ES2643296T3

ES2643296T3 - Síntesis de monómeros nucleosídicos 3'-aminoprotegidos

Info

Publication number: ES2643296T3
Application number: ES05768112.4T
Authority: ES
Inventors: Sergei M. Gryaznov; Krisztina Pongracz; Daria Zielinska
Original assignee: Geron Corp
Current assignee: Geron Corp
Priority date: 2004-07-02
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2017-11-22
Anticipated expiration: 2025-06-30
Also published as: RS56361B1; US20060009636A1; US9365606B2; HK1252664A1; US7485717B2; PL3296312T3; CN100558739C; CY1119536T1; ME02933B; US20240034748A1; US10738073B2; DK3296312T3; US20240300992A1; LT3296312T; HRP20210787T1; PT3296312T; KR101279393B1; HRP20171705T1; KR20070042155A; US20160362440A1

Description

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DESCRIPCION

Slntesis de monomeros nucleosidicos 3'-aminoprotegidos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos de slntesis eficaces de monomeros nucleosidicos 3'-amino protegidos ortogonalmente, utiles en la preparacion sintetica de analogos de oligonucleotidos, y a los monomeros protegidos ortogonalmente preparados por dichos metodos.

Referencias

Asai, A. et al., Cancer Research 63(14):3931-9 (2003).

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Giovannangeli, C., Diviacco, S., Labrousse, V., Gryaznov, S.M., Charneau, P. y Helene, C., Proc. Natl. Acad. Sci.

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Gryaznov, S.M., Lloyd, D.H., Chen, J.-K., Schultz, R.G., DeDionisio, L.A., Ratmeyer, L. y Wilson, W.D., Proc.

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Gryaznov, S.M., Pongracz, K., y Matray, T., PCT Pubn. No. WO 2001/018015 (Mar 15 2001). Gryaznov, S.M.,

Skorski, T., Cucco, C., Nieborowska-Skorska, M, Chiu, C.Y., Lloyd, D.H., Chen, J. K., Koziolkiewicz, M. y

Calabretta, B. Nucleic Acids Res. 24:1508-1514 (1996).

Matray, J.C. et al., Nucleic Acid Research 27(20):3976-3985 (1999).

Nelson, J.S. et al., J. Org. Chem. 62:7278-7287 (1997).

Pongracz, K. y Gryaznov, S.M., Tetrahedron Letters 40(43): 7661-7664 (1999).

Skorski, T., Perrotti, D., Nieborowska-Skorska, M., Gryaznov, S.M. y Calabretta, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

94:3966-3971 (1997).

Vincente, S. et al., J. Org. Chem. 64:991-997 (1999). Vu, H. et al., Tetrahedron Letters 31(5):7269-7272 (1990).

Wang, E.S. et al., Blood 103(1):258-266 (2004).

Zaitseva, G.V. et al., Nucleosides & Nucleotides 13(1-3):819-838 (1994).

Zaitseva, V.E. et al., Sov. J. Bioorg. Chem. 10(5)5:369-378 (transl. from Bioorg. Khim. 10(5):670-680) (1984). Antecedentes de la invencion

El uso de oligonucleotidos y analogos de oligonucleotidos como agentes terapeuticos, basado en la union especlfica a secuencias de acidos nucleicos o a protelnas diana, se ha investigado ampliamente. Se han disenado analogos de oligonucleotidos estructuralmente modificados que carecen de la susceptibilidad nucleasa de los oligonucleotidos naturales (con enlaces fosfodiester) y que, en algunos casos, presentan otras propiedades ventajosas tales como una union mejorada a dianas o una especificidad de union mejorada. Una de estas clases de analogos de nucleotidos es el oligonucleotido unido a fosforodiamidato N3’^-P5’ (Gryaznov y Chen, 1994; Chen et al., 1994). Estos compuestos son resistentes a nucleasas, forman dupletes estables con dianas de ARN complementario y dupletes de ADN, y han demostrado una actividad de sentido contrario especlfica de secuencia tanto in vitro como in vivo (Gryaznov et al., 1995; Escude et al., 1996; Gryaznov et al., 1996; Giovannangeli et al., 1997; Skorski et al., 1997). Los oligonucleotidos de tiofosforamidato N3’^P5’ relacionados retienen la elevada afinidad de union al ARN de los fosforamidatos N3’^P5’ y tambien muestran una estabilidad a acidos mejorada (Pongracz y Gryaznov, 1999; Gryaznov et al., 2001). Algunos oligonucleotidos de tiofosforamidato N3’^P5’ han mostrado una prometedora actividad de inhibicion de la telomerasa (Gryaznov et al., 2003; Asai et al., 2003; Wang et al., 2004).

Por pasos, la preparacion de oligonucleotidos de fosforamidato o de tiofosforamidato N3’^P5’ controlada por secuencia, utiliza monomeros de 3’-aminonucleosidos en los que el grupo 3’-amino se protege durante la adicion, y posteriormente se desprotege para la adicion de un monomero adicional a la cadena del oligonucleotido en crecimiento (veanse, por ejemplo Gryaznov y Chen, 1994; Pongracz y Gryaznov, 1999). Puesto que los grupos de las bases de nucleosidos que normalmente se protegen durante la sintesis son grupos amino primarios, la necesidad de proteger el grupo 3’-amino en presencia de estos grupos ha complicado la preparacion de estos monomeros. Los procedimientos existentes (veanse, por ejemplo, Nelson et al., 1997; Matray et al., 1999) conllevan multiples etapas de proteccion y por lo general implican la conversion de un grupo 3’-hidroxilo en un grupo 3’-azido (-N3), que posteriormente se reduce a la 3’-amina. Estos procedimientos llevan tiempo, son costosos, y dan como resultado bajos rendimientos globales de los monomeros. Por consiguiente, se desea mejorar la eficacia de esta sintesis, lo que facilitara la preparacion de oligonucleotidos de fosforamidato o de tiofosforamidato N3’^P5’.

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La presente invencion proporciona, en un aspecto, un metodo para preparar un monomero de adenosina, guanosina o citidina que tiene una base nucleosidica protegida y un grupo 3'-amino protegido, en el que la base y el grupo 3'- amino estan protegidos ortogonalmente. En una realizacion, el metodo comprende las etapas de:

(a) proporcionar un monomero de 3'-amino-3'-desoxiadenosina, citidina o guanosina en el que el grupo 5'- hidroxilo, la base nucleosidica y el grupo 3'-amino estan desprotegidos;

(b) hacer reaccionar selectivamente el grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo labil a acidos o grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo;

hacer reaccionar el grupo 5'-hidroxilo con un segundo grupo protector que consiste en acilo, eter de trialquilsililo labil a bases, o eter de sililo labil a fluoruro; y

hacer reaccionar la base nucleosidica con un tercer grupo protector que es un grupo acilo o un grupo formamidinilo; en el que el primer grupo protector se puede eliminar del grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen la base nucleosidica, y el segundo grupo protector se puede eliminar del grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen la base nucleosidica o el grupo 3'-amino. El metodo puede comprender ademas la etapa de

(c) eliminar el segundo grupo protector del grupo 5'-hidroxilo, en condiciones que no desprotegen la base nucleosidica o el grupo 3'-amino.

En una realizacion, el primer grupo protector es un grupo labil a acidos; por ejemplo, un grupo triarilmetilo, tal como trifenilmetilo (tritilo), monometoxitritilo (MMT), o dimetoxitritilo (DMT). En otra realizacion, el primer grupo protector es fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o uno de sus derivados, que se pueda eliminar con una amina basica tal como DBU o piperidina.

En una realizacion, preferentemente utilizada para un monomero de adenosina o citidina, el segundo y el tercer grupos protectores son ambos grupos acilo, por ejemplo, grupos benzoilo, y las condiciones de (c) comprenden un tratamiento suave con ion hidroxido.

En otra realizacion, el segundo grupo protector es un trialquil silil eter labil a bases, por ejemplo, un eter de trimetilsililo (TMS), el tercer grupo protector es un grupo acilo, y las condiciones de (c) comprenden un tratamiento suave con ion hidroxido.

En una realizacion adicional, el segundo grupo protector es un eter de sililo labil a fluoruro, el tercer grupo protector es un grupo acilo, y las condiciones de (c) comprenden tratamiento con ion fluoruro. Dichos eteres de sililo labiles a fluoruro incluyen, por ejemplo, un terc-butildimetil silil eter, un terc-butildifenil silil eter, un difenilmetil silil eter, y un tri(isopropil) silil eter. En una realizacion, el eter de sililo labil a fluoruro es un terc-butildimetil silil (TBDMS) eter.

En una realizacion alternativa, el metodo comprende las etapas de:

(b) hacer reaccionar selectivamente el grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo labil a acidos o grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo; y

hacer reaccionar selectivamente la base nucleosidica con un grupo protector adicional que consiste en un grupo formamidinilo cuando el monomero es adenosina o guanosina o un grupo acilo cuando el monomero es citidina; en el que el primer grupo protector se puede eliminar del grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen la base nucleosidica.

En esta realizacion del metodo, el grupo 5'-OH permanece practicamente sin reaccionar en las condiciones de proteccion de la base nucleosidica, y no requiere una proteccion individual. En una realizacion, el monomero es un monomero de citidina, el primer grupo protector es como se ha descrito anteriormente, y el grupo protector adicional es un grupo acilo, preferentemente un grupo benzoilo. El grupo acilo protector se incorpora preferentemente por reaccion con un anhidrido de acilo.

En otras realizaciones, el monomero es un monomero de guanosina o de adenosina, el primer grupo protector es como se ha descrito anteriormente, y el grupo protector adicional es un grupo formamidinilo, tal como un grupo dialquilformamidinilo.

En un aspecto relacionado, la invencion proporciona un metodo para preparar un monomero de timidina que tiene un grupo 5'-hidroxilo libre y un grupo 3'-amino protegido, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar un monomero de 3'-amino-3'-desoxitimidina en el que el grupo 5'-hidroxilo y el grupo 3'-amino estan desprotegidos; y

(b) hacer reaccionar selectivamente el grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo

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triarilmetilo o fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo.

En un aspecto relacionado, la invencion proporciona un metodo para preparar un monomero de timidina que tiene un grupo 3'-amino protegido, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar un monomero de 3'-amino-3'-desoxitimidina en el que el grupo 5'-hidroxilo y el grupo 3'-amino estan desprotegidos;

(b) hacer reaccionar selectivamente dicho grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo labil a acidos o grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo; y posteriormente:

(c) fosfitilar el grupo 5'-hidroxilo.

El primer grupo protector puede ser labil a acidos; por ejemplo, un grupo triarilmetilo, tal como trifenilmetilo (tritilo). En otra realizacion, el primer grupo protector es fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o uno de sus derivados, que se pueda eliminar con una amina basica tal como DBU o piperidina.

Los monomeros de partida y finales en estos metodos sinteticos comprenden, preferentemente, un grupo 2' seleccionado entre hidrogeno, hidroxi, alcoxi inferior, alquilo inferior, y fluor. En realizaciones seleccionadas, el monomero comprende un grupo 2' seleccionado entre hidrogeno, hidroxi, metoxi, y fluor. En una realizacion, el monomero es un monomero 2',3'-didesoxi, tal como el grupo 2' es hidrogeno.

En otro aspecto, la invencion proporciona un monomero de adenosina, guanosina o citidina que tiene un grupo 3'- amino protegido que esta protegido con un grupo labil a acidos o un grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo y una base nucleosldica que esta protegida con un grupo dialquil-formamidinilo, grupo di(cicloalquil)-formamidinilo, o grupo di(aralquil)-formamidinilo, en el que el grupo 5'-hidroxilo esta desprotegido, o esta protegido de tal forma que se puede desproteger en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosldica o dicho grupo 3'-amino. En realizaciones seleccionadas, el grupo 3'-amino esta protegido con un grupo protector labil a acidos; por ejemplo, un grupo triarilmetilo, tal como trifenilmetilo (tritilo). En otras realizaciones, el grupo 3'-amino esta protegido con fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o un derivado del mismo que se pueda eliminar con una amina basica tal como DBU o piperidina.

En una realizacion, la base nucleosldica esta protegida con un grupo acilo. Preferentemente, el grupo acilo es benzoilo cuando el monomero es un monomero de adenosina o citidina, e isobutirilo cuando el monomero es un monomero de guanosina. En otras realizaciones adicionales, la base nucleosldica esta protegida con un grupo formamidinilo, preferentemente, una base nucleosldica esta protegida con un grupo dialquilformamidinilo.

El grupo 5'-hidroxilo del monomero esta desprotegido, o esta protegido de tal forma que se puede desproteger en condiciones que no desprotegen la base nucleosldica o el grupo 3'-amino. Por ejemplo, puede estar protegido con un eter de sililo que es labil a una base debil o al ion fluoruro, tal como se ha indicado anteriormente.

El monomero comprende preferentemente un grupo 2' seleccionado entre hidrogeno, hidroxi, alcoxi inferior, alquilo inferior, y fluor. En realizaciones seleccionadas, el monomero comprende un grupo 2' seleccionado entre hidrogeno, hidroxi, metoxi, y fluor. En una realizacion, el monomero es un monomero 2',3'-didesoxi, tal como el grupo 2' es hidrogeno.

Estos y otros objetivos y caracterlsticas de la invencion seran mas evidentes en su totalidad cuando la siguiente descripcion detallada de la invencion se lea junto con los dibujos adjuntos.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un esquema que muestra metodos ilustrativos alternativos para la slntesis de un monomero de 3'- aminoadenosina, que tambien son de aplicacion para monomeros de 3'-aminocitidina, de acuerdo con diversas realizaciones de la invencion;

la Figura 2A muestra un metodo ilustrativo para la slntesis de un monomero de 3'-aminoguanosina, de acuerdo con una realizacion de la invencion;

la Figura 2B muestra un metodo ilustrativo alternativo para la slntesis de un monomero de 3'-aminoguanosina, de acuerdo con una realizacion de la invencion;

la Figura 2C muestra un metodo para la slntesis de un monomero de 3'-aminocitidina, de acuerdo con una realizacion adicional de la invencion; y

la Figura 3 muestra un metodo ilustrativo para la slntesis de un monomero de 3'-aminotimidina, de acuerdo con una realizacion adicional de la invencion.

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I. Definiciones

Los terminos siguientes tienen los siguientes significados salvo que se indique otra cosa.

"Protegido ortogonalmente", con respecto a una pluralidad de grupos funcionales protegidos en la misma molecula, indica que es posible desproteger cualquier miembro seleccionado del grupo sin desproteger el resto de grupos.

"Protegido selectivamente", con respecto a la proteccion de un grupo funcional diana en una molecula que tiene una pluralidad de grupos funcionales desprotegidos, indica que, en una reaccion de la molecula con un reactivo protector, el grupo funcional diana queda protegido en mayor medida que cualquier grupo funcional no diana. La extension de la reaccion del grupo funcional diana con respecto al cualquier grupo funcional no diana es mayor de 1:1, preferentemente mayor de 2:1, y mas preferentemente mayor de 3:1 o superior, por ejemplo mayor de 9:1. La misma definicion se aplica a la terminologla "reaccion selectiva" de un grupo funcional dado con un grupo protector.

"Reaccion con un grupo protector", tal como se usa en el presente documento, es equivalente a "proporcionar un grupo protector", "proteger con a grupo protector", o "reaccionar con un reactivo protector de grupo".

"Alquilo" se refiere a un resto aclclico completamente saturado que consiste en carbono e hidrogeno, que puede ser lineal o ramificado. Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-butilo, t-butilo, n-heptilo, e isopropilo. Por lo general, se prefieren los grupos alquilo inferior, que tienen de uno a seis atomos de carbono, que se ilustran por metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo, isoamilo, n-pentilo, e isopentilo. En otras realizaciones, alquilo inferior incluye grupos que tienen de uno a cuatro atomos de carbono, o 1-2 atomos de carbono (metilo y etilo).

"Cicloalquilo" se refiere a un hidrocarburo clclico saturado, que tiene preferentemente de 4 a 7 atomos de carbono, mas preferentemente 5 o 6 (es decir ciclopentilo o ciclohexilo).

"Alquenilo" se refiere a un resto aclclico insaturado que consiste en carbono e hidrogeno, que puede ser lineal o ramificado, que tiene uno o mas dobles enlaces. Por lo general, se prefieren los grupos alquenilo inferior, que tienen de dos a seis, o de dos a cuatro, atomos de carbono. "Alquinilo" se refiere a un resto aclclico insaturado que consiste en carbono e hidrogeno, que puede ser lineal o ramificado, que contiene uno o mas triples enlaces. Por lo general, se prefieren los grupos alquinilo inferior, que tienen de dos a seis, o de dos a cuatro, atomos de carbono.

"Arilo" se refiere a un radical aromatico monovalente sustituido o no sustituido, que tiene por lo general un solo anillo (por ejemplo, benceno) o dos anillos condensados (por ejemplo, naftilo), donde se prefieren los grupos arilo monoclclicos. El termino incluye grupos heteroarilo, que son grupos de anillo aromatico que tienen uno o mas atomos de nitrogeno, oxlgeno o azufre en el anillo, tales como furilo, pirrol, piridilo, e indol. Por "sustituido" se entiende que uno o mas atomos de hidrogeno del anillo en el grupo arilo, preferentemente uno o dos atomos de hidrogeno del anillo, esta sustituido por un grupo preferentemente seleccionado entre fluor, cloro, bromo, metilo, etilo, metoxi, halometoxi, y halometilo. Los grupos arilo preferidos para su uso en los grupos protectores son arilos carboclclicos, que estan no sustituidos, o sustituidos por alcoxi inferior (ademas del sustituyente que une el grupo al resto protector).

"Aralquilo" se refiere a un alquilo, preferentemente un sustituyente alquilo inferior (C1-C4, mas preferiblemente C1- C2), que esta adicionalmente sustituido por un grupo arilo, preferiblemente un grupo arilo monoclclico; los ejemplos son bencilo (-CH2C6H5) y fenetilo.

"Acilo" se refiere a un sustituyente de la forma R(C=O)-, en la que R es alquilo, alquenilo, alquinilo, aralquilo, o arilo como se ha definido anteriormente, y se selecciona preferentemente entre alquilo inferior y arilo carboclclico monoclclico. Los ejemplos incluyen benzoilo (Ph(C=O)-), acetilo (CH3(C=O)-) e isobutirilo ((CH3)2CH(C=O)-).

II. Sintesis de monomeros protegidos

La invencion proporciona, en un aspecto, sintesis eficaces de monomeros de 3'-amino-5'-hidroxil nucleosidos protegidos ortogonalmente, en las que los grupos amino en la posicion 3' y la base nucleosidica estan protegidos ortogonalmente, a partir de los correspondientes 3'-aminonucleosidos no protegidos. Normalmente, los monomeros producto se fosfitilan a continuacion en el 5'-hidroxilo libre para su uso en la sintesis de oligonucleotidos de fosforamidato o de tiofosforamidato N3'^P5'. (Veanse por ejemplo la Figura 2B y Figura 3).

A. Materiales de partida

El material de partida para la sintesis del monomero es un 3'-aminonucleosido que tiene la siguiente formula general:

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donde BASE es una base nucleosidica desprotegida seleccionada entre guanina (G), adenina (A), timina (T) y citosina (C). El sustituyente 2' X puede ser hidrogeno, como en los monomeros 2',3'-didesoxi, para producir analogos de ADN. Como alternativa, X puede ser hidroxi o alcoxi inferior, tal como metoxi, para producir ARN o analogos de O-alquil ARN. El sustituyente 2' tambien puede ser fluor (vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 5.684.143) o alquilo inferior, tal como metilo.

Los 3'-amino-2',3'-didesoxinucleosidos, utiles como materiales de partida en las slntesis del presente documento, se pueden obtener comercialmente de Metkinen Oy, situada en Littoinen, Finlandia. El material de partida de 3'-amino- 2',3'-didesoxitimidina tambien esta disponible en el mercado de varias fuentes tales como Dalton Chemical Labs (Toronto, Canada) y MP Biomedicals Inc. (Irvine, CA). Varias preparaciones sinteticas de los 3'-amino-2',3'- didesoxinucleosidos se han notificado en la bibliografla (por ejemplo Zaitseva et al., 1994; Cech et al., 1996; Zaitseva et al., 1984). De acuerdo con Zaitseva et al., 1994, la 3'-amino-2',3'-didesoxitimidina se puede convertir en los correspondientes monomeros de adenosina o guanosina mediante transglicolacion enzimatica.

B1. Estrategias de proteccion: Description general

De acuerdo con la invention, se proporcionan procedimientos eficaces para convertir los nucleosidos anteriormente representados graficamente en los correspondientes monomeros 3'-amino-protegidos (en el caso de A, G, y C). Como los grupos de las bases que se deben proteger son tambien grupos amino, la proteccion selectiva del grupo 3'-amino en presencia de la base no protegida, o viceversa, no se ha conseguido satisfactoriamente en el pasado, y los procedimientos existentes para la preparation de estos monomeros (vease, por ejemplo, Nelson et al., 1997) conlleva multiples etapas de proteccion y por lo general implica la conversion de un grupo 3'-hidroxilo en un grupo azida, que posteriormente se reduce a la 3'-amina.

Los presentes inventores han proporcionado metodos eficaces para proteger selectivamente el grupo 3'-amino en presencia de las bases nucleosldicas, de forma que la base nucleosidica se puede proteger posteriormente con un grupo protector ortogonal; es decir, uno que no se pueda eliminar en las condiciones seleccionadas que son eficaces para eliminar el grupo protector en 3'-amino (o el grupo protector en 5'-hidroxilo, si esta presente).

Ademas, el grupo 3'-amino tambien esta protegido selectivamente en presencia del grupo 5'-hidroxilo o viceversa. Por consiguiente, es posible proporcionar el 5'-hidroxilo libre con un grupo protector, que se puede eliminar en condiciones seleccionadas que no eliminan ni el grupo protector de 3'-amino o el grupo protector de la base. (Como alternativa, como en el caso de la timidina, el grupo 5'-hidroxilo libre se puede fosfitilar directamente).

El grupo protector del 5'-hidroxilo puede ser, por ejemplo, un grupo sililo, que se puede eliminar en condiciones, tales como una base debil o ion fluoruro, que no eliminan los grupos protectores (normalmente grupos acilo o amidinilo) usados con la base nucleotldica. Como alternativa, el mismo grupo protector (tal como un grupo acilo) se puede usar para el 5'-hidroxilo y la base nucleotldica, donde las condiciones utilizadas para su elimination (por ejemplo, base debil) que desprotegeran el grupo hidroxilo no desprotegeran los grupos amino de la base nucleotldica.

En una estrategia adicional, la base nucleotldica se puede proteger en condiciones que dejan el grupo 5'-hidroxilo sin reaccionar y que, por tanto, no requieren proteccion.

En todos los casos, los grupos protectores empleados para las bases nucleotidicas son estables en las condiciones de acoplamiento de monomeros utilizadas en la sintesis de oligonucleotidos. Los procedimientos para preparar oligonucleotidos de fosforamidato o de tiofosforamidato N3'^P5' a partir de los monomeros descritos en el presente documento se describen, por ejemplo, en Gryaznov y Chen (1994) y Pongracz and Gryaznov (1999).

B2. Estrategias de proteccion: monomeros A, G, y C

La invencion proporciona, para monomeros de adenosina, guanosina o citidina, metodos para preparar dichos monomeros que tienen un grupo 5'-hidroxilo libre, una base nucleosidica protegida, y un grupo 3'-amino protegido, donde la base y el grupo 3'-amino estan protegidos ortogonalmente, tal como se define anteriormente. El material de partida es un monomero de 3'-amino-3'-desoxiadenosina, citidina o guanosina en el que el grupo 5'-hidroxilo, la base nucleosidica y el grupo 3'-amino estan desprotegidos.

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En una estrategia general, el metodo comprende hacer reaccionar selectivamente el grupo 3'-amino con un primer grupo protector, hacer reaccionar el grupo 5'-hidroxilo con un segundo grupo protector, y hacer reaccionar la base nucleosldica con un tercer grupo protector. El primer grupo protector (para el 3'-amino) es tal que se puede eliminar del grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen la base nucleosldica. Ademas, el segundo grupo protector (para el 5'-hidroxilo), cuando esta presente, es tal que se puede eliminar del grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen la base nucleosldica o el grupo 3'-amino.

Una vez que los grupos reactivos deseados se han protegido, de acuerdo con la estrategia general anterior, el segundo grupo protector, si se encuentra presente, se elimina del grupo 5'-hidroxilo, en condiciones que no desprotegen la base nucleosldica o el grupo 3'-amino. A continuacion, el monomero se puede fosfitilar, por ejemplo, para su uso en la slntesis de oligonucleotidos.

Normalmente, el primer, segundo y tercer grupos protectores se aplican en dicho orden, aunque el segundo y el tercer grupos pueden, realmente, ser el mismo y, por tanto, aplicarse en una unica reaccion. Ademas, la proteccion del grupo 5'-hidroxilo, en las estrategias que utilizan esta etapa, se puede llevar a cabo antes o despues de la proteccion del grupo 3'-amino. Las dos reacciones se suelen llevar a cabo en el mismo recipiente de reaccion, aunque preferentemente, los agentes no se anaden simultaneamente. Preferentemente, el reactivo protector de 3'- amino se anade en primer lugar, como se ilustra en los ejemplos siguientes.

En realizaciones seleccionadas, la proteccion transitoria del grupo 5'-hidroxilo con una base labil de eter de sililo (por ejemplo, TMS) se utiliza durante la etapa de proteccion de la base, tal como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 1 (conversion de la estructura 2 en la estructura 6) y en la Fig. 2B, como se analiza mas delante de forma detallada.

En otras realizaciones, el grupo 5'-hidroxilo y las bases nucleotldicas se protegen con el mismo reactivo, seguido de la desproteccion selectiva del grupo hidroxilo. Dicho reactivo suele ser un agente acilante, por ejemplo, un haluro de isobutirilo o un haluro de benzollo. Un esquema ilustrativo de este tipo se muestra en la conversion de la estructura 2 en la 3 en la Fig. 1, seguido de tratamiento con base en condiciones suaves para desproteger selectivamente el grupo hidroxilo (conversion de 3 en 6).

Como se ha mencionado anteriormente, el primer grupo protector, para proteger el grupo 3'-amino, es uno que es estable en las condiciones que pueden eliminar el segundo grupo protector (del 5'-hidroxilo), cuando esta presente, pero es labil en condiciones que no eliminan el tercer grupo protector (para la base nucleosldica). En una realizacion, el primer grupo protector es labil a acidos; por ejemplo, un grupo triarilmetilo tal como tritilo (trifenilmetilo), monometoxitritilo (MMT), o dimetoxitritilo (DMT).

Otro grupo util como el primer grupo protector es fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), que se puede eliminar mediante escision no hidrolltica con una amina basica, tal como DBU, morfolina, o piperidina. Una base de hidroxido (por ejemplo NaOH) no es adecuada para este fin, ya que este reactivo normalmente eliminara tambien otros grupos protectores de la molecula. Tambien se pueden usar derivados de Fmoc que se pueden eliminar por un mecanismo similar. Dichos derivados incluyen aquellos en los que el grupo fluorenilo del Fmoc esta sustituido, normalmente en la posicion 2 y/o 7, por un grupo, tal como un grupo alquilo inferior, que no afectara negativamente al mecanismo de escision, o con un grupo electroatrayente, tal como halogeno, que aumenta la labilidad a bases del grupo protector (Carpino et al., 1980). Tambien se incluyen los analogos de dioxido de tioxanteno descritos en Carpino et al., 1989.

La Figura 1 muestra permutaciones ilustrativas de una estrategia sintetica que se puede usar en la preparation de los monomeros sujeto. Estos metodos son especialmente adecuados para los monomeros nucleosidos A (adenosina) y C (citosina). Como se describe a continuacion, los metodos tambien se pueden usar, preferentemente con algunas modificaciones, para monomeros G (guanosina). En las estrategias ilustradas en las Figs. 1 y 2A-B, se usa proteccion del 5'-hidroxi. La Fig. 2C, analizada mas detalladamente a continuacion, ilustra una estrategia en la que no se utiliza proteccion del 5'-hidroxi.

Como se ha mencionado anteriormente, un primer grupo protector preferido (para el grupo 3'-amino) es un grupo labil a acidos, tal como tritilo, MMT, o DMT, o un grupo, tal como Fmoc, que es labil a un reactivo de amina basico tal como DBU. En una realizacion, los segundo y el tercer grupos protectores preferidos son ambos grupos aracilo, por ejemplo, grupos benzollo. Las condiciones que son eficaces para desproteger el grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen la base nucleosldica o el grupo 3'-amino, en este caso, comprenden preferentemente un tratamiento suave con base, tal como un tratamiento con hidroxido, por ejemplo hidroxido de amonio. Dicho tratamiento es eficaz para eliminar el grupo acilo del 5'-hidroxilo y para convertir la base diacilada en la base monoacilada. Dicho esquema se ilustra en la Fig. 1, en la conversion del compuesto intermedio 3 en el producto 6.

En otra realizacion, el segundo grupo protector, para la proteccion del grupo 5'-hidroxilo, es un eter de trialquilsililo labil a bases, preferentemente TMS, y el tercer grupo protector (para la proteccion de la base nucleotldica) es un grupo acilo, tal como un alcanollo, preferentemente isobutirilo, o un grupo benzollo. De nuevo, las condiciones que son eficaces para desproteger el grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen la base nucleosldica o el grupo 3'-amino, en este caso, comprenden preferentemente un tratamiento suave con base, por ejemplo, tratamiento con hidroxido. Dicho tratamiento es eficaz para escindir un eter de trimetilsililo y para convertir la base diacilada, si

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Otro tipo preferido de grupo protector para la base nucleotldica, particularmente para los monomeros de adenosina y guanosina, es un grupo protector de formamidinilo, tal como un grupo dialquil-formamidinilo, di(cicloalquil)- formamidinilo, o di(aralquil)-formamidinilo, donde "alquilo" es, preferentemente, C1-C4 y "cicloalquilo" es, preferentemente, C5-C6. Los ejemplos especlficos incluyen dimetilformamidinilo y dibencilformamidinilo. Estos grupos protectores se pueden eliminar, por lo general, de las bases nucleotldicas (por ejemplo, al final de la slntesis) en condiciones mas suaves de las utilizadas para eliminar los grupos protectores de benzollo o isobutirilo. Veanse, por ejemplo, Vu et al., 1990, Vincent et al., 1999, y/o la patente de Estados Unidos n.° 5.281.701. Tal como se describe en el presente documento, la reaccion de una amina primaria con una dimetil acetal dialquilformamida, por ejemplo, proporciona la amina protegida con dialquilformamidinilo. La desproteccion se puede llevar a cabo, generalmente, por tratamiento con una solucion acuosa o alcoholica de hidroxido de amonio a temperatura ambiente a aproximadamente 55°C.

En una realizacion adicional, el segundo protector (para proteger el 5'-hidroxilo) es un eter de sililo labil a fluoruro, y el tercer grupo protector (pata la base nucleosldica) es un grupo acilo, tal como un grupo benzollo, o un grupo formamidinilo como se ha descrito anteriormente. En este caso, las condiciones que son eficaces para desproteger el grupo 5'-hidroxilo, en condiciones que no desprotegen la base nucleosldica o el grupo 3'-amino, comprenden preferentemente tratamiento con ion fluoruro, por ejemplo, fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF). Dicho tratamiento es eficaz para escindir el eter de sililo y convertir la base diacilada, si se encuentra presente, en la base monoacilada. Un ejemplo de este esquema tambien se ilustra en la Fig. 1, en la conversion del compuesto intermedio 5 en el producto 6. Los eteres de sililo labiles a fluoruro ilustrativos incluyen, por ejemplo, terc-butildimetil silil eter, terc- butildifenil silil eter, difenilmetil silil eter, tri(isopropil) silil eter, y otros conocidos en la tecnica.

Los metodos anteriores tambien se pueden utilizar, con algunas modificaciones relativas principalmente a la solubilidad, para los monomeros de guanosina (G). En una realizacion, que se ilustra en la Figura 2A, el grupo 5'- hidroxilo del monomero de partida 7 se protege con un grupo lipofilo, tal como TBDMS, en una etapa temprana del proceso, para facilitar la solubilidad en el disolvente convencional piridina.

Como se ha mencionado anteriormente, un primer grupo protector preferido (para el grupo 3'-amino) es un grupo labil a acidos, tal como tritilo, DMT, o MMT, o un grupo, tal como Fmoc, que es labil a un reactivo de amina basico tal como DBU. En la realizacion de la Fig. 2A se emplea un grupo tritilo.

Dependiendo de las condiciones de reaccion, se pueden observar pequenas cantidades (por ejemplo, aproximadamente un 5 %) del compuesto ditritilado 9 ademas del compuesto 8 deseado 3'-monotritilado. Por consiguiente, "proteccion selectiva" tal como se usa en el presente documento, indica que la molecula que tiene el estado de proteccion deseado se forma en mayor medida, es decir, en una relacion mayor de 1:1, que las moleculas en las que los grupos funcionales no diana estan protegidos, tanto de forma exclusiva o ademas del grupo funcional diana. Preferentemente, la relacion es mayor de 2:1, mas preferentemente mayor de 3:1, y lo mas preferido mayor de 9:1.

El segundo grupo protector (para el 5'-hidroxilo) es, en esta realizacion, un eter de sililo labil a fluoruro y, mas preferentemente, un grupo que mejora la solubilidad del compuesto intermedio. Se descubrio que un eter de TBDMS, como se muestra en la Fig. 2a, mejoraba la solubilidad en el disolvente piridina.

El tercer grupo protector es, preferentemente, un grupo acilo, por ejemplo, un grupo isobutirilo, o un grupo formamidinilo, como se ha descrito anteriormente. Las condiciones que son eficaces para desproteger el grupo 5'- hidroxilo, en condiciones que no desprotegen la base nucleosldica o el grupo 3'-amino, comprenden preferentemente tratamiento con ion fluoruro, por ejemplo, fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF). Dicho tratamiento es eficaz para escindir el eter de sililo en el compuesto 10 sin afectar los grupos isobutirilo o tritilo, como se muestra en la Fig. 2A.

En otra realizacion, tal como se ilustra en la Figura 2B, un disolvente mas polar, como DMF, se utiliza para solubilizar el monomero de partida 7 y, por otra parte, el esquema de reaccion es similar al esquema de la "proteccion transitoria" (usando un eter de TMS como el grupo protector del 5'-hidroxilo) mostrado para el monomero de adenosina 1 en la Fig. 1.

La Figura 2C ilustra una realizacion de una estrategia sintetica, especialmente aplicable a los monomeros de citidina, en el que no se emplea la proteccion del 5'-hidroxilo. En este esquema de reaccion, tras la proteccion selectiva del grupo 3'-amino del monomero 12 con, por ejemplo, un grupo tritilo, el grupo amino exoclclico de esta base se hace reaccionar con un anhldrido de acilo, tal como anhldrido de benzollo. El disolvente preferiblemente contiene un alcohol, que se cree compite con una reaccion de supresion del grupo 5'-hidroxilo. Los ejemplos incluyen metanol, etanol, y mezclas de estos disolventes con, por ejemplo, acetonitrilo, DMF, o piridina. En la reaccion que utiliza anhldrido de benzollo en etanol o en acetonitrilo:metanol 9:1, como se describe en el Ejemplo 4, se observo poco (< 5 %) producto 5'-benzoilado. El monomero de 5'-hidroxilo 14 predominante se puede fosfitilar despues por metodos

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En otra realizacion, particularmente aplicable a los monomeros de adenosina o guanosina, tras la proteccion selectiva del grupo 3'-amino del monomero con, por ejemplo, un grupo tritilo, el grupo amino exociclico de esta base se protege con un grupo dialquilformamidinilo, grupo di(cicloalquil)formamidinilo, o grupo dibencilformamidinilo, preferentemente un grupo dimetilformamidinilo. El grupo 5'-hidroxilo, que se espera que permanezca practica o totalmente sin reaccionar durante estas etapas, se puede fosfitilar despues por metodos convencionales.

B3. Estrategias de proteccion: Monomero T

En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para preparar un monomero de timidina que tiene un grupo 5'- hidroxilo libre y un grupo 3'-amino protegido. La estrategia sintetica difiere de la anteriormente descrita, en que la base timina no suele necesitar proteccion en condiciones de sintesis de oligonucleotidos. En este caso, el material de partida es un monomero de 3'-amino-3'-desoxitimidina en el que el grupo 5'-hidroxilo y el grupo 3'-amino estan desprotegidos, y el metodo comprende hacer reaccionar selectivamente dicho grupo 3'-amino con un primer grupo protector, de tal forma que el grupo 5'-hidroxilo permanece sustancialmente desprotegido.

Como en las sintesis anteriormente descritas, un grupo protector preferido para el grupo 3'-amino es un grupo labil a acidos, tal como un grupo triarilmetilo, o un grupo, tal como Fmoc, que es labil a un reactivo de amina basico tal como DBU. En la realizacion de la Fig. 3 se emplea un grupo tritilo.

A continuacion, el grupo 5'-hidroxilo se puede fosfitilar, como se describe, por ejemplo en el Ejemplo 5 siguiente. A destacar que este proceso de fosfitilacion tambien es de aplicacion a cualquiera de los monomeros con proteccion en el grupo 5'-hidroxilo y 3'-amino y en la base anteriormente descritos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran, pero no se pretende que limiten la invencion. Por ejemplo, las condiciones de reaccion, tales como la seleccion del disolvente, catalizador (por ejemplo, trietilamina o diisopropil etil amina), tiempos de reaccion y temperaturas de reaccion, pueden variar por lo general de los ilustrados a continuacion, de acuerdo con el conocimiento del experto en la tecnica, usando experimentation rutinaria. En algunos casos, el orden de adicion de reactivos podria variar. Los disolventes adecuados para la mayoria de estas reacciones, cuando no se indica otra cosa, incluyen por lo general disolventes aprotico polares tales como piridina, DMF, acetonitrilo, o mezclas de los mismos. Las temperaturas adecuadas estan generalmente comprendidas en el intervalo de -10°C a temperatura ambiente a aproximadamente 55°C.

Ejemplo 1. Sintesis de N6-benzoil-3'-aminotritil-2',3'-dideoxiadenosina a partir de 3'-amino-2',3'- dideoxiadenosina

A. Metodo 1: Ruta de perbenzoilacion (como se ilustra en la Fig. 1, 1^2^3^6)

El monomero de partida, 3'-amino-2',3'-didesoxiadenosina(1, 10 mmol), se evaporo simultaneamente con piridina seca, despues, se suspendio en 100 ml de piridina seca que contenia 6 equiv. de trietilamina, y la mezcla se calento a 50°C con agitation. Se anadio cloruro de tritilo (1,1 equiv.), y la agitation se continuo durante dos horas a 50°C. La solution trasparente obtenida que contenia el monomero 3'-tritilado 2 se enfrio a 0°C, se anadieron 5 equiv. de cloruro de benzoilo gota a gota, y la mezcla de reaccion se agito durante una hora y despues se vertio en 100 ml de bicarbonato sodico al 5 % frio. La goma de color amarillo precipitada se extrajo con acetato de etilo, y la solucion de acetato de etilo se evaporo. El aceite resultante (3, que tiene un grupo benzoilo en el 5'-hidroxilo y dos en N6 de la base) se disolvio en 50 ml de piridina:metanol:agua 65:35:5 v/v/v, la solucion se enfrio a 0°C, y se anadieron 50 ml de hidroxido sodico 2 M. Despues de 25 min de agitacion a 0°C, la mezcla de reaccion se neutralizo con clorhidrato de piridinio, y el volumen de la mezcla se redujo por evaporation. Tras dilution con acetato de etilo, la capa organica se separo y se lavo con una solucion acuosa saturada de bicarbonato de sodio y se evaporo al vacio. El producto se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida de gel de silice usando un sistema disolvente de cloruro de metileno:metanol 95:5 v/v. El rendimiento del producto aislado (6), que tiene un grupo 5'-hidroxilo libre y la base monobenzoilada, fue 2,0 g (33,6 %)

B. Metodo 2: Ruta de proteccion transitoria (como se muestra en la Fig. 1, 1^2^6)

El monomero de partida, 3'-amino-2',3'-didesoxiadenosina(1, 10 mmol), se convirtio en el monomero 3'-protedigo 2 como se ha descrito anteriormente, es decir, por tratamiento con 1,1 equiv. de cloruro de tritilo en piridina seca que contenia 6 equiv. de trietilamina a 50°C.

La solucion transparente de 2 se enfrio a 0°C, y se anadieron 5 equiv. de clorotrimetilsilano gota a gota, seguido de agitacion durante 30 min, produciendo un compuesto intermedio de 5'-OTMS. A continuacion se anadio cloruro de benzoilo (5 equiv.) gota a gota, seguido de agitacion durante dos horas a temperatura ambiente, produciendo un compuesto intermedio de base protegida con monobenzoilo y/o dibenzoilo.

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La mezcla de reaccion se enfrio a 0°C, y se anadieron 20 ml de agua frla, seguido de 20 min de agitacion y la adicion de 20 ml de una solucion concentrada de hidroxido de amonio. La agitacion se continuo durante 30 min, y la solucion se concentro al vaclo. El residuo oleoso se recogio en acetato de etilo y se lavo con una solucion saturada de bicarbonato sodico, y la solucion se seco y se evaporo al vaclo. El producto se purifico como anteriormente por cromatografla sobre gel de sllice. El rendimiento del producto aislado (6) fue 3,6 g (60,2 %).

En procedimientos posteriores, DMF o DMF/piridina, con adicion de trietilamina, se uso como disolvente en la reaccion de tritilacion inicial, y el compuesto intermedio 2 se hizo reaccionar adicionalmente, usando cualquiera del Metodo A o Metodo B, para dar el producto 6 con un rendimiento de aproximadamente el 70 %. Se encontro que los rendimientos mejoraban algo por elimination de trietilamina (por ejemplo, mediante lavado acuoso) antes de la benzoilacion, particularmente cuando se usa el Metodo A. Se observo que este tratamiento evitaba la formation de un producto secundario, que se crela resultado de la apertura del anillo de la base adenina. La formacion de este producto secundario tambien se elimino aislando el producto tritilado 2 antes de la reaccion posterior.

C. Metodo 3: Ruta de protection TBDMS (como se ilustra en la Fig. 1, 1^2^4^5^6)

El monomero de partida, 3'-amino-2',3'-didesoxiadenosina(1, 10 mmol), se convirtio en el monomero 3'-protedigo 2 como se ha descrito anteriormente, es decir, por tratamiento con 1,1 equiv. de cloruro de tritilo en piridina seca que contenla 6 equiv. de trietilamina a 50°C.

A la solucion transparente se anadieron 2 equiv. de cloruro de terc-butildimetilsililo (TBDMS Cl), y la agitacion continuo durante la noche a temperatura ambiente. Esta solucion (del sililoxi intermedio 4 3'-tritilamino-5'-TBDM ) se enfrio a -5°C, y se anadieron 3 equiv. de cloruro de benzoilo gota a gota, seguido por agitacion a temperatura ambiente durante dos horas, proporcionando el intermedio de N6-dibenzoilo 5. La solucion se concentro al vaclo, y el residuo oleoso se recogio en acetato de etilo, se lavo con una solucion saturada de bicarbonato sodico, se seco y se evaporo al vaclo.

El residuo oleoso obtenido se disolvio en 100 ml de THF, y se anadieron 2 equiv. de TBAF (fluoruro de tetrabutilamonio). La mezcla se agito durante toda la noche a temperatura ambiente. Se anadio acetato de etilo a la mezcla de reaccion, y la solucion se lavo con bicarbonato sodico, citrato de sodio 0,5 M (pH 4) y salmuera. El producto se purifico como anteriormente por cromatografla sobre gel de sllice para dar 3,3 g (55,5 %) del compuesto 6 puro.

Ejemplo 2. Sfntesis de N4-benzoil-3'-aminotritil-2',3'-didesoxicitidina

La slntesis de N4-benzoil-3'-aminotritil-2',3'-didesoxicitidina a partir de 3'-amino-2',3'-didesoxicitidina puede realizarse de una manera similar, usando cualquiera de los procedimientos anteriores, o de acuerdo con el metodo del Ejemplo 4, a continuation.

Ejemplo 3. Sfntesis de N2-isobutiril-3'-aminotritil-2',3'-didesoxiguanosina a partir de 3'-amino-2',3'- didesoxiguanosina (Fig. 2A)

El material de partida, 3'-amino-2',3'-didesoxiguanosina (7, 2 g), se evaporo simultaneamente con piridina seca, a continuacion se suspendio en 100 ml de piridina seca y 6 equiv. de diisopropiletilamina. Se anadio cloruro de terc- butildimetilsililo (2 equiv.), produciendo un sililoxi intermedio 5'-TBDM. Despues de 30 min de agitacion, se anadieron 1,1 equiv. de cloruro de tritilo en dos porciones, y la agitacion continuo durante la noche a temperatura ambiente. Se detectaron dos compuestos mediante TLC, siendo el producto mas abundante de menor recorrido 8 la 5'-TBDMS-3'- aminotritil-2',3'-didesoxiguanosina deseada. El compuesto 9, menos abundante y de mayor recorrido, esta tritilado en la base. El compuesto 8 monotritilado se aislo por cromatografla sobre gel de sllice usando un sistema disolvente de cloruro de metileno:metanol:trietilamina 94:5:1 v/v/v.

Este producto se evaporo simultaneamente con piridina seca y se disolvio en 100 ml de piridina. La solucion se enfrio a 0°C, y se anadieron 1,1 equiv. de cloruro de isobutirilo, seguido de agitacion durante 30 min. Despues de inactivar la reaccion con metanol y evaporation al vaclo, la reaccion se trato con cloruro de metileno-bicarbonato sodico. La fase organica se seco con sulfato sodico y se evaporo al vaclo. El residuo oleoso (el monomero 10 completamente protegido) se disolvio en 100 ml de tetrahidrofurano, y se anadieron 5 equiv. de fluoruro de tetrabutilamonio. La mezcla de reaccion se agito durante toda la noche, a continuacion se diluyo con acetato de etilo, se lavo con bicarbonato sodico. Despues de secar con sulfato sodico el disolvente se evaporo al vaclo para dar 2 g del producto de 5'-hidroxilo 11 (46,1 %).

En procedimientos posteriores, la tritilacion de 7 se llevo a cabo en DMF/piridina a 50°C, y el producto secundario 9 (<5 %) se retiro mediante precipitation del producto predominante 8 en diclorometano o agua. La base nucleotldica se protegio usando bien el esquema de proteccion transitoria de la Fig. 2B o una reaccion de peracilacion (analogo al Ejemplo 1A). El producto 11 se aislo, tras cristalizacion en CH3CN, en rendimientos de aproximadamente 60 % y 53 %, respectivamente. Tambien se observo que los rendimientos mejoraban cuando se ponla cuidado en evitar la hidrolisis del reactivo de cloruro de acilo.

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Ejemplo 4. Sintesis de N4-benzoil-3'-aminotritil-2',3'-didesoxicitidina a partir de 3'-amino-2',3'-didesoxicitidina (como se ilustra en la Fig. 2C)

El grupo 3’-amino del material de partida 12 se hizo reaccionar con cloruro de tritilo en piridina:DMF 1:4 en presencia de trietilamina. El compuesto intermedio 13 se hizo reaccionar con anhidrido de benzoilo en CH3CN:MeOH 9:1 a 50°C. El producto deseado 14 se aislo, tras cromatografia sobre gel de silice, con un 70 % de rendimiento.

Ejemplo 5. Sintesis de 3'-aminotritil-3'-desoxitimidina-5'-(2-cianoetilo, N,N-diisopropil)fosforamidita a partir de 3'-amino-3'-desoxitimidina, seguido de fosfitilacion (como se ilustra en la Fig. 3)

El material de partida, 3’-amino-3’-desoxitimidina (15, 1,3 g) se evaporo simultaneamente con piridina seca, se disolvio a continuacion en 30 ml de piridina seca. A esta solucion se anadieron 5 equiv. de diisopropiletilamina o trietilamina, seguido de 10 min de agitacion y adicion de 1 a 1,1 equiv. de cloruro de tritilo. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante una noche (o, como alternativa, a 50°C durante 1 hora). Tras la desaparicion del material de partida segun TLC, la reaccion se inactivo con metanol y la solucion se evaporo al vacio. El aceite obtenido se disolvio en cloruro de metileno, se lavo con una solucion saturada de bicarbonato sodico, se seco con sulfato sodico y se concentro. La precipitacion con cloruro de metileno-hexano proporciono 2,2 g (85 %) del producto 16 en forma de un polvo de color blanco.

El producto 16 (1,7 g) se evaporo simultaneamente con piridina seca y se disolvio en 100 ml de cloruro de metileno seco. A esta solucion se anadieron 4 equiv. de diisopropiletilamina, seguido de 1,2 equiv. de 2-cianoetil-N,N- diisopropilclorofosforamidita. La reaccion se controlo por TLC y, tras la desaparicion del material de partida, la solucion se lavo con una solucion saturada de bicarbonato sodico, se seco con sulfato sodico y se evaporo al vacio. El producto se purifico por cromatografia en columna ultrarrapida de gel de silice usando un sistema disolvente de cloruro de metileno:trietilamina 10:1 v/v para producir 2 g (83,3 %) del monomero 17 fosfitilado en forma de una espuma solida. El rendimiento global del procedimiento fue del 70,8 %.

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para preparar un monomero de adenosina, guanosina o citidina que tiene una base nucleosidica protegida y un grupo 3'-amino protegido, en el que dicha base y dicho grupo 3'-amino estan protegidos ortogonalmente, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar un monomero de 3'-amino-3'-desoxi adenosina, citidina o guanosina en donde el grupo 5'- hidroxilo, la base nucleosidica y el grupo 3'-amino estan desprotegidos;

(b) hacer reaccionar selectivamente dicho grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo labil a acidos o grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo;

hacer reaccionar dicho grupo 5'-hidroxilo con un segundo grupo protector que consiste en acilo, eter de trialquilsililo labil a bases o eter de sililo labil a fluoruro y hacer reaccionar dicha base nucleosidica con un tercer grupo protector que es un grupo acilo o un grupo formamidinilo;

en donde dicho primer grupo protector se puede eliminar de dicho grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosidica, y dicho segundo grupo protector se puede eliminar de dicho grupo 5'- hidroxilo en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosidica o dicho grupo 3'-amino.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el tercer grupo protector es un grupo acilo.
3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende ademas la etapa de (c) eliminar dicho segundo grupo protector de dicho grupo 5'-hidroxilo en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosidica o dicho grupo 3'- amino.
4. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho primer grupo protector es un grupo labil a acidos.
5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que dicho primer grupo protector es triarilmetilo.
6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que dicho primer grupo protector es trifenilmetilo.
7. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho monomero es un monomero de adenosina o de guanosina.
8. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dichos segundo y tercer grupos protectores son grupos acilo.
9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que dichos segundo y tercer grupos protectores son grupos benzoilo.
10. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho segundo grupo protector es un trialquil silil eter labil a bases y dicho tercer grupo protector es un grupo acilo.
11. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho segundo grupo protector es un eter de sililo labil a fluoruro y dicho tercer grupo protector es un grupo acilo.
12. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho monomero comprende un grupo 2' seleccionado entre hidrogeno, hidroxi, alcoxi C1-C4, alquilo C1-C4 y fluor.
13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que dicho monomero es un monomero 2',3'-didesoxi, de tal forma que dicho grupo 2' es hidrogeno.
14. Un metodo para preparar un monomero de adenosina, de guanosina o de citidina que tiene un grupo 5'-hidroxilo libre, una base nucleosidica protegida y un grupo 3'-amino protegido, en donde dicha base y dicho grupo 3'-amino estan protegidos ortogonalmente, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar un monomero de 3'-amino-3'-desoxi adenosina, citidina o guanosina en donde el grupo 5'- hidroxilo, la base nucleosidica y el grupo 3'-amino estan desprotegidos;

(b) hacer reaccionar selectivamente dicho grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo labil a acidos o grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo; y

(c) hacer reaccionar selectivamente dicha base nucleosidica con un grupo protector adicional que consiste en un grupo formamidinilo cuando el monomero es adenosina o guanosina o un grupo acilo cuando el monomero es citidina;

en donde dicho primer grupo protector se puede eliminar de dicho grupo 3'-amino en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosidica.
15. El metodo de la reivindicacion 14, en el que el grupo protector adicional consiste en un grupo dialquilformamidinilo, di(cicloalquil)formamidinilo o di(aralquil)formamidinilo donde el monomero es adenosina o guanosina.

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16. El metodo de la reivindicacion 15, en el que el grupo dialquilformamidinilo o dicicloalquilformamidinilo es tal que el alquilo es alquilo C1-C4 y el cicloalquilo es cicloalquilo C5-C6.
17. El metodo de la reivindicacion 14, en el que dicho monomero es un monomero de citidina y dicha reaccion con un grupo protector adicional comprende la reaccion con un anhldrido de acilo.
18. El metodo de la reivindicacion 14, en el que dicho primer grupo protector es triarilmetilo.
19. El metodo de la reivindicacion 18, en el que dicho primer grupo protector es trifenilmetilo.
20. El metodo de la reivindicacion 19, en el que dicho monomero es adenosina o guanosina y dicho grupo protector adicional es un grupo dimetilformamidinilo o un grupo dibencilformamidinilo.
21. El metodo de la reivindicacion 20, en el que dicho grupo protector adicional es un grupo dimetilformamidinilo.
22. El metodo de la reivindicacion 14, en el que dicho monomero comprende un grupo 2' seleccionado entre hidrogeno, hidroxi, alcoxi C1-C4, alquilo C1-C4 y fluor.
23. El metodo de la reivindicacion 14, en el que dicho monomero es un monomero 2',3'-didesoxi, de tal forma que dicho grupo 2' es hidrogeno.
24. Un metodo para preparar un monomero de timidina que tiene un grupo 5'-hidroxilo libre y un grupo 3'-amino protegido, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar un monomero de 3'-amino-3'-desoxitimidina en el que el grupo 5'-hidroxilo y el grupo 3'-amino estan desprotegidos; y

(b) hacer reaccionar selectivamente dicho grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo triarilmetilo o fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo.
25. El metodo de la reivindicacion 24, en el que dicho primer grupo protector es trifenilmetilo.
26. El metodo de la reivindicacion 24, en el que dicho primer grupo protector es un grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo.
27. Un metodo para preparar un monomero de timidina que tiene un grupo 3'-amino protegido, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar un monomero de 3'-amino-3'-desoxitimidina en el que el grupo 5'-hidroxilo y el grupo 3'-amino estan desprotegidos;

(b) hacer reaccionar selectivamente dicho grupo 3'-amino con un primer grupo protector que consiste en un grupo labil a acidos o un grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo; y posteriormente:

(c) fosfitilar el grupo 5'-hidroxilo.
28. El metodo de la reivindicacion 27, en el que dicho primer grupo protector es labil a acidos.
29. El metodo de la reivindicacion 28, en el que dicho primer grupo protector es triarilmetilo.
30. El metodo de la reivindicacion 27, en el que dicho primer grupo protector es un grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo.
31. Un monomero de adenosina, guanosina o citidina que tiene un grupo 3'-amino protegido que esta protegido con un grupo labil a acidos o un grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo y una base nucleosldica que esta protegida con un grupo dialquilformamidinilo, di(cicloalquil)formamidinilo o di(aralquil)formamidinilo, en donde el grupo 5'-hidroxilo esta desprotegido o esta protegido de tal forma que se puede desproteger en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosldica o dicho grupo 3'-amino.
32. El monomero de la reivindicacion 31, en el que el grupo dialquilformamidinilo o dicicloalquilformamidinilo es tal que el alquilo es alquilo C1-C4 y el cicloalquilo es cicloalquilo C5-C6.
33. El monomero de la reivindicacion 31, en el que dicho grupo 3'-amino esta protegido con un grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un derivado de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo.
34. El monomero de la reivindicacion 31, en el que dicho grupo protector labil a acidos es un grupo triarilmetilo.
35. El monomero de la reivindicacion 31, en el que dicha base nucleosldica esta protegida con un grupo

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dimetilformamidinilo o un grupo dibencilformamidinilo.
36. El monomero de la reivindicacion 31, en el que dicha base nucleosldica esta protegida con un grupo dialquilformamidinilo.
37. El monomero de la reivindicacion 36, en donde dicho monomero es un monomero de adenosina o de guanosina.
38. El monomero de la reivindicacion 31, que tiene un grupo 5'-hidroxilo desprotegido.
39. El monomero de la reivindicacion 31, que tiene un grupo 5'-hidroxilo protegido que se puede desproteger en condiciones que no desprotegen dicha base nucleosldica o dicho grupo 3'-amino.
40. El monomero de la reivindicacion 31, en donde dicho monomero comprende un grupo 2' seleccionado entre hidrogeno, hidroxi, alcoxi C1-C4, alquilo C1-C4 y fluor.
41. El monomero de la reivindicacion 40, en el que dicho monomero es un monomero 2',3'-didesoxi, de tal forma que dicho grupo 2' es hidrogeno.