ES2588531T3 - Procedimiento de producción de soforosa a partir de soforolípidos - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de producción de soforosa a partir de soforolípidos en el que: a) se proporciona una solución acuosa de soforolípidos; b) se añade un compuesto ácido a la solución acuosa de soforolípidos, estando comprendido el contenido en compuesto ácido entre un 0,01 % y un 6 % en peso con respecto al peso de soforolípidos c) se calienta la mezcla obtenida en la etapa b) durante entre 2 y 200 horas y a una temperatura comprendida entre 60 y 110 ºC.
Description
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DESCRIPCION
Procedimiento de produccion de soforosa a partir de soforollpidos
La presente invencion concierne a un procedimiento de produccion de soforosa mediante la hidrolisis acida de soforollpidos. La invencion tiene igualmente por objeto la utilization de un hidrolizado obtenido segun el procedimiento de la invencion como solution inductora de la expresion de genes que codifican celulasas. Finalmente, la invencion se refiere a un procedimiento de purification de soforosa a partir del hidrolizado.
Estado de la tecnica
Las celulasas adaptadas a la hidrolisis de polisacaridos permiten a los microorganismos que las producen utilizar la celulosa y la hemicelulosa (los componentes mayoritarios de los vegetales) como fuente de carbono, hidrolizando estos pollmeros en azucares simples (glucosa, xilosa, etc).
Actualmente, estas enzimas son empleadas en numerosos ambitos tales como en la detergencia, la industria textil o la alimentaria, as! como en los procedimientos destinados a la valoracion bioqulmica de la biomasa lignocelulosica (por ejemplo, para la produccion de biocarburante de etanol de segunda generation). Trichoderma reesei se reconoce actualmente como el mejor microorganismo productor de celulasas en los procedimientos de produccion de biocarburante a partir de biomasa lignocelulosica debido principalmente a su fuerte poder de secretion.
No obstante, el coste de la produccion de las celulasas sigue siendo elevado y representa uno de los obstaculos economicos para un empleo a escala industrial de los procedimientos denominados de segunda generacion.
Industrialmente, la produccion optimizada de celulasas por parte de Trichoderma se lleva a cabo en un protocolo fed-batch (alimentation sin trasiego) mediante la utilizacion de una solucion de alimentation que contiene lactosa como el azucar inductor de la produccion de celulasas (documento EP 448 430 B1). Aunque es utilizada industrialmente, la lactosa presenta el inconveniente de ser costosa para permitir una produccion de celulasas a bajo precio.
La soforosa es conocida por ser un muy buen inductor del sistema celulolltico de Trichoderma reesei. En 1962, Mandels M. et al. [Sophorosa as an inducer of cellulase in Trichoderma viride. Journal of Bacteriology 1962, 83: 400408] han demostrado que la soforosa, cuando estaba presente unicamente en una cantidad del 0.006 % como impureza en la glucosa, permitla la induction de la produccion de enzimas celulollticas (o celulasas). Estas impurezas de soforosa se forman mediante un mecanismo de transglucosilacion durante la hidrolisis acida del almidon de la glucosa.
La soforosa (2-O-p-D-Glucopiranosil-D-glucosa) es un diholosido constituido por dos unidades en glucosa unidas por un enlace osldico p(1->2). Esta presente en la naturaleza, por ejemplo, en la vaina del arbol Sophora japonica, a partir de la cual se aislo por primera vez en 1938.
Desafortunadamente, el elevado precio de la soforosa hizo que ya no fuera posible una utilizacion a escala industrial. Actualmente se utiliza unicamente en el laboratorio para los experimentos que necesitan una fuerte induccion.
Un objetivo de la presente invencion es poner remedio a los inconvenientes descritos anteriormente, y en particular proponer un procedimiento simple y economico para la produccion de soforosa a partir de soforollpidos. El contenido en soforosa del hidrolizado puede utilizarse por tanto como agente inductor en los microorganismos capaces de producir celulasas, y en particular en Trichoderma reesei.
Resumen de la invencion
Este objetivo se consigue gracias a un procedimiento en el que:
a) se proporciona una solucion acuosa de soforollpidos;
b) se anade un compuesto acido a la solucion acuosa de soforollpidos, estando comprendido el contenido en compuesto acido entre el 0,01 % y el 6 % en peso con respecto al peso de soforollpidos;
c) se calienta la mezcla obtenida en la etapa b) durante entre 2 y 200 horas y a una temperatura comprendida entre 60 y 110 °C.
El procedimiento segun la invencion emplea una hidrolisis de un soforollpido en un medio acuoso en presencia de un compuesto acido, es decir, que es capaz de liberar iones H+ en solucion.
En el ambito de la presente invencion, el termino soforollpido (o soforosa llpido) designa los compuestos que comprenden una unidad de soforosa unida a un acido graso mediante un enlace de tipo osldico (entre el carbono 1' de la soforosa y el de w-1 del acido graso). Los soforollpidos pueden ser producidos por microorganismos, en
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particular por levaduras del genero Candida. Segun el llpido proporcionado al microorganismo y las condiciones de cultivo, se puede obtener una mezcla de diferentes soforollpidos, en una forma acida (funcion carboxllica libre) o de lactona clclica (enlace ester entre el acido graso y el grupo -OH en 4" de la soforosa), y con los grupos -OH 6' y 6" que pueden estar acetilados.
El contenido en soforollpidos del medio esta comprendido generalmente entre 2 y 800 g/l, y preferentemente entre 100 y 400 g/l.
El contenido en compuesto acido esta comprendido entre el 0,01 % y el 6 % en peso con respecto al peso de soforollpidos, preferentemente esta comprendido entre el 0,1 y el 2 % en peso con respecto al peso de soforollpidos. De una forma aun mas preferida, el contenido en compuesto acido esta comprendido entre el 0,1 y el 1 % en peso con respecto al peso de soforollpidos.
Segun una realizacion particular, el contenido en soforollpido del medio esta comprendido entre 100 y 400 g/l y el contenido en compuesto acido esta comprendido entre el 0,1 y el 2 % en peso con respecto al peso de soforollpidos.
El compuesto acido empleado es un acido inorganico o un acido organico.
Preferentemente, el compuesto acido es un acido inorganico elegido entre acido sulfurico, acido clorhldrico, acido fosforico, acido nltrico. Preferentemente, el acido inorganico es acido sulfurico.
Segun una realizacion particular del procedimiento, se lleva a cabo ademas la etapa de separacion de la fase lipldica y de la fase acuosa de la mezcla procedente de la etapa de hidrolisis, de forma que se recupere una solucion acuosa (hidrolizado) que contiene soforosa y glucosa.
El hidrolizado as! obtenido a la salida de la etapa de hidrolisis, y despues de una separacion de la fase lipldica, se utiliza como solucion para la induccion de la expresion de los genes que codifican para las celulasas en un microrganismo tal como, por ejemplo, Trichoderma reesei.
Antes de su empleo como solucion inductora, igualmente se puede purificar dicha solucion acuosa que contiene la mezcla de soforosa y de glucosa mediante la adicion a dicha solucion de un microorganismo alcohollgeno capaz de fermentar la glucosa en etanol, y efectuando despues una fermentacion etanolica, y finalmente llevando a cabo una separacion del etanol (por ejemplo, mediante desorcion) con el fin de recuperar un hidrolizado purificado que contiene soforosa.
Description detallada de la invention
La presente invencion describe las condiciones de empleo de una hidrolisis acida moderada con objeto de producir soforosa y evitando una hidrolisis total de los soforollpidos que conducirla a la liberation de dos unidades de glucosa por molecula de soforollpido.
En las condiciones descritas a continuation, la hidrolisis permite romper preferentemente el enlace osldico entre la soforosa y la cadena lipldica, lo que conduce a la liberacion de la soforosa. No obstante, inevitablemente y en mayor o menor medida, en funcion de las condiciones operativas, la soforosa liberada tambien puede ser hidrolizada en dos unidades de glucosa.
En la practica, se proporciona en primer lugar una solucion acuosa de soforollpidos. Esta solucion acuosa presenta tlpicamente una concentration de soforollpidos comprendida entre 2 y 800 g/l, preferentemente entre 100 y 400 g/l. De forma preferente, se utilizaran soforollpidos en la forma acida mas que en la forma de lactona. La forma acida puede obtenerse bien optimizando las condiciones de fermentacion durante la production de los soforollpidos, o bien llevando a cabo una hidrolisis en condiciones basicas (saponification) del producto de la fermentacion.
A esta solucion acuosa se anade un compuesto acido de forma que se obtenga una concentracion de acido en la mezcla comprendida entre el 0,01 % y el 6 % en peso con respecto al peso de soforollpidos, y preferentemente entre el 0,1 y el 2 % en peso, y de una forma mas preferida entre el 0,1 y el 1 % en peso.
El compuesto acido es bien un acido organico, bien un acido inorganico. Preferentemente se emplea un acido inorganico que puede elegirse entre acido sulfurico, acido clorhldrico, acido fosforico, acido nltrico. Preferentemente, el acido es acido sulfurico. Si se utiliza un acido organico, puede elegirse entre acido formico, acido acetico, acido oxalico, acido trifluoroacetico y acido maleico.
La hidrolisis se lleva a cabo llevando la mezcla acida a una temperatura comprendida generalmente entre 60 °C y 110 °C durante entre 2 horas y 200 horas, preferentemente entre 5 horas y 24 horas. Al final de este tratamiento, los acidos grasos liberados por la hidrolisis fermentan una fase no miscible con el agua, que puede ser facilmente separada de la fase acuosa. La fase acuosa (denominada hidrolizado) contiene una mezcla de glucosa y de soforosa cuyas proporciones varlan en funcion de la dosis de acido utilizada y de la duration de la hidrolisis.
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El hidrolizado as! obtenido puede utilizarse para la produccion de las protelnas de interes (celulasas) por parte de los microorganismos cuyos genes codifican bajo el control de un promotor inducible por la soforosa. En particular, el microrganismo es del genero Trichoderma y preferentemente es Trichoderma reesei.
Se puede utilizar cualquier tipo de procedimiento de produccion adaptado al microorganismo conocido por el experto en la materia. En particular, el hidrolizado que contiene la soforosa se emplea en un procedimiento de tipo "alimentacion sin trasiego" o "fed-batch" segun la terminologla anglosajona, como se describe en el documento FR 2 555 603.
Con este fin, se prepara un precultivo que contiene un microorganismo y un medio de cultivo que contiene las sales minerales y los complementos vitamlnicos habituales, y una fuente de carbono y de energla, preferentemente en forma de azucares solubles (por ejemplo, lactosa). A continuacion el precultivo es transferido a un fermentador de produccion de enzimas que comprende un medio de cultivo que contiene al menos un azucar y es complementado de forma regular con una solucion inductora. En el marco de la invencion, la solucion inductora utilizada es el hidrolizado procedente de la hidrolisis de los soforollpidos. A continuacion se procede a la produccion de las enzimas en el fermentador manteniendo el contacto necesario entre el microrganismo, el medio de cultivo y aportando de forma regular (por ejemplo, de forma continua) la solucion inductora de soforosa.
Antes de su utilizacion, igualmente es posible purificar la mezcla (el hidrolizado) procedente de la etapa de hidrolisis con el fin de aislar la soforosa producida. Con este fin se anade a dicha mezcla un microorganismo capaz de fermentar la glucosa en etanol, tal como, por ejemplo, la levadura Saccharomyces cerevisiae y a continuacion se procede a una etapa de fermentacion. La mezcla final obtenida tras la fermentacion se somete a una etapa de desorcion del etanol con el fin de recuperar una solucion acuosa de soforosa. Igualmente es posible la utilizacion de la solucion acuosa de soforosa as! obtenida como solucion inductora de la expresion de los genes en los microorganismos.
Description de las figuras
La Figura 1 representa la concentration de las celulasas producidas en presencia de glucosa, de lactosa y de soforollpido, solos o en una mezcla.
La Figura 2 representa la evolution de las concentraciones de glucosa y de soforosa en funcion de la concentracion de acido sulfurico empleada para la hidrolisis moderada de los soforollpidos.
La Figura 3 compara las velocidades especlficas de produccion de celulasa por parte de Trichoderma reesei, durante una produccion con alimentacion en fed-batch con una solucion que comprende glucosa y lactosa o soforosa.
Ejemplos
Ejemplo 1 (no conforme)
Despues del cultivo de T. reesei en un frasco con 10 g/l de glucosa y hasta el agotamiento de la glucosa, se obtiene un medio que contiene 5 g/l de biomasa (celulas de T. reesei). En este medio se realizan inyecciones de soluciones concentradas de glucosa y de soforollpido en forma acida procedentes de un cultivo de Candida bombicola con el fin de obtener las cantidades deseadas de glucosa y de soforollpido indicadas en la figura 1. Igualmente se han realizado inyecciones solo de glucosa, solo de lactosa (inductor industrial clasico) y solo de soforollpido, que se corresponden con los medios de blanco.
Despues de 20 h de incubation, se analiza la cantidad de protelnas (celulasas) producidas en los diferentes medios ensayados. La cuantificacion de las protelnas se lleva a cabo segun el metodo de Lowry OH et al. (1951) [Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193, 1, 265-275] mediante un kit DC Protein Assay (Biorad).
En referencia a la figura 1, los resultados muestran que la cantidad de enzimas producida en presencia de soforollpidos siempre es menor que en presencia de lactosa, y por lo tanto que el soforollpido en bruto es peor inductor que la lactosa.
Ejemplo 2 (optimization de las condiciones de la hidrolisis acida moderada del soforollpido)
En tubos de ensayo se mezcla 1 ml de una solucion acuosa de soforollpido (procedente de un cultivo de Candida bombicola) en forma acida a aproximadamente 250 g/l y acido sulfurico concentrado, de forma que se obtenga una concentracion de acido sulfurico comprendida entre el 0,25 y el 2 % en peso de acido con respecto al peso de soforollpido.
Los tubos de ensayo se tapan con un tapon hermetico y despues se colocan en un bano seco a 100 °C durante 16 horas. Las concentraciones de los azucares (glucosa y soforosa) liberados durante la hidrolisis se miden mediante una HPLC.
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En referenda a la figura 2, se observa que cuando se aumenta el contenido en acido sulfurico, mejora la liberacion de azucares totales (para una misma duracion de la hidrolisis), pero no obstante, la mezcla contiene mayoritariamente glucosa. Por el contrario, para los menores contenidos en acido sulfurico, es decir, entre un 0,1 y un 1 % en peso de acido sulfurico con respecto al peso de soforollpido, la mezcla despues de la hidrolisis contiene menos azucares totales, pero una proporcion de soforosa mucho mas importante (41 % en peso de soforosa en la mezcla hidrolizada con un 0,25 % en peso de acido sulfurico con respecto al peso de soforollpidos).
Una experiencia identica llevada a cabo durante 5 horas con un 8 % en peso de acido sulfurico con respecto al peso de soforollpido ha conllevado la liberacion unicamente de glucosa, sin una liberacion asociada de soforosa.
Ejemplo 3 (hidrolisis moderada del soforollpido)
Se preparan 200 ml de una solucion que contiene aproximadamente 200 g/l de soforollpidos en forma acida y un 0,25 % de acido sulfurico con respecto al peso de soforollpido. Esta solucion se lleva ebullicion en un globo con agitacion y a reflujo durante 12 horas. La fraccion oleosa que contiene los llpidos resultantes de la hidrolisis se separa de la fase acuosa y los azucares (glucosa y soforosa) liberados en la fraccion acuosa se miden mediante una HPLC. Las concentraciones medidas son de 10,3 g/l de soforosa y de 16,6 g/l de glucosa, es decir, un 38 % en peso de soforosa en la mezcla de azucares liberados.
Ejemplo 4 (utilizacion del hidrolizado de soforollpido para la induccion de la production de celulasas por parte de T. reesei)
Despues del cultivo de celulas de T. reesei CL847 (Durand H. et al. (1988a) Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strains. In: FEMS Symposium n° 43: Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, pags. 135-151. Academic Press, Londres) con glucosa en frascos agitados hasta el agotamiento de la glucosa, la produccion de celulasas se lleva a cabo segun un procedimiento "fed-batch" que emplea una solucion cuya composition es la siguiente: 50 g/l de una mezcla de azucares y 15 ml/l de NH3 al 20 % en peso segun se describe en la publication "A new stoichiometric miniaturization strategy for screening of industrial microbial strains: application to cellulase hyper-producing Trichoderma reesei strains", Microbial Cell Factories 2012, 11: 70.
La mezcla de azucares utilizada contiene (100-x) % en peso de glucosa y x % en peso del azucar inductor:
• en el 1er caso (blanco), el azucar inductor es la lactosa, en una cantidad x = 8 %
• en los 2°, 3er y 4° caso, el azucar inductor es la soforosa procedente del hidrolizado obtenido en el ejemplo 3 que se ha complementado con glucosa pura para que tenga respectivamente x = 8 %, x = 0,3 % y x = 0,03 %.
El fed-batch se lleva a cabo durante 166 horas con un caudal de alimentation en solucion de 0,3 ml/h y a una temperatura de 30 °C.
Se tomaron muestras diariamente para hacer un seguimiento de la concentration de celulas y de la concentration de protelnas. La capacidad de induccion de la mezcla de azucares utilizada para el fed-batch se expresa por la velocidad especlfica de produccion de protelnas (mg de protelnas producidas por gramo de celulas productoras y por hora).
En la figura 3 se observa que la mezcla que contiene soforosa provoca una induccion aproximadamente dos veces mas fuerte que la mezcla que contiene lactosa a la misma concentracion, con unas velocidades especlficas de produccion de protelnas respectivas de 12 frente a 6,4 mg/g/h.
Ademas, en la figura 3 se remarca que la mezcla que contiene un 0,03 % de soforosa ya provoca una induccion equivalente a la mezcla que contiene un 8 % de lactosa, con unas velocidades especlficas de produccion de protelnas respectivas del orden de 6 mg/g/h.
Finalmente, en la figura 3 se observa que la mezcla que contiene un 0,3 % de soforosa provoca una induccion equivalente a la mezcla que contiene un 8 % de soforosa, con unas velocidades especlficas de produccion de protelnas respectivas de 10,5 y de 12 mg/g/h.
Claims (7)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Procedimiento de produccion de soforosa a partir de soforollpidos en el que:a) se proporciona una solucion acuosa de soforollpidos;b) se anade un compuesto acido a la solucion acuosa de soforollpidos, estando comprendido el contenido en compuesto acido entre un 0,01 % y un 6 % en peso con respecto al peso de soforollpidosc) se calienta la mezcla obtenida en la etapa b) durante entre 2 y 200 horas y a una temperatura comprendida entre 60 y 110 °C.
- 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el contenido en soforollpidos de la solucion acuosa esta comprendido entre 2 y 800 g/l.
- 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el contenido en compuesto acido esta comprendido entre el 0,1 y el 2 % en peso con respecto al peso de soforollpidos.
- 4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, en el que inorganico o un acido organico.
- 5. Procedimiento segun la reivindicacion 4 en el que el acido inorganico se clorhldrico, acido fosforico, acido nltrico.
- 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, en el que se lleva a cabo una separacion de la fase lipldica y de la fase acuosa de la mezcla procedente de la etapa c) de forma que se recupere un hidrolizado acuoso que contiene soforosa y glucosa.
- 7. Procedimiento de purification de soforosa de un hidrolizado obtenido segun el procedimiento de la reivindicacion 6 que comprende las siguientes etapas:a) se anade un microorganismo capaz de fermentar la glucosa en etanol en el hidrolizado;b) se lleva a cabo una fermentation etanolica del hidrolizado de forma que se proporcione un hidrolizado fermentado;c) se lleva a cabo una desorcion del etanol presente en el hidrolizado fermentado.el compuesto acido es un acido elige entre acido sulfurico, acido
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