[go: up one dir, main page]

CN107058445A - 一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法 - Google Patents

一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107058445A
CN107058445A CN201710319796.0A CN201710319796A CN107058445A CN 107058445 A CN107058445 A CN 107058445A CN 201710319796 A CN201710319796 A CN 201710319796A CN 107058445 A CN107058445 A CN 107058445A
Authority
CN
China
Prior art keywords
astragaloside
cycloastragenol
product
glucosidase
substrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710319796.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107058445B (zh
Inventor
袁其朋
程磊雨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing University of Chemical Technology
Original Assignee
Beijing University of Chemical Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing University of Chemical Technology filed Critical Beijing University of Chemical Technology
Priority to CN201710319796.0A priority Critical patent/CN107058445B/zh
Publication of CN107058445A publication Critical patent/CN107058445A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107058445B publication Critical patent/CN107058445B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/20—Preparation of steroids containing heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J53/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by condensation with a carbocyclic rings or by formation of an additional ring by means of a direct link between two ring carbon atoms, including carboxyclic rings fused to the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton are included in this class
    • C07J53/002—Carbocyclic rings fused
    • C07J53/004—3 membered carbocyclic rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。具体涉及一种以黄芪甲苷为底物，利用两种不同的水解酶分别水解断裂黄芪甲苷C3位置的β‑木糖苷键和C6位置的β‑葡萄糖苷键而得到黄芪甲苷的苷元环黄芪醇，后经萃取、硅胶柱层析以及乙醇重结晶纯化得到纯度95％以上的环黄芪醇产品。本发明解决了化学法制备环黄芪醇过程中黄芪甲苷的三元环结构的破坏而导致的大量副产物的产生的问题以及克服了传统环黄芪醇制备方法中底物转化率低、步骤繁琐、污染环境等不足。而本发明的优点在于底物特异性高，底物黄芪甲苷全部转化，步骤简单，条件温和，成本低，是温和的生物制备方法，对环境无污染，适合工业化生产。

Description

一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
技术领域
本发明属于医药化工领域，具体涉及一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。
背景技术
黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分，具有提高免疫力、清除自由基、降压、保肝利尿以及抗菌等多种功效。而环黄芪醇为黄芪皂苷的苷元，研究显示其具有抗氧化、能提高免疫力以及抵抗衰老等活性作用，且相比黄芪皂苷更易于肠道吸收以及膜渗透。另有研究显示，黄芪皂苷在体内发挥药物效果主要是通过被部分分解成环黄芪醇而起到作用。最重要的是环黄芪醇是目前世界上唯一已被证明的可以激活端粒酶活性的活性分子，能够有效抑制端粒的减少。
