ES2599319T3

ES2599319T3 - Anticuerpos específicos de Fc RIIB y métodos de uso de éstos

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Publication number: ES2599319T3
Application number: ES07812341.1T
Authority: ES
Inventors: Leslie S. Johnson; Ling Huang; Robyn Gerena
Original assignee: Macrogenics Inc
Current assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2006-06-26
Filing date: 2007-06-26
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2027-06-26
Also published as: US8785599B2; US20150023964A1; CA2656222A1; AU2007281876B2; DK2029173T3; JP2009541492A; JP2016074684A; PT2029173T; CA2656222C; JP2014014362A; EP2505209A1; US11098125B2; US10100116B2; US20220177574A1; SI2029173T1; US20080044429A1; WO2008019199A8; JP5764290B2; EP2029173A2; US20190218288A1

Abstract

Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno de éste, en el que dicho anticuerpo aislado o dicho fragmento de unión a antígeno se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano nativo con mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno se une a FcγRIIA humano nativo, y en el que: i) dicho anticuerpo es anticuerpo 8B5.3.4 producido por una línea celular de hibridoma que tiene el número de acceso ATCC PTA-7610; o ii) dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; o iii) dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno comprende las seis CDR del anticuerpo producido por el clon de hibridoma 8B5.3.4 que tiene el número de acceso ATCC PTA-7610, teniendo dichas seis CDR la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5-10, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno se une al mismo epítopo de FcγRIIB que el reconocido por el anticuerpo producido por el clon de hibridoma 8B5.3.4 que tiene el número de acceso ATCC PTA-7610 y compite con dicho anticuerpo 8B5.3.4 para la unión a FcγRIIB humano nativo, y en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno tiene una constante de disociación Kd (Kdisoc/Kasoc) de menos de 5 x 10-9 M según se determina por resonancia de plasmón superficial.

Description

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más a chicas que chicos.

La artritis reumatoide es un trastorno autoinmune en el que el sistema inmune del cuerpo identifica inapropiadamente las membranas sinoviales que secretan el fluido lubricante en las articulaciones como extrañas. Se produce inflamación, y el cartílago y tejidos en y alrededor de las articulaciones resultan dañados o destruidos. En los casos graves, esta inflamación se extiende a otros tejidos articulares y cartílago circundante, donde puede erosionar o destruir el hueso y cartílago y da lugar a deformidades articulares. El cuerpo reemplaza el tejido dañado con tejido cicatricial, causando que los espacios normales en las articulaciones se vuelvan estrechos y los huesos se fusionen entre sí. La artritis reumatoide crea rigidez, hinchazón, fatiga, anemia, pérdida de peso, fiebre, y frecuentemente dolor incapacitante. Algunos síntomas comunes de la artritis reumatoide incluyen rigidez de las articulaciones al despertar que dura una hora o más; hinchazón en la articulación de un dedo o muñeca específico; hinchazón en el tejido blando alrededor de las articulaciones; e hinchazón en ambos lados de la articulación. La hinchazón puede ocurrir con o sin dolor, y puede empeorar progresivamente o permanecer igual durante años antes de progresar.

El diagnóstico de la artritis reumatoide se basa en una combinación de factores, incluyendo: la localización específica y simetría de las articulaciones dolorosas, la presencia de rigidez en las articulaciones por la mañana, la presencia de protuberancias y nódulos bajo la piel (nódulos reumatoides), resultados de ensayos de rayos X que sugieren artritis reumatoide, y/o resultados positivos en un ensayo de sangre denominado el factor reumatoide. Mucha, pero no toda, la gente con artritis reumatoide tiene el anticuerpo factor reumatoide en su sangre. El factor reumatoide puede estar presente en personas que no tienen artritis reumatoide. Otras enfermedades también pueden causar que se produzca factor reumatoide en la sangre. Esta es la razón por la que el diagnóstico de artritis reumatoide se basa en una combinación de varios factores y no sólo en la presencia de factor reumatoide en la sangre.

El curso típico de la enfermedad es uno de síntomas articulares persistentes pero fluctuantes, y después de aproximadamente 10 años, el 90% de las personas que lo padecen mostrarán daño estructural en el hueso y cartílago. Un pequeño porcentaje tendrá una enfermedad corta que desaparece completamente, y otro pequeño porcentaje tendrá una enfermedad muy grave con muchas deformidades articulares, y ocasionalmente otras manifestaciones de la enfermedad. El proceso inflamatorio causa erosión o destrucción del hueso y cartílago en las articulaciones. En la artritis reumatoide, existe un ciclo autoinmune de presentación de antígeno persistente, estimulación de células T, secreción de citoquinas, activación de células sinoviales, y destrucción de las articulaciones. La enfermedad tiene un gran impacto tanto en el individuo como en la sociedad, causando dolor significativo, función alterada y discapacidad, así como costes de millones de dólares en gastos sanitarios y sueldos por tiempo perdido. (Véase, por ejemplo, el sitio de internet de NIH y el sitio de internet de NIAID).

La terapia actualmente disponible para la artritis reumatoide se centra en reducir la inflamación de las articulaciones con medicaciones anti-inflamatorias o inmunosupresoras. La primera línea de tratamiento de cualquier artritis es habitualmente anti-inflamatorios, tales como aspirina, ibuprofeno e inhibidores de Cox-2 tales como celecoxib y rofecoxib. Los "fármacos de segunda línea" incluyen oro, metotrexato y esteroides. Aunque estos tratamientos están bien establecidos para la artritis, muy pocos pacientes remiten en estas línea de tratamiento solas. Los avances recientes en la comprensión de la patogénesis de la artritis reumatoide han dado lugar al uso de metotrexato en combinación con anticuerpos frente a citoquinas o receptores solubles recombinantes. Por ejemplo, los receptores solubles recombinantes para el factor de necrosis tumoral (TNF)-α se han usado en combinación con metotrexato en el tratamiento de la artritis. Sin embargo, sólo aproximadamente el 50% de los pacientes tratados con una combinación de metotrexato y agentes anti-TNF-α tales como receptores solubles recombinantes para TNF-α muestran una mejora clínica significativa. Muchos pacientes permanecen refractarios a pesar del tratamiento. Los problemas difíciles del tratamiento todavía permanecen para pacientes con artritis reumatoide. Muchos tratamientos actuales tienen una alta incidencia de efectos secundarios o no pueden prevenir completamente la progresión de la enfermedad. Hasta ahora, no hay ningún tratamiento ideal, y no hay cura. Se necesitan nuevos terapéuticos que traten más eficazmente la artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunes.

2.2.3 Alergia

Las reacciones alérgicas mediadas por inmunidad (hipersensibilidad) se clasifican en cuatro tipos (I-IV) según los mecanismos subyacentes que dan lugar a la expresión de los síntomas alérgicos. Las reacciones alérgicas tipo I se caracterizan por la liberación mediada por IgE de sustancias vasoactivas tales como histamina de mastocitos y basófilos. La liberación de estas sustancias y la manifestación posterior de síntomas alérgicos se inician por el entrecruzamiento de IgE unida a alérgeno a su receptor en la superficie de mastocitos y basófilos. En individuos que padecen reacciones alérgicas tipo I, la exposición a un alérgeno una segunda vez da lugar a la producción de altos niveles de anticuerpos IgE específicos para el alérgeno como un resultado de la implicación de células B y T de memoria en la interacción de 3 células requerida para la producción de IgE. Los altos niveles de anticuerpos IgE producidos causa un incremento en el entrecruzamiento de receptores de IgE en mastocitos y basófilos por IgE unida a alérgeno, lo que a su vez da lugar a la activación de estas células y la liberación de los mediadores farmacológicos que son responsables de las manifestaciones clínicas de las enfermedades alérgicas tipo I.

Se han identificado y caracterizado dos receptores con diferentes afinidades para IgE. El receptor de alta afinidad

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(FcεRI) se expresa en la superficie de mastocitos y basófilos. El receptor de baja afinidad (FcεRII/CD23) se expresa en muchos tipos celulares incluyendo células B, células T, macrófagos, eosinófilos y células de Langerhan. El receptor de alta afinidad de IgE consiste en tres subunidades (cadenas alfa, beta y gamma). Varios estudios demuestran que sólo la cadena alfa está implicada en la unión de IgE, mientras las cadenas beta y gamma (que son proteínas bien transmembrana o citoplásmicas) se requieren para los eventos de transducción de la señal. La identificación de estructuras de IgE requeridas para que IgE se una al FcεRI en mastocitos y basófilos tiene una máxima importancia para averiguar estrategias de tratamiento o prevención de alergias mediadas por IgE. Por ejemplo, la elucidación del sitio de unión al receptor de IgE podría dar lugar a la identificación de péptidos o moléculas pequeñas que bloquean la unión de IgE a células que presentan el receptor in vivo.

Actualmente, las reacciones alérgicas mediadas por IgE se tratan con fármacos tales como antihistamínicos y corticosteroides que intentan aliviar los síntomas asociados con reacciones alérgicas contrarrestando los efectos de las sustancias vasoactivas liberadas de los mastocitos y basófilos. Altas dosis de antihistamínicos y corticosteroides tienen efectos secundarios perjudiciales (por ejemplo, alteración del sistema nervioso central, estreñimiento, etc). Así, son necesarios otros métodos para tratar las reacciones alérgicas tipo I.

Una estrategia para el tratamiento de los trastornos alérgico tipo I ha sido la producción de anticuerpos monoclonales que reaccionan con IgE soluble (libre) en suero, bloquean la unión de IgE a su receptor en mastocitos y basófilos, y no se unen a IgE unida a receptor (es decir, no son anafilactogénicos). Dos de dichos anticuerpos monoclonales están en estadios avanzados de desarrollo clínico para el tratamiento de reacciones alérgicas mediadas por IgE (véase, por ejemplo, Chang, T.W., 2000, Nature Biotechnology 18:157-62).

Uno de los tratamientos más prometedores para las reacciones alérgicas mediadas por IgE es la inmunización activa frente a epítopos no anafilactogénicos apropiados en IgE endógena. Stanworth et al. (Patente U.S. No. 5.601.821) describió una estrategia que implicaba el uso de un péptido derivado del dominio CεH4 de IgE humana acoplado con una proteína vehicular heteróloga como una vacuna de alergia. Sin embargo, se ha mostrado que este péptido no induce la producción de anticuerpos que reaccionan con IgE nativa soluble. Además, Hellman (Patente U.S. No. 5.653.980) propuso composiciones de vacunas anti-IgE basadas en la fusión de los dominios CεH2-CεH3 de longitud completa (con una longitud de aproximadamente 220 aminoácidos) a una proteína vehicular extraña. Sin embargo, los anticuerpos inducidos por las composiciones de vacuna anti-IgE propuestas en Hellman resultarán lo más probablemente en anafilaxia ya que se ha mostrado que los anticuerpos frente a algunas partes de los dominios CεH2 y CεH3 de la molécula de IgE se entrecruzan con el receptor de IgE en la superficie de mastocitos y basófilos y dan lugar a la producción de mediadores de anafilaxis (Véase, por ejemplo, Stadler et al., 1993, Int. Arch. Allergy and Immunology 102:121-126). Por lo tanto, permanece una necesidad de tratamiento de reacciones alérgicas mediadas por IgE que no induzcan anticuerpos anafilácticos.

