ES2580135T3

ES2580135T3 - Métodos de tratamiento de carcinoma hepatocelular

Info

Publication number: ES2580135T3
Application number: ES11760333.2T
Authority: ES
Inventors: Winnie Yeo; Nathalie Wong
Original assignee: Abraxis Bioscience LLC
Current assignee: Abraxis Bioscience LLC
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2016-08-19
Anticipated expiration: 2031-03-25
Also published as: JP2013523656A; JP2015134825A; PT2552438T; MX359413B; AU2011230512B2; US20140079787A1; US20130115296A1; US9370494B2; CN103052385A; DK2552438T3; LT2552438T; TWI495467B; EP2552438A4; MX2012010936A; EP2898884B1; KR20130062922A; EP2552438A1; CN103052385B; PL2552438T3; CA3051495A1

Abstract

Una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina para uso en un método de tratamiento de carcinoma hepatocelular (CHC) en un individuo necesitado de ello, en la que el método comprende además administrar al menos otro agente, en la que dicho otro agente inhibe el desensamblaje de microtúbulos.

Description

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peritoneo vascular), tumor N1 (metástasis de nódulo linfático regional) o tumor M1 (metástasis distal). En algunas realizaciones el CHC es, según los criterios de estadificación de la AJCC (American Joint Commission on Cancer), CHC de etapa T1, T2, T3 o T4. En algunas realizaciones, el CHC es uno cualquiera de carcinomas de células hepáticas, variantes fibrolamelares de CHC y colangiocarcinomas hepatocelulares mixtos.

Por tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones se trata el CHC localizado resecable en un individuo (p.ej. ser humano) mediante la administración al individuo de una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana) en combinación con al menos otro agente inhibidor del ensamblaje de microtúbulos. En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina. En algunas realizaciones, la composición comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana). En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el paclitaxel en las nanopartículas está recubierto con la albúmina.

En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm). En algunas realizaciones, la composición comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), en la que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm).

En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina y el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm). En algunas realizaciones, la composición comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), en la que el paclitaxel en las nanopartículas está recubierto con la albúmina y en la que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm). En algunas realizaciones, la composición comprende Nab-paclitaxel.

En algunas realizaciones, se trata el CHC localizado no resecable en un individuo (p.ej. ser humano) mediante la administración al individuo de una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana) en combinación con al menos otro agente inhibidor del ensamblaje de microtúbulos. En algunas realizaciones, (p.ej. ser humano), en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina. En algunas realizaciones, la composición comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana). En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el paclitaxel en las nanopartículas está recubierto con la albúmina.

En algunas realizaciones, se trata el CHC no resecable en un individuo (p.ej. ser humano) mediante la administración al individuo de una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana) en combinación con al menos otro agente inhibidor del ensamblaje de microtúbulos. En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina. En algunas realizaciones, la composición comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana). En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el paclitaxel en las nanopartículas está recubierto con la albúmina.

En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm). En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm).

Según la invención, puede tratarse un individuo (p.ej., ser humano) que se ha diagnosticado con o es sospechoso de tener CHC. En algunas realizaciones, el individuo es de al menos aproximadamente cualquiera de 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 u 85 años de edad. En algunas realizaciones, el individuo es de orígenes asiáticos. En algunas realizaciones, el individuo es un hombre. En algunas realizaciones, el individuo es una mujer. En algunas realizaciones, el individuo tiene CHC de etapa temprana, CHC no metastásico, CHC primario, CHC avanzado, CHC localmente avanzado, CHC metastásico, CHC en remisión o CHC recurrente. En algunas realizaciones, el individuo tiene CHC de etapa T1, T2, T3 o T4 según los criterios de estadificación de la AJCC (American Joint Commission on Cancer). En algunas realizaciones, el individuo es positivo de HBsAg. En algunas realizaciones, el individuo es negativo de HBsAg. En algunas realizaciones, el individuo tiene cirrosis hepática subyacente. En algunas realizaciones, el individuo no tiene cirrosis hepática subyacente. En algunas realizaciones, el individuo tiene una única lesión en la presentación. En algunas realizaciones, el individuo tiene múltiples lesiones en la presentación. En algunas realizaciones, el individuo es resistente al tratamiento de CHC con otros agentes (tales como una formulación sin nanopartículas de un taxano, p.ej. Taxol® o Taxotere®). En algunas realizaciones, el individuo es inicialmente sensible al tratamiento de CHC con otros agentes (tales como una formulación sin nanopartículas de un taxano, p.ej. Taxol® o Taxotere®) pero ha progresado después del tratamiento.

Por tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones se trata CHC en un individuo (p.ej. un ser humano), en el que el individuo es positivo de HBsAg, mediante la administración al individuo de una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana) en combinación con al menos otro agente inhibidor del ensamblaje de microtúbulos. En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina. En algunas realizaciones, la composición comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana). En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el paclitaxel en las nanopartículas está recubierto con la albúmina.

En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm). En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el tamaño medio de partícula en la composición no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm).

En algunas realizaciones se trata CHC en un individuo (p.ej. un ser humano), en el que el individuo es negativo de HBsAg, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de una composición mediante nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana) en combinación con al menos otro agente inhibidor del ensamblaje de microtúbulos. En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina. En algunas realizaciones, la composición comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana). En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el paclitaxel en las nanopartículas está recubierto con la albúmina.

En algunas realizaciones se trata CHC en un individuo (p.ej. un ser humano), en el que el individuo es resistente al tratamiento con otros agentes (tales como una formulación sin nanopartículas de taxano, por ejemplo Taxol® o Taxotere®) mediante la administración al individuo de una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana) en combinación con al menos otro agente inhibidor del ensamblaje de microtúbulos. En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina. En algunas realizaciones, la composición comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana). En algunas realizaciones, en la composición que comprende nanopartículas que comprenden paclitaxel y una albúmina (tal como seroalbúmina humana), el paclitaxel en las nanopartículas está recubierto con la albúmina.

En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano que exhibe uno o más síntomas asociados a CHC. En algunas realizaciones, el individuo está en una etapa temprana de CHC. En algunas realizaciones, el individuo está en una etapa avanzada de CHC. En algunas realizaciones, el individuo está predispuesto genéticamente o de otro modo (p.ej. tiene un factor de riesgo) a desarrollar CHC. Estos factores de riesgo incluyen, pero sin limitación, edad, sexo, raza, dieta, historial de enfermedad anterior, presencia de enfermedad precursora (p.ej. infección vírica por hepatitis B o hepatitis C, cirrosis hepática), consideraciones genéticas (p.ej. hereditarias) y exposición ambiental. En algunas realizaciones, los individuos con riesgo de CHC incluyen, p.ej., aquellos que tienen parientes que han experimentado CHC, y aquellos cuyo riesgo se determina mediante análisis de marcadores genéticos o bioquímicos. En algunas realizaciones, el individuo es positivo de expresión de SPARC (por ejemplo, basándose en el estándar de IHC). En algunas realizaciones, el individuo es negativo de expresión de SPARC.

Según la invención, los métodos de tratamiento de CHC pueden practicarse en un marco de quimioterapia complementaria. En algunas realizaciones, el método se practica en un marco de quimioterapia de inducción, concretamente el método puede llevarse a cabo antes de la terapia primaria/definitiva. En algunas realizaciones, el método se usa para tratar un individuo que se ha tratado anteriormente. Puede usarse cualquiera de los métodos de tratamiento para tratar un individuo que no se ha tratado anteriormente. En algunas realizaciones, el método se usa como terapia de primera línea. En algunas realizaciones, el método se usa como terapia de segunda línea.