环黄芪醇(CA)：C30H50O5、490.71、环黄芪醇黄芪皂苷的苷元，主要由黄芪甲苷水解得到，为无色针状结晶，易溶于甲醇、正丁醇等。环黄芪醇的化学结构式如下：
对于环黄芪醇的发现在1983年就有报道，它是大部分黄芪皂苷的苷元。目前主要通过化学法水解断裂黄芪甲苷(ASI)C3位置的木糖苷键和C6位置的葡萄糖苷键来得到环黄芪醇，但是由于黄芪甲苷上有一个三元环结构，这种结构不稳定，化学法水解过程中容易开环，形成副产物黄芪醇。
中国已公开的专利申请中(中国专利申请公开号：CN 104817610A)使用硫酸酸解黄芪甲苷制备环黄芪醇，其水解温度为130℃，反应器采用一种高压反应釜。硫酸酸解反应条件剧烈，会导致黄芪甲苷的三元环严重破坏，产生大量的副产物。中国已公开的专利申请中(中国专利申请公开号：CN 103880910A)采用一种氧化还原的方法制备环黄芪醇，理论上解决了三元环开环的问题，但是其操作步骤繁琐，而且强氧化剂和强还原剂的使用增加了对环境的污染以及生产成本，不易工业化生产。
另外中国已公开的两篇专利申请中(中国专利申请公开号：CN 105734109A、CN105566434A)均使用了多种水解酶复合的形式水解黄芪甲苷制备环黄芪醇，其中专利CN105734109A中的复合酶为β-葡萄糖苷酶、蜗牛酶、柚苷酶、纤维素酶等酶按不同质量比的形式混合得来，而专利CN 105566434A中的复合酶为β-葡萄糖苷酶、柚苷酶、β-木糖苷酶的组合。相较于本发明来说，复合酶的缺点无形中提高了酶成本，而且复合酶对底物黄芪甲苷的专一性差，黄芪甲苷的转化率较低。
发明内容
本发明选择采用一种两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇，采用这种温和的生物酶法制备环黄芪醇的目的在于：一、解决传统化学法制备过程中三元环易开裂形成副产物黄芪醇的问题。二、克服化学法制备环黄芪醇中操作步骤繁琐、生产成本高、污染环境、转化率低等缺点。三、较之一些使用复合酶酶解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，本发明提供了专一性非常高的水解酶，降低了生产成本，且本发明中的黄芪甲苷可以完全转化为环黄芪醇。本发明是根据现有技术的不足作出了创新和改进，提供一种高效的易工业化生产的生物酶法制备环黄芪醇的方法。
为实现上述发明目的，所采用的技术方案是：
A.酶解缓冲液的配制
准确配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L的柠檬酸溶液，将两种溶液按照1.06:1的体积比混合，并用盐酸调节混合溶液的pH至5.0。
B.第一步酶解
向步骤A中配制好的酶解缓冲体系中加入底物黄芪甲苷，底物中黄芪甲苷的质量百分比为10％，体系中黄芪甲苷的质量浓度为0.1g/L～1g/L。待底物完全溶解后加入水解酶1，水解酶1和黄芪甲苷的质量比为5:1。调节反应体系的pH为4.6～5.2，最后将反应体系置于温度45～55℃和搅拌转速为200r/min的条件下充分反应48～72h；
C.第二步酶解
用盐酸调节步骤B中反应结束后的体系pH至7.0～7.6，再向该体系中加入水解酶2，水解酶2和黄芪甲苷的质量比为50:1，最后将反应体系置于温度为25～35℃和搅拌转速为200r/min的条件下充分反应48～72h。
D.环黄芪醇的分离纯化
将步骤C中含有产物环黄芪醇的水解液经水饱和正丁醇萃取后真空浓缩蒸干得到萃取产品，并进一步利用硅胶柱层析分离纯化，最终再通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到环黄芪醇产品。
上述步骤B中所用的水解酶1为纤维素酶，水解断裂的是黄芪甲苷C3位置的木糖糖苷键，得到酶解产物是6-O-葡萄糖-环黄芪醇。
上述步骤C中水解酶2为β-葡萄糖苷酶，水解断裂的是中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇上C6位置的葡萄糖苷键。β-葡萄糖苷酶的底物为步骤B中的产物，步骤C的产物为环黄芪醇。
上述步骤C中的β-葡萄糖苷酶的基因来源于Microbacteriumhomini，其基因长度为1878bp。编码626个蛋白。其具体基因序列为SEQ ID No.1，编码的蛋白质序列为SEQ IDNo.2。
上述步骤C中使用的β-葡萄糖苷酶是自制得来，具体是通过将β-葡萄糖苷酶基因导入大肠杆菌后诱导表达，再将菌体经超声破碎后而得到的粗酶液。每100mL的发酵菌液破碎后制得20mLβ-葡萄糖苷酶粗酶液。
上述步骤D中的酶解液和萃取剂的体积比为1:0.5，萃取次数为三遍。
上述步骤D中的硅胶柱层析填料为100～200目硅胶粉。
上述步骤D中硅胶柱层析的洗脱剂为甲醇-氯仿-水的下层溶液，体积比为13:4:2。
本发明的特点是利用一种两步酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇。与现有技术相比，本发明显著的有益效果是：
与传统的化学法制备环黄芪醇相比，酶解法解决了传统化学法制备过程中黄芪甲苷三元环易开裂形成副产物黄芪醇的问题，本发明的酶解过程中没有副产物黄芪醇产生。