La preocupación significativa sobre la inducción de anafilaxis ha resultado en el desarrollo de otra estrategia para el tratamiento de trastornos alérgicos tipo I que consiste en mimotopos que podrían inducir la producción de anticuerpos policlonales anti-IgE cuando se administran a animales (Véase, por ejemplo, Rudolf, et al., 1998, Journal of Immunology 160:3315-3321). Kricek et al. (Publicación Internacional No. WO 97/31948) cribó bibliotecas de péptidos expuestos en fagos con el anticuerpo monoclonal BSWI7 para identificar mimotopos de péptidos que pudieran mimetizar la conformación de la unión del receptor de IgE. Estos mimotopos podrían presumiblemente usarse para inducir anticuerpos policlonales que reaccionan con IgE nativa libre, pero no con IgE unida a receptor así como bloquear la unión de IgE a su receptor. Kriek et al. describió mimotopos de péptidos que no son homólogos a ninguna parte de la molécula de IgE y son así diferentes de los péptidos descritos en la presente invención.

Como se pone de manifiesto por un sondeo de la técnica, permanece una necesidad de aumentar la eficacia terapéutica de los métodos actuales de tratamiento o prevención de trastornos tales como cáncer, enfermedad autoinmune, trastorno inflamatorio, o alergia. En particular, existe una necesidad de aumentar la función efectora, particularmente, el efecto citotóxico de los anticuerpos terapéuticos usados en el tratamiento del cáncer. El estado actual de la técnica también carece del tratamiento o prevención de trastornos alérgicos (por ejemplo, bien por terapia con anticuerpos o terapia con vacuna).

3. Resumen de la invención

Los dominios extracelulares de FcγRIIA y FcγRIIB son 95% idénticos y comparten así numerosos epítopos. Sin embargo, FcγRIIA y FcγRIIB presentan actividades muy diferentes. La diferencia fundamental es que el FcγRIIA inicia una señalización intracelular que da lugar a la activación celular tal como fagocitosis y estallido respiratorio, mientras el FcγRIIB inicia una señalización inhibidora. A la vista de sus distintas actividades y el papel en la modulación de las respuestas inmunes, se necesitan anticuerpos tales que reconocen FcγRIIB nativo, y no FcγRIIA nativo. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de dichos anticuerpos específicos de FcγRIIB.

Como se especifica por las reivindicaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno de éste, en el que dicho anticuerpo aislado o dicho fragmento de unión a antígeno se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano nativo con mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno se une a FcγRIIA humano nativo, y en el que:

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i) dicho anticuerpo es anticuerpo 8B5.3.4 producido por una línea celular de hibridoma que tiene el número de acceso ATCC PTA-7610; o

ii) dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; o

iii) dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno comprende las seis CDR del anticuerpo producido por el clon de hibridoma 8B5.3.4 que tiene el número de acceso ATCC PTA-7610, teniendo dichas seis CDR las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5-10, en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno se une al mismo epítopo de FcγRIIB que el reconocido por el anticuerpo producido por el clon de hibridoma 8B5.3.4 que tiene el número de acceso ATCC PTA-7610 y compite con dicho anticuerpo 8B5.3.4 para la unión a FcγRIIB humano nativo, y en el que dicho anticuerpo o dicho fragmento de unión a antígeno tiene una constante de disociación Kd (Kdisoc/Kasoc) de menos de 5 x 10-9 M según se determina por resonancia de plasmón superficial. Como se especifica por las reivindicaciones, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de éste de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12; y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La especificación se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB, particularmente FcγRIIB humano, más particularmente FcγRIIB humano nativo, con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA, particularmente FcγRIIA humano, más particularmente FcγRIIA humano nativo. Como se especifica por las reivindicaciones, los anticuerpos de la invención se unen al dominio extracelular de FcγRIIB humano nativo. En determinadas realizaciones de la invención que se encuentran en el alcance de las reivindicaciones especificadas, el anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIB con una afinidad al menos 2 veces mayor de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA. En otras realizaciones de la invención que se encuentran en el alcance de las reivindicaciones especificadas, el anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIB con una afinidad al menos 4 veces, al menos 6 veces, al menos 8 veces, al menos 10 veces, al menos 100 veces, al menos 1.000 veces, al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107, o al menos 108 veces mayor de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA. En una realización preferida que se encuentra en el alcance de las reivindicaciones especificadas, dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIB con una afinidad 100 veces, 1.000 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces, 107 veces, ó 108 veces mayor de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA. Preferiblemente, estas afinidades de unión se determinan con la IgG monomérica, y no la IgG agregada, y la unión es a través del dominio variable (por ejemplo, fragmentos Fab de los anticuerpos que tienen características de unión similares a la molécula de inmunoglobulina completa).

La invención se refiere, como se especifica por las reivindicaciones, a un anticuerpo aislado o un fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA, según se determina por cualquier método estándar conocido en la técnica para evaluar especificidades. La invención se refiere, como se especifica por las reivindicaciones, a un anticuerpo aislado o un fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA, según se determina, por ejemplo, por transferencia Western, BIAcore o radioinmunoensayo. La especificación se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA, según se determina en un ensayo ELISA, en el intervalo lineal para la unión a FcγRIIB. En un caso, la especificación se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB, producido en sistema de mamífero, con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA, según se determina en un ensayo ELISA.

En un caso particular, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o un fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA, y el dominio constante de dicho anticuerpo tiene además una afinidad aumentada para al menos uno o más receptores Fc de activación. En otro caso específico más, dicho receptor Fc de activación es FcγRIII.

En un caso, dicho anticuerpo o un fragmento de éste bloquea el sitio de unión a IgG de FcγRIIB y bloquea la unión de IgG marcadas agregadas a FcγRIIB, por ejemplo, en un ensayo ELISA de bloqueo. En un caso particular, dicho anticuerpo o un fragmento de éste bloquea la unión de IgG marcadas agregadas en un ensayo ELISA de bloqueo al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ó 99,9%. En otro caso particular más, el anticuerpo o un fragmento de éste bloquea completamente la unión de dicha IgG marcada agregada en dicho ensayo ELISA.

En otro caso, dicho anticuerpo o un fragmento de éste bloquea el sitio de unión a IgG de FcγRIIB y bloquea la unión de IgG marcada agregada a FcγRIIB, según se determina por un ensayo FACS con doble tinción.

La especificación engloba el uso de anticuerpos que modulan (es decir, agonizan o antagonizan) la actividad de FcγRIIB. En un caso, los anticuerpos de la especificación agonizan al menos una actividad de FcγRIIB, es decir, incitan la señalización. Aunque no se pretende la vinculación a ningún mecanismo de acción, los anticuerpos agonistas de la especificación pueden mimetizar el agrupamiento de FcγRIIB dando lugar a una disminución en la respuesta activadora a la ligación de FcγR e inhibición de la capacidad de respuesta celular.

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clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, y 1F2 que tienen los números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente, o versiones quiméricas, humanizadas u otras preparadas por ingeniería de éste. En otra realización, la invención proporciona, como se especifica por las reivindicaciones, un anticuerpo aislado o un fragmento de éste que compite para la unión con el anticuerpo monoclonal producido por el clon 8B5.3.4 y se une a FcγRIIB humano nativo con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA humano nativo y se une al mismo epítopo de FcγRIIB que el anticuerpo monoclonal producido a partir del clon 8B5.3.4 y se une a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA. Además, la especificación proporciona las líneas celulares de hibridoma 8B5.3.4, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2 que tienen los números de acceso ATCC PTA-7610, PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente. En un caso específico, la especificación proporciona el uso de un anticuerpo 8B5.3.4, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2, o versiones quiméricas, humanizadas u otras preparadas por ingeniería de éste, para prevenir, tratar, gestionar

: o mejorar una malignidad de células B, o uno o más síntomas de ésta. En una realización particular que se encuentra en el alcance de las reivindicaciones especificadas, una versión preparada por ingeniería comprende una

: o más mutaciones en la región Fc. La una o más mutaciones en la región Fc pueden resultar en un anticuerpo con una función efectora mediada por anticuerpo alterada, una unión alterada a otros receptores Fc (por ejemplo, receptores Fc de activación), una actividad ADCC alterada, o una actividad de unión a C1q alterada, o una actividad de citotoxicidad dependiente de complemento alterada, o cualquier combinación de éstas. En una realización preferida, un anticuerpo 8B5.3.4 humanizado comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En otra realización preferida el dominio Fc de la cadena pesada del anticuerpo 8B5.3.4 humanizado se prepara por ingeniería para comprender al menos una sustitución de aminoácido en la posición 240, 243, 247, 255, 270, 292, 300, 316, 370, 392, 396, 416, 419, ó 421 con otro aminoácido en esa posición. En una realización más preferida, el dominio Fc de la cadena pesada del anticuerpo 8B5.3.4 humanizado tiene una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270; una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270; o un ácido glutámico en la posición270, un ácido aspártico en la posición 316, y una glicina en la posición 416. En determinadas realizaciones de la invención, el anticuerpo no es un anticuerpo monoclonal producido por el clon de hibridoma 8B5.3.4, o versiones quiméricas, humanizadas u otras preparadas por ingeniería de éste.

En determinadas realizaciones de la invención que se encuentran en el alcance de las reivindicaciones especificadas, se proporcionan anticuerpos 8B5.3.4 humanizados, comprendiendo dichos anticuerpos 8B5.3.4 humanizados un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, en el que el dominio Fc de la cadena pesada del anticuerpo 8B5.3.4 humanizado tiene una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270; o un ácido glutámico en la posición 270, un ácido aspártico en la posición 316, y una glicina en la posición 416.

La especificación también engloba polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención. En un caso, la especificación proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA. La especificación también se refiere a un vector que comprende dicho ácido nucleico. La especificación proporciona además un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera, siendo dicha cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste que se une a FcγRIIA. En un caso específico, dicho vector es un vector de expresión. La especificación proporciona además células huésped que contienen los vectores de o polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención. Preferiblemente, la especificación engloba polinucleótidos que codifican cadenas pesada y ligera de los anticuerpos producidos por el clone de hibridoma depositado 8B5.3.4, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2 que tienen los números de acceso ATCC PTA-7610, PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA5959, respectivamente, o partes de éste, por ejemplo, CDR, dominios variables, etc. y versiones humanizadas de éste.

Los receptores Fc activadores e inhibidores, por ejemplo, FcγRIIA y FcγRIIB, son críticos para la función equilibrada de estos receptores y las respuestas inmunes celulares apropiadas. La especificación engloba el uso de los anticuerpos de la invención para el tratamiento de cualquier enfermedad relacionada con la pérdida de dicho equilibrio y control regulado de la ruta de señalización del receptor Fc. Así, los anticuerpos frente a FcγRIIB de la invención tienen usos en la regulación de la respuesta inmune, por ejemplo, en la inhibición de la respuesta inmune en conexión con enfermedades autoinmunes o inflamatorias, o respuestas alérgicas. Los anticuerpos frente a FcγRIIB de la invención también pueden usarse para alterar determinadas funciones efectoras para aumentar, por ejemplo, la citotoxicidad mediada por el anticuerpo terapéutico.

Los anticuerpos de la invención son útiles para la prevención o tratamiento del cáncer, por ejemplo, en una realización, como terapia con un único agente. Los anticuerpos de la invención pueden usarse para el tratamiento y/o prevención de melanoma. Los anticuerpos también son útiles para la prevención o tratamiento del cáncer, particularmente para potenciar la actividad citotóxica de anticuerpos terapéuticos específicos de antígenos del

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También se describe un método de diagnóstico de una enfermedad autoinmune en un sujeto que comprende: (i) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con una cantidad efectiva de un anticuerpo de la invención; y (ii) detectar la unión de dicho anticuerpo o un fragmento de éste, en el que la detección de dicho marcador detectable por encima de un fondo o nivel estándar indica que dicho sujeto tiene una enfermedad autoinmune.

La invención proporciona además, como se especifica por las reivindicaciones, una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o un fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA; y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable. Determinadas realizaciones de la invención que se encuentran en el alcance de las reivindicaciones especificadas proporcionan una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o un fragmento de éste que se une específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA; (ii) un anticuerpo citotóxico que se une específicamente a un antígeno de cáncer; y (iii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En determinados casos, se describen composiciones farmacéuticas para uso según los métodos de la especificación, comprendiendo dichas composiciones farmacéuticas un anticuerpo anti-FcγRIIB o un fragmento de unión a antígeno de éste, en una cantidad efectiva para prevenir, tratar, gestionar, o mejorar una malignidad de células B, o uno o más síntomas de ésta, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se proporcionan composiciones farmacéuticas para uso según los métodos de la especificación, comprendiendo dichas composiciones farmacéuticas un anticuerpo anti-FcγRIIB o un fragmento de unión a antígeno de éste, un agente profiláctico o terapéutico distinto de un antagonista de FcγRIIB, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3.1 Definiciones

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "se une específicamente a FcγRIIB" y términos análogos se refieren a anticuerpos o fragmentos de éstos (o cualesquiera otras moléculas que se unen a FcγRIIB) que se unen específicamente a FcγRIIB o un fragmento de éste y no se unen específicamente a otros receptores Fc, en particular a FcγRIIA. Además, un experto en la técnica entiende, que un anticuerpo que se une específicamente a FcγRIIB, puede unirse a través del dominio variable o el dominio constante del anticuerpo. Si el anticuerpo que se une específicamente a FcγRIIB se une a través de su dominio variable, un experto en la técnica entiende que no está agregado, es decir, es monomérico. Un anticuerpo que se une específicamente a FcγRIIB puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad según se determina, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore, u otros ensayos conocidos en la técnica. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos que se une específicamente a FcγRIIB o un fragmento de éste no reaccionan de manera cruzada con otros antígenos. Los anticuerpos o fragmentos que se unen específicamente a FcγRIIB pueden identificarse, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore, u otras técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Un anticuerpo o un fragmento de éste se une específicamente a un FcγRIIB cuando se une a FcγRIIB con mayor afinidad que a cualquier antígeno con reactividad cruzada según se determina usando técnicas experimentales, tales como transferencias Western, radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA). Véase, por ejemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Segunda Edición, Raven Press, Nueva York en las páginas 332-336 para una discusión respecto a la especificidad de los anticuerpos.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "FcγRIIB nativo" se refiere a FcγRIIB que se expresa endógenamente y está presente en la superficie de una célula. En algunas realizaciones, "FcγRIIB nativo" engloba una proteína que se expresa recombinantemente en una célula de mamífero. Preferiblemente, el FcγRIIB nativo no se expresa en una célula bacteriana, es decir, E. coli. Lo más preferiblemente, el FcγRIIB nativo no está desnaturalizado, es decir, está en su conformación biológicamente activa.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "FcγRIIA nativo" se refiere a FcγRIIA que se expresa endógenamente y está presente en la superficie de una célula. En algunas realizaciones, "FcγRIIA nativo" engloba una proteína que se expresa recombinantemente en una célula de mamífero. Preferiblemente, el FcγRIIA nativo no se expresa en una célula bacteriana, es decir, E. coli. Lo más preferiblemente, el FcγRIIA nativo no está desnaturalizado, es decir, está en su conformación biológicamente activa.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "endógeno" en el contexto de una proteína celular se refiere a proteína natural y/o expresada por la célula en ausencia de manipulación recombinante; de acuerdo con esto, los términos "proteína expresada endógenamente" o "proteína endógena" excluye proteínas celulares expresadas por medio de tecnología recombinante.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "análogo" en el contexto de agentes proteináceos (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, y anticuerpos) se refiere a un agente proteináceo que posee una función similar o idéntica a un segundo agente proteináceo pero que no comprende necesariamente una secuencia de aminoácidos similar o idéntica del segundo agente proteináceo, o posee una estructura similar o idéntica del segundo agente proteináceo. Un agente proteináceo que tiene una secuencia de aminoácidos similar se refiere a un segundo agente proteináceo que satisface al menos uno de los siguientes: (a) un agente proteináceo que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos

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Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados, Fv de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fv unidos por disulfuro (sdFv), intracuerpos, y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id y anti-anti-Id frente a anticuerpos de la invención), y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "malignidades de células B" y "malignidad de células B" se refieren a cualquier trastorno linfoproliferativo de células B. Las malignidades de células B incluyen tumores con origen en células B. Las malignidades de células B incluyen, pero no están limitadas a, linfomas, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin y no de Hodgkin, linfoma de células B grandes difuso, linfoma folicular con áreas de linfoma de células B grandes difuso, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células del manto, y linfoma de células escindidas pequeñas difuso.

A no ser que se indique otra cosa, cuando se hace referencia a anticuerpos (como se define de manera amplia en la presente memoria), referencia a dominios de anticuerpo y/o posiciones de aminoácidos en anticuerpos, o fragmentos de éstos, se hace según la definición y asignación de aminoácidos a cada dominio en Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5a Ed. Public Health Service (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991). Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera maduras de inmunoglobulinas se designan por la posición de un aminoácido en la cadena. Kabat describió numerosas secuencias de aminoácidos para anticuerpos, identificó una secuencia de aminoácidos consenso para cada subgrupo, y asignó un número de residuo a cada aminoácido. El esquema de numeración de Kabat es extensible a anticuerpos no incluidos en su compendio mediante el alineamiento del anticuerpo en cuestión con una de las secuencias consenso en Kabat por referencia a los aminoácidos conservados. Este método para la asignación de números de residuos se ha convertido en estándar en el campo e identifica fácilmente aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos, incluyendo variantes quiméricas o humanizadas. Por ejemplo, un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo de ratón. Así, tal y como se usa en la presente memoria en el contexto de anticuerpos humanizados, una referencia tal como "en la posición 297 de la región Fc" se refiere a la posición de aminoácido en una cadena de inmunoglobulina, región de una cadena de inmunoglobulina, o región de un polipéptido derivado de una cadena de inmunoglobulina, que corresponde a la posición 297 de la inmunoglobulina humana correspondiente.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "cáncer" se refiere a un neoplasma o tumor que resulta del crecimiento anormal incontrolado de células. Tal y como se usa en la presente memoria, cáncer incluye explícitamente, leucemias y linfomas. El término "cáncer" se refiere a una enfermedad que implica células que tienen el potencial de metastatizar a sitios distales y presentar rasgos fenotípicos que se diferencian de los de las células no cancerosas, por ejemplo, formación de colonias en un sustrato tridimensional tal como agar blando o la formación de redes tubulares o matrices semejantes a redes en una preparación tridimensional de membrana de basamento o matriz extracelular. Las células no cancerosas no forman colonias en agar blando y forman estructuras claras semejantes a esferas en preparaciones tridimensionales de membrana de basamento o matriz extracelular. Las células cancerosas adquieren un conjunto de características de capacidades funcionales durante su desarrollo, no obstante a través de varios mecanismos. Dichas capacidades incluyen evasión de la apoptosis, auto-suficiencia en señales de crecimiento, insensibilidad a señales anti-crecimiento, invasión/metástasis en tejidos, ausencia de límite en el potencial explicativo, y angiogénesis sostenida. El término "célula cancerosa" se pretende que englobe células cancerosas tanto pre-malignas como malignas. En algunas realizaciones, cáncer se refiere a un tumor benigno, que ha permanecido localizado. En otras realizaciones, cáncer se refiere a un tumor maligno, que ha invadido y destruido estructuras corporales vecinas y se disemina a sitios distantes. En otras realizaciones más, el cáncer está asociado con un antígeno de cáncer específico.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "derivado" en el contexto de polipéptidos o proteínas, incluyendo anticuerpos, se refiere a un polipéptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha alterado por la introducción de sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos. El término "derivado" tal y como se usa en la presente memoria también se refiere a un polipéptido o proteína que se ha modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido o proteína. Por ejemplo, pero no como limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Un polipéptido o proteína derivado puede producirse por modificaciones químicas usando técnicas conocidas para los expertos en la técnica, incluyendo, pero no limitado a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido o proteína derivado posee una función similar o idéntica al polipéptido o proteína del que se derivó.

El término "derivado" tal y como se usa en la presente memoria en conjunción con FcγRIIB se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido FcγRIIB, un fragmento de un

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polipéptido FcγRIIB, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido FcγRIIB, o un fragmento de anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido FcγRIIB, que se ha alterado por la introducción de sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos (es decir, mutaciones). En algunos casos, un derivado de anticuerpo o fragmento de éste comprende sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos en una o más CDR. El derivado de anticuerpo puede tener sustancialmente la misma unión, mejor unión, o peor unión cuando se compara con un anticuerpo no derivado. En casos específicos, se han sustituido, delecionado o añadido uno, dos, tres, cuatro, o cinco residuos de aminoácidos de la CDR (es decir, mutado). El término "derivado" tal y como se usa en la presente memoria en conjunción con FcγRIIB también se refiere a un polipéptido FcγRIIB, un fragmento de un polipéptido FcγRIIB, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido FcγRIIB, o un fragmento de anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido FcγRIIB, que se ha modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero no como limitación, un polipéptido FcγRIIB, un fragmento de un polipéptido FcγRIIB, un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo puede modificarse, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Un derivado de un polipéptido FcγRIIB, un fragmento de un polipéptido FcγRIIB, un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo puede modificarse por modificaciones químicas conocidas para los expertos en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, escisión química específica, acetilación, formulación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un derivado de un polipéptido FcγRIIB, un fragmento de un polipéptido FcγRIIB, un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. En una realización, un derivado de anticuerpo posee una función similar o idéntica al anticuerpo parental. En otra realización, un derivado de un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo tiene una actividad alterada cuando se compara con un anticuerpo no alterado. Por ejemplo, un derivado de anticuerpo o fragmento de éste puede unirse a su epítopo más firmemente o ser más resistente a proteolisis.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan indistintamente para hacer referencia a una afección en un sujeto. En particular, el término "enfermedad autoinmune" se usa indistintamente con el término "trastorno autoinmune" para hacer referencia a una afección en un sujeto caracterizada por el daño celular, tisular y/u orgánico causado por una reacción inmunológica del sujeto frente a sus propias células, tejidos y/u órganos. El término "enfermedad inflamatoria" se usa indistintamente con el término "trastorno inflamatorio" para hacer referencia a una afección en un sujeto caracterizada por inflamación, preferiblemente inflamación crónica. Los trastornos autoinmunes pueden o no estar asociados con inflamación. Además, la inflamación puede o no estar causada por un trastorno autoinmune. Así, determinados trastornos pueden caracterizarse tanto como trastornos autoinmunes como inflamatorios.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "epítopo" se refiere a una región en una molécula de antígeno a la que se une específicamente un anticuerpo.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido. En una realización específica, un fragmento de un polipéptido retiene al menos una función del polipéptido. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo son fragmentos de unión a epítopo.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (habitualmente de ratón o rata). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina el "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se denomina el "aceptor". No es necesario que estén presentes las regiones constantes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85-90%, preferiblemente aproximadamente 95% o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulina humana natural. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina con cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado no englobaría un anticuerpo quimérico típico, porque, por ejemplo, la región variable completa de un anticuerpo quimérico no es humana. Se dice que el anticuerpo donante se ha "humanizado", por el proceso de "humanización", porque el anticuerpo humanizado resultante se espera que se una al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos

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profiláctico suficiente para prevenir la recurrencia o diseminación de una enfermedad hiperproliferativa, particularmente cáncer, o la aparición de ésta en un paciente, incluyendo pero no limitado a aquellos predispuestos a una enfermedad hiperproliferativa, por ejemplo, aquellos predispuestos genéticamente a cáncer o que previamente se han expuesto a carcinógenos. Una cantidad profilácticamente efectiva también puede referirse a la cantidad de agente profiláctico que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de una enfermedad. Además, una cantidad profilácticamente efectiva con respecto a un agente profiláctico de la especificación significa la cantidad de agente profiláctico solo, o en combinación con otros agentes, que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de una enfermedad. Usado en conexión con una cantidad de un anticuerpo frente a FcγRIIB de la invención, el término puede englobar una cantidad que mejora la profilaxis global o aumenta la eficacia profiláctica de o actúa de manera sinérgica con otro agente profiláctico, tal como pero no limitado a un anticuerpo terapéutico. En determinados casos, el término "agente profiláctico" se refiere a un anticuerpo específico de FcγRIIB agonista. En otros casos, el término "agente profiláctico" se refiere a un anticuerpo específico de FcγRIIB antagonista. En determinados otros casos, el término "agente profiláctico" se refiere a quimioterapéuticos de cáncer, terapia con radiación, terapia hormonal, terapia biológica (por ejemplo, inmunoterapia), y/o anticuerpos frente a FcγRIIB de la invención. En otros casos, puede administrase más de un agente profiláctico en combinación.

Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "efectos secundarios" engloba efectos no deseados y adversos de un agente profiláctico o terapéutico. Los efectos adversos son siempre no deseados, pero los efectos no deseados no son necesariamente adversos. Un efecto adverso de un agente profiláctico o terapéutico podría ser dañino o molesto o presentar riesgo. Los efectos secundarios de la quimioterapia incluyen, pero no están limitados a, toxicidad gastrointestinal tal como, pero no limitado a, diarrea y flatulencia de formación temprana y tardía, náusea, vómito, anorexia, leucopenia, anemia, neutropenia, astenia, calambre abdominal, fiebre, dolor, pérdida de peso corporal, deshidratación, alopecia, disnea, insomnio, mareo, mucositis, xerostomía, y fallo renal, así como estreñimiento, efectos nerviosos y musculares, daño temporal o permanente en los riñones y vejiga, síntomas semejantes a gripe, retención de fluidos, e infertilidad temporal o permanente. Los efectos secundarios de la terapia con radiación incluyen pero no están limitados a fatiga, boca seca, y pérdida de apetito. Los efectos secundarios de las terapias biológicas/inmunoterapias incluyen pero no están limitados a enrojecimientos e hinchazones en el sitio de la administración, síntomas semejantes a la gripe tales como fiebre, escalofríos y fatiga, problemas en el tracto digestivo y reacciones alérgicas. Los efectos secundarios de las terapias hormonales incluyen pero no están limitados a náusea, problemas de fertilidad, depresión, pérdida de apetito, problemas oculares, dolor de cabeza, fluctuación de peso. Los efectos no deseados adicionales experimentados típicamente por pacientes son numerosos y conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Physicians' Desk Reference (56a ed., 2002).

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "Fv de cadena única" o "scFv" se refieren a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, p. 269-315 (1994). En realizaciones específicas que se encuentran en el alcance de las reivindicaciones especificadas, los scFv incluyen scFv biespecíficos y scFv humanizados.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente. Tal y como se usa en la presente memoria, un sujeto es preferiblemente un mamífero tal como un no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas etc.) y un primate (por ejemplo, mono y ser humano), lo más preferiblemente un ser humano.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a aquella cantidad del agente terapéutico suficiente para tratar o gestionar una enfermedad o trastorno asociado con FcγRIIB y cualquier enfermedad relacionada con la pérdida de regulación en la ruta de señalización del receptor Fc o para aumentar la eficacia terapéutica de otra terapia, por ejemplo, anticuerpo terapéutico, terapia con vacuna o profilaxis, etc. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede referirse a la cantidad de agente terapéutico suficiente para retrasar o minimizar el inicio de una enfermedad, por ejemplo, retrasar o minimizar la diseminación del cáncer. Una cantidad terapéuticamente efectiva también puede referirse a la cantidad de agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión de una enfermedad. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva respecto a un agente terapéutico de la invención significa la cantidad de agente terapéutico solo, o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión de una enfermedad, por ejemplo, suficiente para aumentar la eficacia terapéutica de un anticuerpo terapéutico suficiente para tratar o gestionar una enfermedad. Usado en conexión con una cantidad de anticuerpo frente a FcγRIIB de la invención, el término puede englobar una cantidad que mejora la terapia global, reduce o evita efectos no deseados,

o aumenta la eficacia terapéutica de o actúa de forma sinérgica con otro agente terapéutico.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "tratar," "que trata" y "tratamiento" se refieren a la erradicación, reducción o mejora de síntomas de una enfermedad o trastornos relacionados con la pérdida de regulación en la ruta de señalización del receptor Fc o para aumentar la eficacia terapéutica de otra terapia, por ejemplo, un anticuerpo terapéutico, terapia con vacuna o profilaxis. En algunos casos, tratamiento se refiere a la erradicación, eliminación, modificación, o control de tejido canceroso primario, regional, o metastásico que resulta de la administración de uno o más agentes terapéuticos. En determinados casos, dichos términos se refieren a

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cinco de las CDR del clon 8B5.3.4 que se unen a FcγRIIB específicamente y que pueden identificarse usando los métodos de cribado descritos en la presente memoria.

En una realización, un fragmento de anticuerpo de la invención es un polipéptido que comprende una o más CDR del anticuerpo producido por el clon 8B5.3.4 con número de acceso ATCC PTA-7610 (por ejemplo, la CDR3 de cadena pesada) que se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano nativo con mayor afinidad de la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA humano nativo. El polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o cualquier combinación de éstas (véanse, por ejemplo, Davies et al., 1995, Bio/Technol. 13:475-479; Pereira et al.., 1998, Biochemistry 37:1430-1437; Tsumoto et al., 2002, FEBS Letters 525:77-82; van den Beucken et al., 2001, J. Mol. Biol. 310:591-601; Ward et at.; 1989, Nature 341:544-546; y Dumoulin et al., 2002, Protein Sci. 11:500-515).

Un anticuerpo usado en los métodos descritos en la presente memoria puede unirse al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 8B5.3.4 con número de acceso ATCC PTA-7610, respectivamente y/o competir con el anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 8B5.3.4 con número de acceso ATCC PTA-7610, respectivamente, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA u otro inmunoensayo competitivo apropiado, y también se une a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA. Un anticuerpo usado en los métodos descritos en la presente memoria puede unirse al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal de ratón producido por los clones de hibridoma 2B6, 3H7, 1 D5, 2E1, 2H9, 2D11, y 1F2 que tienen los números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente, y/o competir con el anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, y 1F2 que tienen los números de acceso ATCC, PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente, según se determina, por ejemplo, en un ensayo ELISA u otro inmunoensayo competitivo apropiado, y también se une a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA.

La presente especificación también engloba anticuerpos o fragmentos de éstos que comprenden una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada variable y/o cadena ligera variable que es al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable y/o cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 8B5.3.4, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 que tienen los números de acceso ATCC PTA-7610, PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente. La presente especificación engloba además anticuerpos o fragmentos de éstos que se unen específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o fragmento de éste se une a FcγRIIA, comprendiendo dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo una secuencia de aminoácidos de una o más CDR que es al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 8B5.3.4, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 que tienen los números de acceso ATCC PTA-7610, PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente. La determinación del porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por cualquier método conocido para un experto en la técnica, incluyendo búsquedas de proteínas BLAST.

La presente especificación también engloba el uso de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad de la que dichos anticuerpos o fragmentos de éstos se unen a FcγRIIA, en la que dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo están codificados por una secuencia de nucleótidos que hibrida con la secuencia de nucleótidos del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 8B5.3.4, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 que tienen los números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente, en condiciones astringentes. En un caso preferido, la invención proporciona anticuerpos o fragmentos de éstos que se unen específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad de la que dichos anticuerpos o fragmentos de éstos se unen a FcγRIIA, comprendiendo dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo una cadena ligera variable y/o cadena pesada variable codificada por una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera variable y/o cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 8B5.3.4, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 que tienen los números de acceso ATCC PTA-7610, PTA-4591, PTA-4592, PTA5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente, en condiciones astringentes. En otro caso preferido, la invención proporciona anticuerpos o fragmentos de éstos que se unen específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad de la que dichos anticuerpos o fragmentos de éstos se unen a FcγRIIA, comprendiendo dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo una o más CDR codificadas por una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos de una o más CDR del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 8B5.3.4, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 que tienen los números de acceso ATCC PTA-7610, PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente. Las condiciones de hibridación astringentes incluyen, pero no están limitadas a, hibridación a ADN unido a filtro en disolución 6X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC/0,1% SDS a aproximadamente 50-65°C, condiciones altamente astringentes tales como hibridación a ADN unido a filtro en 6X SSC a aproximadamente 45°C seguido de uno o más lavados en 0,1X SSC/0,2% SDS a aproximadamente 60°C, o cualesquiera otras condiciones de hibridación astringentes conocidas para los expertos

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derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos respecto al anticuerpo o fragmento de éste original. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones de aminoácidos conservativas hechas en uno o más residuos de aminoácidos que se predice que no son esenciales.

Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y en ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden prepararse por una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de exposición en fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véanse también las Patentes U.S. Nos. 4.444.887 y 4,716.111; y las Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.

