ES2600793T3

ES2600793T3 - Método para la preparación de plasma rico en plaquetas para usos no procesados y su combinación con las células de piel y hueso

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Publication number: ES2600793T3
Application number: ES07802770.3T
Authority: ES
Inventors: Antoine Turzi; Donald François DU TOIT
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-08-21
Filing date: 2007-08-21
Publication date: 2017-02-10
Anticipated expiration: 2027-08-21
Also published as: US20170258839A1; US20210030805A1; PL2073862T3; PL3111974T3; ES2831708T3; EP3111974A3; EP2073862B1; EP4137173A1; US20180042964A1; US20220313740A1; US20090317439A1; US9833478B2; EP3395383B1; US20180036346A1; US10064894B2; US20170080028A1; US11096966B2; WO2008023026A3; US20160158286A1; US20210330709A1

Abstract

Un proceso para la preparación de una composición celular, que comprende los pasos de: (a) centrifugar a sangre completa en un tubo separador seleccionado de: - Un tubo separador de vidrio que contiene un gen tixotrópico que se basa en poliéster y una solución amortiguada de citrato de sodio a 0.10 M; y - Un tubo separador de tereftalato de polietileno que contiene un gel altamente tixotrópico formado por una mezcla polimérica y un citrato anhídrido de sodio a 3.5 miligramos/mililitro; (b) Separar al plasma enriquecido con plaquetas del plasma completo al remover alrededor de la mitad del sobrenadante que contenía plasma con niveles bajos de plaquetas; (c) Suspender nuevamente el plasma enriquecido; donde el paso de centrifugación a) se realiza con una fuerza de, o alrededor de, 1500 g a 2000 g durante un período suficiente de tiempo para formar una barrera entre el plasma que contiene plaquetas, linfocitos y a monocitos y un pellet que contiene a eritrocitos; el paso de separación b) se realiza mediante la recolección del sobrenadante de la parte de encima de dicha barrera y donde el plasma enriquecido esta enriquecido con leucocitos, trombocitos y proteínas de adhesión en comparación a la sangre natural completa.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la preparacion de plasma rico en plaquetas para usos no procesados y su combinacion con las celulas de piel y hueso

Area del invento

[0001] Este invento se refiere al campo de la regeneracion de tejidos, especialmente de la regeneracion de la piel, de cartflagos, de musculos, de tendones, de tejido adiposo, de corneas, de nervios perifericos, de la columna y de los huesos. Se refiere mas especfficamente a nuevas preparaciones celulares en forma de una matriz biologica, un metodo para su preparacion, un metodo para su uso, un dispositivo para su preparacion y preparaciones que contienen a dicha preparacion celular para su uso extemporaneo.

Antecedentes del invento

[0002] Se ha documentado bien la importancia de los materiales biologicos autonomos en el proceso de sanacion. Mas importantemente, se demostro la implicacion directa de 2 materiales biologicos autologos con la formacion de la estructura de coagulos de sangre, lo cual suministra una barrera hemostatica cuyo rol es garantizar la hemostasis y sellar a la herida: (1) la fibrina, que se deriva de la separacion del fibrinogeno clasico en 2 hebras a traves de la accion de la trombina, y (2) las membranas activadas de plaquetas. El proceso de formacion de la herida generalmente se presenta como la sucesion de una fase de coagulacion, un proceso inflamatorio y un proceso regenerativo.

[0003] La fase de coagulacion (coagulacion de la sangre o formacion de coagulos) es un proceso complejo, por el cual una pared danada de vasos sangufneos se cubre por un coagulo de fibrina para detener la hemorragia y reparar los vasos danados, que se inicia por la liberacion en grandes cantidades de citoquinas y de factores de crecimiento provenientes de granulos alfa de plaquetas. La formacion de coagulos sangufneos (formados en condiciones fisiologicas por la fibrina, por las plaquetas y por los globulos rojos, entre otros componentes sangufneos) es un fenomeno natural bien conocido que resulta de traumas de los tejidos y su rol en el proceso de sanacion de heridas, asf como en la union de fracturas oseas.

[0004] El proceso de inflamadon, que sigue a la formacion de un coagulo sangufneo, se estimula mediante numerosos mediadores vasoactivos y factores quimiotacticos (senales especfficas en la forma de protefnas) liberados por los globulos blancos y plaquetas. Estas senales atraen a macrofagos que “limpian” el lugar de cualquier bacteria o partfcula extrana tal como lo hacen los globulos rojos antes de la migracion de las celulas nuevas.

[0005] La fase regenerativa del tejido involucra a la quimioatraccion y a la mitosis de celulas no diferenciadas en la matriz (o matriz de crecimiento) formada por el coagulo sangufneo. Las nuevas celulas, que se multiplican bajo la estimulaaon de los factores de crecimiento de plaquetas, reemplazaran a las celulas danadas o destruidas las cuales son digeridas por los macrofagos.

[0006] Los factores de crecimiento y las numerosas protefnas del plasma, tambien llamadas moleculas senalizadoras, que promueven la migracion celular y division dentro de los coagulos sangufneos, juegan un rol crucial en el proceso de sanacion de heridas.

[0007] En teorfa, es posible amplificar los efectos de estas primeras fases en el proceso de sanacion de heridas al descartar a los globulos rojos e incrementar la concentraaon de factores de crecimiento.

[0008] La amplificacion de la coagulacion sangufnea puede definirse como la formacion de un “coagulo enriquecido (EC - enriched clot)”. Los coagulos enriquecidos pueden obtenerse a traves del uso de concentraciones de plaquetas y se han descrito en Platelets and Megacaryocytes (Plaquetas y Megacariocitos) 2004, vol 1 y 2, como "Structu re

and signals "(“Estructura y Senales”), Ed. Gibbins y Mahaut-Smith, Humana Press, Nueva Jersey.

[0009] El plasma rico en plaquetas (PRP) puede definirse como una concentracion autologa de plaquetas en un volumen pequeno de plasma; se desarrollo como un biomaterial autologo y demostro ser util en la sanacion y en la regeneracion de tejidos (Marx et al., 2004, J. Oral Maxllofac. Surg., 62, 489-496). El plasma rico en plaquetas no solo consiste de una concentracion de plaquetas pero tambien contiene a factores de crecimiento (tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas: PDGF (platelet-derived growth factor), el factor de crecimiento endotelial vascular: VEGF (vascular endothelial growth factor), el factor de crecimiento transform ante: TGF (transforming growth factor) y el factor de crecimiento epidermico: EGF (epidermal growth factor) que se secretan activamente por las plaquetas y han demostrado tener un rol fundamental en el proceso de iniciacion de sanacion de heridas.

[0010] Por ejemplo, el PDGF es conocido por iniciar la sanacion de los tejidos colectivos, incluyendo la regeneracion

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y reparacion osea. El PDGF tambien incrementa la mitogenesis (celulas sanadoras), la angiogenesis (la mitosis endotelial a capilares sangmneos de funcionamiento normal) y la activacion de macrofagos. El VEGF liberado por los leucocitos tambien demostraron tener activdades potentes angiogenicas, mitogenicas y de mejoramiento de la permeabilidad vascular en las celulas endoteliales. El TGF-p promueve la mitosis y la diferenciacion celular para el tejido conectivo y para los huesos, actua en las celulas madres mesenquimas, en los preosteoblastos y en los fibroblastos e inhibe la formacion de osteoclastos. El EGF se conoce por inducir el desarrollo epitelial y promover la angiogenes is.

[0011] Las concentraciones de plaquetas se utilizan generalmente en implantes dentales y en cirugfas oseas, sobre todo en los Estados Unidos de America. Se han desarrollado varias tecnicas de preparacion de PRP mediante procesos de centrifugacion. Sin embargo, debido a la sensibilidad de las celulas de plaquetas y a la variabilidad de la eficiencia de los metodos de separacion de las plaquetas de los globulos rojos, existe una variabilidad enorme entre los metodos utilizados para la preparacion de concentraciones de plaquetas (Marx et al., 2004, mencionado anteriormente; Roukis et al., Adv. Ther., 2006, 23(2):218-37): por ejemplo, el material de laboratorio para diagnosticos in vitro que se utiliza para la preparacion de plaquetas, conlleva a una baja produccion de plaquetas y de otros componentes de plasma (Marx et al., 2004, mencionado anteriormente: Anitua 35%, Landsberg 30%, Clinaseal 39%, ACE surgical 33%, Curasan 29%). Las configuraciones automatizadas de Biomet PCCS & GPS (Marx et al., 2004, mencionado anteriormente), que aparte de ser un proceso complicado tiene costos prohibitivos para el proceso de una muestra sangumea, conllevando a una produccion de unicamente el 61% y SmatPreP de Harvest Technology con un 62%. En aquellos sistemas, existe obviamente una perdida importante de tejidos biologicos valiosos de los pacientes, por lo cual, exste la necesidad del desarrollo de un proceso confiable para recolectar a las celulas de plasma con producciones altas, que sea facil de usar y que sea efectivo en relacion a costos.

[0012] Se demostro, recientemente, que los efectos positivos del plasma rico en plaquetas en la regeneracion osea cubren a un rango limitado de concentracion de plaquetas y se revelo que ocurre un efecto inhibitorio en la presencia de mas de 106 plaquetas por microlitro, lo cual es de 3 a 4 veces el recuento de la lmea base (Weibrich et al., 2004, Bone (hueso), 34(4):665-71).

[0013] Adicionalmente, la adquisicion de concentraciones de plaquetas todavi'a necesita el uso de botiquines relativamente complejos y de maquinaria dedicada costosa y la interaccion igualmente costosa de tecnicos especializados. Esta debilidad hace que los metodos que se conocen actualmente de preparacion de PRP no se adopten para usarse en los puntos de atencion.

[0014] Ademas, la preparacion de celulas en vista de la regeneracion celular o de tejidos para su uso en trasplantes, entre generaciones post-operativas o para propositos esteticos se enfrenta al problema de conservacion a largo plazo de las celulas y de los tejidos. La conservacion criogenica de tejidos o de celulas generalmente se usa para el mantenimiento a largo plazo de tejidos o de celulas, notablemente de plaquetas, pero esta tecnica muestra debilidades y problemas serios tales como la formacion de cristales, problemas osmoticos, aglutinaciones, inhibicion de la capacidad de smtesis de las proternas, la expresion protemica de estres en respuesta al estres termico, etcetera. Por lo tanto, se sabe que la conservacion criogenica de tejidos o de celulas alteran la viabilidad y la estabilidad celular (Agence frangaise de secuiite sanitaire, 2003; Arnaud et al., 1999, Cryobiology (Biologfa Criogenica), 38, 192-199; Tablin et al., 2001, Cryobiology (Biologfa Criogenica), 43(2), 114-23). Algunos de los efectos colaterales de la conservacion criogenica podnan limitarse con el uso de agentes anticongelantes tales como el DMSO o el glicerol u otros conservadores criogenicos (US 5,5891, 617, Oh et al., Cornea, 26, 840-846) pero la concentracion de estos agentes debe adaptarse para limitar su toxicidad y sus efectos colaterales.

[0015] US 566 7 963 presenta un metodo para la preparacion de una composicion con una concentracion de plaquetas que comprende los pasos de centrifugar a toda la sangre y re-suspender el plasma enriquecido.

[0016] Por lo tanto, exste una necesidad de un metodo nuevo o alterno para la preparacion de celulas y tejidos adecuados para su uso extemporaneo mientras que se preserva su integridad, notablemente en terminos de la capacidad y viabilidad de secrecion de los factores de crecimiento.

Resumen del invento

[0017] El invento se refiere a un metodo para la elaboracion de nuevas preparaciones celulares, mezcladas y agregadas opcionalmente con un extracto celular, tal como un extracto autologo de queratinocitos, de celulas de la medula osea, de fibroblastos, de celulas del periostio o de celulas de la cornea, de melanocitos y de celulas de Langheran; celulas grasas; celulas musculares tales como los mioblastos y las celulas satelitales; los osteoblastos; los condrocitos; las celulas del cordon umbilical, las celulas de Schwann o las celulas del tendon de Aquiles.

[0018] El proceso de preparacion de una composicion de una concentracion de plaquetas, de acuerdo al invento, constituye a un proceso confiable que recauda el 95 ± 5% de las celulas de plasma, que es facil de usar y que es efectivo en relacion a costos (Borzini P. et al., in preparation (en preparacion)).

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[0019] Este invento presenta un proceso para la preparacion de una composicion celular, que comprende los pasos de:

a) Centrifugar a toda la sangre en un tubo separador seleccionado de:

• Un tubo separador de vidrio que contiene a un gel tixotropico que se basa en poliester y una solucion amortiguadora de citrato de sodio a 0.10 M; y

• Un separador de tereftalato de polietileno que contiene a un gel altamente tixotropico formado por una mezcla polimerica y un citrato de sodio anhfdrido a 3.5 mil igram os/m il i litro;

b) Separar al plasma enriquecido que es rico en plaquetas de todo el plasma al remover alrededor de la mitad del sobrenadante que contiene a plasma con niveles bajos de plaquetas;

c) Volver a suspender al plasma enriquecido;

donde el paso de centrifugacion a) se realiza con una fuerza de alrededor de 1500 g hasta alrededor de 2000 g en un perfodo suficiente de tiempo para formar una barrera entre el plasma que contiene a plaquetas, a linfocitos y a monocitos y un pellet que contiene a eritrocitos; el paso de separacion b) se lleva a cabo una recaudacion del sobrenadante de encima de dicha barrera y donde el plasma enriquecido tiene altos niveles de leucocitos, trombocitosis y protefnas de adhesion (por ejemplo, la fibronectina) en comparacion a la sangre normal completa.

[0020] En un aspecto preferido, este invento presenta un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas que comprende:

a) Suministrar una concentracion de plaquetas obtenida por medio del metodo del invento;

b) Mezclar y agregar la concentracion de plaquetas con un activador de coagulacion en un fndice de volumen (concentracion de plaquetas: activador de coagulacion) de alrededor de 10:1 hasta alrededor de 10:3;

c) Mezclar opcionalmente un extracto celular autologo, tal como un extracto de queratinocitos, de la medulaosea, de fibroblastos, de celulas del periostio y de la cornea, de melanocitos y de celulas de Langheran; celulas grasas; celulas musculares tales como mioblastos y celulas satelitales; osteoblastos; condrocitos; celulas del cordon umbilical; celulas de Schwann y celulas del tendon de Aquiles.

[0021] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un botiqufn adaptado para la regeneracion de tejidos que comprende a un tubo separador de acuerdo a la presentacion, accesorios de flebotomfa para la preparacion del sanador de heridas de acuerdo a la presentacion y un dispositivo aplicador (por ejemplo, una jeringa doble) para el suministro simultaneo en la herida de la concentracion de plaquetas de acuerdo a la presentacion y un activador de coagulacion.

[0022] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para promover la sanacion de heridas y/o la regeneracion de tejidos y/o de huesos en una herida de un humano o de un animal inferior que comprende:

a) Suministrar un sanador de heridas de acuerdo a la presentacion;

b) Aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicho sanador de heridas a una herida, a un tejido danado o a un hueso danado.

[0023] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para inducir la regeneracion periodontal en una herida o un defecto periodontal de un mamffero con una enfermedad periodontal u otra condicion que requiera la regeneracion periodontal que comprende:

a) Suministrar un sanador de heridas de acuerdo a la presentacion;

b) Aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicho sanador de heridas a dicha herida o dicho defecto o

cavidad periodontal;

c) Insertar opcionalmente una barrera periodontal, donde la barrera se encuentra entre el tejido gingival y la

herida tratada de acuerdo a los pasos a) y b) y dicha barrera se selecciona de una membrana, de un material polimerico biodegradable y/o de material poroso biocompatible;

d) Cerrar la herida.

[0024] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para promover la regeneracion de la piel en una cicatriz o una arruga de un humano o un animal inferior que comprende:

a) Suministrar un sanador de heridas de acuerdo a la presentacion;

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b) Llenar la cicatriz de la piel o linea de arruga con dicho sanador de heridas.