本发明中的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶对黄芪甲苷的专一性更好，且两步酶解法能将黄芪甲苷完全转化为环黄芪醇，转化效率大幅提高。
与传统技术相比，两步酶解转化法是一种温和的生物制备方法，制备条件温和，无需高温高压，大大降低了能耗；
酶法制备无需强氧化剂、还原剂以及强酸等污染环境的试剂，是一种环境保护性的环黄芪醇制备方法。
酶法操作步骤简洁，其中的β-葡萄糖苷酶可以自制，生产成本大大降低，且最终环黄芪醇产品的纯度高，适合工业化生产。
附图说明
图1为纤维素酶转化黄芪甲苷路径图。
图2为β-葡萄糖苷酶转化6-O-葡萄糖-环黄芪醇路径图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但这些实施例的目的并不在于限制本发明的保护范围。
实施例1
准确配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L的柠檬酸溶液，将两种溶液按照1.06:1的体积比混合，并用盐酸调节缓冲盐溶液的pH至5.0。
第一步酶解：准确量取100mL的酶解缓冲盐溶液置于250mL的烧杯中，并向其中加入100mg质量百分比为10％的黄芪甲苷，待底物黄芪甲苷完全溶解后将体系加热至45℃，后向体系中加入0.05g已经加热至45℃的纤维素酶，并用盐酸将体系的pH调节至4.6，最后将反应体系置于磁力加热搅拌仪器上，在搅拌转速为200r/min，温度为45℃下充分反应60h。后取样1mL过0.22μm滤膜，于高效液相色谱检测，结果显示底物黄芪甲苷完全转化为中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇。
第二步酶解：在第一步酶解结束之后，用盐酸调节第一步反应的pH至7.0，并将体系温度降至25℃，再向此体系中加入0.5g已加热至25℃的β-葡萄糖苷酶粗酶液，粗酶液的获得具体是通过将β-葡萄糖苷酶基因导入大肠杆菌后诱导表达，再将菌体经超声破碎后而得到的粗酶液。每100mL的发酵菌液破碎后制得20mLβ-葡萄糖苷酶粗酶液。最后将反应体系置于磁力加热搅拌仪器上，在搅拌转速为200r/min，温度为25℃下充分反应60h。后取样1mL过0.22μm滤膜，于高效液相色谱检测，结果显示中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇完全转化为终产物环黄芪醇。并收集得到92mL的酶水解液。
向两步酶解反应结束后的92mL含有产物环黄芪醇的水解液中加入50mL水饱和正丁醇萃取,一共萃取三次，合并三次的正丁醇相并真空浓缩蒸干得到萃取产品79.68mg，后用10mL的甲醇将萃取产品完全溶解，取1mL溶液过0.22μm有机滤膜，于高效液相色谱-蒸发光检测下测定，经计算萃取产品的纯度为7.05％。
采用上述方法制取纯度为7.05％的粗产品1g并于硅胶柱层析分离纯化，硅胶柱填料为100～200目的硅胶粉，采用干法上样，洗脱剂为甲醇-氯仿-水的下层溶液，其比例为13:4:2。收集其中含有产品的馏分并合并，后于液相检测浓度。最后将所有的馏分收集旋干并称量干重，经计算得到79.43mg纯度为84.36％硅胶层析产品。最后将硅胶柱层析产品通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到环黄芪醇产品。
实施例2
准确配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L的柠檬酸溶液，将两种溶液按照1.06:1的体积比混合，并用盐酸调节缓冲盐溶液的pH至5.0。
第一步酶解：准确量取100mL的酶解缓冲盐溶液置于250mL的烧杯中，并向其中加入100mg质量百分比为10％的黄芪甲苷，待底物黄芪甲苷完全溶解后将体系加热至50℃，后向体系中加入0.05g已经加热至50℃的纤维素酶，并用盐酸将体系的pH调节至5.0，最后将反应体系置于磁力加热搅拌仪器上，在搅拌转速为200r/min，温度为50℃下充分反应48h。后取样1mL过0.22μm滤膜，于高效液相色谱检测，结果显示底物黄芪甲苷完全转化为中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇。
第二步酶解：在第一步酶解结束之后，用盐酸调节第一步反应的pH至7.4，并将体系温度降至30℃，再向此体系中加入0.5g已加热至30℃的β-葡萄糖苷酶粗酶液，粗酶液的获得具体是通过将β-葡萄糖苷酶基因导入大肠杆菌后诱导表达，再将菌体经超声破碎后而得到的粗酶液。每100mL的发酵菌液破碎后制得20mLβ-葡萄糖苷酶粗酶液。最后将反应体系置于磁力加热搅拌仪器上，在搅拌转速为200r/min，温度为30℃下充分反应48h。后取样1mL过0.22μm滤膜，于高效液相色谱检测，结果显示中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇完全转化为终产物环黄芪醇。并收集得到94mL的酶水解液。
向两步酶解反应结束后的94mL含有产物环黄芪醇的水解液中加入50mL水饱和正丁醇萃取,一共萃取三次，合并三次的正丁醇相并真空浓缩蒸干得到萃取产品75.35mg，后用10mL的甲醇将萃取产品完全溶解，取1mL溶液过0.22μm有机滤膜，于高效液相色谱-蒸发光检测下测定，经计算萃取产品的纯度为7.35％。
采用上述方法制取纯度为7.35％的粗产品1g并于硅胶柱层析分离纯化，硅胶柱填料为100～200目的硅胶粉，采用干法上样，洗脱剂为甲醇-氯仿-水的下层溶液，其比例为13:4:2。收集其中含有产品的馏分并合并，后于液相检测浓度。最后将所有的馏分收集旋干并称量干重，经计算得到81.98mg纯度为85.17％硅胶层析产品。最后将硅胶柱层析产品通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到环黄芪醇产品。
实施例3
准确配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L的柠檬酸溶液，将两种溶液按照1.06:1的体积比混合，并用盐酸调节缓冲盐溶液的pH至5.0。
第一步酶解：准确量取100mL的酶解缓冲盐溶液置于250mL的烧杯中，并向其中加入100mg质量百分比为10％的黄芪甲苷，待底物黄芪甲苷完全溶解后将体系加热至55℃，后向体系中加入0.05g已经加热至55℃的纤维素酶，并用盐酸将体系的pH调节至5.5，最后将反应体系置于磁力加热搅拌仪器上，在搅拌转速为200r/min，温度为55℃下充分反应72h。后取样1mL过0.22μm滤膜，于高效液相色谱检测，结果显示底物黄芪甲苷完全转化为中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇。
第二步酶解：在第一步酶解结束之后，用盐酸调节第一步反应的pH至7.6，并将体系温度降至35℃，再向此体系中加入0.5g已加热至35℃的β-葡萄糖苷酶粗酶液，粗酶液的获得具体是通过将β-葡萄糖苷酶基因导入大肠杆菌后诱导表达，再将菌体经超声破碎后而得到的粗酶液。每100mL的发酵菌液破碎后制得20mLβ-葡萄糖苷酶粗酶液。最后将反应体系置于磁力加热搅拌仪器上，在搅拌转速为200r/min，温度为35℃下充分反应72h。后取样1mL过0.22μm滤膜，于高效液相色谱检测，结果显示中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇完全转化为终产物环黄芪醇。并收集得到93mL的酶水解液。
向两步酶解反应结束后的93mL含有产物环黄芪醇的水解液中加入50mL水饱和正丁醇萃取,一共萃取三次，合并三次的正丁醇相并真空浓缩蒸干得到萃取产品78.38mg，后用10mL的甲醇将萃取产品完全溶解，取1mL溶液过0.22μm有机滤膜，于高效液相色谱-蒸发光检测下测定，经计算萃取产品的纯度为6.55％。
采用上述方法制取纯度为6.55％的粗产品1g并于硅胶柱层析分离纯化，硅胶柱填料为100～200目的硅胶粉，采用干法上样，洗脱剂为甲醇-氯仿-水的下层溶液，其比例为13:4:2。收集其中含有产品的馏分并合并，后于液相检测浓度。最后将所有的馏分收集旋干并称量干重，经计算得到79.44mg纯度为82.46％硅胶层析产品。最后将硅胶柱层析产品通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到环黄芪醇产品。
实施例4
准确配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L的柠檬酸溶液，将两种溶液按照1.06:1的体积比混合，并用盐酸调节缓冲盐溶液的pH至5.0。
第一步酶解：准确量取100mL的酶解缓冲盐溶液置于250mL的烧杯中，并向其中加入1000mg质量百分比为10％的黄芪甲苷，待底物黄芪甲苷完全溶解后将体系加热至50℃，后向体系中加入0.5g已经加热至50℃的纤维素酶，并用盐酸将体系的pH调节至5.0，最后将反应体系置于磁力加热搅拌仪器上，在搅拌转速为200r/min，温度为50℃下充分反应48h。后取样1mL过0.22μm滤膜，于高效液相色谱检测，结果显示底物黄芪甲苷完全转化为中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇。
第二步酶解：在第一步酶解结束之后，用盐酸调节第一步反应的pH至7.4，并将体系温度降至30℃，再向此体系中加入5g已加热至30℃的β-葡萄糖苷酶粗酶液，粗酶液的获得具体是通过将β-葡萄糖苷酶基因导入大肠杆菌后诱导表达，再将菌体经超声破碎后而得到的粗酶液。每100mL的发酵菌液破碎后制得20mLβ-葡萄糖苷酶粗酶液。最后将反应体系置于磁力加热搅拌仪器上，在搅拌转速为200r/min，温度为30℃下充分反应48h。后取样1mL过0.22μm滤膜，于高效液相色谱检测，结果显示中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇完全转化为终产物环黄芪醇。并收集得到990mL的酶水解液。
向两步酶解反应结束后的990mL含有产物环黄芪醇的水解液中加入50mL水饱和正丁醇萃取,一共萃取三次，合并三次的正丁醇相并真空浓缩蒸干得到萃取产品770.28mg，取100mg萃取产品用10mL的甲醇完全溶解，取1mL溶液过0.22μm有机滤膜，于高效液相色谱-蒸发光检测下测定，经计算萃取产品的纯度为7.26％。
采用上述方法制取纯度为7.26％的粗产品10g并于硅胶柱层析分离纯化，硅胶柱填料为100～200目的硅胶粉，采用干法上样，洗脱剂为甲醇-氯仿-水的下层溶液，其比例为13:4:2。收集其中含有产品的馏分并合并，后于液相检测浓度。最后将所有的馏分收集旋干并称量干重，经计算得到891.23mg纯度为81.46％硅胶层析产品。最后将硅胶柱层析产品通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到环黄芪醇产品。
SEQ ID No. 1：ATGCAGCCGGAGCGTCAGACTTCCCCGGAAGGTGTAGCTTACCGTGACCTGAACGGTAACGGTCGTATGGACCCGTACGAGGACCCGCGTCTGCCTGTAGAGGAACGTGTAGAAGACCTGCTGGGTCGTCTGTCTCTGGAGGAGAAGGCAGGTCTGATGTTCCACACCGTGATCGAGGCTGGCACCGACGGTACGGTACTGGAGCACCCAGGTGCAATCAGCAAGTCCCCTACCAGCGAGGTCGTCCTGTCTAAGCACCTGACCCACTTCAACGTGCATGCCCTGGACGACGCTCGTATGGCTGCACGCTGGCATAACGCACTGCAAGCACTGGCTGAGCAGACTCCGCATGGTATCCCGGTAACCGTCTCCACTGATCCACGTCACGCTTTCATCGAGAACGCGGGTGTGAGCTTCACCGCGAAAGCATTCTCCCAGTGGCCGGAACCACTGGGTCTGGCAGCACTGCGTGACGCAGAGGCAGTCCGTGCATTCGGTGACATCGCACGTAAAGAATACCGTGCGGTCGGTATCCGTGCGGCTCTGCACCCAACTCTGGACCTGGCAACTGAACCACGTTGGGCACGTCAGGCTGGTACGTTCGGTCAAGACCCTGACCTGGTGACGGAACTGGGTGTCGCTTACCTGAAAGGCTTCCAGGGCGAAGCGCTGGGTCCGGATAGCGTAGCATGTACCAGCAAACACTTCCCAGGCGGTGGTCCGCAGAAAGACGGTGAAGACGCTCACTTCCCGTATGGCCGTGAACAGGTGTACCCGGGTGACCGTTTCGGTGATCATCTGAAACCGTTCCCGCCGATTATCGAAGCCGGCACCGCCGCTATCATGCCGTACTATGGCATGCCTGTTGGTCTGGTGCTGGGCGGCGAACCGATCGAAGAAGTGGGCTTCGGCTACAACCGCCAGATTGTGACCGGCCTGCTGCGCGAACAGCTGGGTTACGACGGTGTTGTCGTGACCGACTGGGAACTGGTGAATGACAATCACGTGGGCGACCAGGTTCTGCCAGCCCGTGCATGGGGTGTTGAACACCTGGACCCGCACGGCCGTATGGAACTGATCCTGCACGCCGGTGCTGATCAGTTTGGTGGTGAAGAATGCGTGGAAATTCTGCTGGAGCTGGTGAAAGAAGGCCGTGTGACCGAAGAACGTATTGACGAAAGCGCGCGCCGTCTGCTGGCCGTTAAATTCCGTCTGGGCCTGTTCGACGATCCGTACGTTGATGAAGATCTGGCCGCTACCACCGTGGGTCGTGAAGATTTCCGCGAAGCGGGCTATGCGGCCCAGGCCCGCTCCGTAACCGTTCTGCAAGATGGCTCTGGTGATCTGGCGCCTGTTCTGCCGCTGGCCCGCGGCCGTAAAGTTTATGCGGAAAACGTTTCCGATGAAGCTCTGGCGGCGGTTGGCACGCGTGTAGCGACTCCGGAAGAAGCGGATGTTGCGCTGGTTCGCCTGATGGCTCCGTTCGAACCGCGCAGCGACCTGTTCCTGGAATCCTGGTTTCATCAGGGCTCTCTGGATTTTCCGCCTGGCCTGGTTGCGCGCCTGGCTCGTGTTGCCGCTCACTGCCCGCTGGTTGTTGATGTTGTTCTGGATCGCCCGGCTGTTCTGACCCCGCTGCTGACTTTTGCTTCTGCGGTAGTTGGCTCTTATGGCACCTCTGATGCGGCGCTGCTGGATGCGCTGACTGGCACTATTCCGCCGGTAGGCCGCCTGCCGTTTGATCTGCCGCGCTCTATGGAAGATGTACGCCGCAAAGGTGAAGATGTTCCGGGCTTTGCGGACCCGCTGTTTCCGTTTGGTCATGGCCTGGCGCTGCGTGATCCGTCT。
SEQ ID No. 2：MQPERQTSPEGVAYRDLNGNGRMDPYEDPRLPVEERVEDLLGRLSLEEKAGLMFHTVIEAGTDGTVLEHPGAISKSPTSEVVLSKHLTHFNVHALDDARMAARWHNALQALAEQTPHGIPVTVSTDPRHAFIENAGVSFTAKAFSQWPEPLGLAALRDAEAVRAFGDIARKEYRAVGIRAALHPTLDLATEPRWARQAGTFGQDPDLVTELGVAYLKGFQGEALGPDSVACTSKHFPGGGPQKDGEDAHFPYGREQVYPGDRFGDHLKPFPPIIEAGTAAIMPYYGMPVGLVLGGEPIEEVGFGYNRQIVTGLLREQLGYDGVVVTDWELVNDNHVGDQVLPARAWGVEHLDPHGRMELILHAGADQFGGEECVEILLELVKEGRVTEERIDESARRLLAVKFRLGLFDDPYVDEDLAATTVGREDFREAGYAAQARSVTVLQDGSGDLAPVLPLARGRKVYAENVSDEALAAVGTRVATPEEADVALVRLMAPFEPRSDLFLESWFHQGSLDFPPGLVARLARVAAHCPLVVDVVLDRPAVLTPLLTFASAVVGSYGTSDAALLDALTGTIPPVGRLPFDLPRSMEDVRRKGEDVPGFADPLFPFGHGLALRDPS。

Claims (6)

1.一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
A.酶解缓冲液的配制
准确配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1mol/L的柠檬酸溶液，将两种溶液按照1.06:1的体积比混合，并用盐酸调节混合溶液的pH至5.0；
B.第一步酶解
向步骤A中配制好的酶解缓冲体系中加入底物黄芪甲苷，底物中黄芪甲苷的质量百分比为10％，体系中黄芪甲苷的质量浓度为0.1g/L～1g/L；待底物完全溶解后加入水解酶1，水解酶1和黄芪甲苷的质量比为5:1；调节反应体系的pH为4.6～5.2，最后将反应体系置于温度45～55℃和搅拌转速为200r/min的条件下充分反应48～72h；
C.第二步酶解
用盐酸调节步骤B中反应结束后的体系pH至7.0～7.6，再向该体系中加入水解酶2，水解酶2和黄芪甲苷的质量比为50:1，最后将反应体系置于温度为25～35℃和搅拌转速为200r/min的条件下充分反应48～72h；
D.环黄芪醇的分离纯化
将步骤C中含有产物环黄芪醇的水解液经水饱和正丁醇萃取后真空浓缩蒸干得到萃取产品，并进一步利用硅胶柱层析分离纯化，最终再通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95％以上，得到环黄芪醇产品；
步骤B中所用的水解酶1为纤维素酶，水解断裂的是黄芪甲苷C3位置的β-木糖糖苷键；
步骤B中得到酶解产物是6-O-葡萄糖-环黄芪醇；
步骤C中水解酶2为β-葡萄糖苷酶，水解断裂的是中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇上C6位置的β-葡萄糖苷键；
步骤C中β-葡萄糖苷酶的底物为6-O-葡萄糖-环黄芪醇，步骤C中得到的产物为环黄芪醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：β-葡萄糖苷酶的基因来源于Phycicoccussp.Soil748，其基因长度为1848bp，编码616个蛋白；其具体基因序列为SEQ ID No.1，编码的蛋白质序列为SEQ ID No.2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C中的β-葡萄糖苷酶通过将β-葡萄糖苷酶基因导入大肠杆菌后诱导表达，再将菌体经超声破碎后而得到的粗酶液，每100mL的发酵菌液破碎后制得20mLβ-葡萄糖苷酶粗酶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D中的酶解液和萃取剂的体积比为1:0.5，萃取次数为三遍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D中的硅胶柱层析填料为100～200目硅胶粉。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D中硅胶柱层析的洗脱剂为甲醇-氯仿-水的下层溶液，体积比为13:4:2。
CN201710319796.0A 2017-05-09 2017-05-09 一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法 Active CN107058445B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710319796.0A CN107058445B (zh) 2017-05-09 2017-05-09 一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710319796.0A CN107058445B (zh) 2017-05-09 2017-05-09 一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107058445A true CN107058445A (zh) 2017-08-18
CN107058445B CN107058445B (zh) 2020-11-20

Family

ID=59597150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710319796.0A Active CN107058445B (zh) 2017-05-09 2017-05-09 一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107058445B (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109609581A (zh) * 2018-12-28 2019-04-12 北京化工大学 一种微生物混合发酵转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
