CN114369561B - 调控CapBCA单体表达水平的菌株及在聚谷氨酸生产的应用 - Google Patents
调控CapBCA单体表达水平的菌株及在聚谷氨酸生产的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114369561B CN114369561B CN202210026910.1A CN202210026910A CN114369561B CN 114369561 B CN114369561 B CN 114369561B CN 202210026910 A CN202210026910 A CN 202210026910A CN 114369561 B CN114369561 B CN 114369561B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pga
- gamma
- capc
- laco
- capa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 70
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 title claims abstract description 30
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 239000000178 monomer Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 15
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims abstract description 21
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108700022290 poly(gamma-glutamic acid) Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims abstract description 8
- 101100221536 Dictyostelium discoideum comA gene Proteins 0.000 claims description 68
- 101150118250 capC gene Proteins 0.000 claims description 39
- 101150064899 capa gene Proteins 0.000 claims description 36
- 101150002095 capB gene Proteins 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 28
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 14
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 abstract description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 abstract description 6
- 108010046991 gamma-polyglutamic acid synthetase Proteins 0.000 abstract description 5
- 241000385736 bacterium B Species 0.000 description 18
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- MXZACTZQSGYANA-UHFFFAOYSA-N chembl545463 Chemical compound Cl.C1=CC(OC)=CC=C1C(N=C1)=CN2C1=NC(C)=C2O MXZACTZQSGYANA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 2
- 229910052603 melanterite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 229930182847 D-glutamic acid Natural products 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种调控CapBCA单体表达水平的菌株及在聚谷氨酸生产中的应用，本发明将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ‑聚谷氨酸合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达，在此基础上，利用不同数量的lacO调控合成酶基因簇各基因的表达水平，获得的重组菌株所生产的γ‑PGA产量为3.63～5.84g/L，产率为0.15～0.27g/L/OD600。还发现单独提高CapB和CapC的表达强度，及适度表达CapA均有利于γ‑PGA的合成，而且CapC对于γ‑PGA的合成发挥着至关重要的作用，其表达水平对γ‑PGA产量的影响贡献度可达68.24％。结果有助于深入了解γ‑PGA合成酶单体的功能，以及对γ‑PGA合成的影响规律。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学和发酵工程领域，具体是调控CapBCA单体表达水平的菌株及在聚谷氨酸生产的应用，分别调控CapB，CapC，CapA单体的表达水平，构建了生产γ-聚谷氨酸能力不同的谷氨酸棒杆菌。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体聚合成的生物聚合物，具有水溶性高、良好的生物降解特性、较强的增稠能力等性质，对金属离子具有优异的吸收性和结合能力。近年来，γ-PGA广泛应用于食品、化妆品、生物医学、环境保护等领域。
