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ES2651692T3 - Anticuerpos anti-TLR4 y sus usos - Google Patents

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ES2651692T3
ES2651692T3 ES13715871.3T ES13715871T ES2651692T3 ES 2651692 T3 ES2651692 T3 ES 2651692T3 ES 13715871 T ES13715871 T ES 13715871T ES 2651692 T3 ES2651692 T3 ES 2651692T3
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ES
Spain
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seq
amino acid
acid sequence
antibody
tlr4
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ES13715871.3T
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Francois Rousseau
Jérémy LOYAU
Nicolas Fischer
Greg Elson
Marie Kosco-Vilbois
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Novimmune SA
Original Assignee
Novimmune SA
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Publication date
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Abstract

Un anticuerpo aislado que se une específicamente al receptor 4 tipo Toll (TLR4), en el que el anticuerpo comprende una combinación de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 seleccionados del grupo que consiste en: a) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; b) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; c) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; d) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; e) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; f) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; g) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, un CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y un CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61; h) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63; i) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64; y j) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoácido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 65, en donde el anticuerpo exhibe un valor IC50 para bloquear TLR4 humana que es más potente que el valor de IC50 exhibido por un anticuerpo de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable de la SEQ ID NO. : 4 cuando se mide en un ensayo ELISA de sangre completa que mide la producción de IL-6 después de que las muestras de sangre se incuban con el anticuerpo y el anticuerpo de referencia.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos anti-TLR4 y sus usos Campo tecnico de la invencion
Esta invencion se refiere generalmente a anticuerpos que se unen espedficamente al receptor 4 tipo Toll (TLR-4), y al uso de anticuerpos anti-TLR4 como agentes terapeuticos y de diagnostico.
Antecedentes de la invencion
Los receptores Toll, descubiertos primero en Drosophila, son protema transmembrana tipo I que tiene repeticiones ricas en leucina (LRR) en la porcion extracelular de la protema, y uno o dos dominios ricos en cistema. Los homologos en mairnferos de los receptores Toll de Drosophila son conocidos como "receptores tipo Toll" (TLR). Los TLR desempenan un papel en la inmunidad innata mediante el reconocimiento de partmulas microbianas y activacion de celulas inmunes contra la fuente de estas partmulas microbianas.
En seres humanos, se han identificado once receptores tipo Toll, TLR 1-11, y se caracterizan por la homologfa de sus dominios intracelulares con aquellos del receptor de IL-1 y por la presencia de repeticiones extracelulares ricas en leucina. Los diferentes tipos de TLR se activan por diferentes tipos de partmulas microbianas. Por ejemplo, TLR4 se activa principalmente por lipopolisacarido (LPS), mientras que TLR2 se activa por acido lipoteicoico (LTA), lipoarabinomanano (LAM); lipoprotema (BLP) y peptidoglicanos (PGN). Tambien se han identificado homologos del receptor Toll, tales como RP105.
Se ha demostrado que TLR4 se asocia con una protema accesoria, protema 2 de diferenciacion mieloide (MD-2). Se ha encontrado que esta protema interactua directamente con TLR4, y MD-2 tiene la capacidad de permitir modificaciones postraduccionales de TLR4, asf como tambien facilita su transporte a la superficie celular. TLR4 y MD-2 forman un complejo en la superficie de la celula.
El lipopolisacarido (LPS), un componente de bacterias Gram negativas, es una partmula microbiana capaz de activar fuertemente el sistema inmune innato. LPS suministra senales a las celulas inmunes a traves de su receptor multicadena, que comprende el complejo TLR4/MD-2 como el principal componente de senalizacion.
De acuerdo con esto, existe la necesidad de metodos y composiciones que se unan a TLR4 y modulen la senalizacion que es mediada por el complejo TLR4/MD-2.
Resumen de la invencion
La descripcion proporciona anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor TLR4/MD-2 de humano y/o mono cynomolgus expresado en la superficie celular. Los anticuerpos son capaces de bloquear, por ejemplo, neutralizar, la activacion del receptor y la posterior senalizacion intracelular inducida por ligandos de TLR4, por ejemplo, LPS. Los anticuerpos de la divulgacion incluyen anticuerpos que se unen al complejo receptor TLR4/MD-2 de humano y mono cynomolgus y tambien se unen a tLR4 independientemente de la presencia de MD-2.
La presente invencion, como se define en las reivindicaciones adjuntas, proporciona anticuerpos monoclonales que se unen espedficamente al receptor TLR4/MD-2 de humano y/o mono cynomolgus expresado en la superficie celular y capaz de bloquear la activacion del receptor y la senalizacion intracelular subsiguiente inducida por LPS. Los ejemplos de anticuerpos monoclonales incluyen: 1E11.C1, 1E11.C2, 1E11.C3, 1E11.C4, 1E11.C5, 1E11.C6, 1E11.E1, 1E11.E2, 1E11.E3, 1E11.E4,1E11.E5, 1E11. .C2E1, 1E11.C2E3, 1E11.C2E4 y 1E11.C2E5.
Tambien se proporcionan en un aspecto de esta descripcion anticuerpos monoclonales: 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10, 1E11, 1E11 N103D, 1G12.
Estos anticuerpos tienen especificidades distintas. Algunos anticuerpos muestran especificidad para tanto para el TLR4 humano y mono cynomolgus y/o para el complejo receptor TLR4/MD-2 humano y de mono cynomolgus, y se ha demostrado que inhiben la activacion del receptor y la senalizacion intracelular subsiguiente a traves de LPS. Por ejemplo, 1C12, 1E11, 1E11 N103D, 1E11.C1, 1E11.C2, 1E11.C3, 1E11.C4, 1E11.C5, 1E11.C6, 1E11.C2E1, 1E11.C2E2, 1E11.C2E3, 1E11.C2E4 y 1E11.C2E5 se unen tanto a TLR4 de humano como de mono cynomolgus independientemente de la presencia de MD-2 de humano o de mono cynomolgus. 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C1o, 1D10 y 1G12 solo se unen a TLR4 de mono cynomolgus independientemente de la presencia de MD-2 de mono cynomolgus. 1E11.E1, 1E11.E2, 1E11.E3, 1E11.E4 y 1E11.E5 se unen unicamente a TLR4 humano independientemente de la presencia de MD-2 de humano. Estos anticuerpos se denominan respectivamente aqrn anticuerpos TLR4.
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Los anticuerpos humanizados de la invencion contienen una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 67, 69, 71, 73, 75, 77, 89, 93, 97 o 101. Los anticuerpos humanizados de la invencion contiene una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 4, 91, 95, 99 o 103.
Tambien se proporcionan en un aspecto de esta descripcion anticuerpos humanizados que contienen una region variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 o 22. y una region variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 79, 81, 83, 85 o 87.
De acuerdo con la descripcion, las tres CDR de cadena pesada incluyen una secuencia de aminoacidos al menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o mas identica a una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDR1 de VH, tambien denominada aqu CDRH1) seleccionada del grupo que consiste en G(F/Y)PI(R/G/W)(Y/F/G)GYS (SEQ ID NO: 110), GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); GFPIRYGYS (SEQ ID NO: 55); GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 56); GYPIRHGYS (SEQ ID NO: 57); GFPIGQGYS (SEQ ID NO: 58); GYPIWGGYS (SEQ ID NO: 59) y GYPIGGGYS (SEQ ID NO: 60), una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDR2 de VH, tambien denominada en este documento CDRH2), de IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y una secuencia de aminoacidos de la region 3 determinante de la complementariedad de cadena pesada variable (Vh CDR3, tambien denominada en este documento CDRH3) seleccionada del grupo que consiste en ARKDSG(N/Q/D/E)X-|X2PY (SEQ ID NO: 111) donde X1 y X2 son cada uno independientemente cualquier aminoacido hidrofobo, ARKdSgNYFPY (SEQ ID NO: 27); ARKDSGRLLPY (SEQ ID NO: 28); ARKDSGKWLPY (SEQ ID NO: 29); ARKDSGHLMPY (SEQ ID NO: 30); ARKDSGHNYPY (SEQ ID NO: 31); ARKDSGKNFPY (SEQ ID NO: 32); ARKDSGQLFPY (SEQ ID NO: 33); ARKDSGHNLPY (SEQ ID NO: 34); ARKDSGDYFPY (SEQ ID NO: 35) y ARKDSGRYWPY (SEQ ID NO: 36). Los tres CDR de cadena ligera incluyen una secuencia de aminoacidos al menos 90%, 92%, 95%, 97% 98%, 99% o mas identica a una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDR1 de VL, tambien denominada en este documento CDRL1 ) de QSISDH (SEQ ID NO: 37); una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDR2 de VL, tambien denominada en este documento CDRL2) de YAS (SEQ ID NO: 38); y una secuencia de aminoacidos de la region 3 que determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDR3 de VL, tambien denominada en este documento CDRL3) seleccionada del grupo que consiste en QQG(Y/N)(D/E)(F/A)PXT (SEQ ID NO : 112) en donde X es cualquier aminoacido hidrofobo, QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39); QQGNDFPVT (SEQ ID NO: 61); QQGYDEPFT (SEQ ID NO: 62); QQGYDFPFT (SEQ ID NO: 63); QQGYDYPFT (sEq ID NO: 64) y QQGYEFPFT (SeQ ID NO: 65). Los anticuerpos se unen al complejo TLR4/MD-2 humano y de mono cynomolgus, a TLR4 de humano y mono cynomolgus cuando no forman complejos con MD-2 de humano y mono cynomolgus, al complejo TLR4/MD-2, a TLR4 de humano cuando no forma complejo con MD-2 humano, al complejo de TLR4/MD-2 humano y de mono cynomolgus o TLR4 de mono cynomolgus cuando no forma complejo con MD-2 de mono cynomolgus.
Los anticuerpos anti-TLR4 de la divulgacion tambien incluyen anticuerpos que incluyen una secuencia de aminoacidos variable de cadena pesada que es al menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98% o 99% identica a la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 89, 93, 97 o 101, y/o una secuencia de aminoacidos variable de cadena ligera que es al menos 90%, 92%, 95%, 97%, 98% o 99% identica a la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NOs: 4, 79, 81, 83, 85 o 87.
Los anticuerpos de la invencion y la divulgacion se unen espedficamente a TLR4 de humano y/o de mono cynomolgus y/o a los complejos TLR4/MD-2 de humano y/o de mono cynomolgus, en donde el anticuerpo se une a un epftopo que incluye uno o mas residuos de aminoacidos en TLR4 de humano y/o mono cynomolgus entre los residuos 289 y 375 de la sEq ID NO: 23 (TLR4 humano) y/o la SEQ ID NO: 24 (TLR4 de mono cynomolgus). Por ejemplo, los anticuerpos de TLR4 se unen espedficamente a un epftopo que incluye el residuo 349 de la SEQ ID NO: 23 (humano) y/o la SEQ ID NO: 24 (mono cynomolgus). En algunas realizaciones, el epftopo tambien incluye residuos adicionales, por ejemplo, residuos seleccionados del grupo que consiste en al menos los residuos 328 y 329 de la SEQ ID NO: 23 (humano) y/o SEQ ID NO: 24 (mono cynomolgus); al menos el residuo 351 de la SEQ iD NO: 23 (humano) y/o SEQ ID NO: 24 (cynomolgus); y al menos los residuos 369 a 371 de la SEQ ID NO: 23 (humano) y/o la sEQ ID NO: 24 (mono cynomolgus), y cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado descrito se une espedficamente al receptor 4 tipo Toll (TLR4), donde el anticuerpo se une a un epftopo que incluye al menos el residuo 349 de la SEQ ID NO: 23 y un epftopo que incluye al menos un residuo 349 de la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye una cadena pesada con tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que incluyen una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante de la complementariedad de cadena pesada variable (CDRH1) de GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDRH2) de IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y una secuencia de aminoacidos de la region 3 (CDRH3) determinante de complementariedad de cadena pesada variable de ARKDSG(X-i)(X2)(X3)PY (SEQ ID NO: 111), en donde X1 es N, Q, D o E, X2 es cualquier aminoacido hidrofobo, y X3 es cualquier aminoacido hidrofobo; y una cadena ligera con tres CDR que incluye una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante de complementariedad de cadena ligera variable
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(CDRL1) de QSISDH (SEQ ID NO: 37); una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinate de complementariedad de cadena ligera variable (CDRL2) de YAS (SEQ ID NO: 38); y una secuencia de aminoacidos de la region 3 determinate de complementariedad (CDRL3) de QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39). En algunas realizaciones, el epftopo incluye ademas al menos los residuos 328 y 329 de la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el epftopo incluye ademas al menos el residuo 351 de la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el epftopo incluye ademas uno o mas residuos entre los residuos 369 a 371 de la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el epftopo incluye ademas al menos los residuos 369 a 371 de la SEQ ID NO : 23 y SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une espetficamente a un epftopo que incluye al menos los residuos 328, 329, 349, 351 y 369 a 371 de la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye ademas una sustitucion de aminoacidos en la region constante de la cadena pesada gamma en la posicion del aminoacido de la EU 325 y una sustitucion de aminoacido en la posicion del aminoacido EU 328. En algunas realizaciones, el aminoacido sustituido en la posicion del aminoacido EU 325 es serina, y en donde el aminoacido sustituido en la posicion del aminoacido EU 328 es fenilalanina.
Tambien se describen anticuerpos aislados que se unen espetficamente al receptor 4 tipo Toll (TLR4), en donde el anticuerpo se une a un epftopo que incluye al menos el residuo 349 de la SEQ ID NO: 23, y en donde el anticuerpo muestra un valor EC50 para union a TLR4 humano que es menor que el valor EC50 exhibido por el anticuerpo de referencia que tiene la secuencia de aminoacidos de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el valor de EC50 para union a TLR4 humano se determina mediante un ELISA competitivo. En algunas realizaciones, el anticuerpo exhibe un valor EC50 para union a TLR4 humano que es al menos diez veces menor que el valor EC50 exhibido por el anticuerpo de referencia. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une espetficamente adicionalmente a un epftopo que incluye al menos el residuo 349 de la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye una cadena pesada con tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que incluye una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDRH1) de G(X1)PI(X2)(X3)GYS (SEQ ID NO: 110), en donde X1 es F o Y, X2 es R, G o W, X3 es Y, F o G; una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinante complementariedad de cadena pesada variable (CDRH2) de IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y una secuencia de aminoacidos de la region 3 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDRH3) de ARKDSG(X-i)(X2)(X3)PY (SEQ ID NO: 111), en donde X1 es N, Q, D o E, X2 es cualquier aminoacido hidrofobo, y X3 es cualquier aminoacido hidrofobo; y una cadena ligera con tres CDR que incluyen una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante complementariedad de cadena ligera variable (CDRL1) de QSISDH (SEQ ID NO: 37); una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDRL2) de YAS (SEQ ID NO: 38); y una region 3 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDRL3) que incluye la secuencia de aminoacidos de QQG(X-i)(X2)(X3)P(X4)T (SEQ ID NO: 112), donde X1 es Y o N, X2 es D o E, X3 es F o Y, y X4 es cualquier aminoacido hidrofobo, o la secuencia de aminoacidos de QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39). En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye ademas una sustitucion de aminoacido en la region constante de cadena pesada gamma en la posicion del aminoacido EU 325 y una sustitucion de aminoacido en la posicion del aminoacido EU 328. En algunas realizaciones, el aminoacido sustituido en la posicion del aminoacido EU 325 es serina, y en donde el aminoacido sustituido en la posicion del aminoacido EU 328 es fenilalanina. En algunas realizaciones, los anticuerpos TLR4 tambien se unen al complejo TLR4/MD-2 de humano y/o mono cynomolgus.
Tambien se describen anticuerpos aislados que se unen espetficamente al receptor 4 tipo Toll (TLR4), en donde el anticuerpo se une a un epftopo que incluye al menos el residuo 349 de la SEQ ID NO: 23 y se une a un epftopo que incluye al menos el residuo 349 de la SEQ ID NO: 24, y en donde el anticuerpo exhibe un valor EC50 para union a TLR4 humano que es menor que el valor EC50 exhibido por un anticuerpo de referencia que tiene la secuencia de aminoacidos de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el valor EC50 para union a TLR4 humano se determina mediante un ELISA de competicion. En algunas realizaciones, el anticuerpo exhibe un valor EC50 para union a TLR4 humano que es al menos diez veces menor que el valor de EC50 exhibido por el anticuerpo de referencia. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une espetficamente adicionalmente a un epftopo que incluye al menos el residuo 349 de la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye una cadena pesada con tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que incluye una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDRH1) de G(X-i)PI(X2)(X3)GYS (SEQ ID NO: 110), en donde X1 es F o Y, X2 es R, G o W, X3 es Y, F o G; una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDRH2) de IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y una secuencia de aminoacidos de la region 3 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDRH3) de ARKDSG (X-i)(X2)(X3)PY (SEQ ID NO: 111), donde X1 es N, Q, D o E, X2 es cualquier aminoacido hidrofobo, y X3 es cualquier aminoacido hidrofobo; y una cadena ligera con tres CDR que incluye una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDRL1) de QSISDH (SEQ ID NO: 37); una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDRL2) de YAS (SEQ ID NO: 38); y una region 3 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDRL3) que incluye la secuencia de aminoacidos QQG(X1)(X2)(Xs)P(X4)T (SEQ ID NO: 112), en donde X1 es Y o N, X2 es D o E, X3 es F o Y, y X4 es cualquier aminoacido hidrofobo, o la secuencia de aminoacidos QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39). En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye ademas una sustitucion de aminoacidos en la region constante de cadena pesada gamma en la posicion del aminoacido EU 325 y una sustitucion de aminoacido en la posicion del aminoacido EU 328.
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En algunas realizaciones, el aminoacido sustituido en la posicion de aminoacido EU 325 es serina, y en donde el aminoacido sustituido en la posicion del aminoacido EU 328 es fenilalanina. En algunas realizaciones, los anticuerpos de TLR4 tambien se unen al complejo TLR4/MD-2 de humano y/o mono cynomolgus.
Tambien se describen anticuerpos aislados que se unen espedficamente al receptor 4 tipo Toll (TLR4) de la SEQ ID NO: 23, en donde el anticuerpo en la cadena principal de IgG1 Fe humana de tipo silvestre exhibe un valor IC50 para la inhibicion de la activacion de LPS de TLR4 humano en un ensayo de sangre completa humana que es menor que el valor IC50 exhibido por un anticuerpo de referencia que tiene la secuencia de aminoacidos de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el anticuerpo exhibe un valor de IC50 para la inhibicion de la activacion de LPS de TLR4 humano que es al menos dos veces menor que el valor IC50 exhibido por el anticuerpo de referencia. En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye una cadena pesada con tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que incluyen una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDRH1) de G(Xi)PI(X2) (Xs)GYS (SEQ ID NO : 110), en donde X1 es F o Y, X2 es R, G o W, X3 es Y, F o G; una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDRH2) de IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y una secuencia de aminoacidos de la region 3 determinante de complementariedad de cadena pesada variable (CDRH3) de ARKDSG(X1)(X2)(X)PY (SEQ ID NO: 111), en donde X1 es N, Q, D, X2 es cualquier aminoacido hidrofobo y X3 es cualquier aminoacido hidrofobo; y una cadena ligera con tres CDR que incluye una secuencia de aminoacidos de la region 1 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDRL1) de QSISDH (SEQ ID NO: 37); una secuencia de aminoacidos de la region 2 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CDRL2) de YAS (SEQ ID NO: 38); y una region 3 determinante de complementariedad de cadena ligera variable (CdRL3) que incluye la secuencia de aminoacidos de QQG(X-i)(X2)(X3)P(X4)T(SEQ ID NO: 112), en donde X1 es Y o N, X2 es D o E, X3 es F o Y, y X4 es cualquier aminoacido hidrofobo, o la secuencia de aminoacidos de QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39). En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un epttopo que incluye al menos el residuo 349 de la SEQ ID NO: 23. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un epttopo que incluye al menos el residuo 349 de la SEQ ID NO: 23 y se une a un epttopo que incluye al menos el residuo 349 de la SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye ademas una sustitucion de aminoacido en la region constante de cadena pesada gamma en la posicion del aminoacido de EU 325 y una sustitucion del aminoacido en la posicion de aminoacido de EU 328. En algunas realizaciones, el aminoacido sustituido en la posicion de aminoacido de la EU 325 es serina, y en el que el aminoacido sustituido en la posicion de aminoacido de la EU 328 es fenilalanina. En algunas realizaciones, los anticuerpos TLR4 tambien se unen al complejo TLR4/MD-2 de humano y/o de mono cynomolgus.
Tambien se describen anticuerpos aislados que se unen espedficamente al receptor 4 tipo Toll (TLR4), donde el anticuerpo incluye una cadena pesada con tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que incluyen una region variable determinante de la cadena pesada 1 determinante (CDRH1) aminoacido secuencia de G (X1) PI (X2) (X3) GYS (SEQ ID NO: 110), donde X1 es F o Y, X2 es R, G o W, X3 es Y, F o G; una complementariedad de cadena pesada variable que determina la secuencia de aminoacidos de la region 2 (CDRH2) de IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y una secuencia de aminoacidos de la region 3 (CDRH3) determinante de complementariedad de cadena pesada variable de ARKDSG (X1) (X2) (X3) PY (SEQ ID NO: 111), donde X1 es N, Q, D o E, X2 es cualquier hidrofobo aminoacido, y X3 es cualquier aminoacido hidrofobo; y una cadena ligera con tres CDR que incluye una complementariedad de cadena ligera variable que determina la secuencia de aminoacidos de la region 1 (CDRL1) de QSISDH (SEQ ID NO: 37); una complementariedad de cadena ligera variable que determina la secuencia de aminoacidos de la region 2 (CDRL2) de YAS (SEQ ID NO: 38); y una secuencia de aminoacidos de la region 3 determinante de la complementariedad de cadena ligera variable (CDRL3) de QQG(X-i)(X2)(X3)P(X4)T (SEQ ID NO: 112), donde X1 es Y o N, X2 es D o E, X3 es F o Y, y X4 es cualquier aminoacido hidrofobo. En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye una secuencia de aminoacidos CDRH1 de GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); GFPIRYGYS (SEQ ID NO: 55), GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 56), GYPIRHGYS (SEQ ID NO: 57), GFPIGQGYS (SEQ ID NO: 58), GYPIWGGYS (SEQ ID NO: 59) o GYPIGGGYS (SEQ ID NO : 60); una secuencia de aminoacidos de CDRH2 de IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y una secuencia de aminoacidos de CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27); ARKDSGQLFPY (SEQ ID NO: 33); y ARKDSGDYFPY (SEQ ID NO: 35); una secuencia de aminoacidos CDRL1 de QSISDH (SEQ ID NO: 37); una secuencia de aminoacidos CDRL2 de YaS (SEQ ID NO: 38); y una secuencia de aminoacidos cDrL3 de QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39), QQGNDFPVT (SEQ ID NO: 61), QQGYDEPFT (SEQ ID NO: 62), QQGYDFPLT (SEQ ID NO: 63), QQGYDYPLT (SEQ ID NO: 64 ) o QQGYEFPLT (SEQ ID NO: 65). En algunas realizaciones, el anticuerpo incluye ademas una sustitucion de aminoacido en la region constante de cadena pesada gamma en la posicion 325 de aminoacido de EU y una sustitucion de aminoacido en la posicion 328 de aminoacido de EU. En algunas realizaciones, el aminoacido sustituido en posicion de aminoacido de Eu 325 es serina, y en donde el aminoacido sustituido en la posicion 328 de aminoacido de la EU es fenilalanina. En algunas realizaciones, los anticuerpos TLR4 tambien se unen al complejo TLR4/MD-2 de mono humano y/o cynomolgus.