CN110974743A (zh) * 2019-12-10 2020-04-10 武汉克鲁金生物科技有限公司 生产酵母环黄芪醇多肽混合液的方法及其抗衰老应用
CN111377998A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型c及其制备方法
CN111377999A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型b及其制备方法
CN111378004A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型d及其制备方法
CN111378002A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇新晶型a及其制备方法
CN111378001A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型e及其制备方法
CN111378000A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型f及其制备方法
CN111893158A (zh) * 2020-08-14 2020-11-06 威海百合生物技术股份有限公司 一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
CN112080532A (zh) * 2020-09-27 2020-12-15 铜陵利夫生物科技有限公司 一种双酶法生产d-对羟基苯甘氨酸的方法
CN113999887A (zh) * 2021-11-23 2022-02-01 泰州丹鼎生物科技有限公司 一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
CN114369636A (zh) * 2021-12-27 2022-04-19 泰州丹鼎生物科技有限公司 一种环黄芪醇的生物催化制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101225424A (zh) * 2007-09-13 2008-07-23 天津药物研究院 环黄芪醇的单葡萄糖苷、其制备方法、药物组合物和应用
CN105566434A (zh) * 2015-12-15 2016-05-11 安徽诚亚生物科技有限公司 一种高效制备环黄芪醇的方法
CN105734109A (zh) * 2016-02-02 2016-07-06 成都锦泰和医药化学技术有限公司 一种高纯度环黄芪醇生产精制的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101225424A (zh) * 2007-09-13 2008-07-23 天津药物研究院 环黄芪醇的单葡萄糖苷、其制备方法、药物组合物和应用
CN105566434A (zh) * 2015-12-15 2016-05-11 安徽诚亚生物科技有限公司 一种高效制备环黄芪醇的方法
CN105734109A (zh) * 2016-02-02 2016-07-06 成都锦泰和医药化学技术有限公司 一种高纯度环黄芪醇生产精制的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGUIRRE,A.: "beta-glycosidase [synthetic construct]", 《GENBANK》 *
FENG LM等: "Smith degradation, an efficient method for the preparation of cycloastragenol from astragaloside IV", 《FITOTERAPIA》 *
夏广苹: "β-葡萄糖苷酶水解黄芪甲苷的研究", 《中草药》 *
王丽媛: "黄芪甲苷和环黄芪醇生产工艺的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109609581A (zh) * 2018-12-28 2019-04-12 北京化工大学 一种微生物混合发酵转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
CN111378001A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型e及其制备方法
CN111377998A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型c及其制备方法
CN111377999A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型b及其制备方法
