ES2590144T3

ES2590144T3 - Inhibidores de proteína quinasa

Info

Publication number: ES2590144T3
Application number: ES12767447.1T
Authority: ES
Inventors: Alain Laurent; Yannick Rose; Stephen Morris; James Jaquith
Original assignee: Pharmascience Inc
Current assignee: Pharmascience Inc
Priority date: 2011-04-04
Filing date: 2012-04-03
Publication date: 2016-11-18
Anticipated expiration: 2032-04-03
Also published as: CA2831843A1; AU2012239791B2; IL228311A0; KR20140021629A; SG193406A1; MX343929B; BR112013025619A2; US9284318B2; EP2694515A4; CN103582643B; EP2694515A1; JP5997252B2; JP2014510113A; NZ615228A; MX2013011537A; AU2012239791A1; ZA201306855B; EA025542B1; BR112013025619A8; CN103582643A

Abstract

Un compuesto de la fórmula 1:**Fórmula** en donde m es un entero de 0 a 1; n es un entero de 0 a 2; R1 se selecciona de alquilo, heteroalquilo, carbociclilo y heterociclilo; R1 también se selecciona de arilo o heteroarilo, en donde el arilo y heteroarilo pueden ser sustituidos adicionalmente por los grupos seleccionados de: 1) Halógeno, 2) Alcoxi, 3) Amino, 4) -N(H)C(O)O-alquilo 5) -N(H)SO2-arilo, 6) -N(H)SO2-heteroarilo, 7) -N(H)CON(H)-arilo, 8) y -N(H)CON(H)-heteroarilo; R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, carbociclilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo. R2a y R2b, R2c y R2d o R2e y R2f puede ser fusionado para formar un sistema de anillo cicloalquilo o heterociclilo de 3 a 8 miembros; X se selecciona de CH2, O, S(O)n, NR3; R3 se selecciona de hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, carbociclilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, -C(O)R4, -C(O)OR4, -S(O)2R4, -C(O)NR4R5, -S(O)2NR4R5, -C(S)NR4R5; R4 y R5 se seleccionan independientemente de alquilo, heteroalquilo, carbociclilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo o R4 y R5 pueden ser fusionados para formar un sistema de anillo heterociclilo de 3 a 8 miembros; en donde alquilo representa C1-6 alquilo; alquenilo representa C2-6 alquenilo; alquinilo representa C2-6 alquinilo; arilo incluye grupos aromáticos de un solo anillo de 5, 6, y 7 miembros, sustituidos o no sustituidos en el que cada 30 átomo del anillo es sistemas de anillo de carbono o policíclico que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes en donde al menos uno de los anillos es aromático carbociclilo incluye un anillo no aromático sustituido o no sustituido en el que cada átomo del anillo es sistemas de anillo de carbono o policíclico que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes en donde al menos uno de los anillos es carbocíclico; heteroarilo incluye estructuras de anillos de 5 a 7 miembros aromáticos sustituidos o no sustituidos, cuyas estructuras de anillo incluyen de uno a cuatro heteroátomos o sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes en donde al menos uno de los anillos es heteroaromático; heterociclilo incluye estructuras de anillo de 3 a 10 miembros no aromáticos sustituidos o no sustituidos, cuyas estructuras de anillo incluyen de uno a cuatro heteroátomos o sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes en donde al menos uno de los anillos es heterocíclico.

Description

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Tal como se utiliza aquí, el término "sonda" se relaciona con un compuesto de la invención que está marcado, ya sea con un marcador detectable o una etiqueta de afinidad, y que es capaz de enlazarse, ya sea covalentemente o no covalentemente, a un dominio de proteína quinasa. Cuando, por ejemplo, la sonda está unida de forma no covalente, puede ser desplazada por un compuesto de prueba. Cuando, por ejemplo, la sonda se une

5 covalentemente, puede ser utilizada para formar aductos entrecruzados, que pueden ser cuantificados e inhibidos por un compuesto de prueba.

El término "sustituido" se relaciona con unidades estructurales que tienen sustituyentes que reemplazan un hidrógeno en uno o más carbonos del esqueleto. Se entenderá que "sustitución" o "sustituido con" incluye la condición implícita de que tal sustitución está de acuerdo con la valencia permitida del átomo sustituido y el 10 sustituyente, y que los resultados de sustitución en un compuesto estable, por ejemplo, que no sufre transformación espontáneamente tal como por reordenamiento, ciclización, eliminación, etc. Como se usa aquí, el término "sustituido" se contempla para incluir todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. En un amplio aspecto, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos, no aromáticos de compuestos orgánicos. Los sustituyentes permisibles 15 pueden ser uno o más y el mismo o diferentes para compuestos orgánicos apropiados. Para los propósitos de esta invención, los heteroátomos tales como nitrógeno pueden tener sustituyentes de hidrógeno y/o cualesquiera sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos descritos aquí que satisfacen las valencias de los heteroátomos. Los sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, un halógeno, un hidroxilo, un carbonilo (tal como un carboxilo, un alcoxicarbonilo, un formilo, o un acilo) un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato, o un tioformiato), un

20 alcoxilo, fosforilo, un fosfato, un fosfonato, un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano, un nitro, un azido, un sulfhidrilo, un alquiltio, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoilo, un sulfonamido, un sulfonilo, un heterociclilo, un aralquilo, o una unidad estructural aromática o heteroaromática. Se entenderá por los expertos en la técnica que las unidades esructurales sustituidas en la cadena de hidrocarburo pueden ser sustituidas, si es apropiado.

25 Los compuestos de la invención también incluyen todos los isótopos de átomos presentes en los intermediarios y/o compuestos finales. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferente número de masa. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen deuterio y tritio.

La Tabla 1 resume algunas realizaciones ilustrativas del compuesto de la Fórmula 1. Tabla 1:

Compuesto: Estructura MS (m/z)

1: imagen10 [M+H]‘=400.2

2: imagen11 [M+H]+=266.2

3: imagen12 [M+H]+=406.1

4: imagen13 [M+H]+=358.2

5: imagen14 [M+H]+=295.1

6: imagen15 [M+H]+=344.1

7: imagen16 [M+H]+=281.1

8: imagen17 [M+H]+=339.2

9: imagen18 [M+H]+=337.2

10: imagen19 [M+H]+=370.2

11: imagen20 [M+H]+=415.2

12: imagen21 [M+H]+=342.2

13: imagen22 [M+H]+=415.2

14: imagen23 [M+H]+=403.2

15: imagen24 [M+H]+=265.1

16: imagen25 [M+H]+=415.1

17: imagen26 [M+H]+=453.1

18: imagen27 [M+H]+=280.2

19: imagen28 [M+H]+=403.1

20: imagen29 [M+H]+=419.3

21: imagen30 [M+H]+=453.1

22: imagen31 [M+H]+=419.5

23: imagen32 [M+H]+=453.1

24: imagen33 [M+H]+=400.2

25: imagen34 [M+H]+=266.1

26: imagen35 [M+H]+=267.1

27: imagen36 [M+H]+=451.1

28: imagen37 [M+H]+=429.1

29: imagen38 [M+H]+=279.2

30: imagen39 [M+H]+=399.2

31: imagen40 [M+H]+=402.2

32: imagen41 [M+H]+=268.2

33: imagen42 [M+H]+=405.2

34: imagen43 [M+H]+=311.2

35: imagen44 [M+H]+=433.2

36: imagen45 [M+H]+=419.4

37: imagen46 [M+H]+=308.3

38: imagen47 [M+H]+=413.2

39: imagen48 [M+H]+=403.2

40: imagen49 [M+H]+=293.2

41: imagen50 [M+H]+=391.3

42: imagen51 M+H]+=431.2

43: imagen52 [M+H]+=417.2

44: imagen53 [M+H]+=471.1

45: imagen54 [M+H]+=413.2

46: imagen55 [M+H]+=413,2

47: imagen56 [M+H]+=419.2

48: imagen57 [M+H]+=455.1

49: imagen58 [M+H]+=251,1

50: imagen59 [M+H]+=421.2

51: imagen60 [M+H]+=307.2

52: imagen61 [M+H]+=417.2

53: imagen62 [M+H]+=373.2

54: imagen63 [M+H]+=433.2

55: imagen64 [M+H]+=483.1

56: imagen65 [M+H]+=433.3

57: imagen66 [M+H]+=451.1

58: imagen67 [M+H]+=483.1

59: imagen68 [M+H]+=487.3

60: imagen69 [M+H]+=418.1

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62: imagen71 [M+H]+=489.1

63: imagen72 [M+H]+=471.1

64: imagen73 [M+H]+=463.2

65: imagen74 [M+H]+=410.2

66: imagen75 [M+H]+=410.2

67: imagen76 [M+H]+=473.0

68: imagen77 [M+H]+=451.2

69: imagen78 [M+H]+=487,3

70: imagen79 [M+H]+=483.2

71: imagen80 [M+H]+=410.2

72: imagen81 [M+H]+=463.2

73: imagen82 [M+H]+=431.2

74: imagen83 [M+H]+=432.2

Métodos sintéticos generales

Método Sintético General A:

Los compuestos de fórmula general i-e se pueden preparar en un proceso de cuatro etapas que se resume en el Esquema I. La alquilación de R1NH2 con bromoacetonitrilo provee el intermediario i-a. La condensación de i-a con i-b en presencia de un ácido tal como ácido p-toluenosulfónico, provee el intermediario i-c. El tratamiento del intermediario i-c con una base tal como tBuOK en t-BuOH provee el intermediario i-d. El tratamiento del intermediario i-d con acetato de formamidina en etanol provee compuestos de la fórmula general i-e

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A una solución del compuesto 32 (200 mg, 0.74 mmol) en DCM (3 mL) se agregó 1-fluoro-2-isocianato-4metilbenceno (113 mg, 0.74 mmol), ácido acético (0.5 mL) y la reacción se agitó entonces a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los volátiles se eliminaron bajo presión reducida. La purificación por cromatografía en fase reversa eluyendo con metanol al 10-40% en gradiente de HCl 1% proveyó el compuesto 47·HCl como un sólido de color beis. MS (m/z) M+H= 419.2

Síntesis del compuesto 48

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10 A una solución del compuesto 32 (154 mg, 0.57 mmol) en ácido acético (5 mL) se agregó 1-isocianato-3(trifluorometil) benceno (108 mg, 0.57 mmol) y la reacción se agitó entonces a temperatura ambiente durante la

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Etapa 1: intermediario 20-a

A una solución de benceno-1,4-diamina (16.2 g, 150 mmol) y trietilamina (20.77 ml, 150 mmol) en DMF se agregó gota a gota durante un período de 15 minutos una solución de DMF de dicarbonato de di-tert-butilo (34.8 ml, 150

5 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se agregaron agua y acetato de etilo, la capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró in vacuo. Se agregó hexano al residuo; se formó un precipitado y se recolectó por filtración para proveer el intermediario 20-a como un sólido de color beis.

Etapa 2: intermediario 20-b

10 A una solución del intermediario 20-a (10.0 g, 48.0 mmol) y bromoacetonitrilo (6.34 g, 52.8 mmol) en THF (150 ml) se agregó DIPEA (17.61 ml, 101 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó entonces a 80 °C durante la noche y luego se enfrió hasta temperatura ambiente. Se agregaron cloruro de amonio acuoso saturado y acetato de etilo, la capa orgánica se separó, se lavó con cloruro de amonio saturado acuoso y salmuera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró bajo presión reducida. Se agregó dietil éter al residuo; se formó un precipitado

15 y se recolectó por filtración para proveer el intermediario 20-b como un sólido de color beis.

Etapa 3: intermediario 20-c

A una solución del intermediario 20-b (1.2 g, 4.85 mmol) en tolueno (30.0 ml), se agregó 2oxociclopentanocarbonitrilo (794 mg, 7.28 mmol) e hidrato de ácido 4-metilbencenosulfónico (92 mg, 0.48 mmol). La reacción se sometió a reflujo durante 3 horas utilizando un dean-stark y luego se enfrió hasta temperatura ambiente. 20 Se agregaron NaHCO3 saturado acuoso y acetato de etilo, la capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se

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secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró bajo presión reducida para proveer el intermediario 20-c como un sólido de color marrón.

Etapa 4: intermediario 20-d

A una solución del intermediario 20-c (1.3 g, 4.73 mmol) en THF (25 mL) se agregó 5-tert-butil-3-isocianatoisoxazol (865 mg, 5.20 mmol) y la reacción se agitó a reflujo durante 1 hora y luego se enfrió hasta temperatura ambiente. Los volátiles se eliminaron bajo presión reducida. Se agregaron hexanos al residuo; se formó un precipitado y se recolectó por filtración para proveer el intermediario 20-d como un sólido de color marrón.

Etapa 5: intermediario 20-e

A una solución del intermediario 20-d (1.9 g, 4.70 mmol) en tert-butanol (23.0 mL) se agregó tertbutóxido de potasio (580 mg, 5.17 mmol) y la reacción se agitó a 80 °C durante 30 minutos y luego se enfrió hasta temperatura ambiente. Se agregaron HCl acuoso al 10% y acetato de etilo, la capa orgánica se separó, la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo, los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para proveer el intermediario 20-e como sólido color marrón.

Etapa 6: Compuesto 74

A una solución del intermediario 20-e (1.9 g, 4.70 mmol) en etanol (23 ml) se agregó acetato de formamidina (3.91 g,

37.6 mmol) y la reacción se agitó a 80 °C durante 30 minutos. La reacción se concentró bajo presión reducida. Se agregaron una solución acuosa saturada de NaHCO3 y acetato de etilo, la capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida. La purificación por cromatografía en fase reversa eluyendo con 10-50% metanol en gradiente de HCl 1% proveyó el compuesto 74·HCl. MS (m/z) M+H= 432.2

Enlazamiento de quinasa

Las afinidades de enlazamiento de quinasa seleccionada se determinaron utilizando el servicio de protocolos de ensayo de Quinasa Profiler™ (MILLIPORW, v53.0).

El compuesto 14 inhibe cFMS(h), Aurora-B(h), Flt3 (h), KDR(h), PDGFR-b(h), FGFR1, Tie2, y FLT4 a una concentración de 100 nM.

El compuesto 44 inhibe cFMS, Flt3, KDR, FGFR1, y EphA2 a 100 nM. Como una medida de la selectividad, otras 216 quinasas fueron inhibidas por 20% o menos en 300 nM.

Ensayo bioquímico de cFMS (CSF1R):

Se realizaron ensayos bioquímicos de quinasa basados en la polarización de fluorescencia en formato de placa de 384 pozos usando el receptor del factor 1 estimulante de colonias humanas recombinantes etiquetadas con histidina (FMS) suministrada de Invitrogen™ (que contiene el dominio catalítico (aminoácidos 538-910), expresados en células de insectos y activados in vitro a través de la auto fosforilación) y un protocolo modificado del ensayo verde de fluoresceína FP de KinEASE™ suministrada de Millipore™.

Se realizaron reacciones en fase en formato de placas de 384 pozos y a temperatura ambiente durante 60 minutos en presencia 100 µM de sustrato, ATP 10 µM y concentraciones variables de artículos de prueba. La reacción se detuvo con reactivos de detección EDTA/ KinEASE™ y la polarización se midió en un instrumento 500 Tecan. A partir de la curva de respuesta a la dosis obtenida, la IC50 se estimó utilizando Graph pad prisms® usando una curva de ajuste no lineal.

Tabla 2:

Compuesto: cFMS IC50

3: C

4: a

9: C

10: C

11: a

12: C

14: b

16: b

17: b

19: a

20: b

21: b

23: b

27: a

28: a

30: b

33: b

35: a

36: b

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44: b

45: b

46: b

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54: a

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56: a

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62: b

63: b

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65: C

66: b

67: b

68: b

69: b

71: C

72: b

73: b

74: a

IC50 a: menos de 100 nM; b: entre 100 y 1000 nM; c: mayor que 1000 nM.

Ensayos celulares:

Ensayo de supervivencia de células M-NFS-60 dependientes de M-CSF murínico

Las células de leucemia mieloide dependientes de M-CSF de M-NFS-60 murínico se adquirieron de ATCC (CRL

5 1838). Las células se cultivaron de forma rutinaria a 37ºC, CO2 al 5% en medio completo (RPMI suplementado con FBS al 10%, 1% de penicilina/estreptomicina, 50 uM de beta mercaptoetanol) que contenía 30 ng/ml de M-CSF murínico recombinante (Peprotech 315-02). Para los ensayos de supervivencia, las células se transfirieron a medio agotado (medio completo agotado de M-CSF) durante 24 horas antes de la iniciación de cada experimento. Se recolectaron las células sometidas a ausencia de M-CSF y resuspendieron en medio completo que contenía 20

10 ng/ml de M-CSF. Las células se sembraron a 25,000 células/pozo en placas de 96 pozos y se incubaron durante 1 hora a 37ºC, CO2 al 5%. Las células fueron tratadas con 1 uM o 10uM de curvas compuestas por triplicado y la supervivencia celular se midió 72 horas más tarde mediante Ensayo Luminiscente de Cell Titer Glo (Promega). La luminiscencia se leyó usando un lector de microplacas Tecan Infinite F200. Los valores de EC50 (50% de supervivencia en presencia de compuesto en comparación con los controles tratados con vehículo) se calcularon a

15 partir de curvas de compuestos con respuesta con ajuste no lineal a la dosis usando el Software GraphPad Prism.

Ensayo de supervivencia de células de leucemia mielomonocítica bifenotípica B de MV4-11 humanas

Las MV4-11 de células de leucemia mielomonocítica bifenotípica B (ATCC CRL-9591) se cultivaron en suspensión a 37ºC, CO2 al 5% en medio completo (RPMI suplementado con FBS al 10%, 1% de penicilina/estreptomicina). Un día antes del tratamiento, las células por sembraron en placas de 96 pozos a 8000 células/pozo en medio completo. Al 20 día siguiente, los pozos por triplicado se trataron con curvas compuestas de 100, 1000 o 10.000 nM a partir de concentración de acuerdo con la potencia del compuesto. La supervivencia celular se midió 72 horas más tarde mediante Ensayo Luminiscente de Cell Titer Glo (Promega). La luminiscencia se leyó usando un lector de microplacas Tecan Infinite F200. Los valores de EC50 (50% de supervivencia en presencia de compuesto en comparación con los controles tratados con vehículo) se calcularon a partir de curvas de compuestos con respuesta

25 con ajuste no lineal a la dosis utilizando el software CambridgeSoft BioAssay (Perkin Elmer).

Tabla 3: Resultados de los ensayos celulares

Compuesto: EC50 M-NFS-60 (nM) EC50 MV4-11 (nM)

2: - a

3: c c

4: a a

5: - c

6: - c

7: - c

8: - c

9: c b

10: c c

11: a a

12: c c

13: a a

14: a a

15: - c

16: a a

17: a a

18: - b

19: a b

20: a b

21: a b

22: a b

23: b c

26: - c

27: a a

28: a a

29: - c

30: b a

31: - b

32: - b

33: b b

34: - c

35: b a

36: b c

37: - c

38: b c

39: a b

40: - b

41: b a

42: b a

43: a a

44: b a

45: b a

46: b a

47: a a

48: b a

49: - b

50: a a

51: - c

52: b a

53: - c

54: a a

55: b a

56: a a

57: a a

58: b a

59: b a

62: b a

63: a a

64: c b

65: b a

66: b a

67: b a

68: b a

69: b a

70: - a

71: c b

72: b a

73: b a

74: a -

EC50 a: menos de 100 nM; b: entre 100 y 1000 nM; c: mayor que 1000 nM.

Claims

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6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos 1, 2, 18, 24, 25, 31, 32, 60 y 61; o

en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 26, 29, 34, 37, 40, 49 y 51; o

en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos 14, 16, 17, 20, 21, 23, 30, 33, 36, 39, 41, 44, 45, 46, 47, 50, 55, 57, 58, 59, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 72 y 73; o

en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos 11, 13, 19, 27, 28, 35, 43, 48, 54, 56 y 74.

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(d) tratamiento del intermediario i-d con acetato de formamidina en un alcohol para proveer un compuesto de fórmula i-e

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