目前，微生物发酵是生产商业γ-PGA的主要方法，因为它具有原料廉价，环境污染少，天然产物纯度高等优点。主要的γ-PGA生产菌株是芽孢杆菌属，根据生产过程中，是否需要额外添加谷氨酸作为前体，γ-PGA生产菌株可以分为两种类型，即谷氨酸依赖型菌株和谷氨酸非依赖型菌株。有学者先后选择E.coli和C.glutamicum为底盘细胞，通过异源表达γ-PGA合成酶，成功实现了γ-PGA的合成。
γ-PGA合成酶CapBCA(同源物是PgsBCA)由capB，capC和capA基因编码，负责催化谷氨酸合成γ-PGA。capB，capC和capA在γ-PGA合成过程中的重要性尚不清晰，限制了γ-PGA合成的进一步调控。目前的研究主要是通过提高γ-PGA合成酶的表达水平提高γ-PGA的产量。课题组前期在谷氨酸棒杆菌中异源表达γ-PGA合成酶，发现仅诱导型表达可以积累γ-PGA，而组成型表达菌株中pgsBCA基因的表达强度不可调控导致γ-PGA未能合成。因此本研究尝试通过调控capB，capC和capA单体蛋白的表达强度，得到一种capB，capC和capA适度表达的组合，以实现γ-PGA的进一步积累。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在谷氨酸棒杆菌中调控聚合酶基因capB,capC,capA，研究γ-PGA合成酶单体蛋白对谷氨酸棒杆菌合成γ-聚谷氨酸的影响。
本发明的第一个目的是提供一种调控CapBCA单体表达水平的方法，以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum为感受态细胞，利用操纵子工程单独调控γ-PGA合成酶基因簇capBCA的capB、capC、capA基因中任意一个的表达水平，并进行串联表达，构建单独调控capBCA单体表达水平的基因工程菌；
所述γ-PGA合成酶基因簇capBCA选自地衣芽孢杆菌；
所述操纵子工程为不同数量的lacO调控，包括高强度1×[lacO]、中强度2×[lacO]和低强度4×[lacO]其中任意一个。
本发明采用的方法是对γ-聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA表达水平单独调控并串联，具体方法是：先提取地衣芽孢杆菌基因组，通过PCR分别扩增出γ-聚谷氨酸合成酶基因capB、capC、capA，利用不同数量的lacO，单独调控γ-PGA合成酶基因capB、capC、capA中任意一个的表达水平，再通过同尾酶技术得到串联表达重组质粒，转化到感受态细胞C.glutamicum中，最终构建了单独调控γ-PGA合成酶基因簇簇capBCA单体表达水平的重组菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述capB、capC、capA的序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，利用高强度1×[lacO]单独调控capB基因。
在本发明的一种实施方式中，利用高强度1×[lacO]单独调控capC基因。
在本发明的一种实施方式中，利用中强度2×[lacO]单独调控capA基因。
在本发明的一种实施方式中，以C.glutamicum F343为感受态细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述地衣芽孢杆菌从ATCC购买，菌株号为ATCC9945a。
在本发明的一种实施方式中，所述同尾酶连接技术，在本发明的一种实施方式中，是一种直接用于路径的新型模块化合成生物学工具ePathBrick。
本发明的第二个目的，是提供一种在所述单独调控聚合酶基因重组菌株的构建过程中形成的重组质粒，所述重组质粒为pZM1-n1B n2C n3A，其中，n1、n2、n3独立选自lacO调控中的高强度1×[lacO]、中强度2×[lacO]和低强度4×[lacO]其中任意一个。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒包括pZM1-2B2C2A、pZM1-1B2C2A、pZM1-4B2C2A、pZM1-2B1C2A、pZM1-2B4C2A、pZM1-2B2C1A、pZM1-2B2C4A其中一种，其中，后半部分的2代表中强度2×[lacO]调控，1代表高强度1×[lacO]调控，4代表低强度4×[lacO]调控。
本发明的第三个目的是提供一种单独调控capBCA单体表达水平的基因工程菌，根据上述方法构建获得。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌包括BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL，其中，M代表中强度2×[lacO]调控，H代表高强度1×[lacO]调控，L代表低强度4×[lacO]调控。
本发明的第四个目的是提供一种合成γ-PGA的方法，利用所述的基因工程菌合成聚谷氨酸，用于调控γ-PGA的产量和产率。即利用表达所述基因工程菌发酵生产γ-聚谷氨酸，分析γ-PGA合成酶单体蛋白对谷氨酸棒杆菌合成γ-聚谷氨酸的影响。
