ES2606536T3 - Nuevos productos génicos de Bacillus licheniformis que forman o descomponen poliaminoácidos y procedimiento de producción biotecnológico mejorado basado en ellos - Google Patents

Abstract

Procedimiento para disminuir el mucílago atribuible a poli-gamma-glutamato, caracterizado por la supresión de la función de la proteína YwtA (CapC, PgsC), codificada por el gen ywtA con una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos 94 % con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO. 6, como una enzima o una subunidad de tal enzima involucradas en la formación de poliaminoácidos.

Description

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DESCRIPCION

Nuevos productos genicos de Bacillus licheniformis que forman o descomponen poliaminoacidos y procedimiento de produccion biotecnologico mejorado basado en ellos

La presente invencion se refiere a procedimientos de produccion biotecnologicos mejorados por medio de microorganismos que se caracterizan desactivando un gen nuevo y su producto genico de Bacillus licheniformis y genes y protemas suficientemente similares que participan in vivo en la formacion, la modificacion y/o la degradacion de poliaminoacidos y pueden utilizarse para este proposito, asf como a microorganismos en los cuales se desactiva funcionalmente el gen ywtA que codifica el producto genico involucrado en la formacion de poli-gamma-glutamato.

La presente invencion se encuentra en el area de biotecnologfa, principalmente la produccion de sustancias valiosas mediante la fermentacion de microorganismos que estan en la capacidad de formar las sustancias valiosas interesantes. Esto incluye, por ejemplo, la produccion de compuestos de bajo peso molecular, por ejemplo de complementos nutricionales o compuestos relevantes en farmacia, o de protemas para las cuales debido a su diversidad existe a su vez un gran campo de aplicacion industrial. En el primer caso se utilizan y/o se modifican las propiedades metabolicas de los microorganismos relevantes para la produccion de las sustancias valiosas; en el segundo caso se emplean celulas que expresan los genes de las protemas de interes. Por lo tanto, en ambos casos se trata casi siempre de organismos geneticamente modificados (OGM).

Para la fermentacion de microorganismos existe un amplio estado de la tecnica, principalmente incluso a gran escala industrial; se extiende desde la optimizacion de las cepas relevantes en relacion con la velocidad de formacion y la utilizacion de nutrientes por medio del diseno tecnologico de los fermentadores hasta el aislamiento de los productos valiosos de las celulas relevantes mismas y/o del medio de fermentacion. Para este proposito se aplican estrategias tanto geneticas y microbiologicas como tambien de ingeniena de procedimientos y enfoques bioqmmicos. El objetivo de la presente invencion es mejorar este procedimiento en relacion con una propiedad frecuente de los microorganismos empleados que perjudica la propia etapa de fermentacion, espedficamente al nivel de las propiedades geneticas de las cepas empleadas.

Para la produccion biotecnologica a escala industrial se cultivan los microorganismos relevantes en fermentadores que estan configurados de manera apropiada para sus propiedades metabolicas. Durante el cultivo, estos metabolizan el sustrato ofrecido y, ademas del producto propio, normalmente forman una gran cantidad de otras sustancias en las cuales ordinariamente no hay interes y/o las cuales, tal como se explica despues, pueden conducir a dificultades en la fermentacion o en el acabado.

Las fermentaciones normalmente son procedimientos muy complicados en los cuales tiene que ajustarse y monitorearse una gran cantidad de diferentes parametros. Asf, por ejemplo, muy frecuentemente se trata de procedimientos aerobicos, es decir que los microorganismos empleados tienen que proveerse de manera suficiente de oxfgeno durante toda la fermentacion (control de la velocidad de aireacion). Otros ejemplos de tales parametros son la geometna del reactor, la composicion continuamente variable del medio nutriente, el valor de pH o la velocidad de formacion de CO2. Un parametro particularmente importante, tanto respecto de la econoirna como en relacion con el manejo del procedimiento per se es la entrada necesaria de energfa, por ejemplo por medio de sistemas de agitacion que aseguran que se mezcle el contenido del reactor tan completamente como sea posible. Ademas, aparte de la distribucion del sustrato tambien se asegura un suministro adecuado de oxfgeno a los organismos.

Despues de finalizar la fermentacion habitualmente, ademas de retirar los organismos productores, el producto valioso de interes tiene que purificarse y/o concentrarse a partir del llamado caldo del fermentador. El procedimiento de acabado puede incluir, por ejemplo, diversas etapas cromatograficas y/o de filtracion. Asf, ademas del contenido de los productos de valor, tambien son decisivas para el exito del procedimiento total de acabado las propiedades bioffsicas del caldo del fermentador, especialmente su viscosidad inmediatamente despues de terminarse la fermentacion.

Sus propiedades tambien se ven influenciadas por las actividades metabolicas de los microorganismos elegidos y tambien es posible que ocurran efectos no deseados. Estos incluyen, por ejemplo, un incremento frecuente en la viscosidad del medio nutriente durante la fermentacion. Esto perjudica el mezclado y de esta manera el transporte de materia y el suministro de oxfgeno dentro del reactor. Dificultades adicionales surgen en la mayona de los casos durante el tratamiento subsiguiente debido a que las viscosidades incrementadas perjudican considerablemente, por ejemplo, la eficiencia de los procedimientos de filtracion.

Principalmente se conoce que las especies del genero Bacillus producen mudlago el cual se compone esencialmente de poli-gamma-glutamato (PGA) y/o aspartato, lo que significa poliaminoacidos enlazados a traves de los enlaces peptfdicos gamma relevantes. En estudios cientfficos en el Bacillus subtilis se enlazan principalmente los tres genes ywsC, ywtA e ywtB por parte de los productos genicos derivados de los mismos con la formacion de poli- gamma-glutamato; el producto genico de ywtD participa en la degradacion. La denominacion general del gen "ywt"

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es sinonima en este caso de las abreviaturas "cap" y "pgs", que son corrientes para estas mismas funciones. Esto se expone mas adelante.

La publicacion "Physiological and biochemical characteristics of poly-gamma-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis" (2001) de M. Ashiuchi, et al., im Eur. J. Biochem., Volumen 268, paginas 5321 - 5328, describe el complejo enzimatico PgsBCA (complejo poli-gamma-glutamato sintetasa BCA), compuesto por las tres sub-unidades PgsB, PgsC y PgsA, de B. subtilis. Por consiguiente, este complejo es una amida ligasa atfpica que convierte tanto el D- como tambien el L-enantiomero de glutamato en el polfmero correspondiente. De acuerdo con esta publicacion, un experimento de disrupcion de gen descrito allf debe considerarse una prueba de que este complejo es el unico que cataliza esta reaccion en B. subtilis.

Y. Urushibata et al. demuestran en la publicacion "Characterization of the Bacillus subtilis ywsC gene, involved in gamma-polyglutamic acid production" (2002), en J. Bacteriol., Volumen 184, paginas 337-343, entre otras por medio de mutaciones por delecion en los tres genes ywsC, ywtA e ywtB, que los tres productos genicos responsables en B. subtilis de la formacion de PGA son codificados por estos tres genes. Ellos forman en esta secuencia y junto con el gen subsiguiente ywtC, un operon coherente en este microorganismo.

El hecho que en el genoma de B. subtilis, corriente abajo de ywtC en un operon propio, se encuentre otro gen relevante para el metabolismo de PGA es mostrado por T. Suzuki e Y. Tahara en la publicacion "Characterization of the Bacillus subtilis ywtD gene, whose product is involved in gamma-polyglutamic acid degradation" (2003), J. Bacteriol., volumen 185, paginas 2379 - 2382. Este gen codifica una DL-endopeptidasa, que es capaz de hidrolizar PGA y de esta manera puede denominarse gamma-DL-glutamil-hidrolasa.