[0025] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion celular que comprende los pasos de:

(a) Centrifugar a la sangre completa en un tubo separador seleccionado de:

- Un tubo separador de vidrio que contiene a un gel tixotropico que se basa en poliester y a una solucion amortiguadora de citrato de sodio 0.10 M; y

- Un tubo separador de tereftalato de polietileno que contiene a un gel altamente tixotropico formado por una mezcla polimerica y un citrato de sodio anhfdrido a 3.5 miligram os/m il i litro;

(b) Separar al plasma enriquecido con altos niveles de plaquetas del plasma completo al remover la mitad del

sobrenadante que contiene al plasma con niveles bajos de plaquetas;

(c) Suspender nuevamente al plasma enriquecido;

(d) Suministrar un extracto celular tal como un extracto de celulas dermicas tales como los queratinocitos, los

fibroblastos, los melanocitos y las celulas de Langheran; las celulas grasas; las celulas de la medula osea; las celulas musculares tales como los mioblastos y las celulas satelitales; los osteoblastos; los condrocitos; las celulas de la membrana del periostio; las celulas de la cornea; las celulas del cordon umbilical; las celulas de Schwann, las celulas de tendones o las celulas de los islotes pancreaticos;

(e) Mezclar y agregar el concentrado de plaquetas obtenido bajo el paso (c) con el extracto celular obtenido en

(d);

donde el paso de centrifugacion a) se realiza con una fuerza de, o de alrededor de, 1500 g a alrededor de 2000 g durante un perfodo suficiente de tiempo para formar una barrera entre el plasma que contiene a las plaquetas, a los linfocitos y a los monocitos y el pellet que contiene a los eritrocitos; el paso de separacion b) se realiza mediante la recoleccion del sobrenadante de encima de dicha barrera y donde el plasma enriquecido tiene niveles altos de leucocitos, de trombocitosis y de protefnas de adhesion (por ejemplo, la fibronectina) en comparacion a la sangre natural completa.

[0026] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a una composicion celular aislada que comprende a:

a) Plasma;

b) Plaquetas con una concentracion de por lo menos 300x109 celulas/litro;

c) Globulos blancos con una concentracion de por lo menos 7,0x109 celulas/litro;

d) Fibrinogeno con una concentracion de por lo menos 3 mg/mililitro;

e) Un extracto celular, tal como un extracto de celulas dermicas tales como los queratinocitos, los fibroblastos, los melanocitos y celulas de Langheran; celulas grasas; celulas de la medula osea; celulas musculares tales como los mioblastos y celulas satelitales; los osteoblastos, los condrocitos; las celulas de la membrana del periostio; celulas de la cornea; celulas de cordones umbilicales; las celulas de Schwann, celulas de tendones o celulas de islotes pancreaticos donde las celulas estan presentes con una concentracion de alrededor de 105 a alrededor de 106 celulas/mililitro de plasma o de plasma enriquecido;

y donde la concentracion de eritrocitos es menor que el 0,6x1012 celulas/litro.

[0027] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a una composicion celular aislada que comprende a:

a) Plasma;

b) Plaquetas con una concentracion de por lo menos 300x109 celulas/litro;

c) Globulos blancos a una concentracion de por lo menos 7,0x109 celulas/litro;

d) Fibrinogeno una concentracion de por lo menos 3 mg/l;

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e) Un activador de coagulacion con una taza de volumen (concentracion de plaquetas: activador de

coagulacion) de alrededor de 10:1 a alrededor de 10:3;

f) Un extracto celular, tal como un extracto de celulas dermicas tales como queratinocitos, fibroblastos,

melanocitos y celulas de Langheran; celulas grasas; celulas de la medula osea; celulas musculares tales como los mioblastos y celulas satelitales; osteoblastos; condrocitos; celulas de la membrana del periostio; celulas de la cornea; celulas del cordon umbilical; celulas de Schwann, celulas de tendones o celulas de islotes pancreaticos donde las celulas estan en una concentracion de alrededor de 105 a alrededor de 106 celulas/mililitro de plasma o de plasma enriquecido;

y donde la concentracion de eritrocitos es menor que 0.6 x 1012 celulas/litro.

[0028] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para promover la sanacion de heridas y/o el sellamiento y/o la regeneracion de un tejido y/o de un cartflago y/o de un hueso y/o de un nervio en un humano o en un animal inferior que comprende a:

a) suministrar una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular de acuerdo a la

presentacion;

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular a una herida, a un tejido danado o a un cartflago danado o a un hueso danado.

[0029] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para incrementar el volumen de tejidos adiposos en un mamffero con un injerto dermico de grasa u otra condicion que requiera la regeneracion de tejidos adiposos que comprende:

a) suministrar una composicion de celulas grasas de acuerdo a la presentacion;

b) aplicar un monto terapeuticamente o cosmeticamente efectivo de dicha composicion de celulas grasas al injerto de grasas dermicas o al tejido adiposo que requiere una regeneracion de tejidos adiposos;

c) insertar opcionalmente una solapa o un implante quirurgico, donde la solapa o el implante quirurgico, se ubica en el lugar que requiere regeneracion o una amplificacion volumetrica y dicha solapa o implante quirurgico comprende a una combinacion de una preparacion de celulas grasas de acuerdo a la presentacion y plasma o material enriquecido con plasma.

[0030] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para inducir una regeneracion del miocardio en un mamffero con una deficiencia del miocardio u otra condicion que requiera una regeneracion del tejido del miocardio que comprende:

a) suministrar una composicion de celulas musculares o de celulas de la medula osea de acuerdo a la presentacion;

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas musculares al tejido del miocardio que requiere regeneracion.

[0031] En un aspecto adicional, se presenta en este documento un metodo para inducir una regeneracion cornea en un mamffero con una deficiencia de la cornea u otra condicion que requiera una regeneracion de la cornea que comprende:

a) suministrar a una composicion de celulas de la cornea de acuerdo a la presentacion;

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas de la cornea al tejido de la cornea que requiere regeneracion.

[0032] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para inducir una regeneracion de las articulaciones o del cartflago en un mamffero con una deficiencia de las articulaciones o del cartflago u otra condicion que requiera una regeneracion de tejidos de las articulaciones o de los cartflagos que comprende:

a) suministrar una composicion de celulas de condrocitos o de celulas de la medula osea de acuerdo a la presentacion;

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas de condrocitos al tejido de articulaciones o de cartflagos que requiere una regeneracion;

c) insertar opcionalmente una solapa un implante quirurgico, donde la solapa o el implante quirurgico, se

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coloca en el defecto del cartflago o bajo un parche periostico, y donde dicha solapa o implante quirurgico comprende a una combinacion de una composicion de condrocitos o de celulas de la medula osea de acuerdo a la presentacion y plasma o material enriquecido con plasma.

[0033] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para promover la regeneracion de la piel en una cicatriz, una arruga o una deficiencia de grasa de un humano o de un animal inferior que comprende:

a) suministrar un sanador de heridas o de tejidos o una composicion celular de acuerdo a la presentacion;

b) llenar la cicatriz de la piel, a la lfnea de arruga o a la deficiencia de grasa con dicho sanador de heridas o de tejidos o con una composicion celular de acuerdo a la presentacion.

[0034] En un aspecto adicional, se presenta, en este documento, a un metodo para inducir la regeneracion de los nervios perifericos en un mamffero con danos a los nervos perifericos, con suturas a los nervios o con lesiones a la medula espinal u otra condicion que requiera una regeneracion de los nervios perifericos que comprende:

a) suministrar una composicion de celulas de Schwann de acuerdo a la presentacion;

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas de Schwann al nervio periferico que requiere regeneracion.

[0035] En un aspecto adicional, en este documento se presenta a un metodo para inducir una regeneracion osea en un mamffero con danos en los huesos, una deficiencia osea u otra condicion que requiera una regeneracion osea que comprende:

a) suministrar una composicion de celulas de la medula osea o de celulas de osteoblastos de acuerdo a la presentacion;

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas de la medula osea o de celulas de osteoblastos al hueso que requiere regeneracion.

[0036] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para el tratamiento de tipos de diabetes, de diabetes que depende de la insulina o de hiperglicemia en un mamffero que comprende:

a) suministrar una composicion de celulas de islotes pancreaticos de acuerdo a la presentacion;

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas de islotes pancreaticos al paciente, por ejemplo, mediante inyecciones.

[0037] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para el tratamiento de inconsistencia urinaria en un mamffero u otra condicion que requiera la regeneracion de la vejiga que comprende:

a) suministrar una composicion de celulas de mioblastos de acuerdo a la presentacion;

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas de mioblastos al cuello de la vejiga que requiere regeneracion.

[0038] en un aspecto adicional, se presenta en este documento a un metodo para el tratamiento de inconsistencia anal en un mamffero u otra condicion que requiera una regeneracion del musculo del ano que comprende:

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas de mioblastos para el area para-anal que requiere regeneracion.

[0039] En un aspecto adicional, se presenta en este documento un metodo para el tratamiento de esofagitis por reflujo o enfermedades de reflujo gastroesofagico en un mamffero u otra condicion que requiera la regeneracion del esffnter esofagico que comprende:

b) aplicar un monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas de mioblastos para el esffnter esofagico que requiere regeneracion.

[0040] En un aspecto adicional, se presenta en este documento un uso de la preparacion celular obtenida a traves

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del metodo de acuerdo a este invento para la fabricacion de un medicamento para la sanacion de heridas o de tejidos o para promover el crecimiento oseo o periodontal y/o la regeneracion de huesos y/o de tejidos tales como la regeneracion de la piel, de los cartflagos, de los musculos, de los tendones, del tejido adiposo, de la cornea, de los nervios perifericos, de la columna.

[0041] En un aspecto, se presenta en este documento a un uso de la composicion celular obtenida mediante el metodo de acuerdo a este invento para la fabricacion de una preparacion cosmetica para su uso como un agente anti-envejecimiento o un agente de reparacion de la piel tal como un agente de reparacion de cicatrices, un agente de reparacion de la lipoatrofia o un agente llenador y/o de reparacion de arrugas.

[0042] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a una composicion farmaceutica que comprende a una composicion celular obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento y un portador farmaceuticamente aceptable.

[0043] En un aspecto adicional, se presenta en este documento una composicion cosmetica que comprende a una composicion celular obtenida por medio de un metodo de acuerdo al invento y a un portador cosmeticamente aceptable.

[0044] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un dispositivo que puede implantarse para su uso en la terapia de regeneracion de tejidos que comprende:

a) un nucleo permeable que comprende a una composicion celular de la presentacion; y

b) un revestimiento externo alrededor de dicho nucleo, donde dicho revestimiento comprende a un material, preferiblemente, biocompatible o bio-reabsorbible.

[0045] Las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son utiles para la regeneracion y/o para el rejuvenecimiento de tejidos, huesos y/o cartflagos. Las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de ulceras neuropaticas diabeticas o ulceras de decubito; danos a los huesos y a los cartflagos tales como danos profundos a los cartflagos de articulaciones o condrales tales como una reparacion quirurgica de tendones desgarrados; artritis de las articulaciones causada por traumas o por la edad; enfermedades del manguito de los rotadores; heridas que no sanan tales como como heridas inducidas por la vasculitis, por ejemplo, en las extremidades inferiores equinas; enfermedades periodontales; cirugfa de implantes; danos del musculo cardiaco tales como en fallas cardiacas cronicas, fallas del corazon, enfermedades isquemicas y no isquemicas, cardiomiopatfa; enfermedad de reflujo gastroesofagico; incontinencias anales o urinarias; cirugfa facial tal como alopecia inducida por cirugfa facial (alopecia debido a la perdida de folfculos del cabello en las areas de las patillas), cirugfa de levantamiento facial (ritidectomfa), rinoplastia, injertos de grasa dermica (en el tratamiento de aumentacion facial, hemiatroffa congenita de la cara tal como una atrofia congenita del cartflago de la nariz y una lipoatrofia tal como en los pacientes que padecen de VIH/SIDA erosion y artroscopia); complicaciones de sanacion de heridas tales como despues de una blefaroplastia de los parpados de los ojos; enfermedades de la cornea tales como aquellas que impliquen la opacidad de la cornea tales como aquellas causadas por quemaduras qufmicas, la afliccion por el sfndrome de Steven's Johnson y ulceras de la cornea; cicatrices de la cornea; el sfndrome del ojo seco; enfermedades hematologicas tales como la talasemia; danos de los nervios perifericos, sutura de los nervios y lesiones de la medula espinal; defectos o enfermedades oseas tales como injertos oseos o fracturas oseas, danos o enfermedades de la piel tales como el acne (especialmente despues del tratamiento de dermoabrasion), quemaduras, cicatrices pequenas de rubeola o de varicela, vitiligo, lipoatrofia, sarcoma de Kaposi, queloides de la piel o la dermatosis palmar de Dupuytren.

[0046] En otro aspecto, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son utiles para la regeneracion y/o rejuvenecimiento de los tejidos de la piel, particularmente en la promocion y/o iniciacion de la regeneracion de la piel tal como para reducir arrugas de la piel, acne (especialmente despues del tratamiento de dermoabrasion), quemaduras, rubeola o cicatrices pequenas de la varicela, el vitiligo y lipoatrofias (por ejemplo, composiciones anti-envejecimiento y composiciones de regeneracion de la piel), el mejoramiento de las lfneas nasolabiales y tratamiento de danos o enfermedades a la piel tales como quemaduras de la piel, el sarcoma de Kaposi, queloides de la piel o la dermatosis palmar de Dupuytren y la reduccion del dolor asociado con la regeneracion de la piel y de los tejidos.

Descripcion de las fiauras

[0047]

La figura 1 es una representacion esquematica de la variacion de concentracion de los factores de crecimiento (PDGF-AB, EGF y VEGF) de una composicion con un concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento versus el tiempo (T en horas) despues del paso de centrifugacion en el proceso de preparacion del invento.

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La figura 2 es una representacion esquematica de los resultados del tratamiento de un lugar donante de injertos de la piel con una preparacion que contiene una composicion de una concentracion de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento en comparacion con un grupo de control en relacion al tiempo de sanacion en dfas (HT), al dolor en el dfa 5 en una escala del 0 al 10 (P - pain) y de epitelizacion en el dfa 5 en una escala del 0 al 7 (E). El grupo de control: C, preparacion individual rica en plaquetas: RegenPRP™, preparacion rica en plaquetas y queratinocitos autologos: RegenExtracell™. La lfnea de puntos indica cuando la primera venda es cambiada en el dfa 5.

La figura 3 representa la morfologfa de un fibroblasto humano expandido en una preparacion celular obtenida por medio del metodo de acuerdo al invento bajo las condiciones descritas en el ejemplo 7, que muestra a una ramificacion y filopodios x 5'000 (microscopio invertido Olympus®).

La figura 4a representa a una matriz de 3 dimensiones de fibroblastos humanos de una preparacion celular obtenida por medio del metodo de acuerdo al invento bajo las condiciones descritas en el ejemplo 7.

La figura 4b representa monocapas de fibroblastos empaquetados densamente en un cultivo 3D a partir de una preparacion celular obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento bajo las condiciones descritas en el ejemplo 7.

Descripcion detallada del invento:

[0048] Los siguientes parrafos suministran definiciones de los terminos de acuerdo al invento y tienen la intencion de aplicarse uniformemente a lo largo de la especificacion y de las reivindicaciones a menos que la definicion establecida expresamente suministre una definicion mas amplia.

[0049] El termino “tixotropico” se refiere a un gel que se vuelve mas fluido como resultado de agitacion o de presion, es decir, un gel cuya viscosidad se reduce como resultado de agitaciones o presiones. El termino viscosidad se refiere a aquellas caracterfsticas de un material o materiales especificados que determinan el nivel de gelificacion, tales como, por ejemplo, la firmeza o la dureza del material, o el nivel con el cual el material resiste fluir en una forma similar a un fluido. Un gel tixotropico de acuerdo al invento comprende a un gel de poliester, o una de sus mezclas, que es soluble en agua y que es qufmicamente inerte a constituyentes sangufneos que pueden utilizarse de acuerdo al invento. Genes tixotropicos comunes se utilizan en la separacion de celulas sangufneas para propositos diagnosticos y proteomicos.

[0050] El termino “punto de atenaon” se refiere a todos los servicios suministrados a pacientes al pie de la cama. El termino “accesorios de flebotomfa” o “accesorios de venopuncion” se refiere a accesorios que permiten la puncion de una vena con una aguja para propositos de sacar sangre.

[0051] El termino “sanador de heridas” o “sellador de heridas” o una “composicion sanadora de tejidos” se refiere a una gente o a una composicion que puede promover y/o incrementar la velocidad y/o la calidad de la cicatrizacion de una herida. Los sanadores o selladores de heridas son capaces de promover la regeneracion de tejidos.

