ES2575364T3 - Pseudovirus de papilomavirus para detección y terapia de tumores - Google Patents

Abstract

Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma que comprenden un marcador detectable para su uso en un metodo de deteccion de la presencia de celulas cancerosas en un sujeto que tiene o es sospechoso de tener celulas cancerosas; en donde dicho metodo comprende: identificar un sujeto que tiene o es sospechoso de tener celulas cancerosas; administrar a dicho sujeto una cantidad detectable de dicho pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma que comprenden un marcador detectable; y detectar la presencia de celulas cancerosas unidas a dicho pseudovirus de papiloma o dicha VLP de papiloma que comprenden un marcador detectable.

Description

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DESCRIPCION

Pseudovirus de papilomavirus para deteccion y terapia de tumores Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a los campos de biolog^a molecular y medicina. Mas espedficamente, se describen en este documento metodos para detectar tumores y tratar sujetos que padecen usando pseudovirus de papiloma y partfculas tipo virus (VLP).

Antecedentes de la invencion

El cancer se diagnostica en mas de 1 millon de personas cada ano en los Estados Unidos solamente. A pesar de los numerosos avances en la investigation medica, el cancer sigue siendo la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, representando casi 1 de cada cuatro muertes. Aunque estan disponibles numerosos tratamientos para diversos canceres, muchas formas de cancer siguen siendo incurables, intratables, y/o se vuelven resistentes a terapias convencionales. Por ejemplo, los tumores pueden ser inoperables a causa de su localization o pueden metastatizar, haciendo dificil o imposible tratar la enfermedad. Las terapias actuales tienen considerables inconvenientes. Por ejemplo, la radioterapia puede causar dano en las superficies epiteliales, hinchamiento, infertilidad, fatiga, fibrosis, perdida del cabello, sequedad, y cancer. La quimioterapia puede inducir nauseas, vomitos, diarrea, estrenimiento, anemia, malnutricion, perdida de cabello, perdida de memoria, depresion del sistema inmunologico y por tanto infecciones y sepsis, hemorragia, neoplasias secundarias, cardiotoxicidad, hepatotoxicidad, nefrotoxicidad, y otoxicidad. Es muy evidente la necesidad de tecnicas robustas para diagnosticar y tratar el cancer.

Los virus han demostrado tener tremenda utilidad en diversas aplicaciones biomedicas. Muchas de estas tecnicas aprovechan la capacidad unica de los virus de entrar en celulas con alta eficacia. Algunas de estas aplicaciones explotan la expresion genica virica y la replication para inducir expresion de un heterologo insertado. Es bien sabido que diversos virus suministra y expresa genes en celulas (viricos u otros genes), que pueden ser utiles, por ejemplo, en terapia genica, el desarrollo de vacunas, o biologia del cancer.

Existe documentation extensiva sobre el uso de vectores viricos, particularmente aquellos basados en adenovirus, virus adenoasociados (AAV), herpes virus y retrovirus, para aumentar la potencia de la terapia antitumoral, sin embargo, estas metodologias estan en su albor.

Nieland et al, Journal of Cellular Biochemistry 73:145-152 (1999), describe particulas tipo virus de papilomavirus quimerico que inducen una respuesta inmunitaria protectora especifica de autoantigeno murino y antitumoral terapeutica. Schiller y Lowry, Expert Opinion On Biological Therapy, vol. 1, n.° 4, 1 julio de 2001 paginas 571-581, describen vacunas basadas en particulas tipo papilomavirus. Cho et al, Cancer Letters 162 (2001) 75-85 describen la mejora de la transferencia genica de lineas celulares de cancer cervical usando agentes no viricos. Touze y Coursaget, Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, N.° 5, 1317-1323, describen transferencia genica in vitro usando particulas tipo papilomavirus humano.

Sumario de la invencion

En un aspecto, la invencion proporciona un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma que comprende un marcador detectable para su uso en metodo de deteccion de la presencia de celulas cancerosas en un sujeto que tiene o es sospecho de tener celulas cancerosas: donde dicho metodo comprende: identificar un sujeto que tiene o es sospechoso de tener celulas cancerosas; administrar a dicho sujeto una cantidad detectable de dicho pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma que comprende un marcador detectable; y detectar la presencia de celulas cancerosas unidas a dicho pseudovirus de papiloma o dicha VLP de papiloma que comprende un marcador detectable.

En otro aspecto, la invencion proporciona una composition que comprende un agente terapeutico formulado con un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso en un metodo de tratamiento de cancer inhibiendo la proliferation de celulas cancerosas y/o eliminando las celulas cancerosas sin inhibir la proliferation y/o sin eliminar las celulas normales en un sujeto identificado con un cancer, donde dicho agente terapeutico es citotoxico para una celula cancerosa.

La invencion se define por las reivindicaciones adjuntas.

Realizaciones de la presente description se refieren a metodos para detectar la presencia de celulas cancerosas, (por ejemplo, celulas tumorales), unidas a al menos un pseudovirus de papiloma (PsV) o particula tipo virus (VLP) de papiloma. Algunos enfoques implican identificar un sujeto que tiene o es sospechoso de tener celulas cancerosas, administrar al sujeto una cantidad detectable de un pseudovirus o VLP de papiloma que comprende un marcador detectable, y detectar la presencia o ausencia de celulas cancerosas unidas al pseudovirus o VLP de papiloma que comprende el marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador esta acoplado quimicamente al

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pseudovirus o VLP. En otras realizaciones, se mide la presencia, ausencia o cantidad de pseudovirus o VLP de papiloma unido a las celulas cancerosas y la presencia, ausencia o cantidad de pseudovirus o VLP de papiloma unido a celulas normales. En mas realizaciones, el pseudovirus comprende un gen que codifica un marcador (por ejemplo, luciferasa o GFP). Otros marcadores, incluyendo marcadores fluorescentes, radiactivos, o quimioluminiscentes, que pueden incorporarse en o acoplarse al PsV o VLP, tambien se contemplan para su uso con algunas realizaciones.

Realizaciones adicionales descritas en este documento se refiere a metodos para controlar una terapia contra el cancer en un sujeto que incluye identificar a un sujeto con un cancer, proporcionar al sujeto una terapia contra el cancer, administrar al sujeto una cantidad detectable de un pseudovirus o VLP de papiloma que comprende un marcador detectable, y determinar la presencia o cantidad de PsV o VLP unido a celulas cancerosas en el sujeto despues, o durante el curso del tratamiento con la terapia contra el cancer. Usando sucesivas inoculaciones con PsV o VLP marcados de forma fluorescente, por ejemplo, puede evaluarse la eficacia a tiempo real de la terapia particular en el tiempo. En algunas realizaciones, el marcador esta acoplado quimicamente al pseudovirus o VLP. En otras realizaciones, se mide la presencia o cantidad de pseudovirus o VLP de papiloma unido a las celulas cancerosas y la presencia o cantidad de pseudovirus o VLP de papiloma unido a celulas normales. En algunas realizaciones, el pseudovirus incluye un gen que codifica el marcador o, opcionalmente, un acido nucleico terapeutico (por ejemplo, un acido nucleico de oligo T).

Mas realizaciones descritas en este documento se refieren a metodos de inhibition selectiva de la proliferation de celulas cancerosas y/o elimination de celulas cancerosas sin inhibir la proliferacion de y/o eliminar celulas normales que incluye identificar un sujeto con un cancer y administrar al sujeto identificado una cantidad inhibidora de una composition que comprende un pseudovirus o VLP de papiloma y un agente terapeutico. En algunas realizaciones, el agente terapeutico esta acoplado quimicamente al pseudovirus o VLP de papiloma. En otras realizaciones, el agente terapeutico se incorpora dentro del pseudovirus o VLP de papiloma. En algunas realizaciones, el agente terapeutico es una toxina. En algunas realizaciones, el agente terapeutico comprende un acido nucleico de oligo T. En algunas realizaciones, el agente terapeutico comprende un radionuclido. Realizaciones adicionales descritas en este documento se refieren a kits que incluyen un pseudovirus o VLP de papiloma, vehiculos farmaceuticos, e instrucciones para el uso de los componentes del kit.

Por consiguiente, aspectos de la presente description se refieren a metodos de detection de la presencia de celulas cancerosas unidas a un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma que comprende identificar a un sujeto que tiene o es sospechoso de tener celulas cancerosas; administrar o proporcionar a dicho sujeto una cantidad detectable de un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma que comprende un marcador detectable; y detectar la presencia de celulas cancerosas unidas a dicho pseudovirus de papiloma o dicha VLP de papiloma que comprende un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador esta acoplado quimicamente a dicho pseudovirus o VLP o dicho pseudovirus comprende un gen que codifica dicho marcador y en mas realizaciones se mide la presencia o cantidad de pseudovirus o VLP unido a dichas celulas cancerosas y la presencia o cantidad de pseudovirus o VLP unido a celulas normales. El marcador usado en estas realizaciones puede ser fluorescente, radiactivo o quimioluminiscente o detectable de otro modo.

Aspectos de la presente descripcion tambien incluyen metodos para evaluar una terapia contra el cancer que comprende identificar un a sujeto con un cancer; proporcionar a dicho sujeto una terapia contra el cancer; administrar o proporcionar a dicho sujeto una cantidad detectable de un pseudovirus de papiloma o VLP de papiloma que comprende un marcador detectable; y determinar la presencia o cantidad de dicho pseudovirus o dicha VLP unida a celulas cancerosas en dicho sujeto, antes de un tratamiento de dicha terapia contra el cancer y durante o despues de un periodo de dicho tratamiento. En algunas realizaciones, el marcador esta acoplado quimicamente a dicho pseudovirus o dicha VLP o dicho pseudovirus comprende un gen que codifica dicho marcador y en algunas realizaciones, se mide la presencia o cantidad de dicho pseudovirus o dicha VLP unida a dichas celulas cancerosas y la presencia o cantidad de dicho pseudovirus o dicha VLP unida a celulas normales. El marcador usado puede ser fluorescente, radiactivo, quimioluminiscente o puede marcar de forma detectable de otro modo.

Aspectos de la presente descripcion tambien incluyen metodos de inhibicion de la proliferacion de celulas cancerosas y/o eliminacion de celulas cancerosas sin inhibir la proliferacion y/o eliminar celulas normales, que comprende identificar a un sujeto con un cancer; y administrar o proporcionar a dicho sujeto identificado una composicion que comprende un agente terapeutico formulado con un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma. En algunas realizaciones, el agente terapeutico esta acoplado quimicamente a dicho pseudovirus o dicha VLP y en otras realizaciones el agente terapeutico se incorpora dentro de dicho pseudovirus o dicha VLP. El agente terapeutico puede ser una toxina, radionuclido, ganciclovir o aciclovir, u oligo T, preferiblemente, oligo T, de menos de o igual a 200, 175, 150, 125, 100, 95, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, o 10 nucleotidos. En algunas realizaciones, el agente terapeutico es un acido nucleico que expresa oligo T y dicho acido nucleico esta unido de forma funcional a un promotor Pol III. En algunas realizaciones, los metodos anteriores se usan para inhibir, eliminar, evaluar, o diagnosticar el estado de un cancer, que se selecciona del grupo que consiste en leucemia, linfoma, mieloma, plasmacitoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama,

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cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudoriparas, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcitico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, neuroglioma, y retinoblastoma.

Aun mas realizaciones incluyen kits que comprenden un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma, un vehiculo farmaceutico, instrucciones para usar los componentes del kit y metodo de detection de la presencia de cancer cervical en un sujeto, que comprende proporcionar a dicho sujeto una composition que comprende una VLP de papiloma acoplada a o que contiene un marcador; retirar las VLP no unidas que comprenden dicho marcador; y detectar la presencia de celulas cancerosas unidas a dicha VLP que comprende dicho marcador.

En algunas de estas realizaciones, el marcador esta quimicamente acoplado a dicha VLP y en algunas realizaciones se mide la presencia o cantidad de dicha VLP unida a dichas celulas cancerosas y la presencia o cantidad de dicha VLP unida a celulas normales. El marcador puede ser fluorescente, radiactivo, quimioluminiscente o puede marcar de forma detectable de otro modo.

Aspectos de la presente description tambien incluyen una composicion que comprende un acido nucleico que comprende un dominio oligo T de al menos 10 y menos de o igual a 200 restos T consecutivos, tal como un dominio oligo T que consiste esencialmente en 45 nucleotidos o un dominio oligo T que cosiste en 45 nucleotidos. Estos acidos nucleicos o acidos nucleicos que codifican estas moleculas pueden unirse de forma funcional al promotor Pol III.

Breve descripcion de los dibujos

Fig. 1a-1d. Efectos de alteration mecanica, N-9 y carragenina sobre infection por pseudovirus HPV16 de la mucosa cervicovaginal de raton. Se indican resultados de imagenes multiespectrales (representativas de dos o tres experimentos diferentes), expresados como senal media por pixel, para ratones (seis por grupo) en el eje Y, y se indican geles usados para preparar el inoculo de pseudovirus en el eje X. El metodo de pretratamiento se indica por la clave. Las barras de error representan el error tipico de la media. (Fig. 1a) Comparacion de la potenciacion de infeccion por alteracion mecanica y quimica. (Fig. 1b) Protection proporcionada por carragenina cuando se mezcla con el inoculo. (Fig. 1c) Proteccion proporcionada por lubricantes sin receta cuando se mezclan con el inoculo. (Fig. 1d) Proteccion proporcionada por carragenina cuando se mezcla con N-9 durante pretratamiento.

Fig. 2. Analisis cuantitativo de infeccion del tracto reproductor murino. Ratones tratados con Conceptrol se infectaron de forma simulada (parte superior) o se expusieron con pseudovirus HPV-16-tdTomato (parte inferior). Despues de 3 dias, se disecciono el tracto reproductor completo y se hizo una incision sagital en la pared ventral de la vagina y el cuello del utero. (Fig. 2a) Imagen Composite Maestro (epitelio mucoso enfocando hacia arriba) con algoritmo sin mezclas aplicado. La senal roja representa la localization de infeccion en comparacion con la autofluorescencia de fondo. (Fig. 2b) Senal tdTomato no mezclada convertida a escala de grises. El perfil del tejido indica ROI. (Fig. 2c) Analisis de ImageJ. Se computo la senal media por pixel con la ROI.

Fig. 3. El tracto genital intacto de raton era completamente resistente a infeccion despues de deposition de 107 unidades infecciosas pseudoviricas en la vagina o canal endocervical.

Fig. 4. Capsidas de HPV acopladas a colorante fluorescente verde no unidas a epitelio escamoso o simple que delinea el tracto reproductor femenino de raton.

Fig. 5. Lineas celulares de tumor epitelial eran permisivas para infeccion con pseudovirus HPV5 y 16.

Fig. 6. Lineas celulares de tumor no epitelial eran permisivas para infeccion por pseudovirus HPV5 y 16.

Fig. 7. Diseno experimental para ensayar si los pseudovirus de papiloma infectan preferentemente celulas tumorales en un modelo de metastasis de tumor peritoneal SHIN3-dsr.

Fig. 8. Pseudovirus HPV16 infecta de forma eficaz y selectiva celulas de cancer de ovario implantadas en la membrana peritoneal como se demuestra por imagenes multiespectrales de fluorescencia.

Fig. 9. Diseno experimental para ensayar si pseudovirus de papiloma infectan preferentemente celulas tumorales en un modelo de metastasis de tumor peritoneal SKOV3.

Fig. 10. Pseudovirus HPV16 infecta de forma eficaz y selectiva celulas de cancer de ovario implantadas en la membrana peritoneal como se demuestra por la medicion de actividad luciferasa.

Fig. 11. Pseudovirus HPV16 infecta de forma eficaz y selectiva celulas de cancer de ovario implantadas en la membrana peritoneal como se demuestra por imagenes multiespectrales de fluorescencia.

Fig. 12. Pseudovirus HPV16 infecta de forma eficaz y selectiva celulas de cancer de ovario implantadas en la membrana peritoneal como se demuestra por imagenes multiespectrales de fluorescencia.

Fig. 13. Pseudovirus HPV16 infecta de forma eficaz y selectiva celulas de cancer de ovario implantadas en la membrana peritoneal como se demuestra por imagenes multiespectrales de fluorescencia.

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Descripcion detallada de la invencion

Se describe en este documento el inesperado descubrimiento de que pseudovirus de papiloma y VLP de papiloma se unen selectivamente a e infectan celulas cancerosas pero no celulas normales. Aunque sin el deseo de limitarse a teoria particular alguna o crear un impedimento de ese modo, se contempla que, en comparacion con los vectores de transferencia genica vmca actuales, los pseudovirus y VLP de papiloma ofrecen inesperadamente muchos beneficios. Los pseudovirus y VLP de papiloma no quedaran implicados en interaccion competitiva con celulas normales, que puede impedir el suministro eficaz de los vectores viricos a las celulas cancerosas. La incapacidad de los pseudovirus y VLP de papiloma de unirse a celulas normales en tejidos intactos (por ejemplo, no transformados o no cancerosos) tambien minimizara la citotoxicidad del tratamiento. Ademas, como los pseudovirus y VLP de papiloma eliminan preferentemente celulas cancerosas, induciran preferentemente una respuesta inmunitaria contra las celulas cancerosas. Finalmente, los pseudovirus y/o VLP para muchos tipos de papilomavirus pueden generarse rapidamente y los anticuerpos neutralizantes de papilomavirus estan restringidos en tipo. Por consiguiente, la inhibition mediada por anticuerpo neutralizante y el refuerzo con pseudovirus o VLP de papiloma homologo puede superarse por el uso de pseudovirus o VLP de papiloma de otro tipo.

Como se describe en este documento, se pretende que cuando se proporciona un intervalo de valores, se entienda que cada valor intermedio, a partir del decimo de la unidad del limite inferior salvo que el contexto indique claramente otra cosa, entre el limite superior e inferior del intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en el intervalo indicado este englobado dentro de las realizaciones. Los limites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden incluirse independientemente en los intervalos mas pequenos tambien englobados dentro de las realizaciones, sujetos a cualquier limite especificamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos limites, intervalos que excluyen cualquiera de estos dos limites incluidos tambien se incluyen en las realizaciones.

Salvo que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en este documento tienen el mismo significado habitualmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenecen las realizaciones. Aunque tambien puede usarse cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en este documento en la practica o ensayo de las realizaciones, ahora se describen los metodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en este documento son para divulgar y describir los metodos y/o materiales en relacion con los cuales se citan las publicaciones.

Las publicaciones analizadas en este documento se proporcionan unicamente para su descripcion antes de la fecha de presentation de la presente solicitud. Nada en este documento debe entenderse como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a antedatar dicha publication en virtud de invencion anterior. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas reales de publicacion que no necesitan estar confirmadas independientemente.

Debe indicarse que como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el", "la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, referencia a "un metodo" incluye una pluralidad de dichos metodos y referencia a "una dosis" incluye referencia a una o mas dosis y equivalentes de las mismas conocidas para los expertos en la materia, y etc.

En algunos contextos, los terminos "individuo", "hospedador", "sujeto", y "paciente" se usan de forma intercambiable para hacer referencia a un animal que es el objeto de tratamiento, observation y/o experimento. "Animal" incluye vertebrados e invertebrados, tales como peces, crustaceos, reptiles, pajaros, y, en particular, mamiferos. "Mamifero" incluye, sin limitation, ratones, ratas, conejos, cobayas, perros, gatos, ovejas, cabras, vacas, caballos, primates, tales como monos, chimpances, y simios, y, en particular, seres humanos.

En algunos contextos, los terminos "mejorar", "tratar", "tratamiento", "terapeutico", o "terapia" no significan necesariamente cura o elimination total de la enfermedad o afeccion. Cualquier alivio de cualquier signo o sintoma indeseado de una enfermedad o afeccion, a cualquier grado, puede considerarse mejora, y en algunos aspectos un tratamiento y/o terapia. Ademas, tratamiento puede incluir actos que pueden empeorar la sensation global del paciente de bienestar o aspecto.

La expresion "cantidad/dosis terapeuticamente eficaz" o "cantidad inhibidora" se usa para indicar una cantidad de un compuesto activo, o agente farmaceutico, que provoca una respuesta biologica o medicinal. Esta respuesta puede aparecer en un tejido, sistema, animal o ser humano e incluye alivio de los sintomas de la enfermedad que se esta tratando. Como se usa en este documento con respecto a vectores pseudoviricos de la invencion, la expresion "cantidad/dosis terapeuticamente eficaz" se refiere a la cantidad/dosis de un vector o composition farmaceutica que contiene al vector que es suficiente para producir una respuesta antitumoral eficaz tras la administration a un sujeto.

La expresion "acidos nucleicos", como se usa en este documento, puede ser ADN o ARN. Los acidos nucleicos tambien pueden incluir nucleotidos modificados que permiten la lectura correcta a traves de una polimerasa y que no alteran la expresion de un polipeptido codificado por ese acido nucleico. Las expresiones "acido nucleico" y "oligonucleotido" se usan de forma intercambiable para hacer referencia a una molecula que comprende multiples

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nucleotidos. Como se usan en este documento, las expresiones se refieren a oligorribonucleotidos asi como oligodesoxirribonucleotidos. Las expresiones tambien incluiran polinucleosidos (es decir, un polinucleotido menos el fosfato) y cualquier otro polimero que contenga base organica. Los acidos nucleicos incluyen vectores, por ejemplo, plasmidos, as^ como oligonucleotidos. Las moleculas de acido nucleico pueden obtenerse a partir de fuentes existentes de acido nucleico, pero son preferiblemente sinteticas (por ejemplo, producidas por sintesis de oligonucleotidos).

La expresion "secuencia de nucleotidos" incluye las hebras tanto con sentido como antisentido como hebras unicas individuales o en duplex.

La expresion "secuencia de acido nucleico codificante" se refiere a un acido nucleico que dirige la expresion de una proteina o peptido especifico. Las secuencias de acido nucleico incluyen tanto la secuencia de hebra de ADN que se transcribe en ARN como la secuencia de ARN que se traduce en proteina. Las secuencias de acido nucleico incluyen tanto, secuencias de acido nucleico de longitud completa, asi como secuencias no de longitud completa derivadas de las secuencias de longitud completa. Debe entenderse adicionalmente que la secuencia incluye los codones degenerados de la secuencia o secuencias nativas que pueden introducirse para proporcionar preferencia de codones en una celula hospedadora especifica.

Por "ADN" se entiende una forma polimerica de desoxirribonucleotidos (adenina, guanina, timina, o citosina) en forma bicatenaria o monocatenaria, relajada y superenrollada. Este termino solamente se refiere a la estructura primaria y secundaria de la molecula, y no la limita a ninguna forma terciaria particular. Por tanto, este termino incluye ADN mono y bicatenario encontrado, entre otros, en moleculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restriction), virus, plasmidos, y cromosomas. En el analisis de la estructura de moleculas particulares de ADN, pueden describirse secuencias en este documento de acuerdo con la convention normal de dar solamente la secuencia en la direction 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (es decir, la hebra que tiene la secuencia homologa al ARNm). El termino abarca moleculas que incluyen las cuatro bases adenina, guanina, timina, o citosina, asi como como moleculas que incluyen analogos de bases que son conocidos en la tecnica.

Un "gen" o "secuencia codificante" o una secuencia, que "codifica" una proteina particular es una molecula de acido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y traduce (en el caso de ARNm) en un polipeptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras o de control apropiadas. Los limites del gen se determinan por un codon de inicio en el extremo 5' (amino) y un codon de parada de la traduction en el extremo 3' (carboxi). Un gen puede incluir, aunque sin limitation, ADNc de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genomico de ADN procariota o eucariota, e incluso secuencias de ADN sintetico. Una secuencia de termination de la transcription habitualmente estara localizada 3' a la secuencia genica.

La expresion "elementos de control" se refiere de forma colectiva a regiones promotoras, senales de poliadenilacion, secuencias de terminacion de la transcripcion, dominios reguladores cadena arriba, origenes de replication, sitios internos de entrada al ribosoma ("IRES"), potenciadores, y similares, que proporcionan de forma colectiva la replicacion, transcripcion y traduccion de una secuencia codificante en una celula receptora. No todos estos elementos de control necesitan estar siempre presentes siempre que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una celula hospedadora apropiada.

La expresion "region promotora" se usa en este documento en su sentido habitual para hacer referencia a una region de nucleotidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, donde la secuencia reguladora se obtiene de un gen que es capaz de unirse a ARN polimerasa e iniciar la transcripcion de una secuencia codificante cadena abajo (direccion 3').

La expresion "unido de forma funcional" se refiere a una ordenacion de elementos, donde los componentes asi descritos estan configurados para realizar su funcion habitual. Por tanto, elementos de control unidos de forma funcional a una secuencia codificante son capaces de lograr la expresion de la secuencia codificante. Los elementos de control no tienen que estar contiguos con la secuencia codificantes, siempre que funcionen dirigiendo la expresion de la misma. Por tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias intermedias transcritas aunque no traducidas entre una secuencia promotora y la secuencia codificantes y las secuencia promotora aun puede considerarse "unido de forma funcional" a la secuencia codificante.

Con el fin de describir la position relativa de las secuencias de nucleotidos en una molecula particular de acido nucleico durante toda la presente solicitud, tal como cuando se describe una secuencia particular de nucleotidos como situada "cadena arriba", "cadena abajo", "5'", o "3'" respecto a otra secuencia, debe entenderse que es la posicion de las secuencias en la hebra no transcrita de una molecula de ADN que se menciona como convencional en la tecnica.

El termino "homologia" se refiere al porcentaje de identidad entre dos restos polinucleotidicos o dos restos polipeptidicos. La correspondencia entre la secuencia de un resto con otro puede determinarse por tecnicas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, puede determinarse homologia por una comparacion directa de la information de secuencia entre dos moleculas polipeptidicas alineando la informacion de secuencia y usando programas

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informaticos facilmente disponibles. Como alternativa, puede determinarse homolog^a por hibridacion de polinucleotidos en condiciones, que forman duplex estables entre regiones homologas, seguida por digestion con una o mas nucleasas espedficas de una hebra, y la determinacion del tamano de los fragmentos digeridos. Dos ADN, o dos secuencias polipeptidicas son "sustancialmente homologas" entre s^ cuando al menos aproximadamente el 80 %, preferiblemente al menos aproximadamente el 90 %, y mucho mas preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % de los nucleotidos a aminoacidos coinciden sobre una longitud definida de las moleculas, como se determina usando los metodos anteriores.

Por "aislado" cuando se hace referencia a una secuencia de nucleotidos, se entiende que la molecula indicada esta presente en ausencia sustancial de otras macromoleculas biologicas del mismo tipo. Por tanto, una "molecula de acido nucleico aislada, que codifica un polipeptido particular", se refiere a una molecula de acido nucleico, que esta sustancialmente libre de otras moleculas de acido nucleico que no codifican el presente polipeptido; sin embargo, la molecula puede incluir algunas bases o restos adicionales, que no afectan de forma nociva a las caracteristicas basicas de la composicion.

Las expresiones "vector, "vector de clonacion", "vector de expresion", y "vector auxiliar" significan el vehiculo por el cual puede introducirse una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen foraneo) en una celula hospedadora, para promover la expresion (por ejemplo, transcripcion y/o traduccion) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plasmidos, fagos, virus, pseudovirus, etc. Como se usa en este documento con respecto a los vectores pseudoviricos, la expresion "vector de expresion" se usa muy habitualmente para hacer referencia a un vector que es capaz de infectar una celula hospedadora, mientras que la expresion "vector auxiliar" se usa para hacer referencia a un vector que es capaz de mediar el empaquetado apropiado del "vector de expresion" en una particula tipo virus.

"Transferencia genica" o "suministro genico" se refiere a metodos o sistemas para insertar de forma fiable ADN foraneo en celulas hospedadoras.

Como se usa en este documento, se entiende que el termino "transfeccion" incluye cualquier medio, tal como, aunque sin limitation, adsorcion, microinyeccion, electroporation, lipofeccion y similares para introducir una molecula exogena de acido nucleico en una celula hospedadora. El termino "transfectada" o "transformada", cuando se usa para describir una celula, significa una celula que contiene una molecula de acido nucleico introducida de forma exogena y/o una celula cuya composition genetica se ha alterado mediante la introduction de una molecula exogena de acido nucleico.

Como se usa en este documento, el termino "tumor" se refiere a un tejido que comprende celulas transformadas que crecen de forma incontrolable. Un tumor puede ser benigno (tumor benigno) o maligno (tumor maligno o cancer). Los tumores incluyen, leucemia, linfomas, mielomas, plasmacitomas, y similares; y tumores solidos. Ejemplos de tumores solidos que pueden tratarse de acuerdo con la invention incluyen sarcomas y carcinomas tales como, aunque sin limitacion: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesiotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudoriparas, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcitico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningiona, melanoma, neuroblastoma, neuroglioma, y retinoblastoma.

El termino "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la materia, que dependera en parte del modo en que se mide o determina el valor, por ejemplo, las limitaciones del sistema de medicion. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar dentro de 1 o mas de 1 desviaciones tipicas, segun la practica en la tecnica. Como alternativa "aproximadamente" puede significar un intervalo de hasta el 20 %, preferiblemente hasta el 10 %, mas preferiblemente hasta el 5 %, y mas preferiblemente hasta el 1 % de un valor dado. Como alternativa, particularmente con respecto a sistemas o procesos biologicos, el termino puede significar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente en 5 veces, y mas preferiblemente en 2 veces de un valor. Cuando se describen valores particulares en la solicitud y reivindicaciones, debe asumirse que, salvo que se indique de otro modo, el termino "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.

Como se usa en este documento, "vehiculo" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, vehiculos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion, tampones, soluciones de vehiculo, suspensiones, coloides, y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmaceuticas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que sea compatible cualquier medio o agente convencional con el ingrediente activo, se contempla su uso en las

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composiciones terapeuticas. Tambien pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

La expresion "farmaceuticamente aceptable" o "farmacologicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion alergica o adversa similar cuando se administra a un ser humano. La preparacion de una composition acuosa que contiene una proteina como ingrediente activo es bien comprendida en la tecnica. Normalmente, dichas composiciones se preparan como inyectables, como soluciones liquidas o suspensiones; tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para solution en, o suspension en, liquido antes de inyeccion.

Como se usa en este documento, la expresion "secuencia o gen heterologo" significa una secuencia de acido nucleico (ARN o ADN), que no se encuentra de forma natural en asociacion con las secuencias de acido nucleico de la molecula especificada, por ejemplo, un genoma de papilomavirus. La siguiente section proporciona mayor detalle sobre algunos enfoques que pueden usarse para preparar particulas tipo virus y pseudovirus.

Preparacion de particulas tipo virus y pseudovirus

La expresion "particula tipo virus" ("VLP") se refiere a una estructura organizada que comprende series ordenadas de autoensamblaje de una o mas proteinas de capsida virica que no incluyen un genoma virico. Por ejemplo, pueden prepararse VLP que tienen la proteina de capsida L1 de papilomavirus solamente, o que tienen ambas proteinas de capsida L1 y L2 juntas. Los metodos usados para preparar particulas de capsida recombinantes para muchos papilomavirus son conocidos en la tecnica. Algunos enfoques se describen, por ejemplo, en la publication de patente de Estados Unidos n.° 2006/0269954.

La expresion "proteina recombinante" se refiere a una proteina que se produce usando tecnicas de biologia molecular, por ejemplo, tecnologia de ADN recombinante. Como un ejemplo, "proteina recombinante" puede referirse a una proteina procedente de un acido nucleico modificado por ingenieria genetica, tal como una "construction de acido nucleico recombinante". Cualquier proteina, peptido, o polipeptido puede estar codificado por una construccion de acido nucleico modificada por ingenieria o construccion de acido nucleico recombinante. La expresion "expresion proteica" se refiere a los procesos de transcription y traduction de acidos nucleicos para producir polipeptidos.

"Pseudovirus" o "pseudovirus de papiloma" o "vectores de transferencia genica de papilomavirus" se refieren a una o mas proteinas de capsida de papilomavirus que se ensamblan y empaquetan acidos nucleicos heterologos (por ejemplo, ADN) con o sin acidos nucleicos viricos (por ejemplo, ADN) en particulas infecciosas. Los metodos usados para producir pseudovirus de papiloma son conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 6.599.739, 7.205.126, y 6.416.945; y en Buck y Thomspon, Production of Papillomavirus-Based Gene Transfer Vectors. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, diciembre de 2007.

La expresion "estructura capsomerica" o "capsida" o "particula de capsida" incluye VLP y pseudovirus. La siguiente seccion describe algunas de las realizaciones de diagnostico contempladas.

Diagnosticos

Algunas realizaciones descritas en este documento se refieren a metodos para detectar la presencia de celulas cancerosas unidad a pseudovirus de papiloma o VLP de papiloma. Algunos enfoques implican identificar un sujeto que tiene o sospechoso de tener celulas cancerosas, administrar al sujeto una cantidad detectable de un pseudovirus o vLp de papiloma que comprende un marcador detectable, y detectar la presencia de celulas cancerosas unidas a un pseudovirus o VLP de papiloma que comprende un marcador detectable.

Otras realizaciones descritas en este documento se refieren a metodos para detectar la presencia de afecciones premalignas (por ejemplo, displasia, o enfermedad hiperproliferativa). Algunos enfoques implican identificar un sujeto que tiene o sospechoso de tener una afeccion premaligna, administrar al sujeto una cantidad detectable de un pseudovirus o VLP de papiloma que comprende un marcador detectable y detectar la presencia de celulas premalignas unidas a un pseudovirus o VLP de papiloma que comprende un marcador detectable.

Realizaciones descritas en este documento se refieren a metodos para identificar todos los tipos de canceres, tumores, metastasis, y afecciones premalignas (por ejemplo, displasia o enfermedad hiperproliferativa). Aunque sin el deseo de limitarse a teoria particular alguna, se cree que el pseudovirus o VLP de papiloma se une selectivamente a y suministra el marcador a celulas cancerosas sin unirse a celulas normales en tejidos intactos, donde la cantidad de celulas normales en tejidos intactos unidas al pseudovirus o VLP es de menos o igual al 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %. 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,09 %, 0,08 %, 0,07 %, 0,06 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 %, o 0,01 % de la cantidad total de celulas unidas por el pseudovirus o VLP.

El marcador detectable puede ser un gen indicador portado dentro del pseudovirus de papiloma o un marcador acoplado quimicamente a una proteina de capsida del pseudovirus o VLP de papiloma.

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Genes indicadores

Como los vectores pseudovmcos de papiloma son vectores de transferencia genica, se contempla que las celulas cancerosas puedan marcarse selectivamente con genes indicadores que estan incorporados en el pseudovirus. Como se usa en este documento un "indicador" o un "gen indicador" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transcribirse como ARNm cuando esta unida de forma funcional a un promotor, excepto que la expresion "gen indicador" como se usa en este documento, no pretende incluir secuencias de papilomavirus de tipo silvestre. Genes indicadores preferidos incluyen luciferasa (por ejemplo, luciferasa de luciernaga o luciferasa de Renilla), pgalactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), timidina quinasa (TK), y proteinas fluorescentes (por ejemplo, proteina verde fluorescente, proteina roja fluorescente, proteina amarilla fluorescente, proteina azul fluorescente, proteina cian fluorescente, o variantes de las mismas, incluyendo variantes potenciadas).

Estos genes pueden incorporarse en pseudovirus de papiloma usando tecnicas bien conocidas para los expertos en la materia. Se describen metodos adecuados, por ejemplo, en Buck y Thomspon, Production of Papillomavirus- Based Gene Transfer Vectors. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, diciembre de 2007, que se incorpora expresamente por la presente por referencia en su totalidad.

Cualquier secuencia de acido nucleico indicadora puede usarse como gen indicador si es detectable por un ensayo indicador. Los ensayos indicadores incluyen cualquier metodo conocido para detectar una secuencia de acido nucleico o su producto proteico codificado directa o indirectamente. Pueden realizarse ensayos indicadores in vitro o in vivo. Por ejemplo, un ensayo indicador puede medir el nivel de expresion o actividad del gen indicador midiendo el nivel de ARNm indicador, el nivel de proteina indicadora, o la cantidad de actividad de proteina indicadora. El nivel de ARNm indicador puede medirse, por ejemplo, usando RT-PCR, tincion con bromuro de etidio de un gel convencional de ARN, transferencia de Nortern, extension de cebador, o ensayo de proteccion con nucleasa. El nivel de proteina indicadora puede medirse, por ejemplo, usando quimioluminiscencia, analisis microscopico, tincion con Coomassie de un gel de SDS-PAGE, transferencia de Western, transferencia dot blot, transferencia slot blot, ELISA, o RIA. La actividad de proteina indicadora puede medirse usando un ensayo especifico para el indicador que se esta usando. Por ejemplo, ensayos convencionales para luciferasa, CAT, pgalactosidasa, ensayos de timidina quinasa (TK) (incluyendo escaneres del cuerpo completo; vease Yu, Y. et al. (2000) Nature Medicine 6:933-937 and Blasberg, R. (2002) J. Cereb. Blood Flow Metab. 22:1157-1164), y proteinas fluorescentes son todos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, puede usarse un dispositivo de imagenes Maestro (CRi, Woburn, MA) para detectar la expresion de gen indicador.

La presencia del marcador puede detectarse en el sujeto usando metodos conocidos en la tecnica para exploracion in vivo. Estos metodos dependen del tipo de marcador usado, los expertos en la materia son capaces de determinar el metodo apropiado para detectar un marcador particular. Metodos y dispositivos que pueden usarse en los metodos de diagnostico de la invention incluyen, aunque sin limitation, tomografia computerizada (CT), escaner de cuerpo completo tal como tomografia de emision de positrones (PET), tomografia de emision de fotones individuales (SPECT), imagenes por resonancia magnetica (MRl), sonografia, quimioluminiscencia, y el sistema de imagenes in vivo Maestro™ (CRi, Inc.). La exploracion in vivo puede realizarse en una region local del sujeto (por ejemplo, puede explorarse el area esofagica) o puede realizarse escaner del cuerpo completo.

Las celulas cancerosas que expresan los marcadores geneticos suministrados por pseudovirus pueden identificase del siguiente modo: para el gen HSV-tk, puede suministrarse al sujeto 9-[(4[18F]fluoro-3-hidroximetilbutil)guanina radiomarcada (FHBG), administrada por via intravenosa, aproximadamente 6000 |jCi/Kg de peso corporal del destinatario (disponible en el mercado de PET Imaging Science Center, U. of South California). La expresion de la actividad HSV-tk en celulas cancerosas provoca la acumulacion de FHBG radiomarcada y puede controlarse por tomografia de emision de positrones (PET). Las celulas cancerosas que expresan GFP en in vitro pueden controlarse por examen microscopico de fluorescencia de secciones tisulares. Las secciones tisulares de celulas cancerosas que expresan Fluc o Rluc pueden controlarse por camaras por dispositivos refrigerados de carga acoplada (CCD) in vivo (disponibles en el mercado en Xenogen Corp., Alamenda, Calif). La actividad D2R puede identificarse administrando 3-(2-[18F]fluoroetil)espiperona ([18F]FESP) y controlarse por PET. La siguiente section describe ejemplos de marcadores que pueden acoplarse quimicamente a pseudovirus o VLP y ejemplos de metodos que pueden usarse para acoplar quimicamente marcadores a pseudovirus o VLP.

Marcadores acoplados quimicamente

Algunas realizaciones tambien se refieren a metodos de identification de canceres, tumores, metastasis y afecciones premalignas usando pseudovirus o VLP de papiloma marcados mediante acoplamiento quimico. Los marcadores acoplados quimicamente incluyen, aunque sin limitacion, colorantes fluorescentes, fosforos, radionuclidos, y otras moleculas conocidas en la tecnica que pueden detectarse directa o indirectamente.

Ejemplos de colorantes fluorescentes incluyen, aunque sin limitacion, 7-amino-actinomicina D, naranja de acridina, amarillo de acridina, colorantes Alexa Fluor (Molecular Probes), auramina O, tinte auramina-rodamina, benzantrona,

9.10- bis(feniletinil)antraceno, 5,12-bis(feniletinil)naftaceno, CFDA-SE, CFSE, calceina, carboxifluoresceina, 1-cloro-

9.10- bis(feniletinil)antraceno, 2-cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno, cumarina, cianina, DAPI, Dark quencher, Dioc6,

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colorantes DyLight Fluor (Thermo Fisher Scientific), bromuro de etidio, fluorescema, fura-2, fura-2-acetoximetil ester, protema fluorescente verde y derivados, colorantes Hilyte Fluor (AnaSpec), tinte Hoechst, amarillo Indian, luciferina, perileno, ficobilina, ficoeritrina, ficoeritrobilina, yoduro de propidio, piranina, rodamina, RiboGreen, rubreno, tris(batofenantrolina disulfonato) de rutenio (II)), SYBR Green, estilbeno, sulforrodamina 101, TSQ, Texas Red, umbeliferona, o proteina amarilla fluorescente.

Ejemplos de fosforos incluyen, aunque sin limitacion, fosforo, antraceno, fluoruro de bario, germanato de bismuto, sulfuro de cadmio, tungstato de cadmio, oxisulfuro de gadolinio, bromuro de lantanio, poliviniltolueno, scheelita, yoduro de sodio, estilbeno, aluminato de estroncio, granate de aluminio e itrio, selenuro de zinc, o sulfuro de zinc.

Ejemplos de marcadores radioisotopicos adecuados incluyen, aunque sin limitacion, 3H, 251I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 186Re, 188Re, o 212Bi. Pseudovirus o VLP radiomarcados preferibles son capaces de suministrar mas de 6000 rads al tumor y tienen suficiente afinidad de modo que la medula osea del paciente no se expone a mas de 300 rads. En algunas realizaciones, 100, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, o 10000 rads a las celulas cancerosas. Por ejemplo, 1311 marcado acoplado a la superficie de pseudovirus o VLP es un ejemplo de un pseudovirus o VLP radiomarcado dentro del alcance de estas realizaciones. El uso de pseudovirus o VLP marcados con 1311 asi como otros pseudovirus o VLP radiomarcados, tambien esta dentro del alcance de estas realizaciones. Los pseudovirus o VLP pueden radiomarcarse, por ejemplo, mediante el metodo de yodogen de acuerdo con metodos establecidos.

La deteccion puede suceder in vitro o in vivo. Por ejemplo, pueden acoplarse colorantes fluorescentes (por ejemplo, Alexa Fluor 488) al pseudovirus por metodos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Buck y Thomspon, Production of Papillomavirus-Based Gene Transfer Vectors. Current Protocols in Cell Biology 26.1.1-26.1.19, diciembre de 2007).

En algunas realizaciones, se acopla quimicamente un compuesto de imagenes radiactivas a los pseudovirus o VLP. Pueden acoplarse rastreadores quimicos radiactivos que emiten radiacion tales como rayos gamma a los pseudovirus o VLP para proporcionar informacion de diagnostico. En el caso de capas forradas de oxido de itrio, puede anadirse un emisor de positrones tal como 87Y para permitir la formacion de imagenes. En el caso de fosfato de lantanio, existen diversos emisores gamma que pueden usarse para anadir un componente de imagenes al componente de tratamiento.

Un marcador puede acoplarse quimicamente directamente al pseudovirus o VLP (por ejemplo, sin un grupo enlazador) a traves de un grupo amino, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo, o un grupo carboxilo.

En algunas realizaciones, se fija un marcador al pseudovirus o VLP mediante un grupo enlazador. El grupo enlazador puede ser cualquier grupo enlazador biocompatible, donde "biocompatible" indica que el compuesto o grupo puede ser no toxico y puede utilizarse in vitro o in vivo sin causar lesion, dolencia, enfermedad, o muerte. El marcador puede unirse al grupo enlazador, por ejemplo, mediante un enlace eter, un enlace ester, un enlace tiol o un enlace amida. Grupos enlazadores biocompatibles adecuados incluyen, aunque sin limitacion, un grupo ester, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un carbohidrato, un grupo succinimida (incluyendo, por ejemplo, succinimidil succinato (SS), succinimidil propionato (SPA), succinimidil butanoato (SBa), succinimidil carboximetilato (SCM), succinimidil succinamida (SSA) o N-hidroxi succinimida (NHS)), un grupo epoxido, un grupo oxicarbonilimidazol (incluyendo, por ejemplo, carbonildimidazol (CDI)), un grupo nitrofenilo (incluyendo, por ejemplo, nitrofenil carbonato (NPC) o triclorofenil carbonato (TPC)), un grupo trisilato, un grupo aldehido, un grupo isocianato, un grupo vinilsulfona, un grupo tirosina, un grupo cisteina, un grupo histidina o una amina primaria.

Los marcadores acoplados quimicamente pueden detectarse usando cualquiera de los metodos descritos para detectar genes indicadores. En una realizacion, el pseudovirus o VLP de papiloma se marca con un radioisotopo y se detecta en el paciente usando un instrumento quirurgico sensible a radiacion (Thurston et al., patente de Estados Unidos n.° 5.441.050). En otra realizacion, el pseudovirus o VLP de papiloma se marca con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente usando un instrumento de exploracion sensible a fluorescencia. En otra realizacion, el pseudovirus o VLP de papiloma se marca con un metal emisor de positrones y se detecta en el paciente usando tomografia de emision de positrones. En otra realizacion mas, el pseudovirus o VLP de papiloma se marca con un marcador paramagnetico y se detecta en un paciente usando imagenes de resonancia magnetica (MRI). La siguiente seccion proporciona mayor detalle sobre algunas realizaciones que pueden usarse para controlar la terapia contra el cancer.

Control de la terapia contra el cancer

La expresion "control de la terapia contra el cancer" se refiere a determinar la cantidad relativa de celulas cancerosas en el cuerpo de un paciente antes, durante y/o despues de terapia antineoplasica.

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Algunas realizaciones descritas en este documento se refieren a metodos para controlar el progreso o eficacia de la terapia contra el cancer en un sujeto. A sujetos identificados como que tienen cancer y estan experimentando terapia contra el cancer se les puede administrar pseudovirus o VLP de papiloma que incluyen marcadores descritos anteriormente.

Puede administrate a los sujetos un pseudovirus o VLP de papiloma que incluye un marcador antes del inicio del tratamiento o durante el tratamiento. Pueden ensayarse las celulas que contienen el marcador y esta medicion puede compararse con una obtenida en un momento posterior durante la terapia y/o despues de que se haya completado la terapia. De este modo, es posible evaluar la inhibicion de la proliferacion de las celulas cancerosas, y la eficacia de la terapia. Como solamente las celulas cancerosas vivas contendran el marcador, la terapia puede continuar hasta que se detecte una cantidad minima de marcador.

Algunas realizaciones descritas en este documento tambien se refieren a metodos para determinar la cantidad de celulas cancerosas presentes en un sujeto. Detectando el marcador, se puede determinar si hay celulas cancerosas presentes en el sujeto y la cantidad de marcador medida proporcional a la cantidad de celulas cancerosas presentes en el sujeto.

Kits de diagnostico y terapeuticos

Algunas realizaciones incluyen metodos que utilizan los pseudovirus o VLP en kits para la detection y/o tratamiento de tumores. Los kits se basan en la especificidad potenciada del pseudovirus o VLP hacia celulas cancerosas en lugar de celulas no cancerosas.

Los kits de diagnostico pueden comprender una cantidad eficaz de un pseudovirus o VLP de papiloma marcado. Los kits pueden comprender adicionalmente una cantidad apropiada de celulas de control no cancerosas. El pseudovirus, VLP y/o celulas pueden suministrarse congelados, liofilizados o cultivados en medio solido o liquido. Los kits de diagnostico pueden comprender adicionalmente ingredientes inertes y otros componentes del kit tales como viales, aplicadores, componentes de embalaje y similares, que son conocidos para los expertos en la materia.

En una realizacion, puede ensamblarse un kit para la deteccion de diagnostico de cancer cervical. El kit puede incluir un pseudovirus o vLp de papiloma que incluye un marcador (por ejemplo, un marcador fluorescente). El pseudovirus o VLP puede estar presente en el kit en un medio liquido que puede aspirarse sobre la mucosa cervicovaginal de un sujeto. Despues de un periodo de incubation para permitir que el pseudovirus o VLP se fije selectivamente a las celulas cancerosas sospechosas, puede lavarse la mucosa cervicovaginal para retirar el exceso de pseudovirus o VLP no unido. Posteriormente, puede usarse un dispositivo de deteccion (por ejemplo, un dispositivo de deteccion fluorescente) para detectar y/o medir el marcador incluido en el pseudovirus o VLP. La deteccion del marcador indicara la presencia de celulas cancerosas.

Aplicaciones biomedicas

Realizaciones descritas en este documento tambien se refieren a metodos de inhibicion selectiva de la proliferacion de celulas cancerosas (o celulas pre-malignas) y/o elimination de celulas cancerosas (o celulas pre-malignas) sin inhibir la proliferacion de y/o eliminacion de celulas normales. En algunos enfoques, se identifica a un sujeto que tiene cancer usando tecnicas clinicas o de diagnostico conocidas en la tecnica. Al sujeto despues se le proporciona una cantidad inhibidora de pseudovirus o VLP de papiloma que incluye un agente terapeutico. Como el pseudovirus o VLP de papiloma se fija selectivamente a celulas cancerosas, puede proporcionarse una terapia muy centrada y sensible contra el cancer. En algunas realizaciones, puede tratarse una afeccion pre-maligna usando metodos descritos en este documento.

En algunos contextos, la expresion "inhibicion selectiva" o "inhibicion especifica" indica que la cantidad de celulas normales que muestran una inhibicion de la proliferacion o se eliminan es de menos de o igual al 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %. 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,09 %, 0,08 %, 0,07 %, 0,06 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 %, 0,01 %, 0,001 %, 0,0001 %, 0,00001 %, o 0 % de la cantidad total de celulas que se ha puesto en contacto con el pseudovirus o VLP de papiloma o en un sitio de inoculation (por ejemplo, un sitio de 1 cm2, 1 mm2, 1 |jm2, o 1 nm2). Una determination de inhibicion especifica, union especifica, o inhibicion selectiva o union selectiva de pseudovirus o VLP a celulas cancerosas o celulas pre-malignas puede determinarse por un intervalo de metodos conocidos en la tecnica o como se describe en este documento (por ejemplo, ensayos de union competitiva o analisis de Scatchard). En algunos contextos, la union especifica, inhibicion especifica, o union selectiva o inhibicion selectiva puede determinarse por mera observation, como se muestra en el Ejemplo 11.

Genes terapeuticos

Los genes terapeuticos incluyen, aunque sin limitation, genes terapeuticos, proteinas codificadas por genes terapeuticos, citotoxinas, y radionuclidos. Los genes terapeuticos incluyen, aunque sin limitacion, genes supresores tumorales, genes pro-apoptoticos, citoquinas, enzimas, hormonas, y genes inmunomoduladores.

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Un "gen terapeutico" se refiere a un gen que puede administrate a un sujeto con el fin de tratar o prevenir una enfermedad. Por ejemplo, un gen terapeutico puede ser un gen administrado a un sujeto para el tratamiento del cancer. Ejemplos de genes terapeuticos incluyen, aunque sin limitacion, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C- CAM, APC, CTS-1, zacl, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-1, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, GM-CSF, G-CSF, timidina quinasa, mda7, fus, interferon alfa, interferon beta, interferon gamma, ADP, p53, ABL1, BLC1, BLC6, CBFA1, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETS2, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TCL3, YES, MADH4, RBI, TP53, WT1, TNF, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAI, ApoAIV, ApoE, Rap1A, citosina desaminasa, Fab, ScFv, BRCA2, zacl, ATM, HIC-1, DPC- 4, FHIT, PTEN, ING1, NOEY1, NOEY2, OVCA1, MADR2, 53BP2, IRF-1, Rb, zacl, DBCCR-1, rks-3, COX-1, TFPI, PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, E1A, p300, VEGF, FGF, trombospondina, BAI-1, GDAIF, o MCC.

En ciertas realizaciones, el gen terapeutico puede ser un gen supresor tumoral. Un gen supresor tumoral se refiere a un gen, cuando esta presente en una celula, reduce la tumorigenicidad, malignidad, o fenotipo hiperproliferativo de la celula. Esta definicion incluye tanto la secuencia de acido nucleico de longitud completa del gen supresor tumoral, asi como secuencias de longitud no completa de cualquier longitud derivadas de las secuencias de longitud completa. Debe entenderse adicionalmente que la secuencia incluye los codones degenerados de la secuencia o secuencias nativas que pueden introducirse para proporcionar preferencia de codones en una celula hospedadora especifica.

Ejemplos de acidos nucleicos supresores tumorales dentro de esta definicion incluyen, aunque sin limitacion, APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, Uteroglobina, Skp2, BRCA-1, BRCA- 2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MEN1, MEN2, MTS1, NF1, NF2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zacl, scFV, MAC1, FCC, MCC, Gen 26 (CACNA2D2), PL6, Beta* (BLU), Luca-1 (HYAL1), Luca-2 (HYAL2), 123F2 (RASSF1), 101F6, Gen 21 (NPRL2), o un gen que codifica un polipeptido SEM A3 y fUsi. Se describen otros genes supresores tumorales ejemplares en bases de datos disponibles al publico de genes supresores tumorales. Acidos nucleicos que codifican genes supresores tumorales, como se ha analizado anteriormente, incluyen genes supresores tumorales, o acidos nucleicos derivados de los mismos (por ejemplo, ADNc, ARNc, ARNm, y subsecuencias de los mismos que codifican fragmentos activos de las secuencias respectivas de aminoacidos supresores tumorales), asi como vectores que comprenden estas secuencias. Un experto en la materia estaria familiarizado con los genes supresores tumorales que pueden aplicarse en las realizaciones.

En ciertas realizaciones, el gen terapeutico puede ser un gen que induce apoptosis (es decir, un gen pro-apoptotico). Una "secuencia de aminoacidos de gen pro-apoptotico" se refiere a un polipeptido que, cuando esta presente en una celula, induce o promueve la apoptosis. La presente invencion contempla la inclusion de cualquier gen pro- apoptotico conocido para los expertos en la materia. Genes pro-apoptoticos ejemplares incluyen CD95, caspasa-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PERP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK, BID, y mda7. Un experto en la materia estaria familiarizado con los genes pro-apoptoticos, y otros de dichos genes no expuestos especificamente en este documento que pueden aplicarse en los metodos y composiciones de la presente invencion.

El gen terapeutico tambien puede ser un gen que codifica una citoquina. El termino "citoquina" es un termino generico para proteinas liberadas por una poblacion de celulas que actuan sobre otra celula como mediadores intercelulares. Una "citoquina" se refiere a un polipeptido que, cuando esta presente en una celula, mantiene alguna o toda la funcion de una citoquina. Esta definicion incluye secuencias de longitud completa, asi como no de longitud completa de cualquier longitud derivada de las secuencias de longitud completa. Debe entenderse adicionalmente, como se ha analizado anteriormente, que la secuencia incluye los codones degenerados de la secuencia o secuencias nativas que pueden introducirse para proporcionar preferencia de codones en una celula hospedadora especifica.

Ejemplos de dichas citoquinas incluyen, aunque sin limitacion, linfoquinas, monoquinas, factores de crecimiento y hormonas polipeptidicas tradicionales. Incluidas entre las citoquinas estan las hormonas del crecimiento tales como hormona humana del crecimiento, hormona humana del crecimiento con N-metionilo, y hormona bovina del crecimiento; hormona paratiroides; tiroxina; insulina, proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glucoproteicas tales como hormona foliculo estimulante (FSH), hormona estimulante de tiroides (TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepatico; prostaglandina, factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactogeno placentario, proteina OB; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mulleriana; peptido asociado con gonadotropina de raton; inhibina; activina; factor de crecimiento del endotelio vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor-I y -II de crecimiento tipo insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferon-alfa, -beta, y -gamma; factores estimuladores de colonias (CS-Fs) tales como macrofago-CSF (M-CSF); granulocito-macrofago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G- CSF); interleuquinas (IL) tales como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL- 10IL-11, IL-12; IL- 13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-24 LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, ligando-kit o FLT-3.

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Otros ejemplos de genes terapeuticos incluyen genes que codifican enzimas. Ejemplos incluyen, aunque sin limitacion, ACP desaturasa, una ACP hidroxilasa, una ADP-glucosa pirofosforilasa, una ATPasa, una alcohol deshidrogenasa, una amilasa, una amiloglucosidasa, una catalasa, una celulasa, una ciclooxigenasa, una decarboxilasa, una dextrinasa, una esterase, una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, una hialuron sintasa, una galactosidasa, una glucanasa, una glucosa oxidasa, una GTPasa, una helicasa, una hemicelulasa, una hialuronidasa, una integrasa, una invertasa, una isomerasa, una quinasa, una lactasa, una lipasa, una lipoxigenasa, una liase, una lisozima, una pectinesterasa, una peroxidasa, una fosfatasa, una fosfolipasa, una fosforilasa, una poligalacturonasa, una proteinasa, una peptideasa, una pulanasa, una recombinasa, una transcriptasa inversa, una topoisomerasa, una xilanasa, un gen indicador, una interleuquina, o una citoquina.

Ejemplos adicionales de genes terapeuticos incluyen el gen que codifica la carbamoil sintatesa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liase, arginasa, fumarilacetoacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, alfa-1 antitripsina, glucosa-6-fosfatasa, receptor de lipoproteina de baja densidad, porfobilinogeno desaminasa, factor VIII, factor IX, cistation beta-sintasa, cetoacido de cadena ramificada descarboxilasa, albumina, isovaleril-CoA deshidrogenasa, propionil CoA carboxilasa, metil malonil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilasa, fosforilasa hepatica, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilasa, H-proteina, T-proteina, ATPasa transportadora de cobre de enfermedad de Menkes, ATPasa de transporte de cobre de enfermedad de Wilson, citosina desaminasa, hipoxantine-guanina fosforribosil- transferasa, galactosa-1-fosfato uridiltransferasa, fenilalanina hidroxilasa, glucocerebrosidasa, esfingomielinasa, alfa- L-iduronidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, timidina quinase de HSV, o timidina quinase humana.

Genes terapeuticos tambien incluyen genes que codifican hormonas. Ejemplos incluyen, aunque sin limitacion, genes que codifican la hormona del crecimiento, prolactina, lactogeno placentario, hormona luteinizante, horma foliculo estimulante, gonadotropina corionica, hormona estimulante de tiroides, leptina, adrenocorticotropina, angiotensina I, angiotensina II, beta-endorfina, hormona estimulante de beta-melanocitos, colecistoquinina, endotelina I, galanina, peptido inhibidor gastrico, glucagon, insulina, lipotropinas, neurofisinas, somatostatina, calcitonina, peptido relacionado con el gen de calcitonina, peptido relacionado con el gen de beta-calcitonina, factor de hipercalcemia de neoplasia, proteina relacionada con hormona paratiroides, proteina relacionada con hormana paratiroides, peptido tipo glucagon, pancreastatina, peptido pancreatico, peptido YY, PHM, secretina, peptido intestinal vasoactivo, oxitocina, vasopresina, vasotocina, encefalinamida, metorfinamida, hormona estimuladora de alfa melanocitos, factor natriuretico atrial, amilina, componente amiloide P, hormona liberadora de corticotropina, factor liberador de hormona del crecimiento, hormona liberadora de hormona luteinizante, neuropeptido Y, sustancia K, sustancia P, u hormona liberadora de tirotropina.

Un "acido nucleico o gen inmunoestimulador" como se usa en este documento es cualquier acido nucleico que contenga un motivo o estructura inmunoestimuladora que induzca una respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria puede caracterizarse como, aunque sin limitacion, una respuesta inmunitaria tipo Th1 o una respuesta inmunitaria tipo Th2. Dichas respuestas inmunitarias se definen por perfiles de citoquinas y produccion de anticuerpos que se provocan por las celulas inmunitarias activadas.

Ejemplos de los genes inmunomoduladores incluyen quimioquinas, moleculas adhesivas, citoquinas, moleculas co- estimuladoras, factores del crecimiento, y moleculas receptoras. Las quimioquinas incluyen MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, IL-8 y MCP-1, Ejemplos de las moleculas adhesivas incluyen construcciones de la familia de selectina, moleculas tipo mucina, construcciones de la familia de integrina, y construcciones de la superfamilia de inmunoglobulina. Ejemplos de las construcciones de la familia de selectina incluyen L-selectina, P-selectina, y E- selectina. Las moleculas tipo mucina son ligandos para las construcciones de la familia de selectina. Ejemplos de la molecula tipo mucina incluyen CD34, GlyCAM-1, y MadCAM-1, Ejemplos de las construcciones de la familia de integrina incluyen LFA-1, VLA-1, Mac-1, y pl50,95, Ejemplos de las construcciones de la superfamilia de inmunoglobulina incluyen PECAM-1, ICAM (ICAM-1, ICAM-2, y ICAM-3), CD2, y LFA-3, Ejemplos de las citoquinas incluyen mutantes de M-CSF, GM-CSF, G-CSF, CSF, IL-4, e iL-18 (incluyendo delecion de los aproximadamente 35 primeros restos de aminoacido que estan presentes en el precursor de una proteina pero no estan presentes en la proteina en la forma madura). Ejemplos de moleculas co-estimuladoras incluyen B71, B72, CD40 y ligandos de CD40 (CD40L). Ejemplos factores del crecimiento incluyen IL-7, factores de crecimiento nervioso, y un factor de crecimiento del endotelio vascular. Ejemplos de las moleculas receptoras incluyen un producto de expresion genica letal Fas, un receptor del factor de necrosis tumoral TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, y DR6. Las composiciones de la presente invencion pueden contener caspasa (ICE).

Los genes terapeuticos tambien incluyen genes que codifican polipeptidos que son citotoxicos para las celulas cancerosas. Las proteinas citotoxicas incluyen, aunque sin limitacion, ricina, toxina de hierba carmin, toxina A difterica, saporina, gelonina, y exotoxina A de pseudomonas.

Como entenderan los expertos en la materia, la expresion "gen terapeutico" incluye secuencias genomicas, secuencias de ADNc, y segmentos genicos modificados por ingenieria mas pequenos que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteinas, polipeptidos, dominios, peptidos, proteinas de fusion, y mutantes. La molecula de acido nucleico que codifica un gen terapeutico puede comprender una secuencia contigua de acido nucleico de

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aproximadamente 5 a aproximadamente 12000 o mas nucleotidos, nucleosidos, o pares de bases.

Agentes terapeuticos acoplados guimicamente

Realizaciones descritas en este documento tambien se refieren a metodos de inhibicion de la proliferacion de canceres, tumores y metastasis usando pseudovirus o VLP de papiloma acoplados quimicamente a agentes terapeuticos. Los agentes terapeuticos acoplados quimicamente incluyen, aungue sin limitacion, proteinas terapeuticas como se ha descrito anteriormente, citotoxinas, y radionuclidos.

Las citotoxinas incluyen, aungue sin limitacion, ricina, toxina de hierba carmin, toxina A difterica, saporina, gelonina, y exotoxina A de pseudomonas.

En una realizacion, los pseudovirus o VLP de papiloma pueden acoplarse a una particula de radionuclido. El pseudovirus o VLP puede fijarse a un sitio de union en las celulas cancerosas diana, y el radionuclido puede administrarse a una dosis letal de radiacion. La estrategia basica del tratamiento con radionuclidos es gue el acoplamiento de un radionuclido al pseudovirus o VLP causa acumulacion potenciada del radionuclido en el sitio diana. La acumulacion del radionuclido en el sitio diana causa gue se suministre radioterapia al sitio diana con un radio gue se aproxima a la longitud media de paso de la particula emitida.

Varios radionuclidos diferentes pueden considerarse para terapia. La eleccion del radionuclido tiene en cuenta las caracteristicas fisicas y guimicas del radionuclido, incluyendo semivida, propiedades de emision de radiacion, propiedades de radiomarcaje, disponibilidad, distribucion in vivo y estabilidad. Los radionuclidos adecuados poseen una semivida suficientemente larga para la localizacion de la diana, poca o ninguna radiacion gamma, energia intermedia de particulas beta, productos hijo estables, y fijacion estable con un sistema de anticuerpo. Estan disponibles muchos radionuclidos gue emiten particulas-p. Estos incluyen, por ejemplo, itrio-90 (90Y), yodo-131 (1311), cobre-67 (67Cu) y renio-186 1i86Re). Los radionuclidos gue emiten particulas alfa (a) incluyen astatina-211 (21 lAt), y bismuto-212 (212Bi). Los emisores alfa y beta son preferidos porgue los enlaces de paso medio estan limitados a docenas de mm, limitando de ese modo el tratamiento a las cercanias inmediatas de la diana. Las particulas beta pueden ser mas adecuadas para tumores mas grandes debido a la longitud de paso medio mas largo de la emision beta. Las particulas alfa generalmente tienen energias extremadamente altas (mayores de 5 MeV) y tasas altas de transferencia de energia lineal, gue son utiles para suministrar altas dosis a un area limitada.

Realizaciones adicionales descritas en este documento se refieren a combinaciones de metodos de diagnostico y/o terapeutico descritos en este documento. Por ejemplo, pueden construirse pseudovirus gue comprenden un gen terapeutico y un radionuclido. En otras realizaciones, pueden construirse pseudovirus gue comprenden ARN oligo T y gen terapeutico.

Profarmacos

El termino "profarmaco" como se usa en este documento se refiere a un farmaco gue es inactivo segun esta y se vuelve activo cuando se cambia guimicamente en el cuerpo por una enzima metabolizadora de farmacos (por ejemplo, derivados de purina y pirimidina usados como agentes guimioterapeuticos para el cancer). Ejemplos de los profarmacos de este documento incluyen preferiblemente ganciclovir, aciclovir, taxol, camptotecina, derivados nucleosidicos de guanina (por ejemplo, A-5021), y similares. Un profarmaco en este documento preferible para la presente invencion es un profarmaco gue se convierte en una forma activa mediante un gen suicida contenido en un pseudovirus o VLP de papiloma.

La expresion "gen suicida" como se usa en este documento se refiere a un gen gue puede eliminar la celula en gue se expresa. De forma representativa, dicho gen es un gen metabolicamente toxico. Por ejemplo, en este documento se ejemplifica un metodo para introducir un gen suicida incorporado en una construccion de pseudovirus o VLP en celulas cancerosas para dirigirlas a suicidio. Por ejemplo, puede incorporarse timidina guinasa en un pseudovirus o VLP.

ARN oligo T para inducir regresion tumoral

Las vacunas terapeuticas antitumorales y terapia genica citotoxica antitumoral han producido exito clinico limitado, a pesar de los esfuerzos extensivos. Un unico enfogue gue podria combinar las dos actividades podria conducir a terapia antitumoral mas eficaz. Para conseguir esto, se construyo un vector de transferencia genica gue expresa ARN oligo T. En algunas realizaciones, el ARN se expresa a partir de un promotor, por ejemplo, un promotor de Pol III, como parte de un pseudogenoma de papilomavirus despues de transduccion de PsV. Este ARN no estara poliadenilado pero formara un duplex con las colas poli A de los ARNm celulares. Los ARN bicatenarios asi generados pueden conducir a citotoxicidad mediante la activacion de apoptosis mediada por PKR e inmunidad a traves de la activacion de TLR 3. El pegueno tamano y la funcion doble de este casete de expresion dejan abierta la posibilidad de expresar otros genes en el pseudogenoma de hasta 8 kb. Podrian cotransducirse genes para aumentar la inmunogenicidad, tales como GMCSF, o citotoxicidad, tales como TK, mediante el PsV oligo T. Los PsV oligo T no pueden producirse de forma eficaz en la mayoria de las celulas ya gue el oligo T se generaria en las

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celulas productoras de PsV y por tanto inducirian apoptosis antes del ensamblaje de PsV. Sin embargo, lineas 293 y derivadas de 293, expresan ARN de VA de adenovirus, que interaccionan con PKR y evita su activacion por ARNbc. Puede producirse de forma eficaz PsV oligo T en una linea 293TT. Otras lineas celulares adecuadas incluyen aquellas que pueden expresar ARN de VA 1 y antigeno T largo de SV40 tales como celulas 293FT (Invitrogen). El pseudogenoma oligo T inducia citotoxicidad despues de introduccion en lineas epiteliales que carecian de ARN de VA. El acido nucleico oligo T puede ser de menos o de igual a 200, 175, 150, 125, 100, 95, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, o 10 nucleotidos.

Formulaciones

Realizaciones descritas en este documento tambien se refieren a metodos de administracion de pseudovirus o VLP a un sujeto para poner en contacto celulas cancerosas con los pseudovirus o VLP. Las vias de administracion pueden variar con la localizacion y naturaleza del tumor, e incluyen, por ejemplo, administracion y formulacion intravascular, intradermica, transdermica, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutanea, regional, percutanea, intratraqueal, intraperitoneal, intraarterial, intravesical, intratumoral, por inhalacion, por perfusion, por lavado, por inyeccion directa, y oral.

Se entiende que el termino "intravascular" se refiere al suministro en la vasculatura de un paciente, que significa a, dentro, o en un vaso o vasos del paciente. En ciertas realizaciones, la administracion puede ser a un vaso considerado una vena (intravenosa), mientras que en otras administraciones puede ser a un vaso considerado una arteria. Las venas incluyen, aunque sin limitacion, la vena yugular interna, una vena periferica, una vena coronaria, una vena hepatica, la vena porta, la vena safena grande, la vena pulmonar, la vena cava superior, la vena cava inferior, una vena gastrica, una vena esplenica, una vena mesenterica inferior, una vena mesenterica superior, vena cefalica, y/o vena femoral. Las arterias incluyen, aunque sin limitacion, la arteria coronaria, arteria pulmonar, arteria braquial, arteria carotida interna, arteria aortica, arteria femoral, arteria periferica, y/o arteria ciliar. Se contempla que el suministro puede ser a traves o a una arteriola o capilar.

La inyeccion a la vasculatura tumoral se contempla especificamente para tumores concretos, solidos, accesibles. La administracion local, regional o sistemica tambien puede ser apropiada. Para tumores de mas de aproximadamente 4 cm, el volumen a administrarse puede ser de 4-10 ml (preferiblemente 10 ml), mientras que para tumores de menos de aproximadamente 4 cm, puede usarse un volumen de aproximadamente 1-3 ml (preferiblemente 3 ml). Multiples inyecciones suministradas como una unica dosis comprenden volumenes de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 ml. Los pseudovirus o VLP pueden ponerse en contacto de forma ventajosa administrando multiples inyecciones al tumor, espaciadas en intervalos de aproximadamente 1 cm.

En el caso de intervencion quirurgica, los pseudovirus o VLP pueden administrarse de forma preoperatoria, para volver a un tumor inoperable objeto de reseccion. Como alternativa, los pseudovirus o VLP pueden administrarse en el momento de la cirugia, y/o despues de ello para tratar la enfermedad residual o metastasica. Por ejemplo, puede inyectarse o perfundirse un lecho tumoral resecado con una formulacion que comprende pseudovirus o VLP que vuelve al pseudovirus o VLP ventajoso para tratamiento de los tumores. La perfusion puede continuarse posreseccion, por ejemplo, dejando un cateter implantado en el sitio de la cirugia. Puede realizarse tratamiento periodico posquirurgico.

Tambien puede aplicarse administracion continua cuando sea apropiado, por ejemplo, cuando se escinde un tumor y el lecho tumoral se trata para eliminar la enfermedad residual, microscopica. Dicha perfusion continua puede tener lugar durante un periodo de aproximadamente 1-2 horas, hasta aproximadamente 2-6 horas, hasta aproximadamente 6-12 horas, hasta aproximadamente 12-24 horas, hasta aproximadamente 1-2 dias, hasta aproximadamente 1-2 semanas o mas tiempo despues del inicio del tratamiento. En lineas generales, la dosis de la composicion terapeutica mediante perfusion continua sera equivalente a la dada por una unica inyeccion o multiples inyecciones, ajustadas sobre un periodo de tiempo durante el cual sucede la perfusion.

Los regimenes de tratamiento pueden variar tambien, y a menudo dependen del tipo de tumor, la localizacion del tumor, la progresion de la enfermedad, y la salud y edad del paciente. Obviamente, ciertos tipos de tumor requeriran tratamiento mas agresivo, mientras que al mismo tiempo, ciertos pacientes no pueden tolerar protocolos mas impositivos. El medico sera el mas adecuado para tomar dichas decisiones basadas en la eficacia y toxicidad conocidas (si las hay) de las formulaciones terapeuticas.

En ciertas realizaciones, el tumor que se esta tratando puede no ser, al menos inicialmente, resecable. Los tratamientos con construcciones o VLP pseudoviricas terapeuticas pueden aumentar la resecabilidad del tumor debido a encogimiento en los margenes o por elimination de ciertas partes particularmente invasivas. Despues de los tratamientos, puede ser posibles la reseccion. Tratamientos adicionales posteriores a la reseccion pueden servir para eliminar enfermedad residual microscopica del sitio del tumor.

Un curso tipico de tratamiento, para un tumor primario o un lecho tumoral posescision, puede implicar multiples dosis. El tratamiento principal tipico para el tumor puede implicar una aplicacion de 6 dosis sobre un periodo de dos semanas. El regimen de dos semanas puede repetirse una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas veces. Durante un

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curso de tratamiento, puede reevaluarse la necesidad de completar las dosificaciones planeadas.

Los tratamientos pueden incluir diversas "dosis unitarias". Dosis unitarias se refiere a una dosis que contiene una cantidad predeterminada de la composition terapeutica. La cantidad a administrate, y la v^a particular y formulation, pertenecen a las habilidades de los expertos en las tecnicas clmicas. Una dosis unitaria no tiene que administrate como una inyeccion unica, pero puede comprender infusion continua sobre un periodo establecido de tiempo. La dosis unitaria de la presente invention puede describirse convenientemente en terminos de unidades formadoras de placa (pfu) para una construction virica. Las dosis unitarias varian de 103, 10a, 105, 106, 107, 101, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 pfu y mayores. Como alternativa, dependiendo del tipo de pseudovirus y el titulo obtenible, se suministraran de 1 a 100, 10 a 50, 100-1000, o hasta aproximadamente 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 o mas particulas pseudovmcas infecciosas al paciente o a las celulas del paciente.

Composiciones y formulaciones inyectables

La inyeccion de pseudovirus o VLP puede suministrarse mediante jeringa a cualquier otro metodo usado para inyeccion de una solution, siempre que el pseudovirus o VLP pueda pasar a traves del calibre particular de la aguja necesaria para la inyeccion. Recientemente se han descrito sistemas de inyeccion sin aguja novedosos (patente de Estados Unidos n.° 5.846.233) que tienen una boquilla que define una camara de ampolla para alojar la solucion y un dispositivo de energia para impulsar la solucion desde la boquilla hasta el sitio de suministro. Tambien se ha descrito un sistema de jeringa para su uso en terapia genica que permite multiples inyecciones de cantidades predeterminadas de una solucion de forma precisa a cualquier profundidad (patente de Estados Unidos n.° 5.846.225).

Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacologicamente aceptables en agua mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Tambien pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles liquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas esteriles o dispersiones y polvos esteriles para la preparation improvisada de soluciones o dispersiones inyectables esteriles (patente de Estados Unidos n.° 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida que exista facil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabrication y almacenamiento y debe estar conservada contra la action contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehiculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol liquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano requerido de particulas en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevention de la accion de microorganismos puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro sodico. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para administration parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion debe estar adecuadamente tamponada si fuera necesario y el diluyente liquido primero se volveria isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, intratumoral e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos esteriles que pueden emplearse seran conocidos para los expertos en la materia a la luz de la presente description. Por ejemplo, puede disolverse una dosificacion en 1 ml de solucion isotonica de NaCl y anadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusion (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a edition, paginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente sucedera alguna variation en la dosificacion dependiendo de la afeccion del paciente que se esta tratando. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Ademas, para administracion a seres humanos, las preparaciones deben de cumplir normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridas por las normas de la FDA Office of Biologies.

Se preparan soluciones inyectables esteriles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, segun lo necesario, seguido por esterilizacion por filtration. En lineas generales, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehiculo esteril que contiene el medio basico de dispersion y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de secado al vacio y secado por congelation que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solucion previamente filtrada a esterilidad del mismo.

Las composiciones descritas en este documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen, las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la

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protema) y que se forman con acidos organicos tales como, por ejemplo, acidos clorhidrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden obtenerse de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos sodico, potasico, de amonio, calcico, o ferrico, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares. Tras la formulacion, las soluciones se administraran de un modo compatible con la formulacion de dosificacion y en una cantidad tal que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en diversas formas de dosificacion tales como soluciones inyectables, capsulas de liberacion de farmaco y similares.

Los siguientes ejemplos proporcionan ilustraciones de algunas de las realizaciones descritas en este documento pero no pretenden limitar la invencion.

Ejemplo 1

La transmision genital de HPV en un modelo de raton se potencia por Nonoxinol-9 y se inhibe por carragenina

Se desarrollo un modelo de raton de infeccion cervicovaginal con HPV16 que recapitula la fase de establecimiento de infeccion por papilomavirus del siguiente modo.

Se obtuvieron ratones BALB/cAnNCr hembra de seis a ocho semanas de edad del National Institutes of Health y se alojaron y manipularon de acuerdo con sus directrices. Se aprobaron protocolos experimentales por el National Cancer Institute's Animal Care and Use Committee. Salvo que se indique de otro modo, todos los ratones recibieron 3 mg de Depo-Provera (Pfizer) diluido en 100 pl de PBS esteril en una inyeccion subcutanea 4 dias antes de la exposicion al pseudovirus.

Para exposicion vaginal, los ratones designados para pretratamiento con N-9 recibieron 50 pl del compuesto que contenia N-9 de forma intravaginal 6 h antes de la inoculacion intravaginal con pseudovirus. El material se suministro con una pipeta de desplazamiento positivo M50 (Gilson), y se usaron forceps convencionales de diseccion para ocluir la entrada vaginal para conseguir retencion maxima del material. Los ratones designados para alteracion mecanica experimentaron un procedimiento junto con inoculacion del pseudovirus en que un colector celular Cytobrush (Cooper- Surgical) se inserto en la vagina y se giro en la direction de las agujas del reloj y en direction contraria a las agujas del reloj 10 veces. El inoculo de pseudovirus fue una dosis de 20 pl compuesta de 5 pl de pseudovirus purificado con un titulo de -5 x 109 lU/ml mezclado con 15 pl de una preparation de carboximetilcelulosa (CMC) al 3 %, con la exception de ciertos experimentos en que se mezclaron 5 pl de inoculo con 5 pl de la preparacion indicada, o en que se mezclaron 15 pl de inoculo con 5 pl de CMC al 4 %. En los ratones pretratados con N-9, esta dosis se suministro como una inoculacion intravaginal, atraumatica en una vez usando una pipeta de desplazamiento positivo M20. En los ratones tratados con Cytobrush, el inoculo se suministro en dos dosis, 10 pl antes y 10 pl despues del tratamiento con Cytobrush, usando una pipeta de desplazamiento positivo M20. Salvo que se indique de otro modo, el tracto reproductor se recogio en el dia 3 posexposicion despues de sacrificar los ratones por inhalation de CO2. Para exposicion endocervical, se pretrato el canal endocervical por instilacion directa de 15 pl de CMC al 1 % o 15 pl de CMC al 1 % con N-9 al 4 %. Seis horas despues del pretratamiento, tambien se depositaron 7 pl (-1,4 x 107 IU) de pseudovirus mezclados con 7 pl de CMC al 1% directamente en el canal endocervical.

Los resultados de estos ensayos iniciales mostraron que el modelo de raton de infeccion cervicovaginal con HPV16 recapitulaba satisfactoriamente la fase de establecimiento de infeccion por papilomavirus. En el siguiente ejemplo, se evaluaron los efectos de nonoxinol-9 y carragenina en el modelo de raton.

Ejemplo 2

La transmision genital de HPV en un modelo de raton se potencia por nonoxinol-9 y se inhibe por carragenina

Se investigo la capacidad de pseudovirus de infectar celulas danadas mecanicamente, celulas tratadas con nonoxinol-9, y celulas tratadas con carragenina. Los detalles de estos experimentos estan a continuation.

La abrasion mecanica suave del epitelio genital con un colector celular Cytobrush permitio niveles detectables de infeccion por pseudovirus. Tambien se determino si la alteracion quimica del epitelio genital podria promover infeccion. N-9 es un tensioactivo no ionico activo de membrana que se usa ampliamente como espermicida y se sabe que altera la arquitectura normal del epitelio genital animal y humano. Se preparo una formulacion de carboximetilcelulosa (CMC) al 3 % designada para imitar la viscosidad de un gel lubricante vaginal tipico con o sin N- 9 al 4 %. Los geles se instilaron en la vagina 6 h antes de que se inoculara a los ratones por via intravaginal el pseudovirus. Los ratones pretratados con CMC solamente no estuvieron infectados de forma detectable, mientras que aquellos pretratados con Cytobrush o con CMC y N-9 eran muy susceptibles a infeccion (P = 0,05, 0,003, respectivamente) (Fig. 1a). De hecho, la intensidad de la senal indicadora en el ultimo grupo fue un promedio de cinco veces mas fuerte que la senal relacionada con infeccion inducida por tratamiento con Cytobrush (P = 0,008). Conceptrol, un espermicida basado en CMC sin receta que contiene N-9 al 4 %, tambien sensibilizaba el tracto genital a infeccion por pseudovirus a un grado mayor que lo hacia el tratamiento con Cytobrush (P = 0,02).

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Puede inhibirse potentemente in vitro una amplia gama de tipos de HPV genital por carragenina, un polisacarido barato cuyas propiedades gelificantes han conducido a su incorporation en algunos lubricantes vaginales sin receta. Para ensayar si el carragenina puede bloquear la infectividad in vivo, los ratones se expusieron a pseudovirus HPV16 premezclados 1:1 con t- carragenina al 1 % o una preparation de CMC al 3 % para controlar la viscosidad de la preparacion de carragenina. El carragenina evito la infection en la mucosa genital que se habia vuelto susceptible a infeccion por alteration mecanica (Cytobrush) o alteration quimica (N-9) (Fig. 1b). Dos lubricantes comerciales que contienen carragenina (Divine n.° 9 y BlOglide) que mostraron fuerte actividad inhibidora en un ensayo in vitro de pseudovirus evitaron de forma similar la infeccion detectable in vitro (Fig. 1c). Para imitar mas estrechamente las condiciones en que podria usarse carragenina en la practica comun como microbicida topico para prevenir la transmision de HPV genital, se aplico por via intravaginal N-9 en carragenina o N-9 en gel de CMC de control 6 h antes de la exposition a pseudovirus. Como se esperaba, el gel basado en CMC contenia N-9 que volvia a la mucosa susceptible a infeccion significativa por pseudovirus HPV (P = 0,03), mientras que el gel basado en carragenina evitaba la infeccion detectable (Fig. 1d). Cuando se compararon cada una de las condiciones de carragenina con los controles negativos, los valores P fueron > 0,1.

Los experimentos anteriores demuestran que la alteracion mecanica permite infeccion por PsV, el tratamiento con N- 9 potencia la infeccion, y el tratamiento con carragenina inhibe la infeccion. El siguiente ejemplo demuestra un metodo que puede usarse para acoplar un marcador a un pseudovirus.

Ejemplo 3

Acoplamiento de colorante Alexa Fluor 488 a pseudoviriones

El acoplamiento de colorante Alexa Fluor 488 a pseudoviriones HPV16-RFP se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para marcaje de proteinas (A10235, Molecular Probes). Se purificaron las capsidas acopladas a colorante por filtration en gel sobre una columna de perlas de agarosa al 2 % de 50 a 150 |jm (Agarose Bead Technologies). La retitulacion de la preparacion de pseudovirion conjugado con colorante confirmo que su infectividad permanecia comparable a la de pseudovirus no marcados.

El experimento anterior muestra que pueden acoplarse satisfactoriamente marcadores a pseudovirus y que la infectividad de los pseudovirus marcados es comparable con la de pseudovirus no marcados. El siguiente ejemplo a continuation demuestra una tecnica para formation de imagenes de marcadores acoplados a o expresados en pseudovirus.

Ejemplo 4

Imagenes multiespectrales de fluorescencia y analisis estad^stico

Para generar un ensayo mas cuantitativo para infeccion cervicovaginal, se desarrollo un metodo para medir la expresion genica total del gen indicador en muestras de tejido completo usando un dispositivo de imagenes multiespectrales de fluorescencia. Para estos analisis, se evaluo la vagina y cuello del utero completos de raton para la expresion del gen indicador, que genero datos sobre la distribution e intensidad de la infeccion y la intensidad media por pixel, permitiendo por tanto la comparacion cuantitativa entre muestras (Fig. 2).

El tracto reproductor de cada raton, desde los genitales externos hasta la mitad inferior de los cuernos uterinos, se escindio y almaceno en PBS en hielo durante <6 h antes de las imagenes. Se uso un dispositivo de imagenes maestro (CRi, Woburn, MA) con un filtro de excitation verde y un filtro de emision de paso largo de 580 nm para obtener imagenes de 550 nm a 9,00 nm en incrementos de 10 nm de longitud de onda. Usando la firma espectral de RFP en tejidos infectados como senal y la autofluorescencia de fondo en tejidos no infectados como ruido, se aplico un algoritmo sin mezcla espectral a las imagenes compuestas para determinar la intensidad y localization de la infeccion. El software de codigo abierto Image J, disponible online, se uso para calcular la senal media por pixel en una region de interes (ROI) en la representation de escala de grises de la senal no mezclada. La media de las cantidades asi generadas representa el resultado de cada condition experimental particular. En algunos casos, para determinar si la diferencia entre estas medias era significativamente estadistica, se realizo un ensayo-t de Student para muestras no relacionadas y los resultados se presentaron en el texto como un valor P.

Ratones tratados con Conceptrol se infectaron de forma simulada o se expusieron a pseudovirus HPV-16-tdTomato. Despues de 3 dias, se disecciono el tracto reproductor completo y se hizo una incision sagital en la pared ventral de la vagina y el cuello del utero. Se aplico la imagen Composite Maestro con algoritmos sin mezcla. La senal roja representaba la localizacion de la infeccion en comparacion con la autofluorescencia de fondo. La senal tdTomato no mezclada se convirtio a escala de grises. Analisis ImageJ. Se computo la senal media por pixel dentro de la ROI. Para ratones tratados de forma simulada, el area ROI fue de 3,3 x 107 y la senal media por pixel fue de 21,4. Para ratones expuestos a pseudovirus, el area ROI fue de 3,5 x 107 y la senal media por pixel fue de 1316,1.

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Ejemplo 5

La mucosa cervicovaginal intacta es resistente a infeccion por HPV (metodos del Ejemplo de N-9/carragenina)

Se uso PsV con protema fluorescente roja (RFP) para estudiar infeccion por papilomavirus del tracto genital de raton. Sorprendentemente se descubrio que el tracto genital intacto era completamente resistente a infeccion despues de deposition de 107 unidades infecciosas en la vagina o el canal endocervical. (Fig. 3) Incluso mas sorprendentemente, el virus acoplado a colorante fluorescente verde no se unia a epitelio escamoso o simple que delimita el tracto reproductor femenino. (Fig. 4)

Ejemplo 6

Pseudovirus HPV no infecta tejido normal intacto

Se administraron de forma atraumatica pseudoviriones HPV-16 que contenian el plasmido que expresa RFP (aproximadamente 108 unidades infecciosas de cultivos tisular) en las siguientes superficies de tejido: mucosa orofaringea, lengua, intestino delgado, intestino grueso, canal anal, conjuntiva del ojo, traquea, bronquios, peritoneo parietal, membrana serosa del tracto gastrointestinal, mesenterio del tracto gastrointestinal, higado, bazo, vejiga, utero, ovarios, piel externa y parenquema pulmonar. La infeccion, evaluada por fluorescencia roja usando microscopia confocal, se observo solamente en el parenquema pulmonar. El siguiente ejemplo demuestra que los pseudovirus infectan de forma selectiva lineas de celulas cancerosas.

Ejemplo 7

Pseudovirus HPV infectan muchas lneas celulares derivadas de tumor humano

Se obtuvo un panel de 59 lineas de celulas tumorales humanas del National Cancer Institute's Developmental Therapeutics Program (DTP) In Vitro Cell Line Screening Project (IVCLSP), con el fin de ensayar la infectividad por pseudovirus HPV (Fig. 5 y 6). Se eligieron pseudoviriones HPV5 y HPV16 para la selection como representativos de HPV cutaneos y mucosatropicos, respectivamente. los pseudovirus infecciosos purificados que contenian plasmidos indicadores de GFP se prepararon como se describe en Buck, C.B., Pastrana, D.V., Lowy, D.R., Schiller J.T. Generation of HPV pseudovirions using transfection and their use in neutralization assays. Methods Mol. Med. 119:445-462, 2005. Para HPV5, se usaron los plasmidos p5L1w, p5L2w y pfwb; y para HPV16, se usaron los plasmidos p16shell y pfwb. Se titularon los pseudovirus purificados en celulas 293TT como se describe en Buck et al. anteriormente, y se determino el titulo de las reservas a 1,4 x 10E9 unidades infecciosas/ml para HPV16 y 2,2 x 10E7 unidades infecciosas/ml para HPV5.

Se inocularon las 59 lineas de celulas tumorales humanas del DTP en placas de microtitulacion de fondo plano de 96 pocillos en 100 pl a densidades de siembra que variaban de 5.000 a 40.000 celulas/pocillo dependiendo del tiempo de duplication de las lineas celulares individuales.

Ademas, se inoculo HeLa, una linea celular de epitelio cervical humano (n.° catalogo CCL-2, ATCC, Manassas, VA 20108) del mismo modo que las lineas de celulas tumorales a 5.000 celulas por pocillo. Todas las lineas celulares se cultivaron en medio RPMl 1640 que contenia suero bovino fetal al 5 % y L-glutamina 2 mM. Despues de la inoculation de las celulas, las placas de microtitulacion se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 %, aire al 95 % y humedad relativa del 100 % durante 24 horas antes de la adicion del pseudovirus. Se hicieron tres diluciones en serie de factor diez de cada pseudovirus en DPBS + NaCl 0,8 M. Se anadieron 5 pl de cada dilution, pseudovirus no diluido y DPBS + NaCl 0,8 M (fondo) en pocillos duplicados para cada linea celular. Las placas se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 %, aire al 95 % y humedad relativa del 100 % durante 24 horas antes de la adicion de 100 pl por pocillo de medio RPMI 1640 que contenia suero bovino fetal al 5 % y L-glutamina 2 mM. Las placas se incubaron durante otras 48 horas antes de analisis FACS (tiempo de infeccion total de 72 horas). Las celulas de cada pocillo se recogieron por separado y se sometieron a analisis FACS. Se determino el porcentaje de celulas GFP positivas para cada muestra. Los valores obtenidos de muestras duplicadas se promediaron y se resto el fondo. La dilucion de pseudovirus que producia del 1-10 % de celulas GFP positivas (en el intervalo lineal del analisis FACS) se uso para calcular los titulos de virus HPV5 y HPV16. Como se muestra en las Figuras 5 y 6, el panel de lineas de celulas tumorales sera permisivo para infeccion por pseudovirus HPV5 y 16. Los experimentos anteriores indican que los pseudovirus de papiloma infectan especificamente lineas de celulas cancerosas. El siguiente ejemplo demuestra que los pseudovirus infectan selectivamente celulas tumorales in vivo.

Ejemplo 8

Pseudovirus HPV infectan de forma preferente celulas tumorales en un modelo de metastasis tumoral peritoneal

Se uso un modelo de tumor de cancer de ovario murino establecido para ensayar la eficacia y especificidad de la infeccion por pseudovirus de implantes de nodulo de tumor peritoneal. Este modelo usa SHIN3-DSR1, que es una linea celular de cancer de ovario humano transfectada de forma estable con un plasmido de proteina fluorescente

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roja (RFP) de modo que RFP se expresa de forma constitutiva en la celula tumoral (Fig. 7). Se establecieron xenoinjertos de tumor intraperitoneal en ratones desnudos hembra 14 dias despues de inyeccion i.p. de 2 x 106 SHIN3-DSR en 200 ul de PBS esteril. Tres dias despues de la inyeccion i.p. de 5 x 109 unidades infecciosas (IU) de HPV16-GFP en 300 ul de PBS esteril, se sacrificaron los ratones y se analizaron las membranas peritoneales por imagenes multiespectrales de fluorescencia. La anatomia del tejido en imagenes y el sistema conceptual para las imagenes son similares a las encontradas en la Referencia 1, Fig. 4c. Especificamente, se selecciono una parte de la membrana peritoneal del mesenterio intestinal de forma aleatoria y se propago en una placa no fluorescente. Se obtuvieron dos imagenes compuestas diferentes con un dispositivo de imagenes Maestro. Para la primera, se uso un filtro de paso de banda de 445 a 490 nm y un filtro de paso largo sobre 515 nm para luz de emision y excitacion, respectivamente. El filtro ajustable en el Maestro se aumento automaticamente en incrementos de 10 nm de 500 a 800 nm mientras la camara capturaba imagenes en cada intervalo de longitud de onda con una exposicion constante. Para la segunda, el filtro de paso banda y paso largo fueron de 503 a 555 y 580, respectivamente, y los incrementos de 10 nm de longitud de onda variaron de 500 a 800. Se aplico un algoritmo sin mezcla espectral a la primera imagen para obtener una imagen no mezclada de GFP y de autofluorescencia. Se aplico un algoritmo diferente a la segunda imagen para obtener una imagen no mezclada de RFP y de autofluorescencia. Estas dos imagenes finales se presentan, junto con la superposicion, que demuestra un alto grado de co-localizacion de senal. Despues de las imagenes multiespectrales, estos tejidos se congelaron instantaneamente, se seccionaron en un criotomo y se analizaron por microscopia confocal. Esto confirmo infeccion por HPV16-GFP mediante la demostracion de la expresion de GFP en nodulos tumorales SHIN3-DSR que expresan RFP. Ademas, el analisis confocal mostro infeccion minima, si la hubiera, de pseudovirus de membrana peritoneal normal adyacente. Este experimento indico que el pseudovirus HPV16 infectaba de forma eficaz celulas de cancer de ovario implantadas en la membrana peritoneal (Fig. 8). Mostro adicionalmente que la infeccion era muy especifica para celulas tumorales, con superficies peritoneales normales libres de infeccion.

Se obtuvieron resultados similares en un modelo murino que usa SKOV3, una linea celular de cancer de ovario humano, inyectada (Fig. 9). Justo como anteriormente, se establecieron xenoinjertos de tumor intraperitoneal en ratones desnudos hembra 14 dias despues de inyeccion i.p. de 1 x 105 celulas SKOV3. Tres dias despues de la inyeccion i.p. de 1 x 108 unidades infecciosas (lU) de HPV16 PsV-luciferasa o HPV16 PsV-RFP, los ratones se sacrificaron y se analizaron las membranas peritoneales por imagenes multiespectrales de fluorescencia como se ha analizado anteriormente.

HPV16-luciferasa

No se observo senal en ratones de control que carecian tanto de HPV16 PsV-luciferasa como de tumores, salvo cuando se anadia sustrato (d-luciferina 120 mg/kg i.p.). Ademas, no se observo senal en ratones de control que carecian de tumores, pero recibieron HPV16-luciferasa y sustrato. En ratones que poseian tumores, HPV16- luciferasa, y sustrato, se observo una senal significativa. (Fig. 10)

HPV16-RFP

No se observo senal en ratones de control a los que se inyecto HPV16 PsV-RFP pero carecian de tumores. En ratones que poseian tumores y recibieron HPV16 PsV-RFP, se observo fluorescencia significativa. (Fig. 11 y 12)

Estos experimentos confirmaron el hallazgo de que el pseudovirus HPV16 infectaba de forma eficaz celulas de cancer de ovario implantadas en la membrana peritoneal. Se confirmo adicionalmente que la infeccion era muy especifica para celulas tumorales, con superficies peritoneales normales libres de infeccion.

Ejemplo 9

Terapia genica de suicidio mediado por pseudovirus HPV de carcinoma de ovario

Basandose en el estudio general de linea celular derivada de tumor humano NCI-60, y a los resultados del experimento descrito anteriormente, se contempla que el suministro intraperitoneal de pseudovirus provocara infeccion eficaz y especifica de las celulas de cancer de ovario confinadas a la cavidad peritoneal, y que este metodo puede usarse para tratar canceres de ovario. Mediante un enfoque, un metodo de terapia genica de suicidio, en que la transduccion del gen para timidina quinasa (TK) de herpes simplex esta seguida por tratamiento sistemico con el profarmaco, gangciclovir. Tanto en el modelo de raton desnudo SHIN3, como en el modelo de raton inmunocompetente singenico MOSEC para cancer de ovario, se contempla que las celulas de tumor intraperitoneal xenoinjertadas se transduciran de forma eficaz por pseudovirus HPV16-TK, y que las celulas tumorales que expresan TK convertiran el gangciclovir administrado de forma sistemica en su metabolito trifosfato toxico, eliminando las celulas tumorales. Esto provocara una respuesta terapeutica, medida por carga tumoral disminuida y tiempo aumentado de supervivencia en ratones xenoinjertados. Como alternativa, se usara pseudovirus que expresa el oligo T para inducir regresion de las celulas tumorales. Ademas, basandose en los experimentos de la linea celular NCI-60, se contempla que explantes frescos de carcinomas de ovario humano seran permisivos a infeccion por pseudovirus. Este fenomeno se ilustra usando un protocolo similar a uno descrito previamente2, en que se usa el sistema de cultivo tisular de corte fino de Krumdieck para preparar secciones delgadas de nodulos cancerosos

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adecuados para analisis de transduccion de virus ex vivo. (Vease, por ejemplo, 1. Hama, Y. et al. A target cell- specific activatable fluorescence probe for in vivo molecular imaging of cancer based on a self-quenched avidin- rhodamina conjugate. Cancer Res 67, 2791-9 (2007) y 2. Kirby, T.O. et al. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res 10, 8697-703 (2004)).

Ejemplo 10

Pseudovirus HPTV que expresan oligo para citotoxicidad combinada e inmunidad a tumores

Se prepararon pseudovirus que expresan oligo T para proporcionar un enfoque simple para combinar vacunas terapeuticas antitumorales y terapia genica citotoxica antitumoral.

Construccion del plasmido pPolyT

Dos oligos

(GCGGCGTCTAGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT; SEQ ID NO: 1) y

GCGGCGTCTAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA; SEQ ID NO: 2) se hibridaron instantaneamente, despues se extendieron con ADN polimerasa T4 (New England Biolabs). El ADN duplex resultante se digirio con Xba I y se ligo en el sitio Xba I de una construccion de promotor pol-I/terminador murino, p417-Ron (obtenido de Ron A.M. Fouchier, Erasmus Medical Center, Paises Bajos). Se secuenciaron los clones, y se selecciono un clon con un tramo T de 45 pares de bases en la hebra con sentido.

Documentacion experimental de citotoxicidad de pPolyT

Se transfectaron celulas HaCaT con pBluescript II KS+ (Stratagene) o pPolyT usando Lipofectamina LTX (Invitrogen). Despues de 48 horas, se inspeccionaron las celulas por microscopia optica y se trataron con un sustrato metabolico colorimetrico (WST-1, Roche). Las celulas que recibieron pPolyT mostraron morfologia reticulada y eran bastante escasas respecto a celulas transfectadas con pBluescript (o no transfectadas). Se redujo la renovacion de WST-1 en >2 veces en las celulas transfectadas con pPolyT.

Ejemplo 11

La administracion intravenosa de pseudovirus HPV aborda metastasis pulmonares

De acuerdo con un protocolo establecido para producir metastasis de tumor pulmonar (vease, por ejemplo, Qian et al. Prophylactic, therapeutic and anti-metastatic effects of an HPV-16 mE6A/mE7/TBhsp70A fusion protein vaccine in an animal model. Immunology Letters 102(2):191-201 (2006)), se inyecto a una serie de ratones 2x104 celulas TC-1 por via intravenosa 2 semanas antes del experimento. Todos los ratones despues se trataron con aproximadamente 1 x 107 HPV16 PsV-luciferasa por via intravenosa, incluyendo los animales de control, que recibieron solucion salina en lugar de celulas tumorales. Posteriormente se midio la actividad luciferasa tras introduccion del sustrato. No se detecto senal en los ratones de control. En los ratones que se habian inoculado con celulas tumorales, se detecto senal significativa, lo que indica que los pseudovirus abordan de forma eficaz metastasis pulmonares (Fig. 13). Este experimento demostro que la administracion intravenosa de pseudovirus provoca abordaje especifico de las celulas tumorales y escaso de tejido normal, similar al patron demostrado despues de administracion por otras vias.

Ejemplo 12

Diagnostico y tratamiento de cancer cervical

A un sujeto que tiene cancer cervical se le proporciona una composition que comprende una VLP de papiloma acoplada a un radionuclido (por ejemplo, 3H, 125 I, 13I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 186Re, 188Re, o 212Bi). La composicion puede proporcionarse en una cantidad de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg. Como alternativa, la composicion puede proporcionarse en una cantidad suficiente para suministrar 100, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, o 10000 rads a las celulas cancerosas. La composicion puede proporcionarse en una aplicacion vaginal conveniente y la composicion puede estar en forma liquida o de gel. La composicion que comprende la VLP de papiloma acoplada al radionuclido se proporciona al sujeto y se permite que las VLP marcadas se unan a las celulas de cancer cervical durante 2, 4, 6, u 8 horas. Despues de la union, se retiran las VLP marcadas no unidas por lavado sucesivo. La cantidad de radiactividad presente en el canal vaginal se evalua por determinaciones de dosimetria (por ejemplo, placas de dosimetria). Se proporciona una nueva placa diariamente durante 4 semanas y se recogen las placas al final de la evaluation y se observara en el tiempo una disminucion gradual en la exposition radiactiva.

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Tambien se preve que se tomara una biopsia cervical semanal para evaluar la reduccion histologica de las celulas cancerosas durante el experimento. Los resultados mostraran que las VLP radiomarcadas se unen selectivamente a e identifican las celulas de cancer cervical en el canal vaginal del sujeto y, con el tiempo, la radiactividad contribuira a la reduccion de la presencia y proliferacion de las celulas cancerosas y la restauracion de la morfologia celular normal, en comparacion con sujetos de control no tratados.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, THE Roberts, Jeff Lowy, Douglas R. Schiller, John T.

<120> PSEUDOVIRUS DE PAPILOMAVIRUS PARA DETECCI6N Y TERAPIA DE TUMORES

<130> NIH360.001VPC

<150> 61/065.897 <151 >

<150> 60/928.498 <151 >

<160>2

<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 59 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador A Oligo T <400> 1

gcggcgtcta gaattttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttt

59

<210>2 <211> 59 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cebador B Oligo T <400>2

gcggcgtcta gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 59

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   REIVINDICACIONES

   1. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma que comprenden un marcador detectable para su uso en un metodo de deteccion de la presencia de celulas cancerosas en un sujeto que tiene o es sospechoso de tener celulas cancerosas; en donde dicho metodo comprende:

   identificar un sujeto que tiene o es sospechoso de tener celulas cancerosas;

   administrar a dicho sujeto una cantidad detectable de dicho pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma que comprenden un marcador detectable; y

   detectar la presencia de celulas cancerosas unidas a dicho pseudovirus de papiloma o dicha VLP de papiloma que comprenden un marcador detectable.
2. 2. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha deteccion se realiza en un sujeto antes de un tratamiento de terapia contra el cancer y durante o despues de un periodo de dicho tratamiento.
3. 3. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho marcador esta acoplado quimicamente a dicho pseudovirus o dicha VLP o dicho pseudovirus comprenden un gen que codifica dicho marcador.
4. 4. Una composicion que comprende un agente terapeutico formulado con un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso en un metodo de tratamiento del cancer inhibiendo la proliferacion de celulas cancerosas y/o eliminando celulas cancerosas sin inhibir la proliferacion y/o sin eliminar las celulas normales en un sujeto identificado con un cancer, en donde dicho agente terapeutico es citotoxico para una celula cancerosa.
5. 5. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que dicho agente terapeutico esta acoplado quimicamente a dicho pseudovirus o dicha VLP o se incorpora dentro de dicho virus o dicha vLp.
6. 6. Una composicion para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5, en la que dicho agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en:

   a) un gen seleccionado del grupo que consiste en:

   i) un gen supresor tumoral;

   ii) un gen pro-apoptotico;

   iii) un gen que codifica una citoquina, una linfoquina, una monoquina, un factor de crecimiento, una enzima o una hormona;

   iv) un gen inmunomodulador;

   v) un gen que codifica un polipeptido que es citotoxico para una celula cancerosa; y

   vi) un gen suicida;

   b) una citotoxina;

   c) un radionuclido;

   d) un profarmaco; y

   e) un acido nucleico terapeutico.
7. 7. Una composicion para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5, en la que dicho agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en ganciclovir o aciclovir, oligo T, y un acido nucleico que expresa oligo T, en donde dicho acido nucleico esta unido de forma funcional a un promotor de Pol III.
8. 8. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que dicho oligo T es de menos de o igual a 200, 175, 150, 125, 100, 95, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleotidos.
9. 9. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso en el metodo de deteccion de la presencia de celulas cancerosas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una composicion para su uso en el metodo de tratamiento del cancer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, linfoma, mieloma, plasmacitoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, carcinoma epidermoide, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudoriparas, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcitico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico,

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, neuroglioma y retinoblastoma.
10. 10. Un kit que comprende un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma, un vehiculo farmaceutico e instrucciones para el uso de los componentes del kit, en donde el pseudovirus o la VLP comprenden un agente terapeutico que es citotoxico para una celula cancerosa.
11. 11. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma que comprenden un marcador detectable para su uso en un metodo de deteccion de la presencia de celulas de cancer cervical en un sujeto, en donde dicho metodo comprende:

    proporcionar a dicho sujeto una composicion que comprende una VLP de papiloma acoplada a un marcador o que lo contiene;

    retirar las VLP no unidas que comprenden dicho marcador; y

    detectar la presencia de celulas cancerosas unidas a dicha VLP que comprende dicho marcador.
12. 12. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde dicho marcador esta acoplado quimicamente a dicha VLP.
13. 13. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 11 o 12, que comprende adicionalmente medir la presencia o la cantidad de dicho pseudovirus o dicha VLP unidos a dichas celulas cancerosas y la presencia o la cantidad de dicho pseudovirus o dicha VLP unidos a celulas normales.
14. 14. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 3, 11 o 12, en donde dicho marcador es fluorescente.
15. 15. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 3, 11 o 12, en donde dicho marcador es radiactivo.
16. 16. Un pseudovirus de papiloma o una VLP de papiloma para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 3, 11 o 12, en donde dicho marcador es quimioluminiscente.