CN110938663B - 一种基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于改造核糖体结合位点提高ε‑己内酯产量的方法。该方法以pRSFDuet为出发载体，将chmo基因和RBS₂₁‑adh序列插入空载pRSFDuet中，得到pRSF‑RBS₁₀‑CHMO‑RBS₂₁‑ADH载体；根据核糖体结合位点的特征，设计新的CHMO RBS序列，构建含CHMO RBS序列的重组菌株，并诱导重组菌株表达ADH蛋白和CHMO蛋白后，收集活细胞进行静息催化，实现环己醇被催化高产ε‑己内酯。本发明提供的方法中得到的重组菌株能在16h内完全催化60mM环己醇，得到43.98mM的ε‑己内酯。该方法高效，周期短，节约资源，为工业高产ε‑己内酯提供了可能性。

Description

一种基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法

技术领域

本发明涉及ε-己内酯合成领域，具体涉及一种基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法。

背景技术

ε-己内酯，无色油状液体，具有芳香气味，一种无毒的重要的有机化合物中间体。该物质在工业应用范围广泛，可用于合成橡胶、合成纤维和合成树脂方面的生产；可用于制造己内酰胺、己二酸、粘合剂、涂料、环氧树脂稀释剂和溶剂；也可与各种树脂掺合改善其光泽、透明性和防粘性；还可用于医学材料，模拟人体皮肤等。目前，工业上生产-己内酯的能力已达到上万吨的规模。

目前，ε-己内酯的生产方法有两种：化学氧化法和生物转化法。工业上主要用UCC(Union Carbide Corporation)化学法产ε-己内酯，通过添加过氧酸氧化底物环己酮得到目的产物。在该方法中，会伴随一些非环境友好型的有机试剂，会对环境造成污染。由于化学法操作繁琐、环境问题严重等缺点，通过更为安全和高效的生物催化法越来越受欢迎。

内酯主要是通过Baeyer-Villiger氧化环酮实现，其中主要是通过过氧化物使临近羰基的C-C键的氧化裂解，从而嵌入一个氧原子。而这个氧化反应，同样也可以通过有过氧化结构存在的路易斯酸或Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)实现。早些年，研究人员利用BVMO家族的环己酮单加氧酶CHMO催化环己酮转化成ε-己内酯。其中，在不动杆菌属(Acinetobacter).NCIMB 9871中发现的环己酮单加氧酶CHMO是应用最未广泛的酶。但反应过程不仅需要氧气的参与，还需要辅助因子(NADPH)的参与。这使得整个反应的成本大大提高。而近期，以线性级联方式合成内酯的完全酶促方法(即单一中间体中间单一产物)越来越受关注。该级联方法用于ε-己内酯合成，其中以环己醇为原料，在分子氧(以空气的形式)作为氧化试剂的条件下，将环己酮单加氧酶CHMO和醇脱氢酶ADH偶联一步氧化成ε-己内酯(Schmidt S,Scherkus C,Muschiol J,et al.An Enzyme Cascade Synthesis of ε-Caprolactone and its Oligomers[J].Angewandte Chemie International Edition,2015,54(9):2784-2787.)。反应过程需要环己酮单加氧酶CHMO和醇脱氢酶ADH的参与，有效地使还原力NADPH循环再生和利用。然而，由于CHMO酶稳定性差、酶活性低等问题，使得双酶在表达和催化过程中处于一种不平衡的状态。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法。该方法能有效地解决酶蛋白表达量少、双酶共表达不平衡以导致反应底物浓度转化率低的问题，并将该方法应用于醇脱氢酶ADH和环己酮单加氧酶CHMO双酶在大肠杆菌异源共表达并催化环己醇产ε-己内酯。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法，通过改变核糖体结合位点序列，调节从环己醇到ε-己内酯催化过程两个关键酶醇脱氢酶ADH和环己酮单加氧酶CHMO的表达量，从而实现反应过程中辅因子NADPH的循环和再生，进而实现ε-己内酯高产。该方法是一种能够实现更有效地双酶共表达，使得细胞体内还原力NADPH再生及利用的高效便捷的方法(图1)。

本发明提供的一种基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法，包括如下步骤：

(1)将chmo序列和RBS₂₁-adh序列插入pRSFDuet载体中，得到重组质粒pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH；

(2)根据步骤(1)所述重组质粒pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH设计chmo序列的核糖体结合位点序列，得到RBS₁₁序列；

(3)将步骤(2)所述RBS₁₁序列利用同源重组的方法替换chmo序列的核糖体结合位点序列，得到重组质粒pRSF-RBS₁₁-CHMO-RBS₂₁-ADH；

(4)将步骤(3)所述重组质粒pRSF-RBS₁₁-CHMO-RBS₂₁-ADH导入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，得到工程菌株；

(5)诱导步骤(4)所述工程菌株表达蛋白，收菌，进行全细胞催化环己醇产ε-己内酯反应，得到ε-己内酯。

进一步地，步骤(2)所述RBS₁₁序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，步骤(2)中，使用PrimerPremier设计chmo序列的核糖体结合位点序列。

进一步地，步骤(5)所述诱导工程菌株表达蛋白，包括：将工程菌株置于LB液体培养基中培养至对数生长期，然后往LB液体培养基中加入IPTG诱导ADH蛋白和CHMO蛋白的表达。

进一步地，所述诱导的温度为28-32℃，诱导过程中LB液体培养基置于转速为150-200rpm的摇床上，在LB液体培养基中，所述IPTG的终浓度为0.2-0.6mM。

进一步地，步骤(5)所述全细胞催化环己醇产ε-己内酯反应的温度为23-25℃，全细胞催化环己醇产ε-己内酯反应是在转速为100-150rpm的摇床上进行的，全细胞催化环己醇产ε-己内酯反应的时间为14-20h。

优选地，在步骤(5)进行诱导表达后，收集并重悬菌体至100g/L，再进行全细胞催化环己醇产ε-己内酯反应(静息催化)。

本发明提供的基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法是一种平衡双酶表达量的方法。该方法以pRSFDuet为出发载体，将合成的chmo基因和RBS₂₁-ADH基因插入空载pRSFDuet中，得到pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH载体。并设计和合成了新的CHMO核糖体结合位点序列(RBS₁₁-RBS₁₅)，再利用同源重组的方法替换原始CHMO的RBS₁₀，得到新的质粒载体。化学法转入大肠杆菌细胞后，进行诱导表达，再利用表达了蛋白的全细胞催化不同浓度的环己醇，择优选出使得己内酯转化率最高的质粒载体。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供的基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法，利用核糖体结合位点的结构特征，设计并得到5条新的CHMO RBS序列，调节从环己醇到ε-己内酯催化过程中ADH和CHMO双酶的表达量，也进一步解决了酶链反应中辅助因子NADPH的再生和消耗，进而实现ε-己内酯高产。

附图说明

图1为大肠异源催化环己醇产ε-己内酯的示意图；

图2为大肠杆菌产ε-己内酯的实验流程图；

图3为醇脱氢酶(ADH)和环己酮单加氧酶(CHMO)表达量的SDS-PAGE检验；

图4为实施例中6株工程菌株(BR01-BR06)催化不同浓度环己醇的结果示意图，a)、b)分别表示催化40/60mM环己醇的结果示意图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

以下实施例提供的一种基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法，包括如下步骤：

1)先将chmo和RBS₂₁-adh插入pRSFDuet载体中，得到重组质粒pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH；

2)然后以构建好的pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH质粒为出发载体，利用核糖体结合位点的序列结构特征设计5个新的CHMO RBS序列；

3)合成5个新的CHMO RBS序列并利用同源重组的方法替换CHMO原有的RBS序列，得到新的载体；

4)将5个新的载体分别导入大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，得到新的5株工程菌株；

5)诱导6株工程菌株表达蛋白并收菌，供后期全细胞催化备用。

实施例1醇脱氢酶ADH和环己酮单加氧酶CHMO双酶共表达载体的构建

以从Invitrogen公司购得的质粒pRSFDuet为出发载体，在该载体中的NcoI和PstI位点插入chmo基因，然后通过同源臂重组技术将RBS₂₁-adh引入pRSFDuet载体的多克隆位点MCS 2中，得到重组质粒pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH。具体实施如下：

1.chmo和RBS₂₁-adh基因表达元件的克隆

在Sangon Biotech公司合成的CHMO基因(CHMO序列见SEQ ID NO:7)插入pUC57载体上，以pUC57-CHMO为出发载体，以CHMO-f(5′-TTTACACCATGGGCAGCAGCCATCA-3′)/CHMO-r(5′-TTTACACTGCAGTTATGCGTTAGCC-3′)引物对扩增chmo基因。在Sangon Biotech公司合成的RBS₂₁-ADH序列(RBS₂₁-ADH序列见SEQ ID NO:6)插入pUC57载体上，以pUC57-ADH为出发载体，，以RBS₂₁-ADH-f(5′-CCCCATCTTAGTATATTAGTTA-3′)/RBS₂₁-ADH-r(5′-AGCAGCGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTACTGCGCGGTG-3′)引物对扩增RBS₂₁-adh基因。

2.pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH重组载体的构建

以从Invitrogen公司购得的质粒pRSFDuet为出发载体，将扩增得到的chmo基因片段插到NcoI和PstI双酶切的pRSFDuet载体上，标记为pRSF-CHMO。以pD-f(5′-ACTAATATACTAAGATGGGGAATTGTTA-3′)/pD-r(5′-TCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAA-3′)和RBS₂₁-ADH-f(5′-CCCCATCTTAGTATATTAGTTA-3′)/RBS₂₁-ADH-r(5′-AGCAGCGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTACTGCGCGGTG-3′)两对引物对分别扩增出来的pRSF载体骨架和RBS₂₁-adh基因，经常规的连接转化，获得含有adh和chmo双基因表达盒的pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH的重组载体。

实施例2含不同的CHMO RBS的重组菌株的构建

以构建好的pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH的重组载体为出发载体，利用核糖体结合位点的序列结构特征设计5个新的CHMO RBS序列(设计软件为RBS Calculator v2.0)，合成新的CHMO RBS序列后，替换原有的CHMO RBS序列，得到新的重组载体。具体实施如下：

1.利用核糖体结合位点的结构特征设计5个新的CHMO RBS序列，这5个新的CHMORBS序列分别命名为RBS₁₁(如SEQ ID NO:1所示)、RBS₁₂(如SEQ ID NO:2所示)、RBS₁₃(如SEQID NO:3所示)、RBS₁₄(如SEQ ID NO:4所示)及RBS₁₅(如SEQ ID NO:5所示)。

2.设计并合成带有新的CHMO核糖体结合位点序列的五对引物对(RBS₁₁-f/RBS₁₁-r、RBS₁₂-f/RBS₁₂-r、RBS₁₃-f/RBS₁₃-r、RBS₁₄-f/RBS₁₄-r、RBS₁₅-f/RBS₁₅-r)。

3.PCR扩增含不同CHMO核糖体结合位点序列(RBS₁₁-RBS₁₅)的表达载体片段。

以构建好的pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH的重组载体为模板，以CR-f(5′-ATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAAT-3′)/RBS₁₁-r(5′-GACTCCTCCTTAATGATAGAAATTAAAGTTAAACAAAATTA-3′)，CR-r(5′-GCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATA-3′)/RBS₁₁-f(5′-TTCTATCATTAAGGAGGAGTCCCATGGGCAGCAGCCATCAC-3′)引物对，分别扩增含RBS₁₁-CHMO的pRSF载体骨架的两个片段RBS11-1和RBS11-2。

以构建好的pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH的重组载体为模板，以CR-f(5′-ATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAAT-3′)/RBS₁₂-r(5′-AAAAAGTCTCCTTAGTATTTATTAAAGTTAAACAAAATTA-3′)，CR-r(5′-GCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATA-3′)/RBS₁₂-f(5′-AAATACTAAGGAGACTTTTTCCATGGGCAGCAGCCATCACCA-3′)引物对，分别扩增含RBS₁₂-CHMO的pRSF载体骨架的两个片段RBS12-1和RBS12-2。

以构建好的pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH的重组载体为模板，以CR-f(5′-ATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAAT-3′)/RBS₁₃-r(5′-AAAAAAGCTCCTTATTAAATGTTGATTAAAGTTAAACAAAATTA-3′)，CR-r(5′-GCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATA-3′)/RBS₁₃-f(5′-CAACATTTAATAAGGAGCTTTTTTCCATGGGCAGCAGCCATCA-3′)引物对，分别扩增含RBS₁₃-CHMO的pRSF载体骨架的两个片段RBS13-1和RBS13-2。

以构建好的pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH的重组载体为模板，以CR-f(5′-ATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAAT-3′)/RBS₁₄-r(5′-GTATTACCTCCTTAAAGAAGGGTTTATTAAAGTTAAACAAAATTA-3′)，CR-r(5′-GCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATA-3′)/RBS₁₄-f(5′-AAACCCTTCTTTAAGGAGGTAATACCCATGGGCAGCAGCCATCAC-3′)引物对，分别扩增含RBS₁₄-CHMO的pRSF载体骨架的两个片段RBS14-1和RBS14-2。

以构建好的pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH的重组载体为模板，以CR-f(5′-ATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAAT-3′)/RBS₁₅-r(5′-AAGAATACCTCCTTACTTTTGATTAAAGTTAAACAAAATTA-3′)，CR-r(5′-GCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATA-3′)/RBS₁₅-f(5′-CAAAAGTAAGGAGGTATTCTTCCATGGGCAGCAGCCATCA-3′)引物对，分别扩增含RBS₁₅-CHMO的pRSF载体骨架的两个片段RBS15-1和RBS15-2。

4.含有不同CHMO核糖体结合位点(RBS₁₁-RBS₁₅)的五种重组载体的构建

利用

II重组克隆试剂盒，将克隆的RBS11-1和RBS11-2两个片段重组，获得携带ADH和RBS₁₁-CHMO序列的重组载体pRSF-RBS₁₁-CHMO-RBS₂₁-ADH。

利用

II重组克隆试剂盒，将克隆的RBS12-1和RBS12-2两个片段重组，获得携带ADH和RBS₁₂-CHMO序列的重组载体pRSF-RBS₁₂-CHMO-RBS₂₁-ADH。

利用

II重组克隆试剂盒，将克隆的RBS13-1和RBS13-2两个片段重组，获得携带ADH和RBS₁₃-CHMO序列的重组载体pRSF-RBS₁₃-CHMO-RBS₂₁-ADH。

利用

II重组克隆试剂盒，将克隆的RBS14-1和RBS14-2两个片段重组，获得携带ADH和RBS₁₄-CHMO序列的重组载体pRSF-RBS₁₄-CHMO-RBS₂₁-ADH。

利用

II重组克隆试剂盒，将克隆的RBS15-1和RBS15-2两个片段重组，获得携带ADH和RBS₁₅-CHMO序列的重组载体pRSF-RBS₁₅-CHMO-RBS₂₁-ADH。

5.产ε-己内酯的工程菌株的构建

将pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH，pRSF-RBS₁₁-CHMO-RBS₂₁-ADH，pRSF-RBS₁₂-CHMO-RBS₂₁-ADH，pRSF-RBS₁₃-CHMO-RBS₂₁-ADH，pRSF-RBS₁₄-CHMO-RBS₂₁-ADH，pRSF-RBS₁₅-CHMO-RBS₂₁-ADH六种不同的质粒分别转入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，获得六株工程菌，分别命名为BR01、BR02、BR03、BR04、BR05、BR06。

实施例3诱导工程菌表达两个关键酶并高产ε-己内酯

实施例2构建的工程菌株，从-80℃活化至含卡那霉素的LB平板后，挑取单菌落接种到液体培养基，在30℃，220rpm摇床中培养12小时。基于此，接种至摇瓶后，诱导菌株表达环己醇脱氢酶ADH和环己酮单加氧酶CHMO(如图2所示)。具体实施如下：

1.醇脱氢酶ADH和环己酮单加氧酶CHMO的诱导表达

将培养的菌液按1:100的体积比接种于300mL LB液体培养基中，30℃，220rpm摇床培养。液体LB培养基提前灭菌并添加卡纳霉素，使其终浓度为50μg/mL。培养2-2.5h至OD₆₀₀在0.5-0.7之间，即对数生长期时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)，至终浓度为0.5mM。诱导条件为30℃，180rpm。诱导7h后，测菌液OD₆₀₀值，并于5000rpm，4℃，离心10min，收集菌体。

2.SDS-PAGE电泳检测醇脱氢酶ADH和环己酮单加氧酶CHMO的蛋白表达量

将离心收集的菌体用pH 7.0的PB缓冲溶液重悬至10OD₆₀₀/mL。取1mL菌体悬浮液用超声破碎仪破碎。破碎后的菌液于4℃，8000rpm离心8min，随后将上清与沉淀分离，且用与上清等体积的pH 7.0的PB缓冲溶液重悬沉淀，分别得到上清和沉淀。

于1.5mL离心管中加入20μL 5×loading buffer以及80μL的上清或沉淀样品，煮沸10min，通过SDS-PAGE电泳分析ADH和CHMO蛋白的表达情况。

结果如图3所示，BR01-BR06这六株工程菌株经诱导表达后均能表达出预期大小的ADH蛋白(62.3kDa)和CHMO蛋白(26.8kDa)。且BDR02菌株的CHMO蛋白表达量高于BR01和其它工程菌株CHMO蛋白表达量，这说明通过改变CHMO核糖体结合位点的序列能影响翻译起始速率，从而影响蛋白的表达量。

3.工程菌在摇瓶里催化环己醇

将诱导收集的菌体用pH 7.5的Tris-HCl(含1wt％NaCl)缓冲溶液重悬至100g/L后，每株工程菌株取3mL的细胞悬浮液于5mL离心管中，加入30μL二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，慢摇混匀后置于冰上30min。

随后，将细胞悬浮液于1344g，4℃，离心30min，弃掉上清。每管菌体用pH 7.5的Tris-HCl(含1wt％NaCl)缓冲溶液重悬至3mL，并在相同的条件下再次离心去上清。再次重复上述重悬操作后，得到细胞悬浮液放于4℃备用。于50mL锥形瓶配制如下体系(如下表1所示)。

表1

试剂	体积
		pH 7.5的Tris-HCl(含1wt％NaCl)缓冲液	9mL
100g/L的细胞悬浮液	1mL
		环己醇	41.6μL(40mM)/62.4μL(60mM)

先于锥形瓶中加入pH 7.5的Tris-HCl(含1wt％NaCl)缓冲液，环己醇并混匀，最后分别加入1mL六株工程菌株的悬浮液，对照组加入相同体积的pH7.5的Tris-HCl(含1wt％NaCl)缓冲液。催化前，于对照组取500μL的样品作为环己醇的实际投入量。将加入细胞悬浮液的锥形瓶用封口膜封口，并置于25℃摇床中，120rpm，培养16h。每株工程菌有3个平行组。

实施例4ε-己内酯的检测

待实施例3中的重组工程菌株催化结束后，取500μL反应混合液于2mL离心管中，加入500μL的乙酸乙酯(含2mM苯乙酮)振荡萃取15min。随后，将离心管置于离心机中，于1200rpm，离心5min。取200μL有机相于含有600μL乙酸乙酯(含2mM苯乙酮)的离心管中，稀释4倍。最后，用0.22μm无菌有机相滤头过滤到干净的气相色谱瓶中。

检测有机相成分含量用的是型号为Hewlett-Packard 7890的气相色谱仪，色谱柱为HP-5，规格为10m×0.10mm×0.10μm，检测器为氢火焰检测器(FID)，设置的程序如下：1μL样品分流进样，分流比30:1，检测器温度为250℃，柱相初始温度为37℃，以10℃/min的速率升温至160℃，再以10℃/min的速率升温至220℃，总时间为15.3min。

结果如图4所示，工程菌株BR01-BR06均能催化环己醇产ε-己内酯，且不同的CHMO核糖体结合位点(RBS)不仅能影响CHMO蛋白的表达情况(见实施例3)，而且也能影响ε-己内酯的产量。

图4的a)部分为6株工程菌株(BR01-BR06)催化40mM环己醇的结果示意图；图4的b)部分为6株工程菌株(BR01-BR06)催化60mM环己醇的结果示意图；其中，这6株工程菌株(BR01-BR06)携带不同的质粒。其中，BR01中携带pRSF-RBS10-CHMO-RBS21-ADH质粒；BR02中携带pRSF-RBS11-CHMO-RBS21-ADH质粒；BR03中携带pRSF-RBS12-CHMO-RBS21-ADH质粒；BR04中携带pRSF-RBS13-CHMO-RBS21-ADH质粒；BR05中携带pRSF-RBS14-CHMO-RBS21-ADH质粒；BR06中携带pRSF-RBS15-CHMO-RBS21-ADH质粒。

在催化40mM环己醇时，16小时后，BR02工程菌能产31.82mM的ε-己内酯，转化率高达76.93％。而对照工程菌株的产量为29.47mM，转化率为73.67％。值得一提的是，在催化高浓度(60mM)底物时，工程菌株产ε-己内酯的差异更为明显。工程菌株BR02的ε-己内酯产量为42mM，是对照工程菌株BR01的1.67倍。这说明高浓度底物的抑制作用对BR02工程菌株的影响比其他工程菌株更低，也为工业上高产ε-己内酯的实施提供了技术支持。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 1

ttctatcatt aaggaggagt ccc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 2

aaatactaag gagacttttt cc 22

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 3

caacatttaa taaggagctt ttttcc 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 4

aaacccttct ttaaggaggt aataccc 27

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 5

caaaagtaag gaggtattct tcc 23

<210> 6

<211> 773

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 6

aacgagatat acatatgacg gatcgtctga aaggcaaagt tgcgatcgtt accggcggca 60

ccctgggcat cggtctggcg atcgcggata aattcgttga agaaggcgcg aaagttgtta 120

tcaccggccg tcacgcggat gttggtgaaa aagcggcgaa aagcatcggc ggcaccgatg 180

ttatccgttt cgttcagcac gacgcgagcg atgaagcggg ctggaccaaa ctgttcgata 240

ccaccgaaga agcgttcggt ccggttacca ccgttgttaa caacgcgggc atcgcggtta 300

gcaaatccgt tgaagatacc accaccgaag aatggcgtaa actgctgtct gttaacctgg 360

acggcgtttt cttcggcacc cgtctgggca tccagcgtat gaaaaacaaa ggcctgggtg 420

cgagcatcat caacatgagc agcatcgaag gcttcgtggg cgatccgacc ctgggtgcgt 480

acaacgcgag caaaggcgca gttcgtatca tgagcaaaag cgcggcgctg gattgcgcgc 540

tgaaagatta cgatgttcgt gttaacaccg ttcatccggg ttacatcaaa accccgctgg 600

ttgatgatct ggaaggtgcg gaagaaatga tgtctcagcg taccaaaacc ccgatgggtc 660

acatcggcga accgaacgat atcgcgtgga tctgcgttta cctggcgagc gatgaatcta 720

aattcgcaac cggtgcggaa ttcgttgttg atggtggtta caccgcgcag taa 773

<210> 7

<211> 1634

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 7

gatccagcca gaaaatggat ttcgatgcta tcgttatcgg cggtggtttc ggcggcctgt 60

acgcggttaa aaaactgcgt gatgaactgg aactgaaagt tcaggcgttc gataaagcga 120

ccgatgttgc tggtacttgg tactggaacc gttatccggg tgcgctgacc gacaccgaaa 180

cccacctgta ctgctactct tgggataaag aactgctcca gagcctggaa atcaagaaaa 240

aatacgttca aggcccggat gttcgtaaat acctgcaaca ggtggcagaa aaacacgatc 300

tgaaaaaatc ttaccagttt aacaccgcgg ttcagagcgc gcactataac gaagctgacg 360

cactgtggga agttaccacc gaatacggtg ataaatatac cgctcgtttc ctgatcaccg 420

cgctgggcct gctgtctgcg ccgaacctgc cgaacatcaa aggcatcaac cagttcaaag 480

gtgaactgca ccacacctcc cgttggccgg atgatgtttc cttcgaaggt aaacgtgtgg 540

gtgttatcgg caccggttct accggtgttc aggtgatcac cgctgttgcg ccgctggcga 600

aacacctgac cgttttccag cgtagcgcgc agtacagcgt tccgattggt aacgatccgc 660

tgagcgaaga agatgttaaa aagatcaaag ataactatga taaaatttgg gacggcgttt 720

ggaactctgc gctggcattc ggtctgaacg aatctaccgt gccggcgatg agcgttagcg 780

ctgaagaacg taaagcggtt ttcgaaaaag catggcagac cggtggcggt ttccgtttca 840

tgttcgaaac cttcggtgac attgcgacca acatggaagc gaacatcgaa gctcagaact 900

tcattaaagg taaaattgcg gaaatcgtta aagatccggc aatcgcgcag aaactgatgc 960

cgcaggatct gtacgcaaaa cgcccgctgt gcgatagcgg ttactacaac accttcaacc 1020

gtgataacgt tcgcctggaa gatgttaaag ctaacccgat cgttgaaatc accgaaaacg 1080

gtgttaaact ggaaaacggc gacttcgtgg aactggatat gctgatcctg gcgaccggct 1140

tcgatgcggt tgacggtaac tacgttcgta tggatatcca gggcaaaaac ggtctggcga 1200

tcaaagatta ctggaaagaa ggtccgtcta gctacatggg tgtttgcgtt aacaactatc 1260

cgaacatgtt catggttctc ggcccgaacg gtccgttcac caacctgccg ccgagcattg 1320

aatcccaggt tgaatggatc agcgacacca tccagtacac cgttgaaaac aacgttgaaa 1380

gcatcgaatg caccaaagaa gcggaagaac agtggaccca gacctgcgcg aacatcgcgg 1440

aaatgaccct gttcccgaaa gcgcagtctt ggatcttcgg cgcgaacatt ccgggtaaaa 1500

agaacaccgt gtatttctac ctgggtggtc tgaaagaata ccgttctgct ctggcgaact 1560

gcaaaaacca cgcttacgaa ggcttcgata tccagttgca gcgtagcgat attaaacagc 1620

cggctaacgc ataa 1634

Claims (5)

1.一种基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将chmo序列和RBS₂₁-adh序列插入pRSFDuet载体中，得到重组质粒pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH，所述chmo序列如SEQ ID NO:7所示，RBS₂₁-ADH序列如SEQ ID NO:6所示；

(2)根据步骤(1)所述重组质粒pRSF-RBS₁₀-CHMO-RBS₂₁-ADH设计chmo序列的核糖体结合位点序列，得到RBS₁₁序列，所述RBS₁₁序列如SEQ ID NO.1所示；

(3)将步骤(2)所述RBS₁₁序列利用同源重组的方法替换chmo序列的核糖体结合位点序列，得到重组质粒pRSF-RBS₁₁-CHMO-RBS₂₁-ADH；

(4)将步骤(3)所述重组质粒pRSF-RBS₁₁-CHMO-RBS₂₁-ADH导入大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，得到工程菌株；

(5)诱导步骤(4)所述工程菌株表达蛋白，收菌，进行全细胞催化环己醇产ε-己内酯反应，得到ε-己内酯。

2.根据权利要求1所述的基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法，其特征在于，步骤(2)中，使用在线软件RBS Calculator v2.0设计chmo基因前的核糖体结合位点序列。

3.根据权利要求1所述的基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法，其特征在于，步骤(5)所述诱导工程菌株表达蛋白，包括：将工程菌株置于LB液体培养基中培养至对数生长期，然后往LB液体培养基中加入IPTG诱导ADH蛋白和CHMO蛋白的表达。

4.根据权利要求3所述的基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法，其特征在于，所述诱导的温度为28-32℃，诱导过程中LB液体培养基置于转速为150-200rpm的摇床上，在LB液体培养基中，所述IPTG的终浓度为0.2-0.6mM。

5.根据权利要求1所述的基于改造核糖体结合位点提高ε-己内酯产量的方法，其特征在于，步骤(5)所述全细胞催化环己醇产ε-己内酯反应的温度为23-25℃，全细胞催化环己醇产ε-己内酯反应是在转速为100-150rpm的摇床上进行的，全细胞催化环己醇产ε-己内酯反应的时间为14-20h。

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