[0052] El termino “heridas” se refiere a cualquier tejido danado, por ejemplo, despues de traumas o cirugfas. Las heridas en los mamfferos, incluyendo, por ejemplo, a ulceras por presion, otros tipos de ulceras, laceraciones y quemaduras, lugares donde se realizaron injertos (el injerto donado y los lugares que recibieron los injertos), fisuras, danos del tejido periodontal, heridas diabeticas que no se sanan, consecuencias de traumas o de cualquier cirugfa. En su sentido general, la expresion tiene la intencion de abarcar a danos de la piel en los que la superficie de la piel presenta una depresion sin que exista necesariamente un corte en su superficie tal como danos a los tejidos relacionados con la edad (por ejemplo, arrugas) y cicatrices tales como, por ejemplo, cicatrices del acne (especialmente despues del tratamiento de dermoabrasion) o de la rubeola.

[0053] El termino “PRP” se refiere a un plasma rico en plaquetas, preferiblemente de origen humano, mas preferiblemente autologo, preparada mediante el proceso del invento para pellets y para remover eritrocitos y concentrar el plasma en leucocitos, trombocitosis y protefnas de adherencia en comparacion con la sangre natural completa.

[0054] El termino “autologos” o “autogenico” o “autogeno” se refiere a un metodo del invento utilizando sangre de un solo donante y donde se propone usar la sangre extrafda de este donante en el mismo donante. En contraste con los metodos “alogenicos” que utilizan la sangre de una o mas terceras partes para su uso en un donante (“homologo” o “heterologo”). Un producto autologo evita algunos de los problemas comunes asociados con el uso de materiales biologicos de terceras partes, tales como, por ejemplo, examinaciones para asegurar que el donante sea biologicamente o inmunologicamente compatible con el paciente y contaminaciones potenciales con hepatitis, VIH, priones, la enfermedad de Creutzfeld-Jacob y similares.

[0055] El termino “activador de coagulacion” se refiere a un agente que puede activar o iniciar una coagulacion. Un activador de coagulacion comprende a un activador de trombina y/o un activador de fibrinogeno.

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[0056] El termino “activador de trombinas” se refiere a un agente que es capaz de activar a la trombina y de iniciar la coagulacion. Activadores comunes de la trombina son ciertos factores tales como el sodio o el calcio. En la practica de este invento, la activacion de la trombina ocurre preferiblemente en la presencia de iones de calcio. Los iones de calcio se agregan, generalmente, a la concentracion de plaquetas como una solucion salina para suministrar una concentracion final de, generalmente, alrededor de 0.1 miligramos/mililitro de concentracion de plaquetas. Sales de calcio adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, CaCO3, y CaSCU. Una sal preferida de calcio para su uso en el invento es cloruro de calcio (CaCh). El CaCh esta disponible como una inyeccion de cloruro de calcio, USP 10% (Regen Lab, Suiza).

[0057] El termino “activador de fibrinogeno” se refiere a un agente que esta disponible para activar a la conversion de fibrinogeno a fibrina y activa a la formacion del coagulo. Activadores comunes del fibrinogeno son la trombina y la batroxobina. El termino trombina podrfa incluir a trombina calcificada, en particular, a desde o alrededor de 100 a alrededor de 10 unidades de trombina por 1 ml de un 10% de una solucion acuosa de cloruro de calcio; podrfa incluir a trombina bovina calcificada, a trombina alogenica o a trombina humana recombinante, preferiblemente una trombina autologa. Un activador de fibrinogeno puede ser una composicion enriquecida con trombina tal como composiciones de trombina tal como se describen en US 6'472.162 o un suero autologo de trombina de acuerdo a la presentacion.

[0058] El termino “monto terapeuticamente efectivo” se refiere a un monto o montos de los elementos constituyentes o una de sus combinaciones necesarias para mejorar la sanacion de heridas, tal como, por ejemplo, la reduccion en el volumen o en el area superficial de la herida, el incremento del monto de tejido de granulacion u otro material biologico que facilita el asentamiento del colageno, el crecimiento interno vascular, la proliferacion de fibroblastos o la sanacion general; se asume que todas las versiones del invento aquf descritas tienen el monto o montos terapeuticamente efectivos de sustancias constituyentes, o sus combinaciones. El termino “portador farmaceuticamente aceptable” se refiere a ingredientes adicionales farmaceuticamente aceptables tales como estabilizadores, agentes antimicrobianos, amortiguadores, adyuvantes, anestesicos, corticoesteroides y similares.

[0059] El termino “portador cosmeticamente aceptable” se refiere a ingredientes adicionales aceptables tales como estabilizadores, amortiguadores, agentes colorantes, agentes saborizantes, adyuvantes y similares.

[0060] Las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en tratamientos de sanacion o regeneracion de heridas o tejidos, especialmente el tratamiento de heridas traumaticas o quirurgicas tales como el encaje y/o la aplicacion y/o el sellamiento de injertos naturales o prosteticos (especialmente injertos de la piel, oseos y/o protesis o implantes dentales o similares, incluyendo ademas al lugar del injerto del donante); el tratamiento de vasculitis; ulceras tales como ulceras neuropaticas diabeticas o ulceras de decubitos; radiodermatitis (por ejemplo, despues de la irradiacion en un carcinoma epidermoide de la piel) y el cierre de fistulas (tales como para ciclistas).

[0061] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de enfermedades cardiacas, regeneraciones cardiacas tales como en el tratamiento de fallas cardiacas, fallas cardiacas cronicas, fallas cardiacas isquemicas y no isquemicas y cardiomiopatfas.

[0062] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles para el tratamiento de incontinencias urinarias y/o anales.

[0063] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de la enfermedad esofagitis por reflujos y/o de reflujos gastroesofagicoos.

[0064] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de danos a la piel tales como pieles danadas por radiaciones (piel danada por la radiodermatitis o el sol), pieles viejas o pieles quemadas y/o el alivio de arrugas faciales, arrugas de expresion, el acne (especialmente despues del tratamiento de dermoabrasion), quemaduras, cicatrices pequenas de la rubeola o de la varicela, vitiligo, lipoatrofias o lipodistrofias, el sarcoma de Kaposi, queloides de la piel o fibromatosis palmar de Dupuytren y/o tratamientos de rejuvenecimiento de la piel.

[0065] Ademas, las composiciones obtenidas por medio del metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de lipoatrofias tales como en los pacientes del VIH/SIDA y en otras hemiatrofias congenitas de la cara tales como la atrofia congenita del cartflago de la nariz.

[0066] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de enfermedades de los huesos, de los cartflagos y de las articulaciones tales como danos condrales, artritis, lesiones del cartflago y/o de los huesos tales como danos y/o erosiones y/o artroscopias profundas del cartflago, tendones rasgados y manguitos de los rotadores rasgados en el hombro.

[0067] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles

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en el tratamiento de enfermedades hematologicas tales como la talasemia.

[0068] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de enfermedades de la cornea tales como el sindrome del ojo seco; la opacidad de la cornea tal como aquellas causadas por quemaduras qufmicas, la afliccion del sfndrome de Steven's Johnson, cicatrices de la cornea y ulceras de la cornea.

[0069] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de danos de los nervios perifericos, suturas de nervios y lesiones de la medula espinal.

[0070] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de diabetes de tipo 1, diabetes que depende de la insulina y/o la hiperglicemia.

[0071] Ademas, las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en el tratamiento de defectos o enfermedades oseas tales como injertos de huesos o fracturas de huesos.

[0072] El uso de la composicion resultante puede modificarse aun mas antes de la aplicacion y de acuerdo al objetivo terapeutico.

[0073] Las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento pueden utilizarse en conjunto con materiales oseos de relleno, especialmente materiales reabsorbibles de relleno tales como la hidroxiapatita (ceramica de fosfato de calcio utilizada como un biomaterial) o huesos desmineralizados, o utilizados como una mezcla con extractos oseos en un proceso para el recrecimiento del hueso, por ejemplo, en procedimientos craneofaciales y ortopedicos.

[0074] Las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento podrfan utilizarse como selladores de heridas en cirugfas plasticas incluyendo injertos por quemaduras y otras aplicaciones de injertos de piel suelta, por ejemplo, en la Oncologfa favoreciendo la regeneracion de tejidos, incluyendo la aceleracion de la (neo)vascularizacion.

[0075] Las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en tratamientos de sanacion de heridas en los lugares donantes de injertos de piel. La remocion de un injerto de piel en una piel saludable crea una nueva herida en el lugar donante que normalmente se sana espontaneamente en un lapso de 12 a 14 dfas. Sin embargo, esta cicatrizacion es extremadamente exgente para el cuerpo, especialmente si el lugar donante es amplio o la persona es menos resistente (por ejemplo, vfctimas de quemaduras, gente que padece de varios traumas, gente tratada con corticoides, ninos o ancianos) y las perdidas energeticas se incrementan aun mas por la perdida de minerales, de oligoelementos y protefnas inducidas por las perdidas de fluidos que se originan por la nueva herida. Adicionalmente, a menudo se presenta un dolor importante durante los primeros 8 dfas en el lugar donante del injerto. A menudo se utilizan tratamientos de reduccion del dolor tales como el uso de analgesicos (por ejemplo, la morfina) y/o vendajes hidrocelulares de heridas, sin embargo, el dolor sigue presente, especialmente durante el cambio de vendajes que ocurren necesariamente en las primeras 48 horas hasta la primera semana despues de la remocion del injerto. Adicionalmente, los vendajes hidrocelulares de heridas tienen la debilidad de que son caros y que ademas mantienen la humedad de la herida lo cual evita que esta se seque incrementando la profundidad de la herida, lo cual favorece brotes de infecciones bacterianas y conlleva a cicatrices que no son esteticas. Ademas, es muy deseable una simulacion de la sanacion del lugar donante del injerto de piel.

[0076] Las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento son particularmente adaptables a heridas cronicas que podrfan no tener la suficiente circulacion de sangre para facilitar el proceso de sanacion de heridas.

[0077] Las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento tambien podrfan utilizarse en el tratamiento de enfermedades periodontales en las cuales se observa una perdida y/o un dano de tejidos periodontales, tales como, un tratamiento que comprende, por ejemplo, colocar en un lugar periodontal o una carie, en un humano, o en un animal inferior, que necesite la regeneracion de tejidos periodontales a una composicion que se obtiene mediante el metodo de acuerdo al invento.

[0078] Las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo a este invento son efectivas para eliminar o para reducir, en una forma importante, sangrados y excavaciones post operativas o la perdida de lfquido seroso u otro fluido en estas aplicaciones, para reducir el riesgo de infeccion causado por la mayorfa de bacterias y/o mejorar la formacion de tejidos colectivos en comparacion con la sanacion natural (es decir, no se agregan agentes exogenos) o a la sanacion obtenida a traves del uso de otras concentraciones de plaquetas preparadas con metodos conocidos.

[0079] Las composiciones obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento son particularmente utiles en la preparacion de elementos farmaceuticos para la promocion y/o el inicio de sanacion de heridas y/o la regeneracion de tejidos o para la preparacion de composiciones cosmeticas para la regeneracion de la piel, tal como, para reducir arrugas de la piel, el acne (especialmente despues del tratamiento de dermoabrasion), cicatrices pequenas de la rubeola o de la varicela, vitiligo y lipoatrofia (por ejemplo, composiciones anti-envejecimiento y composiciones de regeneracion de la piel).

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[0080] Las composiciones obtenidas mediante el metodo de este invento podrfan administrarse localmente o inyectarse en la herida, o en, o cerca de, el organo injertado o pueden inyectarse subcutaneamente. La administracion local podrfa ser mediante inyecciones en el lugar de la lesion o del defecto o mediante inserciones o adhesiones con un portador solido en el lugar en cuestion, o mediante la mezcla y agregacion a cremas o emulsiones, o mediante la inclusion en un tejido o papel o portador tipo hidrogel, o mediante la aplicacion directa y topica de la composicion obtenida mediante el metodo del invento, tal como, en la forma de gotitas para los ojos. Preferiblemente, las composiciones pueden utilizarse en composiciones para jeringas. La modalidad de administracion, la dosis administrada, la modaldad de dosis unicas o multiples, a un individuo, variara dependiendo de una variedad de factores, incluyendo las propiedades farmacocineticas, las condiciones y caracterfsticas del paciente (genero, edad, masa corporal, salud, tamano), la magnitud de los sfntomas, la existencia de tratamientos concurrentes, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado.

[0081] Las composiciones obtenidas mediante el metodo de este invento podrfan administrarse en combinacion con un co-agente util para el tratamiento de la regeneracion de tejidos tal como un agente sanador, un llenador de arrugas, un agente anti-envejecimiento, tal como, el complejo vitamfnico anti-envejecimiento, un agente antibacteriano, un agente antibiotico, un agente corticoesteroide, un agente antialgico y analgesico, un agente anestesico como la adrenalina, etcetera. Las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento podrfan combinarse con un co-agente util para el tratamiento de la regeneracion de tejidos para su uso simultaneo, por separado o secuencial en la terapia de regeneracion de tejidos tal como, la sanacion de heridas, la reparacion del crecimiento oseo y periodontal, etc.

[0082] Las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento, los procedimientos para la preparacion de concentraciones autologas de plaquetas o composiciones celulares del invento son parti cularmente utiles para usos terapeuticos, particularmente como pegamento biologico autogeno en un sistema hemostatico que tiene el proposito de acelerar el proceso fisiologico o la regeneracion de tejidos, por ejemplo, en implantes dentales, en cirugfa de la piel y de los huesos, en cirugfa de cartflagos y tendones, en la regeneracion de la cornea y de nervios perifericos y en cirugfas cardiacas. Las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento, los procedimientos para la preparacion de concentraciones autologas de plaquetas y las composiciones celulares del invento son particularmente utiles para su uso cosmetico, particularmente, materiales autogenos de rejuvenecimiento que tienen la intencion de utilizarse, por ejemplo, como rellenos de arrugas, de cicatrices o en deficiencias grasa, individualmente o en combinacion con por lo menos un agente anti-envejecimiento.

[0083] La concentracion de plaquetas obtenida mediante el metodo del invento podrfa combinarse con una preparacion autologa de extractos celulares, tal como, por ejemplo, queratinocitos, celulas de la medula osea, osteoblastos, condrocitos, fibroblastos, celulas del periostio, melanocitos y celulas de Langheran; celulas grasas; celulas de la medula osea; celulas musculares tal como los mioblastos y celulas satelitales; celulas de la membrana del periostio; celulas de la cornea; celulas de cordones umbilicales; celulas de tendones o celulas del islote pancreatico. Los queratinocitos pueden cosecharse a traves de un metodo descrito por Reinwald y Green, 1975, Cell (Celula), 6(3):331-43. Otras celulas mencionadas pueden cosecharse mediante los metodos descritos en "Culture de cellules animales; methologies-applications (metodologfas-aplicaciones)", 2003, Ed. Barlovatz-Meimom y Adolphe, INSERM editions, Par/s. Alternamente, los extractos celulares se derivan de un banco celular o de un cultivo celular o se cosechan tal como se describe en ejemplos mas adelante.

[0084] La concentracion de plaquetas y las composiciones celulares obtenidas mediante el metodo del invento demostraron ser realmente beneficiosas para la aceleracion y/o la promocion del proceso de sanacion de heridas, inclusive heridas cronicas que no sanan, conllevando a conclusiones exitosas en casos en los cuales semanas de terapias convencionales fallaron y estos metodos lograron una reduccion en el riesgo de infecciones, una mejora en la recuperacion y comodidad del paciente, una reduccion de costos de atencion medica y un mejor resultado estetico final.

[0085] Las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento pueden, desde luego, tambien prepararse a partir de plasma derivado de algunos donantes identificados. El invento no se limita a materiales biologicos autologos, tales como, la recaudacion de plaquetas concentradas del material biologico propio de la persona herida. El invento abarca el uso de materiales biologicos obtenidos de una o mas terceras partes, que no necesitan ser de la misma especie, puesto que el paciente que esta recibiendo tratamiento con la composicion sanadora de heridas aquf descrita, a menos que exista una bio-incompatibilidad, podrfa usar materiales biologicos de una tercera parte.

[0086] En una implementacion, el invento presenta a un proceso para la preparacion de una composicion de un concentrado de plaquetas o una composicion celular tal como se describe en la reivindicacion 1.

[0087] En otra implementacion, se presenta en este documento a un dispositivo para la preparacion de una composicion de una concentracion de plaquetas a partir de sangre completa tal como se describe en este documento.

[0088] En una implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una

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composicion con una concentracion de plaquetas donde el paso de centrifugacion se realiza con una fuerza de entre alrededor de 1500 g y hasta alrededor de 1700 g durante un periodo seleccionado que va desde alrededor de 3 minutos hasta alrededor de 15 minutos, preferiblemente a 1500 g durante alrededor de 8 minutos.

[0089] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion con un concentrado de plaquetas donde el tubo separador tiene una entrada para introducir a dicha sangre completa, se mantiene al vacfo para aspirar a la muestra de sangre completa, es esteril, tiene un vacfo usable de 8 a 10 ml y es adecuado para la centrifugacion que se esta llevando a cabo.

[0090] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion con una concentracion de plaquetas donde el tubo separador es de tereftalato de polietileno que contiene un gen altamente tixotropico formado por una mezcla polimerica y un citrato de sodio anhfdrido a 3.5 miligramos/mililitro.

[0091] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion aislada con una concentracion de plaquetas que se obtiene del proceso de acuerdo al invento.

[0092] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion aislada con una concentracion de plaquetas que comprende a:

a) plasma;

b) plaquetas con una concentracion de por lo menos 300 x 109 celulas/litro, preferiblemente de por lo menos 350 x 109 celulas/litro, mas preferiblemente de por lo menos 400 x 109 celulas/litro;

c) globulos blancos con una concentracion de por lo menos 7.0 x 109 celulas/litro, preferiblemente de por lo menos 8.0 x 109 celulas/litro;

d) fibrinogeno a una concentracion de por lo menos 3 mg/litro; y donde la concentracion de eritrocitos es menor que 0.6 x 1012 celulas/litro, preferiblemente menos que 0.5 x 1012 celulas/litro.

[0093] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion sanadora de heridas o tejidos que comprende a:

a) plasma;

b) plaquetas a una concentracion de por lo menos 300 x 109 celulas/litro, preferiblemente de por lo menos 350 x 109 celulas/litro, mas preferiblemente de por lo menos 400 x 109 celulas/litro;

d) fibrinogeno con una concentracion de por lo menos 3 mg/litro;

e) un activador de coagulacion con una tasa de volumen (concentracion de plaquetas: activador de coagulacion) de alrededor de 10:1 a alrededor de 10:3;

f) opcionalmente un extracto celular autologo, tal como un extracto de queratinocitos, de celulas de la medula

osea, de fibroblastos, de celulas del periostio, de melanocitos y de celulas de Langheran; celulas grasas; celulas de la medula osea; celulas musculares tales como mioblastos y celulas satelitales; osteoblastos; condrocitos; celulas de la membrana del periostio; celulas de la cornea; celulas de cordones umbilicales; celulas de tendones o celulas de islotes pancreaticos; y donde la concentracion de eritrocitos es menor que 0.6 x 10 celulas/litro, preferiblemente menos que 0.5 x 10 celulas/litro.

[0094] En otra implementacion, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos tal como se describe en este documento.

[0095] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos donde el activador de coagulacion contenido es un 10% de cloruro de calcio.

[0096] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos donde el activador de coagulacion que se mezclo bajo el paso b) es una preparacion enriquecida con trombina. Un metodo para preparar a la trombina para su uso en un pegamento biologico se describe en US 6,472,162 mediante la adicion de un 8 a un 20% de ETOH a un volumen de plasma y esta preparacion puede utilizarse como una preparacion enriquecida con trombina. Alternamente, un suero autologo de trombina (ATS - autologous thrombin serum) puede usarse como una preparacion enriquecida con trombina. Un

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suero autologo de trombina, de acuerdo a la presentacion, se obtiene mediante un proceso que comprende (i) la adicion a una muestra de sangre completa del paciente (por ejemplo, 8 ml) recaudada en un tubo separador de la presentacion, un 10% del volumen final de cloruro de calcio 10% (por ejemplo, 1 ml) y un 10% del volumen final de la preparacion de un 95% (volumen) de una solucion de etanol (por ejemplo, 1 ml) y (ii) una preapitacion durante alrededor de 30 minutos a la temperatura del cuarto. Despues de 30 minutos, una centrifugacion de alrededor de 1500 g durante alrededor de 8 a 10 minutos. En una implementacion adicional preferida, la preparacion enriquecida con trombina y preferiblemente el suero autologo de trombina se mezclan bajo el paso b) directamente en la herida.

[0097] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos donde un paso adicional b') en el cual la composicion activada con una preparacion rica en plaquetas (obtenida mediante la mezcla y adicion de la concentracion de plaquetas con dicho activador de coagulacion) obtenida en el paso b) podrfa estar parcialmente deshidratada por el contacto de un vendaje de heridas cubierto por una capa hidrofobica suave para evitar la contaminacion con hilos microscopicos del vendaje para obtener un gel semi-solido que puede manipularse mediante instrumentos apropiados, por ejemplo, para llenar una cavidad o una deficiencia de tejidos, o como una matriz de crecimiento (“soporte”) mientras se espera por la reconstitucion de la matriz autogena extracelular. El sanador de heridas o de tejidos obtenido es particularmente util en un metodo para inducir una regeneracion periodontal en una herida, en un tejido con un defecto periodontal o en una caries.

[0098] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular donde el extracto celular es uno de queratinocitos.

[0099] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular donde el extracto celular es un extracto autologo de queratinocitos.

[0100] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular donde el extracto celular es un extracto de celulas del musculo esqueletico, tal como, celulas progenitoras de musculo o celulas madre satelitales.

[0101] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular donde el extracto celular es un extracto de fibroblastos.

[0102] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular donde el extracto celular es un extracto de adipocitos.

[0103] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular en la cual el extracto celular es un extracto de condrocitos.

[0104] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular donde el extracto celular es un extracto de celulas madre tales como celulas madres del cordon umbilical.

[0105] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular en la cual el extracto celular es un extracto de celulas del tendon.

[0106] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular en la cual el extracto celular es un extracto de celulas de la membrana del periostio o de celulas gingivales.

[0107] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular en la cual el extracto celular es un extracto de las celulas de la cornea.

[0108] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular donde el extracto celular es un extracto de celulas de la medula osea.

[0109] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular en la cual el extracto celular es un extracto de celulas de obleoblastos.

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[0110] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular donde el extracto celular es un extracto de celulas de Schwann.

[0111] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion sanadora de heridas o de tejidos o una composicion celular donde el extracto celular es un extracto de celulas de islotes pancreaticos.

[0112] En otra implementacion adicional, la composicion aislada con un concentrado de plaquetas, la composicion sanadora de heridas o de tejidos, el suero enriquecido con trombina y/o el extracto celular del invento son autologos.

[0113] En un aspecto adicional, esta presentacion suministra un botiqufn adaptado para la regeneracion de tejidos de acuerdo a la presentacion donde el botiqufn comprende ademas a matraces separados que contienen a ETOH y a CaCl2, a sostenedores de jeringas, acumuladores y un aplicador de vertimiento con una salida dual.

[0114] En un aspecto adicional, se presenta en este documento a un botiqufn adaptado para la regeneracion de tejidos de acuerdo a la presentacion que comprenden a 2 ampollas esteriles:

(1) una ampolla que comprende a accesorios para la flebotomfa, a tubos separadores de la presentacion, a matraces de ETOH y de CaCh para la preparacion de un suero autologo de trombina; y

(2) una 2a ampolla que contiene accesorios para 2 sostenedores de jeringas y un acumulador, y un aplicador de vertimiento con una salida dual.

[0115] En otra implementacion, se presenta en este documento un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento donde el extracto celular suministrado bajo el paso d) o e) se obtiene mediante un proceso que comprende a los pasos de:

(A) suministrar a dichas celulas en una concentracion de plaquetas de acuerdo al invento;

(B) cultivar opcionalmente a las celulas;

(C) re-suspender a las celulas cultivadas obtenidas bajo el paso (B) en un concentrado de plaquetas de acuerdo al invento.

[0116] En una implementacion adicional, se presenta en este documento un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento donde la expansion celular bajo el paso (A) se realiza en una concentracion de plaquetas de acuerdo al invento de tal forma que la concentracion final de las plaquetas contenidas comprende desde alrededor del 5% a alrededor del 40% del volumen del medio cultivado.

[0117] En otra implementacion, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion de acuerdo al invento donde el paso de cultivo celular (B) comprende a por lo menos un paso de colocacion en placas a las celulas, por ejemplo, en una superficie de cultivo celular tal como la placa de Petri o un matraz de cultivos.

[0118] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento que comprende a por lo menos un paso adicional de cosechar las celulas despues del paso del cultivo celular (B).

[0119] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento donde el paso de cultivo celular (B) se realiza a 37 °C.

[0120] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento donde el paso de cultivo celular (B) se realiza bajo un flujo de gas que comprende a oxfgeno o a aire y dioxido de carbono, comunmente, el flujo de gas comprende un 95% de oxfgeno o aire y un 5% de dioxido de carbono.

[0121] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento, donde el paso de cultivo celular (B) dura alrededor de 3 a 4 semanas.

[0122] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento en el cual durante el paso del cultivo celular (B), el medio de cultivo celular se cambia regularmente durante la incubacion, comunmente, alrededor de cada 3 dfas.

[0123] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento donde el paso de cultivo celular (B), comprende a por lo menos un paso de exposicion de las celulas a luz visible, comunmente, a alrededor de 633 nm, durante alrededor de 10 minutos. En otro aspecto, el paso de exposicion a una luz visible se repite una vez a la semana durante la incubacion celular.

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[0124] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composiaon celular de acuerdo al invento donde la composicion celular es una composicion celular de queratinocitos o fibroblastos y el paso de cultivo celular (B), comprende a por lo menos un paso de exposicion de las celulas a luz visible, comunmente a alrededor de 633 nm, durante alrededor de 10 minutos. En otro aspecto, el paso de exposicion a luz visible se repite una vez a la semana durante la incubacion celular.

[0125] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento, donde el paso de cultivo celular (B), comprende a por lo menos un paso de adicion de un concentrado de plaquetas diluidas de acuerdo al invento, tal como la concentracion final en plaquetas que comprende de entre alrededor de 5% a alrededor del 40% del volumen del medio de cultivo.

[0126] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo al invento, donde, la composicion celular es una composicion celular de queratinocitos o fibroblastos y el paso de cultivo celular (B), comprende a por lo menos un paso de adicion de un concentrado de plaquetas diluidas de acuerdo al invento, de tal forma que, la concentracion final en las plaquetas comprende entre alrededor del 5% a alrededor del 40% del volumen del medio de cultivo.

[0127] En otra implementacion, esta presentacion suministra a una composicion celular aislada que puede obtenerse de un proceso de acuerdo a la presentacion.

[0128] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, donde la composicion celular aislada es una composicion de celulas grasas tales como una composicion celular de adipocitos.

[0129] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, donde la composicion celular aislada es una composicion celular muscular tal como una composicion de celulas de mioblastos o de celulas madre satelitales.

[0130] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, donde la composicion celular aislada es una composicion de celulas de la cornea.

[0131] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, donde la composicion celular aislada es una composicion de celulas del cartflago, tales como una composicion de celulas de condrocitos.

[0132] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, que es una composicion de celulas de la piel, tal como una composicion de celulas de fibroblastos o de celulas de queratinocitos.

[0133] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, que es una composicion de celulas de la membrana del periostio o de celulas gingivales.

[0134] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada que es una composicion de celulas del tendon.

[0135] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada que es una composicion de celulas madre, tal como una composicion de celulas madre de cordones umbilicales.

[0136] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, donde la composicion celular aislada es una composicion de celulas de la medula osea.

[0137] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, que es una composicion de celulas de Schwann.

[0138] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, que es una composicion celular de islotes pancreaticos.

[0139] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composicion celular aislada, que es una composicion celular de osteoblastos.

[0140] En otra implementacion, se presenta en este documento a una composiaon celular aislada, donde las celulas estan a una concentracion de alrededor de 3 x 105 a alrededor de 106 celulas/mililitro de plasma o de plasma enriquecido.

[0141] En otra implementacion, se presenta en este documento a composiciones, metodos y formas de uso para promover la regeneracion de sellamiento de heridas y/o de tejidos y/o de huesos en una herida de un humano o de un animal inferior tal como se describe en este documento.

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[ 0142] en otra implementacion adicional, se presenta en este documento a composiciones, metodos y modos de uso para promover la regeneracion de sellamiento de heridas y/o tejidos y/o huesos en una herida de un mairnfero, preferiblemente un humano.

[0143] En otra implementacion, se presenta en este documento a composiciones, metodos y formas de uso para inducir la regeneracion periodontal en una herida o en un defecto periodontal de un mam^era con una enfermedad periodontal u otra condicion tal como se describen este documento.

[0144] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un metodo para inducir la regeneracion periodontal en una herida o en un defecto periodontal o en una carie de un mai^ero con una enfermedad periodontal u otra condicion, y donde, dicho nam^ero es un humano.

[0145] En otra implementacion adicional, se presenta en este documento a un metodo para inducir la regeneracion periodontal en una herida con un defecto periodontal o en una cavidad de acuerdo a la presentacion, donde, dicho monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion sanadora de heridas o de tejidos se aplica en una forma de un gel semisolido o una matriz de crecimiento a dicha herida o dicho defecto periodontal o cavidad tal como se describe, por ejemplo, en Garg et al., 2000, Dental Implantology Update (actualizacion de implantologfa dental), 11(6), 41-44.

[0146] En otra implementacion, se presenta en este documento a un metodo para promover la regeneracion de tejidos de la piel en una cicatriz o en una arruga tal como se describe en este documento.

[0147] En otra implementacion, se presenta en este documento a un metodo para inducir la regeneracion del miocardio de acuerdo a la presentacion, donde dicho monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas musculares de acuerdo a la presentacion se inyecta al miocardio, comunmente, en el miocardio del ventnculo izquierdo. La inyeccion puede realizarse como inyeccion directa o como una inyeccion de varios cateteres. Las celulas de mioblastos o las celulas satelitales pueden disenarse ex vivo tal como se describe en este documento en una estructura des-epitalizada de amnios biologicos humanos y biocompuesta, tal como una capa en esta descripcion. Los amnios se suturan entonces al epicardio isquemico para repoblar el tejido subyacente con celulas madre, para mejorar el poder de contraccion de la pared ventricular y de los miocitos.

[0148] En otra implementacion, se presenta en este documento a un metodo para inducir una regeneracion del miocardio de acuerdo a la presentacion, donde, dicho monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion celular muscular de acuerdo a la presentacion se inyecta al miocardio, junto con un monto terapeuticamente efectivo de una composicion celular de fibroblastos de acuerdo a la presentacion de tal forma que el mdice fibroblastos/mioblastos es de alrededor del 30:70.

[0149] En otra implementacion, se presenta en este documento a un metodo para inducir la regeneracion del miocardio de acuerdo a la presentacion, donde dicho monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion celular muscular, de acuerdo a la presentacion, se aplica en la superficie ventricular en la forma de un parche amniotico que se incuba, preferiblemente, a una composicion de celulas madre de mioblastos y de celulas satelitales de acuerdo a la presentacion.

[0150] En otra implementacion, se presenta en este documento a un metodo para inducir una regeneracion de la cornea de acuerdo a la presentacion, donde dicho monto terapeuticamente efectivo de dicha composicion de celulas de la cornea, de acuerdo a la presentacion, se aplica al tejido de la cornea en forma de un parche amniotico, preferiblemente distribuido en un lente de contacto que puede disolverse.

[0151] Dicho metodo para tratar una herida, un tejido o una enfermedad podna incluir el uso de cualquiera de las composiciones aqm descritas; tambien podna incluir el uso de cualquier composicion hecha por cualquiera de los metodos aqm descritos.

[0152] El metodo de acuerdo al invento presenta las ventajas de suministrar una forma efectiva en cuanto tiempo y relativamente barata para obtener concentrados de plaquetas en una sola operacion que es facil de implementar y que se adapta a una aplicacion en un punto de atencion medica. El metodo del invento presenta la ventaja que aparte de conllevar a preparaciones enriquecidas donde las plaquetas estan concentradas con una produccion alta que no puede obtenerse mediante metodos conocidos, y tambien el contenido de eritrocitos es mucho mas bajo que aquellos niveles obtenidos con metodos conocidos para la preparacion de PRP. Las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento tienen la ventaja de producir un contenido mas alto de plaquetas, un contenido mas bajo de eritrocitos que los PRPs obtenidos mediante metodos conocidos y con propiedades completamente mantenidas para su uso terapeutico subsiguiente in vivo. Mas especficamente, la capacidad de las plaquetas para liberar a los principales factores de crecimiento involucrados en la regeneracion de tejidos (PDGF, TGF-p, IGF, VEGF y EGF) a niveles que se mantienen estables durante algunos dfas (o la vida util de 7-10 dfas de los trombocitos).

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Adicionalmente, si las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento se producen de sangre autologa, el invento aqm descrito reduce los riesgos de transmision de enfermedades y de inmuno-reacciones asociadas con el uso del tratamiento de materiales hechos de sustancias biologicas obtenidas de una o mas terceras partes.

[0153] El metodo del invento, suministra, por lo tanto, un material biologico de regeneracion de tejidos y de sanacion de heridas, preferiblemente autologo, que promueve la regeneracion de tejidos, tales como, la piel, el cartriago y los huesos, especialmente promueve la cicatrizacion y/o el rejuvenecimiento. Los beneficios del invento comprenden a un metodo simple y rapido para la preparacion de materiales mejorados, para la regeneracion de tejidos y para la sanacion de heridas, adaptados a servicios en puntos de atencion y que han demostrado reducir el tiempo de sanacion, el dolor asociado y los costos medicos. Ademas, los materiales mejorados de sanacion de heridas y de regeneracion de tejidos reducen los riesgos de rechazo de injertos y mejoran los indices de exito de injertos. Ademas, los materiales mejorados de sanacion de heridas y de regeneracion de tejidos conllevan a que el aspecto final estetico de las cicatrices sea mucho mejor y que el relleno de cicatrices y arrugas sea mucho mas durable.

[0154] Comunmente, los extractos celulares se obtienen de una biopsia de tejidos que se realiza preferiblemente el dfa antes de la mezcla con el concentrado de plaquetas bajo el paso a). El tamano de las biopsias se adapta al proposito terapeutico en cuestion y a los tipos celulares utilizados en la preparacion de la composicion celular de acuerdo a la presentacion. Ejemplos de biopsias se presentan en los ejemplos a continuacion para diferentes tipos de tejidos.

[0155] Ejemplos que ilustran al invento se describiran a partir de este momento en este documento en una forma mas detallada y mediante referencias a las secciones presentadas en las figuras.

EJ EMPLOS

Las siguientes abreviaciones se refieren respectivamente a las definiciones a continuacion:

[0156] ATS (autologous thrombin serum - suero autologo de trombina); BU (Baxothrobin unit - unidad de Baxotrobina); DMEM (Dulbecco's minimum essential medium - medio esencial mmimo de Dulbecco); DMSO (Dimethyl Sulfoxide - sulfoxido de dimetilo); EC (Enriched clot - coagulo enriquecido); FCS (fetal calf serum - suero fetal de ternero); HT (healing time - tiempo de sanacion); IU (International Unit - unidad internacional); PBS (Phosphate Buffered Saline - sustancia salina amortiguada de fosfato); PET (polyethylene terephthalate - tereftalato de polietileno); PRP (platelet- rich plasma - plasma rico en plaquetas); PPP (platelet-poor plasma - plasma con niveles bajos de plaquetas); USP (United States Pharmacopoeia - Farmacopea de Estados Unidos); cm (centnmetro); dL (decilitro); g (gramo); Gy (gray - gris); J (Joule - Julio); L (litro); min (minuto); mm (milmetro); M (molar); mL (mililitro); nm (nanometro); rpm (revolucion por minuto); Vol. (volumen).

PROCEDIMIENTOS Y CONDICIONES GENERALES

[0157] Para determinar la efectividad de las composiciones obtenidas mediante el metodo del invento para promover la sanacion de heridas y/o huesos y/o la regeneracion de tejidos, se realizaron los siguientes experimentos.

[0158] Se recaudaron muestras de sangre humana completa en un tubo separador. Un tubo separador para el uso en un metodo de acuerdo al invento es, por ejemplo, un tubo de vidrio de aproximadamente 15 ml (16 mm de diametro y 130 mm de largo) que contema a 3 ml de gel tixotropico que se basa en poliester, asf como 1 ml de una solucion de citrato de sodio a 0.1 M y que contiene un vacfo usable de alrededor de 8.5 mililitros. Este tubo separador constituye a un dispositivo listo para utilizarse para la preparacion de una composicion de concentrado de plaquetas por medio del metodo del invento (tambien llamado RegenTHT™ (Tubo Cosechador de Trombocitos) de Regen Lab, Suiza).

[0159] Otro ejemplo de un tubo separador para su uso en el metodo del invento es un tubo de aproximadamente 10 mm en PET (polyethylene terephthalate - tereftalato de polietileno) que contiene 1 ml de un gel tixotropico que contiene a una mezcla polimerica y a citrato de sodio anlmdrido depositado en la superficie interior del tubo el cual fue untado mediante aerosol (alrededor de 3.5 miligramos por mililitro de sangre) y que contiene un vacfo usable de, o de alrededor de, 8 ml, el cual constituye un dispositivo listo para utilizarse para la preparacion de un concentrado de plaquetas (tambien llamado RegenBCT™ (Blood Cell Therapy - Terapia de Celulas Sangumeas) de Regen Lab, Suiza).

[0160] Estos tubos se esterilizan mediante irradiaciones (tal como se prescribe por ISO 11137, UNI EN ISO 11737-2, UNI EN 552, UNI EN 556) y se sellan hermeticamente mediante una tapa tradicional tal como un tapon de caucho convencional de bromobutilo moteado para el tubo de vidrio y un tapon de clorobutilo que tiene un cobertor de polietileno para la seguridad del operador.

[0161] Entonces, el tubo separador se centrifuga a alrededor de 1500 g a alrededor de 2000 g durante alrededor de 3 a 10 minutos, es decir, a alrededor de 2500 revoluciones por minuto hasta alrededor de 3800 revoluciones por minuto con una centrifugacion con un rotor oscilante, que tiene un radio de 20 cm. En caso de que un equipo

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centrifugador tenga un rotor con un angulo fijo de alrededor de 45°, el tiempo de centrifugacion deberfa durar, por lo menos, alrededor de 15 minutos.

[0162] Despues de la centrifugacion, el concentrado de plaquetas se recauda para su uso en aplicaciones terapeuticas o cosmeticas de la presentacion o para la preparacion de composiciones adicionales que contienen el concentrado obtenido de plaquetas a traves de la mezcla con agentes adicionales tales como extractos celulares, preferiblemente autologos (por ejemplo, queratinocitos, fibroblastos, celulas de la medula osea, osteoblastos, condrocitos, mioblastos, celulas de la cornea, celulas de Schwann, celulas grasas, celulas madre de cordones umbilicales, celulas de tendones, celulas de islotes pancreaticos, celulas de ligamentos y gingivales, celulas de la membrana del periostio) y/o sustitutos oseos y/o activadores de la coagulacion.

[0163] Para las aplicaciones terapeuticas se utiliza un botiqufn adaptado para la regeneracion de tejidos (tambien llamado RegenKit™) que tiene a 2 ampollas esteriles que comprenden a:

- Una ampolla (RegenPRP™) que comprende a accesorios para los tubos separadores de flebotomfa de la presentacion (RegenTHT™ o RegenBCT™), opcionalmente matraces de ETOH y de CACh para la preparacion de un suero autologo de trombina (RegenATS™).

- Una ampolla (RegenApplicator™) que tiene 2 jeringas (por ejemplo, de 1 ml y de 1 o 3 ml), sostenedores y sujetadores en un aplicador con una punta con una salida dual.

[0164] Para la preparacion de la composicion celular, se preparan a las celulas de acuerdo al protocolo general a continuacion:

a) Biops ia

[0165] Una biopsia del tejido correspondiente se obtiene bajo condiciones esteriles utilizando metodos estandar adaptados a la celula especffica que se recolectara. Las celulas se utilizan extemporaneamente u opcionalmente despues de la proliferacion de cultivos ex-vivo y de la proliferacion celular tal como se describe mas adelante.

b) Cultivos ex vivo y la proliferacion celular

[0166] Las celulas utilizadas para la preparacion de composiciones celulares, tales como los queratinocitos, las celulas de la medula osea, los fibroblastos; las celulas del periostio o de la cornea, tales como celulas madre corneales del limbo; melanocitos y las celulas de Langheran; celulas grasas, celulas musculares tales como los mioblastos y las celulas satelitales; osteoblastos, condrocitos; celulas del cordon umbilical; las celulas de Schwann; celulas de tendones o pancreaticas, se expanden en un medio portador de celulas (por ejemplo, DMEM o Ham) en placas (por ejemplo, placas de Petri o matraces de cultivo) cubiertas con un concentrado de plaquetas de acuerdo a la presentacion, preferiblemente autologo, enriquecido con fibronectina. El medio de cultivo podrfa enriquecerse preferiblemente con DMEM por ejemplo en el caso de queratinocitos. Para las celulas tales como los osteoblastos oseos los condrocitos y los mioblastos, es necesaria la digestion enzimatica del tejido correspondiente en la presencia de 4 ejemplos de colagenasa o de tripsina antes de colocarlos en placas. La incubacion de las placas se realiza a 37 °C bajo un flujo de gas de 95% de oxfgeno o aire y el 5% de dioxido de carbono. Comunmente, el tiempo de incubacion varfa entre los 10 y 20 minutos. La expansion celular podrfa incrementarse (tal como, por ejemplo, en el caso de mioblastos, fibroblastos y celulas de condrocitos).

[0167] Mediante fototerapia (por ejemplo, exposicion a la luz a 633 nm durante alrededor de 10 minutos a 2J/centfmetro cuadrado, una vez a la semana durante la fase de incubacion).

[0168] Los explantes podrfan cultivarse en placas de Petri o en matraces de cultivo utilizando tecnicas de levantamiento de aire (Molnar et al., 1996, Tissue & Cell (Tejido y Celula), 28:547-556) y un metodo de interfaz de aire ((Meller et al., 2002, Br. J. Opht., 86, 463-471) con la mitad del explante expuesto al aire. El medio de cultivo se cambia regularmente durante la incubacion, tal como cada 3 dfas. La expansion de las celulas en una modalidad de 2 dimensiones como monocapas planas, se obtiene, por ejemplo, para celulas de mioblastos, fibroblastos, y de condrocitos. Un patron creciente de celulas en 3 dimensiones puede obtenerse, por ejemplo, para celulas de la cornea, de mioblastos, de fibroblastos, de condrocitos, de adipocitos y de queratinocitos, agregando una composicion diluida con un concentrado de plaquetas de acuerdo a la presentacion de alrededor del 5 a alrededor del 40% del volumen del plasma o del plasma enriquecido al medio de cultivo. Comunmente, la adicion de un concentrado autologo diluido de plaquetas de acuerdo a la presentacion se realiza 2 o 3 veces durante el tiempo de incubacion. Un portador biologico de 3 dimensiones que se obtiene de esa forma permite mejorar a la matriz extracelular lo que resulta util para la transferencia de celulas madres autologas. Despues de la incubacion, las celulas son liberadas nuevamente de las placas con una digestion de tripsina suave que levanta las celulas permitiendo que se coloquen en peletes.

c) Calidad celular y revision de seguridad

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[0169] La viabilidad celular en la preparacion celular que se obtiene de esa forma se revisa mediante un recuento de celulas en una forma microscopica, un recuento de flujo-citometrico junto con inmunoqufmica en marcadores de tejido mediante tecnicas estandar. La viabilidad celular tambien se examina mediante tripano azul justo despues de la liberacion celular mediante tripsina. La seguridad de la preparacion tambien se revisa a traves de una revision de contaminacion mediante un ensayo microbiologico para excluir la contaminacion con virus o bacterias y para evitar la transferencia de infecciones zoonoticas. La utilizacion de FCS se evita, evitando, de esa forma, la transmision de la enfermedad de la vaca loca.

d) Administracion de la preparacion celular

[0170] La preparacion celular obtenida como se menciono anteriormente se coloca en una composicion autologa con un concentrado de plaquetas de acuerdo a la presentacion como un vehfculo portador de celulas antes de la entrega para el paciente. Entonces, la preparacion celular obtenida, tal como se acaba de mencionar, se inyecta o se trasplanta al paciente. La modalidad de inyeccion o de trasplante debe adaptarse al tipo de celulas contenidas en la preparacion celular de acuerdo a la presentacion y al efecto terapeutico o estetico deseado. Se dan mas detalles en los ejemplos que se muestran.

[0171] mas adelante acerca del metodo para la preparacion y el uso de las composiciones celulares, mas especfficamente, dependiendo del tipo de celulas y del efecto terapeutico o estetico deseado.

[0172] Las preparaciones de celulas de queratinocitos o de fibroblastos de acuerdo a la presentacion podrfan utilizarse facilmente despues de la recaudacion o despues del cultivo celular tal como se describio anteriormente. Sin embargo, las preparaciones celulares de acuerdo a la presentacion se elaboran preferiblemente despues del cultivo celular tal como se describio anteriormente.

[0173] Las preparaciones celulares presentan una mejor viabilidad y estabilidad (incluyendo la integridad de propiedades preservadas de celulas tales como la capacidad de sintetizar protefnas y de entrega de factores de crecimiento) que las celulas preparadas en un medio sin la composicion autologa con un concentrado de plaquetas de acuerdo a la presentacion. Ademas, la proliferacion celular obtenida de esa forma mejora: las celulas crecen mas rapido (alrededor de 3 a 5 dfas mas rapido) y son mas densas en comparacion a los medios de control y a los medios sin sueros. La ventaja del proceso para la preparacion de una composicion celular de acuerdo a la presentacion es que el mismo medio autologo se utiliza como un vector para cultivos celulares, para la preservacion celular, para la inyeccion de celulas, para vectores para bio-estimulaciones celulares y para la regeneracion de tejidos.

Ejemplo 1: preparacion de un concentrado autoloao de plaquetas

[0174] Tubos separadores para su uso en el metodo del invento se prueban por anticipado para detectar si tienen una buena tolerancia, para detectar cualquier toxcidad y para detectar si no tienen mutagenicidad del gen tixotropico de acuerdo a las normas ISO 10993-11, ISO 10993-10, ISO 10993-12 e ISO 10993-3.

[0175] Alrededor de 8,5 a alrededor de 10 ml de una muestra de sangre humana se recaudan dentro del tubo separador para su uso en el metodo del invento, donde la sangre se aspira. La mezcla se centrifuga aproximadamente a 3800 revoluciones por minuto durante 3,5 minutos. El plasma rico en plaquetas se recauda entonces.

[0176] El analisis del concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento demostro que contiene de 2 a 4 veces los niveles normales de plaquetas y de factores de crecimiento, en comparacion a un coagulo natural de sangre, mientras que mantienen niveles normales de fibrina y de fibrinogeno y virtualmente no contiene celulas de sangre (menos del 1% de hematocrito en comparacion con el 35-50% en un coagulo normal de sangre y un 15-20% en plasma rico en plaquetas obtenido mediante metodos conocidos de preparacion). El estudio muestra ademas la presencia de fibronectina protefnica de leucocitos lo cual demuestra que se conservan las propiedades de coagulacion.

[0177] La composicion del concentrado de plaquetas (tambien llamado RegenPRP™ de Regen Lab, Suiza) en comparacion con sangre completa, plasma completo y plasma con niveles bajos de plaquetas se presenta en la tabla uno a continuacion:

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Muestra: Globulos blancos' (x 109/litro) Globulos rojos (x 1012/litro Hemoglobina (gramos/decilitro) Plaquetas (x 109/litro)

Sangre completa: 6,6 4,43 13,5 269

Plasma completo: 2,8 “004 0,4 “305

Plasma rico en plaquetas: 14,2 0,57 2,1 570

Plasma con niveles bajos de plaquetas: 0 0 0,1 116

[0178] El experimental se repitio en algunos pacientes y se observe que los concentrados obtenidos de plaquetas presentaron concentraciones reproducibles de plaquetas (por lo menos 300 x 109 celulas/litro), globulos blancos (por lo menos 7,0 x 109 celulas/litro), fibrinogeno (por lo menos 3 miligramos/litro) y eritrocitos (menos que 0,6 x 1012 celulas/litro).

[0179] La produccion de plaquetas obtenidas por el metodo del invento se midio (90-99%) y demostro que se incremento drasticamente en comparacion con las producciones de plaquetas (30-62%) obtenidas por medio de metodos conocidos de la preparacion descrita en Marx et al., 2004, mencionada anteriormente.

Adicionalmente, se demostro a traves de botiquines ELISA (R&D Systems, Inc.) y por medio de la respuesta a la activacion de coagulacion del concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento, que la actividad de los factores de coagulacion se conservaron: la concentracion de dfmeros D (productos que descomponen la fibrina), los marcadores conocidos de la activacion de la coagulacion, y el proceso de lisis son estables, y, por lo tanto, las propiedades de coagulacion del concentrado de plaquetas no se debilitan por el proceso del invento.

Los niveles de los factores de crecimiento (PDGF, EGF, TGF-p y VEGF) del concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento son estables, en una forma demostrable, durante por lo menos 72 horas (4 dfas) cuando se almacenan a la temperatura del cuarto en un tubo separador esteril para su uso en los metodos del invento. La evolucion de los factores de crecimiento PDGF BB, EGF y VEGF durante 72 horas se presenta en la figura 1.

[0180] Las propiedades del concentrado de plaquetas obtenido mediante un metodo de acuerdo al invento hace posible concebir la preparacion de un concentrado de plaquetas obtenido utilizando el procedimiento del invento, uno a varios dfas antes de una cirugfa reparativa, para reducir la carga de trabajo en la sala de operaciones y acelerar el procedimiento quirurgico.

[0181] Para usos terapeuticos subsiguientes, el concentrado autologo de plaquetas se mezcla, generalmente, con un activador convencional de coagulacion tal como un activador de trombina (por ejemplo, cloruro de calcio, por ejemplo, el 10%), mezclado opcionalmente con un activador de fibrinogeno tal como la trombina, preferiblemente homologa (por ejemplo, de 10 UI a 100 IU por mililitro de plasma), batroxobina (por ejemplo, 20 BU por mililitro de plasma) o una preparacion enriquecida con trombina.

Ejemplo 2: uso terapeutico del concentrado autoloao de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento

a) Pacientes:

[0182]

Se seleccionaron a 3 pacientes que presentaban heridas cronicas que nosesanaban:

- Un paciente de 88 anos (paciente 1) que padecia de angiosarcoma de Kaposi en varias ubicadones en las extremidades inferiores y una necrosis inducida por radioterapia en la pierna izquierda. La necrosis inducida por radioterapia resulta de tratamientos de radioterapia. 12 meses despues del final del tratamiento de rayos equis de bajo voltaje, la necrosis consistia de una ulcera profunda super infectada rodeada por una costra (35 x 25 mm). La herida fue tratada previamente sin ningun exito con varios tratamientos tales como con esteroides ycomo cremas sanadoras.

- Un paciente de 81 anos (paciente 2) que padecia de un carcinoma espinocelular del vertice que presentaba una ulceracion cutanea (de alrededor de 10 mm de diametro) con disqueratosis periferica sin ninguna serial de infeccion que resulta de una reseccion de una biopsia y una radioterapia postquirurgica (dosis total de 52 Gy).

- Un paciente de 60 anos (paciente 3) que recibio una irradiacion prequirurgica (7 Gy) para una sintesis de la tibia y de la fibula en la pierna derecha presentaba una necrosis inducida por radioterapia que consistia de una ulcera profunda (50 x30 mm de diametro)sin inflamaciones.

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[0183] 8.5 mililitros de una muestra de sangre se toma de cada paciente y se centrifuga en un tubo separador tal como se describio en el ejemplo 1, de acuerdo a los protocolos descritos en el ejemplo 2. Los concentrados resultantes de plaquetas se mezclan entonces con cloruro de calcio a un 10% del volumen. Cada composicion autologa de concentrados de plaquetas se aplica entonces al lugar de la herida de epidermiditis radiologica del paciente respectivo. La herida se cubre y se protege entonces con compresas humedas (dfa 1).

[0184] Entre los dfas 3 y 5, se revisa el estado de la herida y se cambia el vendaje de la herida. En el dfa 7 ± 1 se obtiene una nueva aplicacion de una nueva preparacion autologa del concentrado mediante el metodo del invento. En efecto, la misma secuencia de tratamiento se sigue con los mismos intervalos de tiempo hasta la cicatrizacion completa de la herida.

b) Efectos sanadores:

[0185]

Paciente 1: Sanado lento y regular de la ulcera. Cicatrizacion completa despues de 189 dfas.

Paciente 2: Sanado muy rapido obtenido en 21 dfas.

Paciente 3: Sanado progresivo y regular. Cicatrizacion completa despues de 41 dfas. Estos resultados muestran el efecto beneficioso de la composicion con un concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento en ulceras cronicas inducidas por ondas de radio, incluso en los casos de aquellas que fueron resistentes a tratamientos topicos previos en la ausencia de cualquier accion alergica.

Ejemplo 3: Uso terapeutico del concentrado autoloao de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento en combinacion con un suero autoloao enriquecido con trombina

[0186] Para activar la coagulacion, una alternativa a la mezcla del concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento con un activador de trombina antes de su uso en un paciente, tal como se describio en el ejemplo 1, es la combinacion del concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento con un activador de fibrinogeno tal como una composicion enriquecida con trombina y, preferiblemente, con un suero de trombina (por ejemplo, autologo) de acuerdo al metodo del invento.

a) Preparacion de un suero autologo de trombina (ATS - autologous thrombin serum)

[0187] Un suero autologo de trombina para utilizarse como una preparacion enriquecida con trombina se elabora mediante un proceso que comprende la adicion a la muestra de sangre completa de un paciente (por ejemplo, 8 ml) recaudada en un tubo separador para usarse en el metodo del invento tal como se describio en el ejemplo 1, una solucion con un 95% del volumen de etanol (por ejemplo, 1 ml) y cloruro de calcio 10% (por ejemplo, 1 ml) a la mezcla (tambien llamada RegenATS™ de Regen Lab, Suiza) se le permite precipitarse durante alrededor de 30 minutos a la temperatura del cuarto. Despues de 30 minutos, casi el 80% de la antitrombina (entre otras protefnas similares al fibrinogeno) se precipita; entonces el tubo se centrifuga a, alrededor de, 1500 g durante alrededor de 8 a 10 minutos y el suero autologo de trombina esta listo para usarse en combinacion con el concentrado rico en plaquetas obtenido mediante el metodo del invento.

b) Preparaciones combinadas

[0188] Una originalidad de este proceso es que despues del paso inicial de incubacion del proceso de preparacion del suero autologo de trombina (por ejemplo, de por lo menos alrededor de 30 minutos), los tubos separadores para su uso en el metodo del invento que contiene respectivamente a la preparacion autologa de suero de trombina y a la preparacion del concentrado de plaquetas pueden centrifugarse simultaneamente para obtener a 2 preparaciones de extractos sangufneos listas para utilizarse al mismo tiempo.

c) Uso combinado

[0189] Para permitir la polimerizacion de fibrinogeno a una malla de fibrina (lo cual ocurre durante el proceso de coagulacion) para que ocurra unicamente en el momento de la aplicacion de la preparacion rica en plaquetas a la herida, la composicion del concentrado de plaquetas y el suero autologo de trombina (activador de coagulacion) se aplican simultaneamente con un fndice de volumen de alrededor de 10:1 a alrededor de 10:3 (el fndice de concentrado en relacion al activador de coagulacion) a la herida.

[0190] La entrega simultanea de ambas preparaciones se logra, por ejemplo, mediante un dispositivo que comprende a 2 jeringas (por ejemplo, una jeringa de 10 ml para la composicion de concentrado de plaquetas y una

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jeringa de 1 o 3 ml para el suero de trombina), que liberan a las preparaciones simultaneamente para que se mezclen y se polimericen cuando entren en contacto con la herida.

Ejemplo 4: uso terapeutico del concentrado autoload de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento en combinacion con un extracto de celulas de la piel

[0191] Un total de 35 pacientes que recibieron anteriormente injertos de piel (que representaba menos del 15% de la superficie de la piel) se induyeron en el estudio. Se excluyeron a pacientes tratados con inmu nos up res ores o corticoides o con insuficiencia renal o a artropatfa periferica. Todas las siguientes manipuladones se realizaron bajo reglas estrictas de asepsia y esterilidad.

Grupo A: 13 pacientes

a) Preparacion del concentrado de plaquetas

[0192] Una muestra de 8,5 mililitros de sangre completa de cada paciente (de una extremidad superior donde no exstfan perfusiones) se recaudaron en un tubo separador para su uso en el metodo de acuerdo al invento. El tubo separador con la sangre completa se centrifuga inmediatamente durante alrededor de 8 minutos a 2800 revoluciones por minuto. Antes de que se recaude al plasma enriquecido (PRP), el operador descarta la mitad o 2 ml del sobrenadante y vuelve a suspender las plaquetas en el plasma remanente. El concentrado rico en plaquetas se transfiere entonces a un tubo esteril y se mantiene a una temperature de 37 °C.

b) Recubrimiento de las heridas

[0193] El concentrado autologo de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento (tambien denominado RegenPRP™) se mezcla con una solucion de cloruro de calcio 10% a una tasa de 10:1 y el lugar donante del injerto (donde se removio la piel) de cada paciente respectivo se recubre con la mezcla autologa correspondiente para obtener la coagulacion del concentrado de plaquetas en la herida.

Grupo B: 8 pacientes

a) Muestras de celulas de la piel en el paciente

[0194] Se extraen queratinocitos de cada uno de los pacientes de este grupo. Una muestra delgada de piel saludable (de alrededor de 2 cm2) se remueve de cada paciente y se lava 3 veces en una solucion de PBS. La biopsia lavada se deposita entonces en una placa de Petri que contiene tripsina y se corta en fragmentos muy pequenos (0,5 centfmetros x 0,5 centfmetros) con un bisturf. Los fragmentos de piel se incuban entonces durante 45 minutos a 37 °C en un dispositivo agitador en un 20% del volumen de una composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenidas mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominada RegenPRP™ que se consiguio anteriormente. El sobrenadante se recauda, se centrifuga y las celulas se re-suspenden en una solucion de PBS. El recuento de queratinocitos se determina bajo microscopio. Finalmente, los queratinodtos obtenidos se re- suspendieron en el concentrado autologo de plaquetas obtenido mediante el metodo de acuerdo al invento (5-40% volumen) del paciente correspondiente.

b) Preparacion del concentrado de plaquetas

[0195] El procedimiento es el mismo que para el grupo A

c) Recubrimiento de heridas

[0196] La suspension de queratinocitos (tambien llamada RegenExtracell™) se aplica tan pronto como sea posible (la preparacion completa no debe exceder un dfa) en la herida en la misma forma que se describio en el caso del grupo A

Grupo de control: 14 pacientes

[0197] El lugar donante del injerto de cada paciente de este grupo se recubre con una compresa no terapeutica (Jelonet®).

Mezcla aleatoria y tratamiento

[0198] En el bloque quirurgico, despues de la remocion de la piel insertada, el lugar donante se recubre con una compresa temporal empapada con una solucion de adrenalina (una ampolla de 1 mg/mililitro de adrenalina diluida en 500 ml de NaCl a un 0.9 por ciento) y dependiendo de la tabla de mezcla aleatoria, el lugar del donante se trata de acuerdo a los 3 siguientes metodos: grupo 1 y 2: recubrimiento de la herida con la composicion sanadora de heridas respectiva y el recubrimiento de la herida con una compresa no terapeutica (Jelonet®).

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[0199] Grupo 3: Recubrimiento directo de la herida con una compresa no terapeutica (Jelonet®).

[0200] Las compresas son recubiertas entonces con bandas Kerlix®y bandas elasticas tales como "Velpeau". Criterios de eficacia del tratamiento

[0201] La eficacia del tratamiento se evalua de acuerdo a 3 criterios:

- El tiempo necesario para completar la cicatrizacion del lugartratado (tiempo de sanacion o HT - healing time - en dias)

- La epitelizacion (evolucion del progreso de cicatrizacion) medido en el dia 5 despues del tratamiento de acuerdo a 7 niveles:

0: ausente

1: ligero

2: moderado

3: importante

4-7: muy importante, niveles crecientes de importancia;

- El dolor evaluado en el dia 5 despues del tratamiento, por el paciente mismo, generalmente en el momenta de cambio de compresas en una escala del 0 al 10 (0: sin dolor y 10: dolor extremo). La compresa se abre en el dia 5 despues de la cirugia para permitir la evaluacion de la calidad del tratamiento y se cubre con nuevas compresas Jelonet® recubiertas con compresas secas. Las compresas se cambian entonces cada 2 dias hasta que se completa la cicatrizacion. Cualquier efecto colateral o complicacion medica se vigila durante toda la duracion del proceso de cicatrizacion.

Resultados

[0202] Los resultados de los tratamientos para cada grupo de pacientes (grupo de control: C, grupo A RegenPRP™, grupo B: RegenExtracell™) se presentan en la figura 2 en terminos de tiempo de sanacion en dias (HT - healing time), dolor en el dia 5 (P - pain) y epitelizacion en el dia 5 (E). La linea de puntos indica el momenta en que se cambia a la primera venda en el dia 5.

[0203] El proceso de cicatrizacion se estimula daramente por el uso del concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento en comparacion con el grupo de control. La calidad de la cicatrizacion tambien es mejor en el caso del uso del concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo del invento. Adicionalmente, el dolor en el lugar donante se reduce dramaticamente en los casos en los que se utiliza el concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento en comparacion al grupo de control. Todos los efectos beneficiosos del concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento se incrementan cuando se utiliza una mezcla de queratinocitos suspendidos en el concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento.

El tiempo medio de sanacion es de 7 dias para el grupo tratado con un concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento y 5 dias cuando se suspenden queratinocitos en el concentrado de plaquetas en comparacion a un promedio de 12 dias en el grupo de control. La tolerancia fue excelente y no se detectaron efectos colaterales o alergias.

Esto demuestra que el concentrado de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento, solo o combinado con queratinocitos, es muy eficaz para acelerarel proceso de sanacion de heridas y ademas de reducir el dolor, reduce la reaccion inflamatoria y mejora el aspecto final de la cicatriz.

[0204] Aternamente, usando el mismo proceso de disociacion, se pueden colocar a celulas de la piel en una placa de Petri recubierta con la composicion autaloga de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien llamada RegenPRP™, obtenida tal como se menciono anteriormente y cultivada durante 2 a 5 dias. Entonces, antes del injerto, la preparacion obtenida de celulas de la piel podria esparcirse con aerosol en la herida, para preparar al sitio para una mejor integracion biologica de las celulas implantadas, y una mejor expansion in vivo.

Eiemplo 5: Uso cosmetico del concentrado autoloao de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento

[0205] Una composicion autologa de concentrado de plaquetas se prepara tal como se describe en el ejemplo 1. 5

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ml de esta composicion de un concentrado de plaquetas (tambien llamada RegenACR™: (rejuvenecimiento de celulas autologas) de RegenLab, Suiza) se inyecta subcutaneamente en una ranura de arruga como material de relleno de arrugas, en la misma forma que se hace comunmente con otros rellenos de arrugas tales como el acido hialuronico. La profundidad de la arruga se reduce progresivamente en las primeras semanas despues del tratamiento y en el lugar de la inyeccion, se obtiene una regeneracion muy clara del area con un resultado optimo en 2 a 3 meses. En contraste con lo que se observo con otros materiales de relleno de arrugas, no se observo ninguna inflamacion ni hinchazon en el lugar de la inyeccion y el beneficio es duradero en contraste con el acido hialuronico que se reabsorbe biologicamente despues de 4 a 6 meses.

[0206] Pueden utilizarse metodos conocidos para estudiar el efecto de composiciones autologas de concentrado de plaquetas obtenidas mediante el metodo del invento en la profundidad de arrugas tal como una reconstitucion tridimensional de alivio de la piel mediante perfilometerfa optica (metodo de lapiz) (Grove et al., 1989, J. Am. Acad. Dermatol, 21: 631-7) o mediante microscopfa laser en replicas de silicona de la piel. Otro metodo consiste en una cuantificacion in vivo de la superficie de la piel «evaluacion superficial de la piel viva» o «SELS (Surface evaluation of living skin)» a traves del analisis de imagenes en luz ultravioleta (Tronnier et al., 1997, Akt. Dermatol, 23 :290- 295). Otro metodo para la evaluacion superficial de la piel viva se basa en un sistema optico con una camara CCD que mide los 4 parametros de la piel: aspereza, escamas, suavidad y arrugas (Fluhr et al., 1995, Akt. Dermatol, 21:151-156). La aumentacion dermica profunda puede evaluarse mediante ultrasonido, Dermascan®, Dinamarca).

[0207] Otros ejemplos del uso del concentrado autologo de plaquetas obtenido mediante el metodo del invento incluyen:

Mezclar y agregar al concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento con una crema, preferiblemente una emulsion, antes de la aplicacion a una herida, despues de la cirugfa o en piel sana. Durante el proceso de absorcion, la preparacion de plaquetas se unta en la piel mediante la crema o mediante una emulsion para amplificar el beneficio de hidratacion y estimular biologicamente la regeneracion o el rejuvenecimiento de la piel.

[0208] Usando un hidrogel similar a una preparacion de Albugel (EP 1 543 846) de un 100% de albumina o cualquier otro hidrogel resultante de la reticulacion de albumina y otro compuesto qufmico similar al glicol de polietileno o cualquier otro ingrediente, usando un portador altamente hidrofflico que se basa en papel para dejarlo en contacto con la piel hasta que el plasma rico en plaquetas se absorba.

Eiemplo 6: Preparacion autologa de una asociacion de celulas de los musculos

[0209] Un ejemplo de asociacion autologa de celulas puede prepararse utilizando el proceso de acuerdo al invento donde las celulas del musculo esqueletico (celulas progenitoras de musculo o celulas madre satelitales) se suministran bajo el paso (d) o (e).

a) Celulas madre progenitoras de mioblastos

[0210] La biopsia del musculo esqueletico se obtiene del vasto lateral y mide 7 * 3 cm. El musculo se ceba el dfa antes de la biopsia, con una inyeccion intramuscular en el lugar propuesto de la biopsia (10 * 15 cm de area de la piel en el aspecto lateral del muslo subyacente al musculo vasto lateral justo arriba de la union de la rodilla, en cualquier lado) con Decadon y Bupivacafna (lidocafna de duracion larga). El musculo se corta en pedacitos y se digiere enzimaticamente con una combinacion de colagenasa, pronasa y tripsina (Worthington). La accion enzimatica se neutraliza utilizando el suero de los pacientes en un medio de cultivo DMEM. El explanto muscular se pone en placas de Petri cubiertas con la composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominado RegenPRP™ (preparado tal como se describio en el ejemplo 4) y se incuba en un 95% de oxfgeno y un 5% de dioxido de carbono a 37 °C durante 3 a 4 semanas. Se utiliza una expresion de desmina o de CD-56 como un marcador de mioblastos para identificar a los mioblastos de los fibroblastos. La proliferacion de celulas progenitoras de mioblastos se muestra tridimensionalmente en la figura 3.

[0211] La proliferacion celular puede mejorarse mediante la exposicion foto-luminosa a 633 nm de 2 J/centfmetro cuadrado durante 10 minutos durante el cultivo. El dfa del trasplante (por ejemplo, 3 a 4 semanas despues de la incubacion), las celulas de musculo esqueletico se liberan mediante tripsina y se colocan en la composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominada RegenPRP™ (preparada tal como se describe en el ejemplo 4). Las inyecciones al miocardio pueden hacerse como inyecciones directas o como inyecciones de cateteres multiples en el miocardio del ventrfculo izquierdo. La preparacion celular de mioblastos obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento es util para enfermedades cardiacas tales como la regeneracion del corazon, el tratamiento de fallas del corazon, fallas cardfacas cronicas, fallas cardfacas isquemicas y no isquemicas y cardiomiopatfas no isquemicas. La fraccion de eyeccion puede mejorarse por un 9% para receptores cardiacos de mioblastos esqueleticos.

[0212] La preparacion celular que se acaba de mencionar tambien puede ser util en el tratamiento de incontinencia urinaria (extractos celulares de mioblastos preparados tal como se describio anteriormente y que se inyectan al

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cuello de la vejiga), esofagitis por reflujos o la enfermedad de reflujos gastroesofagicos (extractos celulares de mioblastos preparados tal como se describio anteriormente e inyectados en el esffnter inferior esofagico) e incontinencia anal (extractos celulares de mioblastos preparados tal como se describio anteriormente e inyectados en el area para-anal). Alternamente, una preparacion combinada de fibroblastos y de mioblastos podrfa ejecutarse (los fibroblastos estan presentes en la biopsia muscular y brotan del perimisio junto con las celulas madres de miotubos y celulas madres satelitales). En el caso del tratamiento de enfermedades cardiacas, una mezcla de una preparacion de celulas de fibroblastos y de una preparacion de celulas de mioblastos (obtenidas de acuerdo a como se indico anteriormente) se insertan en el miocardio con una tasa de fibroblastos/mioblastos de alrededor de 30:70.

[0213] Para el tratamiento de incontinencia del cuello de la vejiga, un cultivo separado de fibroblastos se realiza al mismo tiempo que los mioblastos tal como se describio anteriormente y la preparacion celular de fibroblastos se inyecta adyacentemente a la uretra y una preparacion celular de mioblastos se inyecta en el rabdoesffnter, bajo control de ultrasonido.

b) Celulas madre satelitales

[0214] Las celulas madre de mioblastos y satelitales son cultivadas ex vivo en la presencia de la composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominada RegenPRP™. Se observe un cebado de proliferacion celular despues de 7 dfas del cultivo primario.

[0215] Las celulas se cultivan entonces durante 3-4 semanas despues de la incubacion y se colocan en el medio de cultivo de tejidos (DMEM junto con un 5-10% volumen de la composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento) que contienen un parche de amnios des-epitelizados humanos de 4 x 4 cm y la composicion autologa del concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominada RegenPRP™ (preparada tal como se describio en el ejemplo 4). Se expone a la preparacion a una irradiacion ultravioleta durante 10 minutos. Durante la incubacion (comunmente alrededor de 2 a 3 semanas), las celulas se esparcen sobre la estructura de amnios y forman una monocapa. Se evalua la viabilidad y el progreso de la monocapa mediante biopsias del filo del parche 2 veces a la semana y una evaluacion histologica del grosor de la monocapa.

[0216] El dfa de trasplante (por ejemplo, 3 a 4 semanas despues de la incubacion), la superficie ventricular se esparce con la composicion autologa del concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominada RegenPRP™ (preparada tal como se describio en el ejemplo 4) y entonces el parche obtenido tal como se menciono anteriormente se coloca con las celulas hacia abajo en una superficie cruda del ventrfculo isquemico para permitir a las celulas madres en el parche poblar el segmento isquemico despues de la inyeccion ventricular. La retencion celular se mantiene mediante los amnios que son inertes y no inducen ninguna reaccion inmunologica.

[0217] La preparacion de celulas madre satelitales obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento es util para la regeneracion del corazon y para tratamientos de fallas cardiacas como una preparacion de diseno de tejidos para la mioplastia cardiaca.

Ejemplo 7: preparacion autologa de asociacion de celulas de fibroblastos

[0218] Se puede preparar un ejemplo de una asociacion autologa de celulas de fibroblastos usando el proceso de acuerdo al invento donde las celulas de fibroblastos dermicos se facilitan bajo el paso (d) o (e).

[0219] Los fibroblastos dermicos se aislan y se expanden de acuerdo al siguiente procedimiento: un mes antes de la biopsia, el area principal de donacion de la piel (detras de una oreja del pliegue axilar anterior, por ejemplo, un area que no haya envejecido por el sol) se trata con crema de vitamina A para activar a los fibroblastos dermicos. Se realiza una biopsia de la piel de 10 x 6 mm de grosor completo y se disecciona bajo microscopio para remover a todo el epitelio. La biopsia des-epitalizada (dermis) se corta en bloques de 3 x 3 mm en forma de explantos. La dermis papilar se coloca hacia arriba y se cultiva utilizando la tecnica de levantamiento de aire (Molnar et al., 1996, mencionada anteriormente) y el interfaz de aire (Metier et al., 2002, mencionada anteriormente) con la mitad del explanto expuesto al aire. Los explantos se ponen en placas (por ejemplo, 6 explantos por pozo) en DMEM y se cultivan a 37 °C con un 95% de oxigeno y un 5% de CO2 durante alrededor de 3-5 e incluso hasta 9 dfas en placas de Petri o en matraces de cultivo. El medio se cambia cada 3 dfas. La expansion de fibroblastos se modela en 2 dimensiones en forma de monocapas planas, puesto que se observa un crecimiento estatico durante la incubacion. En los dfas 7 a 9 despues del inicio de la incubacion, se obtiene un cambio de proliferacion y de patrones de fenotipos tridimensionales agregando un 5-10% diluido de la composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominada RegenPRP™ (preparada tal como se describio en el ejemplo 4) al medio de cultivo: las celulas se ceban con RegenPRP™ (0,2 ml por pozo) solo para cubrir la base. Las celulas crecen entonces como una matriz tridimensional de gel de fibrina (figura 3). Las celulas se diferencian entonces para formar un portador o una red biologica en el gel de fibrina tal como se muestra en las figuras 4a y 4b. El numero de celulas se mide mediante un recuento diario bajo una red y para evaluar la apoptosis: se utiliza un microscopio invertido (Olympus®).

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[0220] Despues de 3 a 6 semanas de la incubacion, se cosechan a las celulas del gel de fibrina. La viabilidad celular se sujeta a ensayos con el metodo clasico de Tripano Azul y con una evaluacion bacteriologica, incluyendo una evaluacion de contaminadon de virus. El extracto celular expandido de fibroblastos obtenido tal como se acaba de mencionar se coloca en una jeringa en la presencia de la composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominada RegenPRP™ y la preparacion se inyecta en las arrugas de la cara, mas especfficamente bajo las arrugas. Las inyecciones deben realizarse a lo largo de toda la cara para cubrir la frente, la quijada, la region molar, los cachetes, la papada y el cuello.

[0221] La expansion celular puede incrementarse mediante la exposicion a foto (luminiscencia) a 633 nm. La preparacion de celulas de fibroblastos obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento es util para un rejuvenecimiento facial, para reducir las arrugas faciales y lfneas de expresion, para tratamiento de pieles danadas por radiaciones (radiodermatitis o piel danada por el sol), pieles envejecidas o pieles quemadas y/o el mejoramiento de arrugas faciales, de lfneas de expresion, del acne (especialmente despues del tratamiento de dermoabrasion), de quemaduras, de la rubeola o de la varicela, el vitiligo, la lipoatrofia o la lipodistrofia, tal como la lipodistrofia relacionada con el SIDA el sarcoma de Kaposi, queloides de la piel o fibrosis de la fascia palmar de Dupuytren y/o en tratamientos de rejuvenecimiento de la piel.

Ejemplo 8: Preparacion autoloaa de una asociacion de celulas arasas

[0222] Un ejemplo de asociacion celular autologa puede prepararse usando el proceso de acuerdo al invento donde las celulas madres adiposas se facilitan bajo el paso (d) o (e). Las celulas madre adiposas adultas se afslan mediante un metodo estandar de cultivo en un 5-10% volumen de una composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominada RegenPRP™. La preparacion se inyecta entonces con un aplicador en pacientes que padecen de deficiencias de tejidos, tal como deficiencias postraumaticas o deficiencias relacionadas con la edad para pacientes que superan los 40 anos de edad.

[0223] La preparacion de celulas grasas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento es util para tratamiento de lipoatrofias tales como en los pacientes de VIH/SIDA y otras hemiatrofias congenitas de la cara.

Ejemplo 9: preparacion autoloaa de asociacion de celulas de condrocitos

[0224] Un ejemplo de una asociacion autologa de celulas puede prepararse usando el proceso de acuerdo al invento donde las celulas de condrocitos se facilitan bajo el paso (d) o (e).

El cartflago se afsla de la rodilla del donante (tamano de la biopsia de 10 x 5 mm) y se corta en cuadraditos. Las celulas de condrocitos del cartflago se cultivan durante 4-6 semanas en un medio enriquecido con una composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento, tambien denominada RegenPRP™. Las celulas del cartflago se liberan entonces mediante digestion enzimatica (colagenasa y pronasa). La preparacion celular se incorpora entonces quirurgicamente al paciente con defectos y danos condrales profundos. La preparacion de celulas de condrocitos obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento es util para tratamiento de danos, erosiones o artroscopias profundas del cartflago.

[0225] Otro ejemplo del uso de una preparacion de celulas de condrocitos obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento es el uso en rinoplastia sin cirugfas mediante un procedimiento de una sola inyeccion: un paciente que padece de atrofia congenita del cartflago de la nariz.

El dfa antes de la inyeccion, se realiza una biopsia del cartflago de la oreja de 0,4 por 0,4 centfmetros y se coloca en un recipiente esteril lleno de DMEM y antibiotico. La biopsia se trata con digestion enzimatica incluyendo a tripsina y colagenasa. Los condrocitos liberados son suspendidos nuevamente en la composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento donde se agrega previamente un 10% de CaCh.

[0026] El paciente recibe primero una anestesia local, y una desinfeccion de la nariz. Entonces, la preparacion de condrocitos que se menciono anteriormente se inyecta en la superficie el cartflago y/o en la membrana del periostio del lugar que requiere aumento de volumen o un levantamiento. En una 2a fase, la composicion autologa de concentrado de plaquetas obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento que tiene un 10% de CaCh se inyecta a la parte superficial de la piel de la nariz, para estimular biologicamente la regeneracion y el rejuvenecimiento de la piel. Despues de una hora, se hace la inyeccion y el paciente podrfa regresar a la casa. Se observa una recuperacion excepcional de las celulas viables: el monto de celulas de condrocitos y de celulas de plasma recuperadas e inyectadas fue de alrededor de 109 celulas.

[0227] La preparacion de celulas de condrocitos obtenida mediante el metodo de acuerdo al invento es, por lo tanto, util para tratamiento de defectos del cartflago nasal, si procedimiento quirurgico, pero solamente mediante la inyeccion.

Ejemplo 10: Preparacion para la asociacion celular de celulas madre autoloaas del cordon umbilical

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[0228] Un ejemplo de asociacion celular autologa obtenida por medio del metodo de acuerdo a este invento, puede prepararse al utilizar el proceso obtenido por medio del metodo de conocimiento donde las celulas madres de cordon umbilical se obtienen bajo los pasos (d) o (e). Las celulas madres de cordon umbilical se afslan y son criogenicamente preservadas y utilizadas para el tratamiento de enfermedades de la sangre.

[0229] La preparacion de celulas madre de cordon umbilical obtenidas por medio del metodo de acuerdos invento, es util para el tratamiento de enfermedades hematologicas (por ejemplo, Talasemia)

Ejemplo 11: Preparacion para la asociacion celular de celulas autoloaas del tendon

[0230] Un ejemplo de asociacion celular autologa que puede ser preparada al utilizar el proceso de acuerdos invento donde las celulas del tendon se obtienen bajo los pasos (d) o (e).

[0231] Las celulas fibroblastos se afslan de acuerdo al procedimiento estandarizado en 5 - 10% vol. de una composicion concentrada de plaquetas autologa, obtenidas por medio del metodo de acuerdos invento. Las celulas fibroblastos del tendon se cultivan por alrededor de una a tres semanas en un medio de cultivo enriquecido con una composicion concentrada de plaquetas autologa obtenida por medio del metodo acuerdos invento, tambien llamado RegenPRT™. La preparacion celular es entonces inyectada al paciente en el lugar de la herida (por ejemplo, tendon desgarrado, aria artrftica). La inyeccion pude ser guiada por medio de una ecograffa, para la localizacion del sitio afectado y un mejor injerto de la solucion implantada.

[0232] La inyeccion de la preparacion de celulas fibroblastos de tendon tambien puede realizarse junto al manguito rotador si: primero se repara de forma artroscopica el desgarre del manguito rotatorio, luego se inquieta la preparacion de celulas fibroblastos de tendon por medio de un cateter largo al area de sutura. Esto mejora el proceso de curacion de fibroblastos de tendon en el borde del manguito retador, previene hematomas en el espacio confinado bajo el acromion, previene la rigidez del hombro al acelerar el proceso de curacion, mejora la rehabilitacion y el movimiento de articulaciones.

[0233] La preparacion de celulas del tendon, obtenida por medio del metodo acuerdos invento, es util para tratamiento de desgarre de tendones, artritis en articulaciones causadas por traumas o por edad y manguito rotatorio en el hombro.

Ejemplo 12: Preparacion para la asociacion celular de celulas autoloaas de liaamentos y ainaival

[0234] Un ejemplo de asociacion celular autologa que puede ser preparada al utilizar el proceso de acuerdo al invento, donde las celulas de la membrana del periostio y celulas gingivales se obtienen bajo los pasos (d) o (e).

[0235] Bajo anestesia general y local, el periostio (aproximadamente 10x10 mm), es recolectado asepticamente desde el lado bucal del cuerpo mandibular en cuatro perros Beagle hembras. El periostio recolectado se corta en pedazos de 3x3 mm. Los tejidos son ubicados directamente en un plato de cultivo de seis pozos y se cultiva (por aproximadamente 3 a p semanas) en una atm osfera humedecida de 5% de CO y 95% de aire a 37°C en un medio de cultivo enriquecido con una composicion concentrada de plaquetas autonomas, obtenida por medio del metodo de acuerdo este invento, tambien llamado RegenPRT™. La membrana del periostio y las celulas gingivales se afslan por digestion enzimatica y se cultivan por medio de una tecnica estatica.

[0236] Tfpicamente, 6 semanas de cultivo son suficientes para obtener un grosor apropiado de membrana de periostio para injertos.

[0237] Los pacientes separan en dos grupos: (1) un grupo de control que recibe una composicion concentrada de plaquetas autologas obtenidas por medio del metodo de este invento, sin contener celulas de membrana de periostio, y (2) un grupo de en tratamiento que recibe la preparacion de celulas de membrana de periostio, obtenida previamente. La composicion concentrada de plaquetas autologas (en el grupo de control) y la preparacion celular (para el grupo tratamiento) se inquietan respectivamente al paciente en el lugar de la lesion.

[0238] 12 semanas despues de la operacion, la preparacion celular de membrana de periostio, desaparece por completo tanto en el grupo de control como en el grupo en tratamiento. La regeneracion del hueso en el grupo en tratamiento con membrana de periostio cultivada, fue significativamente mayor que en el grupo de control: el filamento de implantes dentales se cubrio casi por completo con el hueso regenerado, mientras gran parte del filamento en el grupo de control segufa expuesto. El grupo de tratamiento demostro una formacion laminar osea relativamente gruesa y densa desde la parte inferior a la parte superior. Capas gruesas de tejido oseo se anexaron a la superficie del implante.

[0239] y se observaron celulas similares a osteoblastos cerca de la superficie. Aun cuando se observo neo- vascularizacion en abundancia en la matriz osea, raramente se observaron celulas inflamatorias. El borde entre el hueso regenerado y original no era claro. En el grupo de control, los especfmenes exhibieron una formacion delgada

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de hueso cortical en el defecto de dehiscencia. Se observo escasos huesos reticulares entre la superficie del implante y el hueso cortical, y se observaron muy pocos osteocitos y osteoclastos dentro de la matriz osea y en la superficie, respectivamente. La densidad osea fue significativamente mayor en el grupo en tratamiento en comparacion con el grupo de control. La media de los valores de LF fue 77.586 ±1.14% y 37.03 ±64.63% en los grupos en tratamiento y control, respectivamente (P<0.05).

[0240] La preparacion de membrana de periostio y de celulas gingivales obtenida por medio del metodo de este invento, es util para el tratamiento de enfermedades periodontales y osteitis alveolar, especialmente en la busqueda de regeneracion osea en lugares de implantes por dehiscencia.

Ejemplo 13: Preparacion para la asociacion celular de celulas autoloaas de cornea

[0241] Un ejemplo de asociacion celular autologa que puede ser preparada al utilizar el proceso de acuerdo al invento, donde las celulas corneales se obtienen bajo los pasos (d) o (e).

[0242] Se tomo una biopsia del epicanto, al borde de la cornea; y se expandieron las celulas madre limbales de la cornea para trasplante autologo en la misma persona 4 semanas despues del cultivo en una caja Petri o en un frasco recubierto con una composicion concentrada de plaquetas obtenida mediante el metodo de este invento, tambien conocido como RegenPRP™. Las celulas madre cultivadas de la cornea (de origen limbal) pueden ser modificadas ex vivo sobre la superficie de amnios humano sin epitelio en una monocapa, despues de la siembra del constructo con una suspension de queratinocitos corneales cultivados y viables, obtenidos a traves del metodo del invento. Se utilizan cerca de 500 000 celulas para el cultivo y se permite que las celulas cubran la superficie del constructo despues de 3 semanas de incubacion. La ingenieria de las celulas ocurre despues de aproximadamente tres semanas de cultivo primario de celulas, podria necesitarse una nueva siembra. El constructo biologico celular resultante consiste de colageno, fibras de amnios y queratinocitos corneales, compuestos por una membrana y una monocapa de celulas.

[0243] La preparacion de celulas corneales, obtenida utilizando el metodo de este invento, puede ser esparcida sobre un lente de contacto soluble y aplicado sobre la cornea danada. El lente de contacto desaparece y las celulas cierran el defecto corneal.

[0244] La preparacion de celulas corneales, obtenida utilizando el metodo de este invento, puede ser administrada de forma topica como gotas oculares en pacientes que sufren de sintomas de ojo seco. De forma alternativa, el amnios previamente mencionado puede ser utilizado independientemente sobre una cornea con cicatriz; o, el constructo y la preparacion celular obtenida utilizando el metodo de este invento, puede ser adherido al interior de un lente de contacto biologico o artificial para luego aplicarlo a la cornea y cubierto con un parche de ojo.

[0245] La preparacion celular de la cornea, obtenida utilizando el metodo de este invento, puede ser utilizada para aliviar el dolor del sindrome de ojo seco, para el tratamiento del Sindrome de Steven Johnson y para tratar ceguera corneal debida a quemaduras industriales con sustancias acidas o basicas, para ulceras corneales tales como alteracion corneal neurotropica recalcitrante, herpetica e inmunologicamente inducida.

Ejemplo 14: Preparacion para la asociacion celular autologa de medula osea

[0246] Un ejemplo de asociacion celular autologa que puede ser preparada al utilizar el proceso de acuerdo al invento, donde las celulas de medula osea se obtienen bajo los pasos (d) o (e).

[0247] La medula osea de la cadera se recogio y se centrifugo en un dispositivo, listo para el uso, para la preparacion de un concentrado de plaquetas obtenidas a traves del metodo de este invento (tambien llamado Regen BCTtm (Terapia de Celulas Sanguineas (Blood Cell Therapy)) con el fin de separar las celulas rojas de la sangre.

[0248] La preparacion de celulas de medula osea se mezcla entonces con el concentrado de plaquetas obtenido a traves del metodo segun el invento; y, se lo aplica o inyecta utilizando un aplicador con adicion de CaCh al sitio de la lesion en los pacientes.

[0249] La preparacion de celulas de medula osea obtenida a traves del procedimiento segun el invento, es util para el tratamiento de la enfermedad cardiaca isquemica y no isquemica, defecto de hueso y defecto de cartilago.

Ejemplo 15: Preparacion para la asociacion celular autologa Schwann

[0250] Un ejemplo de asociacion celular autologa que puede ser preparada al utilizar el proceso de acuerdo al invento, donde las celulas de Schwann se obtienen bajo los pasos (d) o (e).

[0251] Bajo anestesia local, se realiza una biopsia ya sea en N. Safena o N. SURALIS en la extremidad inferior. La biopsia del nervio se corta en bloques pequenos y se realizan cultivos primarios en placas Petri enriquecidas con una composicion concentrada de plaquetas autologas, obtenida mediante el metodo de este invento (tambien

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llamado RegenBCT™). Las mono capas se expanden en 3D y las celulas eventualmente son cosechadas por digestion de tripsina y se las concentra en una jeringa para la infiltracion local de la medula espinal danada que esta expuesta quirurgicamente. Se ha demostrado que las celulas cultivadas contienen mielina.

[0252] La preparacion de celulas de Schwann, obtenida utilizando el metodo de este invento, es util para el tratamiento de danos del nervio periferico, sutura de nervios y danos en la medula espinal.

Ejemplo 16: Preparacion de islotes celulares humanos autoloaos

[0253] Un ejemplo de asociacion celular autologa que puede ser preparada al utilizar el proceso de acuerdo al invento, donde islotes celulares del pancreas se obtienen bajo los pasos (d) o (e).

[0254] Los islotes celulares del pancreas son cosechados durante una biopsia abierta y se separan por digestion enzimatica convencional y separacion Ficol y Hypage (Page et al., 2007, Diba. Vas. Dis. Res., 7-12) en un medio enriquecido con una composicion concentrada de plaquetas autologas, obtenida utilizando el metodo de este invento, tambien conocido como RegenBCT™.

[0255] La preparacion de islotes celulares del pancreas se inyecta entonces como un bolo por medio de la vena porta hepatica al hfgado.

[0256] La preparacion de islotes celulares del pancreas, obtenida utilizando el metodo de este invento, es util en el tratamiento de diabetes tipo 1 o diabetes insulina-dependiente y para la reversion de la hiperglucemia de la diabetes mellitus.

Ejemplo 17: Preparacion de osteoblastos celulares humanos autoloaos

[0257] Un ejemplo de asociacion celular autologa que puede ser preparada al utilizar el proceso de acuerdo al invento, donde osteoblastos celulares se obtienen bajo los pasos (d) o (e). Utilizando anestesia local, se realiza una puncion para la biopsia del hueso cortical derivado de la cresta ilfaca o un sitio equivalente. Se coloca la biopsia del hueso en un medio DMEM aseptico a 4°C o en un medio de transporte equivalente conocido por expertos en la materia de cultivo ex vivo de huesos y osteoblastos. La biopsia de hueso es entonces cortada en cubos, digerida en colagenasa tipo-1 al 10% (Sigma o Boehringer) a 37°C durante 15 minutos bajo una campana de flujo laminar. De forma alternativa, la digestion por tripsina (Worthington) puede ser utilizada. La digestion enzimatica termina con tres lavados utilizando la composicion concentrada de plaquetas autologas obtenida utilizando el metodo de este invento, tambien llamado RegenBCT™, en DMEM a 4°C. La preparacion se centrifuga, separada en pfldoras y resuspendida. Los fragmentos de hueso se colocan en placas Petri o frascos como explantes utilizando tecnologfa de aire ascendente en una composicion concentrada de plaquetas autologas obtenida utilizando el metodo de este invento, tambien llamado RegenBCT™. La preparacion se cultiva a 37°C con antibioticos, gentimicina y amfotericina-B, bajo un flujo de gas de 95% aire y 5% CO2. El medio de cultivo se cambia tres veces a la semana, cada vez aumentando el medio DMEM con 10% vol. de composicion concentrada de plaquetas autologas obtenida utilizando el metodo de este invento. La viabilidad y morfologfa de las celulas se valora tres veces por semana para evaluar la locomocion, apoptosis y progresion 3D mono capa de las celulas. La formacion de micro filamentos y la diferenciacion se evalua por medio de microscopfa inversa (Olympus®). Se confirma la ausencia de contaminacion bacteriana y viral. Los osteoblastos pueden ser manipulados en amnios humanos para crear una distribucion de biocomposicion celular y mono capa celular de transporte/construccion despues de sembrar la membrana con 100 000 celulas previamente obtenidas; y, permite la expansion de la membrana mono capa por 3-4 semanas, logrando una construccion unica de osteoblastos-amnios-membrana para usar y transferir, cubriendo un defecto oseo o area injertada, a lo largo de la seccion no unida de la fractura en cualquier sitio.

[0258] La preparacion de celulas de osteoblastos, obtenida a traves del metodo de este invento, es util para el tratamiento de defectos oseos, injertos oseos y trastornos oseos

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1. Un proceso para la preparacion de una composicion celular, que comprende los pasos de:

(a) centrifugar a sangre completa en un tubo separador seleccionado de:

Un tubo separador de vidrio que contiene un gen tixotropico que se basa en poliester y una solucion amortiguada de citrato de sodio a 0.10 M; y

Un tubo separador de tereftalato de polietileno que contiene un gel altamente tixotropico form ado por una mezcla polimerica y un citrato anhidrido de sodio a 3.5 m il ig ram os An i li I itro;

(b) Separar al plasma enriquecido con plaquetas del plasma completo al remover alrededor de la mitad del sobrenadante que contenia plasma con niveles bajos de plaquetas;

(c) Suspender nuevamente el plasma enriquecido;

donde el paso de centrifugacion a) se realiza con una fuerza de, o alrededor de, 1500 g a 2000 g durante un periodo suficiente de tiempo para formar una barrera entre el plasma que contiene plaquetas, linfocitos ya monocitos y un pellet que contiene a eritrodtos; el paso de separacion b) se realiza mediante la recoleccion del sobrenadante de la parte de encima de dicha barrera y donde el plasma enriquecido esta enriquecido con leucocitos, trombocitos y proteinas de adhesion en comparacion a la sangre natural completa.
2. Un proceso de acuerdo a la reivindicacion 1, donde el paso de centrifugacion se realiza con una fuerza de entre alrededor de los 1500 g y hasta los 1700 g durante un periodo de tiempo seleccionado de alrededor de 3 minutos hasta de alrededor de 15minutos, o a 1500 g durante alrededor de 8 minutos.
3. Un proceso de acuerdo a la reivindicacion 1 o a la reivindicacion 2, que comprende ademas los pasos de:

(d) Facilitar un extracto celular en el cual las celulas se seleccionan de celulas dermicas, de queratinocitos, de fibroblastos, de melanodtos, de celulas de Langherans, de celulas grasas, de celulas de la medula osea, de celulas musculares, de osteoblastos, de condrocitos, de celulas de la membrana del periostio, de celulas de la cornea, de celulas de cordones umbilicales, de celulas de Schwann, de celulas de tendones, de celulas de islotes pancreaticos, de adipocitos, de celulas madre de adiposas, de celulas madre del limbo de la cornea, de queratinocitos de la cornea, de celulas madre satelitales, de celulas madre progenitoras de mioblastos, de celulas madre, de celulas del cartilago, de celulas de ligamentos y de celulas gingivales; (e) mezclar y agregar el concentrado de plaquetas obtenido bajo el paso (c) con el extracto celular obtenido en (d).
4. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 que comprende el paso de agregar y mezclar el concentrado de plaquetas obtenido bajo el paso (c) con un activador de coagulacion a una tasa de volumen (concentrado de plaquetas: activador de coagulacion) de alrededor de 10:1 hasta alrededor de 10:3,

donde dicho activador de coagulacion es, opcionalmente, un activador de trombina, un activador de fibrinogeno, calcio, una sal de calcio, CaCh, CaCC>3, CaSCX sodio, batroxobina, trombina, preparaciones enriquecidas con trombina, trombina autologa y/o suero autologo de trombina.
5. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, donde dicho estrato celular se obtiene de un proceso que comprende los pasos de:

(A) Suministrar a dichas celulas en una composicion concentrada de plaquetas que comprende a i) plasma; ii) plaquetas a una concentracion de porlo menos 300 * 109 celulas/litro; iii) globulos blancos a una concentracion de por lo menos 7,0 por 109 ce I u I as /litro; iv) fibrinogeno a una concentracion de por lo menos 3 mg/litro; y donde la concentracion de eritrocitos es menorque 0,6 por 1012 celulas/litro;

(B) Cultivar opcionalmente a las celulas;

(C) Cosechar opcionalmente a las celulas;

(D) Suspender nuevamente a las celulas cultivadas obtenidas bajo el paso (A), (B) o (C) en un concentrado de plaquetas,

donde el paso (A) se realiza opcionalmente en una composicion aislada de concentrado de plaquetas tal como la concentracion final en plaquetas que comprende entre alrededor del 5% y alrededor del 40% del volumen del medio de cultivo,

donde el paso de cultivo celular (B) comprende opcionalmente a por lo menos un paso de colocacion en placas de las celulas en una superficie de cultivo celular,

donde el paso de cultivo celular (B) se realiza opcionalmente a 37 °C,

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donde el paso de cultivo celular (B) se realiza opcionalmente bajo un flujo de gas o a aire y a dioxido de carbono,

donde el paso de cultivo celular (B) dura opcionalmente durante alrededor de 3 a 4 semanas, donde el medio de cultivo celular se cambia regularmente y opcionalmente durante la incubacion,

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donde el paso de cultivo celular (B) comprende opcionalmente por lo menos un paso de exposicion de las celulas a luz visible durante alrededor de 10 minutos,

donde el paso de cultivo celular (B) comprende opcionalmente por lo menos un paso de adicion de un concentrado 15 diluido de plaquetas que comprende a i) plasma; ii) plaquetas con una concentracion de por lo menos 300 x 109 celulas/litro; iii) globulos blancos con una concentracion de por lo menos 7,0 x 109 celulas/litro; iv) fibrinogeno con una concentracion de por lo menos 3 mg/litro; y donde la concentracion de eritrocitos es inferior a 0,6 x 1012 celulas/litro; tal como la concentracion final de plaquetas entre alrededor del 5% y alrededor del 40% del volumen del medio de cultivo.

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