La invencion tambien proporciona anticuerpos aislados que se unen espedficamente a un complejo del receptor 4 tipo Toll (TLR4)/MD-2, en donde el anticuerpo incluye una secuencia de aminoacidos variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 67, 69, 71, 73, 75 o 77 e incluye un aminoacido variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones de la invencion, el anticuerpo incluye una combinacion de una secuencia de aminoacidos de cadena pesada variable y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en:
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(a) una region variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 67 y una region variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4; (b) una region variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 69 y una region variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4; (c) una region variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 71 y una region variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4; (d) una region variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 73 y una region variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4; (e) una region variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 75 y una region variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4; (f) una region variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 77 y una region variable de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4; y (g) una region variable de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 y una region variable de cadena ligera que incluye
la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 79. En algunas realizaciones, el aminoacido sustituido en la posicion del aminoacido EU 325 es serina, y en donde el aminoacido sustituido en la posicion del aminoacido EU 328 es fenilalanina. En algunas realizaciones, los anticuerpos de TLR4 tambien se unen al complejo TLR4/MD-2 de humano y/o mono cynomolgus.
Preferiblemente, los anticuerpos de TLR4 se formatean en un isotipo IgG. Mas preferiblemente, los anticuerpos de TLR4 estan formateados en un isotipo IgG1. Un ejemplo de un anticuerpo formateado de IgG1 es el anticuerpo 1E11 formateado de IgG1 de la description que comprende la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 40 y la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41, como se muestra a continuation:
> Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de 1E11
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS
LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV
PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO: 40)
Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de 1E11
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 41)
Los anticuerpos anti-TLR4 descritos en este documento tambien incluyen al menos una sustitucion de aminoacidos espedfica dentro de, por ejemplo, una region Fc o un fragmento de union de FcR de la misma (por ejemplo, un polipeptido que tiene sustituciones de aminoacidos dentro de un dominio constante de IgG) de tal manera que el anticuerpo modificado provoca alteraciones en la funcion efectora dependiente de antfgeno mientras que retiene la union al antfgeno en comparacion con un anticuerpo inalterado. Por ejemplo, los anticuerpos alterados provocan la prevention de la liberation del mediador proinflamatorio. En una realization preferida, los anticuerpos alterados son humanos y del isotipo IgG1.
Los anticuerpos anti-TLR4 de la invention incluyen un anticuerpo alterado en el que se ha modificado al menos un residuo de aminoacido en la region constante de la portion Fc del anticuerpo. Por ejemplo, al menos un aminoacido en el dominio CH2 de la porcion Fc ha sido reemplazado por un residuo diferente, es decir, una sustitucion de aminoacido. En los anticuerpos alterados descritos en la presente memoria, uno o mas de los residuos de aminoacidos que corresponden a los residuos 325, 326 y 328 esta sustituido con un residuo diferente en comparacion con un anticuerpo inalterado. La numeration de los residuos en la cadena pesada gamma es la del fndice EU (vease Edelman, GM et al, 1969, Kabat, E, A., TT Wu, HM Perry, KS Gottesman, y C. Foeller, 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edition U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, Publication del NIH No. 91-3242). En una realizacion preferida, la posicion del aminoacido EU 325 de la region constante de cadena pesada gamma esta sustituida con serina, y la posicion del aminoacido EU 328 de la region constante de cadena pesada gamma esta
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sustituida con fenilalanina, de modo que las posiciones EU 325 a 328 de la region constante de cadena pesada gamma del anticuerpo IgG1 humano alterado comprende la secuencia de aminoacidos SKAF (SEQ ID NO: 42).
La invencion proporciona ademas el anticuerpo aislado de la invencion para uso en el tratamiento de una enfermedad autoimmune o un trastorno inflamatorio.
En un aspecto adicional, la descripcion proporciona metodos de tratamiento o prevencion de patolog^as asociadas con actividad de LPS aberrante y/o activacion aberrante de TLR4/MD-2 (por ejemplo, la produccion aberrante de citoquinas proinflamatorias tal como la produccion aberrante de IL-8), o el alivio de un smtoma asociado con tales patologfas, mediante la administracion de un anticuerpo monoclonal de la divulgacion (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino o monoclonal humanizado) a un sujeto en el que se desea dicho tratamiento o prevencion. El sujeto a tratar es, por ejemplo, humano. El anticuerpo monoclonal se administra en una cantidad suficiente para tratar, prevenir o aliviar un smtoma asociado con la patologfa. La cantidad de anticuerpo monoclonal suficiente para tratar o prevenir la patologfa en el sujeto es, por ejemplo, una cantidad que es suficiente para reducir la produccion inducida por LPS de una o mas citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-6, IL-8). Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "reducida" se refiere a una disminucion en la produccion de una citoquina proinflamatoria en presencia de un anticuerpo monoclonal de la divulgacion, en el que la produccion es, por ejemplo, la produccion de citoquina proinflamatoria local (por ejemplo, en un sitio de tejido inflamado) o produccion de citoquina proinflamatoria sistemica. La produccion inducida por LPS de una citoquina proinflamatoria se reduce cuando el nivel de la produccion de citoquina proinflamatorias en presencia de un anticuerpo monoclonal de la divulgacion es mayor que o igual a 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% menor que un nivel de control de la produccion de citoquina proinflamatoria (es decir, el nivel de produccion de citoquina inflamatoria en ausencia del anticuerpo monoclonal). Se mide el nivel de produccion de citoquina proinflamatoria. Los expertos en la tecnica apreciaran que el nivel de produccion de citoquina proinflamatoria puede medirse usando una variedad de ensayos, que incluyen, por ejemplo, los metodos descritos en la presente memoria asf como kits de ELISA disponibles comercialmente.
Las patologfas tratadas y/o prevenidas incluyen, por ejemplo, sepsis inducida por productos microbianos, inflamacion aguda, inflamacion cronica (por ejemplo, inflamacion cronica asociada con condiciones alergicas y asma), enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, IBD y aterosclerosis), lesion isquemica con y sin trasplante, enfermedades renales (por ejemplo, nefropatfa diabetica), lesion renal aguda y enfermedades en las que el estres, por ejemplo, estres celular, induce la expresion de factores de estres solubles endogenos (por ejemplo, Hsp60, fibronectina, sulfato de heparano, hialuronano, gp96 , p-Defensina-2 y protema surfactante A). Las patologfas en las que el estres, por ejemplo, el estres celular induce la expresion de factores de estres solubles endogenos incluyen, por ejemplo, la osteoartritis y la artritis reumatoide. Las patologfas asociadas con el estres, por ejemplo, el estres celular, tambien pueden ocurrir en sujetos y pacientes colocados en respiradores, ventiladores y otros dispositivos de asistencia respiratoria. Dichas patologfas incluyen, por ejemplo, lesion pulmonar inducida por ventilador ("VILI"), tambien denominada lesion pulmonar asociada a la ventilacion ("VALI").
Las composiciones farmaceuticas segun la descripcion pueden incluir un anticuerpo anti-TLR4 y un vehmulo. Estas composiciones farmaceuticas se pueden incluir en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnostico.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un grafico que representa la union por fagos monoclonales que expresan scFv, denominados en este documento como "1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10, 1E11, 1G12, 15C1", al TLR4 de mono cynomolgus. La especificidad de union se muestra mediante citometna de flujo usando celulas CHO simuladamente transfectadas o transfectadas con TLR4 de mono cynomolgus. Los resultados que usan celulas simuladamente transfectadas se muestran con sfmbolos grises (clave a la derecha), mientras que los resultados que usan celulas transfectadas con TLR4 de mono cynomolgus se muestran en otros sfmbolos de color (clave a la izquierda).
La Figura 2 es un grafico que representa la union por fagos monoclonales que expresan scFv, denominados en este documento como "1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10, 1E11, 1G12, 15C1", al complejo TLR4/MD2 humano. La especificidad de la union se muestra mediante citometna de flujo usando celulas CHO transfectadas en forma simulada o transfectadas con TLR4/MD2 de mono cynomolgus. Los resultados que utilizan celulas transfectadas de manera simulada se muestran con sfmbolos grises (clave a la derecha), mientras que los resultados que utilizan celulas transfectadas con TLR4/MD-2 de mono cynomolgus se muestran con otros sfmbolos de color (clave a la izquierda).
La Figura 4 es un grafico que representa la union por anticuerpos purificados, denominados en este documento "1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10, 1E11, 1G12, 15C1", al complejo TLR4/MD2 humano. La especificidad de union se muestra mediante citometna de flujo de celulas CHO simuladamente transfectadas o transfectadas con TLR4/MD-2 humano. Los resultados que utilizan celulas transfectadas de manera simulada se muestran con sfmbolos grises (clave a la derecha), mientras que los resultados que usan celulas transfectadas con TLR4/MD-2 humano se muestran en otros sfmbolos de color (clave a la izquierda).
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La Figura 5 es una ilustracion del contacto entre el aminoacido potencial del paratopo del anticuerpo/epftopo TLR4. La secuencia de CDRH3 del anticuerpo de TLR4 espedfico humano, 15C1, (SEQ ID NO: 44) puede realizar la interaccion del puente salino con lisina 349 de TLR4 humano (SEQ ID NO: 23). La secuencia de CDRH3 del MAb de 1G12 TLR4 espedfico de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 36) puede realizar la interaccion del puente salino con el acido glutamico 349 del TLR4 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 24). La secuencia de CDRH3 de MAb 1E11 de TLR4 espedfico de humano/mono cynomolgus puede realizar enlaces de hidrogeno tanto con lisina 349 de TLR4 humano (SEQ ID NO: 23) como con acido glutamico 349 de TLR4 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 24).
La Figura 6 es un grafico que representa la union por anticuerpos purificados, denominados en este documento "1E11, 1E11 N103D", al TLR4 de mono cynomolgus. La especificidad de union se muestra mediante citometna de flujo usando celulas CHO simuladamente transfectadas o transfectadas con TLR4/MD2 de mono cynomolgus. Los resultados que usan celulas simuladamente transfectadas se muestran con sfmbolos grises, mientras que los resultados que usan celulas transfectadas con TLR4/MD-2 de mono cynomolgus se muestran en otros sfmbolos de color.
La Figura 7 es un grafico que representa la union de anticuerpos purificados, referidos en la presente memoria "1E11, 1E11 N103D", al complejo TLR4/MD-2 humano. La especificidad de la union se muestra por citometna de flujo usando celulas CHO simuladamente transfectadas o transfectadas con TLR4 humano. Los resultados que usan celulas simuladamente transfectadas se muestran con sfmbolos grises, mientras que los resultados que usan celulas transfectadas con TLR4/MD2 humano se muestran en otros sfmbolos de color.
La Figura 8 es un grafico que representa la inhibicion de la cascada de senalizacion en direccion 3' inducida por LPS de TLR4, NF-kB, por anticuerpos purificados, a los que se hace referencia en este documento "1E11, 15C1, 1C12, 1G12". La lmea celular THP1-azul-CD14 se deriva de la lmea celular monodtica humana que expresa al complejo TLR4/MD2 humano y se transfecta en forma estable con un gen informador que facilita el control de la activacion de NF-kB/AP-1 inducida por TLR. Las celulas se incubaron con 1E11, 15C1, 1C12 y 1G12 a las concentraciones indicadas y posteriormente se incubaron con LPS (10 ng/mL). Los niveles de fosfatasa alcalina embrionaria secretada se evaluaron 24 horas despues del tratamiento con LPS midiendo la absorbancia a 650 nm usando un lector de microplacas.
La Figura 9 es un grafico que representa la potencia de union de anticuerpos purificados con mutaciones CDRH1, denominadas en este documento "15C1, 1E11.C2, 1E11.C3, 1E11.C4, 1E11.C5, 1E11.C6", al complejo TLR4/MD2 humano. La potencia de union se determina mediante ELISA competitivo. Los resultados obtenidos con el anticuerpo 15C1 parental se muestran con sfmbolos circulares, mientras que los resultados que usan anticuerpos 1E11.C2, 1E11.C3, 1E11.C4, 1E11.C5 y 1E11.C6 se muestran en otros sfmbolos con diferente color y forma.
La Figura 10 es un grafico que representa la potencia de union de anticuerpos purificados con mutaciones CDRH1, a los que se hace referencia en esta memoria como "15C1, 1E11.E1, 1E11.E3, 1E11.E4, 1E11.E5", al complejo TLR4/MD2 humano. La potencia de union se determina mediante ELISA competitivo. Los resultados obtenidos con el anticuerpo 15C1 parental se muestran con sfmbolos circulares, mientras que los resultados que usan anticuerpos 1E11.E1, 1E11.E3, 1E11.E4 y 1E11.E5 se muestran en otros sfmbolos con diferente color y forma.
La Figura 11 es un grafico que representa la potencia de union de anticuerpos purificados con mutaciones de CDRH1, denominada en este documento "15C1, 1E11.C2E1, 1E11.C2E3, 1E11.C2E4, 1E11.C2E5", al complejo de TLR4/MD2 humano. La potencia de union se determina mediante ELISA competitivo. Los resultados obtenidos con el anticuerpo 15C1 parental se muestran con sfmbolos circulares, mientras que los resultados que usan anticuerpos 1E11.C2E1, 1E11.C2E3, 1E11.C2E4 y 1E11.C2E5 se muestran en otros sfmbolos con diferente color y forma.
La Figura 12 es un grafico que representa la union por Fab purificado, denominado en este documento "Fab 15C1, Fab 1E11, Fab 1E11.C2, Fab 1E11.e3 y Fab 1E11.C2E3", al complejo TLR4/MD2 de mono cynomolgus. La especificidad de la union se muestra mediante citometna de flujo de celulas CHO transfectadas en forma simulada o transfectadas con el TLR4/MD2 de mono cynomolgus. Los resultados que usan celulas transfectadas simuladas se muestran con sfmbolos grises (clave a la derecha), mientras que los resultados que usan las celulas transfectadas con TLR4/MD2 de mono cynomolgus se muestran en otros sfmbolos coloreados (clave a la izquierda).
La Figura 13 es un grafico que representa la inhibicion de la cascada de senalizacion en direccion 3' inducida por LPS de TLR4, NF-kB, por anticuerpos purificados, denominada en este documento "15C1, 1E11.E2". La lmea celular THP1- azul-CD14 se deriva de la lmea celular monocftica humana que expresa el complejo TLR4/MD2 humano y se transfecta de forma estable con un gen informador que facilita el control de la activacion de NF-kB/AP-1 inducida por TLR. Las celulas se incubaron con 15C1 y 1E11.E2 en las concentraciones indicadas y posteriormente se incubaron con LPS (10 ng/mL). Los niveles de fosfatasa alcalina embrionaria secretada se evaluaron 24 horas despues del tratamiento con LPS midiendo la absorbancia a 650 nm usando un lector de microplacas.
La Figura 14 es un grafico que representa la inhibicion de la produccion de IL-6 inducida por la activacion de TLR4 en el ensayo de sangre completa humana por anticuerpos purificados, denominados en este documento "15C1, 1E11C2, 1E11 .C2E3". La sangre humana se diluyo con una concentracion disminuida de anticuerpos y posteriormente se incubo
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con LPS. Los niveles de IL-6 se evaluaron 24 horas despues del tratamiento con LPS utilizando el kit Milliplex. Los resultados se representan como porcentaje de inhibicion de IL-6. Los datos obtenidos con el anticuerpo parental 15C1 se muestran con sfmbolos de color naranja, mientras que los resultados que usan anticuerpos 1E11.C2 y 1E11.C2E3 se muestran en otros sfmbolos de color.
La Figura 15 es una serie de graficos que representan la inhibicion de la produccion de IL-6 inducida por activacion de TLR4 en el ensayo de sangre completa de mono cynomolgus por anticuerpos purificados, a los que se hace referencia en esta memoria como "15C1, 1E11C2". Este experimento se realizo con sangre de 2 animales diferentes. La sangre del mono cynomolgus se diluyo con una concentracion disminuida de anticuerpos y posteriormente se incubo con LPS. Los niveles de IL-6 se evaluaron 24 horas despues del tratamiento con LPS utilizando el kit Milliplex. Los resultados obtenidos con el anticuerpo parental 15C1 se muestran con sfmbolos circulares, mientras que los resultados que usan el anticuerpo 1E11.C2 se muestran en sfmbolos cuadrados.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales (MAb) como se describe en las reivindicaciones adjuntas. Los anticuerpos se unen espedficamente al complejo receptor TLR4/MD-2 de humano y/o mono cynomolgus. Este complejo receptor se activa mediante lipopolisacarido (LPS), el componente principal de la membrana externa de bacterias Gram negativas. Tambien se activa mediante ligandos adicionales, que incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, la protema de fusion del virus respiratorio sincitial, OxPL, Ox-LDL, amiloide p, p-Defensina 2, mquel, HMGB 1, HSP, S100A8/S100A9, tenascina C, Fibronectina-EDA, Biglicano y Hialuronano. Los anticuerpos monoclonales de la invencion inhiben la activacion del receptor y la senalizacion intracelular subsiguiente a traves de LPS. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales neutralizan la activacion del complejo receptor TLR4/MD-2. En particular, la invencion proporciona anticuerpos monoclonales que reconocen el complejo receptor TLR4/MD-2 expresado en la superficie celular. Ademas, los anticuerpos monoclonales de la invencion tambien reconocen TLR4 humano y de mono cynomolgus cuando no estan complejados con MD-2. El anticuerpo monoclonal es, por ejemplo, un anticuerpo humanizado.
Los anticuerpos de la invencion se unen espedficamente al complejo TLR4/MD-2 de humano y/o de mono cynomolgus, en donde el anticuerpo se une a un epttopo que incluye uno o mas residuos de aminoacidos en TLR4 humano y/o TLR4 de mono cynomolgus entre los residuos 289 y 375 de la SEQ ID NO: 23 (humana) y la SEQ ID NO: 24 (mono cynomolgus).
Los anticuerpos ilustrativos de la invencion incluyen, 1E11.C1, 1E11.C2, 1E11.C3, 1E11.C4, 1E11.C5, 1E11.C6, 1E11.E1, 1E11.E2, 1E11.E3, 1E11.E4, 1E11.E5, 1E11.C2E1, 1E11.C2E2, 1E11.C2E3, 1E11.C2E4 y 1E11.C2E5. Algunos anticuerpos muestran especificidad para el complejo receptor TLR4/MD-2 de humano y mono cynomolgus, y se ha demostrado que inhiben la activacion del receptor y la senalizacion intracelular posterior a traves de LPS. Por ejemplo, 1E11.C1, 1E11.C2, 1E11.C3, 1E11.C4, 1E11.C5, 1E11.C6, 1E11.C2E1, 1E11.C2E2, 1E11.C2E3, 1E11.C2E4 y 1E11.C2E5 se unen tanto a TLR4 humano como a mono cynomolgus independientemente de la presencia de MD-2 humano o mono cynomolgus. Los anticuerpos ejemplares de la divulgacion 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1D10 y 1G12, solo se unen a TLR4 de mono cynomolgus independientemente de la presencia de MD-2 de mono cynomolgus. 1E11.E1, 1E11.E2, 1E11.E3, 1E11.E4 y 1E11.E5 se unen solo a TLR4 humano independientemente de la presencia de MD-2 humano.
Los TLR reconocen partmulas microbianas y activan las celulas inmunitarias contra la fuente de estas partmulas microbianas. (Vease Takeda et al., Annu. Rev. Immunol., 21: 335-76 (2003)). Se ha demostrado que TLR4 y MD-2 forman un complejo sobre la superficie celular, y la presencia de MD-2 parece esencial para la capacidad de respuesta de TLR4 a diversos ligandos, incluido a modo de ejemplo no limitante, LPS, protema de fusion del virus sincitial respiratorio, OxPL, Ox-LDL, amiloide p , p-Defensina 2, Mquel, HMGB1, hSp, S100A8/S100A9, Tenascina C, Fibronectina-EDA, Biglicano y Hialuronano.
El LPS suministra senales a las celulas inmunes a traves de su receptor multicadena en el que el complejo TLR4/MD-2 es el principal componente de senalizacion. Se ha demostrado que LPS ejerce sus efectos sobre el sistema inmune a traves de la senalizacion de TLR4. El LPS se une rapidamente a la protema de union a lipopolisacarido (LBP) en el torrente sangumeo, y en esta forma, LPS interactua con la protema de superficie celular CD14 anclada a GPI. LPS se transfiere a TLR4 que transduce una senal de activacion intracelular. Recientemente, se encontro que otra protema, MD-2, era necesaria para que se produjera la transduccion de senales a traves de TLR4. MD-2 interactua directamente con TLR4 y juega un papel importante en su modificacion postraduccional y el trafico intracelular. Ademas, se ha demostrado que MD-2 se une directamente a LPS, lo que demuestra la importancia de esta protema accesoria en el complejo receptor de LPS (Vease Miyake K., Int. Immunopharmacol., 3: 119-128 (2003)). Por consiguiente, la neutralizacion de la senalizacion de LPS mediada por el complejo TLR4/MD-2 es una estrategia terapeutica potencial en el tratamiento de trastornos tales como, por ejemplo, inflamacion sistemica aguda y sepsis inducida por infeccion bacteriana Gram negativa.