5.1.1 Anticuerpos humanizados

En realizaciones preferidas, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo, una variante o un fragmento de éste que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región marco que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo específico de FcγRIIB humanizado puede comprender sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado de la invención también comprende al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Los dominios constantes de los anticuerpos humanizados de la invención pueden seleccionarse respecto a la función propuesta del anticuerpo, en particular la función efectora que puede requerirse. En algunas realizaciones, los dominios constantes de los anticuerpos humanizados de la invención son dominios de IgA, IgE, IgG o IgM humanas. En una realización específica que se encuentra en el alcance de las reivindicaciones especificadas, se usan los dominios constantes de IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3, cuando los anticuerpos humanizados de la invención se pretenden para usos terapéuticos y se necesitan las funciones efectoras del anticuerpo. En realizaciones alternativas, se usan los isotipos IgG2 e IgG4 cuando el anticuerpo humanizado de la invención se pretende para propósitos terapéuticos y no se requiere la función efectora del anticuerpo. Los anticuerpos específicos de FcγRIIB humanizados se describen en las Solicitudes Provisionales U.S. con Nos. de Serie 60/569,882 y 60/582,043, presentadas el 10 de mayo de 2004 y el 21 de junio de 2004, respectivamente, y Solicitud de Patente U.S. No. 11/126.978, presentada el 10 de mayo de 2005.

En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene tanto la cadena ligera así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. En otras realizaciones, el anticuerpo puede comprender además una o más de las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3, y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunas realizaciones, el dominio constante es un dominio constante de fijación de complemento cuando se desea que el anticuerpo humanizado presente actividad citotóxica, y la clase es típicamente IgG1. En otras realizaciones, cuando no es deseable dicha actividad citotóxica, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y la selección de dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas está en el alcance de la técnica.

Las regiones marco y CDR de un anticuerpo humanizado no es necesario que se correspondan de manera precisa con las secuencias parentales, por ejemplo, la CDR donante o el marco consenso pueden mutagenizarse por sustitución, inserción o deleción de al menos un residuo de manera que el residuo CDR o marco en ese sitio no se corresponde ni con el consenso ni anticuerpo donante. Dichas mutaciones, sin embargo, son preferiblemente no extensas. Habitualmente, al menos 75% de los residuos del anticuerpo humanizado se corresponderán con aquellos de las secuencias de región marco parental (FR) y CDR, más frecuentemente 90%, y lo más preferiblemente más del 95%. Los anticuerpos humanizados pueden producirse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo pero no limitado a, injerto de CDR (Patente Europea No. EP 239.400; Publicación Internacional No. WO 91/09967; y Patentes U.S. Nos. 5.225.539, 5.530.101, y 5.585.089), recubrimiento o modificación en superficie (Patentes Europeas Nos. EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:969973), intercambio de cadenas (Patente U.S. No. 5.565.332), y técnicas descritas, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 6.407.213, 5.766.886, 5.585.089, Publicación Internacional No. WO 9317105, Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al.., 2000, Protein Eng. 13:353-60, Morea et al., 2000, Methods 20:267-79, Baca et al., 1997,

J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9:895-904, Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Sup):5973s-5977s, Couto et al., 1995, Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Frecuentemente, los residuos marco en las regiones marco se

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sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones marco se identifican por métodos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, modelando las interacciones de los residuos CDR y marco para identificar residuos marco importantes para la unión a antígeno y comparación de secuencias para identificar residuos marco no habituales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al., Patente U.S. No. 5.585.089; Publicaciones U.S. Nos. 2004/0049014 y 2003/0229208; Patentes U.S. Nos. 6.350.861; 6.180.370;5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101 y Riechmann et al., 1988, Nature 332:323).,

La presente especificación proporciona el uso de moléculas de anticuerpo humanizado específicas para FcγRIIB en las que una o más regiones de una o más CDR de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano (el anticuerpo receptor) se han sustituido por partes análogas de una o más CDR de un anticuerpo monoclonal donante que se une específicamente a FcγRIIB, con una afinidad mayor que FcγRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido por el clon 8B5.3.4, que tiene el número de acceso ATCC PTA-7610, respectivamente. En otro caso, los anticuerpos humanizados se unen al mismo epítopo que el anticuerpo 8B5.3.4. En un caso lo más preferido, el anticuerpo humanizado se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo murino donante. Un experto en la técnica apreciará que la invención engloba injerto de CDR de anticuerpos en general. Así, los anticuerpos donante y aceptor pueden derivar de animales de la misma especie e incluso la misma clase o subclase de anticuerpo. Más habitualmente, sin embargo, los anticuerpos donante y aceptor derivan de animales de diferentes especies. Típicamente, el anticuerpo donante es un anticuerpo no humano, tal como un MAb de roedor, y el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano.

En algunos casos, al menos una CDR del anticuerpo donante se injerta en el anticuerpo humano. En otros casos, al menos dos y preferiblemente las tres CDR de cada una de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera se injertan en el anticuerpo humano. Las CDR pueden comprender las CDR de Kabat, las CDR de bucle estructural o una combinación de éstas. En algunos casos, la especificación engloba un anticuerpo frente a FcγRIIB humanizado que comprende al menos una cadena pesada injertada con CDR y al menos una cadena ligera injertada con CDR.

En una realización preferida, las regiones CDR del anticuerpo específico de FcγRIIB humanizado derivan de un anticuerpo murino específico para FcγRIIB. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria comprenden alteraciones, incluyendo pero no limitado a deleciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos, del anticuerpo aceptor, es decir, regiones marco de dominio variable humanas de cadena pesada y/o ligera que son necesarias para retener la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal donante. En algunas realizaciones, las regiones marco de los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria no consisten necesariamente en la secuencia de aminoácidos precisa de la región marco de una región variable de anticuerpo humano natural, sino que contiene varias alteraciones, incluyendo pero no limitado a deleciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos que alteran la propiedad del anticuerpo humanizado, por ejemplo, mejoran las propiedades de unión de una región del anticuerpo humanizado que es específico para la misma diana que el anticuerpo específico de FcγRIIB murino. En las realizaciones más preferidas, se hace un número mínimo de alteraciones a la región marco con el fin de evitar introducciones a gran escala de residuos marco no humanos y para asegurar una inmunogenicidad mínima del anticuerpo humanizado en los seres humanos. El anticuerpo monoclonal donante es preferiblemente un anticuerpo monoclonal producido por el clon 8B5.3.4 (que tiene el número de acceso ATCC PTA-7610) que se une a FcγRIIB.

En un caso específico, la especificación engloba el uso de un anticuerpo injertado con CDR que se une específicamente a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA, en el que el anticuerpo injertado con CDR comprende un dominio de región variable de cadena pesada que comprende residuos marco del anticuerpo receptor y residuos del anticuerpo monoclonal donante, que se une específicamente a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido a partir del clon 8B5.3.4. En otro caso específico, la especificación engloba el uso de un anticuerpo injertado con CDR que se une específicamente a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA, en el que el anticuerpo injertado con CDR comprende un dominio de región variable de cadena ligera que comprende residuos marco del anticuerpo receptor y residuos del anticuerpo monoclonal donante, que se une específicamente a FcγRIIB con una mayor afinidad de la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 8B5.3.4, 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, ó 1F2.

Preferiblemente, los anticuerpos humanizados se unen al dominio extracelular de FcγRIIB humano nativo. Los anticuerpos anti-FcγRIIB humanizados de la especificación pueden tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEQ ID NO: 8) y/o CDR2 (SEQ ID NO: 9) y/o CDR3 (SEQ ID NO: 10) y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEQ ID NO: 5) y/o una CDR2 (SEQ ID NO: 6) y/o CDR3 (SEQ ID NO: 7).

En un caso específico, la especificación engloba el uso de un anticuerpo humanizado que comprende las CDR del anticuerpo 8B5.3.4 en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una malignidad de células B, o uno o más síntomas de ésta. En particular, un anticuerpo con el dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y el dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 se usa en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de una malignidad de células B, o uno o más síntomas de ésta. En otro caso preferido más, los anticuerpos humanizados no se unen además a receptores Fc de

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Tabla 2. Mutaciones ejemplares

Mutantes de único sitio: Mutantes de doble sitio

K392R: Q347H, A339V

N315I: S415I, L251F

S132I: K290E, L142P

P396L: G285E, P247H

P396H: K409R, S166N

A162V: E334A, K334A

R292L: R292L. K334E

T359N: K288N, A330S

T366S: R255L, E318K

V379L: F243L, E318K

K288N: V279L, P395S

A330S: K246T, Y319F

F243L: F243I, V379L

E318K: K288M, K334E

V379M: K334E, E308D

S219Y: E233D, K334E

V282M: K246T, P396H

D401V: H268D, E318D

K222N: K246I, K334N

K334I: K320E, K326E

K334E: S375C, P396L

1377F: K288N, K326N

P247L: P247L, N421K

F372Y: S298N, W381R

K326E: R255Q, K326E

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Mutantes de único sitio: Mutantes de doble sitio

H224L: V284A, F372L

F275Y: T394M. V397M

L398V: P247L, E389G

K334N: K290T, G371D

S400P: P247L, L398Q

S407I: P247L, I377F

F372Y: K326E, G385E

T366N: S298N, S407R

K414N: E258D, N384K

M352L: F241L, E258G

T225S: K370N, S440N

I377N: K317N, F423-Delecionado

K248M: P227S, K290E

R292G: K334E, E380D

S298N: P291S, P353Q

D270E: V240I, V281M

E233G: P232S, S304G

imagen17: P247L,L406F

imagen18: D399E, M428L

imagen19: L251F, F372L

imagen20: D399E, G402D

imagen21: D399E, M428L

imagen22: K392T,P396L

imagen23: H268N, P396L

imagen24: K3261, P396L

imagen25: H268D, P396L

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Mutantes de único sitio: Mutantes de doble sitio

imagen26: K210M, P396L

imagen27: L358P, P396L

imagen28: K334N, P396L

imagen29: V379M, P396L

imagen30: P227S, P396L

imagen31: P217S, P396L

imagen32: Q419H, P396L

imagen33: K370E, P396L

imagen34: L242F, P396L

imagen35: R255L, P396L

imagen36: V240A, P396L

imagen37: T250A, P396L

imagen38: P247S, P396L

imagen39: L410H, P396L

imagen40: Q419L, P396L

imagen41: V427A, P396L

imagen42: E258D, P396L

imagen43: N384K, P396L

imagen44: V323I, P396L

imagen45: P244H, P396L

imagen46: V305L, P396L

imagen47: S400F,P396L

imagen48: V303I, P396L

imagen49: A330V, Q419H

imagen50: V263Q, E272D

imagen51: K326E, A330T

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En otras realizaciones más, que se encuentran en el alcance de las reivindicaciones especificadas, la invención engloba moléculas que comprenden regiones Fc variantes que tienen más de dos modificaciones de aminoácidos. Un ejemplo no limitativo de dichas variantes se lista en la tabla siguiente (Tabla 3). La invención engloba mutaciones listadas en la Tabla 3 que comprenden además una o más modificaciones de aminoácidos tales como las descritas en la presente memoria.

Tabla 3. Variantes de combinación ejemplares

D399E, R292L, V185M

R301C, M252L, S192T

P291S, K288E, H268L, A141V

S383N, N384K, T256N, V262L, K218E, R214I, K205E, F149Y, K133M

S408I, V215I, V125L

G385E, P247H

V348M, K334N, F275I, Y202M, K147T

H310Y, T289A, Y407V, E258D

R292L, P396L, T359N

F275I, K334N, V348M

F243L. R255L, E318K

K334E, T359N, T366S

T256S, V305I, K334E, N390S

T335N, K370E, A378V, T394M, S424L

K334E, T359N, T366S, Q386R

K288N, A330S, P396L

P244H, L358M, V379M, N384K, V397M

P217S, A378V, S408R

P247L, I253N, K334N

D312E, K327N,1378S

D280E, S354F, A431D, L441I

K218R, G281D, G385R

P247L, A330T, S440G

T355N, P387S, H435Q

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P247L, A431V, S442F

P343S,P353L,S375I,S383N

E216D,E345K,S375I

K288N, A330S, P396L

K222N,T335N,K370E,A378V,T394M

G316D,A378V,D399E

N315I,V379M,T394M

K326Q,K334E,T359N,T366S

A378V,N390I,V422I

V282E,V369I,L406F

V397M,T411A,S415N

T223I,T256S,L406F

L235P,V382M,S304G,V305J,V323I

P247L,W313R,E388G

D221Y,M252I,A330G,A339T,T359N,V422I,H433L

F243I,V379L,G420V

A231V,Q386H,V412M

T215P,K274N,A287G,K334N,L365V,P396L

P244A,K326I,C367R,S375I,K447T

R301H, K340E,D399E

C229Y,A287T,V379M,P396L,L443V

E269K,K290N,Q311R,H433Y

E216D,K334R,S375I

T335N,P387S,H435Q

K246I,Q362H,K370E

K334E,E380D,G446V

V303I,V369F,M428L

33

K246E,V284M,V308A

E293V,Q295E,A327T

Y319F,P352L,P396L

D221E, D270E, V308A, Q311H, P396L, G402D

K290T, N390I, P396L

K288R, T307A, K344E, P396L

V273I, K326E, L328I, P396L

K326I, S408N, P396L

K261N, K210M, P396L

F243L, V305I, A378D, F404S, P396L

K290E, V369A, T393A, P396L

K210N, K222I, K320M, P396L

P217S, V305I, I309L, N390H, P396L

K246N, Q419R, P396L

P217A, T359A, P396L

V215I, K290V, P396L

F275L, Q362H, N384K, P396L

A330V, H433Q, V427M

V263Q, E272D, Q419H

N276Y, T393N, W417R

V282L, A330V, H433Y, T436R

V284M, S298N, K334E, R355W

A330V, G427M, K438R

S219T, T225K, D270E, K360R

K222E, V263Q, S298N

E233G, P247S, L306P

S219T, T225K, D270E

34 5

10

15

20

25

30

S254T, A330V, N361D, P243L

V284M, S298N, K334E, R355W R416T

D270E,G316D,R416G

K392T, P396L, D270E

R255L, P396L, D270E

V240A, P396L, D270E

Q419H, P396L, D270E

K370E, P396L, D270E

P247L, N421K, D270E

R292P, V305I

R292P, V305I, F243L

V284M, R292L, K370N

F243L, R292L, Y300L

En las realizaciones más preferidas que se encuentran en el alcance de las reivindicaciones especificadas, un anticuerpo anti-FcγRIIB de la invención tiene una región Fc modificada con afinidad alterada para receptores activadores y/o inhibidores, en el que el dominio Fc tiene una o más modificaciones de aminoácidos, en el que dichas una o más modificaciones de aminoácidos es una sustitución en la posición 288 con asparagina, en la posición 330 con serina y en la posición 396 con leucina (MgFc10) (véanse, las Tablas 2 y 3); o una sustitución en la posición 334 con ácido glutámico, en la posición 359 con asparagina, y en la posición 366 con serina (MgFc13); o una sustitución en la posición 316 con ácido aspártico, en la posición 378 con valina, y en la posición 399 con ácido glutámico (MgFc27); o una sustitución en la posición 392 con treonina, y en la posición 396 con leucina (MgFc38); o una sustitución en la posición 221 con ácido glutámico, en la posición 270 con ácido glutámico, en la posición 308 con alanina, en la posición 311 con histidina, en la posición 396 con leucina, y en la posición 402 con ácido aspártico (MgFc42); o una sustitución en la posición 240 con alanina, y en la posición 396 con leucina (MgFc52); o una sustitución en la posición 410 con histidina, y en la posición 396 con leucina (MgFc53); o una sustitución en la posición 243 con leucina, en la posición 305 con isoleucina, en la posición 378 con ácido aspártico, en la posición 404 con serina, y en la posición 396 con leucina (MgFc54); o una sustitución en la posición 255 con leucina, y en la posición 396 con leucina (MgFc55); o una sustitución en la posición 370 con ácido glutámico y en la posición 396 con leucina (MgFc59); o una sustitución en la posición 243 con leucina, en la posición 292 con prolina, en la posición 300 con leucina, en la posición 305 con isoleucina, y en la posición 396 con leucina (MgFc88); o una sustitución en la posición 243 con leucina, en la posición 292 con prolina, en la posición 300 con leucina, y en la posición 396 con leucina (MgFc88A); o una sustitución en la posición 243 con leucina, en la posición 292 con prolina, y en la posición 300 con leucina (MgFc155). (Véanse, también, las Tablas 2, 3A y 3B de la Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 2005/0064514 A1, de Stavenhagen et al., presentada el 28 de julio, 2004).

En una realización preferida, el anticuerpo anti-FcγRIIB, tal como el anticuerpo 8B5.3.4, tiene una región Fc modificada con una leucina en la posición 243, una prolina en la posición 292, una leucina en la posición 300, una isoleucina en la posición 305 y una leucina en la posición 396.

En realizaciones específicas que se encuentran en el alcance de las reivindicaciones especificadas, la región Fc variante tiene una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270 (MgFc31/60); una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270 (MgFc38/60); una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270, y una leucina en la posición 243 (MgFc38/60/F243L); una histidina en la posición 419, una leucina en la posición 396, y un ácido glutámico en la posición 270 (MGFc51/60); una histidina en la posición 419, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270, y una leucina en la posición 243 (MGFc51/60/F243L); una

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La tecnología de exposición en fago puede usarse para incrementar la afinidad de un anticuerpo de la invención para FcγRIIB. Esta técnica sería útil para la obtención de anticuerpos de alta afinidad que podrían usarse en los métodos combinatorios de la invención. La tecnología, referida como maduración por afinidad, emplea mutagénesis

o paseo de CDR y re-selección usando FcγRIIB o un fragmento antigénico de éste para identificar anticuerpos que se unen con mayor afinidad al antígeno cuando se comparan con el anticuerpo inicial o parental (Véase, por ejemplo, Glaser et al., 1992, J. Immunology 149:3903). La mutagénesis de codones enteros en lugar de nucleótidos únicos resulta en un repertorio semi-aleatorizado de mutaciones de aminoácidos. Pueden construirse bibliotecas que consisten en un conjunto de clones variantes cada uno de los cuales se diferencia por una única alteración de aminoácidos en una única CDR y que contienen variantes que representan cada sustitución posible de aminoácidos para cada residuo de CDR. Los mutantes con afinidad de unión incrementada para el antígeno pueden cribarse poniendo en contacto los mutantes inmovilizados con antígeno marcado. Puede usarse cualquier método de cribado conocido en la técnica para identificar anticuerpos mutantes con avidez incrementada para el antígeno (por ejemplo, ELISA) (Véase, Wu et al., 1998, Proc Natl. Acad Sci. USA 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994). También es posible el paseo de CDR que aleatoriza la cadena ligera (Véase, Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551).

Los anticuerpos de la invención pueden caracterizarse adicionalmente por mapeo de epítopos, de manera que pueden seleccionarse los anticuerpos que tienen la mayor especificidad para FcγRIIB comparada con FcγRIIA. Los métodos de mapeo de epítopos de anticuerpos son muy conocidos en la técnica y están englobados en los métodos de la invención. En determinados casos, pueden usarse proteínas de fusión que comprenden una o más regiones de FcγRIIB en el mapeo del epítopo de un anticuerpo de la invención. En un caso específico, la proteína de fusión contiene la secuencia de aminoácidos de una región de un FcγRIIB fusionada con la parte Fc de IgG2 humana. Cada proteína de fusión puede comprender además sustituciones de aminoácidos y/o reemplazos de determinadas regiones del receptor con la región correspondiente de un receptor homólogo, por ejemplo, FcγRIIA, como se muestra en la Tabla 4 siguiente. pMGX125 y pMGX132 contienen el sitio de unión de IgG del receptor FcγRIIB, el primero con el extremo C de FcγRIIB y el último con el extremo C de FcγRIIA y pueden usarse para diferenciar la unión del extremo C. Los otros tienen sustituciones de FcγRIIA en el sitio de unión de IgG y bien el extremo N de FcγIIA o FcγIIB. Estas moléculas pueden ayudar a determinar la parte de la molécula de receptor a la que se unen los anticuerpos.

Tabla 4. Lista de las proteínas de fusión que pueden usarse para investigar el epítopo de los anticuerpos monoclonales anti-FcγRIIB. Los residuos 172 a 180 pertenecen al sitio de unión de IgG de FcγRIIA y B. Los aminoácidos específicos de la secuencia de FcγRIIA están en negrita. La secuencia del extremo C APSSS es SEQ ID NO: 11 y la secuencia del extremo C VPSMGSSS es SEQ ID NO: 12.

Plásmido: Receptor Extremo N 172-180 SEQ ID NO: Extremo C

pMGX125: RIIb IIb KKFSRSDPN 51 APS------SS (IIb)

pMGX126: RIIa/b IIa QKFSRLDPN 52 APS------SS (IIb)

pMGX127: imagen58 IIa QKFSRLDPT 53 APS------SS (IIb)

pMGX128: imagen59 IIb KKFSRLDPT 54 APS------SS (IIb)

pMGX129: imagen60 na QKFSHLDPT 55 APS------SS (IIb)

pMGX130: imagen61 IIb KKFSHLDPT 56 APS------SS (IIb)

pMGX131: imagen62 IIa QKFSRLDPN 52 VPSMGSSS(IIa)

pMGX132: imagen63 IIb KKFSRSDPN 51 VPSMGSSS(IIa)

pMGX133: RIIa-131R IIa QKFSRLDPT 53 VPSMGSSS(IIa)

pMGX134: RIIa-131H IIa QKFSHLDPT 55 VPSMGSSS(IIa)

pMGX135: imagen64 IIb KKFSRLDPT 54 VPSMGSSS(IIa)

pMGX136: imagen65 IIb KKFSHLDPT 56 VPSMGSSS(IIa)

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diferenciada, artropatía no diferenciada, artritis, osteolisis inflamatoria, e inflamación crónica que resulta de infecciones virales o bacterianas crónicas.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar una enfermedad autoinmune que es más prevalente en un sexo. Por ejemplo, la prevalencia de la enfermedad de Graves en mujeres se ha asociado con la expresión de 5 FcγRIIB2 (véase, Estienne et al., 2002, FASEB J. 16:1087-1092).

Los anticuerpos de la invención también pueden usarse para reducir la inflamación experimentada por animales, particularmente mamíferos, con trastornos inflamatorios. En un ejemplo específico, un anticuerpo reduce la inflamación en un animal al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al

10 menos 30%, al menos 25%, al menos 20%, o al menos 10% respecto a la inflamación en un animal al que no se administra dicho anticuerpo. En otro ejemplo, una combinación de anticuerpos reduce la inflamación en un animal al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60%, al menos 50%, al menos 45%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 35%, al menos 30%, al menos 25%, al menos 20%, o al menos 10% respecto a la inflamación en un animal al que no se administran dichos anticuerpos.

15 Tabla 6A: Anticuerpos para enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes que pueden usarse en combinación con los anticuerpos de la invención.

Nombre anticuerpo: del Antígeno diana Tipo de producto Isotipo Patrocinadores Indicación

5G1.1: imagen87 Complemento (C5) Humanizado IgG Alexion Pharm Inc Artritis reumatoide

5G1.1: imagen88 Complemento (C5) Humanizado IgG Alexion Pharm Inc SLE

5G1.1: imagen89 Complemento (C5) Humanizado IgG Alexion Pharm Inc Nefritis

5G1.1-SC: imagen90 Complemento (C5) Humanizado ScFv Alexion Pharm Inc Bypass cardiopulmonar

5G1.1-SC: imagen91 Complemento (C5) Humanizado ScFv Alexion Pharm Inc Infarto de miocardio

5G1.1-SC: imagen92 Complemento (C5) Humanizado ScFv Alexion Pharm Inc Angioplastia

ABX-CBL: imagen93 CBL Humano imagen94 Abgenix Inc GvHD

ABX-CBL: imagen95 CD147 Murino IgG Abgenix Inc Rechazo de aloinjerto

ABX-IL8: imagen96 IL-8 Humano IgG2 Abgenix Inc Psoriasis

Antegren: imagen97 VLA-4 Humanizado IgG Athena/Elan Esclerosis múltiple

Anti-CD11a: imagen98 CD11a Humanizado IgG1 Genentech Inc/Xoma Psoriasis

Anti-CD18: imagen99 CD18 Humanizado Fab'2 Genentech Inc Infarto de miocardio

Anti-LFA1: imagen100 CD18 Murino Fab'2 Pasteur-Merieux/ Immunotech Rechazo de aloinjerto

Antova: imagen101 CD40L Humanizado IgG Biogen Rechazo de aloinjerto

Antova: imagen102 CD40L Humanizado IgG Biogen SLE

64 65

Nombre del anticuerpo: Antígeno diana Tipo de producto Isotipo Patrocinadores Indicación

BTI-322: CD2 Rata IgG Medimmune Inc GvHD, Psoriasis

CDP571: TNF-alfa Humanizado IgG4 Celltech de Crohn

CDP571: TNF-alfa Humanizado IgG4 Celltech Artritis reumatoide

CDP850 Corsevin M: E-selectina Fact VII Humanizado Quimérico imagen103 Celltech Centocor Psoriasis Anticoagulante

D2E7: TNF-alfa Humano imagen104 CAT/BASF Artritis reumatoide

Hu23F2G: CD11/18 Humanizado imagen105 ICOS Pharm Inc Esclerosis múltiple

Hu23F2G: CD11/18 Humanizado IgG ICOS Pharm Inc Ictus

IC14: CD14 imagen106 imagen107 ICOS Pharm Inc Choque tóxico

ICM3: ICAM-3 Humanizado imagen108 ICOS Pharm Inc Psoriasis

IDEC-114: CD80 Primatizado imagen109 IDEC Pharm/Mitsub ishi Psoriasis

IDEC-131: CD40L Humanizado imagen110 IDEC Pharm/Eisai SLE

IDEC-131: CD40L Humanizado imagen111 IDEC Pharm/Eisai Esclerosis múltiple

IDEC-151: CD4 Primatizado IgG 1 IDEC Pharm/Glaxo SmithKline Artritis reumatoide

IDEC-152: CD23 Primatizado imagen112 IDEC Pharm Asma/alergia

Infliximab: TNF-alfa Quimérico IgG 1 Centocor Artritis reumatoide

Infliximab: TNF-alfa Quimérico IgG 1 Centocor de Crohn

LDP-01: beta2integrina Humanizado IgG Millennium Inc (LeukoSite Inc.) Ictus

LDP-01: beta2integrina Humanizado IgG Millennium Inc (LeukoSite Inc.) Rechazo de aloinjerto

LDP-02: alfa4beta7 Humanizado imagen113 Millennium Inc (LeukoSite Inc.) Colitis ulcerosa

MAK-195F: TNF alfa Murino Fab'2 Knoll Pharm, BASF Choque tóxico

MDX-33: CD64 (FcR) Humano imagen114 Medarex/Centeon Trastornos hematológicos autoinmunes

MDX-CD4: CD4 Humano IgG Medarex/Eisai/Genmab Artritis reumatoide

MEDI-507: CD2 Humanizado imagen115 Medimmune Inc Psoriasis

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Anticuerpo: Indicación imagen118 Antígeno diana

imagen119: inflamación imagen120 imagen121

Enbrel (etanercept): imagen122 dirigido a TNF (factor de necrosis tumoral)

IL-8: imagen123 MAB completamente humano frente a IL-8 (interleuquina 8) (bloquea IL-8 bloquea la respuesta inflamatoria)

5G1.1: artritis reumatoide (erupción cutánea psoriasis lupus penfigoide peligrosa) un inhibidor del complemento C5

Apogen MP4: imagen124 antígeno recombinante destruye selectivamente las células T asociadas a enfermedad induce apoptosis células T eliminadas por muerte celular programada no atacan más las células propias del cuerpo apógenos específicos dirigidos a células T específicas

5.4.3 Alergia

Se discuten métodos para tratar o prevenir un trastornos alérgico mediado por IgE y o mediado por FcγRI en un sujeto que lo necesita, que comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de los 5 anticuerpos agonistas o fragmentos de éstos de la invención. Aunque no se pretende la vinculación a ningún mecanismo particular de acción, los anticuerpos de la invención son útiles para inhibir la activación de mastocitos inducida por FcεRI, que contribuye a respuestas alérgicas de fase aguda y tardía (Metcalfe D. et al. 1997, Physiol. Rev. 77:1033). Preferiblemente, los anticuerpos agonistas de la invención tienen una eficacia terapéutica aumentada y/o efectos secundarios reducidos en comparación con los métodos convencionales usados en la técnica para el

10 tratamiento y/o prevención de trastornos alérgicos mediados por IgE. Los métodos convencionales para el tratamiento y/o prevención de trastornos alérgicos mediados por IgE incluyen, pero no están limitados a, fármacos anti-inflamatorios (por ejemplo, corticosteroides orales e inhalados para el asma), antihistamínicos (por ejemplo, para rinitis alérgica y dermatitis atópica), cisteinil leucotrienos (por ejemplo, para el tratamiento del asma); anticuerpos anti-IgE; e inmunoterapia específica o desensibilización.

15 Los ejemplos de respuestas alérgicas mediadas por IgE incluyen, pero no están limitados a, asma, rinitis alérgica, alergias gastrointestinales, eosinofilia, conjuntivitis, dermatitis atópica, urticaria, anafilaxis, o nefritis glomerular.

También se describen moléculas, por ejemplo, inmunoglobulinas, preparadas por ingeniería para formar complejos con FcγRI y FcγRIIB humano, es decir, se unen específicamente a FcγRI y FcγRIIB humano. Preferiblemente, dichas moléculas tienen eficacia terapéutica en trastornos mediados por IgE y FcγRI. Aunque no se pretende la

20 vinculación a ningún mecanismo particular de acción, la eficacia terapéutica de estas moléculas preparadas por ingeniería se debe, en parte, a su capacidad de inhibir la función de los mastocitos y basófilos.

Las moléculas que se unen específicamente a FcγRI y FcγRIIB humano pueden ser proteínas de fusión quiméricas que comprenden un sitio de unión para FcγRI y un sitio de unión para FcγRIIB. Dichas moléculas pueden prepararse por ingeniería según metodologías estándar de ADN recombinante conocidas para un experto en la técnica. 25 Preferiblemente, una proteína de fusión quimérica para uso en los métodos de la especificación comprende una única cadena única F(ab') de un anticuerpo anti-FcγRIIB monoclonal de la invención fusionada con una región usada como un puente para unir el huFcγ a la región C terminal de la cadena única F(ab') del anticuerpo anti-FcγRIIB monoclonal. Una proteína de fusión quimérica ejemplar para uso en los métodos de la especificación comprende lo siguiente: VL/CH (FcγRIIB )-bisagra-VH/CH (FcγRIIB)-CONECTOR-CHε2-CHε3-CHε4. El conector para las moléculas 30 quiméricas puede tener una longitud de cinco, diez, preferiblemente quince aminoácidos. La longitud del conector puede variar para proporcionar una unión óptima de la molécula tanto a FcγRIIB como a FcγRI. En una realización específica, el conector es un conector de 15 aminoácidos, que consiste en la secuencia: (Gly4Ser)3. Aunque no se pretende la vinculación a ningún mecanismo particular de acción, el conector peptídico flexible facilita el emparejamiento de cadenas y minimiza el replegamiento posible y también permitirá que la molécula quimérica 35 alcance los dos receptores, es decir, FcγRIIB y FcγRI en las células y los entrecruce. Preferiblemente, la molécula quimérica se clona en un vector de expresión de mamíferos, por ejemplo, pCI-neo, con un promotor compatible, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus. La proteína de fusión preparada según los métodos de la especificación contendrá el sitio de unión para FcεRI (CHε2CHε3) y para FcγRIIB (VL/CL,-bisagra-VH/CH). El ácido nucleico que codifica la proteína de fusión preparada según los métodos de la especificación se transfecta preferiblemente en

40 células 293 y la proteína secretada se purifica según métodos comunes conocidos en la técnica.

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Empresa: Producto imagen129 Enfermedad Diana

imagen130: 90) imagen131 imagen132 PEM

imagen133: Therex imagen134 cáncer de mama antígeno PEM

Boehringer Ingelheim: blvatuzumab imagen135 cáncer de cabeza y cuello CD44

Centocor/J&J: Panorex imagen136 cáncer colorrectal 17-1A

imagen137: ReoPro imagen138 PTCA gp IIIb/IIIa

imagen139: ReoPro imagen140 MI agudo gp IIIb/IIIa

imagen141: ReoPro imagen142 ictus isquémico gp IIIb/IIIa

Corixa: Bexocar imagen143 NHL CD20

CRC Technology: MAb, 105AD7 idiotípico imagen144 vacuna para el cáncer colorrectal gp72

Crucell: Anti-EpCAM imagen145 cáncer Ep-CAM

Cytoclonal: MAb, cáncer de pulmón imagen146 cáncer de pulmón de células no pequeñas NA

Genentech: Herceptina imagen147 cáncer de mama metastásico HER-2

imagen148: Herceptina imagen149 cáncer de mama en estadío temprano HER-2

imagen150: Rituxan imagen151 NHL recidivante/refractario de bajo grado o folicular CD20

imagen152: Rituxan imagen153 NHL de grado intermedio y alto CD20

imagen154: MAb-VEGF imagen155 NSCLC, metastásico VEGF

imagen156: MAb-VEGF imagen157 Cáncer colorrectal, metastásico VEGF

imagen158: AMD Fab imagen159 degeneración macular relacionada con la edad CD18

imagen160: E-26 (2a gen. IgE) imagen161 asma y rinitis alérgicos IgE

IDEC: Zevalin (Rituxan + itrio-90) imagen162 grado bajo de NHL de células B folicular, recidivante o refractario, positivo para CD20 y NHL refractario para Rituximab CD20

ImClone: Cetuximab + innotecán imagen163 carcinoma colorrectal refractario Receptor de EGF

imagen164: Cetuximab + cisplatino radiación y cáncer de cabeza y cuello recién diagnosticado o recurrente Receptor de EGF

imagen165: Cetuximab + gemcitabina imagen166 carcinoma pancreático metastásico recién diagnosticado Receptor de EGF

73 74 75

Empresa: Producto Enfermedad Diana

imagen167: Cetuximab + cisplatino + 5FU o Taxol cáncer de cabeza y cuello recurrente o metastásico Receptor de EGF

imagen168: Cetuximab + carboplatino + paclitaxel carcinoma de pulmón de células no pequeñas recién diagnosticado Receptor de EGF

imagen169: Cetuximab + cisplatino cáncer de cabeza y cuello (enfermedad extensa incurable local-regional y metástasis distantes) Receptor de EGF

imagen170: Cetuximab + radiación carcinoma de cabeza y cuello localmente avanzado Receptor de EGF

imagen171: BEC2 + Bacilo de Calmette Guerin carcinoma de pulmón de células pequeñas miméticos de gangliósido GD3

imagen172: BEC2 + Bacilo de Calmette Guerin melanoma miméticos de gangliósido GD3

imagen173: IMC-1C11 cáncer colorrectal con metástasis hepáticas receptor de VEGF

ImmonoGen: nuC242-DM1 cáncer colorrectal, gástrico, y pancreático nuC242

ImmunoMedics: LymphoCide Linfoma no de Hodgkins CD22

imagen174: LymphoCide Y-90 Linfoma no de Hodgkins CD22

imagen175: CEA-Cide tumores sólidos matastásicos CEA

imagen176: CEA-Cide Y-90 tumores sólidos matastásicos CEA

imagen177: CEA-Scan (arcitumomab marcado con Tc-99m) cáncer colorrectal (radioimagen) CEA

imagen178: CEA-Scan (arcitumomab marcado con Tc-99m) cáncer de mama (radioimagen) CEA

imagen179: CEA-Scan (arcitumomab marcado con Tc-99m) cáncer de pulmón (radioimagen) CEA

imagen180: CEA-Scan (arcitumomab marcado con Tc-99m) tumores intraoperatorios (radio imagen) CEA

imagen181: LeukoScan (sulesomab marcado con Tc-99m) infección de tejido blando (radioimagen) CEA

imagen182: LymphoScan (marcado con Tc-99m) linfomas (radioimagen) CD22

imagen183: AFP-Scan (marcado con Tc99m) cánceres de línea germinal hígado 7 (radioimagen) AFP

Empresa: Producto Enfermedad Diana

Intracel: HumaRAD-HN (+ itrio-90) cáncer de cabeza y cuello NA

imagen184: HumaSPECT imagen colorrectal NA

Medarex: MDX-101 (CTLA-4) cánceres de próstata ÿ otros CTLA-4

imagen185: MDX-210 (sobreexpresión de her-2) Cáncer de próstata HER-2

imagen186: MDX-210/MAK Cáncer HER-2

MedImmune: Vitaxina Cáncer αvβ3

Merck KGaA: MAb 425 Varios cánceres Receptor de EGF

imagen187: IS-IL-2 Varios cánceres Ep-CAM

Millennium: Campath (alemtuzumab) leucemia linfocítica crónica CD52

NeoRx: CD20-streptavidina (+ biotinaitrio 90) Linfoma no de Hodgkins CD20

imagen188: Avidicina (albúmina + NRLU13) cáncer metastásico NA

Peregrine: Oncolym (+ yodo-131) Linfoma no de Hodgkins HLA-DR 10 beta

imagen189: Cotara (+ yodo-131) glioma maligno no reseccionable Proteínas asociadas al ADN

Pharmacia Corporation: C215 (+ enterotoxina staphylococcal) cáncer pancreático NA

imagen190: MAb, cáncer de pulmón/riñón cáncer de pulmón y riñón NA

imagen191: nacolomab tafenatox (C242 + enterotoxina staphylococcal) cáncer de colon y pancreático NA

Protein Design Labs: Nuvion malignidades de células T CD3

imagen192: SMART M195 AML CD33

imagen193: SMART 1D10 NHL antígeno HLA-DR

Titan: CEAVac cáncer colorrectal, avanzado CEA

imagen194: TriGem melanoma metastásico y cáncer de pulmón de células pequeñas GD2gangliósido

Empresa: Producto Enfermedad Diana

imagen195: TriAb cáncer de mama metastásico MUC-1

Trilex: CEAVac cáncer colorrectal, avanzado CEA

imagen196: TriGem melanoma metastásico y cáncer de pulmón de células pequeñas GD2gangliósido

imagen197: TriAb cáncer de mama metastásico MUC-1

Viventia Biotech: NovoMAb-G2 radiomarcado Linfoma no de Hodgkins NA

imagen198: Monopharm C carcinoma colorrectal y pancreático Antígeno SK-1

imagen199: GlioMAb-H (+ toxina gelonina) gliorna, melanoma y neuroblastoma NA

Xoma: Rituxan NHL recidivante/refractario de bajo grado o folicular CD20

imagen200: Rituxan NHL de grado intermedio y alto CD20

imagen201: ING-1 adenocarcinoma Ep-CAM

5.4.6 Terapia de vacuna

Se describe un método para aumentar una respuesta inmune a una composición de vacuna en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto un anticuerpo o un fragmento de éste que se une 5 específicamente a FcγRIIB con mayor afinidad de la que dicho anticuerpo o un fragmento de éste se une a FcγRIIA, y una composición de vacuna, en el que dicho anticuerpo o un fragmento de éste aumenta la respuesta inmune a dicha composición de vacuna. Dicho anticuerpo o un fragmento de éste puede aumentar la respuesta inmune a dicha composición de vacuna aumentando la presentación de antígeno y/o el procesamiento del antígeno frente al que está dirigida la vacuna. Cualquier composición de vacuna conocida en la técnica es útil en combinación con los

10 anticuerpos o fragmentos de éstos de la invención.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse en combinación con cualquier vacuna de cáncer conocida en la técnica, por ejemplo, CanvaxinTM (Cancer Vax, Corporation, melanoma y cáncer de colon); Oncophage (HSPPC-96; Antigenics; melanoma metastásico); vacuna de cáncer HER-2/neu, etc. Las vacunas de cáncer usadas en los métodos descritos en la presente memoria y composiciones de la invención pueden ser, por ejemplo, vacunas 15 específicas de antígeno, vacunas anti-idiotípicas, vacunas de células dendríticas, vacunas de ADN. También se describe el uso de los anticuerpos de la invención con vacunas basadas en células como se describe por Segal et al. (Patente U.S. No. 6.403.080). Las vacunas basadas en células en combinación con los anticuerpos de la invención pueden ser bien autólogas o alogénicas. Brevemente, las vacunas basadas en cáncer como se describe por Segal et al. se basan en el producto Opsonokine (TM) por Genitrix, LLC. Las Opsonokines(TM) son citoquinas preparadas 20 por ingeniería genética que, cuando se mezclan con células tumorales, se unen automáticamente a la superficie de las células. Cuando las células "decoradas" se administran como una vacuna, la citoquina en las células activa las células presentadoras de antígeno en el receptor, mientras también permite que las células presentadoras de antígeno ingieran las células tumorales. Las células presentadoras de antígeno son entonces capaces de instruir a células T "asesinas" para encontrar y destruir células tumorales similares a lo largo del cuerpo. Así, el producto de

25 Opsonokine(TM) convierte a las células tumorales en un inmunoterapéutico anti-tumoral potente.

Los anticuerpos de la invención pueden usarse en combinación con cualquier vacuna de alergia conocida en la técnica. Los anticuerpos de la invención pueden usarse, por ejemplo, en combinación con moléculas híbridas recombinantes que codifican los alérgenos principales de polen de hierba timotea usados para la vacunación frente a la alergia al polen de hierba, como se describe por Linhart et al. (2000, FASEB Journal, 16(10):1301-3). Además, 30 los anticuerpos de la invención pueden usarse en combinación con vacunaciones basadas en ADN descritas por Horner et al. (2002, Allergy, 57 Supl, 72:24-9). Los anticuerpos de la invención pueden usarse en combinación con vacunación con el bacilo de Clamett-Guerin ("BCG") como se describe por Choi et al. (2002, Ann. Allergy Asthma Immunology, 88(6): 584-91) y Barlan et al. (2002, Journal Asthma, 39(3):239-46) para regular a la baja la secreción

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Tabla 8: Resultados de ensayo ELISA para caracterizar la unión de MAb 8B5.3.4 producido por el clon de hibridoma 8B5.3.4 a FcγRIIA y FcγRIIB. Se reportan los valores de absorbancia (en duplicado) a 650 nm para cada muestra.

imagen214: Pocillos recubiertos con CD32A Pocillos recubiertos con CD32B

8B5.3.4: 0,094 2,044

imagen215: 0,092 2,028

Control negativo: 0,071 0,074

0,065: 0,078

Control positivo: 0,340 0,332

0,352: 0,308

5 Isotipado de MAb 8BS.3.4 producido a partir del clon 8B5.3.4: El isotipo del MAb 8B5.3.4 se determinó por ensayo ELISA (Tabla 9 y FIG. 2). Se ensayaron anticuerpos frente a varios isotipos indicados. Los valores de absorbancia en la Fig. 2 muestran que los anticuerpos anti-IgG, anti-IgG1, y anti-kappa tienen la mayor reactividad con el MAb 8B5.3.4, lo que indica que el MAb 8B5.3.4 tiene un isotipo IgG1/kappa.

Tabla 9: Resultados de ensayo ELISA para caracterizar el isotipo de MAb 8B5.3.4 producido por el clon de 10 hibridoma 8B5.3.4. Se reportan los valores de absorbancia a 650 nm para el isotipo de anticuerpo indicado.

Isotipo del anticuerpo: Absorbancia a 650 nm

IgG: 2,828

IgG3: 0,165

IgM: 0,105

IgG2a: 0,246

IgG2b: 0,213

IgG1: 2,488

IgA: 0,363

kappa: 0,511

6.2.3 Ensayos ADCC in vivo

6.2.3.1 Actividad de los anticuerpos FcγRIIB en modelos murinos de xenoinjerto usando líneas celulares tumorales humanas

15 Se utilizan ratones desnudos Balb/c hembra de seis a ocho semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME; Taconic) para establecer los modelos de xenoinjerto de carcinoma de ovario y mama. Los ratones se estabulan en instalaciones de bioseguridad nivel 2 para el modelo de xenoinjerto que usa las células de ovario derivadas de ascitis y células de cáncer de mama derivadas de efusión pleural como fuentes de tumores. Los ratones se ponen en grupos de 4 para estos experimentos y se monitorizan tres veces a la semana. El peso de los ratones y el tiempo

20 de supervivencia se registran y los criterios para el crecimiento de tumores es distensión abdominal y tumores palpables. Los ratones que muestran signos de malestar visible o que alcanzan 5 gramos de peso tumoral se sacrifican por eutanasia con dióxido de carbono y se someten a autopsia. Los animales tratados con anticuerpo se

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Claims

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