本发明通过高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌为底盘微生物，外源表达来源于地衣芽孢杆菌中γ-聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA，并且通过不同数量的lacO单独调控聚合酶基因capB,capC,capA。本发明的γ-PGA合成方法是一种从糖质原料一步法发酵合成γ–聚谷氨酸的生产工艺。通过探究不同单体蛋白的表达强度对γ-PGA合成的影响，发现capC的表达水平对γ-PGA产量的影响贡献度可达68.24％，提高capC的转录水平，γ-PGA产量增加了43.82％(从4.06到5.84g/L)，γ-PGA产率增加了76.53％(0.15g/L/OD600到0.27g/L/OD600)。因此，本发明所提供的方案，对于利用谷氨酸棒杆菌高产γ-聚谷氨酸的研究具有普遍的意义。
在本发明的一种实施方式中，所述合成γ-PGA的方法包括：将所述基因工程菌的种子液，接种至发酵培养基，先于32±2℃培养1～2h，加入IPTG诱导1～2h，再于37±2℃培养72±5h。
在本发明的一种实施方式中，所述合成γ-PGA的方法是将BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL从保菌冻存管中吸取2-5μL菌液，在LB-Glu(含卡那霉素25mg/L)平板中划线，培养24h(30℃)。挑单菌落到种子培养基中，32℃，120rpm往复培养12h，按5％的接种量接入发酵培养基中，32℃、120rpm培养2h，加入IPTG诱导1h后温度调为37℃培养48h。
在本发明的一种实施方式中，通过方差分析计算capB，capC和capA 3个因素的表达水平对γ-PGA合成的贡献度。
本发明的有益效果：
(1)本发明将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达，在此基础上，利用不同数量的lacO调控合成酶基因簇各基因的表达水平，获得的重组菌株所生产的γ-PGA产量为3.63～5.84g/L，产率为0.15～0.27g/L/OD600。说明本发明构建的基因工程菌不仅能够有效提高γ-PGA产量和产率，还能够通过调控合成酶基因簇各基因的表达水平进行γ-PGA合成产量的调控；
(2)本发明成功地构建了聚谷氨酸的外源合成途径，并使用操纵子工程调控单体capB，capC和capA的表达强度，发现单独提高CapB和CapC的表达强度，及适度表达CapA均有利于γ-PGA的合成，为进一步提高γ-PGA产量提供有效方法；
(2)通过方差分析计算capB，capC和capA 3个因素的表达水平对γ-PGA合成的贡献度，发现CapC对于γ-PGA的合成发挥着至关重要的作用，其表达水平对γ-PGA产量的影响贡献度可达68.24％，该结果有助于深入了解γ-PGA合成酶单体的功能以及对γ-PGA合成的影响规律。因此，本发明对于提高γ-聚谷氨酸产量的研究具有普遍的意义。
附图说明
图1：基因工程菌BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL的菌落PCR验证；
图2：基因工程菌BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL的转录水平及聚谷氨酸产量；
图3：方差分析capB，capC和capA的表达水平对γ-PGA合成的贡献。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
下面实施例涉及的测定方法或培养方法如下：
聚谷氨酸产量测定方法：
样品处理：将发酵液12000rpm离心15min，取上清，稀释适当倍数，用0.45μm过滤膜过滤，取500μL于2mL进样瓶中，待测。使用凝胶渗透色谱柱：TSKgel super Aw 4000、TSKgelsuper Aw 5000。柱温：40℃，进样量50μL。流动相为0.2M Na2SO4，用冰醋酸调节流动相pH为4.0左右。检测器为：waters液相RID示差检测器。
生物量的测定方法(紫外可见光光度计)：将各个取样点的样品稀释合适倍数，至OD600值为0.2-0.8，量取200μL，在波长600nm处测取吸光度。
种子培养基：玉米浆35g·L-1，葡萄糖25g·L-1，K2HPO4 1.5g·L-1，MgSO4 0.6g·L-1，FeSO4·7H2O 0.005g·L-1，MnCl2·4H2O 0.005g·L-1，尿素2.5g·L-1(分消灭菌)，pH6.8-7.0，每250mL三角瓶中装液25mL，121℃灭菌20min。
发酵培养基：玉米浆10g·L-1，葡萄糖120g·L-1，K2HPO4 1.0g·L-1，MgSO4 0.6g·L-1，FeSO4·7H2O 0.002g·L-1，MnCl2·4H2O 0.002g·L-1，尿素7.0g·L-1(分消灭菌)，pH6.8-7.0，每500mL三角瓶装液50mL，121℃灭菌20min。
基因工程菌BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL的构建方法：以构建基因工程菌BMCMAM为例，以B.licheniformis ATCC9945a基因组为模板，扩增出capB、capC和capA基因片段，将PCR产物和诱导型载体pZM(Ptac)-2×[lacO]进行Nde I和BamH I双酶切、连接，得到重组质粒pZM(Ptac)-2×[lacO]-capB、pZM(Ptac)-2×[lacO]-capC和pZM(Ptac)-2×[lacO]-capA。