Una vision actual en conjunto de estas enzimas se proporciona adicionalmente en el artfculo "Biochemistry and molecular genetics of poly-gamma-glutamate synthesis" de M. Ashiuchi y H. Misono en App/. Microbiol. Biotechno/., Volumen 59, paginas 9-14 de 2002. Allf los genes homologos de pgsB, pgsC y pgsA que codifican el complejo PGA-sintasa en B. anthracis son denominados capB, capC y capA. El gen localizado corriente abajo de acuerdo con este artfculo se denomina dep (para "D-PGA-depolimerasa") en B. anthracis y pgdS (para "PGA-depolimerasa") en B. subtilis.

En el actual estado de la tecnica estas actividades enzimaticas ya se utilizan de manera positiva, principalmente para la produccion de poli-gamma-glutamato como materia prima, por ejemplo para uso en cosmeticos, aunque a la fecha no se han conocido sus secuencias de ADN y secuencias de aminoacidos exactas principalmente de B. licheniformis. Asf, por ejemplo, la solicitud de patente japonesa JP 08308590 A divulga la produccion de PGA mediante fermentacion de las mismas cepas que producen PGA, espedficamente de especies de bacilos como B. subtilis y B. licheniformis; tambien se describe aqrn el aislamiento de esta materia prima del medio de cultivo. De acuerdo con la solicitud de patente WO 02/055671 A1, B. subtilis var. chunkookjang representa un microorganismo particularmente adecuado para este proposito.

De esta manera, en algunas fermentaciones existe un interes en GLA como producto valioso que puede producirse mediante fermentacion.

Sin embargo, el interes en todas las otras fermentaciones es preparar otros productos valiosos; en este caso, por las razones enunciadas antes, la formacion de poliaminoacidos significa un efecto colateral negativo. Un procedimiento tfpico para enfrentar la viscosidad incrementada del medio de fermentacion que puede atribuirse a la formacion de estos es el incremento del numero de revoluciones de agitacion. Sin embargo, esto tiene un efecto en la entrada de energfa. Adicionalmente, los microorganismos fermentados se exponen de esta manera a fuerzas de cizalla crecientes, lo cual representa un factor de estres considerable para ellos. Finalmente, las viscosidades muy altas no pueden ser superadas incluso de esta manera, de modo que puede requerirse una terminacion prematura de la fermentacion aunque la produccion todavfa podna continuar de otra manera.

La formacion de mudlago como un efecto colateral negativo de numerosos procesos de fermentacion tambien puede tener efectos negativos en el resultado total de fermentacion por diversas razones. Los procedimientos convencionales para que las fermentaciones continuen exitosamente a pesar de una viscosidad creciente del medio nutriente solo pueden designarse como insuficientes, principalmente porque no representan un control causal.

De esta manera el problema mas apremiante fue suprimir tanto como fuera posible una formacion no deseada de mudlago, especialmente un mudlago atribuible a poli-gamma-aminoacidos tal como poli-gamma-glutamato, durante la fermentacion de microorganismos. Principalmente debfa encontrarse una solucion que representara un control causal. Otro aspecto de este problema es proporcionar los genes relevantes para una utilizacion positiva de los productos genicos que sintetizan GLA.

Una solucion de este problema es un procedimiento para disminuir el mudlago atribuible a poli-gamma-glutamato, caracterizado por la supresion de la funcion de la protema YwtA (CapC, PgsC), codificada por el gen Gen ywtA con una secuencia de aminoacido que tiene identidad de 94 % con la secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID

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NO. 6, como una enzima, o como subunidad de una enzima de este tipo, que participa en la formacion de poliaminoacidos.

En una forma de realizacion el procedimiento se caracteriza porque se suprime la funcion de la protema YwtA durante la fermentacion del microorganismo.

En otra forma de realizacion, el procedimiento se caracteriza por una reduccion de 50 % del mudlago atribuible a poliaminoacidos.

En otra forma de realizacion, el procedimiento se caracteriza porque el microorganismo es una bacteria y/o una bacteria gram-negativa o una gram-positiva.

En otra forma de realizacion, el procedimiento se caracteriza porque el microorganismo se selecciona de uno de los generos Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Xanthomonas, Bacillus, Staphylococcus o Corynebacterium.

En otra forma de realizacion, el procedimiento se caracteriza por las siguientes etapas para suprimir la funcion de la protema YwtA codificada por el gen ywtA:

a) seleccionar dos regiones de la secuencia SEQ ID NO. 5,

b) clonar la regiones en un vector de modo que estas se encuentren en los flancos de una parte purificadora de la protema inactiva, o de manera que estas se sucedan omitiendo la region que se encuentra en medio,

c) delecion del gen ywtA con el vector producido en el paso b), y

d) detectar la delecion del gen.

En otra forma de realizacion, el procedimiento se caracteriza porque se suprime la funcion de la protema YwtA (CapC, PsgC) codificada por el gen ywtA empleando un acido nucleico con una mutacion de delecion o de insercion, que comprende preferentemente las secuencias perifericas que comprenden al menos 70 a 150 posiciones de acido nucleico respectivas de la region que codifica la protema.

Otra solucion es un procedimiento para la produccion de una sustancia valiosa mediante fermentacion de un microorganismo el cual se caracteriza porque durante la fermentacion se disminuye la formacion de poli-gamma- glutamato por el microorganismo suprimiendo la funcion de la protema YwtA (CapC, PgsC) codificada por el gen ywtA con una secuencia de aminoacidos que presenta identidad de al menos 94 % con la secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID NO. 6, como una enzima, o como subunidad de una enzima de este tipo, involucrada en la formacion de poliaminoacidos.

En una forma de realizacion, el procedimiento se caracteriza porque se suprime la funcion de la protema YwtA (CapC, PgsC) codificada por el gen ywtA mediante un procedimiento que tiene las siguientes etapas:

a) seleccion de dos regiones de la secuencia SEQ ID NO. 5,

b) clonacion de la regiones en un vector, de modo que flanquean una parte codificadora de una protema inactiva, o de manera que se sucedan una tras otra directamente omitiendo la region intermedia,

c) delecion del gen ywtA con el vector producido en el paso b), y

d) deteccion de la delecion del gen.

En otra forma de realizacion, el procedimiento se caracteriza porque se suprime la funcion de la protema YwtA (CapC, PsgC) codificada por el gen ywtA empleando un acido nucleico con una mutacion de delecion o de insercion que comprende preferiblemente las secuencias de borde que comprenden respectivamente al menos 70 a 150 posiciones de acido nucleico de la region que codifica la protema.

En otra forma de realizacion el procedimiento se caracteriza porque la sustancia de valor es una sustancia natural, un complemento alimenticio o un compuesto relevante en farmacia o una enzima.

En otra forma de realizacion el procedimiento se caracteriza porque la enzima se selecciona del grupo de las a- amilasas, proteasas, celulasas, lipasas, oxidoreductasas, peroxidasas, lacasas, oxidasas y hemicelulasas.

Otra solucion es el uso de un acido nucleico que codifica una protema YwtA (CapC, PgsC) que participa en la formacion de poli-gamma-glutamato, la cual tiene una secuencia de aminoacidos que presenta al menos 94 % de identidad con la secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID NO. 6, o respectivamente partes de la misma, para

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suprimir la funcion de la protema YwtA (CapC, PgsC) como una enzima, o como una subunidad de una enzima de este tipo, involucrada en la formacion de poliaminoacidos.

Otra solucion es el uso de un acido nucleico que codifica una protema YwtA (CapC, PgsC) involucrada en la formacion de poli y gamma-glutamato, que tiene una secuencia de aminoacidos que presenta al menos una identidad de 94 % con la secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID NO. 6, o respectivamente partes de la misma para disminuir a 50 % el mudlago atribuible al poli-gamma-glutamato durante la fermentacion de un microorganismo.

En otra forma de realizacion el uso se caracteriza porque el acido nucleico tiene la secuencia SEQ ID NO. 5.