CN111378004A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型d及其制备方法
CN111378002A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇新晶型a及其制备方法
CN111378000A (zh) * 2018-12-30 2020-07-07 山东新时代药业有限公司 一种环黄芪醇晶型f及其制备方法
CN110974743A (zh) * 2019-12-10 2020-04-10 武汉克鲁金生物科技有限公司 生产酵母环黄芪醇多肽混合液的方法及其抗衰老应用
CN110974743B (zh) * 2019-12-10 2022-03-29 武汉克鲁金生物科技有限公司 生产酵母环黄芪醇多肽混合液的方法及其抗衰老应用
CN111893158A (zh) * 2020-08-14 2020-11-06 威海百合生物技术股份有限公司 一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
CN112080532A (zh) * 2020-09-27 2020-12-15 铜陵利夫生物科技有限公司 一种双酶法生产d-对羟基苯甘氨酸的方法
CN113999887A (zh) * 2021-11-23 2022-02-01 泰州丹鼎生物科技有限公司 一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
CN113999887B (zh) * 2021-11-23 2023-12-12 泰州丹鼎生物科技有限公司 一种酶法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
CN114369636A (zh) * 2021-12-27 2022-04-19 泰州丹鼎生物科技有限公司 一种环黄芪醇的生物催化制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107058445B (zh) 2020-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107058445A (zh) 一种利用两步酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
CN105671088B (zh) 一种表面活性剂改进的木质纤维素的连续糖化共发酵法
CN101603067A (zh) 一种定向生物合成gamg的方法
CN104630186A (zh) 一种用于诱导生产纤维素酶的糖混合液的制备方法及应用
CN1966665A (zh) 一种利用玉米皮制备的水解液及其制备方法和应用
CN103613682A (zh) 一种制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法
CN106636290A (zh) 一种发酵生产单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法和应用
WO2024113998A1 (zh) 一种酶法制备超低分子量石斛寡聚糖的方法及其应用
CN106978407A (zh) 一种β‑葡萄糖醛酸苷酶及其基因与应用
CN106755214B (zh) 一种双相酶水解获取宝藿苷i的方法
CN105838608A (zh) 一种利用氨水和双氧水对秸秆进行分段预处理的方法
CN105566434B (zh) 一种高效制备环黄芪醇的方法
CN111893158B (zh) 一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
BR112013000791B1 (pt) processo de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas melhorado
CN101519652B (zh) 海藻糖合成酶及其编码基因与它们的应用
CN106755190A (zh) 基于重组κ‑卡拉胶酶制备卡拉胶寡糖的方法
CN112575050A (zh) 一种生物法转化制备薯蓣皂素的方法
DK2912049T3 (en) PROCEDURE FOR PREPARING SOPHOROSIS FROM SOPHOROLIPIDS
CN102154411B (zh) 一种寡糖Globotriose的制备方法
CN109609581A (zh) 一种微生物混合发酵转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
CN116445519A (zh) 一种糖基转移酶及其在生物合成丁香脂素葡萄糖苷中的应用
CN107034261B (zh) 炭黑曲霉转化黄芪甲苷制备6-o-葡萄糖-环黄芪醇的方法
CN103789283B (zh) 一种中性阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43及其基因和应用
CN101481725A (zh) 酶促水解人参皂苷Rb1制备人参皂苷F2的方法
CN1724685A (zh) 生物酶阶梯催化提取薯蓣皂苷元的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant