ES2642516T3 - Supresiones en el dominio II de la exotoxina A de Pseudomonas que reducen la toxicidad no específica - Google Patents

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inmunotoxina producida con PE38. La nueva inmunotoxina, sin embargo, también había reducido significativamente la toxicidad no específica, y podía ser tolerada por los ratones con dosis mucho más altas que HA22, mejorando así el efecto antitumoral del tratamiento y permitiendo una ventana terapéutica más grande entre la dosis máxima tolerada y la necesaria para inducir una respuesta completa.

Se han elaborado varias inmunotoxinas utilizando diferentes anticuerpos u otros ligandos como la fracción de direccionamiento, pero utilizando una PE como la fracción de toxina. Se ha sabido que, en algunos casos, la fracción de direccionamiento puede hacer alguna contribución a la toxicidad no específica de una inmunotoxina. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente PCT/US01/43602 en copropiedad, publicada como la publicación internacional No. WO 02/40545, que informa que la toxicidad no específica de algunas inmunotoxinas podría reducirse reduciendo el punto isoeléctrico de las regiones marco de Fv utilizadas como la fracción de direccionamiento. Sin embargo, también ha quedado claro que, en inmunotoxinas y otras moléculas quiméricas que usan PE como fracción de la toxina, el principal contribuyente a la toxicidad no específica es el componente de PE. Por lo tanto, se espera que la toxicidad no específica reducida similar a la observada con respecto a la inmunotoxina HA22-LR en los estudios descritos en la presente memoria resultará también cuando las PE de la invención se usan como la fracción de la toxina de moléculas quiméricas usando como fracción de direccionamiento anticuerpos distintos del anticuerpo usado en HA22 como la fracción de direccionamiento u otros ligandos como la fracción de direccionamiento.

Se realizaron estudios de la citotoxicidad de una inmunotoxina obtenida utilizando un anticuerpo diferente, SS1, que reconoce y se une a la mesotelina, un antígeno presente en las células de muchos cánceres. El anticuerpo SS1 se divulga, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 7.081.518, y se ha probado una inmunotoxina que comprende SS1 fusionada a PE38 (la inmunotoxina se denomina "SS1P") en un ensayo clínico de Fase I. Se elaboró una inmunotoxina usando el anticuerpo SS1 como la fracción de direccionamiento y la forma de PE usada en HA22-LR ("PE-LR") como la fracción de toxina y se ensayaron las dos inmunotoxinas, SS1P y SS1-PE-LR por su citotoxicidad contra una serie de líneas celulares que expresan mesotelina. Las dos inmunotoxinas tenían una actividad comparable frente a varias líneas celulares. La inmunotoxina SS1-PE-LR tenía una actividad notablemente más baja contra algunas líneas celulares en comparación con SS1P. Esto indica que, al igual que la mayoría de los agentes terapéuticos, no todos los cánceres de pacientes u otras células de interés serán susceptibles de tratamiento con una inmunotoxina usando un PE-LR como fracción de la toxina. Si se puede inhibir el crecimiento de células de cualquier cáncer particular u otras células objetivo de interés puede determinarse fácilmente mediante medios estándar, tales como mediante la toma de una biopsia de las células, poniendo en contacto las células con la inmunotoxina que contiene PE-LR y determinando si la inmunotoxina inhibe el crecimiento del cáncer u otras células objetivo en la extensión deseada.

Además, se conocen varios medios para aumentar la citotoxicidad de PE alterando los residuos en el dominio III de la secuencia nativa. Estudios del laboratorio de los presentes inventores hace más de una década determinaron que ciertas secuencias de aminoácidos y repeticiones de estas secuencias podrían ser usadas en lugar de la secuencia nativa de residuos 609-613 de PE para aumentar la citotoxicidad de la PE resultante en comparación con la PE preparada con la secuencia nativa (la secuencia nativa de los residuos 609-613 y mutaciones específicas que aumentan la citotoxicidad se discuten con más detalle más adelante en la sección titulada "exotoxina A de Pseudomonas"). Más recientemente, los trabajos de laboratorio de los presentes inventores indicaron que una sustitución de glicina, alanina, valina u otros residuos por la arginina presente en la posición 490 de la secuencia de PE nativa aumentaría la citotoxicidad, siendo la sustitución de la arginina por la alanina particularmente ventajosa. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense publicada No. 2007/0189962; Bang et al., Clin Cancer Res, 11: 1545-1550 (2005). Aunque se espera que las PE de la invención usando la secuencia de dominio nativo III sean útiles por sí mismas, si se desea que la citotoxicidad de la PE pueda aumentarse usando una o más de estas sustituciones o mutaciones. Se puede probar cualquier sustitución o mutación en particular para determinar si conserva la citotoxicidad adecuada para uso in vitro y si tiene toxicidad no específica suficientemente baja para uso in vivo con ensayos conocidos en la técnica, incluyendo los expuestos en los Ejemplos.

Además, el trabajo previo del laboratorio de los presentes inventores ha mapeado la presencia de epítopos o subepítopos en el dominio III. La unión de anticuerpos que reconocen esos epítopos se puede reducir o eliminar mediante sustituciones de los residuos normalmente presentes en ciertas posiciones. Como se expone en la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos, la unión de estos anticuerpos puede reducirse sustituyendo una alanina, glicina, serina o glutamina por un residuo de aminoácido correspondiente a un residuo de aminoácido de la SEQ ID NO: 1 seleccionado del grupo que consiste en D403, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590 y L597. Dado que la presencia de estos residuos antes de su sustitución mantiene un epítopo o subepítopo en el dominio III, para facilitar la referencia, los residuos en estas posiciones se pueden denominar como "mantenimiento" de la inmunogenicidad de sus respectivos epítopos o subepítopos, sustituyéndolos con alanina o similares reduce la inmunogenicidad del dominio III de PE resultante del epítopo o subepítopo nativo. Aunque se espera que las PE de la invención usando la secuencia del dominio nativo III sean útiles por sí mismas, por lo tanto, si se desean sustituciones de uno o más de los residuos identificados anteriormente, se puede reducir la inmunogenicidad de las PE de la invención. Se puede probar cualquier sustitución o mutación en particular para determinar si conserva la citotoxicidad adecuada para uso in vitro o in vivo usando ensayos conocidos en la técnica, incluyendo los expuestos en los Ejemplos.

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El término "péptido enlazador" incluye referencia a un péptido dentro de un fragmento de unión a anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fv) que sirve para unir indirectamente el dominio variable de la cadena pesada al dominio variable de la cadena ligera.

El término "anticuerpo parental" significa cualquier anticuerpo de interés que debe ser mutado o variado para obtener anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unan al mismo epítopo que el anticuerpo parental, pero con mayor afinidad.

El término "sitio activo" significa una porción de una secuencia de nucleótidos de una CDR o de una región marco de un dominio variable que es un sitio de variación natural particularmente alta. Aunque las CDR son consideradas ellas mismas como regiones de hipervariabilidad, se ha aprendido que las mutaciones no están uniformemente distribuidas a través de las CDR. Sitios particulares, o sitios activos, han sido identificados como esos lugares que experimentan mutaciones concentradas. Los sitios activos se caracterizan por una serie de características estructurales y secuencias. Estos "motivos de sitio activo" se pueden utilizar para identificar sitios activos. Dos motivos de secuencias de consenso que están especialmente bien caracterizados son la secuencia tetranucleotídica RGYW y la secuencia de serina AGY, donde R es A o G, Yes C o T y W es A o T.

Una "fracción de direccionamiento" es la porción de un inmunoconjugado destinado a dirigir el inmunoconjugado a una célula de interés. Típicamente, la fracción de direccionamiento es un anticuerpo, o un fragmento de un anticuerpo que retiene la capacidad de reconocimiento de antígeno, tal como una scFv, una dsFv, una Fab, o una F(ab')2.

Típicamente, una inmunoglobulina tiene una cadena pesada y ligera. Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante y una región variable (las regiones también se conocen como "dominios"). Las regiones variables de cadena ligera y pesada contienen una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también denominadas "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". Se han definido la extensión de la región marco y las CDR. Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligera o pesada se conservan relativamente dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligera y pesada constitutivas, sirve para posicionar y alinear las CDR en un espacio tridimensional.

Las CDR son principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan típicamente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente partiendo del extremo terminal N, y también se identifican típicamente por la cadena en la que está localizada la CDR particular. Por lo tanto, una CDR3 de VH está localizada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una CDR1 de VL es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en el que se encuentra.

La frase "enlace disulfuro" o "enlace disulfuro de cisteína-cisteína" se refiere a una interacción covalente entre dos cisteínas en las que los átomos de azufre de las cisteínas se oxidan para formar un enlace disulfuro. La energía de enlace media de un enlace disulfuro es aproximadamente de 60 kcal/mol en comparación con 1-2 kcal/mol para un enlace de hidrógeno.

La frase "Fv estabilizado por disulfuro" o "dsFv" se refiere a la región variable de una inmunoglobulina en la que hay un enlace disulfuro entre la cadena ligera y la cadena pesada. En el contexto de esta invención, las cisteínas que forman el enlace disulfuro están dentro de las regiones marco de las cadenas de anticuerpo y sirven para estabilizar la conformación del anticuerpo. Típicamente, el anticuerpo es modificado genéticamente para introducir cisteínas en la región marco en las posiciones donde la sustitución no interferirá con la unión del antígeno.

Un anticuerpo inmunológicamente reactivo con un antígeno particular puede ser generado por métodos recombinantes tales como la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, véase, por ejemplo, Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); Ward, et al., Nature, 341: 544-546 (1989); y Vaughan et al., Nature Biotech., 14: 309-314 (1996), o mediante la inmunización de un animal con el antígeno o con ADN que codifica el antígeno.

Una "fracción tóxica" es la porción de una inmunotoxina que hace que la inmunotoxina sea citotóxica para las células de interés.

Una "fracción terapéutica" es la porción de un inmunoconjugado destinado a actuar como un agente terapéutico.

El término "agente terapéutico" incluye cualquier número de compuestos actualmente conocidos o desarrollados posteriormente para actuar como antineoplásicos, antiinflamatorios, citoquinas, antiinfecciosos, activadores o inhibidores enzimáticos, modificadores alostéricos, antibióticos u otros agentes administrados para inducir un efecto terapéutico deseado en un paciente. El agente terapéutico puede ser también una toxina o un radioisótopo, donde el efecto terapéutico deseado es, por ejemplo, la muerte de una célula cancerosa.

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Los términos "sustancialmente similar" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con al menos 90%, preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de 10-20 aminoácidos. El porcentaje de identidad de secuencia se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que está presente la misma base de ácido nucleico o residuo de aminoácido en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos "unión", "conjugación", "conexión", "unión con" o "enlace" se refieren a la elaboración de dos polipéptidos en una molécula polipeptídica contigua. En el contexto de la presente invención, los términos incluyen referencia a la unión de una fracción de anticuerpo a una PE de la invención. El enlace puede ser por medios químicos o recombinantes. Medio químico se refiere a una reacción entre la fracción de anticuerpo y la molécula de PE de tal manera que existe una unión covalente formada entre las dos moléculas para formar una molécula.

Tal como se usa en la presente memoria, "recombinante" incluye referencia a una proteína producida usando células que no tienen, en su estado nativo, una copia endógena del ADN capaz de expresar la proteína. Las células producen la proteína recombinante porque han sido alteradas genéticamente por la introducción de la secuencia de ácido nucleico aislada apropiada. El término también incluye referencia a una célula, o ácido nucleico, o vector, que ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o la alteración de un ácido nucleico nativo a una forma no nativa de esa célula, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, expresan mutantes de genes que se encuentran dentro de la forma nativa o expresan genes nativos que de otro modo se expresan anormalmente, se subexpresan o no se expresan en absoluto.

Tal como se usa en la presente memoria, "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" incluye referencia a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma de cadena sencilla o doble, y a menos que se limite de otro modo, abarca análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan con nucleótidos ácidos de una manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular incluye su secuencia complementaria, así como variantes conservadoras, es decir, ácidos nucleicos presentes en posiciones oscilantes de codones y variantes que, cuando se traducen en una proteína, dan como resultado una sustitución conservadora de un aminoácido.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la "codificación" con respecto a un ácido nucleico especificado, incluye referencia a ácidos nucleicos que comprenden la información para traducción en la proteína especificada. La información se especifica mediante el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos está codificada por el ácido nucleico usando el código genético "universal". Sin embargo, pueden usarse las variantes del código universal, tal como está presente en algunas mitocondrias vegetales, animales y fúngicas, la bacteria Mycoplasma capricolum (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 2306-2309 (1985)), o el macronúcleo ciliado, cuando el ácido nucleico se expresa en el uso de la maquinaria de traducción de estos organismos.

La frase "fusionar en marco" se refiere a unir dos o más secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de manera que la secuencia de ácido nucleico unida se traduce en una proteína de cadena sencilla que comprende las cadenas polipeptídicas originales.

Tal como se usa en la presente memoria, "expresado" incluye referencia a la traducción de un ácido nucleico en una proteína. Las proteínas pueden expresarse y permanecer intracelulares, convertirse en un componente de la membrana de la superficie celular o ser secretadas en la matriz o medio extracelular.

Por "célula huésped" se entiende una célula que puede soportar la replicación o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas tales como E. coli o células eucariotas tales como células de levadura, insecto, anfibio o mamífero.

La frase "biblioteca de presentación en fagos" se refiere a una población de bacteriófagos, cada uno de los cuales contiene un ADNc foráneo fusionado de forma recombinante en marco a una proteína de superficie. El fago presenta la proteína foránea codificada por el ADNc en su superficie. Después de la replicación en un huésped bacteriano, típicamente E. coli, el fago que contienen el ADNc foráneo de interés se selecciona mediante la expresión de la proteína foránea en la superficie del fago.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos, cuando se comparan y se alinean para la

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sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se divulga a continuación.

El término "in vivo" incluye referencia al interior del cuerpo del organismo del que se obtuvo la célula. "Ex vivo" e "in vitro" significan fuera del cuerpo del organismo del que se obtuvo la célula.

La frase "célula maligna" o "malignidad" se refiere a tumores o células tumorales que son invasivas y/o capaces de experimentar metástasis, es decir, una célula cancerosa.

Tal como se usa en la presente memoria, las "células de mamífero" incluyen referencia a células derivadas de mamíferos incluyendo humanos, ratas, ratones, cobayas, chimpancés o macacos. Las células pueden ser cultivadas in vivo o in vitro.

El término "selectivamente reactivo" se refiere, con respecto a un antígeno, a la asociación preferencial de un anticuerpo, en su totalidad o en parte, con una célula o tejido que porta ese antígeno y no a células o tejidos que carecen de ese antígeno. Se reconoce, por supuesto, que puede producirse un cierto grado de interacción no específica entre una molécula y una célula o tejido no objetivo. Sin embargo, la reactividad selectiva puede distinguirse como mediada por el reconocimiento específico del antígeno. Aunque los anticuerpos selectivamente reactivos se unen al antígeno, pueden hacerlo con baja afinidad. Por otra parte, la unión específica resulta en una asociación mucho más fuerte entre el anticuerpo y las células que portan el antígeno que entre el anticuerpo unido y las células que carecen del antígeno. La unión específica típicamente da lugar a un aumento superior a dos veces, preferiblemente superior a cinco veces, más preferiblemente superior a diez veces y lo más preferible superior a cien veces, de la cantidad de anticuerpo unido (por unidad de tiempo) a una células o tejido que porta un antígeno objetivo en comparación con una célula o tejido que carece del antígeno objetivo. La unión específica a una proteína en tales condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteína particular. Una variedad de formatos de inmunoensayo son apropiados para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase sólida se usan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para una descripción de los formatos de inmunoensayo y de las condiciones que se pueden usar para determinar la inmunorreactividad específica.

El término "condiciones inmunológicamente reactivas" incluye la referencia a condiciones que permiten que un anticuerpo generado para un epítopo particular se una a ese epítopo hasta un grado mayor en forma detectable que, y/o a la exclusión sustancial de, la unión a sustancialmente todos los otros epítopos. Las condiciones inmunológicamente reactivas dependen del formato de la reacción de unión al anticuerpo y típicamente son aquellas utilizadas en protocolos de inmunoensayo o aquellas condiciones encontradas in vivo. Véase Harlow & Lane, citado más arriba, para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayo. Preferentemente, las condiciones inmunológicamente reactivas empleadas en los métodos de la presente invención son "condiciones fisiológicas" que incluyen referencia a condiciones (por ejemplo, temperatura, osmolaridad, pH) que son típicas dentro de un mamífero vivo o una célula de mamífero. Aunque se reconoce que algunos órganos están sometidos a condiciones extremas, el entorno dentro del organismo e intracelular se sitúa normalmente alrededor de pH 7 (es decir, de pH 6,0 a pH 8,0, más típicamente de pH 6,5 a 7,5), contiene agua como disolvente predominante, y existe a una temperatura por encima de 0ºC y por debajo de 50ºC. La osmolaridad está dentro del intervalo que es favorable a la viabilidad celular y proliferación.

Exotoxina A de Pseudomonas

La exotoxina A de Pseudomonas ("PE") es una proteína monomérica extremadamente activa (peso molecular 66 kD), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la síntesis de proteínas en células eucariotas. La secuencia de PE nativa (SEQ ID NO: 1) es bien conocida y se expone, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 1 de la patente de Estados Unidos No. 5.602.095. El método de acción es la inactivación de la ribosilación de ADP del factor de elongación 2 (EF-2).

La PE se ha estudiado durante más de 20 años para su uso como agente terapéutico. La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actúan en conjunto para causar citotoxicidad. El dominio Ia (aminoácidos 1-252) media la unión celular. El dominio II (aminoácidos 253-364) es responsable de la translocación en el citosol y el dominio III (aminoácidos 400-613) media la ribosilación de ADP del factor de elongación 2. La función del dominio Ib (aminoácidos 365-399) permanece indefinida, aunque se ha sabido que una gran parte de él, los aminoácidos 365-380, se pueden eliminar sin pérdida de citotoxicidad. Véase Siegall et al., J Biol Chem, 264: 14256-14261 (1989).

Los términos "exotoxina de Pseudomonas" y "PE", tal como se usan aquí, se refieren típicamente a una PE que ha sido modificada a partir de la proteína nativa para reducir la unión y absorción a través de LRP1/CD91 (el receptor de superficie celular unido a la toxina de longitud completa), para eliminar problemas de plegado, o para reducir la toxicidad no específica. Numerosas de tales modificaciones son conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, eliminación del dominio Ia, varias supresiones de aminoácidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de aminoácidos

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individuales y la adición de una o más secuencias en el extremo terminal carboxilo tal como KDEL (SEQ ID NO: 2) y REDL (SEQ ID NO: 3). Véase Siegall et al., citado más arriba. Los fragmentos citotóxicos de PE incluyen aquellos que son citotóxicos con o sin posterior procesamiento proteolítico o de otro tipo en la célula objetivo (por ejemplo, como una proteína o preproteína).

Ciertos fragmentos citotóxicos de PE son conocidos en la técnica y a menudo se referencian por el peso molecular del fragmento, que designa para la persona experta en la técnica la composición particular del fragmento de PE. Por ejemplo, la PE40 fue uno de los primeros fragmentos que se estudió y utilizó como la porción tóxica de las inmunotoxinas. El término designa una forma truncada de PE en la que el dominio I, el dominio responsable de la unión no específica. Véase, por ejemplo, Pai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3358-3362 (1991); y Kondo et al., J. Biol. Chem., 263: 9470-9475 (1988). Sin embargo, la eliminación de la unión no específica también puede lograrse mediante la mutación de ciertos residuos del dominio Ia. La patente de Estados Unidos No. 5.512.658, por ejemplo, divulga que una PE mutada en la que está presente el dominio Ia, pero en el que los residuos básicos del dominio Ia en las posiciones 57, 246, 247 y 249 se sustituyen por residuos ácidos (ácido glutámico, o "E")) presenta una citotoxicidad no específica muy reducida. Esta forma mutante de PE se conoce a veces como "PE4E".

El término "PE38" se refiere a un fragmento citotóxico de PE compuesto de los aminoácidos 253-364 y 381-613 de PE y que tiene un peso molecular de aproximadamente 38 kD. Contiene los dominios de translocación y ribosilación de ADP de PE, pero no la porción de unión a la célula (Hwang J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987)). PE38 es una proproteína que se activa a su forma citotóxica tras el procesamiento dentro de una célula (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.608.039, y Pastan et al., Biochim, Biophys Acta, 1333: C1-C6 (1997)). La secuencia de PE38 es bien conocida en la técnica, pero también puede ser determinada fácilmente por el profesional restando los residuos indicados de la secuencia conocida de PE. Las personas expertas en la materia serán conscientes de que, debido a la degeneración del código genético, la secuencia de aminoácidos de PE38, de sus variantes, tales como PE38KDEL o PE38QQR, y de los otros derivados de PE discutidos en la presente memoria pueden codificarse mediante una gran variedad de secuencias de ácido nucleico, cualquiera de las cuales puede expresarse para dar como resultado el polipéptido deseado.

"PE35" es un fragmento del terminal carboxilo de 35 kD de PE en el que se han suprimido los residuos de aminoácidos 1-279 y la molécula comienza con una metionina en la posición 280, seguido de los aminoácidos 281-364 y 381-613 de PE nativa. PE35 y PE40 se divulgan en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.602.095 y 4.892.827.

Los estudios también determinaron que las mutaciones de los residuos terminales de PE, REDLK (SEQ ID NO: 5, residuos 609-613) podrían variarse de formas que aumentarían la citotoxicidad del mutante resultante. Por ejemplo, las inmunotoxinas producidas con PE mutadas que terminan en las secuencias KDEL (SEQ ID NO: 2), REEL (SEQ ID NO: 32) o RDEL (SEQ ID NO: 3) eran mucho más citotóxicas para las células objetivo que las inmunotoxinas con PE38 que portan la secuencia terminal nativa. Véase, Kreitman y Pastan, Biochem J, 307 (Pt 1): 29-37 (1995). También se pueden usar repeticiones de estas secuencias. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.854.044; 5.821.238; y 5.602.095 y la publicación internacional WO 99/51643. Mientras que las PE que terminan en KDEL (SEQ ID NO: 2) son útiles para los propósitos in vitro, demostraron tener toxicidad no específica en animales y son menos preferidas para uso in vivo.

En una realización preferida, el fragmento citotóxico de PE retiene al menos aproximadamente 10%, preferiblemente al menos aproximadamente 40%, más preferiblemente aproximadamente 50%, aún más preferiblemente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y aún más preferiblemente 95% de la citotoxicidad de PE38. En realizaciones particularmente preferidas, el fragmento citotóxico tiene al menos la citotoxicidad de PE38, y preferiblemente tiene más.

A. Variantes de PE modificadas de forma conservadora

Se entiende que la secuencia de PE nativa y las variantes discutidas anteriormente pueden tener sustituciones conservadoras y retener capacidad citotóxica y, deseablemente, una antigenicidad reducida en comparación con la secuencia nativa de PE. En realizaciones preferidas, las variantes modificadas de PE o fragmentos citotóxicos de las mismas tienen al menos 80% de similitud de secuencia, preferiblemente al menos 85% de similitud de secuencia, más preferiblemente al menos 90% de similitud de secuencia y más preferiblemente al menos 95% de similitud de secuencia al nivel de aminoácidos, con la PE de interés, tal como PE38.

El término "variantes modificadas conservativamente" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservativamente modificadas se refieren a aquellas secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o si el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias de ácido nucleico esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos al aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que una alanina está especificada por un

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La respuesta tumoral a la dosis de 1,0 mg/kg de HA22-LR fue similar a la respuesta a 0,3 mg/kg de HA22, pero 1,75 mg/kg de HA22-LR fue mucho más eficaz. En el día 14, 5/8 de los ratones tratados con 1,75 mg/kg de HA22-LR presentaron tumores indetectables que permanecieron imperceptibles durante la duración del estudio. Los otros tumores se contrajeron inicialmente, pero crecieron hasta un tamaño medio de 54 mm3 el día 40. La dosis de 2,5 mg/kg de HA22-LR demostró una actividad antitumoral notable. En 7/8 de los ratones los tumores desaparecieron por completo el día 14 y no habían regresado por 10 semanas. Un tumor disminuyó a 10 mm3 el día 14, pero creció hasta 30 mm3 el día 40. Se concluye que la baja toxicidad animal de HA22-LR permite administrar dosis mayores de inmunotoxina de manera segura, lo que mejora dramáticamente la actividad antitumoral de la inmunotoxina.

Ejemplo 7

Este Ejemplo discute los resultados de los estudios usando como la fracción de direccionamiento un anticuerpo que se une a un antígeno denominado mesotelina presente en la superficie de muchos cánceres.

Se ha ensayado una inmunotoxina que utiliza el anticuerpo, conocido como "SS1" (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 7.081.518) como la fracción de direccionamiento, y PE38 como la fracción de toxina en un ensayo clínico de fase I en pacientes con mesotelioma o cáncer de ovario que habían fracasado con terapias estándar (Hassan,

R. et al., Clin Cancer Res, 13: 5144-5149 (2007)). Para comparar el efecto de usar una PE resistente a los lisosomas de la invención, la PE utilizada en la inmunotoxina HA22-LR discutida en los Ejemplos anteriores se fusionó al anticuerpo SS1 para formar la inmunotoxina SS1-PE-LR y se ensayó en líneas celulares que expresaban mesotelina contra una inmunotoxina similar de SS1 fusionada a PE38.

Los resultados se muestran en la Tabla 4. Como se puede observar, para dos de las líneas celulares, la citotoxicidad era comparable, mientras que, para una línea celular, la inmunotoxina con PE-LR era 3,72 veces más citotóxica para las células que la inmunotoxina hecha con PE38. En una línea celular, la inmunotoxina SS1-PE-LR tenía aproximadamente la mitad de la citotoxicidad de la inmunotoxina PE38, indicando que sería muy útil si, como la inmunotoxina HA22-LR, pudiera administrarse en dosis mucho mayores sin toxicidad. La inmunotoxina SS1-PE-LR tenía valores de IC50 en el intervalo de ng/ml de un solo dígito en 5 de las 6 líneas celulares ensayadas. Para una línea celular, la inmunotoxina SS1-PE-LR era mucho menos citotóxica para las células que la inmunotoxina basada en PE38. Estos resultados muestran que las inmunotoxinas que usan PE-LR como fracción tóxica es probable que sean agentes terapéuticos útiles, pero, al igual que la mayoría de los agentes terapéuticos, no necesariamente serán útiles contra las células de todos los cánceres u otros trastornos. El médico puede determinar fácilmente si cualquier molécula quimérica particular que se utilice como la fracción de toxina, una PE de la invención será eficaz en células objetivo, tales como las del cáncer de un paciente, tomando una biopsia de las células objetivo a las que la molécula quimérica va a ser dirigida y probar la molécula quimérica sobre las células de la biopsia para determinar si son susceptibles de tener su crecimiento inhibido por la molécula quimérica, con una IC50 en el intervalo de ng/mL de un solo dígito indicando que la inhibición del crecimiento es aceptable.

Tabla 4. Citotoxicidad de la inmunotoxina SS1-PE y SS1-PE-LR a las células de las líneas celulares que expresan mesotelina.

IC50 (ng/ml)

Línea Celular

Fracción de direccionamiento Inmunotoxina elaborada con PE38 Inmunotoxina elaborada con PE-LR Actividad relativa

L55

SS1 4,77 ± 0,87 3,87 ± 0,41 1,23

A1847

SS1 4,06 ± 0,35 4,24 ± 0,28* 0,96

A431/K5

SS1 0,20 ± 0,02 1,19 ± 0,19 0,17

OVCAR-8

SS1 2,32 ± 0,58 4,29 ± 0,67* 0,54

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Claims (1)

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