Otra solucion es el uso de un acido nucleico con una mutacion de delecion o de insercion el cual comprende las secuencias de borde que comprenden respectivamente al menos 70 a 150 posiciones de acido nucleico de la region que codifica una protema YwtA (CapC, PsgC) con una secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de al menos 94 % con la secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID NO. 6 para disminuir el mudlago atribuible al poli y gamma-glutamato durante la fermentacion de un microorganismo.

Otra solucion es un microorganismo en el cual esta funcionalmente inactivo el gen ywtA que codifica un producto genico involucrado en la formacion de poli-gamma-glutamato y la secuencia de nucleotidos ywtA codificante posee una secuencia de nucleotidos que presenta una identidad de al menos 94 % con la secuencia de nucleotidos indicada en SEQ ID NO. 5.

En otra forma de realizacion el microorganismo es Bacillus licheniformis.

Ademas se divulga el acido nucleico ywtA correspondiente y con base en esto el uso de los acidos nucleicos correspondientes para disminuir la formacion de mudlago atribuible a poliaminoacidos durante la fermentacion del microorganismo, asf como procedimientos de fermentacion de microorganismos.

En la disminucion segun la invencion de la formacion de mudlago el gen ywtA se desactiva funcionalmente a nivel genetico. A esto se le suma la utilizacion positiva de este gen o de los productos genicos derivados para la produccion de poli-gamma-glutamato.

Esta invencion, aplicable principalmente a todos los microorganismos fermentables, principalmente aquellos del genero Bacillus, conduce a que para la produccion fermentativa de sustancias de valor, distintas de poliaminoacidos, principalmente de compuestos de bajo peso molecular relevantes en farmacia o de protemas, se impida a nivel genetico que los microorganismos empleados formen poliaminoacidos, principalmente GLA. Por un lado, esto tiene un efecto ventajoso en la viscosidad del medio de cultivo y sobre todo en la capacidad de mezclado, en la entrada de oxfgeno y la energfa que debe gastarse; por otra parte se facilita considerablemente el acabado del producto de interes. Ademas, una gran parte de las materias primas empleadas, por ejemplo las fuentes de N, no se convierten en un producto que no tenga interes, de modo que en general puede esperarse un rendimiento mas alto de la fermentacion.

El gen mencionado puede usarse para un aprovechamiento positivo del producto genico que sintetiza GLA, espedficamente formando de manera biotecnologica la protema derivada YwtA e introduciendolo en las celulas que la producen o de manera independiente de esto en las correspondientes mezclas de reaccion como catalizador.

Se divulga una protema YwtA (CapC, PgsC) involucrada en la formacion de poliaminoacidos la cual es codificada por una secuencia de nucleotidos ywtA que tiene una identidad de al menos 82 % con la secuencia de nucleotidos indicada en SEQ ID NO. 5.

Esta enzima especial se obtuvo mediante un analisis del genoma de B. licheniformis DSM 13 (vease ejemplo 1). Esta protema se pone a disposicion de manera que sea realizable (vease ejemplo 1) mediante las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos indicados en la presente solicitud en SEQ ID NO. 5 y 6.

La coincidencia con los datos bibliograficos expuestos al principio es otra subunidad del complejo de poli-gamma- glutamato-sintetasa. Como la protema conocida en el estado de la tecnica mas similar a esta se determino el homologo YwsA de B. subtilis, el cual esta registrado en el banco de datos GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA) bajo el numero de acceso AB046355.1 y posee una homologfa de 77,8 % a nivel de acido nucleico; a nivel de aminoacido, la coincidencia se encuentra en una identidad de 89,9 % (vease ejemplo 2). Estas coincidencias significativas permiten concluir no solo sobre la funcion bioqmmica, sino tambien sobre el hecho de que dentro de la region reivindicada se encuentra una gran cantidad de protemas relacionadas que tienen la misma funcion.

A esta protema YwtA pueden corresponder las siguientes variantes:

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- Cada protema YwtA correspondiente codificada por una secuencia de nucleotidos que tiene, por ejemplo, una identidad creciente preferiblemente de al menos 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y de manera particularmente preferida de 100 % a la secuencia de nucleotidos indicada en SEQ ID NO. 5.

-Cada protema YwtA (CapC, PgsC) involucrada en la formacion de poliaminoacidos, con una secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de al menos 94 %, preferiblemente de manera creciente de al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y de manera particularmente preferida de 100 % con la secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID NO. 6.

La protema DSM13 obtenida concretamente de B. licheniformis se prefiere de la manera mas enfatica porque esta se describe concretamente con la presente solicitud y se hace disponible de manera 100 % realizable.

Entre estas se prefiere respectivamente una protema de este tipo, previamente descrita, involucrada en la formacion o la degradacion de poliaminoacidos, que se forma de manera natural por un microorganismo, de preferencia una bacteria, de particular preferencia una bacteria gram-positiva, entre estas preferiblemente una del genero Bacillus, entre estas de modo particularmente preferible una de la especie B. licheniformis y entre estas de manera muy particularmente preferida B. licheniformis DSM13.

Esto es porque de conformidad con el problema habfa interes de mejorar la fermentacion de microorganismos, para lo cual con frecuencia se usan bacterias y entre estas particularmente las bacterias gram-positivas, principalmente aquellas que como el bacilo estan en capacidad de secretar sustancias de valor y protemas formadas. Ademas, para esto existe un amplio bagaje de experiencia industrial. Ademas, tal como se menciono, pudieron detectarse las protemas indicadas en el protocolo de secuencias para B. licheniformis, concretamente para B. licheniformis DSM13. Es de esperar que un grado creciente de afinidad de los organismos relevantes vaya acompanado de una medida creciente de coincidencia de la secuencia de nucleotidos y de aminoacidos y de esta manera su intercambiabilidad.

La divulgacion se refiere ademas a acidos nucleicos:

- acido nucleico ywtA (capC, pgsC) que codifica un producto genico involucrado en la formacion de poliaminoacidos, con una secuencia de nucleotidos que presenta una identidad de al menos 82 % a la secuencia de nucleotidos indicada en SEQ ID NO. 5;

-un acido nucleico correspondiente ywtA con una secuencia de nucleotidos que presenta una identidad creciente preferiblemente de al menos85 %, 90 %. 92 %, 94 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y de modo particularmente preferido de 100 % a la secuencia de nucleotidos indicada en SEQ ID NO. 5.

Los acidos nucleicos puestos a disposicion por medio de la presente pueden emplearse para la desactivacion o la amplificacion de la actividad de las protemas correspondientes de acuerdo con procedimientos de biologfa molecular conocidos per se. De esta manera son posibles las desactivaciones por ejemplo mediante vectores de delecion correspondientes (vease mas adelante); la amplificacion de la actividad se efectua ventajosamente por medio de una sobreexpresion que puede lograrse con ayuda de un vector de expresion (vease mas adelante).

Los genes correspondientes que caen en las regiones de homologfa indicadas respectivamente pueden obtenerse a partir de los organismos de interes con ayuda de sondas que pueden producirse por medio de la secuencia 5. Estos genes completos tambien pueden servir como modelos para la generacion de cebadores de PCR, por medio de los cuales pueden explotarse los genes relevantes de las correspondientes preparaciones de ADN completo; estas a su vez proporcionan las protemas previamente descritas. En este caso por lo regular la cuota de exito es tanto mayor, cuanto mas cerca este relacionada la cepa relevante con la que ha servido para la construccion de la sonda o del cebador de PCR, es decir en este caso con B. licheniformis.

Respectivamente se prefiere entre estos, respectivamente un acido nucleico tal que este contenido de manera natural en un microorganismo, preferiblemente una bacteria, particularmente preferible una bacteria gram-positiva, entre estas preferiblemente una del genero bacilo, entre estas particularmente preferible una de la especie B. licheniformis y entre estas muy particularmente preferible B. licheniformis DSM13.