对pZM(Ptac)-2×[lacO]-capB进行Nhe I和Sal I双酶切，对pZM(Ptac)-2×[lacO]-capC进行Avr II和Sal I双酶切，利用Nhe I和Avr II是一对同尾酶，酶切后具有相同的粘性末端，T4连接两段酶切后的片段，连接处的Nhe I和Avr II两酶切位点消失，得到重组片段pZM1-2×[lacO]-capB-2×[lacO]-capC。再利用Nhe I和Sal I双酶切对其双酶切，Avr II和Sal I双酶切pZM(Ptac)-2×[lacO]-capA，T4连接两段酶切产物，得到重组质粒pZM1-2×[lacO]-capB-2×[lacO]-capC-2×[lacO]-capA(pZM1-2B2C2A)。
按照同样的方法构建其他重组质粒：pZM1-1×[lacO]-capB-2×[lacO]-capC-2×[lacO]-capA(pZM1-1B2C2A)、pZM1-4×[lacO]-capB-2×[lacO]-capC-2×[lacO]-capA(pZM1-4B2C2A)、pZM1-2×[lacO]-capB-1×[lacO]-capC-2×[lacO]-capA(pZM1-2B1C2A)、pZM1-2×[lacO]-capB-4×[lacO]-capC-2×[lacO]-capA(pZM1-2B4C2A)、pZM1-2×[lacO]-capB-2×[lacO]-capC-1×[lacO]-capA(pZM1-2B2C1A)和pZM1-2×[lacO]-capB-2×[lacO]-capC-4×[lacO]-capA(pZM1-2B2C4A)。
将得到的重组质粒转化到C.glutamicum F343中，对应构建基因工程菌BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL，其中，M代表中强度2×[lacO]调控，H代表高强度1×[lacO]调控，L代表低强度4×[lacO]调控。以基因工程菌BMCMAM作为对照，评价单独上调和下调CapB、CapC或CapA的表达水平对γ-PGA合成的影响。
谷氨酸棒杆菌转化方法(质粒)：(1)取单菌落接种至种子培养基中，32℃，120rpm培养过夜；将适量的种子培养物接种于感受态培养基中，使初始OD600＝0.3；30℃，120rpm培养使OD600＝0.7-0.8，4h左右；将培养基置于冰上10min，将菌液分装到离心管中，离心10min，4000rpm，获得菌株；用25ml冰浴10％甘油洗涤4遍；用1.5mL-2mL 10％甘油悬浮，用冰浴后的1.5mL Ep管分装，得到感受态细胞。(2)电击杯提前放置超净台吹洗，放置冰箱；
(3)取感受态细胞置于冰上融化，加入3-5μL DNA混合，加入电击杯中，1.8kV，5mS电转，电转后立即加入1mL BHIS至电极杯中悬浮；(4)悬浮后转至1.5mL EP管中，46℃，温育6min；(5)温育后于30℃，培养2h，使细胞复苏及表达抗性；(6)温育好后，12000rpm，离心1min，涂布至含有50μg/mL Kan+抗性的LBHIS平板1-2d。
实施例1：单独调控聚合酶基因的基因工程菌的构建
利用NCBI查找来自B.licheniformis ATCC9945a菌株的γ-PGA聚合酶基因capB、capC、capA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示，长度分别为1179bp、447bp和1167bp。设计包含Nde I和BamH I酶切位点的扩增引物(如表1)，按照上述基因工程菌BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL的构建方法，PCR扩增、双酶切、连接、转化和验证构建重组质粒pZM1(Ptac)-capB、pZM1(Ptac)-capC和pZM1(Ptac)-capA。然后利用同尾酶Avr II和Nhe I，对要串联的两个基因片段分别进行Nhe I和Sal I、Avr II和Sal I进行双酶切、连接、转化构建基因串联表达重组质粒，转化到C.glutamicum F343，在含有25μg/L的Kan培养基中进行筛选，挑取转化子进行菌落PCR，验证正确(如图1)，基因工程菌BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL构建成功。
图1中，M：DNA Marker；1：重组菌BMCMAM；2：重组菌BHCMAM；3：重组菌BLCMAM；4：重组菌BMCHAM；5：重组菌BMCLAM；6：重组菌BMCMAH；7：重组菌BMCMAL，在3800bp左右有明显条带，这与各重组质粒中多片段总长长度相一致，表明在C.glutamicum F343中利用不同数量的lacO单独调控γ-PGA聚合酶基因表达的基因工程菌构建成功。
表1本研究中用得到的引物
实施例2：基因工程菌BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL摇瓶发酵性能检测
将基因工程菌BMCMAM、BHCMAM、BLCMAM、BMCHAM、BMCLAM、BMCMAH、BMCMAL按照上述谷氨酸棒杆菌转化方法(质粒)方法进行摇瓶发酵，以基因工程菌BMCMAM作为对照，评价单独上调和下调CapB、CapC或CapA的表达水平对γ-PGA合成的影响。
(1)转录水平比较
结果如图2A(1)所示，菌株BLCMAM和BHCMAM菌株中capB的转录水平分别为菌株BMCMAM的83.22％和136.25％(P<0.05)；
如图2A(2)所示，菌株BMCLAM和BMCHAM中capC的转录水平分别约为菌株BMCMAM的83.72％和126.66％(P<0.01)；
如图2A(3)所示，菌株BMCMAL和BMCMAH中capA的转录水平分别为菌株BMCMAM的86.57％和129.88％(P<0.05)。
通过不同数量的[lacO]在转录水平上调控基因的表达水平。以上结果说明，通过1×[lacO]成功上调了capB，capC和capA的表达水平，通过4×[lacO]成功下调了capB，capC和capA的表达水平。
(2)γ-PGA产量及产率比较
结果如图2B(1)和2C(1)所示，在保持capC和capA表达水平不变的情况下，单独增强capB的表达水平，有利于γ-PGA的产生。随着capB的转录水平增加(从低到高)，γ-PGA产量增加了14.88％(从4.80到5.51g/L)，γ-PGA产率增加了35.44％(从0.18g/L/OD600增加到0.24g/L/OD600)。其中，γ-PGA产量提高幅度低是由于基因表达水平的提高造成了菌株的代谢负担，菌株的生长受到不利影响。
如图2B(2)和2C(2)所示，在保持capB和capA表达水平不变的情况下，单独增强capC的表达水平，也有利于γ-PGA的产生。随着capC的转录水平增加(从低到高)，γ-PGA产量增加了43.82％(从4.06到5.84g/L)，γ-PGA产率增加了76.53％(从0.15g/L/OD600增加到0.27g/L/OD600)。
然而，如图2B(3)和2C(3)所示，在保持capB和capC表达水平不变的情况下，单独增强capA的表达水平，随着capA转录水平的适度提高(从低到中)，γ-PGA产量增加15.02％(从4.21到4.84g/L)，γ-PGA产率增加了35.01％(从0.16g/L/OD600增加到0.22g/L/OD600)；而capA表达水平的进一步提高(从中到高)导致γ-PGA产量降低了25.02％(从4.84到3.63g/L)，γ-PGA产率降低了10.36％(从0.22g/L/OD600增加到0.20g/L/OD600)。
γ-PGA产量是指每升发酵液中合成的γ-PGA的重量，γ-PGA产率是指每升发酵液中1OD600的菌株合成的γ-PGA的重量。以上γ-PGA产量及产率比较的结果说明，单独提高CapB和CapC的表达强度，及适度表达CapA均有利于γ-PGA的合成。
实施例3：CapB、CapC、CapA表达水平对γ-PGA合成的贡献度分析
方差分析是检验多组样本均值间的差异是否具有统计意义的一种方法。采用SPSS软件的ANOVA Models(方差分析)，对CapB，CapC和CapA的表达水平因素指标进行显著性分析，然后分析CapB，CapC和CapA的表达水平3个因素对γ-PGA合成的贡献度。
结果表明，capB，capC和capA的贡献分别为20.03％、68.24％和11.73％，表明CapC的表达水平对γ-PGA产率的影响最大，其次是CapB和CapA的表达水平(图3)。因此，CapC对于γ-PGA的合成发挥着至关重要的作用。贡献度最大的CapC的表达水平可以作为之后研究中主要调控的对象，此结果为后续提高γ-PGA产率的研究提供了重要的研究方向。
综上，本发明利用操纵子工程探究了不同单体蛋白的表达强度对γ-PGA合成的影响，将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ-PGA合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达，并使用操纵子工程调控单体capB，capC和capA的表达强度，发现单独提高CapB和CapC的表达强度，适度表达CapA均有利于γ-PGA的合成，而且CapC对于γ-PGA的合成发挥着至关重要的作用，其表达水平对γ-PGA产量的影响贡献度可达68.24％。本发明首次对γ-PGA合成酶的各单体展开研究，结果有助于深入了解γ-PGA合成酶单体的功能，以及对γ-PGA合成的影响规律。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 调控CapBCA单体表达水平的菌株及在聚谷氨酸生产中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1182
<212> capB
<213> DNA/RNA
<400> 1
atgtgggtaa tgctattagc ctgtgtgatc gttgttggga tcggcattta tgaaaaaagg 60
cgccaccagc aaaacatcga tgcgctgcct gtccgagtga acatcaacgg gatacgcgga 120
aagtccacgg tgacaagatt aacaacaggg atattaatcg aggcaggcta caaaacagta 180
ggaaaaacaa ccgggacaga cgcaaggatg atttattggg acacaccgga agagaaaccg 240
atcaaaagaa aacctcaagg cccgaatatc ggagaacaga aagaggttat gaaagaaacg 300
gtggaaagag gggccaatgc gattgtcagt gagtgcatgg ccgttaaccc tgattaccaa 360
atcatctttc aggaagaatt gcttcaggct aatatcggcg tgatcgtgaa cgtgctggaa 420
gatcacatgg atgtgatggg accgactttg gatgaaattg cagaagcttt cacagcaacc 480
attccttata atggacattt agttatcact gatagtgagt ataccgattt ctttaagcag 540
attgcaaaag aaaggaacac aaaagtcatc gtcgcagaca attctaaaat aacagatgaa 600
tacctcagac agtttgagta catggtattc cctgataatg cgtctcttgc gctcggtgtg 660