Los anticuerpos de TLR4 de la invencion y la divulgacion incluyen, por ejemplo, las regiones determinates de complementariedad de cadena pesada (CDR) mostradas a continuacion en la Tabla 1A, las CDR de la cadena ligera mostradas en la Tabla 1B y combinaciones de las mismas.
Tabla 1. Secuencias de CDR de VH de clones de anticuerpos que se unen y neutralizan TLR
ID del clon
CDR1 pesada CDR2 pesada CDR3 pesada
1A1
GYSIT ... GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS ... GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGRLLPY (SEQ ID NO: 28)
1A6
GYSIT ... GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS ... GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGKWLPY (SEQ ID NO: 29)
1B12
GYSIT ... GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS ... GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGHLMPY (SEQ ID NO: 30)
1C7
GYSIT ... GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS ... GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGHNYPY (SEQ ID NO: 31)
1C10
GYSIT ... GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS ... GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGKNFPY (SEQ ID NO: 32)
1C12
GYSIT ... GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS ... GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGQLFPY (SEQ ID NO: 33)
1D10
GYSIT...GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGHNLPY (SEQ ID NO: 34)
1E11
GYSIT...GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11 N103D
GYSIT...GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGDYFPY (SEQ ID NO: 35)
1G12
GYSIT...GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGRYWPY(SEQ ID NO: 36)
1E11.C1
GFPIR...YGYS (SEQ ID NO: 55) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.C2
GYPIR...FGYS (SEQ ID NO: 56) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.C3
GYPIR...HGYS (SEQ ID NO: 57) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.C4
GFPIG...QGYS (SEQ ID NO: 58) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.C5
GYPIW...GGYS (SEQ ID NO: 59) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.C6
GYPIG...GGYS (SEQ ID NO: 60) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.E1
GYSIT...GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.E2
GYSIT...GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.E3
GYSIT...GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
ID del clon
CDR1 pesada CDR2 pesada CDR3 pesada
1E11.E4
GYSIT...GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.E5
GYSIT...GGYS (SEQ ID NO: 25) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.C2E1
GYPIR...FGYS (SEQ ID NO: 56) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.C2E3
GYPIR...FGYS (SEQ ID NO: 56) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.C2E4
GYPIR...FGYS (SEQ ID NO: 56) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11.C2E5
GYPIR...FGYS (SEQ ID NO: 56) IHYS...GYT (SEQ ID NO: 26) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
Tabla 1B. Secuencias de CDR de VL de clones de anticuerpos que se unen y neutralizan TLR4
ID del clon
CDR1 Ligera CDR2 Ligera CDR3 Ligera
1A1
QSI.....SDH (SEQ ID NO: 37) YA......S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1A6
QSI.....SDH (SEQ ID NO: 37) YA......S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1B12
QSI.....SDH (SEQ ID NO: 37) YA......S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1C7
QSI.....SDH (SEQ ID NO: 37) YA......S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1C10
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1C12
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1010
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1E11
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1E11 N103D
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1G12
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1E110C1
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1E110C2
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1E110C3
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
ID del clon
CDR1 Ligera CDR2 Ligera CDR3 Ligera
1E110C4
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1E110C5
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1E110C6
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39)
1E110E1
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGNDFPVT (SEQ ID NO: 61)
1E110E2
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGYDEPFT (SEQ ID NO: 62)
1E110E3
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGYDFPLT (SEQ ID NO: 63)
1E110E4
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGYDYPLT (SEQ ID NO: 64)
1E110E5
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGYEFPLT (SEQ ID NO: 65)
1E110C2E1
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGNDFPVT (SEQ ID NO: 61)
1E110C2E3
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGYDFPLT (SEQ ID NO: 63)
1E110C2E4
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGYDYPLT (SEQ ID NO: 64)
1E110C2E5
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGYEFPLT (SEQ ID NO: 65)
1E110C2E5
QSI..........SDH (SEQ ID NO: 37) YA............S (SEQ ID NO: 38) QQGYEFPLT (SEQ ID NO: 65)
Los anticuerpos de TLR4 de la invencion y la descripcion incluyen, por ejemplo, anticuerpos que tienen la combinacion de secuencias de cadena pesada y cadena ligera que se muestran a continuacion en la Tabla 2.
Tabla 2. Secuencias de VH y VL de clones de anticuerpos que se unen y neutralizan TLR4
ID del clon
Cadena pesada variable Cadena Ligera variable
1A1
SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:4
1A6
SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:4
1B12
SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:4
1C7
SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:4
1C10
SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:4
ID del clon
Cadena pesada variable Cadena Ligera variable
1C12
SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:4
1D10
SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:4
1E11
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:4
1E11 N103D
SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:4
1G12
SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:4
1E11.C1
SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:4
1E11.C2
SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:4
1E11.C3
SEQ ID NO:71 SEQ ID NO:4
1E11.C4
SEQ ID NO:73 SEQ ID NO:4
1E11.C5
SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:4
1E11.C6
SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:4
1E11.E1
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:79
1E11.E2
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:81
1E11.E3
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:83
1E11.E4
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:85
1E11.E5
SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:87
1 E11.C2E1
SEQ ID NO:89 SEQ ID NO:91
1 E11.C2E3
SEQ ID NO:93 SEQ ID NO:95
1 E11.C2E4
SEQ ID NO:97 SEQ ID NO:99
1 E11.C2E5
SEQ ID NO:101 SEQ ID NO:103
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 a modo de ejemplo de la divulgacion es el anticuerpo 1E11 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1E11 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ
ID NO: 2) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 1, y una region variable de cadena ligera (sEq ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 1)
5 > Secuencia de aminoacidos de VH de 1E11
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)
Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
Secuencia de aminoacidos de VL de 1E11
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS 10 GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena 15 ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo de la divulgacion es el anticuerpo 1A1 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1A1 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 6) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 5, y una region variable de cadena ligera (SeQ ID NO: 4) 20 codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1A1
CAGGTGC AGCTT CAGGAGT CCGGCCCAGGACT GGT GAAGCCTT CGG ACACCCT GTC CCT C ACCT GCGCT GT CT CT GGTT ACT CC AT C ACCGGT GGTT AT AGCT GGC ACTGGAT A CGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTA C ACT GACTTCAACCCCTCCCTCAAGACT CGAAT CACCATAT C ACGT GACACGT CCAA GAACC AGTT CTCCCT GAAGCT G AGCT CT GT G ACCGCT GT GG AC ACT GC AGT GT ATT A CT GT GCGAGAAAAGATT CCGGCCGCCT CCTCCCTT ACTGGGGCCAAGGGACT CT GGT C ACT GT CTCTTCC (SEQ ID NO: 5)
5
10
15
20
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYT DFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSYTAYDTAYYYCARKDSGRLLPYWGQGTLYTYSS (SEQ ID NO: 6)
Secuencia de acidos nucleicos de VL de 1A1
G AAATT GT GTT G ACGC AGT CT CC AG ACTTT C AGT CTGT G ACT CC AA AGG AAAAAGT C ACCAT C ACCT GCAGGGCCAGT C AGAGT AT C AGCG ACCACTT ACACT GGT ACC AACA G AAACCT GAT C AGT CTCC C A AGCT C CT CAT C AAAT AT GCTT CCC AT GCC ATTT CT GG GGTC CC AT CG AGGTT C AGT GGC AGT GGGTCT GGG AC AG ACTT C ACT CT C ACC AT C AA T AGCCTAGAGGCT GAAGAT GCTGCAACGTATTACT GTCAGCAGGGT CACAGTTTTCC GCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
Secuencia de aminoacidos de VL de 1A1
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSR FSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1A1 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGRLLPY (SEQ ID NO: 28). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1A1 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo de la divulgacion es el anticuerpo 1A6 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1A6 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 8) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 7, y una region variable de cadena ligera (SeQ ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1A6
CAGGTGC AGCTT CAGGAGT CCGGCCCAGGACT GGT GAAGCCTT CGG ACACCCT GTC CCT C ACCT GCGCT GT CT CT GGTT ACT CC AT C ACCGGT GGTT AT AGCTGGCACTGGATA CGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTA CACTGACTTCAACCCCTCCCTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAA GAACC AGTT CTCCCT GAAGCT G AGCT CTGT G ACCGCT GT GG AC ACT GC AGT GT ATT A CT GT GCGAGAAAAG ATAGCGGCAAGT GGTTGCCTT ACT GGGGCCAAGGGACTCT GG TCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 7)
Secuencia de aminoacidos de VH de 1A6
QVQEQESGPGEVKPSDTESET CAVSGY SIT GGYS WHWIRQPPGKGEEWMGYIHYSGYT DFNPSFKTRITISRDTSKNQFSFKFSSVTAVDTAVYYCARKDSGKWFPYWGQGTEVTVS S (SEQ ID NO: 8)
Secuencia de acidos nucleicos de VL de 1A6
G AAATT GT GTT G ACGC AGT CT CC AG ACTTT C AGT CTGT G ACT CC AAAGG AAA AAGT C ACCAT CACCT GCAGGGCCAGT C AGAGT AT CAGCGACCACTT ACACTGGT ACC AACA GAAACCTGATCAGTCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGG GGTC CC AT CG AGGTT C AGT GGC AGT GGGTCT GGG AC AG ACTT C ACT CT C ACC AT C AA T AGCCTAGAGGCT GAAGAT GCTGCAACGTATTACT GTCAGCAGGGT CACAGTTTTCC GCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 3)
5
10
15
20
25
30
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSR FS GSGSGTDFTFTINSFEAEDAATYYCQQGHSFPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1A6 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGKWLPY (SEQ ID NO: 29). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1A6 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un ejemplo de anticuerpo monoclonal de TLR4 de la divulgacion es el anticuerpo 1B12 descrito en la presente memoria. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1B12 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 10) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 9, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1B12
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTC CCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATA CGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTA C ACT G ACTTC AACCCCTCCCTC AAGACT CG AAT CACCATAT C ACGT GACACGT CCAA G AACC AGTTCT CCCT GAAGCT GAGC
T CT GT GACCGCT GT GGACACT GCAGT GT ATT ACT GT GCGAG AAAAGAT AGCGGGCA CCTCATG CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 9)
> Secuencia de aminoacidos de VH de 1B12
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYT DFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGHLMPYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO: 10)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1B12
G AAATT GT GTT G ACGC AGT CT CC AG ACTTT C AGT CTGT G ACT CC AAAGGAAA AAGT C ACCAT CACCT GC AGGGCCAGT C AGAGT AT CAGCGACCACTT ACACTGGT ACC AACA GAAACCT GAT CAGTCTCCC AAGCTCCT CAT CAAATAT GCTT CCCAT GCCATTT CT GG GGTCCC AT CG AGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCT CACCAT C AA T AGCCT AGAGGCT GAAGAT GCTGC AACGT ATT ACT GTC AGC AGGGT C AC AGTTTTCC GCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 3)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 1B12
imagen1
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1A6 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGHLMPY (SEQ ID NO: 30). Las CDR de la cadena ligera del anticuerpo 1B12 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo de la divulgacion es el anticuerpo 1C7 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1C7 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 12) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 11, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 3.
5
10
15
20
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1C7
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCCGGGCACAACTAC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 11)
> Secuencia de aminoacidos de VH de 1C7
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGHNYPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1C7
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 1C7
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1C7 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGHNYPY (SEQ ID NO: 31). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1C7 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 a modo de ejemplo de la divulgation es el anticuerpo 1C10 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1C10 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 14) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 13, y una region variable de cadena ligera (SeQ ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1C10
CAGGTGC AGCTT CAGGAGT CCGGCCCAGGACT GGT GAAGCCTT CGG ACACCCT GT C CCT C ACCT GCGCT GT CT CT GGTT ACT CC AT C ACCGGT GGTT AT AGCTGGCACTGGATA CGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTA C ACT GACTTC AACCCCTCCCTC AAGACT CG AAT CACCATAT C ACGT GACACGT CCAA GAACCAGTT CT CCCT GAAGCT GAGCTCTGT GACCGCT GT GGAC ACT GC AGT GT ATTA CT GT GCGAGAAA AGAT AGCGGC AAGAACTTCCCTTACT GGGGCC AAGGG ACT CT GG T C ACT GT CTCTTCC (SEQ ID NO: 13)
> Secuencia de aminoacidos de VH de 1C10
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYT DFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSYTAYDTAVYYCARKDSGKNFPYWGQGTLVTYS S (SEQ ID NO: 14)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1C10
GAAATT GT GTT GACGC AGT CT CC AGACTTT CAGTCTGTGACT CC AAAGGAAAAAGT C ACCAT CACCT GC AGGGCCAGT C AGAGT AT CAGCGACCACTT ACACTGGT ACC AACA GAAACCT GAT CAGTCTCCC AAGCT CCT CAT CAAATAT GCTT CCCAT GCCATTT CT GG GGTCCCAT CGAGGTT CAGT GGCAGT GGGTCT GGGACAGACTTCACTCT CACCAT C AA TAGCCTAGAGGCTGAAGAT GCTGCA
ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG GTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 3)
5 > Secuencia de aminoacidos de VL de 1C10
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSR FS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1C10 tienen las siguientes secuencias: 10 GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGKNFPY (SEQ ID NO: 32). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1C10 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo de la divulgacion es el anticuerpo 1C12 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1C12 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 16) 15 codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 15, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SeQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1C12
CAGGTGC AGCTTCAGGAGT CCGGCCCAGGACTGGT GAAGCCTT CGGAC ACCCT GTC CCT CACCT GCGCT GT CT CT GGTT ACT CC AT C ACCGGT GGTT AT AGCTGGCACTGGATA CGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTA C ACT GACTTCAACCCCTCCCTCAAGACT CGAAT CACCAT AT C ACGT GACACGT CCAA GAACC AGTT CTCCCT GAAGCT G AGCT CT GT G ACCGCT GT GG AC ACT GC AGT GT ATT A CTGT GCGAGAAAAGAT AGCGGCC AGTTGTTCCCTT ACT GGGGCCAAGGGACTCTGGT C ACT GT CT CTTCC (SEQ ID NO: 15)
Secuencia de aminoacidos de VH de 1C12
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYT DFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGQLFPYWGQGTLVTVSS 20 (SEQ ID NO: 16)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1C12
GAAATT GT GTT GACGC AGT CT CC AG ACTTT C AGTCTGT G ACT CC AAAGGAAAAAGT C ACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACA GAAACCTGATCAGTCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGG GGTCCCAT CGAGGTT CAGT GGCAGT GGGT CT GGGACAGACTTCACTCT CACCAT CAA T AGCCT AG AGGCT G AAG AT GCT GC AACGT ATT ACT GT C AGC AGGGT C AC AGTTTTCC GCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 3)
5
10
15
20
25
30
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSR FS GSGSGTDFTFTINSFEAEDAATYYCQQGHSFPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1C12 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGQLFPY (SEQ ID NO: 33). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1C12 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo de la divulgacion es el anticuerpo 1D10 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1D10 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 18) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 17, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SeQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1D10
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATAGCGGCCACAACTTG CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 17)
> Secuencia de aminoacidos de VH de 1D10
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGHNLPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1D10
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
> secuencia de aminoacidos de VL de 1D10
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1D10 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGHNLPY (SEQ ID NO: 34). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1D10 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 a modo de ejemplo de la divulgacion es el anticuerpo 1E11 N103D descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1E11 N103D incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 20) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 19, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de IE11 N103D
5
10
15
20
CAGGTGC AGCTT CAGGAGT CCGGCCCAGGACT GGT GAAGCCTT CGG ACACCCT GTC CCT C ACCT GCGCTGT CT CT GGTT ACT CC AT C ACCGGT GGTT AT AGCTGGCACT GGATA CGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTA C ACT GACTTCAACCCCTCCCTCAAGACT CGAAT CACCATAT C ACGT GACACGT CCAA GAACCAGTT CT CCCT GAAGCTGAGCTCTGT GACCGCT GT GGAC ACT GC AGT GT ATTA CTGT GCGAGAAAAGATTCGGGCGACTACTTCCCTTACT GGGGCCAAGGGACT CTGGT C ACT GT CT CTTCC (SEQ ID NO: 19)
> secuencia de aminoacidos de VH de I E11 N103D
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYT DFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGDYFPYWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO: 20)
> secuencia de acido nucleico de VL de IE11 N103D
G AAATT GT GTT G ACGC AGT CT CC AG ACTTT C AGT CTGT G ACT CC AAAGG AAA AAGT C ACCATCACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACA GAAACCT GAT CAGTCTCCC AAGCT CCT CAT CAA ATAT GCTT CCCAT GCCATTT CT GG GGTCCC AT CGAGGTT CAGT GGC AGT GGGTCT GGGAC AGACTT C ACTCT CACCAT C AA T AGCCT AGAGGCT GAAGAT GCT GCAACGT ATT ACT GT C AGCAGGGT CAC AGTTTTCC GCT C ACTTT CGGC GG AGGG ACC AAGGT GG AG AT CAA A (SEQ ID NO: 3)
> secuencia de aminoacidos de VL de IE11 N103D
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSR FSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11 N103D tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGDYFPY (SEQ ID NO: 35). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 N103D tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SeQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 a modo de ejemplo de la divulgacion es el anticuerpo 1G12 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1G12 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 22) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 21, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SeQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1G12
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTC CCT C ACCT GCGCT GT CT CT GGTT ACT CC AT C ACCGGTGGTT AT AGCTGGCACTGGATA CG GC AGC CCCC AGGG AAGG G ACT GG AGT GG AT GGGGT AT AT C C ACT AC AGT GGTT A C ACT G ACTT C AAC CC CTCCCT C AAG ACT CGAAT CACCAT AT C ACGT GACACGT CCAA GAACCAGTT CTCC CT G AAGCT G AGCT CTGT GACCGCT GT GGAC ACT GC AGT GT ATT A CTGTGCGAGAAAAGATTCCGGGCGGTACTGGCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGG T C ACT GT CT CTTCC (SEQ ID NO: 21)
> Secuencia de aminoacidos de VH de 1G12
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYT DFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGRYWPYWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 22)
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GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 1G12
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de la complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1G12 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGRYWPY (SEQ ID NO: 36). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 N103D tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SeQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ IDNO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.C1 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1E11.C1 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 67) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 66, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico 1E11.C1 VH
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC
TGCGCTGTCTCTGGTTTCCCGATCCGCTACGGGTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA
GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC
CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC
TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 66)
> Secuencia de aminoacidos de VH de 1E11.C1
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGFPIRYGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.C1
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 1E11.C1
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Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C1 tienen las siguientes secuencias: GFPIRYGYS (SEQ ID NO: 55); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11.C1 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.C2 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1E11.C2 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 69) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 68, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.C2
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACCCGATCCGGTTCGGCTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 68)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.C2
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYPIRFGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 69)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.C2
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
> Secuencia de aminoacido de VL de 1E11.C2
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C2 tienen las siguientes secuencias: GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 56); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11.C1 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.C3 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1E11.C3 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 71) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 70, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.C3
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CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACCCCATCCGGCACGGGTACAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 70)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.C3
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYPIRHGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 71)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.C3
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
> Secuencia de aminoacido de VL de 1E11.C3
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C3 tienen las siguientes secuencias: GYPIRHGYS (SEQ ID NO: 57); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11.C1 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.C4 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1E11.C4 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 73) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 72, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.C4
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTTCCCGATCGGCCAGGGGTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 72)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.C4
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGFPIGQGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 73)
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> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.C4
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
> Secuencia de aminoacido de VL de 1E11.C4
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de la complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C4 tienen las siguientes secuencias: GFPIGQGYS (SEQ ID NO: 58); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11.C1 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ejemplar es el anticuerpo 1E11.C5 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1E11.C5 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 75) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en SEQ ID NO: 74, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.C5
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC
TGCGCTGTCTCTGGTTACCCGATCTGGGGGGGCTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA
GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC
CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC
TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC
CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCCGCCTCCACC (SEQ ID
NO: 74)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.C5
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYPIWGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 75)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.C5
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
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EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C5 tienen las siguientes secuencias: GYPIWGGYS (SEQ ID NO: 59); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11.C1 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ejemplar es el anticuerpo 1E11.C6 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1E11.C6 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 77) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 76, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 3.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.C5
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACCCCATCGGCGGCGGCTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 76)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.C5
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYPIGGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 77)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.C5
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 3)
> Secuencia de aminoacido de VL de 1E11.C5
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C6 tienen las siguientes secuencias: GYPIGGGYS (SEQ ID NO: 60); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11.C1 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGHSFPLT (SEQ ID NO: 39).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.E1 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1E11.E1 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 2, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 79) codificada por la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 78.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.E1
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 1)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.E1
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)
5 > Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.E1
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGGAACGACTTCCCGGTGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 78)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 1E11.E1
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGNDFPVTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 79)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. 10 Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.E1 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGNDFPVT (SEQ ID NO: 61).
15 Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.E2 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1E11.E2 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 2, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 81) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 80.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.E2
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC 20 CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 1)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.E2
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QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.E2
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGGTACGACGAGCCGTTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 80)
> Secuencia de aminoacido de VL de 1E11.E2
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGYDEPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 81)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.E2 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGYDEPFT (SEQ ID NO: 62).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.E3 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1E11.E3 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 2, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 83) codificada por la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 82.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.E3
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 1)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.E3
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.E3
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GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGCTACGACTTCCCGTTGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 82)
> Secuencia de aminoacido de VL de 1E11.E3
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGYDFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 83)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.E3 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGYDFPLT (SEQ ID NO: 63).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 a modo de ejemplo es el anticuerpo 1E11.E4 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1E11.E4 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 2, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 85) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 84.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.E4
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC
TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA
GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC
CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC
TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 1)
> Secuencia de aminoacidos de VH de 1E11.E4
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.E4
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGCTACGACTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 84)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 1E11.E4
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGYDYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 85)
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Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.E4 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGYDYPLT (SEQ ID NO: 64).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.E5 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1E11.E5 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 2, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 87) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 86.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.E5
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 1)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.E5
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.E5
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGCTACGAGTTCCCGTTGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 86)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 1E11.E5
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGYEFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 87)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.E5 tienen las siguientes secuencias: GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGYEFPLT (SEQ ID NO: 65).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.C2E1 descrito en este documento. Como se muestra a continuacion, el anticuerpo 1E11.C2E1 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 89) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 88, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 91) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 90.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.C2E1
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CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACCCGATCCGGTTCGGCTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 88)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.C2E1
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYPIRFGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 89)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.C2E1
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGGAACGACTTCCCGGTGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 90)
> Secuencia de aminoacido de VL de 1E11.C2E1
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGNDFPVTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 91)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C2E1 tienen las siguientes secuencias: GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 56); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGNDFPVT (SEQ ID NO: 61).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ejemplar es el anticuerpo 1E11.C2E3 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1E11.C2E3 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 93) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 92, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 95) codificada por la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 94.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.C2E3
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACCCGATCCGGTTCGGCTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 92)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.C2E3
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYPIRFGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93)
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> Secuencia de acido nucleico 1E11.C2E3 VL
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGCTACGACTTCCCGTTGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 94)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 1E11.C2E3
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGYDFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 95)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de la complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C2E3 tienen las siguientes secuencias: GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 56); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGYDFPLT (SEQ ID NO: 63).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.C2E4 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1E11.C2E4 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 97) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 96, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 99) codificada por la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 98.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.C2E4
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC
TGCGCTGTCTCTGGTTACCCGATCCGGTTCGGCTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA
GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC
CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC
TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 96)
> Secuencia de aminoacido de VH de 1E11.C2E4
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYPIRFGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 97)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.C2E4
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGCTACGACTACCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 98)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 1E11.C2E4
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EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGYDYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 99)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinates de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C2E4 tienen las siguientes secuencias: GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 56); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGYDYPLT (SEQ ID NO: 64).
Un anticuerpo monoclonal de TLR4 ilustrativo es el anticuerpo 1E11.C2E5 descrito en este documento. Como se muestra a continuation, el anticuerpo 1E11.C2E5 incluye una region variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 101) codificada por la secuencia de acido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 100, y una region variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 103) codificada mediante la secuencia de acido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 102.
> Secuencia de acido nucleico de VH de 1E11.C2E5
CAGGTGCAGCTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACC TGCGCTGTCTCTGGTTACCCGATCCGGTTCGGCTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCA GGGAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCC CTCAAGACTCGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGC TCTGTGACCGCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTC CCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCC (SEQ ID NO: 100)
> Secuencia de aminoacidos de VH de 1E11.C2E5
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYPIRFGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 101)
> Secuencia de acido nucleico de VL de 1E11.C2E5
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATC ACCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAG TCTCCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGT GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCA ACGTATTACTGTCAGCAGGGCTACGAGTTCCCGTTGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAG ATCAAA (SEQ ID NO: 102)
> Secuencia de aminoacido de VL de 1E11.C2E5
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGYEFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 103)
Los aminoacidos que abarcan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) son como se define por M.P. Lefranc (Vease Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology, J. Wiley and Sons, Nueva York suplemento 40, A1.P.1-A.1P.37 (2000) LIGM: 230). Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 1E11.C2E5 tienen las siguientes secuencias: GYPIRFGYS (SEQ ID NO: 56); IHYSGYT (SEQ ID NO: 26); y ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 1E11 tienen las siguientes secuencias: QSISDH (SEQ ID NO: 37); YAS (SEQ ID NO: 38); y QQGYEFPLT (SEQ ID NO: 65).
Los anticuerpos de TLR4 de la invention se unen espedficamente al complejo TLR4/MD-2 humano y/o mono cynomolgus, en donde el anticuerpo se une a un eprtopo que incluye uno o mas residuos de aminoacidos en TLR4 de humano y/o cynomolgus entre los residuos 325 y 374 de la SEQ ID NO: 23 (humana) y SEQ ID NO: 24 (mono cynomolgus). Alternativamente, en un aspecto de la divulgation, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que se une al mismo eprtopo que 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10, 1E11, 1E11 N103D, 1G12, 1E11.C1, 1E11.C2 ,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
1E11.C3, 1E11.C4, 1E11.C5, 1E11.C6, 1E11.E1, 1E11.E2, 1E11.E3, 1E11.E4, 1E11.E5, 1E11.C2E1, 1E11.C2E3, 1E11.C2E4 y 1E11.C2E5.
Los anticuerpos anti-TLR4 de la invencion incluyen un anticuerpo alterado en el que al menos el residuo de aminoacido en la posicion EU 325 y al menos el resto de aminoacido en la posicion EU 328 en el dominio CH2 de la porcion Fe del anticuerpo ha sido modificada Por ejemplo, al menos el residuo de aminoacido en la posicion EU 325 se ha sustituido con serina, y al menos el residuo de aminoacido en la posicion EU 328 se ha sustituido con fenilalanina.
Estos anticuerpos anti-TLR4 con una porcion Fc modificada provocan funciones efectoras modificadas, por ejemplo, una actividad del receptor Fc modificado, en comparacion con un anticuerpo inalterado. Por ejemplo, el receptor de Fc humano es CD32A. En algunas realizaciones, estos anticuerpos anti-TLR4 desencadenan una prevencion de la liberacion de mediadores proinflamatorios despues de la ligacion a CD32A en comparacion con un anticuerpo inalterado. Por lo tanto, estos anticuerpos anti-TLR4 provocan una actividad del receptor de Fc modificada, tal como la prevencion de la liberacion de mediadores proinflamatorios al mismo tiempo que retiene la capacidad de unirse a un antigeno objetivo. En algunas realizaciones, estos anticuerpos anti-TLR4 son anticuerpos neutralizantes, en donde el anticuerpo anti-TLR4 provoca una actividad del receptor Fc modificada, mientras retiene la capacidad de neutralizar una o mas actividades biologicas de un antigeno objetivo.
Por ejemplo, los anticuerpos anti-TLR4 de la invencion incluyen anticuerpos monoclonales que se unen al complejo de del receptor TLR4/MD-2 humano. Este complejo receptor se activa mediante el lipopolisacarido (LPS), el componente principal de la membrana externa de bacterias Gram negativas. Los anticuerpos anti-TLR4 de la invencion inhiben la activacion del receptor y la senalizacion intracelular subsiguiente a traves del LPS. Por lo tanto, los anticuerpos anti- TLR4 neutralizan la activacion del complejo receptor TLR4/MD-2. En particular, la invencion proporciona anticuerpos anti-TLR4 que reconocen el complejo receptor TLR4/MD-2 expresado en la superficie celular. Estos anticuerpos anti- TLR4 bloquean la produccion de IL-8 inducida por LPS. Ademas, algunos anticuerpos anti-TLR4 de la invencion tambien reconocen TLR4 cuando no estan complejados con MD-2. El anticuerpo alterado es, por ejemplo, un anticuerpo humanizado.
Definiciones:
A menos que se defina lo contrario, los terminos cientfficos y tecnicos usados en conexion con la presente invencion tendran los significados que comunmente comprenden los expertos en la tecnica. Ademas, a menos que el contexto requiera lo contrario, los terminos singulares incluiran los plurales y los terminos en plural incluiran el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y las tecnicas de, cultivo de celulas y tejidos, biologfa molecular y proterna y qmmica oligo o polinucleotidos y la hibridacion descrita aqm son bien conocidas y usadas comunmente en la tecnica. Se usan tecnicas estandar para ADN recombinante, smtesis de oligonucleotidos y cultivo y transformacion de tejidos (por ejemplo, electroporacion, lipofeccion). Las reacciones enzimaticas y las tecnicas de purificacion se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realiza comunmente en la tecnica o como se describe en este documento. Las tecnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describe en diversas referencias generales y mas espedficas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de laboratorio de, qmmica analftica, qmmica organica sintetica y qmmica medica y farmaceutica descritas en la presente memoria son las bien conocidas y usadas comunmente en la tecnica. Las tecnicas estandar se utilizan para smtesis qmmicas, analisis qmmicos, preparacion farmaceutica, formulacion, suministro y tratamiento de pacientes.
Como se utiliza de acuerdo con la presente descripcion, se entendera que los siguientes terminos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:
Como se usa en este documento, el termino "anticuerpo" se refiere a moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moleculas que contienen un sitio de union al antfgeno que se une espedficamente (inmunorreacciona con) un antfgeno. Por "unirse espedficamente" o "inmunorreaccionar con" o "unirse inmunoespedficamente" se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o mas determinantes antigenicos del antfgeno deseado y no reacciona con otros polipeptidos o se une a una afinidad mucho menor (Kd > 10'6). Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos policlonales, monoclonales, quimericos, dAb (anticuerpo de dominio), monocatenarios, Fab, Fab' y F(ab')2, scFvy una biblioteca de expresion de Fab.
Se sabe que la unidad estructural basica del anticuerpo comprende un tetramero. Cada tetramero esta compuesto por dos pares identicos de cadenas polipeptfdicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porcion del terminal amino de cada cadena incluye una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos principalmente responsables del reconocimiento del antfgeno. La porcion del terminal carboxilo de cada cadena define una region constante principalmente responsable de la funcion efectora. En general, las moleculas de anticuerpo obtenidas de humanos se relacionan con cualquiera de las
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clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre s^ por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molecula. Ciertas clases tambien tienen subclases, como IgG1, IgG2 y otras. Ademas, en humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
El termino "anticuerpo monoclonal" (MAb) o "composicion de anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una poblacion de moleculas de anticuerpo que contiene solo una especie molecular de molecula de anticuerpo que consiste en un producto unico de gen de cadena ligera y un unico producto genico de cadena pesada. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son identicas en todas las moleculas de la poblacion. Los MAb contienen un sitio de union al antigeno capaz de inmunorreaccionar con un epftopo particular del antfgeno caracterizado por una afinidad de union unica por el.
El termino "sitio de union al antigeno" o "porcion de union" se refiere a la parte de la molecula de inmunoglobulina que participa en la union al antfgeno. El sitio de union al antfgeno esta formado por residuos de aminoacidos de las regiones variables de terminales N ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas "regiones hipervariables", estan interpuestas entre los tramos flanqueantes mas conservados conocidos como "regiones marco" o "FR". Por lo tanto, el termino "FR" se refiere a secuencias de aminoacidos que se encuentran naturalmente entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molecula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada estan dispuestas una respecto de la otra en un espacio tridimensional para formar una superficie de union al antfgeno. La superficie de union al antfgeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antfgeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". La asignacion de aminoacidos a cada dominio esta de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989).
Como se usa en el presente documento, el termino "epftopo" incluye cualquier determinante de protema capaz de unirse espedficamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de celulas T. El termino "epftopo" incluye cualquier determinante de protema capaz de unirse espedficamente a una inmunoglobulina o receptor de celulas T. Los determinantes epitopicos suelen consistir en agrupaciones superficiales qmmicamente activas de moleculas tales como aminoacidos o cadenas laterales de azucar y, por lo general, tienen caractensticas estructurales tridimensionales espedficas, asf como caractensticas de carga espedficas. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos contra peptidos del terminal N o del terminal C de un polipeptido. Un anticuerpo es el que se une espedficamente a un antfgeno cuando la constante de disociacion es < 1 pM; por ejemplo, < 100 nM, preferiblemente <10 nM y mas preferiblemente < 1 nM.
Como se usa en el presente documento, los terminos "union inmunologica" y "propiedades de union inmunologica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se produce entre una molecula de inmunoglobulina y un antfgeno para el que la inmunoglobulina es espedfica. La fuerza o afinidad de las interacciones de union inmunologica se puede expresar en terminos de la constante de disociacion (Kd) de la interaccion, donde una Kd mas pequena representa una mayor afinidad. Las propiedades de union inmunologica de polipeptidos seleccionados se pueden cuantificar usando metodos bien conocidos en la tecnica. Uno de tales metodos implica medir las velocidades de formacion y disociacion del complejo sitio de union al antfgeno/antigeno, donde esas velocidades dependen de las concentraciones de los socios del complejo, la afinidad de la interaccion y los parametros geometricos que influyen igualmente en la velocidad en ambas direcciones. Por consiguiente, tanto la "constante de asociacion" (Kon) como la "constante disociacion" (Koff) pueden determinarse mediante el calculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociacion y disociacion. (Vease Nature 361: 186-87 (1993)). La relacion de Koff/Kon permite la cancelacion de todos los parametros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociacion Kd. (Vease, en general, Davies et al., (1990) Annual Rev Biochem 59: 439-473). Un anticuerpo de la presente invencion es el que se une espedficamente a su objetivo, cuando la constante de equilibrio de union (Kd) es <1 pM, por ejemplo, < 100 nM, preferiblemente < 10 nM, y mas preferiblemente < 1 nM, segun lo medido por ensayos tales como ensayos de union a radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la tecnica.
El termino "polinucleotido aislado" como se usa en la presente memoria significara un polinucleotido de origen genomico, ADNc o sintetico o alguna combinacion de los mismos, que en virtud de su origen, el "polinucleotido aislado" (1) no esta asociado con todo o una porcion de un polinucleotido en el que el "polinucleotido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) esta operativamente enlazado a un polinucleotido al que no esta enlazado en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. Los polinucleotidos de acuerdo con la invencion incluyen las moleculas de acido nucleico que codifican las moleculas de inmunoglobulina de cadena pesada, y las moleculas de acido nucleico que codifican las moleculas de inmunoglobulina de cadena ligera descritas aqrn.
El termino "protema aislada" al que se hace referencia aqrn significa una protema de ADNc, ARN recombinante o de origen sintetico o alguna combinacion de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de derivacion, la "protema aislada" (1) no esta asociada con protemas encontradas en la naturaleza, (2) esta libre de otras protemas de la misma fuente, por ejemplo, libre de protemas marinas, (3) es expresado por una celula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza .
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El termino "polipeptido" se usa en el presente documento como un termino generico para referirse a protema nativa, fragmentos o analogos de una secuencia polipeptidica. Por lo tanto, los fragmented proteicos nativos y los analogos son especies del genero polipeptidico. Los polipeptidos de acuerdo con la invencion comprenden las moleculas de inmunoglobulina de cadena pesada y las moleculas de inmunoglobulina de cadena ligera descritas aqm, asf como moleculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moleculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moleculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como moleculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa y viceversa, asf como fragmentos y analogos de los mismos.
El termino "de origen natural" tal como se usa en el presente documento tal como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptido o polinucleotido que esta presente en un organismo (incluidos virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otro modo, es de origen natural.
El termino "operativamente enlazado" como se usa en el presente documento se refiere a que las posiciones de los componentes que se describen estan en una relacion que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "operativamente enlazada" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresion de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El termino "secuencia de control", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de polinucleotidos que son necesarias para efectuar la expresion y el procesamiento de secuencias codificantes a las que estan ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huesped en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de union ribosomal y secuencia de terminacion de la transcripcion en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminacion de la transcripcion. El termino "secuencias de control" pretende incluir, como mmimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresion y el procesamiento, y tambien puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias grna y secuencias companeras de fusion. El termino "polinucleotido" como se denomina aqm significa una cadena polimerica de nucleotidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleotidos o desoxinucleotidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleotido. El termino incluye formas de ADN de cadena simple o doble.
Como se usa en el presente documento, los veinte aminoacidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Vease Immunology - A Synthesis (2a Edicion, E. S. Golub y D. R. Gren, Editores., Sinauer Associates, Sunderland Mass (1991)). Los estereoisomeros (por ejemplo, D-aminoacidos) de los veinte aminoacidos convencionales, los aminoacidos no naturales tales como aminoacidos a, a-disustituidos, aminoacidos N-alquilo, acido lactico y otros aminoacidos no convencionales tambien pueden ser componentes adecuados para polipeptidos de la presente invencion. Los ejemplos de aminoacidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N, N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N- metilarginina y otros aminoacidos e iminoacidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notacion de polipeptidos usada en este documento, la direccion de la mano izquierda es la direccion del terminal amino y la direccion de la derecha es la direccion del terminal carboxilo, de acuerdo con el uso y la convencion estandar.
Como se aplica a polipeptidos, el termino "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptfdicas, cuando estan optimamente alineadas, tal como mediante los programas GAP o BESTFlT usando pesos de espacio predeterminados, comparten al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 por ciento identidad de secuencia, mas preferiblemente al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y lo mas preferiblemente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia.
Preferiblemente, las posiciones de los residuos que no son identicas difieren por sustituciones de aminoacidos conservadoras.
Las sustituciones de aminoacidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales alifaticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales de hidroxilo alifatico es serina y treonina; un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales aromaticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales basicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoacidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cistema y metionina. Los grupos conservadores preferidos de sustitucion de aminoacidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, acido glutamico-aspartico y asparagina-glutamina.
Como se analiza en este documento, se contemplan variaciones menores en las secuencias de aminoacidos de anticuerpos o moleculas de inmunoglobulina incluidas en la presente invencion, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoacidos mantengan al menos el 75%, mas preferiblemente al menos el 80% , 90%, 95%, y lo mas preferiblemente 99%. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoacidos. Los reemplazos
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conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos que estan relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoacidos geneticamente codificados generalmente se dividen en familias: (1) los aminoacidos acidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoacidos basicos son lisina, arginina, histidina; (3) aminoacidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano, y (4) aminoacidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cistema, serina, treonina, tirosina. Los aminoacidos hidrofflicos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoacidos hidrofobos incluyen alanina, cistema, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina y valina. Otras familias de aminoacidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxi-alifatica; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifatica; y (iv) fenilalanina, triptofano y tirosina, que son la familia aromatica. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o un reemplazo similar de un aminoacido con un aminoacido estructuralmente relacionado no tenga un efecto importante sobre la union o propiedades de la molecula resultante, especialmente si la sustitucion no implica un aminoacido dentro de un sitio marco. Si un cambio de aminoacido da como resultado un peptido funcional puede determinarse facilmente ensayando la actividad espedfica del derivado polipeptidico. Los ensayos se describen en detalle en este documento. Los expertos en la tecnica pueden preparar facilmente fragmentos o analogos de anticuerpos o moleculas de inmunoglobulina. Los terminales amino y carboxilo preferidos de los fragmentos o analogos se producen cerca de los lfmites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparacion de los datos de la secuencia de nucleotidos y/o aminoacidos con las bases de datos de secuencias publicas o patentadas. Preferiblemente, los metodos de comparacion informatizados se usan para identificar motivos de secuencia o dominios de conformacion de protema predichos que se producen en otras protemas de estructura y/o funcion conocidas. Se conocen metodos para identificar secuencias de protemas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al., Science 253: 164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la tecnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invencion.
Las sustituciones de aminoacidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidacion, (3) alteran la afinidad de union para formar complejos proteicos, (4) modifican las afinidades de union, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoqmmicas o funcionales de tales analogos. Los analogos pueden incluir diversas mutemas de una secuencia distinta de la secuencia peptfdica de origen natural. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoacidos simples o multiples (preferiblemente sustituciones conservadoras de aminoacidos) en la secuencia de origen natural (preferiblemente en la porcion del polipeptido fuera del (de los) dominio(s) que forman contactos intermoleculares. Una sustitucion conservadora de aminoacidos no debe cambiar sustancialmente las caractensticas estructurales de la secuencia progenitora (por ejemplo, un aminoacido de reemplazo no debe tender a romper una helice que se produce en la secuencia original o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia original). Ejemplos de polipeptidos reconocidos en la tecnica de estructuras secundarias y terciarias se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., WH Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, editores., Garland Publishing, New York, NY (1991)) y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).
Como se usa en este documento, los terminos "marca" o "marcado" se refieren a la incorporacion de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporacion de un aminoacido radiomarcado o la union a un polipeptido de fracciones biotiniladas que puede detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimatica que puede ser detectada mediante metodos opticos o calorimetricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador tambien puede ser terapeutico. Se conocen en la tecnica diversos metodos para marcar polipeptidos y glicoprotemas y se pueden usar. Los ejemplos de marcadores para polipeptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisotopos o radionuclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fosfuros de lantanido), marcadores enzimaticos (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epftopos polipeptfdicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metal, etiquetas de epftopo). En algunas realizaciones, las etiquetas estan unidas por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento esterico potencial. El termino "agente farmaceutico o farmaco" tal como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto qrnmico o composicion capaz de inducir un efecto terapeutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
Otros terminos qmmicos de la presente invencion se usan de acuerdo con el uso convencional en la tecnica, como se ejemplifica en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Como se usa en este documento, "sustancialmente puro" significa que una especie objetivo es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es mas abundante que cualquier otra especie individual en la composicion), y preferiblemente una fraccion sustancialmente purificada es una composicion en donde la especie objetivo comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
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Generalmente, una composicion sustancialmente pura comprendera mas de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composicion, mas preferiblemente mas de aproximadamente 85%, 90%, 95% y 99%. Lo mas preferiblemente, la especie objetivo se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composicion mediante metodos de deteccion convencionales) en donde la composicion consiste esencialmente en una unica especie macromolecular.
El termino paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
Anticuerpos
Los anticuerpos anti-TLR4 proporcionados en la presente memoria reconocen el receptor TLR4/MD-2 de humano y/o mono cynomolgus expresado en la superficie celular. Los anticuerpos son capaces de bloquear, por ejemplo, neutralizar, la activacion del receptor y la posterior senalizacion intracelular inducida por ligandos de TLR4, por ejemplo, LPS. Los anticuerpos de la invencion incluyen anticuerpos que se unen al complejo receptor TLR4/MD-2 de humano y mono cynomolgus y tambien se unen a TLR4 independientemente de la presencia de MD-2.
Los anticuerpos anti-TLR4 descritos en la presente memoria son anticuerpos que incluyen al menos una sustitucion de aminoacido espedfica en la region constante de cadena pesada gamma de modo que el anticuerpo anti-TLR4 provoca alteraciones en la funcion efectora dependiente de anffgeno mientras retiene la union al anffgeno en comparacion a un anticuerpo inalterado. En una realizacion preferida de los anticuerpos anti-TLR4, la posicion del aminoacido EU 325 de la region constante de cadena pesada gamma esta sustituida con serina, y la posicion del aminoacido EU 328 de la region constante de cadena pesada gamma esta sustituida con fenilalanina, de modo que las posiciones EU 325 a 328 de la region constante de cadena pesada gamma del anticuerpo IgG1 humano alterado comprenden la secuencia de aminoacidos SKAF (SEQ ID NO: 42).
En una realizacion, los anticuerpos anti-TLR4 que reconocen el complejo TLR4/MD-2 de humano y cynomolgus tienen la capacidad de inhibir la produccion de citoquina proinflamatoria inducida por LPS. La inhibicion se determina, por ejemplo, en sangre humana completa y los ensayos con celulas HEK 293 transfectadas con huTLR4/MD-2 tales como los descritos en las Publicaciones PCT Numeros. WO2005/065015 y WO2007/110678.
Tambien se incluyen en la descripcion anticuerpos que se unen al mismo epftopo que los anticuerpos anti-TLR4 descritos en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos anti-TLR4 de la invencion se unen espedficamente a un complejo TLR4/MD-2 humano y/o cynomolgus, donde el anticuerpo se une a un epftopo que incluye uno o mas residuos de aminoacidos en TLR4 de humano y/o mono cynomolgus entre los residuos 289 y 375 de la SEQ ID NO: 23 (humana) y la SEQ ID NO: 24 (cynomolgus). Por ejemplo, los anticuerpos de TLR4 se unen espedficamente a un epftopo que incluye residuos seleccionados del grupo que consiste en al menos los residuos 328 y 329 de la SEQ ID NO: 23 (humana) y la SEQ ID NO: 24 (cynomolgus); al menos los residuos 349 a 351 de la SEQ ID NO: 23 (humana) y la SEQ ID NO: 24 (cynomolgus); y al menos los residuos 369 a 371 de la SEQ ID NO: 23 (humana) y SEQ ID NO: 24 (cynomolgus).
Se pueden usar diversos procedimientos conocidos en la tecnica para la produccion de anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra un objetivo dado, tal como, por ejemplo, un receptor tipo Toll, el complejo TLR4/MD-2 humano y/o cynomolgus, o TLR4 cuando no esta complejado con MD-2, o contra derivados, fragmentos, analogos, homologos u ortologos de los mismos. (Vease, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, y Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Los anticuerpos se purifican por tecnicas bien conocidas, tales como cromatograffa de afinidad que usa protema A o protema G, que proporcionan principalmente la fraccion IgG del suero inmune. Posteriormente, o alternativamente, el anffgeno espedfico que es el objetivo de la inmunoglobulina buscada, o un epftopo del mismo, se puede inmovilizar en una columna para purificar el anticuerpo inmune espedfico mediante cromatograffa de inmunoafinidad. La purificacion de inmunoglobulinas se discute, por ejemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April17, 2000), paginas. 25-28).
Preferiblemente, los anticuerpos anti-TLR4 de la invencion son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales anti-TLR4 se generan, por ejemplo, usando los procedimientos expuestos en las publicaciones PCT Nos. WO 2005/065015, WO 2007/110678 y/o WO 2009/101479. Los anticuerpos anti-TLR4 se generan, por ejemplo, usando los procedimientos expuestos en los Ejemplos proporcionados en este documento. Los anticuerpos anti-TLR4 tambien se generan, por ejemplo, inmunizando ratones BALB/c con combinaciones de transfectantes celulares que expresan altos niveles de un objetivo dado en su superficie. Los hibridomas resultantes de las fusiones de mieloma/celula B se criban a continuacion para determinar su reactividad frente al objetivo seleccionado.
Los anticuerpos monoclonales se preparan, por ejemplo, usando metodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un metodo de hibridoma, un raton, hamster u otro animal huesped apropiado, se inmuniza ffpicamente con un agente inmunizante para provocar linfocitos que producen o son capaces de
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producir anticuerpos que se uniran espedficamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.
El agente inmunizante tfpicamente incluira el antfgeno de protema, un fragmento del mismo o una protema de fusion del mismo. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periferica si se desean celulas de origen humano, o celulas de bazo o celulas de ganglios linfaticos si se desean fuentes de mamfferos no humanos. Los linfocitos luego se fusionan con una lmea celular inmortalizada usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) paginas 59-103). Las lmeas celulares inmortalizadas generalmente son celulas de marnffero transformadas, particularmente celulas de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se emplean lmeas celulares de mieloma de rata o raton. Las celulas de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas tfpicamente incluira hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que previenen el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.
Las lmeas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan una expresion estable de alto nivel de anticuerpo por las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las lmeas celulares inmortalizadas mas preferidas son lmeas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Tambien se han descrito lmeas celulares de mieloma humano y heteromieloma de raton-humano para la produccion de anticuerpos monoclonales. (Vease Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pp. 51-63)).
El medio de cultivo en el que las celulas de hibridoma se cultivan puede a continuacion ensayarse para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antfgeno. Preferiblemente, la especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos por las celulas de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA). Dichas tecnicas y ensayos son conocidos en la tecnica. La afinidad de union del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el analisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980). Ademas, en aplicaciones terapeuticas de anticuerpos monoclonales, es importante identificar anticuerpos que tengan un alto grado de especificidad y una alta afinidad de union por el antfgeno objetivo.
Despues de identificar las celulas de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilucion limitante y crecer mediante metodos estandar. (Vease Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) paginas 59-103). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las celulas de hibridoma se pueden cultivar in vivo como ascitis en un mairnfero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido de ascitis mediante procedimientos de purificacion de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, protema A- Sefarosa, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis, o cromatograffa de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales tambien pueden prepararse por metodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente de los Estados Unidos No 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invencion se puede aislar y secuenciar facilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleotido que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresion, que luego se transfectan en celulas huesped tales como celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que de otra forma no producen protema de inmunoglobulina, para obtener la smtesis de anticuerpos monoclonales en las celulas huesped recombinantes. El ADN tambien se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homologas (vease la patente de Estados Unidos No 4.816.567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)). o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificadora de un polipeptido diferente de inmunoglobulina. Tal polipeptido diferente de inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invencion, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinacion de anffgeno de un anticuerpo de la invencion para crear un anticuerpo bivalente quimerico.
Los anticuerpos monoclonales de la invencion incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Estos anticuerpos son adecuados para la administracion a humanos sin engendrar una respuesta inmune por el humano contra la inmunoglobulina administrada. Las formas humanizadas de anticuerpos son inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen al anffgeno) que estan principalmente compuestas por la secuencia de una inmunoglobulina
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humana, y contienen una secuencia minima derivada de una inmunoglobulina no humana. La humanizacion se realiza, por ejemplo, siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen. et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), sustituyendo CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. (Vease tambien la patente de Estados Unidos No. 5.225.539). En algunos casos, los residuos del marco de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados tambien comprenden, por ejemplo, residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o las secuencias marco. En general, el anticuerpo humanizado incluye sustancialmente todos de al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien incluye de forma optima al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988 y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. ., 2: 593-596 (1992)).
Los anticuerpos completamente humanos son moleculas de anticuerpo en las que la secuencia completa tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, que incluye las CDR, surge de genes humanos. Dichos anticuerpos se denominan "anticuerpos humanos" o "anticuerpos completamente humanos" en este documento. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando la tecnica del trioma; la tecnica del hibridoma de celulas B humanas (vease Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la tecnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales (vease Cole, et al., 1985 en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., paginas. 7796). Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales y se pueden producir usando hibridomas humanos (vease Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando celulas B humanas con virus de Epstein Barr in vitro (vease Cole , et al., 1985 en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., paginas. 7796).
Ademas, los anticuerpos humanos tambien se pueden producir usando tecnicas adicionales, que incluyen bibliotecas de presentacion en fagos. (Vease Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581
(1991) ). De forma similar, los anticuerpos humanos pueden prepararse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgenicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endogena se han inactivado parcial o completamente. Tras la exposicion, se observa la produccion de anticuerpos humanos, que se parece mucho a aquella que se observa en humanos en todos los aspectos, incluida la reorganizacion genetica, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos numeros 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783
(1992) ; Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Inter. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
Los anticuerpos humanos pueden producirse adicionalmente usando animales transgenicos no humanos que se modifican para producir anticuerpos completamente humanos en lugar de los anticuerpos endogenos del animal en respuesta a la exposicion a un antfgeno. (Vease la publicacion PCT WO94/02602). Los genes endogenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera en el huesped no humano han sido incapacitados, y los loci activos que codifican las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera humanas se insertan en el genoma del huesped. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, usando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humano requeridos. Entonces se obtiene un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas como progenie mediante cruzamiento de animales transgenicos intermedios que contienen menos que el complemento completo de las modificaciones. Un ejemplo de dicho animal no humano es un raton denominado XenomouseMR como se describe en las publicaciones PCT Wo 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce celulas B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos se pueden obtener directamente del animal despues de la inmunizacion con un inmunogeno de interes, como, por ejemplo, una preparacion de un anticuerpo policlonal, o alternativamente de celulas B inmortalizadas derivadas del animal, tales como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse adicionalmente para obtener analogos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moleculas de Fv de cadena sencilla (scFv).
Un ejemplo de un metodo para producir un huesped no humano, ejemplificado como un raton, que carece de expresion de una cadena pesada de inmunoglobulina endogena se describe en la patente de los Estados Unidos No 5.939.598. Puede obtenerse mediante un metodo, que incluye eliminar los genes del segmento J de al menos un locus de cadena pesada endogeno en una celula madre embrionaria para evitar la reorganizacion del locus y evitar la formacion de una transcripcion de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizada, la eliminacion se efectua mediante un vector de direccionamiento que contiene un gen que codifica un marcador seleccionable; y produciendo a partir de la celula madre embrionaria un raton transgenico cuyas celulas somaticas y germinales contienen el gen que codifica el marcador seleccionable.
Un metodo para producir un anticuerpo de interes, tal como un anticuerpo humano, se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5.916.771. Este metodo incluye introducir un vector de expresion que contiene una secuencia de
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nucleotidos que codifica una cadena pesada en una celula huesped de mai^ero en cultivo, introducir un vector de expresion que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una cadena ligera en otra celula huesped de mairnfero y fusionar las dos celulas para formar una celula Idbrida. La celula Idbrida expresa un anticuerpo que contiene la cadena pesada y la cadena ligera.
En una mejora adicional de este procedimiento, en la publicacion PCT WO99/53049 se describe un metodo para identificar un epttopo clmicamente relevante en un inmunogeno y un metodo correlativo para seleccionar un anticuerpo que se une espedficamente al epftopo relevante con alta afinidad.
El anticuerpo puede expresarse mediante un vector que contiene un segmento de ADN que codifica el anticuerpo monocatenario descrito anteriormente.
Estos pueden incluir vectores, liposomas, ADN desnudo, ADN asistido por adyuvante, pistola genica, cateteres, etc. Los vectores incluyen conjugados qmmicos tales como los descritos en el documento WO 93/64701, que tiene una fraccion de direccionamiento (por ejemplo, un ligando a un receptor de superficie celular) y una fraccion de union a acido nucleico (por ejemplo, polilisina), un vector viral (por ejemplo, un vector viral de ADN o ARN), protemas de fusion tales como las descritas en el documento WO 95/22618 que es una protema de fusion que contiene una fraccion objetivo (por ejemplo, un anticuerpo espedfico para una celula objetivo) y una fraccion de union a acido nucleico (por ejemplo una protamina), plasmidos, fagos, etc. Los vectores pueden ser cromosomicos, no cromosomicos o sinteticos.
Los vectores preferidos incluyen vectores virales, protemas de fusion y conjugados qmmicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de leucemia murina de Moloney. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de viruela tales como vectores ortopox o de viruela aviar, vectores del virus del herpes tales como el vector del virus del herpes simple I (HSV) (vease Geller, AI et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F. et al., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford Inglaterra) (1995); Geller, AI et al., Proc Natl. Acad. Sci .: USA 90: 7603 (1993), Geller, AI, et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 87: 1149 (1990), Vectores adenovirus (vease LeGal LaSalle et al., Science, 259: 988 (1993)); Davidson, et al., Nat. Genet 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995) y vectores de virus adenoasociados (vease Kaplitt, MG et al., Nat. Genet. 8: 148 (1994)).
Los vectores virales introducen el gen en el citoplasma de las celulas. Los vectores del virus de viruela aviar dan como resultado solo una expresion a corto plazo del acido nucleico. Se prefieren vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados y vectores del virus del herpes simple (HSV) para introducir el acido nucleico en las celulas neuronales. El vector de adenovirus da como resultado una expresion a mas corto plazo (aproximadamente 2 meses) que el virus adenoasociado (aproximadamente 4 meses), que a su vez es mas corta que los vectores de HSV. El vector particular elegido dependera de la celula objetivo y la condicion que se trate. La introduccion puede ser mediante tecnicas estandar, por ejemplo, infeccion, transfeccion, transduccion o transformacion. Los ejemplos de modos de transferencia genica incluyen, por ejemplo, ADN desnudo, precipitacion con CaPO4, DEAE dextrano, electroporacion, fusion de protoplastos, lipofeccion, microinyeccion celular y vectores virales.
El vector puede emplearse para dirigirse esencialmente a cualquier celula objetivo deseada. Por ejemplo, la inyeccion estereotaxica se puede usar para dirigir los vectores (por ejemplo, adenovirus, HSV) a una ubicacion deseada. Ademas, las partmulas pueden administrarse mediante infusion intracerebroventricular (icv) usando un sistema de infusion de minibomba, tal como un sistema de infusion SynchroMed. Un metodo basado en el flujo a granel, denominado conveccion, tambien ha demostrado su eficacia en el suministro de moleculas grandes a areas extendidas del cerebro y puede ser util para suministrar el vector a la celula objetivo. (Vease Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 20762080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol., 266: 292-305 (1994)). Otros metodos que se pueden usar incluyen cateteres, inyeccion intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutanea, y vfas de administracion oral u otras conocidas.
Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos que tienen especificidades de union por al menos dos andgenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de union es para un objetivo tal como TLR4, MD-2, complejo TLR4/MD-2 de humano y/o cynomolgus o cualquier fragmento del mismo. El segundo objetivo de union es cualquier otro andgeno, y ventajosamente es una protema o receptor o subunidad receptora de la superficie celular.
Los metodos para producir anticuerpos biespedficos son conocidos en la tecnica. Tradicionalmente, la produccion recombinante de anticuerpos biespedficos se basa en la coexpresion de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulinas, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moleculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespedfica correcta. La purificacion de la molecula correcta generalmente se realiza por etapas de cromatograda de afinidad. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
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Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion anticuerpo- antigeno) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera region constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la union de cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion separados, y se cotransfectan en un organismo huesped adecuado. Para mas detalles sobre la generacion de anticuerpos biespedficos, vease, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO 96/27011, la interfaz entre un par de moleculas de anticuerpo puede disenarse para maximizar el porcentaje de heterodfmeros que se recuperan del cultivo de celulas recombinantes. La interfaz preferida incluye al menos una parte de la region CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, una o mas cadenas laterales de aminoacidos pequenas de la interfaz de la primera molecula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mas grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano). Las "cavidades" compensatorias de tamano identico o similar a la o las cadenas laterales grandes se crean en la interfaz de la segunda molecula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoacidos grandes por cadenas mas pequenas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodfmero frente a otros productos finales no deseados tales como homodfmeros.
Las tecnicas para generar anticuerpos biespedficos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespedficos pueden prepararse usando un enlace qmmico. Los anticuerpos biespedficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.
Se han descrito tambien diversas tecnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespedficos directamente del cultivo de celulas recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespedficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992). Los peptidos de cremallera de leucina de las protemas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusion genica. Los homodfmeros de anticuerpos se redujeron en la region bisagra para formar monomeros y luego se oxidaron nuevamente para formar los heterodfmeros de anticuerpo. Este metodo tambien puede utilizarse para la produccion de homodfmeros de anticuerpos. La tecnologfa de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespedficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios Vh y Vl de un fragmento se fuerzan para aparearse con los dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento, formando asf dos sitios de union al antfgeno. Otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespedficos mediante el uso de dfmeros de Fv de cadena unica (sFv) tambien ha sido reportada Vease, Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespedficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
Los anticuerpos biespedficos ilustrativos se pueden unir a dos epftopos diferentes, al menos uno de los cuales se origina en el antfgeno de protema de la invencion. Alternativamente, un brazo antiantigenico de una molecula de inmunoglobulina se puede combinar con un brazo que se une a una molecula desencadenante en un leucocito tal como una molecula receptora de celulas T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7) o receptores de Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) para centrar los mecanismos de defensa celular en la celula que expresa el antfgeno particular. Los anticuerpos biespedficos tambien pueden usarse para dirigir agentes citotoxicos a celulas que expresan un antfgeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de union al antfgeno y un brazo que se une a un agente citotoxico o un quelante de radionuclidos, como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespedfico de interes se une al antfgeno de protema descrito en la presente memoria y se une adicionalmente al factor tisular (TF).
Los anticuerpos heteroconjugados tambien se describen en el presente documento. Los anticuerpos heteroconjugados estan compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir celulas del sistema inmunitario a celulas no deseadas (vease la patente de Estados Unidos No. 4.676.980) y para el tratamiento de la infeccion por VIH (veanse los documentos WO 91/00360, WO 92/200373, EP 03089). Se contempla que los anticuerpos se pueden preparar in vitro usando metodos conocidos en qmmica de protemas sinteticas, que incluyen aquellos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse usando una reaccion de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioeter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 4.676.980.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invencion con respecto a la funcion efectora, para mejorar, por ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con la senalizacion de LPS aberrante. Por ejemplo, el o los residuos de cistema pueden introducirse en la region Fc, permitiendo de este modo la formacion de enlaces disulfuro entre las cadenas en esta region. El anticuerpo homodimerico generado de este modo
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puede tener una capacidad de internalizacion mejorada y/o una mayor destruccion de celulas mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). (Vease Caron et al., J. Exp Med., 176: 11911195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente, se puede disenar un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y, por lo tanto, puede tener lisis de complemento mejorada y capacidades de ADCC. (Vease Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).
La descripcion tambien se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotoxico tal como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isotopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).
Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos no enlazantes de toxina difterica, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, sarcina alfa, protemas de Aleurites fordii, protemas de diantina, protemas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Una variedad de radionucleidos estan disponibles para la produccion de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I,
131|n, 90y y 186Re.
Los conjugados del anticuerpo y agente citotoxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de protemas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehndos (como glutaraldehndo), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)
hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolieno) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El acido 1- isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminapentaacetico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugacion del radionucleotido al anticuerpo. (Vease el documento WO94/11026).
Los expertos en la tecnica reconoceran que se puede acoplar una gran variedad de fracciones posibles a los anticuerpos resultantes de la invencion. (Vease, por ejemplo, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J.M. Cruse y R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, Nueva York, (1989).
El acoplamiento se puede realizar mediante cualquier reaccion qrnmica que una a las dos moleculas siempre que el anticuerpo y la otra fraccion retengan sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos qmmicos, por ejemplo union covalente, union por afinidad, intercalacion, union coordinada y complejacion. La union preferida es, sin embargo, union covalente. La union covalente puede lograrse mediante condensacion directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporacion de moleculas puente externas. Muchos agentes de enlace bivalentes o polivalentes son utiles para acoplar moleculas de protemas, tales como los anticuerpos de la presente invencion, a otras moleculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos organicos tales como tioesteres, carbodiimidas, esteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldefndo, diazobencenos y hexametilendiaminas. Este listado no pretende ser exhaustivo de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la tecnica sino, mas bien, es un ejemplo de los agentes de acoplamiento mas comunes. (Vease Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984), Jansen et al., Immunological Reviews 62: 185-216 (1982), y Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987).
Los enlazadores preferidos se describen en la literatura. (Vease, por ejemplo, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44: 201-208 (1984) que describe el uso de MBS (ester de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Vease tambien la patente de Estados Unidos No. 5.030.719, que describe uso de un derivado de acetil hidracida halogenado acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oiigopeptfdico. Los enlazadores particularmente preferidos incluyen: (i) EDC clorhidrato de (1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida, (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil- ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP hexanoato de (succinimidil-6[3-(2-piridilditio)-propionamida] (Pierce Chem. Co., Cat. #21651-G); (iv) Sulfo-LC-SPDP hexanoato de(sulfosuccinimidil-6[3-(2-piridilditio)-propionamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. # 2165-G); y (v) Sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., Cat. # 24510) conjugado con EDC.
Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, lo que conduce a conjugados con diferentes propiedades fisicoqmmicas. Por ejemplo, los esteres de Sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son mas estables que los esteres de Sulfo-NHS de carboxilatos aromaticos. Los enlazadores que contienen ester de NHS son menos solubles que los esteres de Sulfo-NHS. Ademas, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro estericamente impedido, y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro, en general, son menos estables que otros enlaces debido a que el enlace disulfuro se escinde in vitro, dando como resultado un menor conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodimida. Los acoplamientos de carbodiimida (tales como EDC) cuando se usan junto con Sulfo-NHS, forman esteres que son mas resistentes a la hidrolisis que la reaccion de acoplamiento de carbodimida sola.
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Los anticuerpos descritos en la presente memoria tambien se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por metodos conocidos en la tecnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y la patente de los EE. UU. Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un tiempo de circulacion mejorado se describen en la patente de los EE.UU. numero 5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente utiles mediante el metodo de evaporacion de fase inversa con una composicion lipfdica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina que forma derivado con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a traves de filtros de tamano de poro definido para producir liposomas con el diametro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invencion se pueden conjugar con los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) a traves de una reaccion de intercambio de disulfuro.
Uso de anticuerpos anti-TLR4
Se apreciara que la administracion de entidades terapeuticas de acuerdo con la invencion se administraran con vetticulos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar una transferencia, suministro, tolerancia y similares mejorados. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los qmmicos farmaceuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el Captiulo 87 por Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, unguentos, gelatinas, ceras, aceites, lfpidos, vesmulas que contienen lfpido (cationico o anionico) (tal como LipofectinMR), conjugados de ADN, pastas de absorcion anhidra, aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisolidos y mezclas semisolidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada para uso en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invencion, con la condicion de que el ingrediente activo en la formulacion no se inactive por la formulacion y la formulacion sea fisiologicamente compatible y tolerable con la via de administracion. Vease tambien Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2): 210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery- some emerging concepts". J Pharm Sci. 89(8): 967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 (1998) y las citas en el mismo para obtener informacion adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vetticulos bien conocidos por los qmmicos farmaceuticos.
Las formulaciones terapeuticas, que incluyen un anticuerpo anti-TLR4 de la invencion, se usan para tratar o aliviar un smtoma asociado con un trastorno relacionado con el sistema inmune. La presente invencion tambien proporciona el anticuerpo de la invencion para uso en el tratamiento o alivio de un smtoma asociado con un trastorno relacionado con el sistema inmune. Se lleva a cabo un regimen terapeutico identificando un sujeto, por ejemplo, un paciente humano que padece (o esta en riesgo de desarrollar) un trastorno relacionado con el sistema inmune, usando metodos estandar. Por ejemplo, los anticuerpos anti-TLR4 de la invencion son herramientas terapeuticas utiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y/o trastornos inflamatorios. En ciertas realizaciones, el uso de anticuerpos anti-TLR4 que modulan, por ejemplo, inhiben, neutralizan o interfieren con la senalizacion de TLR, se contempla para tratar enfermedades autoinmunes y/o trastornos inflamatorios.
Las enfermedades autoinmunes incluyen, por ejemplo, Smdrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA, que es una enfermedad viral con un componente autoinmune), alopecia areata, espondilitis anquilosante, smdrome antifosfotipido, enfermedad autoinmune de Addison, anemia hemotitica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad autoinmune del ofdo interno (AIED), smdrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), purpura trombocitopenica autoinmune (ATP), enfermedad de Behcet, cardiomiopatia, dermatitis herpetiforme celiaca; smdrome de disfuncion inmune de fatiga cronica (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatoria cronica (CIPD), penfigoide cicatricial, enfermedad de aglutinina fria, smdrome de cresta, enfermedad de Crohn, enfermedad de Degos, dermatomiositis juvenil, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopatica, purpura trombocitopenica idiopatica (ITP), nefropatia de IgA, diabetes mellitus insulinodependiente, artritis cronica juvenil (enfermedad de Still), artritis reumatoide juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad del tejido conectivo mixto, esclerosis multiple, miastenia grave, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, smdromes poliglandulares, polimialgia reumatica, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriasica, fenomeno de Raynaud, smdrome de Reiter, fiebre reumatica, artritis reumatoide, sarcoidosis esclero derma (esclerosis sistemica progresiva (PSS), tambien conocida como esclerosis sistemica (SS)), smdrome de Sjogren, smdrome de hombre ngido, lupus eritematoso sistemico, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de celulas gigantes, colitis ulcerosa, uveitis, vitiligo y granulomatosis de Wegener .
Los trastornos inflamatorios incluyen, por ejemplo, trastornos inflamatorios cronicos y agudos. Ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen enfermedad de Alzheimer, asma, alergia atopica, alergia, aterosclerosis, asma bronquial, eccema, glomerulonefritis, enfermedad de injerto contra huesped, anemias hemotiticas, osteoartritis, sepsis, apoplejfa, trasplante de tejido y organos, vasculitis, retinopatia diabetica y lesion pulmonar inducida por ventilador.
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Por ejemplo, los anticuerpos anti-TLR4 son utiles en el tratamiento de inflamacion aguda y sepsis inducida por productos microbianos (por ejemplo, LPS) y exacerbaciones que surgen de esta inflamacion aguda, tales como, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva cronica y asma (vease O'Neill, Curr. Opin. Pharmacol., 3: 396-403 (2003), incorporado en este documento como referencia en su totalidad). Dichos anticuerpos tambien son utiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes neurodegenerativas. (Lehnardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 85148519 (2003)).
Ademas, los anticuerpos de la invencion tambien son utiles como reactivos terapeuticos en el tratamiento de enfermedades, tales como, por ejemplo, osteoartritis, que son causadas por estres, por ejemplo, estres celular, que, a su vez, induce factores de "estres" solubles endogenos que desencadenan TLR4. El factor de estres soluble endogeno incluye, por ejemplo, Hsp60 (vease Ohashi et al., J. Immunol. 164: 558-561 (2000)) y fibronectina (vease Okamura et al., J. Biol. Chem. 276: 10229-10233 (2001)) y sulfato de heparina, hialuronano, gp96, p-Defensina-2 o protema A surfactante (vease, por ejemplo, Johnson et al., Crit. Rev. Immunol., 23 (1-2): 15-44 (2003)). Los anticuerpos de la invencion tambien son utiles en el tratamiento de una variedad de trastornos asociados con el estres, tales como, por ejemplo, el estres celular que esta asociado con sujetos y pacientes colocados en respiradores, ventiladores y otros dispositivos de ayuda respiratoria. Por ejemplo, los anticuerpos de la invencion es util en el tratamiento de la lesion pulmonar inducida por el ventilador ("VILI"), tambien denominada lesion pulmonar asociada a la ventilacion ("VALI").
Otras areas de enfermedad en las que la funcion inhibidora de TLR4 podna ser beneficiosa incluyen, por ejemplo, inflamacion cronica (por ejemplo, inflamacion cronica asociada con condiciones alergicas y asma), enfermedades autoinmunes (por ejemplo, trastorno inflamatorio intestinal) y aterosclerosis (vease O'Neill, Curr. Opin. Pharmacol., 3: 396-403 (2003)).
Los smtomas asociados con estos trastornos relacionados con el sistema inmune incluyen, por ejemplo, inflamacion, fiebre, malestar general, fiebre, dolor, a menudo localizado en el area inflamada, pulso rapido, dolor o molestias en las articulaciones (artralgia), respiracion rapida u otros patrones de respiracion anormal, escalofnos, confusion, desorientacion, agitacion, mareos, tos, disnea, infecciones pulmonares, insuficiencia cardfaca, insuficiencia respiratoria, edema, aumento de peso, recafdas mucopurulentas, caquexia, sibilancia, dolor de cabeza y smtomas abdominales como, por ejemplo, dolor abdominal, diarrea o estrenimiento.
La eficacia del tratamiento se determina en asociacion con cualquier metodo conocido para diagnosticar o tratar el trastorno particular relacionado con el sistema inmune. El alivio de uno o mas smtomas del trastorno relacionado con el sistema inmune indica que el anticuerpo confiere un beneficio clmico.
Los metodos para el cribado de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero no se limitan a, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y otras tecnicas inmunologicamente mediadas conocidas en el arte.
Los anticuerpos dirigidos contra un objetivo tal como TLR2, CD14, TLR4, MD-2, el complejo TLR4/MD-2 o cualquier receptor tipo Toll (o un fragmento del mismo) se pueden usar en metodos conocidos en la tecnica relacionados con la localizacion y/o cuantificacion de estos objetivos, por ejemplo, para uso en la medicion de niveles de estos objetivos dentro de muestras fisiologicas apropiadas, para uso en metodos de diagnostico, para uso en la formacion de imagenes de la protema, y similares). En una realizacion dada, los anticuerpos espedficos de cualquiera de estos objetivos, o derivado, fragmento, analogo u homologo de los mismos, que contienen el dominio de union al antfgeno derivado de anticuerpos, se utilizan como compuestos farmacologicamente activos (denominados en lo sucesivo "Terapeuticos").
Un anticuerpo anti-TLR4 de la invencion se puede usar para aislar un objetivo particular usando tecnicas estandar, tales como inmunoafinidad, cromatograffa o inmunoprecipitacion. Los anticuerpos anti-TLR4 de la invencion (o un fragmento de los mismos) se pueden usar en forma diagnostica para controlar los niveles de protema en el tejido como parte de un procedimiento de prueba clmica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un regimen de tratamiento dado. La deteccion se puede facilitar acoplando (es decir, enlazando ffsicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prosteticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescema, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.
Los anticuerpos de la invencion, que incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados y completamente humanos, pueden usarse como agentes terapeuticos. Tales agentes se emplearan generalmente para tratar o prevenir una enfermedad o patologfa asociada con la expresion aberrante o la activacion de un objetivo dado en un sujeto. Se administra al sujeto una preparacion de anticuerpo, preferiblemente una que tiene alta especificidad y alta afinidad por su antfgeno objetivo, y generalmente tendra un efecto debido a su union con el objetivo. La administracion del
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anticuerpo puede anular o inhibir o interferir con la funcion de senalizacion del objetivo. La administracion del anticuerpo puede anular o inhibir o interferir con la union del objetivo con un ligando endogeno al que se une de forma natural. Por ejemplo, el anticuerpo se une al objetivo y neutraliza la produccion de citoquina proinflamatoria inducida por LPS.
Una cantidad terapeuticamente efectiva de un anticuerpo de la invencion se refiere generalmente a la cantidad necesaria para lograr un objetivo terapeutico. Como se indico anteriormente, esta puede ser una interaccion vinculante entre el anticuerpo y su antigeno objetivo que, en ciertos casos, interfiere con el funcionamiento del objetivo. La cantidad requerida para administrar dependera ademas de la afinidad de union del anticuerpo por su antigeno espedfico, y tambien dependera de la velocidad a la que un anticuerpo administrado se agota del volumen libre del otro sujeto al que se administra. Los intervalos comunes para la dosificacion terapeuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion pueden ser, a modo de ejemplo no limitante, de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de dosificacion comunes pueden variar, por ejemplo, de dos veces al dfa a una vez a la semana.
Los anticuerpos o uno de sus fragmentos de la invencion se pueden administrar para el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos en forma de composiciones farmaceuticas. Los principios y consideraciones involucrados en la preparacion de tales composiciones, asf como la orientacion en la eleccion de los componentes, se proporcionan, por ejemplo, en Remington: The Science And Practice of Pharmacy, 19a ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., Editores) Mack Pub. Co., Easton, Pa .: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.
Cuando se usan fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor mas pequeno que se une espedficamente al dominio de union de la protema objetivo. Por ejemplo, en base a las secuencias de la region variable de un anticuerpo, se pueden disenar moleculas peptfdicas que conserven la capacidad de unirse a la secuencia de protema objetivo. Tales peptidos se pueden sintetizar qmmicamente y/o producirse mediante tecnologfa de ADN recombinante. (Vease, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). La formulacion tambien puede contener mas de un compuesto activo segun sea necesario para la indicacion particular que se trata, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sf Alternativamente, o ademas, la composicion puede comprender un agente que potencia su funcion, tal como, por ejemplo, un agente citotoxico, citoquina, agente quimioterapeutico o agente inhibidor del crecimiento. Dichas moleculas estan adecuadamente presentes en combinacion en cantidades que son efectivas para el proposito pretendido.
Los principios activos tambien se pueden atrapar en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcapsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartmulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones.
Las formulaciones a usar para la administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se logra facilmente por filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles.
Se pueden elaborar preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polfmeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices estan en forma de artmulos conformados, por ejemplo, pelmulas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (patente de Estados Unidos No. 3.773.919), copolfmeros de acido L-glutamico y Y-etil-L-glutamato, acetato etilenvinilo no degradable, copolfmeros degradables de acido lactico-acido glicolico tales como LUPRON DEPOTMR (microesferas inyectables compuestas de copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida), y Acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco. Mientras que los polfmeros tales como acetato de etilenvinilo y acido lactico-acido glicolico permiten la liberacion de moleculas durante mas de 100 dfas, ciertos hidrogeles liberan protemas durante periodos de tiempo mas cortos.
Un anticuerpo de acuerdo con la invencion puede usarse como un agente para detectar la presencia de un objetivo dado (o un fragmento de protema del mismo) en una muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene una etiqueta detectable. Los anticuerpos son policlonales, o mas preferiblemente, monoclonales. Se usa un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, scFv o F(ab)2). El termino "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar el marcaje directo de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir, uniendo ffsicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, asf como el etiquetado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que esta directamente marcado. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen la deteccion de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado de forma fluorescente y el marcado final de una sonda de ADN con biotina de manera que se pueda detectar con estreptavidina marcada de forma fluorescente. El termino "muestra biologica" pretende incluir tejidos, celulas y fluidos biologicos aislados de un sujeto, asf como tejidos, celulas y fluidos presentes en un sujeto. Incluido dentro del uso del termino "muestra biologica", por lo tanto, se encuentra la sangre y una fraccion o componente de la sangre que incluye suero sangumeo, plasma sangumeo o linfa. Es decir, el
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metodo de deteccion puede usarse para detectar un ARNm, protema o ADN genomico de un analito en una muestra biologica in vitro as^ como in vivo. Por ejemplo, las tecnicas in vitro para la deteccion de un ARNm de analito incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las tecnicas in vitro para la deteccion de una protema de analito incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las tecnicas in vitro para la deteccion de un ADN genomico de analito incluyen hibridaciones Southern. Se describen procedimientos para realizar inmunoensayos, por ejemplo, en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Ademas, las tecnicas in vivo para la deteccion de una protema de analito incluyen la introduccion en un sujeto de un anticuerpo de antiprotema de analito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radioactivo cuya presencia y localizacion en un sujeto pueden detectarse mediante tecnicas de imagenologfa estandar.
Composiciones farmaceuticas
Los anticuerpos de la invencion o polipeptidos quimericos solubles de la divulgacion (tambien denominados en la presente memoria como "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, analogos y homologos de los mismos, se pueden incorporar en composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion. Dichas composiciones tfpicamente comprenden el anticuerpo o el polipeptido quimerico soluble y un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, el termino "vehmulo farmaceuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de retardo de la absorcion, y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. Los portadores adecuados se describen en la edicion mas reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estandar en este campo. Los ejemplos preferidos de tales vehmulos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solucion salina, soluciones de Ringer, solucion de dextrosa y albumina de suero humano al 5%. Tambien se pueden usar liposomas y vehmulos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. Compuestos activos suplementarios tambien se pueden incorporar en las composiciones.
Se formula una composicion farmaceutica para que sea compatible con su via de administracion prevista. Los ejemplos de vfas de administracion incluyen administracion parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradermica, subcutanea, oral (por ejemplo, inhalacion), transdermica (es decir, topica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico o metil parabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiaminotetraacetico (EDTA); reguladores tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con acidos o bases, como acido clortudrico o hidroxido de sodio. La preparacion parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis multiples hechos de vidrio o plastico.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas esteriles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para la administracion intravenosa, los vehmulos adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor ELMR (BASF, Parsippany, N.J.) o solucion salina regulada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composicion debe ser esteril y debe ser fluida de tal menara que exista facilidad de administracion mediante jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe conservarse frente a la accion contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehmulo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partmula requerido en el caso de la dispersion y mediante el uso de tensoactivos. La prevencion de la accion de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehmulo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion son secado al vacm y liofilizacion que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado de una solucion filtrada previamente de forma esteril del mismo.
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Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vetnculo comestible. Pueden encerrarse en capsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el proposito de la administracion terapeutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de tabletas, pastillas o capsulas. Las composiciones orales tambien se pueden preparar usando un vetnculo fluido para usar como enjuague bucal, en el que el compuesto en el vetnculo fluido se aplica por via oral y se agita y se expectora o se ingiere. Los agentes aglutinantes farmaceuticamente compatibles y/o los materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composicion. Las tabletas, pfldoras, capsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente disgregante tal como acido algmico, Primogel o almidon de mafz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o sabor de naranja.
Para la administracion por inhalacion, los compuestos se suministran en forma de un atomizador en aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dioxido de carbono, o un nebulizador.
La administracion sistemica tambien puede ser por medios transmucosales o transdermicos. Para la administracion transmucosal o transdermica, se usan en la formulacion penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, para administracion transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de acido fusfdico. La administracion transmucosal se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administracion transdermica, los compuestos activos se formulan en unguentos, pomadas, geles o cremas como se conoce generalmente en la tecnica.
Los compuestos tambien pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retencion para administracion rectal.
En una realizacion, los compuestos activos se preparan con vehnculos que protegeran el compuesto contra la eliminacion rapida del cuerpo, tal como una formulacion de liberacion controlada, que incluye implantes y sistemas de administracion microencapsulados. Se pueden usar polfmeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhndridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Los metodos para la preparacion de tales formulaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Los materiales tambien se pueden obtener comercialmente a traves de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomicas (que incluyen liposomas dirigidos a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales contra antfgenos virales) tambien pueden usarse como vehnculos farmaceuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. La forma unitaria de dosificacion como se usa en la presente memoria se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehnculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas unitarias de dosificacion estan dictadas y dependen directamente de las caractensticas unicas del compuesto activo y del efecto terapeutico particular que debe lograrse, y las limitaciones inherentes en la tecnica de composicion de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmaceuticas se pueden incluir en un recipiente, empaque o dispensador junto con instrucciones para la administracion.
La invencion se describira adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invencion descrita en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1. Generacion de transfectantes estables de TLR4 de mono cynomolgus y TLR4/MD-2 humano
Se generaron transfectantes estables deTLR4 de mono cynomolgus y TLR4/MD-2 humano en celulas CHO-K1 basandose en las secuencias que se describen a continuacion.
> Secuencia de aminoacidos de TLR4 humano
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MMSASRLAGTLIPAMAFLSCVRPESWEPCVEWPNITYQCMELNFYKIPDNLPFSTKNL
DLSFNPLRHLGSYSFFSFPELQVLDLSRCEIQTIEDGAYQSLSHLSTLILTGNPIQSLALGAF
SGLS
SLQKLVAVETNLASLENFPIGHLKTLKELNVAHNLIQSFKLPEYFSNLTNLEHLDLSSNKIQS IYCTDLRVLHQMPLLNLSLDLSLNPMNFIQPGAFKEIRLHKLTLRNNFDSLNVMKTCIQGLAG LEVHRLVLGEFRNEGNLEKFDKSALEGLCNLTIEEFRLAYLDYYLDDIIDLFNCLTNVSSFSL VSVTIERVKDFSYNFGWQHLELVNCKFGQFPTLKLKSLKRLTFTSNKGGNAFSEVDLPSLEFL DLSRNGLSFKGCCSQSDFGTTSLKYLDLSFNGVITMSSNFLGLEQLEHLDFQHSNLKQMSEFS VFLSLRNLIYLDISHTHTRVAFNGIFNGLSSLEVLKMAGNSFQENFLPDIFTELRNLTFLDLS QCQLEQLS PTAFNSLSSLQVLNMSHNNFFSLDTFPYKCLNSLQVLDYSLNHIMTSKKQELQHF PSSLAFLNLTQNDFACTCEHQSFLQWIKDQRQLLVEVERMECATPSDKQGMPVLSLNITCQMN KTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELV KNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQT WQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGK SWNPEGTVGTGCNWQEATSI (SEQ ID NO: 23)
> Secuencia de aminoacidos de TLR4 de mono Cynomolgus
MTSALRLAGTLIPAMAFLSCVRPESWEPCVEVVPNITYQCMELKFYKIPDNIPFSTKNLDLSF NPLRHLGSYSFLRFPELQVLDLSRCEIQTIEDGAYQSLSHLSTLILTGNPIQSLALGAFSGLS SLQKLVAVETNLASLENFPIGHLKTLKELNVAHNLIQSFKLPEYFSNLTNLEHLDLSSNKIQN IYCKDLQVLHQMPLSNLSLDLSLNPINFIQPGAFKEIRLHKLTLRSNFDDLNVMKTCIQGLAG LEVHRLVLGEFRNERNLEEFDKSSLEGLCNLTIEEFRLTYLDCYLDNIIDLFNCLANVSSFSL VSVNIKRVEDFSYNFRWQHLELVNCKFEQFPTLELKSLKRLTFTANKGGNAFSEVDLPSLEFL DLSRNGLSFKGCCSQSDFGTTSLKYLDLSFNDVITMSSNFLGLEQLEHLDFQHSNLKQMSQFS VFLSLRNLIYLDISHTHTRVAFNGIFDGLLSLKVLKMAGNSFQENFLPDIFTDLKNLTFLDLS QCQLEQLS PTAFDTLNKLQVLNMSHNNFFSLDTFPYKCLPSLQVLDYSLNHIMTSNNQELQHF PS SLAFLNLTQNDFACTCEHQSFLQWIKDQRQLLVEAERMECATPSDKQGMPVLSLNITCQMN KTIIGVSVFSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELV KNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQT WQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGQHIFWRRLRKALLDGK SWNPEEQ (SEQ ID NO: 24)
Para celulas CHO-K1, el ADNc de TLR4 humano que codifica una etiqueta del eprtopo c-Myc del terminal N y el ADNc de TLR4 de mono cynomolgus se clonaron en pCDNA3.1 (-) hygro (Invitrogen), y ADNc de MD-2 humano que codifica c-Myc del terminal C y las etiquetas del eprtopo de Protema C se clonaron en pCDNA3 (Invitrogen). Los constructos TLR4 humano y MD-2 humano se cotransfectaron en celulas CHO usando el reactivo Fugene 6MR (Roche), de acuerdo con las directrices del fabricante. Las celulas resistentes a antibioticos se seleccionaron en medio de cultivo que contema 500 Mg/mL de G418 y 250 Mg/mL de higromicina B (ambos de Invitrogen). El constructo de TLR4 de mono Cynomolgus se transfecto en celulas CHO utilizando el reactivo Fugene 6MR (Roche), de acuerdo con las directrices del fabricante y se cultivaron como se describio anteriormente.
Para seleccionar celulas que expresan el complejo TLR4/MD-2 humano o TLR4 de mono cynomolgus, se incubaron 1x 107 celulas CHO/mL en 1x PBS complementado con BSA al 1% y 10 Mg/mL de anticuerpo monoclonal antiprotema C ( Roche) o 10 Mg/mL de anticuerpo monoclonal protema 1 C6 anti-TLR4 (NovImmune SA). Las celulas se lavaron una vez y luego se incubaron en el mismo regulador con anticuerpo de cabra anti IgG de raton conjugado con PE (H+L) (dilucion 1:200; Anwara). Posteriormente, las celulas se incubaron con microperlas anti-PE (Miltenyi Biotec) y se pasaron a traves de una columna Midi MACS LS. Las celulas retenidas en la columna se eluyeron y se volvieron a colocar en cultivo con seleccion de antibioticos. Se continuaron las rondas de clasificacion hasta que se obtuvieron poblaciones uniformemente positivas de celulas que expresaban el complejo TLR4/MD-2 humano y se obtuvieron TLR4 de mono cynomolgus.
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Ejemplo 2. Aleatorizacion de CDR de anticuerpo 15C1 y selecciones de superficie celular
El anticuerpo humanizado anti-TLR4 15C1 (como se describe en la patente de los Estados Unidos 7.674.884, mostrada en el presente documento como las SEQ ID NOs: 43 y 4 a continuation) se sometieron a aleatorizacion de secuencia para obtener anticuerpos que se unen a TLR4 de mono cynomolgus y/o humano capaces de neutralizar la production de citoquinas proinflamatorias inducidas por LPS mediada por TLR4.
> Secuencia de aminoacidos de VH de 15C1
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYT DFNPSLKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDPSDAFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 43)
> Secuencia de aminoacidos de VL de 15C1
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 4)
Las regiones Vh (SEQ ID NO: 43) y Vl (SEQ ID NO: 4) del anticuerpo 15C1 humanizado se clonaron en el vector pNDS descrito en Ravn et al., (Nucleic Acids Res. 2010 Nov; 38 (21): e193). Brevemente, la region Vh se clono en el marco de la secuencia gma PelB usando un sitio de restriction Ncol en 5' y un sitio de restriction Xhol en 3'. Luego, la region Vl se inserto en el marco de una secuencia enlazadora utilizando la enzima de restriccion SalI en 5' y la enzima de restriccion Notl en 3' para formar un constructo que codifica para el scFv de 15C1 fusionado en su parte terminal C a las etiquetas 6xHis y c-Myc y la protema plll.
Luego, se aleatorizaron tramos de 5 residuos en la CDR3 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 44) o cadena ligera (SEQ ID NO: 48) para generar 6 bibliotecas (tamano de biblioteca que varia de 5x107 a 2x108) . Las diferentes bibliotecas generadas se muestran a continuacion en la Tabla 3 y la Tabla 4 donde X representa cualquier aminoacido.
Tabla 3. Bibliotecas de aleatorizacion de CDRH3 de 15C1.
CDRH3 de 15C1 (SEQ ID NO: 44)
A R K D P S D A F P Y
Biblioteca 1 (SEQ ID NO: 45)
A R X X X X X A F P Y
Biblioteca 2 (SEQ ID NO: 46)
A R K D P S X X X X X
Biblioteca 3 (SEQ ID NO: 47)
A R K D X X X X X P Y
Tabla 4. Bibliotecas de aleatorizacion de CDRL3 de 15C1
CDRL3 de 15C1 (SEQ ID NO: 48)
Q Q G H S F P L T
Biblioteca 4 (SEQ ID NO: 49)
Q Q X X X X X L T
Biblioteca 5 (SEQ ID NO: 50)
Q Q G H X X X X X
Biblioteca 6 (SEQ ID NO: 51)
Q Q X X X X P X T
Se realizaron cinco rondas de selection usando estas bibliotecas y se realizo el cribado de las variantes con las actividades deseadas usando extractos periplasmicos de scFv. En resumen, se bloquearon alicuotas de bibliotecas de fagos de scFv modificadas con 15C1 (1012 Pfu) con PBS que contema leche desnatada al 3% (p/v) durante una hora a
temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. Los fagos bloqueados se deseleccionaron luego durante una hora a 37°C/5% de CO2 sobre celulas CHO (en un matraz T75 con 80% de confluencia) que se ha^an bloqueado previamente con PBS que contema leche desnatada al 2% (p/v). Los fagos deseleccionados se incubaron a continuacion en celulas CHO que expresaban TLR4 de mono cynomolgus durante tres horas a temperatura ambiente con agitacion suave. Las 5 celulas se lavaron luego diez veces con PBS. Los fagos unidos se eluyeron mediante la adicion de 1 mL de acido cftrico 75 mM seguido de neutralizacion con 280 pL de Tris-HCl pH 9. Luego, se anadieron 10 mL de TG1 en crecimiento exponencial al matraz T75 e incubando durante una hora a 37°C con agitacion lenta. Una alfcuota del TG1 infectado se diluyo en serie para valorar el resultado de la seleccion. TG1 infectado se centrifugo a 3.000 rpm durante 15 minutos y se resuspendio en 0,5 mL de 2x TY-AG (medio 2x TY que contema 100 pg/mL de ampicilina y glucosa al 2%) y se 10 extendio en placas de bioensayo agar 2x TYAG. Despues de una noche de incubacion a 30°C, se anadieron 10 mL de 2x TYAG a las placas y las celulas se rasparon de la superficie y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 mL. Se anadio 2x TYAG que contema 50% de glicerol a la suspension celular para obtener una concentracion final de 17% de glicerol. Las alfcuotas de la ronda de seleccion se mantuvieron a -80°C.
Ejemplo 3. Cribado de variantes de scFv de 15C1
15 Los procedimientos generales para la construccion y manipulacion de bibliotecas de scFv humanas se describen en Vaughan et al., (Nat. Biotech., 1996, 14: 309-314). Bibliotecas de variantes de scFv de 15C1 se criban contra TLR4 de mono cynomolgus de acuerdo con el siguiente procedimiento.
Preparacion de ScFv periplasmatica para cribado
Despues de cinco rondas de selecciones en celulas CHO que expresan TLR4 de mono cynomolgus en la membrana, se 20 recogieron clones individuales en una placa de microtitulacion de pozos profundos que contiene 0,9 mL de medio 2xTYAG (glucosa al 0,1%) por pozo y se cultivaron a 37°C durante 5-6h (250 rpm). A continuacion, se anadieron 100 pL por pozo de IPTG 0,2 mM en medio 2xTY para obtener una concentracion final de IPTG 0,02 mM. Las placas se incubaron durante la noche a 30°C con agitacion a 250 rpm. Las placas de pozos profundos se centrifugaron a 2.500 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se elimino cuidadosamente. Los sedimentos se resuspendieron en 150 pL de 25 regulador TES (Tris/HCl 50 mM (pH 8), EDTA 1 mM (pH 8), sacarosa al 20%, complementado con inhibidor completo de proteasa, Roche). Se produjo un choque hipotonico anadiendo 150 pL de regulador TES diluido (dilucion 1:5 de TES: agua) e incubacion en hielo durante 30 minutos. Las placas se centrifugaron luego a 4.000 rpm durante 10 minutos para eliminar las celulas y los desechos. Los sobrenadantes se transfirieron cuidadosamente a otra placa de microtitulacion y se mantuvieron en hielo para su analisis inmediato en ensayos de cribado
30 Preparacion de fagos monoclonales para cribado
Se recogieron clones individuales en una placa de microtitulacion que contema 150 pL de medio 2xTYAG (glucosa al 2%) por pozo y se cultivaron a 37°C (100-120 rpm) durante 5-6 h. Se anadio el fago auxiliar M13K07 a cada pozo para obtener una multiplicidad de infeccion (MOI) de 10 (es decir, 10 fagos para cada celula en el cultivo) y se incubo a 37°C (100 rpm) durante 1 h. Despues del cultivo, las placas se centrifugaron a 3.200 rpm durante 10 minutos. El 35 sobrenadante se elimino cuidadosamente, las celulas se resuspendieron en 150 pL de medio 2xTYAK y se cultivaron durante la noche a 30°C (120 rpm). Las placas se centrifugaron a continuacion durante 10 minutos a 3.000 rpm y el sobrenadante que contema el fago se concentro a continuacion mediante precipitacion con PEG. Brevemente, los fagos se precipitaron mediante la adicion de 1/3 de volumen de PEG 8.000 frio al 20%, NaCl 2,5 M al sobrenadante que contema el fago. La mezcla se incubo en hielo durante 1 h y luego se centrifugo 15 minutos a 8.000 rpm a 4°C. El 40 sedimento de fagos se resuspendio en 500 pL de regulador TE.
Cribado de scFv
En resumen, se distribuyeron celulas CHO-K1 y se transfectaron en forma estable CHO-K1 que expresan TLR4 de mono cynomolgus en placas opticas de 384 pozos FMAT® (Applied Biosystems) a una densidad de 5.000 celulas por pozo (en 50 pL de DMEM F12, 10% de FCS, Gln 2 mM), 24 horas antes del ensayo de cribado. El dfa 0, las celulas se 45 mezclaron con un pequeno volumen de preparacion periplasmica de scFv (40 pL por pozo) y 10 pL de conjugado Penta- His Alexa Fluor 647 (dilucion 1:200, QIAGEN). Despues de un penodo de incubacion de 1 a 8 horas, se midio la fluorescencia de las celulas en un analizador Cellular Detection System 8200 (Applied Biosystems). Se retuvieron los clones de scFv que se unen a CHO-K1 que expresan TLR4 de mono cynomolgus pero no a celulas CHO-K1 de tipo silvestre y se sometieron a analisis adicionales. Los clones seleccionados fueron 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 50 1D10, 1E11 y 1G12.
Fago monoclonal que se une a TLR4 de mono cynomolgus y humano
Se incubaron 105 celulas CHO o celulas CHO que expresan el TLR4 de mono cynomolgus en solucion salina regulada con fosfato, albumina de suero bovino al 2% con diferentes concentraciones de fagos monoclonales precipitados que expresan scFv seleccionados por FMAT (1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10, 1E11, 1G12). Como control, se
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expreso tambien scFv de 15C1 parental como fago monoclonal para la prueba de union. Las celulas se lavaron luego y se incubaron en el mismo regulador con anticuerpo monoclonal para M13, fd, fagos filamentosos F1-FITC (1:50, anticuerpos Acris). Las celulas se analizaron finalmente usando un citometro FACSCalibur (BD Biosciences). La Figura 1 muestra el analisis FACS de estas celulas despues de la tincion de anticuerpos, que revelo que 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10, 1E11 y 1G12 reconocieron celulas que expresan solo TLR4 de mono cynomolgus, a diferencia de 15C1 que no se une a estas celulas. Ademas, estos resultados sugieren que los scFv probados son espedficos de la protema TLR4 de mono cynomolgus ya que no se unieron a las celulas CHO nativas.
De forma similar, se incubaron 105 celulas CHO o celulas CHO que expresan el complejo TLR4/MD-2 humano en solucion salina regulada con fosfato, albumina de suero bovino al 2% con diferentes concentraciones de los fagos monoclonales precipitados que expresan scFv como se describio anteriormente. La Figura 2 muestra el analisis FACS de estas celulas despues de la tincion del anticuerpo, que revelo que 1E11 reconocio celulas que expresan el complejo TLR4/MD-2 humano, de forma similar a 15C1 pero no a 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10 y 1G12. Estos resultados sugieren que los scFv 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10 y 1G12 son especficos de TLR4 de mono cynomolgus y que 1E11 es de reactividad cruzada para TLR4 humano y de mono cynomolgus.
Ejemplo 4. Reformateo de scFv en formato de IgG y union de IgG a TLR4 de mono cynomolgus y humano
Reformateo, production y purification
La secuencia de VH y VL de scFv seleccionados (1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10, 1E11, 1G12) se amplificaron con oligonucleotidos espetificos que introducen una secuencia gufa en el extremo 5'. Las secuencias de Vh y Vl amplificadas se clonaron en el vector de expresion de mamffero en el marco con dominios de IgG1 humana constante y Kappa constante, respectivamente. Las construcciones se verificaron por secuenciacion antes de la transfection en celulas de mamffero.
Las secuencias de ADNc de Vh y Vl en sus vectores de expresion apropiados se transfectaron en celulas de mamffero usando el reactivo de transfeccion Fugene 6 (Roche, Basilea, Suiza). En resumen, los picos de celulas se cultivaron en placas de 6 pozos a una concentration de 6 x 105 celulas por pozo en 2 mL de medio de cultivo que contema suero bovino fetal. Los vectores de expresion, que codifican las secuencias de Vh y Vl candidatas, se cotransfectaron en las celulas usando el reactivo de transfeccion Fugene 6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un dfa despues de la transfeccion, se aspiro el medio de cultivo y se anadieron 3 mL de medio fresco sin suero a las celulas y se cultivaron durante tres dfas a 37°C. Despues de un penodo de cultivo de tres dfas, el sobrenadante se recolecto para IgG purificada en columnas de flujo rapido de proteha G-Sefarosa 4B (Sigma, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los sobrenadantes de las celulas transfectadas se incubaron durante la noche a 4°C con regulador de union a IgG ImmunoPure (G) (Pierce, Rockford IL). Las muestras se pasaron a continuation sobre columnas de flujo rapido de Proteha G-Sefarosa 4B y la IgG se purifico en consecuencia usando regulador de elucion. La fraction de IgG eluida se dializo a continuacion contra PBS y se cuantifico el contenido de IgG por absorcion a 280 nm. La pureza y la integridad de IgG se verificaron mediante SDS-PAGE.
Las secuencias de acido nucleico y de aminoacidos del anticuerpo 1E11 reformateado con IgG1 se muestran a continuacion:
> Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de 1E11
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO: 40)
> Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de 1E11
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 41)
> Secuencia de acido nucleico de cadena ligera de 1E11
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGAA ATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATCACC TGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAGTCT CCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCAACG TATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATC AAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGG AAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG GGAGAGTGTTAA (SEQ ID NO: 52)
> Secuencia de acido nucleico de cadena pesada de 1E11
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACCAGGTGCAG CTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTC TCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGA CTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCCCTCAAGACT CGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACC GCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATCCGTCCGACGCCTTTCCTTACTGG GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTAC TTCCCCGAACCGGTGACAGTCTCGTGGAACTCAGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA CTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCTCGGGAGGAGATGACC AAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAACGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG 5 TCTCCGGGTTAA (SEQ ID NO: 53)
Anticuerpo monoclonal que se une a TLR4 de mono cynomolgus y humano
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Se incubaron 105 celulas CHO o celulas CHO que expresan el TLR4 de mono cynomolgus en solucion salina regulada con fosfato, albumina de suero bovino al 2% con diferentes concentraciones de anticuerpos purificados seleccionados por FMAT (1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10 , 1E11, 1G12) con 15C1 como control. Las celulas se lavaron en solucion salina regulada con fosfato, albumina de suero bovino al 2% y se incubaron en IgG de cabra antihumana (H+L) Alexa Fluor® 647 (1:200; Invitrogen). Las celulas se analizaron usando un citometro FACSCalibur (BD Biosciences). La Figura 3 muestra el analisis FACS de estas celulas despues de la tincion de anticuerpos, que revelo que los Mab 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1C12, 1D10, 1E11 y 1G12 reconocieron celulas que expresan solo TLR4 de mono cynomolgus, contrariamente a 15C1 que no se une a estas celdas. Ademas, estos resultados confirman que estos anticuerpos fueron espedficos de la protema TLR4 ya que no se unieron a las celulas CHO nativas.
Se llevaron a cabo experimentos similares con celulas CHO o celulas CHO que expresan el complejo TLR4/MD2 humano. La Figura 4 muestra el analisis FACS de estas celulas despues de la tincion de anticuerpos, que revelo que Mab 1E11 reconocio celulas que expresaban el complejo TLR4/MD2 humano, de manera similar a Mab 15C1 pero que Mab 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1D10 y 1G12 no pueden unirse a la protema humana. Mab 1C12 tambien se pudo unir a TLR4 humano pero con una potencia menor en comparacion con Mab 1E11 y 15C1. Estos resultados confirman que 1E11 y 1C12 son anticuerpos monoclonales de reaccion cruzada capaces de unirse tanto a TLR4 humano como de mono cynomolgus solos o en complejo con MD2. Estos resultados tambien confirman que 1A1, 1A6, 1B12, 1C7, 1C10, 1D10 y 1G12 son anticuerpos monoclonales espedficos anti-TLR4 de mono cynomolgus.
Ejemplo 5. Analisis de especificidad de paratopo-epftopo entre anticuerpos anti-TLR4 y TLR4
La Figura 5 muestra una ilustracion del contacto del aminoacido potencial del epftopo del paratopo/TLR4 del anticuerpo que determina las especificidades anticuerpo/TLR4. El TLR4 humano y el TLR4 del mono cynomolgus tienen solo un aminoacido diferente en las regiones que se sabe que son importantes para la union (vease Irene Dunne-Siegrist et al., J Biol Chem, 30 de noviembre de 2007; 282 (48): 34817-27). Efectivamente, el TLR4 humano tiene una lisina (aminoacido cargado positivamente) en la posicion 349, mientras que el TLR4 de mono cynomolgus tiene un acido glutamico (aminoacido cargado negativamente) en esta posicion. Estos resultados sugieren que se produce un puente salino entre el aminoacido 103 de la cadena pesada de los anticuerpos seleccionados y el aminoacido 349 de TLR4. Ademas, los anticuerpos de reaccion cruzada (1E11 y 1C12) tienen una asparagina o una glutamina en la posicion 103 que pueden servir tanto como donante de hidrogeno para el acido glutamico como aceptor de hidrogeno para lisina. Estos aminoacidos espedficos pueden permitir la reactividad cruzada del anticuerpo tanto de TLR4 humano como de mono cynomolgus.
La mutagenesis dirigida al sitio se realizo en la posicion 103 en el anticuerpo 1E11 para introducir la mutacion N103D. El vector que contiene la secuencia de Vh verificada de 1E11 N103D se cotransfecto luego con la secuencia de Vl en celulas de marnffero usando el reactivo de transfeccion Fugene 6 (Roche, Basilea, Suiza) como se describio previamente. A continuacion, se incubaron 105 celulas CHO o celulas CHO que expresan el TLR4 de mono cynomolgus en solucion salina regulada con fosfato, albumina de suero bovino al 2% con diferentes concentraciones de anticuerpos purificados (1E11 y 1E11 N103D). Las celulas se lavaron en solucion salina regulada con fosfato, albumina de suero bovino al 2% y se incubaron en IgG de cabra anti-humana (H+L) Alexa Fluor® 647 (1:200; Invitrogen) y finalmente se analizaron usando un citometro FACSCalibur (BD Biosciences). La Figura 6 muestra los resultados del analisis de estas celulas despues de la tincion del anticuerpo, lo que revelo que los Mab 1E11 y 1E11 N103D reconocieron celulas que expresaban solo TLR4 de mono cynomolgus. Sin embargo, la union Mab 1E11 N103D a mono cynomolgus es significativamente menor en comparacion con 1E11. De manera similar, se incubaron 105 celulas CHO o celulas CHO que expresan el complejo TLR4/MD-2 humano en solucion salina regulada con fosfato, albumina de suero bovino al 2% con diferentes concentraciones de anticuerpos purificados (1E11 y 1E11 N103D) y luego se controlaron la union de los anticuerpos a estas celulas mediante FACS. La Figura 7 representa el analisis FACS de estas celulas despues de la tincion del anticuerpo, que revelo que los Mab 1E11 y 1E11 N103D reconocen las celulas que expresan el TLR4 humano con la misma potencia. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la posicion 103 es crucial para la union de 1E11 a TLR4 de humano y mono cynomolgus. Mas precisamente, estos datos indican que podna disenarse un motivo CDRH3 con el fin de inducir la reactividad cruzada entre especies de un anticuerpo anti tLR4.
Tabla 5. Reactividad cruzada de anticuerpos anti-TLR4.
Motivo CDRH3 = CARKDSG [N, Q, D] [Y, L] FPY (SEQ ID NO: 54)
ID del clon
CDR3 pesada Especificidad de la especie
1A1
ARKDSGRLLPY (SEQ ID NO: 28)
5
10
15
20
Motivo CDRH3 = CARKDSG [N, Q, D] [Y, L] FPY (SEQ ID NO: 54)
ID del clon
CDR3 pesada Especificidad de la especie
1A6
ARKDSGKWLPY (SEQ ID NO: 29)
1B12
ARKDSGHLMPY (SEQ ID NO: 30)
1C7
ARKDSGHNYPY (SEQ ID NO: 31) Mono Cynomolgus
1C10
ARKDSGKNFPY (SEQ ID NO: 32)
1G12
ARKDSGRYWPY (SEQ ID NO: 36)
1D10
ARKDSGHNLPY (SEQ ID NO: 34)
15C1
ARKDPSDAFPY (SEQ ID NO: 44) Humana
1E11
ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27)
1E11 N103D
ARKDSGDYFPY (SEQ ID NO: 35) Humana y mono cynomolgus
1C12
ARKDSGQLFPY (SEQ ID NO: 33)
Ejemplo 6. Inhibicion de la cascada de senalizacion en direccion 3' inducida por LPS de TLR4: NFkB, por anticuerpos purificados.
Las celulas THP1-BlueMR-CD14 (Invivogen), que expresan el complejo TLR4/MD2 humano, se sembraron en placas de 96 pozos a razon de 105 celulas/pozo en 30 pL de medio de deteccion HEK-Blue (Invivogen). Los anticuerpos de TLR4 se diluyeron en 30 pL de medio hasta la concentracion apropiada y se anadieron a las celulas durante 30 min a 37°C. Luego, el LPS se diluyo a 10 ng/mL en 30 pL de medio, se agrego a las celulas y se dejo incubar durante 24 horas a 37°C. La absorbancia se midio a 650 nm usando un lector de microplacas. La Figura 8 muestra los resultados de la inhibicion de la cascada de senalizacion en direccion 3' inducida por LPS de TLR4 mediante los Mab seleccionados (1E11, 15C1, 1C12 y 1G12). 1E11 mostro potencia de inhibicion de la senalizacion de TLR4 inducida por LPS comparable a 15C1. 1C12 mostro capacidades de inhibicion mas bajas en comparacion con 1E11 y 1G12 no afecto a la cascada de senalizacion en direccion 3' inducida por LPS de TLR4 humano lo que confirma su especificidad por TLR4 de mono cynomolgus.
Ejemplo 7. Aleatorizacion de CDR del anticuerpo 1E11 y selecciones de superficie celular
La secuencia del anticuerpo 1E11 de reactividad cruzada (secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 40 y secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41) tiene la misma potencia de union y de bloqueo que 15C1. Este anticuerpo se sometio a una aleatorizacion de la secuencia para obtener anticuerpos que se unen a TLR4 humano y de mono cynomolgus con mayor afinidad en comparacion con el anticuerpo parental y 15C1 y son capaces de neutralizar la produccion de citoquina proinflamatoria inducida por LPS mediada por TLR4.
> Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de 1E11
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 41)
> Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de 1E11
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSITGGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPS LKTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO:40)
5 > Secuencia de acido nucleico de cadena ligera de 1E11
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGAA ATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATCACC TGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAGTCT CCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCAACG TATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATC AAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGG AAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG GGAGAGTGTTAA (SEQ ID NO: 52)
> Secuencia de acido nucleico de cadena pesada de 1E11
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACCAGGTGCAG CTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTC TCTGGTTACTCCATCACCGGTGGTTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGA CTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCCCTCAAGACT CGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACC GCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATCCGTCCGACGCCTTTCCTTACTGG GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTAC TTCCCCGAACCGGTGACAGTCTCGTGGAACTCAGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC CCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCCAGC AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAGAG T T GAGCCCAAATC T T GT GACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCT GAA CTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC
5
10
15
20
25
CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCTCGGGAGGAGATGACC AAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAACGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTTAA (SEQ ID NO: 53)
Las regiones Vh (SEQ ID NO: 1) y vl (SEQ ID NO: 2) del anticuerpo 1E11 se clonaron en el vector pNDS descrito en Ravn et al., (Nucleic Acids Res. noviembre de 2010; 38 (21): e193). En resumen, la region Vh se clono en el marco de la secuencia gufa PelB usando un sitio de restriction Ncol en 5' y un sitio de restriction Xhol en 3'. Luego, la region Vl se inserto en el marco de una secuencia enlazadora utilizando la enzima de restriccion SalI en 5' y la enzima de restriccion Notl en 3' para formar una construction que codifica la scFv de 15C1 fusionada en su parte terminal C a las etiquetas 6xHis y c-Myc y la protefna pill. A continuation, se aleatorizaron 5 residuos en el CDRH1 de la cadena pesada (SEQ ID NO: 25) o la cadena ligera (SEQ ID NO: 48) con el fin de generar 5 bibliotecas (tamano de biblioteca que varfa de 5x107 a 2x108). Las diferentes bibliotecas generadas se muestran a continuacion en la Tabla 6 y la Tabla 7 donde X representa cualquier aminoacido.
Tabla 6. Bibliotecas de aleatorizacion de CDRH1 de 1E11.
CDRH1 de 1E11 (SEQ ID NO: 25)
G Y S I T G G Y
Biblioteca 1 (SEQ ID NO: 104)
G X X I X X X Y
Biblioteca 2 (SEQ ID NO: 105)
G Y X I X X X X
Tabla 7. Bibliotecas de aleatorizacion de CDRL3 de 1E11.
CDRL3 de 1E11 (SEQ ID NO: 48)
Q Q G H S F P L T
Biblioteca 3 (SEQ ID NO: 49)
Q Q X X X X X L T
Biblioteca 4 (SEQ ID NO: 50)
Q Q G H X X X X X
Biblioteca 5 (SEQ ID NO: 51)
Q Q X X X X P X T
Se realizaron cinco rondas de selection usando estas bibliotecas y se realizo el cribado de variantes con las actividades deseadas usando extractos periplasmicos de scFv. En resumen, se bloquearon alfcuotas de bibliotecas de fagos de scFv modificadas con 1E11 (1012 Pfu) con PBS que contenfa leche desnatada al 3% (p/v) durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. Los fagos bloqueados se deseleccionaron luego durante una hora a 37°C/5% de CO2 sobre celulas CHO (en un matraz T75 con 80% de confluencia) que se habfan bloqueado previamente con PBS que contenfa leche desnatada al 2% (p/v). Los fagos deseleccionados se mezclaron despues con una concentration creciente de anticuerpo 15C1 y se incubaron en celulas CHO que expresan TLR4 humano durante tres horas a temperatura ambiente con agitation suave. Las celulas se lavaron luego diez veces con PBS. Los fagos unidos se eluyeron mediante la adicion de 1 mL de acido cftrico 75 mM seguido de neutralization con 280 pL de Tris-HCl pH 9. Luego, se anadieron 10 mL de TG1 en crecimiento exponencial al matraz T75 e incubando durante una hora a 37°C con agitacion lenta. Una alfcuota de TG1 infectada se diluyo en serie para valorar el resultado de la seleccion. TG1 infectado
5
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25
se centrifugo a 3.000 rpm durante 15 minutos y se resuspendio en 0,5 mL de 2xTY-AG (medio 2xTY que contema 100 pg/mL de ampicilina y glucosa al 2%) y se esparcio en placas de agar para bioensayo 2xTYAG. Despues de una noche de incubacion a 30°C, se anadieron 10 mL de 2xTYAG a las placas y las celulas se rasparon de la superficie y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 mL. Se anadio 2xTYAG que contema 50% de glicerol a la suspension celular para obtener una concentracion final de 17% de glicerol. Las alfcuotas de la ronda de selection se mantuvieron a -80°C. Despues de cinco rondas de selecciones en celulas CHO que expresan TLR4 humano en la membrana en competencia con el anticuerpo 15C1, 50 clones individuales se recogieron en una placa de microtitulacion de pozos profundos que contema 0,9 mL de medio 2xTYAG (glucosa al 0,1%) por pozo y se cultivaron a 37°C durante 5-6 h (250 rpm). Los plasmidos que codifican scFv se purificaron luego y se analizaron mediante secuenciacion de Sanger.
Ejemplo 8. Identification de variantes maduras por afinidad de 1E11.
Los clones aislados despues de la ultima ronda de seleccion se secuenciaron y analizaron. Despues del alineamiento, se identificaron los consensos de secuencia en CDRH1 o CDRL3. Luego se seleccionaron secuencias de scFv enriquecidas con consenso de aminoacidos espedfico. Los scFv 1E11.C1, 1E11.C2, 1E11.C3, 1E11.C4, 1E11.C5 y 1E11.C6 tienen secuencias espedficas de CDRH1. Los scFv 1E11.E1, 1E11.E2, 1E11.E3, 1E11.E4 y 1E11.E5 que tienen secuencias CDRL3 espedficas tambien se identificaron. La secuencia Vh y Vl de los scFv seleccionados se amplificaron con oligonucleotidos espedficos que introducen una secuencia gma en el extremo 5'. Las secuencias de VH y Vl amplificadas se clonaron en el vector de expresion de mamffero en el marco con los dominios de IgG1 humana constante y Kappa constante, respectivamente. Las construcciones se verificaron mediante secuenciacion antes de la transfection en celulas de mamffero. Las secuencias de acidos nucleicos y aminoacidos del anticuerpo 1E11.C1 reformateado con IgG1 se muestran a continuation:
> Secuencia de aminoacidos de cadena ligera de 1E11.C1
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSISDHLHWYQQKPDQSPKLLIKYASHAISGVPSRFS GSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQGHSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 106)
> Secuencia de aminoacidos de cadena pesada de 1E11.C1
QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGFPIRYGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGYTDFNPL KTRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCARKDSGNYFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPG (SEQ ID NO: 108)
> Secuencia de acido nucleico de cadena ligera de 1E11.C1
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGAA ATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTTTCAGTCTGTGACTCCAAAGGAAAAAGTCACCATCACC TGCAGGGCCAGTCAGAGTATCAGCGACCACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGATCAGTCT CCCAAGCTCCTCATCAAATATGCTTCCCATGCCATTTCTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAATAGCCTAGAGGCTGAAGATGCTGCAACG TATTACTGTCAGCAGGGTCACAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATC AAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGG AAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG GGAGAGTGTTAA (SEQ ID NO: 107)
> Secuencia de acido nucleico de cadena pesada de 1E11.C1
ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACCAGGTGCAG
CTTCAGGAGTCCGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTC
TCTGGTTTCCCGATCCGCTACGGGTATAGCTGGCACTGGATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGA
CTGGAGTGGATGGGGTATATCCACTACAGTGGTTACACTGACTTCAACCCCTCCCTCAAGACT
CGAATCACCATATCACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACC
GCTGTGGACACTGCAGTGTATTACTGTGCGAGAAAAGATTCGGGCAACTACTTCCCTTACTGG
GGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG
GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTAC
TTCCCCGAACCGGTGACAGTCTCGTGGAACTCAGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTC
CCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCCAGC
AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC
AAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA
CTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCTCGGGAGGAGATGACC AAGAACCAGGTCAGCCTGACTTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAACGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTTAA (SEQ ID NO: 109)
5 Las secuencias de ADNc de Vh y Vl en sus vectores de expresion apropiados se transfectaron en celulas de mamrifero usando el reactivo de transfeccion Fugene 6 (Roche, Basilea, Suiza). En resumen, se cultivaron picos de celulas en placas de 6 pozos a una concentracion de 6 x 105 celulas por pozo en 2 mL de medio de cultivo que contema suero bovino fetal. Los vectores de expresion, que codifican las secuencias de Vh y Vl candidatas, se cotransfectaron en las celulas usando el reactivo de transfeccion Fugene 6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un dia despues de 10 la transfeccion, se aspiro el medio de cultivo y se anadieron 3 mL de medio fresco sin suero a las celulas y se cultivaron durante tres dias a 37°C. Despues de un periodo de cultivo de tres dias, el sobrenadante se recolecto para IgG purificada en columnas de flujo rapido de protema G-Sefarosa 4B (Sigma, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los sobrenadantes de las celulas transfectadas se incubaron durante la noche a 4°C con regulador de union a IgG ImmunoPure (G) (Pierce, Rockford IL). Las muestras se pasaron a continuacion
5
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15
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sobre columnas de flujo rapido de Protema G-Sefarosa 4B y la IgG se purifico en consecuencia usando regulador de elucion. La fraccion de IgG eluida se dializo a continuacion contra PBS y se cuantifico el contenido de IgG por absorcion a 280 nm. La pureza y la integridad de IgG se verificaron mediante SDS-PAGE. La potencia de union relativa de las variantes de lEll se evaluo mediante ELISA competitivo. En resumen, se recubrio el anticuerpo 15C1 durante la noche en una placa Maxisorp de 96 pozos y luego se bloqueo con PBS-BSA. El anticuerpo de referencia 15C1 y las variantes maduras de afinidad de 1E11 se anadieron a la placa a una concentracion fija y se realizo una dilucion en serie de 3,5 veces de las muestras. A continuacion, se anadio a la placa una forma soluble marcada con histidina del complejo TLR4/MD-2 humano a una concentracion fija. Despues de una hora de incubacion a 37°C, la placa se lavo y se distribuyo una solucion de anticuerpo Penta-His-HRP, esta etapa fue seguida por un tiempo de incubacion adicional de una hora a 37°C. Finalmente, la placa se lavo y se anadio TMB para la revelacion colorimetrica, la reaccion enzimatica se detuvo con una solucion de H2SO4. Los resultados se determinaron de acuerdo con la absorbancia a 450 nm. La potencia de union relativa se calculo dividiendo la EC50 de referencia con la EC50 de las variantes maduradas de afinidad (Tabla 8).
Todos los Mab seleccionados con mutaciones en su CDRH1 (1E11.C1, 1E11.C2, 1E11.C3, 1E11.C4, 1E11.C5, 1E11.C6) fueron positivos para unirse a TLR4 humano con potencia de union relativa que variaba con un aumenta de 3 a 17 veces en comparacion con el anticuerpo parental 15C1 (Figura 9 y Tabla 8). Los Mab seleccionados con mutaciones en sus CDRL3 (1E11.E1, 1E11.E2, 1E11.E3, 1E11.E4 y 1E11.E5) tambien fueron positivos para unirse al TLR4 humano con una potencia de union relativa que vana con un aumento de 2 a 5 veces en comparacion con el anticuerpo parental 15C1 (Figura 10 y Tabla 8).
Para probar un efecto de union aditiva combinando variantes de cadena ligera y pesada, se eligio la variante 1E11.C2 con CDRH1 modificado, que tema la mayor potencia de union. La cadena pesada de esta variante se asocio con la cadena ligera de 1E11.E1, 1E11.E3, 1E11.E4 y 1E11.E5 que se modificaron en la CDRL3. La region VH de 1E11.C2 se clono con la VL de 1E11.E1, 1E11.E3, 1E11.E4 y 1E11.E5 en vectores de expresion de marnfferos como se describio anteriormente. Despues de la expresion y purificacion, las nuevas variantes de 1E11 llamadas 1E11.C2E1, 1E11.C2E3, 1E11.C2E4 y 1E11.C2E5 se analizaron mediante ELISA competitivo para determinar su potencia de union.
Todos los Mab seleccionados (1E11.C2E1, 1E11.C2E3, 1E11.C2E4 y 1E11.C2E5) fueron positivos para unirse al TLR4 humano con potencia de union que vana con un aumento de 29 a 40 veces en comparacion con el anticuerpo parental 15C1 (Figura 11 y Tabla 8).
Tabla 8. Valores de EC50 de anticuerpos que se unen a TLR4 humano determinados por ELISA y aumento de potencia
de union relativa de variantes maduras de afinidad de 1E11
EC50 de referencia de 15C1 |jg/mL
0,63
variantes de 1E1 (CDRH1)
1E11,C1 1E11,C2 1E11,C3 1E11,C4 1E11,C5 1E11,C6
EC50 jg/mL
0,052 0,036 0,119 0,251 0,087 0,061
Aumento de la potencia de union relativa
12 17 5 2,5 7 10
Variantes de 1E11 (CDRL3)
1E11.E1 1E11.E2 1E11.E3 1E11.E4 1E11.E5
EC50 jg/mL
0,157 0,315 0,126 0,130 0,152
Aumento de la potencia de union relativa
4 2 5 5 4
1E11 variantes (CDRH1/CDRL3)
1E11.C2E1 1E11.C2E3 1E11.C2E4 1E11.C2E5
EC50 jg/mL
0,021 0,016 0,015 0,017
EC50 de referencia de 15C1 |jg/mL
0,63
variantes de 1E1 (CDRH1)
1E11,C1 1E11,C2 1E11,C3 1E11,C4 1E11,C5 1E11,C6
Aumento de la potencia de union relativa
29 39 40 36
Tambien se realizaron pruebas de union con TLR4 de mono cynomolgus. Curiosamente, las mutaciones en la CDRH1 (C1, C2, C3, C4, C5) aumentan la union del anticuerpo modificado con 1E11 a TLR4 de mono cynomolgus, pero las mutaciones en CDRL3 (E1, E2, E3, E4 y E5) disminuyen o casi elimina el anticuerpo que se une a esta molecula (Tabla 9 y Figura 12).
5 Tabla 9. Reactividad cruzada de anticuerpos anti-TLR4 madurados de afinidad.
ID del clon
CDR1 pesada CDR3 pesada CDR3 ligera Potencial de union de la especie
GYSITGGYS ARKDSGNYFPY QQGHSFPLT Humano: +
1E11
(SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 39) Mono Cynomolgus: +
GFPIRYGYS ARKDSGNYFPY QQGHSFPLT
1E11.C1
(SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 39)
GYPIRFGYS ARKDSGNYFPY QQGHSFPLT
1E11.C2
(SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 39)
GYPIRHGYS ARKDSGNYFPY QQGHSFPLT
1E11.C3
(SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 39) Humano: ++ Mono Cynomolgus: ++
GFPIGQGYS ARKDSGNYFPY QQGHSFPLT
1E11.C4
(SEQ ID NO: 58) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 39)
GYPIWGGYS ARKDSGNYFPY QQGHSFPLT
1E11.C5
(SEQ ID NO: 59) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 39)
GYPIGGGYS ARKDSGNYFPY QQGHSFPLT
1E11.C6
(SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 39)
1E11.E1
GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27) QQGNDFPVT (SEQ ID NO: 61) Humano: +
1E11.E2
GYSITGGYS ARKDSGNYFPY QQGYDEPFT Mono cynomolgus: +/-
ID del clon
CDR1 pesada CDR3 pesada CDR3 ligera Potencial de union de la especie
(SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 62)
GYSITGGYS ARKDSGNYFPY QQGYDFPLT
1E11.E3
(SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 63)
1E11.E4
GYSITGGYS (SEQ ID NO: 25) ARKDSGNYFPY (SEQ ID NO: 27) QQGYDYPLT (SEQ ID NO: 64)
GYSITGGYS ARKDSGNYFPY QQGYEFPLT
1E11.E5
(SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 65)
1E11.C2E1
GYPIRFGYS ARKDSGNYFPY QQGNDFPVT (SEQ ID NO: 61)
(SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 27)
GYPIRFGYS ARKDSGNYFPY QQGYDFPLT
1E11.C2E3
(SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 63)
1E11.C2E4
GYPIRFGYS ARKDSGNYFPY QQGYDYPLT (SEQ ID NO: 64) Humano: +++
(SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 27) Mono cynomolgus: +
GYPIRFGYS ARKDSGNYFPY QQGYEFPLT
1E11.C2E5
(SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 65)
Consenso
G (F/Y) PI (R/G/W) (Y/F/G)GYS (SEQ ID NO: 110) ARKDSG (N/Q/D/E) (hidrofobo) (hidrofobo)PY (SEQ ID NO: 111) QQG (Y/N) (D/E) (F/Y)P (hidrofobo)T (SEQ ID NO: 112)
Por lo tanto, es posible predecir la especificidad de union del anticuerpo dependiendo de sus composiciones de CDR y en funcion de la potencia de union relativa y la reactividad cruzada de TLR4.
Efectivamente, anticuerpos que tienen las CDR de cadena pesada compuestas por la secuencia GYSITGGYS de CDR1 5 (SEQ ID NO: 25) o una CDR1 con la secuencia consenso G(F/Y)PI(R/G/W)(Y/F/G )GYS (SEQ ID NO: 110); secuencia IHYSGYT de CDR2 (SEQ ID NO: 26); CDR3 con la secuencia consenso ARKDSG (N/Q/D/E) (X1)(X2)PY (SEQ ID NO: 111) donde Xi y X2 son cada uno independientemente cualquier aminoacido hidrofobo, y las CDR de cadena ligera compuestas de secuencia QSISDH de CDR1 (SEQ ID NO: 37); secuencia YAS de cDr2 (SEQ ID NO: 38); y la secuencia QQGHSFPLT de CDR3 (SEQ ID NO: 39), son TLR4 de humano/mono cynomolgus con reactividad cruzada.
10 Anticuerpos que tienen las CDR de cadena pesada compuestas de CDR1 con la secuencia consenso G(F/Y)PI(R/G/W) (Y/F/G)GYS (SEQ ID NO: 110), secuencia IHYSGYT de CDR2 ( SEQ ID NO: 26), CDR3 con la secuencia consenso ARKDSG(N/Q/D/E)(X1)(X2)PY (SEQ ID NO: 111) donde X1 y X2 son cada uno independientemente cualquier aminoacido hidrofobo, y las CDR de cadena ligera compuestas por la secuencia QSISDH de CDR1 (SEQ ID NO: 37); la secuencia
5
10
15
20
25
30
YAS de CDR2 (SEQ ID NO: 38); la secuencia QQGHSFPLT de CDR3 (SEQ ID NO: 39) o CDR3 con la secuencia consenso QQg(y/N)(D/E)(F/A)pXt (SEQ ID NO: 112, donde X es cualquier aminoacido hidrofobo), son TLR4 de humano/mono cynomolgus que tienen reactividad cruzada con una mayor potencia de union al TLR4 humano en comparacion con el anticuerpo parental 15C1.
Ejemplo 9. Inhibicion de la activacion de LPS de TLR4
La activacion inducida por LPS de TLR4da como resultado la activacion de la ruta de senalizacion de NFkB. Para probar la inhibicion de esta ruta de senalizacion, se usaron celulas THP1-BlueMR-CD14 (Invivogen), que expresan el complejo TLR4/MD2 humano y se transfectaron de forma estable con un gen informador con elementos sensibles a NFkB. Los anticuerpos de TLR4 se probaron en este ensayo como se describio anteriormente. La Figura 13 muestra los resultados de la inhibicion de la cascada de senalizacion en direccion 3' inducida por LPS de TLR4 mediante Mab seleccionados (15C1 y 1E11.E2). Curiosamente, a pesar de un aumento de 2 veces en la potencia de union de 1E11.E2 en comparacion con 15C1 parental, este anticuerpo no mostro una mayor potencia de inhibicion de la senalizacion de TLR4 inducida por LPS en comparacion con 15Cl.
In vivo, la activacion de TLR4 por LPS da como resultado la produccion de IL-6 por los macrofagos. Para analizar la potencia de 1E11, 1E11.C2 y 1E11.C2E3 ex vivo, estos anticuerpos se produjeron tal como se describio previamente y se ensayaron en analisis de sangre completa de humano y mono cynomolgus. Este experimento consiste en medir la inhibicion de la produccion de IL-6 cuando se bloquea la activacion de TLR4 por LPS.
En resumen, la sangre se diluyo en una cantidad igual de RPMI 1640 y se esparcio en placas de 96 pozos de fondo en U. Se prepararon diluciones de anticuerpos (9 concentraciones entre 20 pg/mL y 305 pg/mL, concentraciones finales) en RPMI 1640 y se anadieron por triplicado a la sangre. Una hora mas tarde, se anadio LPS (0,25 ng/mL de concentracion final en RPMi 0,1% FCS) a los pozos y se incubo durante 24 ha 37°C y 5% de CO2. Despues de la incubacion, los sobrenadantes se recogieron cuidadosamente y se congelaron para analisis posterior. Los niveles de IL-6 se midieron en sobrenadantes segun las instrucciones del kit Milliplex para uso con el lector Luminex 200. Los datos en bruto fueron obtenidos y analizados por el software Milliplex Analyst.
En el ensayo de sangre completa humana, las IC50 de 1E11.C2 y 1E11.C2E3 fueron de 70 ng/mL y 50 ng/mL, respectivamente. En comparacion con 15C1, el anticuerpo parental que tiene un IC50 de aproximadamente 220 ng/mL, estos anticuerpos son 3 veces y 5 veces mejores, respectivamente, en el bloqueo de TLR4 humano (Figura 14). Curiosamente para 1E11.C2, un aumento de 17 veces en la potencia de union se tradujo en un aumento de 3 veces en la potencia de bloqueo, mientras que, para 1E11.C2E3, un aumento de 40 veces en la potencia de union se correlaciono con un aumento de 5 veces en la potencia de bloqueo.
En el ensayo de sangre completa de mono cynomolgus realizado con 2 muestras de animales, el anticuerpo 1E11.C2 bloqueo la activacion de TLR4 por LPS con una IC50 de aproximadamente 500 ng/mL (Figura 15).
Aunque la invencion ha sido descrita junto con la descripcion detallada de la misma, la descripcion anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invencion, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (5)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo aislado que se une espedficamente al receptor 4 tipo Toll (TLR4), en el que el anticuerpo comprende una combinacion de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 seleccionados del grupo que consiste en:
    a) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39;
    b) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 55, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39;
    c) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 57, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39;
    d) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 58, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39;
    e) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 59, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39;
    f) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 60, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 39;
    g) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, un CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y un CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 61;
    h) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 63;
    i) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 64; y
    j) una CDRH1 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 56, una CDRH2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26, una CDRH3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27, una CDRL1 que comprende el aminoacido secuencia de la SEQ ID NO: 37, una CDRL2 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 38, y una CDRL3 que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 65,
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    en donde el anticuerpo exhibe un valor IC50 para bloquear TLR4 humana que es mas potente que el valor de IC50 exhibido por un anticuerpo de referencia que tiene la secuencia de aminoacidos de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera variable de la SEQ ID NO. : 4 cuando se mide en un ensayo ELISA de sangre completa que mide la produccion de IL-6 despues de que las muestras de sangre se incuban con el anticuerpo y el anticuerpo de referencia.
  2. 2. El anticuerpo aislado de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende una combinacion de una secuencia de aminoacidos de cadena pesada variable y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en:
    (a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 69 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4;
    (b) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 67 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4;
    (c) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 71 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4;
    (d) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 73 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4;
    (e) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 75 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4;
    (f) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 77 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4;
    (g) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 89 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 91;
    (h) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 93 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 95;
    (i) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 97 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 99; y
    (j) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 101 y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 103.
  3. 3. El anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo comprende ademas una sustitucion de aminoacido en la region constante de cadena pesada gamma en la posicion del aminoacido EU 325 y una sustitucion de aminoacido en la posicion del aminoacido EU 328.
  4. 4. El anticuerpo aislado de la reivindicacion 3, en el que el aminoacido sustituido en la posicion del aminoacido EU 325 es serina, y en el que el aminoacido sustituido en la posicion del aminoacido EU 328 es fenilalanina.
  5. 5. El anticuerpo aislado enfermedad autoinmune o
    de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en el tratamiento de una un trastorno inflamatorio.
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