Esto es porque, tal como se ha expuesto previamente, existe un interes particular en aprovechar estos genes para fermentaciones de microorganismos de este tipo. Por otra parte, con la presente divulgacion tambien esta enlazada la posibilidad de reajustar el metabolismo de los poliaminoacidos, principalmente acido gamma-glutamico al menos en parte, mediante los genes y/o protemas aqrn descritos, si estos poliaminoacidos deben sintetizarse, modificarse y/o degradarse. Para esto, en terminos generales, la cuota de exito se incrementa principalmente en celulas hospederas transgenicas correspondientes, cuanto mas coincidan los genes relevantes con aquellos de las celulas naturales.

Ademas pueden aislarse facilmente alternativas de los genes y de las protemas a partir de, teoricamente, todos los organismos naturales.

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Ademas se divulgan acidos nucleicos que codifican una protema que ya se ha descrito antes.

As^ existen diferencias particularmente entre especies lejanamente relacionadas respecto del uso de codones sinonimos que codifican los respectivos aminoacidos, a los cuales tambien se adapta el aparato de biosmtesis de la protema, por ejemplo mediante la cantidad disponible de los ARNt cargados apropiados. La transferencia de uno de dichos genes a especies menos relacionadas puede usarse entonces de manera particularmente exitosa por ejemplo para mutacion de delecion o para smtesis de la protema relevante si se optimiza de manera correspondiente respecto de los codones. A causa de esto pueden introducirse diferencias porcentuales crecientes a nivel de ADN que, sin embargo, no tienen consecuencia a nivel de aminoacidos.

Ademas se divulgan vectores que contienen una region de acido nucleico previamente designada.

Con el fin de manejar los acidos nucleicos relevantes para la invencion y de esta manera principalmente preparar la produccion de protemas de la invencion, estos son ligados a vectores de manera adecuada. Tales vectores y los procedimientos de trabajo relevantes se describen en detalle en el estado de la tecnica. Los vectores se encuentran disponibles comercialmente en gran cantidad y gama de variacion tanto para clonacion como para expresion. Estos incluyen, por ejemplo, vectores derivados de plasmidos bacterianos, de bacteriofagos o de virus, o de modo predominante vectores sinteticos. Tambien se distinguen de acuerdo con la naturaleza de los tipos de celula en las cuales son capaces de establecerse, por ejemplo segun vectores para bacterias gram-negativas, para gram- positivas, para levaduras o para eucariotas superiores. Forman puntos de partida adecuados, por ejemplo para investigaciones moleculares biologicas y bioqmmicas para la expresion del gen relevante o la protema correspondiente. Tal como es evidente del estado de la tecnica relevante para esto, son practicamente indispensables principalmente para la preparacion de constructos para delecion o ampliacion de la expresion.

Los vectores pueden ser vectores de clonacion.

Ademas del almacenamiento, la amplificacion biologica o la seleccion del gen de interes, los vectores de clonacion son adecuados para su caracterizacion biologica molecular. Al mismo tiempo, representan formas transportables y almacenables de los acidos nucleicos reivindicados y tambien son puntos de partida para tecnicas biologicas moleculares que no estan ligadas a celulas tales como, por ejemplo, PCR o procedimientos de mutagenesis in vitro.

Los vectores son preferiblemente vectores de expresion.

Los vectores de expresion de este tipo son la base para implementar los acidos nucleicos correspondientes en sistemas biologicos de produccion y para producir con estos las protemas correspondientes. Se prefieren vectores de expresion que tienen los elementos geneticos necesarios para la expresion; por ejemplo, el promotor natural, originalmente localizado antes de este gen o un promotor de algun otro organismo. Estos elementos pueden estar dispuestos, por ejemplo, en forma de un, asf llamado, casete de expresion. De manera alternativa algunos o todos los elementos de regulacion tambien pueden ser preparados por la respectiva celula hospedera. Particularmente se prefieren los vectores de expresion en relacion con otras propiedades tales como, por ejemplo, el numero optimo de copias compaginado con el sistema de expresion elegido, principalmente las celulas hospederas (vease mas adelante).

Ademas se divulgan celulas que contienen uno de los acidos nucleicos previamente designados despues de la modificacion mediante ingeniena genetica.

Puesto que estas celulas contienen la informacion genetica para la smtesis de una protema. Por estas se entienden principalmente aquellas celulas que han sido provistas con el acido nucleico de acuerdo con procedimientos conocidos per se, o que se derivan de tales celulas. Las celulas hospederas seleccionadas adecuadamente para este proposito son aquellas que pueden cultivarse de modo relativamente simple y/o proporcionan altos rendimientos de producto.

Fundamentalmente para pafses en los cuales las celulas madre embrionales humanas no pueden colocarse bajo proteccion de patente, tales celulas madre embrionales humanas de la invencion tienen que excluirse del area de proteccion.

Las celulas hacen posible a manera de ejemplo la amplificacion de los genes correspondientes pero tambien su mutagenesis o transcripcion y traslacion y en ultimas la produccion biotecnologica de las protemas relevantes. Esta informacion genetica puede estar presente extra-cromosomaticamente como elemento genetico propio, es decir en bacterias en localizacion de los plasmidos, o estar integrada a un cromosoma. La eleccion de un sistema adecuado depende de cuestiones tales como por ejemplo el tipo y la duracion del almacenamiento del gen o del organismo o el tipo de mutagenesis o de seleccion.

Entre estas se cuentan principalmente aquellas celulas que contienen el gen ywtA por medio de un vector en trans y de esta manera puede usarse para deleciones correspondientes (vease mas adelante).

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El acido nucleico mencionado es una parte de un vector, principalmente de un vector previamente descrito, en una celula de este tipo.

Entre estas se prefieren celulas hospederas que son bacterias.

Puesto que las bacterias se caracterizan por tiempos de generacion breves y bajas demandas a las condiciones de cultivo. De esta manera pueden establecerse procedimientos economicos. Ademas, en el caso de las bacterias en la tecnologfa de fermentacion se dispone de una amplia experiencia. Las bacterias gram-negativas o gram-positivas pueden ser adecuadas para una produccion espedfica por las razones mas diversas a determinarse experimentalmente en el caso individual como las fuentes de nutrientes, la velocidad de formacion de producto, la demanda de tiempo, etcetera.

Preferiblemente es una bacteria gram-negativa, principalmente una de los generos Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas o Xanthomonas, principalmente cepas de E. coli K12, E. coli B o Klebsiella planticola, y muy particularmente derivados de las cepas Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5a, E. coli JM109, E. coli XL-1 o Klebsiella planticola (Rf).

Puesto que en el caso de bacterias gram-negativas, tales como por ejemplo E. coli, se secreta una gran cantidad de protemas en el espacio periplasmatico. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales. En la solicitud WO 01/81597 A1 se divulga un procedimiento segun el cual se logra la expulsion de las protemas expresadas por bacterias gram-negativas. Las bacterias gram-negativas mencionadas como preferidas son por lo regular facilmente accesibles, es decir comercialmente o mediante colecciones publicas de cepas y pueden optimizarse para condiciones de preparaciones espedficas en asociacion con otros componentes tales como, por ejemplo, vectores que estan disponibles igualmente en gran cantidad.

No menos preferida es una bacteria gram-positiva, principalmente una de los generos Bacillus, Staphylococcus o Corynebakterium, muy particularmente de la especie Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii o B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus o Corynebacterium glutamicum, y entre estas a su vez muy particularmente se prefiere un derivado de B. licheniformis DSM 13.

Puesto que las bacterias gram-positivas tienen la diferencia fundamental frente a las gram-negativas de liberar inmediatamente protemas secretadas al medio nutriente que rodea las celulas y a partir de las cuales si se desea las protemas expresadas pueden purificarse directamente a partir del medio nutriente. Ademas, estan relacionadas o son identicas a la mayona de los organismos de origen para enzimas industrialmente importantes y casi siempre ellas mismas producen enzimas comparables de modo que tienen un uso de codon similar y su aparato de smtesis de protema esta configurado naturalmente de manera correspondiente. Muy particularmente se prefieren derivados de B. licheniformis DSM 13 porque por una parte se usan igualmente de manera amplia como cepas de produccion biotecnologica en el estado de la tecnica y, por otra parte, porque con la presente solicitud se vuelven disponibles exactamente los genes y protemas de B. licheniformis DSM 13 de modo que de la manera mas probable debena ser exitosa la realizacion de la presente invencion en tales cepas.