gctcaagcgt tgggtattga cgaagaaacc gcttttaaag gcatgctgaa tgcgccgcct 720
gatccgggag ccatgagaat tctgccgctg atgaacgcca aaaaccccgg acatttcgtc 780
aacggttttg cggccaatga cgcagcttcg actttaaaca tttggaagcg tgtaaaagaa 840
ataggctatc ctacggatca gccgatcgtc attatgaact gccgcgccga cagggtagac 900
agaacacagc agtttgcgga agatgtcctt ccttatattg aagcaagtga acttgtgctg 960
attggagaaa caacagagcc gatcgtcaaa gcgtatgaag caggcaaaat tcctgcggac 1020
aagctgtttg attttgagca caaatcaacg gaagaaatca tgtttatgct gaaaaacaag 1080
cttgagggcc gcgtcattta cggagtcgga aatatccacg gagcagcgga gcctctcatt 1140
gaaaaaatac aagattacaa gattaagcag ctcgttagct ag 1182
<210> 2
<211> 450
<212> capC
<213> DNA/RNA
<400> 2
atgtttggat cagatttata tatcgccctc attttaggag tcttactcag tttgattttt 60
gcagagaaaa cgggaattgt accagccggc ctcgtcgtac cgggttattt gggacttgtg 120
ttcaatcagc cgattttcat gttgctcgtt ctttttgtca gtttgctgac gtatgtcatc 180
gtgaaattcg gactttccaa aattatgatt ctatatggac gcagaaaatt cgcagcgatg 240
ctgattacgg gaattctttt gaaaatcggt tttgatttta tatatccggt gatgccgttt 300
gagattgccg aattcagggg aatcggaatt atcgtgccgg ggctgatcgc gaataccatt 360
caaagacagg gattaacgat tacgcttgga agtacgcttt tattgagcgg agcaacattc 420
gtcattatgt atgcttacta tctaatctaa 450
<210> 3
<211> 1170
<212> capA
<213> DNA/RNA
<400> 3
atgaaaaaac aactgaactt tcaggaaaaa ctgctgaagc tgacgaagca ggagaaaaag 60
aaaacaaaca agcacgtctt tatcgtattg cccgttattt tctgtttaat gtttgtcttt 120
acttgggtcg gaagcgccaa aactccttcg caaatggaca aaaaagaaga tgccaagctt 180
acagctactt ttgtgggcga tatgatgatg ggaagaaacg tagaaaaagt gacaaacttg 240
cacggttcgg aaagtgtctt caaaaatgtg aagccgtact ttaatgtgtc agattttatc 300
acaggaaact ttgaaaaccc tgtaaccaat gcaaaggact atcaagaggc agaaaagaac 360
atccatctgc aaacgaatca agaatcagtc gaaacattga aaaagctgaa cttcagcgta 420
ctgaactttg ccaacaacca tgcgatggac tacggggaag acggtttgaa ggatacgctg 480
aataaattct caaatgagga tttggagctt gtcggagcag ggaataatct cgaagacgcg 540
aaacagcacg tatcctatca ggatgtgaac ggtgttaaaa tcgcaacgct cggttttaca 600
gacgtctaca cgaagaactt tacagccaaa aagaacagag gcggagtgct gccgctcagc 660
ccgaaaatct ttattccaat gatcgcggaa gcatccaaaa aagcggatat cgtccttgtc 720
cacgtgcact ggggacaaga atatgacaat gaaccgaacg ccagacagaa ggatctggct 780
aaagcgattg cggatgccgg agcagatgtc atcatcggcg ctcaccccca tgttctcgaa 840
ccgatcgaag tgtataacgg cactgtgatc ttctacagcc tcggaaactt tgtgtttgat 900
cagggctggt caagaacacg ggacagcgcg cttgtacaat accatttaat gaatgacggc 960
aaagggcgct ttgagataac gcctctcaac attcgcgaag caacaccgac gcctttaggc 1020
aagagcgatt tcttgaaacg aaaagcgatc ttccgtcaat tgacaaaagg aacaaacctc 1080