Los métodos descritos en la presente memoria son útiles para diversos aspectos del tratamiento de CHC. Por tanto, puede inhibirse la proliferación de células de CHC (tal como el crecimiento tumoral de CHC) en un individuo mediante la administración al individuo de una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina en combinación con al menos otro agente que inhibe el ensamblaje de microtúbulos. En algunos ejemplos, se inhibe al menos aproximadamente un 10 % (incluyendo por ejemplo al menos aproximadamente cualquiera de un 20, 30, 40, 60, 70, 80, 90 o 100 %) de la proliferación celular. El taxano puede

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eficaz de un agente que inhibe STMN1. En algunas realizaciones, el agente inhibe la actividad de STMN1. En algunas realizaciones, el agente inhibe la unión de STMN1 a tubulina. En algunas realizaciones, el agente aumenta la fosforilación de STMN1. En algunas realizaciones, el agente es un anticuerpo contra STMN1.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina y (b) una cantidad eficaz de un inhibidor de SMTN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina, en la que el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina y (b) una cantidad eficaz de un inhibidor de STMN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina, en la que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición de nanopartículas no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm) y (b) una cantidad eficaz de un inhibidor de STMN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina, en la que el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina y en la que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición de nanopartículas no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm) y (b) una cantidad eficaz de un inhibidor de STMN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden Nab-paclitaxel (Abraxane®) y (b) una cantidad eficaz de un inhibidor de STMN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de Nab-paclitaxel (Abraxane®) y (b) una cantidad eficaz de un inhibidor de STMN1. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas y el inhibidor de STMN1 se administran concurrentemente.

En algunas realizaciones, el agente es una molécula de la familia de las xantonas. En algunas realizaciones, el agente es una gutagamba o un derivado de la misma. La gutagamba y derivados incluyen, por ejemplo, ácido gambógico (AG) y ácido gembogénico (AGE). Por tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo, que comprende administrar al individuo a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina y (b) una cantidad eficaz de una gutagamba o derivado de la misma. En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo, que comprende administrar al individuo a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y una albúmina (tal como Nab-paclitaxel) y b) una cantidad eficaz de una gutagamba o un derivado de la misma. En algunas realizaciones, la gutagamba o derivado de la misma tiene un efecto sinérgico cuando se combina con la cantidad eficaz de la composición de nanopartículas de taxano en la inhibición de la proliferación o metástasis celular en CHC. En algunas realizaciones, la gutagamba o derivado de la misma sensibiliza a las células de CHC frente a la composición de nanopartículas de taxano (tal como Nab-paclitaxel).

Por tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina y (b) una cantidad eficaz de una gutagamba o derivado de la misma. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina, en la que el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina y (b) una cantidad eficaz de una gutagamba o derivado de la misma. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina, en la que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición de nanopartículas no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm) y (b) una cantidad eficaz de una gutagamba o derivado de la misma. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina, en la que el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina, y en la que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición de nanopartículas no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm) y (b) una cantidad eficaz de una gutagamba o derivado de la misma. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden Nab-paclitaxel (Abraxane®) y (b) una cantidad eficaz de una gutagamba o derivado de la misma. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende (a) una cantidad eficaz de Nab-paclitaxel (Abraxane®) y (b) una cantidad eficaz de una gutagamba o derivado de la misma. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas y la gutagamba o derivado de la misma se administran concurrentemente.

En algunas realizaciones, el otro agente inhibe la expresión de STMN1. En algunas realizaciones, el agente es una ribozima anti-STMN1 (tal como Rz184 y Rz305). En algunas realizaciones, el inhibidor de STMN1 es un oligonucleótido anticodificante que inhibe la expresión de STMN1. En algunas realizaciones, el oligonucleótido anticodificante es un oligodesoxinucleótido anticodificante. En algunas realizaciones, el oligonucleótido anticodificante es un oligodesoxirribonucleótido. En otras realizaciones, el inhibidor de STMN1 es un ARN interferente pequeño (ARNip). En algunas realizaciones, el otro agente es una composición que comprende más de un ARNip contra STMN1. Los ARNip contra STMN1 adecuados son conocidos en la materia. Por ejemplo, el conjunto siGenomeSMART de STMN1 es una mezcla de cuatro ARNip contra STMN1.

Por tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina y (b) una cantidad eficaz de un ARNip contra STMN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina, en la que el taxano en las nanopartículas está recubierto con la albúmina y (b) una cantidad eficaz de un ARNip contra STMN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina, en la que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición de nanopartículas no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm) y (b) una cantidad eficaz de un ARNip contra STMN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina, en la que el tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la composición de nanopartículas no es mayor de aproximadamente 200 nm (tal como menor de aproximadamente 200 nm) y (b) una cantidad eficaz de ARNip contra STMN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden Nab-paclitaxel (Abraxane®) y

(b): una cantidad eficaz de un ARNip contra STMN1. En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo

(a): una cantidad eficaz de Nab-paclitaxel (Abraxane®) y (b) una cantidad eficaz de un ARNip contra STMN1. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas y el ARNip contra STMN1 se administran concurrentemente.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y albúmina y (b) una cantidad eficaz de otro agente, en la que el otro agente es un inhibidor de TUBB4. En algunas realizaciones, el otro agente inhibe la polimerización de TUBB4. En algunas realizaciones, el otro agente inhibe la expresión de TUBB4. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el inhibidor de TUBB4 es un oligonucleótido anticodificante que inhibe la expresión de TUBB4. En algunas realizaciones, el inhibidor de TUBB4 es un ARNip contra TUBB4. En algunas realizaciones, las cantidades eficaces de composición de nanopartículas de taxano e inhibidor de TUBB4 inhiben sinérgicamente la proliferación o metástasis celular en CHC. En algunas realizaciones, el inhibidor de TUBB4 sensibiliza a células de CHC frente a la composición de nanopartículas de taxano (tal como Nab-paclitaxel).

En algunas realizaciones, se proporciona una composición para uso en un método de tratamiento de CHC en un individuo necesitado de ello, que comprende administrar al individuo (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano y albúmina y (b) una cantidad eficaz de otro agente, en la que el otro agente es un activador de DOCK7.

Los otros agentes descritos en la presente memoria pueden ser los agentes mismos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos, así como estereoisómeros, enantiómeros, mezclas racémicas y similares. El otro agente o agentes como se describen pueden administrarse también en forma de una composición farmacéutica que contiene el agente o agentes, en los que la composición farmacéutica comprende un vehículo portador farmacéuticamente aceptable o similar.

En algunas realizaciones, se administran dos o más agentes quimioterapéuticos además del taxano en la composición de nanopartículas. Estos dos o más agentes quimioterapéuticos pueden pertenecer (pero no necesariamente) a clases diferentes de agentes quimioterapéuticos. Se proporcionan en la presente memoria ejemplos de estas combinaciones. Se contemplan también otras combinaciones.

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En algunas realizaciones, según cualquiera de los métodos descritos anteriormente en esta sección, el individuo es un ser humano.

Dosificación y método de administración de las composiciones de nanopartículas

La dosis de composiciones de nanopartículas de taxano administrada a un individuo (tal como un ser humano) puede variar con la composición particular, el modo de administración y el tipo de CHC que se esté tratando. En algunas realizaciones, la cantidad de la composición es eficaz para dar como resultado una respuesta objetiva (tal como una respuesta parcial o una respuesta completa). En algunas realizaciones, la cantidad de composición de nanopartículas de taxano es suficiente para dar como resultado una respuesta completa en el individuo. En algunas realizaciones, la cantidad de composición de nanopartículas de taxano es suficiente para dar como resultado una respuesta parcial en el individuo. En algunas realizaciones, la cantidad de composición de nanopartículas de taxano administrada (por ejemplo cuando se administra sola) es suficiente para producir una tasa de respuesta global de más de aproximadamente cualquiera de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 64, 65, 70, 75, 80, 85 o 90 % entre una población de individuos tratados con la composición de nanopartículas de taxano. Las respuestas de un individuo al tratamiento de los métodos descritos en la presente memoria pueden determinarse, por ejemplo, basándose en los niveles de RECIST.

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición es suficiente para prolongar la supervivencia libre de progresión del individuo. En algunas realizaciones, la cantidad de la composición es suficiente para prolongar la supervivencia global del individuo. En algunas realizaciones, la cantidad de la composición (por ejemplo, cuando se administra sola) es suficiente para producir un beneficio clínico de más de aproximadamente cualquiera de un 50, 60, 70 o 77 % entre una población de individuos tratados con la composición de nanopartículas de taxano.

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición, primera terapia, segunda terapia o terapia de combinación es una cantidad suficiente para disminuir el tamaño de un tumor, disminuir el número de células cancerosas o disminuir la tasa de crecimiento de un tumor en al menos aproximadamente cualquiera de un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100 % en comparación con el correspondiente tamaño tumoral, número de células de CHC o tasa de crecimiento tumoral en el mismo sujeto antes del tratamiento o en comparación con la correspondiente actividad en otros sujetos que no reciben el tratamiento. Pueden usarse métodos estándares para medir la magnitud de este efecto, tales como ensayos in vitro con enzima purificada, ensayos basados en células, modelos animales o ensayos humanos.

En algunas realizaciones, la cantidad de taxano (p.ej. paclitaxel) en la composición está por debajo del nivel que induce un efecto toxicológico (concretamente, un efecto por encima del nivel clínicamente aceptable de toxicidad) o está a un nivel en que puede controlarse o tolerarse un efecto secundario potencial cuando la composición se administra al individuo.

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición es cercana a la dosis máxima tolerada (DMT) de la composición siguiendo el mismo régimen de dosificación. En algunas realizaciones, la cantidad de la composición es más de aproximadamente cualquiera de un 80, 90, 95 o 98 % de la DMT.

En algunas realizaciones, la cantidad de un taxano (p.ej. paclitaxel) en la composición está incluida en cualquiera de los intervalos siguientes: de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 2,5 mg, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 50 a aproximadamente 75 mg, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 100 a aproximadamente 125 mg, de aproximadamente 125 a aproximadamente 150 mg, de aproximadamente 150 a aproximadamente 175 mg, de aproximadamente 175 a aproximadamente 200 mg, de aproximadamente 200 a aproximadamente 225 mg, de aproximadamente 225 a aproximadamente 250 mg, de aproximadamente 250 a aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 300 a aproximadamente 350 mg, de aproximadamente 350 a aproximadamente 400 mg, de aproximadamente 400 a aproximadamente 450 mg o de aproximadamente 450 a aproximadamente 500 mg. En algunas realizaciones, la cantidad de taxano (p.ej. paclitaxel) en la cantidad eficaz de la composición (p.ej., una forma de dosificación unitaria) está en el intervalo de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 500 mg, tal como de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 300 mg o de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 200 mg. En algunas realizaciones, la concentración del taxano (p.ej., paclitaxel) en la composición está diluida (aproximadamente 0,1 mg/ml) o concentrada (aproximadamente 100 mg/ml), incluyendo por ejemplo cualquiera de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 mg/ml o aproximadamente 5 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración del taxano (p.ej., paclitaxel) es de al menos aproximadamente cualquiera de 0,5 mg/ml, 1,3 mg/ml, 1,5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml

o 50 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración del taxano (p.ej., paclitaxel) es de no más de aproximadamente cualquiera de 100 mg/ml, 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 20 mg/ml, 10 mg/ml o 5 mg/ml.

Las cantidades eficaces ejemplares de un taxano (p.ej. , paclitaxel) en la composición de nanopartículas incluyen, pero sin limitación, al menos aproximadamente cualquiera de 25 mg/m2, 30 mg/m2, 50 mg/m2, 60 mg/m2, 75 mg/m2, 80 mg/m2 90 mg/m2, 100 mg/m2, 120 mg/m2, 125 mg/m2, 150 mg/m2, 160 mg/m2, 175 mg/m2, 180 mg/m2, 200 mg/m2, 210 mg/m2, 220 mg/m2, 250 mg/m2, 260 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2, 500 mg/m2, 540 mg/m2, 750 mg/m2, 1000 mg/m2 o 1080 mg/m2 de un taxano (p.ej., paclitaxel). En diversas realizaciones, la composición incluye menos de aproximadamente cualquiera de 350 mg/m2, 300 mg/m2, 250 mg/m2, 200 mg/m2, 150 mg/m2, 120 mg/m2, 100 mg/m2, 90 mg/m2, 50 mg/m2 o 30 mg/m2 de un taxano (p.ej., paclitaxel). En algunas realizaciones, la cantidad del taxano (p.ej., paclitaxel) por administración es menor de aproximadamente cualquiera de 25 mg/m2, 22 mg/m2, 20 mg/m2, 18 mg/m2, 15 mg/m2, 14 mg/m2, 13 mg/m2, 12 mg/m2, 11 mg/m2, 10 mg/m2, 9 mg/m2, 8 mg/m2, 7 mg/m2, 6 mg/m2, 5 mg/m2, 4 mg/m2, 3 mg/m2, 2 mg/m2 o 1 mg/m2. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de un taxano (p.ej., paclitaxel) en la composición está incluida en cualquiera de los siguientes intervalos: de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/m2, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mg/m2, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 mg/m2, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/m2, de aproximadamente 50 a aproximadamente 75 mg/m2, de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 mg/m2, de aproximadamente 100 a aproximadamente 125 mg/m2, de aproximadamente 125 a aproximadamente 150 mg/m2, de aproximadamente 150 a aproximadamente 175 mg/m2, de aproximadamente 175 a aproximadamente 200 mg/m2, de aproximadamente 200 a aproximadamente 225 mg/m2, de aproximadamente 225 a aproximadamente 250 mg/m2, de aproximadamente 250 a aproximadamente 300 mg/m2, de aproximadamente 300 a aproximadamente 350 mg/m2 o de aproximadamente 350 a aproximadamente 400 mg/m2. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de un taxano (p.ej., paclitaxel) en la composición es de aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg/m2, tal como de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 mg/m2, de aproximadamente 120 mg/m2, de aproximadamente 130 mg/m2 o de aproximadamente 140 mg/m2.

En algunas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, la cantidad eficaz de un taxano (p.ej., paclitaxel) en la composición incluye al menos aproximadamente cualquiera de 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,5 mg/kg, 5 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg o 60 mg/kg. En diversas realizaciones, la cantidad eficaz de un taxano (p.ej., paclitaxel) en la composición incluye menos de aproximadamente cualquiera de 350 mg/kg, 300 mg/kg, 250 mg/kg, 200 mg/kg, 150 mg/kg, 100 mg/kg, 50 mg/kg, 25 mg/kg, 20 mg/kg, 10 mg/kg, 7,5 mg/kg, 6,5 mg/kg, 5 mg/kg, 3,5 mg/kg, 2,5 mg/kg o 1 mg/kg de un taxano (p.ej., paclitaxel).

Las frecuencias de dosificación ejemplares para la administración de las composiciones de nanopartículas incluyen, pero sin limitación, diariamente, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, cada seis días, semanalmente sin descanso, en tres de cada cuatro semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada dos semanas o en dos de cada tres semanas. En algunas realizaciones, la composición se administra aproximadamente una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas, una vez cada 6 semanas o una vez cada 8 semanas. En algunas realizaciones, la composición se administra al menos aproximadamente en cualquiera de 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x o 7x (concretamente diariamente) por semana. En algunas realizaciones, los intervalos entre cada administración son menores de aproximadamente cualquiera de 6 meses, 3 meses, 1 mes, 20 días, 15 días, 14 días, 13 días, 12 días, 11 días, 10 días, 9 días, 8 días, 7 días, 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días o 1 día. En algunas realizaciones, los intervalos entre cada administración son de más de aproximadamente cualquiera de 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 8 meses o 12 meses. En algunas realizaciones, no hay descanso en el programa de dosificación. En algunas realizaciones, el intervalo entre cada administración es de no más de aproximadamente una semana.

En algunas realizaciones, la frecuencia de dosificación es una vez cada dos días una vez, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces y once veces. En algunas realizaciones, la frecuencia de dosificación es una vez cada dos días cinco veces. En algunas realizaciones, el taxano (p.ej., paclitaxel) se administra durante un periodo de al menos diez días, en el que el intervalo entre cada administración es de no más de aproximadamente dos días, y en el que la dosis de taxano (p.ej., paclitaxel) en cada administración es de aproximadamente 0,25 mg/m2 a aproximadamente 250 mg/m2, de aproximadamente 0,25 mg/m2 a aproximadamente 150 mg/m2, de aproximadamente 0,25 mg/m2 a aproximadamente 75 mg/m2, tal como de aproximadamente 0,25 mg/m2 a aproximadamente 25 mg/m2, o de aproximadamente 25 mg/m2 a aproximadamente 50 mg/m2.

La administración de la composición puede extenderse durante un periodo prolongado de tiempo, tal como de aproximadamente un mes hasta aproximadamente siete años. En algunas realizaciones, la composición se administra durante un periodo de al menos aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 30, 36, 48, 60, 72 u 84 meses.

En algunas realizaciones, la dosificación de un taxano (p.ej., paclitaxel) en una composición de nanopartículas puede estar en el intervalo de 5-400 mg/m2 cuando se procura en un programa de 3 semanas, o de 5-250 mg/m2 (tal como 80-150 mg/m2, por ejemplo 100-120 mg/m2) cuando se procura en un programa semanal. Por ejemplo, la cantidad de un taxano (p.ej., paclitaxel) es de aproximadamente 60 a aproximadamente 300 mg/m2 (p.ej., de aproximadamente 260 mg/m2) en un programa de 3 semanas.

Otros programas de dosificación ejemplares para la administración de la composición de nanopartículas (p.ej., composición de nanopartículas de paclitaxel/albúmina) incluyen, pero sin limitación, 100 mg/m2 semanalmente sin descansos; 75 mg/m2 semanalmente en 3 de cada 4 semanas; 100 mg/m2 semanalmente en 3 de cada 4 semanas; 125 mg/m2 semanalmente en 3 de cada 4 semanas; 125 mg/m2 semanalmente en 2 de cada 3 semanas; 130 mg/m2 semanalmente sin descansos; 175 mg/m2 una vez cada 2 semanas; 260 mg/m2 una vez cada 2 semanas; 260 mg/m2 una vez cada 3 semanas; 180-300 mg/m2 cada tres semanas; 60-175 mg/m2 semanalmente sin descanso; 20-150 mg/m2 dos veces por semana y 150-250 mg/m2 dos veces por semana. La frecuencia de dosificación de la composición puede ajustarse durante el curso del tratamiento basándose en el criterio del médico administrador.

En algunas realizaciones, el individuo se trata durante al menos cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez ciclos de tratamiento.

Las composiciones descritas en la presente memoria permiten la infusión de la composición a un individuo durante un tiempo de infusión que es menor de aproximadamente 24 horas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se administra la composición durante un periodo de infusión de menos de aproximadamente cualquiera de 24 horas, 12 horas, 8 horas, 5 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, 20 minutos o 10 minutos. En algunas realizaciones, se administra la composición durante un periodo de infusión de aproximadamente 30 minutos.

Otra dosis ejemplar del taxano (en algunas realizaciones paclitaxel) en la composición de nanopartículas incluye, pero sin limitación, aproximadamente cualquiera de 50 mg/m2, 60 mg/m2, 75 mg/m2, 80 mg/m2, 90 mg/m2, 100 mg/m2, 120 mg/m2, 160 mg/m2, 175 mg/m2, 200 mg/m2, 210 mg/m2, 220 mg/m2, 260 mg/m2 y 300 mg/m2. Por ejemplo, la dosificación de paclitaxel en una composición de nanopartículas puede estar en el intervalo de aproximadamente 100-400 mg/m2 cuando se procura en un programa de 3 semanas, o de aproximadamente 50-250 mg/m2 cuando se procura en un programa semanal.

Las composiciones de nanopartículas pueden administrarse a un individuo (tal como un ser humano) mediante diversas vías incluyendo, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intrapulmonar, oral, por inhalación, intravesicular, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intraocular, intratecal, transmucosa y transdérmica. En algunas realizaciones, pueden usarse formulaciones de liberación continua prolongada de la composición. En algunas realizaciones, la composición se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, la composición se administra por vía intraportal. En algunas realizaciones, la composición se administra por vía intraarterial. En algunas realizaciones, la composición se administra por vía intraperitoneal. En algunas realizaciones, la composición se administra por vía intrahepática. En algunas realizaciones, la composición se administra por infusión arterial hepática.

Modos de administración de terapias de combinación

Los regímenes de dosificación descritos en la sección anterior se aplican a marcos de quimioterapia de combinación. Los modos de administración para métodos de terapia de combinación se describen adicionalmente a continuación.

En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas y el otro agente (incluyendo los agentes quimioterapéuticos específicos descritos en la presente memoria) se administran simultáneamente. Cuando se administran los fármacos simultáneamente, el fármaco en las nanopartículas y el otro agente pueden estar contenidos en la misma composición (p.ej. una composición que comprende tanto las nanopartículas como el otro agente) o en composiciones separadas (p.ej. las nanopartículas están contenidas en una composición y el otro agente está contenido en otra composición).

En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas y el otro agente se administran secuencialmente. Pueden administrarse en primer lugar la composición de nanopartículas o el otro agente. La composición de nanopartículas y el otro agente están contenidos en composiciones separadas, que pueden estar contenidas en los mismos o diferentes envases.

En algunas realizaciones, la administración de la composición de nanopartículas y el otro agente es concurrente, concretamente el periodo de administración de la composición de nanopartículas y el del otro agente se superponen entre sí. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas se administra durante al menos un ciclo (por ejemplo, al menos cualquiera de 2, 3 o 4 ciclos) antes de la administración del otro agente. En algunas realizaciones, el otro agente se administra durante al menos cualquiera de una, dos, tres o cuatro semanas. En algunas realizaciones, las administraciones de la composición de nanopartículas y el otro agente se inician aproximadamente a la vez (por ejemplo, al cabo de uno cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días). En algunas realizaciones, la administración de la composición de nanopartículas y el otro agente se terminan aproximadamente a la vez (por ejemplo, al cabo de uno cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días). En algunas realizaciones, la administración del otro agente continúa (por ejemplo durante aproximadamente uno cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses) después de la terminación de la administración de la composición de nanopartículas. En algunas realizaciones, la administración del otro agente se inicia después (por ejemplo después de aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses) del inicio de la administración de la composición de nanopartículas. En algunas realizaciones, las administraciones de la composición de nanopartículas y el otro agente se inician y terminan aproximadamente a la vez. En algunas realizaciones, las administraciones de la composición de nanopartículas y el otro agente se inician aproximadamente a la vez y la administración del otro agente continúa (por ejemplo durante aproximadamente uno cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses) después de la terminación de la administración de la composición de nanopartículas. En algunas realizaciones, la administración de la composición de nanopartículas y el otro agente se detiene aproximadamente a la vez y la administración del otro agente se inicia después (por ejemplo después de aproximadamente uno cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses) del inicio de la administración de la composición de nanopartículas. En algunas realizaciones, el método comprende más de un ciclo de tratamiento, en el que al menos uno de los ciclos de tratamiento comprende la administración de (a) una cantidad eficaz de una composición que comprende nanopartículas que comprenden un taxano (tal como paclitaxel) y albúmina y (b) una cantidad eficaz de al menos otro agente, en el que dicho otro agente inhibe el desensamblaje de microtúbulos. En algunas realizaciones, el ciclo de tratamiento comprende no menos de aproximadamente (tal como aproximadamente) 21 días. En algunas realizaciones, el ciclo de tratamiento comprende menos de aproximadamente 21 días (por ejemplo semanal o diariamente).

En algunas realizaciones, la administración de la composición de nanopartículas y el otro agente es no concurrente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la administración de la composición de nanopartículas se termina antes de administrar el otro agente. En algunas realizaciones, la administración del otro agente se termina antes de administrar la composición de nanopartículas. El periodo de tiempo entre estas dos administraciones no concurrentes puede oscilar de aproximadamente dos a ocho semanas, tal como aproximadamente cuatro semanas.

La frecuencia de dosificación de la composición de nanopartículas que contiene fármaco y el otro agente puede ajustarse durante el curso del tratamiento, basándose en el criterio del médico administrador. Cuando se administran separadamente, la composición de nanopartículas que contienen fármaco y el otro agente pueden administrarse con diferentes frecuencias o intervalos de dosificación. Por ejemplo, la composición de nanopartículas que contienen fármaco puede administrarse semanalmente, mientras que un agente quimioterapéutico puede administrarse más o menos frecuentemente. En algunas realizaciones, puede usarse una formulación de liberación continua prolongada de las nanopartículas que contienen fármaco y/o agente quimioterapéutico. Son conocidos en la materia diversas formulaciones y dispositivos para conseguir una liberación prolongada. Puede usarse también una combinación de las configuraciones de administración descritas en la presente memoria.

La composición de nanopartículas y el otro agente pueden administrarse usando la misma vía de administración o diferentes vías de administración. En algunas realizaciones, (para administraciones tanto simultáneas como secuenciales), el taxano en la composición de nanopartículas y el otro agente se administran a una relación predeterminada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la relación en peso de taxano en la composición de nanopartículas y el otro agente es de aproximadamente 1 a 1. En algunas realizaciones, la relación en peso puede estar entre aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1 y de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 1, o entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1 y de 100 a aproximadamente 1. En algunas realizaciones, la relación en peso de taxano en la composición de nanopartículas y el otro agente es menor de aproximadamente uno cualquiera de 100:1, 50:1, 30:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 y 1:1. En algunas realizaciones, la relación en peso de taxano en la composición de nanopartículas y el otro agente es más de aproximadamente cualquiera de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 30:1, 50:1 y 100:1. Se contemplan otras relaciones.

Las dosis requeridas para el taxano y/o el otro agente pueden ser (pero no necesariamente) menores de las requeridas normalmente cuando se administra cada agente solo. Por tanto, en algunas realizaciones, se administra una cantidad subterapéutica del fármaco en la composición de nanopartículas y/o el otro agente. “Cantidad subterapéutica” o “nivel subterapéutico” hacen referencia a una cantidad que es menor que la cantidad terapéutica, es decir, menor que la cantidad usada normalmente cuando se administra el fármaco en la composición de nanopartículas y/o el otro agente solos. La reducción puede reflejarse en términos de la cantidad administrada en una administración dada y/o la cantidad administrada durante un periodo de tiempo dado (frecuencia reducida).

En algunas realizaciones, se administra suficiente agente quimioterapéutico para permitir una reducción de la dosis normal del fármaco en la composición de nanopartículas requerida para lograr el mismo grado de tratamiento en al menos aproximadamente alguno de un 5, 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 90 % o más. En algunas realizaciones, se administra suficiente fármaco en la composición de nanopartículas para permitir la reducción de la dosis normal del otro agente requerida para lograr el mismo grado de tratamiento en al menos aproximadamente cualquiera de un 5, 10, 20, 30, 50, 60, 70, 80, 90 % o más.

En algunas realizaciones, las dosis tanto del taxano en la composición de nanopartículas como del otro agente se reducen en comparación con la correspondiente dosis normal de cada uno cuando se administran solos. En algunas realizaciones, tanto el taxano en la composición de nanopartículas como el otro agente se administran a un nivel subterapéutico, concretamente reducido. En algunas realizaciones, la dosis de la composición de nanopartículas y/o el otro agente es sustancialmente menor que la dosis tóxica máxima (DTM) establecida. Por ejemplo, la dosis de la composición de nanopartículas y/o el otro agente es menor de aproximadamente un 50, 40, 30, 20 o 10 % de la DTM.

Puede usarse una combinación de las configuraciones de administración descritas en la presente memoria. Los métodos de terapia de combinación descritos en la presente memoria pueden efectuarse solos o junto con otra

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cualquiera de un 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 %) de la albúmina en la porción de nanopartículas de la composición está reticulada (por ejemplo reticulada a través de uno o más enlaces disulfuro).

En algunas realizaciones, las nanopartículas comprenden el taxano (tal como paclitaxel) recubierto con una albúmina (p.ej., seroalbúmina humana). En algunas realizaciones, la composición comprende un taxano tanto en forma de nanopartícula como no nanopartícula (p.ej., en forma de disoluciones de paclitaxel o en forma de complejos solubles de albúmina/nanopartícula), en la que aproximadamente uno cualquiera de un 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % del taxano en la composición está en forma de nanopartícula. En algunas realizaciones, el taxano en las nanopartículas constituye más de aproximadamente uno cualquiera de un 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % de las nanopartículas en peso. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen una matriz no polimérica. En algunas realizaciones, las nanopartículas comprenden un núcleo de taxano que está sustancialmente exento de materiales poliméricos (tales como matriz polimérica).

En algunas realizaciones, la composición comprende albúmina en las porciones tanto de nanopartícula como de no nanopartícula de la composición, en la que al menos aproximadamente uno cualquiera de un 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % de la albúmina en la composición está en la porción de no nanopartícula de la composición.

En algunas realizaciones, la relación en peso de albúmina (tal como seroalbúmina humana) y taxano en la composición de nanopartículas es de aproximadamente 18:1 o menos, tal como de aproximadamente 15:1 o menos, por ejemplo de aproximadamente 10:1 o menos. En algunas realizaciones, la relación en peso de albúmina (tal como seroalbúmina humana) y taxano en la composición entra dentro del intervalo de uno cualquiera de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 18:1, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 13:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 12:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 10:1. En algunas realizaciones, la relación en peso de albúmina y taxano en la porción de nanopartícula de la composición es de aproximadamente uno cualquiera de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10,

1:15 o menos. En algunas realizaciones, la relación en peso de albúmina (tal como seroalbúmina humana) y taxano en la composición es una cualquiera de las siguientes: de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 18:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 12:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 9:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 7:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1 y de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:1.

En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas comprende una o más de las características anteriores.

Las nanopartículas descritas en la presente memoria pueden estar presentes en una formulación seca (tal como una composición liofilizada) o suspendidas en un medio biocompatible. Los medios biocompatibles adecuados incluyen, pero sin limitación, agua, medio acuoso tamponado, disolución salina, disolución salina tamponada, disoluciones opcionalmente tamponadas de aminoácidos, disoluciones opcionalmente tamponadas de proteínas, disoluciones opcionalmente tamponadas de azúcares, disoluciones opcionalmente tamponadas de vitaminas, disoluciones opcionalmente tamponadas de polímeros sintéticos, emulsiones que contienen lípidos y similares.

En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable comprende seroalbúmina humana. La seroalbúmina humana (HSA) es una proteína globular altamente soluble de Mr 65 K y consiste en 585 aminoácidos. La HSA es la proteína más abundante en el plasma y da cuenta del 70-80 % de la presión osmótica coloidal del plasma humano. La secuencia aminoacídica de HSA contiene un total de 17 puentes disulfuro, un tiol libre (Cys 34) y un único triptófano (Trp 214). El uso intravenoso de una disolución de HSA se ha indicado para la prevención y el tratamiento de choque hipovolémico (véanse, p.ej., Tullis, JAMA, 237, 355-360, 460-463, (1977)) y Houser et al., Surgery, Gynecology and Obstetrics, 150, 811-816 (1980)) y junto con exsanguinotransfusión en el tratamiento de hiperbilirrubinemia neonatal (véase, p.ej., Finlayson, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 6, 85-120, (1980)). Se contemplan otras albúminas, tales como seroalbúmina bovina. El uso de dichas albúminas no humanas podría ser apropiado, por ejemplo, en el contexto de uso de estas composiciones en mamíferos no humanos, tales como el veterinario (incluyendo mascotas domésticas y el contexto agrícola).

La seroalbúmina humana (HSA) tiene múltiples sitios de unión hidrófobos (un total de 8 para ácidos grasos, un ligando endógeno de HSA) y se une a un conjunto diverso de taxanos, especialmente compuestos neutros e hidrófobos y cargados negativamente (Goodman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9ª ed., McGraw-Hill, Nueva York (1996)). Se han propuesto dos sitios de alta afinidad en los subdominios IIA y lIlA de HSA, que son bolsillos hidrófobos altamente alargados con residuos de lisina y arginina cargados cerca de la superficie que funcionan como puntos de enlace para los rasgos de ligando polar (véanse, p.ej., Fehske et al., Biochem. Pharmcol., 30, 687-92 (198a), Vorum, Dan. Med. Bull., 46, 379-99 (1999), Kragh-Hansen, Dan. Med. Bull., 1441, 131-40 (1990), Curry et al., Nat. Struct. Biol., 5, 827-35 (1998), Sugio et al., Protein. Eng., 12, 439-46 (1999), He et aI., Nature, 358, 209-15 (199b) y Carter et al., Adv. Protein. Chem., 45, 153-203 (1994)). Se ha mostrado que paclitaxel y propofol se unen a HSA (véanse, p.ej., Paal et al., Eur. J. Biochem., 268(7), 2187-91 (200a), Purcell et al., Biochim. Biophys. Acta, 1478(a), 61-8 (2000), Altmayer et al., Arzneimittelforschung, 45, 1053-6 (1995) y Garrido et al., Rev. Esp. Anestestiol. Reanim., 41, 308-12 (1994)). Además, se ha mostrado que el docetaxel se une a proteínas plasmáticas humanas (véase, p.ej., Urien et al., Invest. New Drugs, 14(b), 147-51 (1996)).

La albúmina (tal como seroalbúmina humana) en la composición sirve generalmente como portador para el taxano, concretamente, la albúmina en la composición hace al taxano más fácil de suspender en un medio acuoso o ayuda a mantener la suspensión en comparación con composiciones que no comprenden una albúmina. Esto puede evitar el uso de disolventes tóxicos (o tensioactivos) para solubilizar el taxano, y puede reducir así uno o más efectos secundarios de la administración del taxano a un individuo (tal como un ser humano). Por tanto, en algunas realizaciones, la composición descrita en la presente memoria esta sustancialmente exenta (tal como exenta) de tensioactivos tales como Cremophor (incluyendo Cremophor EL® (BASF)). En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas está esencialmente exenta (tal como exenta) de tensioactivos. Una composición está “sustancialmente exenta de Cremophor" o “sustancialmente exenta de tensioactivo” si la cantidad de Cremophor o tensioactivo en la composición no es suficiente para causar uno o más efectos secundarios en un individuo cuando se administra la composición de nanopartículas al individuo. En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas contiene menos de aproximadamente uno cualquiera de un 20, 15, 10, 7,5, 5, 2,5 o 1 % de disolvente orgánico o tensioactivo.

La cantidad de albúmina en la composición descrita en la presente memoria variará dependiendo de los demás componentes en la composición. En algunas realizaciones, la composición comprende una albúmina en una cantidad que es suficiente para estabilizar el taxano en una suspensión acuosa, por ejemplo en forma de una suspensión coloidal estable (tal como una suspensión estable de nanopartículas). En algunas realizaciones, la albúmina está en una cantidad que reduce la tasa de sedimentación del taxano en un medio acuoso. Para composiciones que contienen partículas, la cantidad de albúmina depende también del tamaño y la densidad de nanopartículas del taxano.

Un taxano se “estabiliza” en una suspensión acuosa si permanece suspendido en un medio acuoso (tal como sin precipitación o sedimentación visible) durante un periodo de tiempo prolongado, tal como durante al menos aproximadamente cualquiera de 0,1, 0,2, 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48, 60 o 72 horas. La suspensión es generalmente, pero no necesariamente, adecuada para administración a un individuo (tal como un ser humano). La estabilidad de la suspensión se evalúa generalmente (pero no necesariamente) a la temperatura de almacenamiento (tal como temperatura ambiente (tal como 20-25 ºC) o en condiciones refrigeradas (tal como 4 ºC)). Por ejemplo, una suspensión es estable a la temperatura de almacenamiento si no exhibe floculación ni aglomeración de partículas visible a simple vista o cuando se observa bajo microscopio óptico a 1000 aumentos aproximadamente 15 minutos después de la preparación de la suspensión. La estabilidad puede evaluarse también en condiciones de ensayo aceleradas, tales como a una temperatura que es mayor de aproximadamente 40 ºC.

En algunas realizaciones, la albúmina está presente en una cantidad que es suficiente para estabilizar el taxano en una suspensión acuosa a una cierta concentración. Por ejemplo, la concentración de taxano en la composición es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/ml, incluyendo por ejemplo cualquiera de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 mg/ml o de aproximadamente 5 mg/ml. En algunas realizaciones, la concentración de taxano es al menos aproximadamente cualquiera de 1,3 mg/ml, 1,5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml y 50 mg/ml. En algunas realizaciones, la albúmina está presente en una cantidad que evita el uso de tensioactivos (tales como Cremophor), de modo que la composición está exenta o sustancialmente exenta de tensioactivos (tales como Cremophor).

En algunas realizaciones, la composición, en forma líquida, comprende de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 % (p/v) (p.ej. aproximadamente 0,5 % (p/v), aproximadamente 5 % (p/v), aproximadamente 10 % (p/v), aproximadamente 15 % (p/v), aproximadamente 20 % (p/v), aproximadamente 30 % (p/v), aproximadamente 40 % (p/v) o aproximadamente 50 % (p/v)) de albúmina. En algunas realizaciones, la composición, en forma líquida, comprende de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 % (p/v) de albúmina.

En algunas realizaciones, la relación en peso de albúmina, p.ej., albúmina, a taxano en la composición de nanopartículas es tal que se une a, o se transporta por, la célula una cantidad suficiente de taxano. Aunque la relación en peso de albúmina a taxano tendrá que optimizarse para diferentes combinaciones de albúmina y taxano, generalmente la relación en peso de albúmina, p.ej. albúmina, a taxano (p/v) es de aproximadamente 0,01:1 a aproximadamente 100:1, de aproximadamente 0,02:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 0,05:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 20:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 18:1, de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 12:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 9:1 o de aproximadamente 9:1. En algunas realizaciones, la relación en peso de albúmina a taxano es de aproximadamente cualquiera de 18:1 o menos, 15:1 o menos, 14:1 o menos, 13:1 o menos, 12:1 o menos, 11:1 o menos, 10:1 o menos, 9:1 o menos, 8:1 o menos, 7:1 o menos, 6:1 o menos, 5:1 o menos, 4:1 o menos y 3:1 o menos. En algunas realizaciones, la relación en peso de albúmina (tal como seroalbúmina humana) a taxano en la composición es una cualquiera de las siguientes: de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 18:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 12:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 9:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 8:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 7:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 6:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 3:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1 y de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:1.

En algunas realizaciones, la albúmina permite administrar la composición a un individuo (tal como un ser humano) sin efectos secundarios significativos. En algunas realizaciones, la albúmina (tal como seroalbúmina humana) está en una cantidad que es eficaz para reducir uno o más efectos secundarios de la administración del taxano a un ser humano. El término “reducir uno o más efectos secundarios de la administración del taxano” hace referencia a la reducción, alivio, eliminación o evitación de uno o más efectos indeseables causados por el taxano, así como efectos secundarios causados por los vehículos de suministro (tales como disolventes que vuelven los taxanos adecuados para inyección) usados para suministrar el taxano. Dichos efectos secundarios incluyen, por ejemplo, mielosupresión, neurotoxicidad, hipersensibilidad, inflamación, irritación venosa, flebitis, dolor, irritación cutánea, neuropatía periférica, fiebre neutropénica, reacción anafiláctica, trombosis venosa, extravasación y combinaciones de los mismos. Estos efectos secundarios, sin embargo, son meramente ejemplares y pueden reducirse otros efectos secundarios, o combinación de efectos secundarios, asociados a los taxanos.

En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas comprende Abraxane® (Nab-paclitaxel). En algunas realizaciones, la composición de nanopartículas es Abraxane® (Nab-paclitaxel). Abraxane® es una formulación de paclitaxel estabilizado con albúmina humana USP, que puede dispersarse en disolución fisiológica directamente inyectable. Cuando se dispersa en un medio acuoso adecuado tal como inyección de cloruro de sodio al 0,9 % o inyección de dextrosa al 5 %, Abraxane® forma una suspensión coloidal estable de paclitaxel. El tamaño medio de partícula de las nanopartículas en la suspensión coloidal es de aproximadamente 130 nanómetros. Puesto que la HSA es libremente soluble en agua, puede reconstituirse Abraxane® en un amplio intervalo de concentraciones que oscilan de diluida (0,1 mg/ml de paclitaxel) a concentrada (20 mg/ml de paclitaxel) incluyendo, por ejemplo, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, o aproximadamente 5 mg/ml.

Los métodos de elaboración de composiciones de nanopartículas son conocidos en la materia. Por ejemplo, las nanopartículas que contienen taxanos (tales como paclitaxel) y albúmina (tal como seroalbúmina humana) pueden prepararse en condiciones de alta fuerza de cizallamiento (p.ej., sonicación, homogeneización a alta presión o similares). Estos métodos se dan a conocer, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 5.916.596, 6.506.405, 6.749.868, 6.537.579 y 7.820.788 y también en las publicaciones de patente de EE.UU. nº 2007/0082838, 2006/0263434 y la solicitud PCT WO08/137148.

Brevemente, se disuelve el taxano (tal como paclitaxel) en un disolvente orgánico, y la disolución puede añadirse a una disolución de albúmina. Se somete la mezcla a homogeneización a alta presión. El disolvente orgánico puede retirarse entonces por evaporación. La dispersión obtenida puede liofilizarse además. El disolvente orgánico adecuado incluye, por ejemplo, cetonas, ésteres, éteres, disolventes clorados y otros disolventes conocidos en la materia. Por ejemplo, el disolvente orgánico puede ser cloruro de metileno o cloroformo/etanol (por ejemplo, con una relación de 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1 o 9:1).

Otros componentes en las composiciones de nanopartículas

Las nanopartículas descritas en la presente memoria pueden estar presentes en una composición que incluye otros agentes, excipientes o estabilizadores. Por ejemplo, para aumentar la estabilidad aumentando el potencial zeta negativo de las nanopartículas, pueden añadirse uno o más componentes cargados negativamente. Dichos componentes cargados negativamente incluyen, pero sin limitación, sales biliares de ácidos biliares consistentes en ácido glicocólico, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido glicoquenodesoxicólico, ácido tauroquenodesoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido deshidrocólico y otros; fosfolípidos incluyendo fosfolípidos basados en lecitina (yema de huevo) que incluyen las siguientes fosfatidilcolinas: palmitoleilfosfatidilcolina, palmitoleil-linoleilfosfatidilcolina, estearoil-lineoilfosfatidilcolina, estearoiloleilfosfatidilcolina, estearoilaraquidoilfosfatidilcolina y dipalmitoilfosfatidilcolina. Otros fosfolípidos incluyen L--dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y otros compuestos relacionados. Los tensioactivos o emulsionantes cargados negativamente son adecuados también como aditivos, p.ej. colesterilsulfato de sodio y similares.

En algunas realizaciones, la composición es adecuada para administración a un ser humano. En algunas realizaciones, la composición es adecuada para administración a un mamífero tal como, en el contexto veterinario, mascotas domésticas y animales agrícolas. Hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de la composición de nanopartículas (véanse, p.ej., las patentes de EE.UU. nº 5.916.596, 6.096.331 y 7.820.788). Las siguientes formulaciones y métodos son meramente ejemplares y no son en modo algunos limitantes. Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden consistir en (a) disoluciones líquidas tales como una cantidad eficaz del compuesto disuelta en diluyentes tales como agua, disolución salina o zumo de naranja, (b) cápsulas, saquitos o comprimidos, que contienen cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo, como sólidos o gránulos,

(c): suspensiones en un líquido apropiado y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de comprimido pueden incluir uno

: o más de lactosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa de sodio, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes,

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Pacientes de CHC (n= 43)

Estadificación de la AJCC

Nº de lesiones en la presentación: Etapa T1 Etapa T2 Etapa T3 Etapa T4 Única Múltiple 6 (14,0 %) 23 (53,5 %) 10 (23,3 %) 4 (9,3 %) 27 (62,8 %) 16 (37,2 %)

Se efectuó un análisis paramétrico y no paramétrico combinado en los perfiles de micromatriz obtenidos. Se calculó la significación estadística (valor de P) para cada gen basándose en la prueba t de permutación emparejada usando análisis de significación de micromatrices (SAM) y la prueba de rangos con signo de Wilcoxon emparejada. La corrección del ensayo de hipótesis múltiples se había llevado a cabo también usando el análisis de Bonferonni o tasa de descubrimientos falsos. Para establecer la significación de un gen, se promediaron el valor de P combinado de las pruebas de SAM y Wilcoxon y se puntuó la precedencia por clasificación. Los genes que se clasificaron en el percentil superior del 5 % (a ≥1,8 veces la regulación positiva o negativa mediana) se seleccionaron y se sometieron además a un análisis de ontología funcional mediante el análisis de ruta Ingenuity (IPA; www.ingenuity.com).

Cultivo celular y fármacos de taxano

Se cultivaron las estirpes celulares de cáncer de hígado humano Hep3B y SK-HEP1 adquiridas en la ATCC en medio de Eagle modificado por Dulbecco con Glutamax-1 (Gibco-BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con 10 % de suero fetal bovino. Se cultivaron las HKCI-9 (como se describe en Chan K.Y.Y. et al., Modern Pathology 19: 1546-54 (2006)) en medio AIMV (Gibco-BRL) suplementado con 1 % de L-glutamina y 10 % de suero fetal bovino. Se cultivaron todas las células en atmósfera humidificada de 5 % de CO2 a 37 ºC.

Se obtuvo doxorubicina en EBEWE Pharma Ges (Unterach, Austria) y se almacenó a una concentración de 2 mg/ml a 4 ºC. Se obtuvo paclitaxel (Taxol®) en Bristol-Myers Squibb (Princeton, NJ, EE.UU.) y se almacenó a una concentración de 6 mg/ml en 527 mg de Cremophor EL purificado y alcohol deshidratado al 49,7 % a -20º C. Se obtuvo docetaxel (Taxotere®) en Aventis Pharma SA (París, Francia) y se almacenó a una concentración de 10 mg/ml en etanol al 13 % p/p a 4 ºC. Se usó la nanopartícula de (nab)-paclitaxel unido a albúmina en este experimento. Cada vial de Nab-paclitaxel suministrado contiene 100 mg de paclitaxel, estabilizado con 900 mg de albúmina. Tras la reconstitución, se añadieron 20 ml de PBS, dando una concentración madre de Nab-paclitaxel de 5 mg/ml, y se almacenó a -20 ºC hasta el uso.

Ensayo de viabilidad celular

Se midió la viabilidad celular mediante el ensayo MTT. Se trataron células crecidas en placas de 96 pocillos a una densidad de 3.000 células por pocillo con fármacos o transfección de ARNip como se indica. Se ensayaron paclitaxel, docetaxel y Nab-paclitaxel a diferentes concentraciones en el intervalo de 0 to 40 μg/ml durante 48 h, mientras que se ensayó doxorubicina a concentraciones en el intervalo de 0 a 150 μg/ml durante 48 h. Se midió el formazano formado a 570 nm y se expresa la viabilidad celular como un porcentaje de la absorbancia máxima de 5 repeticiones en 3 experimentos independientes. Se determinó la concentración de fármaco que inhibía la supervivencia celular un 50 % (CI50) a partir de las curvas de supervivencia celular.

Análisis de inmunofluorescencia

Se dejaron adherir células sembradas sobre un cubreobjetos de vidrio estéril de 18x18 mm durante 24 horas antes del tratamiento con Nab-paclitaxel 5 ng/ml o medio durante otras 24 h. Se incubaron entonces las células fijadas con paraformaldehído al 4 % con anti--tubulina (Zymed, Invitrogen) a dilución 1:100. Se aplicó el anticuerpo secundario inmunoglobulina anti-ratón acoplada con Alexa-598 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) a una dilución 1:200. Se examinaron los núcleos celulares contrateñidos con DAPI (Molecular Probes) bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon EFD-3, Japón). Se efectuaron el análisis de las imágenes después de la captura y el procesamiento de las pilas de imágenes usando el software AnalySIS.

Análisis por citometría de flujo del ciclo celular

Se midió la distribución del ciclo celular después de exposición a diferentes concentraciones de Nab-paclitaxel.

Después de 12 hm se recolectaron todas las células incluyendo las células desprendidas y se fijaron con etanol al 70 % a 4 ºC durante una noche. Se incubaron las células fijadas con ARNasa A y yoduro de propidio antes del análisis citométrico de flujo (BD FACSCalibur™, Becton Dickinson). Se calculó el valor promedio de las fases G0-G1, S y G2-M a partir de 2 experimentos independientes.

Ensayo TUNEL

Se realizó el ensayo TUNEL según los procedimientos del kit de detección de muerte celular in situ (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Brevemente, se fijaron células tratadas con diferentes concentraciones de Nabpaclitaxel y se incubaron con la mezcla de reacción TUNEL durante 1 h a 37 ºC. Se examinaron los núcleos celulares contrateñidos con DAPI por microscopio de fluorescencia (Nikon EFD-3, Japón). Se calculó el porcentaje de células apoptóticas basándose en al menos cuatro campos seleccionados aleatoriamente, que totalizaban aproximadamente 200 células.

Transfección de ARNip

Las secuencias de ARNip incluían siGENOME SMARTpool de STMN1 (si-STMN1) y ARNip no orientador si-CONTROL (siMock). Todos los ARNip se sintetizaron químicamente como ARN bicatenario (Dharmacon) y se introdujeron en estirpes celulares por Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubaron las células con ARNip 100 nM (si-STMN1 o si-Mock). 6 horas después de la transfección, se reemplazó el medio por medio de crecimiento reciente. Se monitorizó la expresión de STMN1 mediante transferencia Western, que indicó una expresión reprimida durante al menos 3 días. Se aplicaron paclitaxel y Nab-paclitaxel a concentraciones en el intervalo de 0 a 40 μg/ml a las 6 h después de las transfecciones de ARNip. Se llevó a cabo el ensayo de MTT de viabilidad celular a las 48 h, y se calcularon los valores de CI50.

Inmunotransferencia

Se cuantificaron los lisados proteicos de células tratadas con Nab-paclitaxel durante 48 h y de células de control no tratadas usando el ensayo de proteína Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE..UU.). Se separaron iguales cantidades de lisados proteicos (30-60 μg) por PAGE-SDS y se electrotransfirieron a membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories). Los anticuerpos primarios usados incluían anti-STMN1 (dilución 1:1000), anti-PARP (dilución 1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania) y anti-GAPDH (dilución 1:10.000) (Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.). Después de incubación con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (dilución 1:10.000 para anti-GAPDH; 1:2000 para otros anticuerpos primarios) (Santa Cruz), se detectó la expresión de proteína usando sustrato luminiscente SuperSignal West Pico (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.).

Modelo de xenoinjerto en SK-HEP1/Luc+

Se preparó un clon estable de luciferasa SK-HEP1 transfectando células SK-HEP1 con vector de expresión de luciferasa de luciérnaga y se seleccionó con geneticina 500 μg/ml (Gibco-BRL) durante 4 semanas. Se cribaron en las colonias individuales la actividad de bioluminiscencia usando el formador de imágenes Xenogen IVIS® (Alameda, CA, EE.UU.). Se usaron para estudios in vivo los clones con expresión de luminiscencia estable.

Se anestesiaron ratones BALB/c macho atímicos de 6-8 semanas de edad con un peso corporal promedio de aproximadamente 20 g mediante inyección intraperitoneal de hidrocloruro de ketamina (120 mg/kg) (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, lA, EE.UU.) más xilazina (6 mg/kg) (Phoenix Scientific, Inc., St. Joseph, MO, EE.UU). Los animales anestesiados recibieron entonces 5 x 106 células SK-HEP1/Luc+ suspendidas en 200 μl de medio exento de suero mediante inyección subcutánea debajo del flanco dorsal. Los tratamientos farmacológicos empezaron el día 14 después de la inoculación de las células tumorales. Se dividieron los ratones en 5 grupos: PBS (n= 13), Nabpaclitaxel (n= 14), paclitaxel (n= 9), docetaxel (n= 9) y doxorubicina, (n= 10). Se procuraron todos los fármacos cada dos días cinco veces, a una dosis de 35 mmol/kg. Véase Desai N. et al., Clinical Cancer Research, 12: 1317-24 (2006). Se monitorizó el crecimiento tumoral dos veces por semana mediante imagenología bioluminiscente in vivo y mediante medidas con calibre externo usando la fórmula [(longitudxanchura2)/2] durante 24 días. Para la imagenología bioluminiscente in vivo, se procuró D-luciferina 150 mg/kg mediante inyección intraperitoneal y, 10 minutos después de la inyección de luciferina, se anestesiaron los ratones con isoflurano y se midió la viabilidad de las células tumorales mediante el formador de imágenes Xenogen IVIS®.

Análisis estadístico

Se presentaron los datos como media ± DE. Se efectuaron la prueba de t de Student, curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y análisis ANOVA de un factor usando el software Graphpad Prism 3.0. Se consideraron estadísticamente significativas las diferencias de P< 0,05.

Resultados

Ontologías funcionales implicadas en el desarrollo de CHC

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Claims

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