Ademas, se divulgan los procedimientos para la preparacion de un producto genico YwtA previamente descrito.

Este incluye cualquier procedimiento para preparar una protema como la descrita antes, por ejemplo procedimientos qrnmicos de smtesis. Sin embargo, en comparacion con estos, se prefieren todos los procedimientos biologicos moleculares, microbiologicos y biotecnologicos de preparacion que se han discutido antes en la presente, en aspectos individuales y que estan establecidos en el estado de la tecnica. El objetivo de los mismos es principalmente obtener las protemas al fin de hacerlas disponibles para aplicaciones correspondientes, por ejemplo para la smtesis, de poli-gamma-glutamato.

En este caso los procedimientos preferidos son aquellos que se efectuan empleando acidos nucleicos ya designados en la presente, preferiblemente empleando un vector previamente designado y de modo particularmente preferido empleando una celula previamente designada.

Puesto que mediante los acidos nucleicos mencionados, principalmente los acidos nucleicos indicados en el protocolo de secuencias de SEQ ID NO. 5, se pone a disposicion la informacion genetica correspondientemente preferida en forma microbiologicamente utilizable, es decir el procedimiento de produccion por ingeniena genetica. De manera creciente se prefiere la preparacion sobre un vector utilizable de manera particularmente exitosa por parte de la celula hospedera o de las mismas celulas de este tipo. Los procedimientos relevantes de produccion son conocidos per se por el experto en la materia.

La base de los acidos nucleicos correspondientes tambien pueden ser sistemas de expresion desprovistos de celulas en los cuales esta comprendida la smtesis de protema in vitro. Todos los elementos ya mencionados tambien pueden combinarse en procedimientos novedosos con el fin de producir protemas. En tal caso, para cada protema es concebible una gran cantidad de combinaciones posibles de etapas de procedimiento de modo que tienen que determinarse experimentalmente procedimientos optimos para cada caso concreto.

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Ademas, se prefieren aquellos procedimientos de este tipo en los cuales la secuencia de nucleotidos ha sido adaptada en uno o preferiblemente varios codones a la utilizacion de codon de la cepa hospedera.

Puesto que en correspondencia con lo ya dicho, la transferencia de uno de dichos genes a una especie menos relacionada puede usarse de manera particularmente exitosa para sintetizar la protema relevante si esta correspondientemente optimizada respecto de la utilizacion de codon.

Ademas, se divulga el uso de uno de los acidos nucleicos ywtA descritos en la presente o de un acido nucleico correspondiente que codifica una de las protemas descritas en la presente o respectivamente partes de la misma, para la desactivacion funcional de cada gen ywtA correspondiente en un microorganismo.

Por desactivacion funcional en el contexto de la presente solicitud se entiende cada tipo de modificacion o mutacion despues de la cual se suprime la funcion de la protema relevante como enzima involucrada en la formacion de poliaminoacidos, o como una subunidad de una enzima de este tipo. Esto incluye la forma de realizacion en la cual se forma una protema virtualmente completa pero inactiva, en la cual las partes inactivas de tal protema estan presentes en la celula, hasta las posibilidades de que el gen correspondiente ya no se traslade o incluso se suprima completamente. De esta manera, un "uso" especial de estos factores o genes de esta forma de realizacion consiste en que estos ya no tienen efecto de su manera natural precisamente en la celula relevante. De acuerdo con un objeto de la invencion esto se logra a nivel genetico desconectando el gen relevante.

En formas de realizacion preferidas ambos usos son aquellos en los cuales la desactivacion funcional o el incremento de actividad se efectuan durante la fermentacion del microorganismo, preferiblemente con una disminucion al 50 % del mudlago atribuible a poliaminoacidos, particularmente preferible a menos de 20 %, muy particularmente preferible a menos de 5 %, y en tal caso nuevamente todos los valores porcentuales en numeros enteros o fraccionarios que se encuentren en el medio deben entenderse en una escala correspondientemente preferida.

Para determinar estos valores se fermentan celulas de una cepa no tratada y de una cepa tratada en condiciones que de otra manera son identicas y durante la fermentacion se determina adecuadamente la viscosidad del medio respectivo. Puesto que de otra manera las cepas son identicas, las diferencias en viscosidad son atribuibles a los diferentes contenidos de poliaminoacidos. De acuerdo con la invencion se desea toda reduccion en la viscosidad. Se obtienen valores porcentuales comparables tomando muestras de ambas fermentaciones y determinando el contenido de mudlago que contiene poliaminoacidos de acuerdo con procedimientos conocidos. De manera creciente se prefiere si el valor que pueda determinarse en la muestra en la transicion a la fase de crecimiento estacionario sea menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % y muy particularmente de menos de 1 % del valor correspondiente de la fermentacion comparativa.

Para el uso para desactivacion funcional del gen ywtA puede emplearse un acido nucleico que codifica una protema inactiva con una mutacion puntual.

Acidos nucleicos de este tipo pueden generarse mediante procedimientos conocidos per se para la mutagenesis. Tales procedimientos se exponen, por ejemplo, en manuales correspondientes tales como el de Fritsch, Sambrook y Maniatis, "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989. Ademas, para estos se encuentran disponibles en la actualidad numerosos kits comerciales, por ejemplo el kit QuickChange® de la companfa Stratagene, La Jolla, USA. El principio de este consiste en que se sintetizan oligonucleotidos que tienen intercambios individuales (cebador-discordancia) y se hibridan con el gen puesto en forma monocatenaria; la subsiguiente polimerizacion de ADN produce mutantes puntuales correspondientes. Para esto pueden usarse las respectivas secuencias, propias de la especie, de este gen. Debido a las altas homologfa as es posible y de acuerdo con la invencion es particularmente ventajoso realizar esta reaccion por medio de la secuencia disponible en SEQ ID NO. 5. Esta secuencia tambien puede servir para disenar cebadores de discordancia apropiados para especies relacionadas, especialmente por medio de las regiones conservadas que pueden identificarse en las alineaciones de las figuras 1 y 2.

De acuerdo con una forma de realizacion de este uso, para la desactivacion funcional se emplea respectivamente un acido nucleico con una mutacion de delecion o de insercion, que de preferencia comprende las secuencias de borde que comprenden al menos 70 a 150 posiciones de acido nucleico de la region que codifica la protema.

Estos procedimientos tambien son familiares para el experto en la materia. De esta manera tambien es posible impedir la formacion de un factor YwtA por la celula hospedera cortando parte del gen relevante en un vector apropiado de transformacion por medio de endonucleasas de restriccion y transformando a continuacion el vector en el hospedero de interes donde el gen activo se reemplaza por la copia inactiva por medio de la recombinacion homologa que aun es posible hasta entonces. En la forma de realizacion de la mutacion de insercion es posible solamente introducir el gen intacto de manera interrumpida o, en lugar de una porcion del gen, otro gen, por ejemplo un marcador de seleccion. De una manera conocida per se desde el punto de vista fenotfpico es verificable el evento de mutacion.