gactggaaag aagagaacgg aaaattgacg tttgaagtcg atcatgcgga caaactgaaa 1140
aataacaaaa acggagtggt gaacaaatga 1170
Claims (5)
1.一种调控CapBCA单体表达水平的方法，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌C. glutamicum为感受态细胞，利用操纵子工程单独调控γ-PGA合成酶基因簇capBCA的capB、capC、capA基因中每一个的表达水平，并进行串联表达，构建单独调控capBCA单体表达水平的基因工程菌；
所述γ-PGA合成酶基因簇capBCA选自地衣芽孢杆菌；
所述操纵子工程为：利用高强度1×lacO 单独调控capB基因，利用高强度1×lacO单独调控capC基因，利用中强度2×lacO单独调控capA基因；
调控后的γ-PGA合成酶基因簇为cap n1 B n2 C n3A，其中，n1、n2、n3分别为高强度1×lacO、高强度1×lacO和中强度2×lacO；
所述capB、capC、capA的序列分别如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.3所示；
以C. glutamicum F343为感受态细胞。
2.重组质粒，其特征在于，根据权利要求1所述的方法过程中形成，所述重组质粒为pZM1-n1B n2C n3A，其中，n1、n2、n3分别为高强度1×lacO、高强度1×lacO和中强度2×lacO。
3.单独调控capBCA单体表达水平的基因工程菌，其特征在于，根据权利要求1所述方法构建获得。
4.一种合成γ-PGA的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的基因工程菌合成聚谷氨酸，用于调控γ-PGA的产量和产率。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将所述基因工程菌的种子液，接种至发酵培养基，先于32±2 ℃培养1～2 h，加入IPTG诱导1～2 h，再于37±2 ℃培养48±2 h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210026910.1A CN114369561B (zh) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | 调控CapBCA单体表达水平的菌株及在聚谷氨酸生产的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210026910.1A CN114369561B (zh) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | 调控CapBCA单体表达水平的菌株及在聚谷氨酸生产的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114369561A CN114369561A (zh) | 2022-04-19 |
| CN114369561B true CN114369561B (zh) | 2024-07-02 |
Family
ID=81144577
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210026910.1A Active CN114369561B (zh) | 2022-01-11 | 2022-01-11 | 调控CapBCA单体表达水平的菌株及在聚谷氨酸生产的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114369561B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112175982A (zh) * | 2020-09-29 | 2021-01-05 | 江南大学 | 一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102004030938A1 (de) * | 2004-06-26 | 2006-01-12 | Henkel Kgaa | Neue, Polyaminosäuren bildende oder abbauende Genprodukte von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren |
| US20100248308A1 (en) * | 2007-09-20 | 2010-09-30 | Kazuhisa Sawada | Recombinant Microorganism and a Method for Producing Poly-Gamma-Glutamic Acid |
| CN103146630B (zh) * | 2013-03-13 | 2014-10-22 | 南通大学 | 生产γ-聚谷氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和用途 |
| CN107502585A (zh) * | 2017-09-06 | 2017-12-22 | 武汉骏安生物科技有限公司 | 一株高效合成聚‑γ‑谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌 |
| WO2020077293A1 (en) * | 2018-10-11 | 2020-04-16 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems and methods for compartment spatial organization |
| CN110066758A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-07-30 | 武汉骏安生物科技有限公司 | 一种高产聚-γ-谷氨酸的芽胞杆菌及其构建方法和应用 |
| CN113151136A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-07-23 | 江南大学 | 产γ-DL-PGA的菌株及其合成不同D/L单体比γ-PGA的方法 |
| CN113234764A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-10 | 江南大学 | 一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法 |
-
2022
- 2022-01-11 CN CN202210026910.1A patent/CN114369561B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112175982A (zh) * | 2020-09-29 | 2021-01-05 | 江南大学 | 一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114369561A (zh) | 2022-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110249054A (zh) | 产生imp的微生物和使用其产生imp的方法 | |
| CN111518806B (zh) | 巴氏醋酸杆菌启动子及其应用 | |
| CN109536428A (zh) | 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN113774075B (zh) | 一株大肠杆菌基因工程菌及其发酵生产l-茶氨酸的方法 | |
| CN111117942A (zh) | 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN111718936B (zh) | 一种铵盐诱导型启动子及其在调控目的基因表达中的应用 | |
| CN111057711B (zh) | 鞘氨醇单胞菌工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN106995794A (zh) | 一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株及其构建方法与用途 | |
| US20210324391A1 (en) | Recombinant microorganism, preparation method therefor and application thereof in producing coenzyme q10 | |
| CN114369561B (zh) | 调控CapBCA单体表达水平的菌株及在聚谷氨酸生产的应用 | |
| CN112175982B (zh) | 一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN102382790B (zh) | 一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN113151136A (zh) | 产γ-DL-PGA的菌株及其合成不同D/L单体比γ-PGA的方法 | |
| CN114058561B (zh) | 一种n-乙酰氨基葡萄糖生产菌株及其应用 | |
| CN116042660A (zh) | 一种替换PgsA来源的γ-PGA合成酶的基因簇及其合成聚谷氨酸的方法 | |
| CN110055201A (zh) | 一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 | |
| CN104877997B (zh) | 一个特异响应渗透胁迫信号的启动子及应用 | |
| WO2023115997A1 (zh) | 一种用于生产异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 | |
| CN110938663B (zh) | 一种基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法 | |
| CN114196607A (zh) | 一种生产phb的运动发酵单胞菌的构建方法及其应用 | |
| CN113234764A (zh) | 一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法 | |
| CN113136382A (zh) | 基于CRISPRi调控的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法 | |
| CN114231475B (zh) | 一种高效表达gdh的工程菌株及其制备方法和应用 | |
| CN118291492A (zh) | 替换PgsBC来源改变聚谷氨酸产量和分子量的方法 | |
| CN114606172B (zh) | 一种提高血红素产量的解淀粉芽胞杆菌工程菌及其构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |