmeda de JM01, se detecta una cantidad considerable de 3-fucosil-lactosa, mientras que solamente está presente comparativamente poca 3-fucosil-lactosa en el sobrenadante.
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