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Con el fin de hacer posibles estos eventos de recombinacion que son necesarios en cada caso entre el gen defectuoso introducido a la celula y la copia del gen intacta que esta presente de modo endogeno por ejemplo en el cromosoma, de acuerdo con el estado actual de conocimiento es necesaria una coincidencia en al menos 70 a 150 posiciones de acido nucleico conectadas con la parte no coincidente, respectivamente en las dos secuencias de borde, y la parte intermedia no importa. Por consiguiente, se prefieren aquellas formas de realizacion que incluyen solamente dos regiones a los flancos con al menos

Para el uso pueden emplearse acidos nucleicos con dos segmentos de acido nucleico en total que comprenden respectivamente al menos 70 a 150 posiciones de acido nucleico y de esta manera flanquean al menos parcialmente, de preferencia totalmente, la region que codifica la protema. Las regiones de los flancos en este caso pueden determinarse a partir de secuencias conocidas mediante procedimientos conocidos per se, por ejemplo con la ayuda de cebadores de PCR dirigidos hacia fuera y una preparacion de ADN genomico como molde (PCR anclado). Puesto que con el fin de hacer posible solamente el intercambio de las dos copias del gen mediante recombinacion homologa, no se necesita obligatoriamente que sean segmentos de codificacion de protema. De acuerdo con la presente invencion es posible disenar los cebadores requeridos para esto por medio de la SEQ ID NO. 5 incluso para otras especies de bacterias gram-positivas y, entre estas, en particular para aquellas del genero Bacillus. De modo alternativo a este enfoque experimental, es posible tomar dichas regiones que son al menos en parte no codificadoras para muchos de estos genes de especies relacionadas, por ejemplo de entradas de bancos de datos de B. subtilis, por ejemplo el banco de datos Subtilis del Institute Pasteur, Paris, Francia (
http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi).

La presente invencion tambien se pone en practica en la forma de microorganismos geneticamente modificados, para los cuales es aplicable lo dicho previamente.

De manera muy general, son microorganismos en los cuales se desactiva funcionalmente el gen ywtA. Preferiblemente estos son microorganismos que son bacterias.

Entre estos se prefieren aquellos microorganismos que son bacterias gram-negativas, principalmente aquellas de los generos Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas o Xanthomonas, principalmente cepas de E. coli K12, E. coli B o Klebsiella planticola, y muy particularmente derivados de las cepas Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5a, E. coli JM109, E. coli XL-1 o Klebsiella planticola (Rf).

Los microorganismos que son bacterias gram-positivas son principalmente aquellas de los generos Bacillus, Staphylococcus o Corynebacterium, muy particularmente de las especies Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. globigii o B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus o Corynebacterium glutamicum y entre estos muy particularmente B. licheniformis DSM 13 no son menos preferidos.

Los objetivos fundamentales de la presente solicitud debfan ser principalmente el mejoramiento de los procedimientos industriales de fermentacion. Por consiguiente, la invencion se pone en practica principalmente en procedimientos de fermentacion correspondientes de acuerdo con la invencion.

En terminos muy generales, estos son procedimientos para la fermentacion de un microorganismo descrito previamente, de acuerdo con la invencion.

De acuerdo con las realizaciones hasta ahora, de manera correspondiente se prefieren procedimientos caracterizados por estas. Estos incluyen principalmente desactivar funcionalmente el gen ywtA. Para esto se prefiere particularmente recurrir a los acidos nucleicos ya descritos, ante todo a los indicados en SEQ ID NO. 5. Esto tambien es valido de manera correspondiente para las especies apropiadamente seleccionadas para la respectiva fermentacion. De conformidad con lo dicho anteriormente entre estas se prefieren de manera creciente los que tienen una afinidad con B. licheniformis DSM13 en medida creciente, porque de esta manera se incrementan las perspectivas de exito al emplear los acidos nucleicos indicados.

Entre los procedimientos de fermentacion de acuerdo con la invencion se prefieren aquellos para la produccion de una sustancia de valor, principalmente para la produccion de un compuesto con bajo peso molecular o de una protema.

Puesto que este es el campo de aplicacion mas importante para las fermentaciones a escala industrial.

Se da preferencia a los procedimientos donde el compuesto de bajo peso molecular es un producto natural, un complemento nutricional o un compuesto relevante en farmacia.

De esta manera se producen por ejemplo aminoacidos o vitaminas que se usan en particular como complementos nutricionales. Los compuestos relevantes en farmacia pueden ser precursores o intermedios para medicamentos o incluso estos ultimos. En todos estos casos tambien se usa el termino biotransformacion, de acuerdo con lo cual se

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utilizan las propiedades metabolicas de los microorganismos para reemplazar, totalmente o al menos en etapas individuals, la smtesis qmmica de otra manera compleja.

No menos preferidos son procedimientos correspondientes en los cuales la protema producida de esta manera es una enzima, en particular una del grupo de a-amilasas, proteasas, celulasas, lipasas, oxidoreductasas, peroxidasas, lacasas, oxidasasa y hemicelulasas.

Las enzimas industriales preparadas mediante tales procedimientos se usan por ejemplo en la industria de alimentos. De esta manera, las a-amilasas sirven por ejemplo para impedir que el pan se ponga duro o para clarificar zumos de fruta. Las proteasas se usan para la lisis de protemas. Todas estas enzimas han sido descritas para uso en detergentes y composiciones de limpieza y un lugar prominente es ocupado en particular por las proteasas de Subtilisin, preparadas naturalmente por bacterias gram-positivas. Estas se usan principalmente en la industria textil y de cuero para procesar las materias primas naturales. Ademas, todas estas enzimas pueden emplearse a su vez como catalizadores para reacciones qmmicas en el contexto de la biotransformacion.

Muchas de estas enzimas se derivan originalmente de la especie Bacillus y por esto se producen de manera particularmente exitosa en organismos gram-positivos, principalmente en aquellos del genero Bacillus, entre los cuales en muchos casos tambien se encuentran derivados de B. licheniformis DSM13. Por medio de la presente invencion pueden mejorarse principalmente los procedimientos de produccion que se basan en estos sistemas microbianos porque principalmente la secuencia indicada en SEQ ID NO. 5 proviene precisamente de este organismo.

Finalmente, los factores proporcionados con la presente solicitud tambien pueden emplearse de manera positiva, es decir en el contexto de su funcion natural, es decir en conexion con una produccion dirigida de poli-gamma- glutamato.

De esta manera se divulgan procedimientos microbianos para la produccion de poli-gamma-glutamato en los cuales se emplea de modo transgenico uno de los acidos nucleicos ywtA previamente descrito o un acido nucleico correspondiente que codifica una protema como la descrita previamente, de preferencia con la formacion de la protema correspondiente que se ha descrito previamente.

Entre estos se prefieren procedimientos en los cuales se emplea un microorganismo del genero Bacillus, principalmente B. subtilis o B. licheniformis.

De esta manera es posible, tal como se describe por ejemplo en las solicitudes de patentes JP 08308590 A o WO 02/055671 A1, producir GLA de modo microbiano, espedficamente en B. subtilis y B. licheniformis. Las secuencias de ADN proporcionadas con la presente solicitud pueden utilizarse para incrementar las respectivas actividades genicas en las celulas correspondientes y de esta manera aumentar el rendimiento.

Como una alternativa a esto ahora son posibles procedimientos libres de celulas para la produccion de poli-gamma- glutamato con la participacion de un producto genico YwtA, ya descrito previamente en la presente, involucrado en la formacion de poliaminoacidos, de preferencia empleando uno de los acidos nucleicos correspondientes ya descritos en la presente.

De esta manera estos factores pueden hacerse reaccionar en un biorreactor, por ejemplo. La construccion de tales biorreactores de enzima es conocida del estado de la tecnica.

Los siguientes ejemplos explican aun mas la presente invencion.

Ejemplos

Todas las etapas de operacion biologica molecular siguen procedimientos estandar, tal como se indican en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, o en obras especializadas comparables. Las enzimas, kits y aparatos han sido empleados segun las indicaciones del fabricante correspondiente.

Ejemplo 1

Identificacion de los genes ywsC, ywsC', ywtA, ywtB e ywtD de B. licheniformis DSM 13

El ADN genomico fue preparado mediante procedimientos estandar a partir de la cepa B. licheniformis DSM 13, que se encuentra disponible para cualquier persona en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (
http://www.dsmz.de), se fracciono mecanicamente y mediante electroforesis se fracciono en un gel de agarosa al 0,8 %. Para una clonacion mediante disparos de perdigones de los fragmentos mas pequenos, los fragmentos con tamanos de 2 a 2,5 kb fueron eluidos del gel de agarosa, desfosforilados y ligados como fragmentos con extremos romos (blunt ended) al sitio de corte de restriccion Smal del

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vector pTZ19R-Cm. Este es un derivado que confiere resistencia a cloranfenicol de plasmido pTZ19RCm disponible comercialmente en la comparna Fermentas (St. Leon-Rot). De esta manera se obtuvo un banco genico de los fragmentos mas pequenos. Como segunda clonacion con disparo de perdigones fueron ligados los fragmentos genomicos obtenidos mediante una restriccion parcial con la enzima SauIIIal al sistema de vector SuperCos-1 ("Cosmid Vector Kit") de la comparna Stratagene, La Jolla, Estados Unidos, por lo cual se obtuvo un banco genico sobre los fragmentos predominantemente mas grandes.

Los plasmidos recombinantes relevantes fueron aislados y secuenciados de las bacterias E. coli DH5a (D. Hannahan (1983): "Studies on transformation on Escherichia coli"; J. Mol. Microbiol., Volumen 166, paginas 557 - 580) que pueden obtenerse mediante transformacion con los bancos genicos relevantes. En este caso fue empleado el procedimiento de determinacion con tinte (dye terminator chemistry) realizado por medio de los aparatos secuenciadores automaticos Mega-BACE 1000/4000 (Amersham Bioscence, Piscataway, Estados Unidos) y ABI Prism 377 (Applied Biosystems, Foster City, Estados Unidos).

De esta manera se obtuvieron entre otras las secuencias SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7 y 9 indicadas en el protocolo de secuencias de la presente solicitud, que se encuentran en este orden para los genes ywsC, ywsC' (como variante abreviada de ywsC), ywtA, ywtB e ywtD. Las secuencias de aminoacidos derivadas de estos se indican en la secuencia correspondiente en SEQ iD NO. 2, 4, 6, 8 y 10 respectivamente. Se indica una variante truncada ywsC' (o YwsC') para el gen o protema ywsC (o YwsC), porque la comparacion mostrada en la figura 6 de las secuencias de aminoacidos para la protema homologa en B. subtilis muestra un polipeptido que en caso de una homologfa de otra manera bastante alta y por lo tanto una actividad comparable N- terminalmente es 16 aminoacidos mas corto.

Reproducibilidad

Estos genes y productos genicos pueden sintetizarse ahora artificialmente de acuerdo con procedimientos conocidos per se y sin la necesidad de reproducir la secuenciacion descrita, de una manera dirigida por medio de estas secuencias. Como otra alternativa para esto, es posible aislar los genes relevantes de una cepa Bacillus, en particular de la cepa B. licheniformis DSM 13 disponible en DSMZ, mediante PCR, en cuyo caso pueden usarse las respectivas secuencias de borde indicadas en el protocolo de secuencias para la smtesis de cebadores. Al usar otras cepas se obtienen respectivamente los genes homologos a estas y la PCR debe ser mas exitosa cuanto mas estrechamente relacionadas esten las cepas seleccionadas con la B. licheniformis DSM 13, porque de esta manera puede asociarse una coincidencia creciente de secuencias incluso dentro de la regiones de enlace de cebadores.

Ejemplo 2

Homologia de secuencia

Despues de determinar las secuencias de ADN y de aminoacidos segun el Ejemplo 1, fueron determinados los homologos mas similares hasta ahora conocidos mediante busqueda en los bancos de datos GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Estados Unidos;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y en la Subtilist des Institute Pasteur, Paris, Francia (
http://genolist.pasteur.fr/Subtilist/genome.cgi).

Las secuencias determinadas de ADN y de aminoacidos fueron comparadas entre sf por medio de alineaciones representadas en las figuras 1 a 10; para esto se utilizo el programa de ordenador Vector NTI® Suite Version 7, el cual se encuentra disponible en la comparna Informax Inc., Bethesda, Estados Unidos. En este caso se usaron los parametros estandar de este programa, es decir para la comparacion de las secuencias de ADN: tamano (size) K- tuple: 2; cantidad de mejores diagonales (Number of best Diagonals): 4; tamano de ventana (Window size): 4; penalidad de brecha (Gap penalti): 5; penalidad de abertura de brecha (Gap opening penalti): 15 y penalidad de extension de brecha (Gap extension penalti): 6,66. Para la comparacion de las secuencias de aminoacidos se aplicaron los siguientes parametros estandar: K-tuple size: 1; Number of best Diagonals: 5; Window size: 5; Gap penalty: 3; Gap opening penalty: 10 y Gap extension penalty: 0,1. Los resultados de estas comparaciones de secuencias se recopilan en la siguiente tabla 1, en la cual los numeros de acceso indicados son aquellos del banco de datos de NCBI.

Tabla 1: Genes y protemas de mayor similitud con los genes y protemas determinados en el ejemplo 1

Gen o protema encontradas en B. licheniformis / SEQ ID NO. Gen o protema mas cercanamente relacionados Entrada en el banco de datos del gen o de la protema mas cercanamente relacionados Homologfa en % identidad

ywsC/1

ywsC de B. subtilis AB046355.1 75,4

ywsC’ / 3

ywsC de B. subtilis AB046355.1 78,5

ywtA / 5

ywsA de B. subtilis AB046355.1 77,8

ywtB / 7

ywsB de B. subtilis AB046355.1 67,1

ywtD / 9

ywtD de B. subtilis AB080748 62,3

YwsC / 2

YwsC de B. subtilis AB046355.1 86,1

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Gen o protema encontradas en B. licheniformis / SEQ ID NO.

Gen o protema mas cercanamente relacionados Entrada en el banco de datos del gen o de la protema mas cercanamente relacionados Homologfa en % identidad

YwsC' / 4

YwsC de B. subtilis AB046355.1 89,6

YwtA / 6

YwsA de B. subtilis AB046355.1 89,9

YwtB / 8

YwsB de B. subtilis AB046355.1 65,8

YwtD / 10

YwsD de B. subtilis AB080748 57,3

Ejemplo 3

Desactivacion funcional de uno o de varios de los genes ywsC, ywsC', ywtA e ywtB en B. licheniformis Principio de la preparacion de un vector de delecion

Cada uno de estos genes pueden desactivarse funcionalmente, por ejemplo, por medio de un llamado vector de delecion. Este procedimiento se describe per se, por ejemplo, por J. Vehmaanpera et al. (1991) en la publicacion "Genetic manipulation of Bacillus amyloliquefaciens"; J. Biotechnol., Volumen 19, paginas 221 - 240.

Un vector adecuado para esto es pE194, el cual se caracteriza en la publicacion "Replication and incompatibility properties of plasmid pE194 in Bacillus subtilis" de T.J. Gryczan et al. (1982), J. Bacteriol., Volumen 152, paginas 722 - 735. La ventaja de este vector de delecion consiste en que tiene un origen de replicacion dependiente de la temperatura. A 33°C pE194 puede replicar en la celula transformada, de modo que a esta temperatura primero se selecciona una transformacion exitosa. A continuacion, las celulas que contienen el vector son incubadas a 42 °C. A esta temperatura el vector de delecion ya no se replica y se ejerce una presion de seleccion sobre la integracion del plasmido por una region homologa seleccionada previamente en el cromosoma. Una segunda recombinacion homologa sobre una segunda region homologa conduce luego a que se extirpe del cromosoma el vector conjuntamente con la copia intacta del gen y de esta manera a la delecion del gen localizado in vivo en el cromosoma. Tambien sena posible la reaccion inversa hacia la integracion como segunda recombinacion, es decir que el gen cromosomico quedana intacto. La delecion del gen tiene que detectarse por lo tanto de acuerdo con procedimientos conocidos per se, por ejemplo en un Southern Blot despues de restriccion del ADN cromosomico con enzimas adecuadas o con la ayuda de la tecnica de PCR por medio del tamano de la region amplificada.

Tambien se requiere seleccionar dos regiones homologas del gen que van a suprimirse, las cuales deben comprender al menos cada una 70 pares de bases, por ejemplo la region 5' y la region 3' del gen seleccionado. Estas son clonadas en el vector de tal manera que flanquean una parte que codifica una protema inactiva o se suceden directamente con la omision de la region del medio.

Delecion de los genes ywsC, ywsC', ywtA e ywtB considerados en la presente

Para la construccion de un vector de delecion segun la invencion se amplifican las regiones 5' y 3 de uno de estos cuatro o tres genes por medio de PCR. Para la construccion de cebadores adecuados se encuentran disponibles las secuencias SEQ ID NO. 1, 3, 5 y 7 indicadas en el protocolo de secuencias las cuales provienen de B. licheniformis, pero debido a sus homologfa que deben esperarse tambien deben ser adecuadas para otras especies, principalmente del genero Bacillus.

Las dos regiones amplificadas experimentan una clonacion intermedia en sucesion directa sobre un vector util para estas operaciones, por ejemplo sobre el vector pUC18 que es adecuado para etapas de clonacion en E. coli.

En el siguiente paso se efectua una subclonacion en el vector pE194 seleccionado para delecion y para una transformacion del mismo en B. subtilis DB104, por ejemplo de acuerdo con el procedimiento de transformacion de protoplasto segun Chang & Cohen (1979; "High Frequency Transformation of Bacillus subtilis Protoplasts by Plasmid DNA"; Molec. Gen. Genet. (1979), volumen 168, paginas 111-115). Todos los pasos operacionales tienen que realizarse a 33 °C con el fin de garantizar una replicacion del vector.

En una siguiente etapa, el vector que ha experimentado clonacion intermedia se transforma igualmente por el procedimiento de transformacion de protoplasto en la cepa hospedera deseada, en este caso B. licheniformis. Los transformantes obtenidos de esta manera e identificados como positivos mediante procedimientos convencionales (seleccion por medio de marcador de resistencia del plasmido; control mediante preparacion de plasmido PCR para el inserto) son cultivados a continuacion a 42 °C bajo presion de seleccion adicionando eritromicina para presencia del plasmido. A esta temperatura el vector de delecion ya no puede replicarse y las unicas celulas que sobreviven son aquellas en las cuales se integra el vector al cromosoma y esta integracion tienen lugar de manera mas probable en regiones homologas o identicas. La extirpacion del vector de delecion puede inducirse luego cultivando a continuacion a 33 °C sin presion de seleccion de eritromicina y el gen codificado de modo cromosomico se suprime completamente del cromosoma. El exito de la delecion se verifica a continuacion mediante Southern-Blot despues de la restriccion del ADN cromosomico con enzimas adecuadas o con ayuda de la tecnica de PCR.

Claims (18)

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   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para disminuir el mudlago atribuible a poli-gamma-glutamato, caracterizado por la supresion de la funcion de la protema YwtA (CapC, PgsC), codificada por el gen ywtA con una secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de al menos 94 % con la secuencia de aminoacidos indicada en la SEQ ID NO. 6, como una enzima o una subunidad de tal enzima involucradas en la formacion de poliaminoacidos.
2. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque se suprime la funcion de la protema YwtA durante la fermentacion del microorganismo.
3. 3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por una disminucion al 50 % del mudlago atribuible a poliaminoacidos.
4. 4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1,2 o 3, caracterizado porque el microorganismo

   a) es una bacteria, y/o

   b) es una bacteria gram-negativa, o

   c) una bacteria gram-positiva.
5. 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de uno de los generos Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Xanthomonas, Bacillus, Staphylococcus o Corynebacterium.
6. 6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por las siguientes etapas para suprimir la funcion de la protema YwtA codificada por el gen ywtA:

   a) seleccionar dos regiones de la secuencia SEQ ID NO. 5,

   b) clonar las regiones en un vector de modo que flanquean una parte que codifica una protema inactiva o de manera que se sucedan directamente omitiendo la region intermedia,

   c) suprimir el gen ywtA con el vector preparado en la etapa b), y

   d) detectar la delacion del gen.
7. 7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se suprime la funcion de la protema YwtA (CapC, PsgC) codificada por el gen ywtA empleando un acido nucleico con una mutacion de delacion o de insercion, que comprende preferentemente las secuencias de borde que comprenden respectivamente al menos de 70 a 150 posiciones de acido nucleico de la region que codifica la protema.
8. 8. Procedimiento para producir una sustancia de valor mediante fermentacion de un microorganismo caracterizado porque durante la fermentacion se disminuye la formacion de poli-gamma-glutamato por parte del microorganismo suprimiendo la funcion de la protema YwtA (CapC, PsgC), codificada por el gen ywtA con una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos el 94 % con la secuencia de aminoacidos indicada en la SEQ ID NO. 6, como una enzima o una subunidad de una enzima de este tipo involucradas en la formacion de poliaminoacidos.
9. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, caracterizado porque se suprime la funcion de la protema YwtA (CapC, PsgC) codificada por el gen ywtA por medio de un procedimiento con las siguientes etapas:

   a) seleccionar dos regiones de la secuencia SEQ ID NO. 5,

   b) clonar las regiones en un vector de modo que flanquean una parte que codifica una protema inactiva o de manera que se sucedan directamente omitiendo la region intermedia,

   c) suprimir el gen ywtA con el vector preparado en la etapa b), y

   d) detectar la delacion del gen.
10. 10. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado porque se suprime la funcion de la protema YwtA (CapC, PsgC) codificada por el gen ywtA empleando un acido nucleico con una mutacion de delacion o de insercion, de preferencia que comprende las secuencias de borde que comprenden al menos de 70 a 150 posiciones de acido nucleico de la region que codifica la protema.
11. 11. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 8, 9 o 10, caracterizado porque la sustancia de valor es una sustancia natural, un complemento nutricional o un compuesto farmaceuticamente relevante o una enzima.
12. 12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, caracterizado porque la enzima se selecciona del grupo de las a-amilasas, proteasas, celulasas, lipasas, oxidoreductasas, peroxidasas, lacasas, oxidasas y hemicelulasas.
13. 13. Uso de un acido nucleico que codifica una protema YwtA (CapC, PgsC) involucrada en la formacion de poli- gamma-glutamato, con una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos el 94 % con la

    5 secuencia de aminoacidos indicada en la SEQ ID NO. 6, o respectivamente partes de la misma, para suprimir la funcion de la protema YwtA (CapC, PgsC) como una enzima o una subunidad de una enzima de este tipo involucradas en la formacion de poliaminoacidos.
14. 14. Uso de un acido nucleico que codifica una protema YwtA (CapC, PgsC) involucrada en la formacion de poli- gamma-glutamato, con una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos el 94 % con la

    10 secuencia de aminoacidos indicada en la SEQ ID NO. 6, o respectivamente partes de la misma, para disminuir al 50 % el mudlago atribuible a poli-gamma-glutamato durante la fermentacion de un microorganismo.
15. 15. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 13 o 14, caracterizado porque el acido nucleico tiene la secuencia SEQ ID NO. 5.
16. 16. Uso de un acido nucleico con una mutacion de delecion o de insercion que comprende las secuencias de borde 15 que comprenden en cada caso al menos de 70 a 150 posiciones de acido nucleico de la region que codifica una

    protema YwtA (CapC, PsgC) con la secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos 94 % con la secuencia de aminoacidos indicada en SEQ ID NO. 6, para disminuir el mudlago atribuible a poli-gamma-glutamato durante la fermentacion de un microorganismo.
17. 17. Microorganismo, en el cual esta desactivado funcionalmente el gen ywtA que codifica un producto genico 20 involucrado en la formacion de poli-gamma-glutamato, poseyendo la secuencia de nucleotidos ywtA codificante una

    secuencia de nucleotidos que presenta una identidad de al menos el 94 % con la secuencia de nucleotidos indicada en la SEQ ID NO. 5.
18. 18. Microorganismo de acuerdo con la reivindicacion 17, que es Bacillus licheniformis.