ES2569485T3 - Procedimiento de ensayo de la apolipoproteína AI para el diagnóstico in vitro del cáncer colorrectal - Google Patents
Procedimiento de ensayo de la apolipoproteína AI para el diagnóstico in vitro del cáncer colorrectal Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de diagnóstico in vitro del cáncer colorrectal por valoración inmunológica del marcador apolipoproteína AI por determinación de la disminución de la concentración en dicho marcador, con respecto a los valores de referencia determinados para los sujetos sanos, en una muestra biológica procedente de un paciente sospechoso de padecer cáncer colorrectal, estando dicha muestra distante del tumor, entendiéndose que la valoración por inmunoensayo utilizada no es la turbidimetría.
Description
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El marcador cadherina epitelial (nº Swiss Prot P12830, también denominado E-cadherina, Uvomorulina, Cadherina1, CAM 120/80 o antígeno CD324) es una proteína transmembranaria mediadora de la adhesión celular calciodependiente. Está expresada específicamente en las células epiteliales, en las que está implicada en el mantenimiento de su fenotipo. El dominio citoplásmico de E-cadherina se une a la -catenina, que está ella en sí misma unida a las redes de filamentos de actina del citoesqueleto. Esta unión E-cadherina/-catenina desempeña un papel crítico para estabilizar las adhesiones células/células del tejido epitelial. La pérdida de E-cadherina puede por lo tanto reducir la adhesión celular y aumentar el poder invasivo de las células cancerosas. Una reducción de expresión de E-cadherina o de -catenina está generalmente asociada con una desdiferenciación y una agresividad más importante del tumor, en particular para los cánceres digestivos. Es así que F. Roca et al.43 han mostrado que los pacientes que padecen un cáncer colorrectal y que sub-expresan la E-cadherina tenían un pronóstico más peyorativo que los pacientes que tienen un nivel de expresión normal. A partir de 1983, Damsky et al.44 han mostrado que una forma soluble de E-cadherina podía ser liberada por la línea celular del cáncer de mama MCF-7. Esta forma soluble corresponde a la escisión de la parte extracelular de E-cadherina. Más tarde, M. Katayama et al.45 han mostrado que la forma soluble de E-cadherina podía ser liberada en la circulación sanguínea en caso de cáncer, y C. Willmanns et al.46 han mostrado que el aumento de la dosis de E-cadherina sanguínea estaba correlacionado con la fase tumoral para los cánceres colorrectales. Por otro lado, la compañía Takara BioChemicals (Tokio, Japón) propone un kit comercial.
El ensayo de ACE (antígeno carcino-embrionario) para el diagnóstico del cáncer colorrectal se ha propuesto desde 1965 por P. Gold y S. Freedman47, pero la detección sanguínea de este marcador tiene una sensibilidad mediocre para el diagnóstico de cánceres colorrectales en una fase poco avanzada. Es por eso que el ensayo del ACE sérico está especialmente recomendado para evaluar el riesgo de metástasis hepáticas48 y para el seguimiento terapéutico. Además, es un marcador poco específico del cáncer colorrectal; en efecto, puede ser aumentado en muchos otros cánceres (pulmón, mama, etc.). Sin embargo, el ensayo de ACE en las heces parece más sensible y más específico que el ensayo de ACE sérico o que el ensayo de sangre en las heces49. No obstante, no se propone todavía este ensayo de forma rutinaria.
Los determinantes antigénicos 1116-NS-19-9 reactivos, más comúnmente denominados CA19-9 (Carbohydrate Antigen 19.9), son llevados por unas proteínas de peso molecular elevado50. La prueba sanguínea de CA 19-9 es más específica que la de ACE. El porcentaje de CA 19-9 sanguíneo aumenta en caso de cáncer colorrectal, de páncreas y de hígado (colangiocarcinoma), pero también en caso de patologías no cancerosas (colangitis, etc.). Su uso en asociación con ACE está recomendado tanto en el momento del diagnóstico de un cáncer como para el seguimiento de la patología.
J. Holmgren et al.51 han mostrado que la dosis sérica de antígeno CA 50 aumentaba en caso de cáncer collorrectal. El antígeno CA 50 está definido por su facultad para ser reconocido por un anticuerpo monoclonal específico.
Tratándose del marcador CA 72, T. L. Klug et al.52 han mostrado que la dosis sérica de antígeno CA 72 aumentaba en caso de cáncer colorrectal. El antígeno CA 72 está definido por su facultad para ser reconocido por un anticuerpo monoclonal específico.
Asimismo, P. Kuusela et al.53 han mostrado que la dosis sérica de antígeno CA 242 aumentaba en caso de cáncer colorrectal. El antígeno CA 242 está definido por su facultad para ser reconocido por un anticuerpo monoclonal específico.
La valoración de la testosterona para el diagnóstico del cáncer colorrectal se ha propuesto en el hombre por M. Holland et al.54. Estos autores han mostrado una caída del porcentaje de testosterona en caso de cáncer colorrectal.
Tratándose del marcador TIMP-1 o Inhibidor Tisular de la Matriz Metaloproteinasa de tipo 1, la solicitud de patente US 2007/0020707 describe en particular el ensayo de TIMP-1 para el diagnóstico del cáncer colorrectal con la ayuda de una prueba en un fluido corporal.
F. Model et al.55 han mostrado en julio de 2006, durante el congreso "World Congress on Gastrointestinal Cancer", que era posible detectar unas formas metiladas del gen de la septina-9 en el plasma de pacientes que padecen cáncer colorrectal.
M.P. Ebert et al.56 han mostrado que el gen ALX4, o homeocaja-4 de tipo Aristaless, era más a menudo metilado en los sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal que en los sueros control (P < 0,0001). Utilizando un valor límite de 41,4 pg/ml, han obtenido una sensibilidad del 83,3% y una especificidad del 70%.
La villina se describe como marcador sanguíneo para el diagnóstico del cáncer colorrectal en la solicitud de patente FR2581456.
C. Bianco et al.57 han mostrado que la dosis sérica de Cripto-1 aumentaba en caso de cáncer colorrectal.
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La valoración de la intelectina-1 (nº Swiss Prot Q8WWA0, también denominada Receptor de lactoferrina intestinal, lectina de unión a Galactofuranosa, lectina endotelial HL-1 u Omentina) para el diagnóstico del cáncer se ha descrito en la solicitud de patente US2003/0082533.
La utilización de la proteína disulfuro isomerasa (nº Swiss Prot P07237, también denominada EC 5.3.4.1, PDI, subunidad beta de Prolil 4-hidroxilasa, Proteína de unión a hormona tiroidea celular o p55), de la proteína tumoral controlada translacionalmente (nº Swiss Prot P13693, también denominado TCTP, p23, Factor liberador de histamina, HRF o Fortilina) y de la (Pro)defensina-A5 (Nº Swiss Prot Q01523) como marcadores en el cáncer colorrectal, se describe respectivamente en las solicitudes de patente EP1724586, US2003/0172388 y US2006/0179496. Por (pro)defensina, se entiende el precursor, a saber la prodefensina antes de la escisión, el propéptido, a saber la mitad N-terminal después de la escisión de la prodefensina, y la proteína madura, a saber la Defensina, que corresponde a la mitad C-terminal después de la escisión.
Finalmente, se conoce el ensayo de la hemoglobina humana en las heces y puede ser realizado como se ha descrito anteriormente.
La concentración del marcador tumoral seleccionado del Grupo B estará, según el marcador considerado, aumentada o disminuida en la muestra biológica en la que se realiza el procedimiento de la invención, con respecto a los valores de referencia determinados para los pacientes sanos.
Preferentemente, el o los marcadores tumorales del Grupo B se seleccionan de entre: los marcadores Microglobulina Beta 2, proteasoma 20S, Galetina-3, cadena B de L-Lactado Deshidrogenasa, Calreticulina, Proteína 3 alfa derivada de islote regenerador, Transductor 1 de la señal de calcio asociado a los tumores, Cadherina epitelial, ACE, CA 19-9, Testosterona, TIMP-1, Intelectina-1, Proteína Disulfuro Isomerasa, Citoqueratina 20, Proteína tumoral controlada translacionalmente, (Pro)defensina-A5, la detección de hemoglobina humana en las heces.
Por supuesto, el procedimiento de la invención puede también incluir la detección de cualquier otro marcador del cáncer colorrectal conocido por el experto en la materia.
Por la determinación de la presencia de un marcador tumoral diferente de apolipoproteína AI, se entiende la determinación de la presencia de la proteína, de su ARN mensajero, o de la detección de una modificación sobre su gen en las secuencias codificantes o no codificantes, como unas metilaciones.
La determinación de la presencia, en la muestra biológica, del marcador tumoral de interés "proteína" se puede realizar mediante cualquier procedimiento de determinación de la presencia de una proteína en una muestra, conocido por el experto en la materia, como por ejemplo mediante una prueba bioquímica, incluyendo un ensayo inmunológico o por espectrometría de masas.
La prueba bioquímica puede ser cualquier prueba ampliamente conocida por el experto en la materia que implique unas interacciones moleculares, a saber unas reacciones entre dicho marcador tumoral y una o varias parejas de unión específicas o no de dicho marcador tumoral.
Preferentemente, la prueba bioquímica es un ensayo inmunológico conocida por el experto en la materia que implica unas reacciones inmunológicas entre el marcador tumoral, que es el antígeno, y una o varias parejas de unión específicas, que son los anticuerpos dirigidos contra este antígeno.
Las parejas de unión específicas o no del o de los marcadores tumorales buscadas en el procedimiento de la invención son cualquier pareja susceptible de unirse a este o estos marcadores. Se denominan específicas cuando son capaces de unirse a estos marcadores con una especificidad elevada, incluso una especificidad del 100%. Se denominan no específicas cuando su especificidad de unión a estos marcadores es baja y que son entonces capaces de unirse a otros ligandos, tales como unas proteínas. A título de ejemplo, se pueden citar los anticuerpos, las fracciones de anticuerpos, los receptores y cualquier otra molécula capaz de unirse a este marcador.
Los anticuerpos parejas de unión son, por ejemplo, o bien unos anticuerpos policlonales, o bien unos anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos policlonales se pueden obtener por inmunización de un animal con el marcador tumoral en cuestión, seguida de la recuperación de los anticuerpos buscados en forma purificada, por extracción del suero de dicho animal, y separación de dichos anticuerpos de los otros constituyentes del suero, en particular por cromatografía de afinidad sobre una columna en la que se fija un antígeno específicamente reconocido por los anticuerpos, en particular dicho marcador.
Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante la técnica de los hibridomas, cuyo principio general se recuerda a continuación.
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En una primera fase, se inmuniza un animal, generalmente un ratón, con el marcador tumoral de interés, cuyos linfocitos B son entonces capaces de producir unos anticuerpos contra dicho antígeno. Estos linfocitos productores de anticuerpos son después fusionados con unas células mielomatosas "inmortales" (murinas en el ejemplo) para dar lugar a unos hibridomas. A partir de la mezcla heterogénea de las células así obtenida, se efectúa entonces una selección de las células capaces de producir un anticuerpo particular y multiplicarse indefinidamente. Cada hibridoma se multiplica en forma de clon, conduciendo cada uno a la producción de un anticuerpo monoclonal cuyas propiedades de reconocimiento frente a dicho marcador tumoral podrán ser ensayadas por ejemplo por ELISA, por inmunotransferencia (transferencia Western) en una o dos dimensiones, por inmunofluorescencia, o con la ayuda de un biosensor. Los anticuerpos monoclonales así seleccionados son después purificados, en particular según la técnica de cromatografía de afinidad descrita anteriormente.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser también unos anticuerpos recombinantes obtenidos por ingeniería genética, mediante técnicas bien conocidas por el experto en la materia.
Son conocidos ejemplos de anticuerpos Inhibidor anti-elastasa leucocitaria y están disponibles en particular en el catálogo Abcam, anticuerpo policlonal de conejo anti-LEI, Cat. nº Ab47731. Un anticuerpo monoclonal anti-LEI Clone ELA-1 se ha descrito en el artículo de Yasumatsu et al.58.
Se conocen unos ejemplos de anticuerpos anti-ezrina y están disponibles en particular en el catálogo Abcam, anticuerpo monoclonal anti-Ezrine Clone 3C12, Cat. nº Ab4069 y anticuerpo policlonal de conejo anti-Ezrina, Cat. nº Ab47418.
Se conocen unos ejemplos de anticuerpo anti-aminoacilasa 1 y están disponibles en particular en el catálogo Abnova, anticuerpo monoclonal anti-aminoacilasa 1 Clone 4F1-B7, Cat. nº H00000095-M01, y en el catálogo Abcam, anticuerpo policlonal de gallina anti-Aminociclasa 1, Cat. nº Ab26173.
Se conocen ejemplos de anticuerpo de anti-proteína de unión a ácidos grasos de hígado y están disponibles en particular en el catálogo Abcam, anticuerpo monoclonal anti-L-FABP Clon 6B6, Cat. nº Ab10059 y anticuerpo policlonal de conejo anti-L-FABP, Cat. nº Ab7807.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-proteína de unión a ácidos grasos intestinales y están disponibles en particular en el catálogo R&D Systems, anticuerpo monoclonal anti-I-FABP Clon 323701, Cat. nº MAB3078, y en el catálogo Abcam, anticuerpo policlonal de conejo anti-I-FABP, Cat. nº Ab7805.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-Apolipoproteína AI y están disponibles en particular en el catálogo Biodesign Meridian Life Sciences, anticuerpo monoclonal anti-Apo AI Clon 4A90, Cat. nº H45402M y anticuerpo policlonal de cabra anti-Apo AI, Cat. nº K45252P.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-Apolipoproteína AII son y están disponibles en particular en el catálogo US Biological, anticuerpo monoclonal anti-Apo AII Clon 1402, Cat. nº A2299-31C y en el catálogo Biodesign Meridian Life Sciences anticuerpo policlonal de cabra anti-Apo AII, Cat. nº K74001P.
Se conocen ejemplos de anticuerpos policlonales anti-Plastina-I y están disponibles en particular en el catálogo Santa Cruz Biotechnology. El anticuerpo policlonal de conejo H-300 (Cat. nº sc-28531) reacciona con las Plastinas-I, L y T. La solicitante ha desarrollado unos anticuerpos monoclonales dirigidos contra la Plastina-I.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-Microglobulina Beta2, anti-ACE, anti-CA19-9 y anti-Testosterona son conocidos y se utilizan en particular en equipamientos de ensayo de la solicitante, respectivamente Vidas® Beta2 Microglobulina, Vidas® ACE, Vidas® CA19-9™ y Vidas® Testosterona.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-Proteasoma 20S y están disponibles en particular en el catálogo de Affinitiy Research Products.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-Galectina-3, anti-L-Lactato deshidrogenasa Cadena B, anti-Calreticulina, anti-Transductor 1 de la señal de calcio asociado a los tumores, anti-Queratina Tipo II Citoesqueleto 8, anti-Queratina tipo I Citoesqueleto 18, anti-Queratina tipo I Citoesqueleto 19, anti-Cadherina epitelial, anti-Villina y anti-TIMP-1 y están disponibles en particular en el catálogo Abcam.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-proteína alfa 3 derivada del islote regenerador y se utilizan en particular en los equipamientos de ensayo de Dynabio (La Gaude, Francia).
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-CA 242, anti-CA 50, anti-CA 72-4 y están disponibles en particular en el catálogo Fujirebio.
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Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-Intelectina-1 y están disponibles en particular en el catálogo Alexis Biochemicals, anticuerpo monoclonal anti-Intelectina-1 Clon Saly-1, Cat. nº ALX-804-850-C100 y anticuerpo policlonal de conejo anti-Intelectina-1, Cat. nº ALX-210-941.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-Proteína Disulfuro Isomerasa y están disponibles en particular en el catálogo Abcam, anticuerpo monoclonal anti-PDI Clon RL77, Cat. nº Ab5484 y anticuerpo policlonal de conejo anti-PDI, Cat. nº Ab3672.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-Citoqueratina 20 y están disponibles en particular en el catálogo Abcam, anticuerpo monoclonal anti-Citoqueratina 20 Clon Ks20.8, Cat. nº Ab962 y anticuerpo policlonal de conejo anti-Citoqueratina 20, Cat. nº Ab36756.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-TCTP y están disponibles en particular en el catálogo Abnova, anticuerpo monoclonal anti-TCTP Clon 3C7, Cat. nº 157H00007178-M01 y anticuerpo policlonal anti-TCTP, Cat. nº 157H00007178-A01.
Se conocen ejemplos de anticuerpo anti-Defensina-A5 y están disponibles en particular en el catálogo Santa Cruz Biotechnology, anticuerpo monoclonal anti-Defensina-A5 Clon 8C8, Cat. nº sc-53997, y en el catálogo Alpha Diagnostic International Inc., anticuerpo policlonal de conejo anti-Defensina-A5, Cat. nº HDEFA51-A.
Las parejas de unión específicas o no del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención se pueden utilizar como reactivo de captura, como reactivo de detección o como reactivo de captura y de detección.
Preferentemente, las parejas de unión específica o no de apolipoproteína AI se utilizan como reactivo de captura y como reactivo de detección.
La visualización de las reacciones inmunológicas, es decir de la unión marcador tumoral/pareja de unión, se puede efectuar mediante cualquier medio de detección, tales como unos medios directos o indirectos.
En el caso de la detección directa, es decir sin el intermedio de un marcado, se observan las reacciones inmunológicas, por ejemplo por resonancia plasmónica de superficie o por voltametría cíclica sobre un electrodo que lleva un polímero conductor.
La detección indirecta se realiza por medio de un marcado, bien de la pareja de unión denominada reactivo de revelación, o bien del marcador tumoral de interés en sí mismo. Se habla entonces en este último caso de método de competición.
Por marcado, se entiende la fijación de un reactivo marcador capaz de generar directa o indirectamente una señal detectable. Una lista no limitativa de estos reactivos marcadores consiste en:
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- las enzimas que producen una señal detectable, por ejemplo por colorimetría, fluorescencia, luminiscencia, como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la -galactosidasa, la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa,
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- los cromóforos como los compuestos fluorescentes, luminiscentes, colorantes,
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- las moléculas radioactivas como el 32P, el 35S o el 125I, y
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- las moléculas fluorescentes tales como las Alexa o las ficocianinas.
También se pueden utilizar unos sistemas indirectos de detección, como por ejemplo unos ligandos capaces de reaccionar con un anti-ligando. Las parejas ligando/antiligando son bien conocidas por el experto en la materia, que es el caso, por ejemplo, de las parejas siguientes: biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo, antígeno/anticuerpo, péptido/anticuerpo, azúcar/lectina, polinucleótido/complementario del polinucleótido. En este caso, es el ligando el que lleva la pareja de unión. El anti-ligando puede ser detectable directamente por los reactivos marcadores descritos en el párrafo anterior o ser él mismo detectable por un ligando/anti-ligando.
Estos sistemas indirectos de detección pueden conducir, en algunas condiciones, a una amplificación de la señal. Esta técnica de amplificación de la señal es bien conocida por el experto en la materia, y se podrá referir a las solicitudes de patente anteriores FR98/10084 o WO-A-95/08000 de la solicitante o al artículo de Chevalier et al.59.
Según el tipo de marcado utilizado, el experto en la materia añadirá unos reactivos que permiten la visualización del marcado.
A título de ejemplo de ensayos inmunológicos tales como los definidos anteriormente, se pueden citar los métodos "sándwich" tales como ELISA, IRMA y RIA, los métodos denominados de competición y los métodos de
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inmunodetección directa como la inmunohistoquímica, la inmunocitoquímica, la transferencia Westerm y la transferencia Dot.
La espectrometría de masas puede también ser utilizada para la detección en el fluido biológico del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención. El principio de la espectrometría es ampliamente conocido por el experto en la materia y está descrito por ejemplo en Patterson, S.60.
Para ello, la muestra biológica previamente tratada o no se pasa en un espectrómetro de masas y se compara el espectro obtenido con el del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención. Un ejemplo de tratamiento previo de la muestra consiste en hacerlo pasar sobre un soporte de inmunocaptura, que comprende una de las pajeras de unión del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención, por ejemplo un anticuerpo dirigido contra el o los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención. Otro ejemplo de tratamiento previo de la muestra puede ser el pre-fraccionamiento de la muestra biológica, a fin de separar entre sí las proteínas de la muestra. En unas técnicas bien conocidas por el experto en la materia, se pueden agotar, por ejemplo, en primer lugar, las proteínas predominantes de la muestra.
Gracias a avances tecnológicos recientes, se ha vuelto también posible cuantificar unas proteínas en medios biológicos complejos utilizando la espectrometría de masa en tándem (MS/MS) realizada utilizando un analizador tripe cuadrupolo que funciona en modo MRM (seguimiento por reacción múltiple). Este modo de funcionamiento presenta una doble selectividad (dos analizadores, selecciones del ión parental y del ión producido) y la sensibilidad de detección se mejora con respecto a otros modos de barrido. La viabilidad técnica de este enfoque se ha demostrado recientemente por Anderson y Hunter61 que han conseguido detectar unas proteínas cuya concentración es del orden del centenar de ng/ml en el plasma, después de la inmunodepleción de las proteínas más abundantes.
La determinación de la presencia, en la muestra biológica, del marcador tumoral de interés "ARNm" se puede realizar mediante cualquier procedimiento de determinación de la presencia de ARNm en una muestra, a saber o bien la detección directa del ARNm, o bien la detección indirecta del ARNm, o cualquier otro procedimiento de determinación de la presencia de un ARN en una muestra, conocido por el experto en la materia.
Por detección directa del ARNm, se entiende la puesta en evidencia del ARNm en sí mismo en la muestra biológica.
La detección directa del ARNm en la muestra biológica se puede realizar mediante cualquier medio conocido por el experto en la materia, como por ejemplo por hibridación con una pareja de unión específica del ARNm, llegado el caso después de la amplificación mediante la técnica PCR o NASBA.
Por hibridación, se entiende el proceso durante el cual, en condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos, se unen con unas uniones hidrógeno estables y específicas para formar un complejo bicatenario. Estas uniones hidrógeno se forman entre las bases complementarias Adenina (A) y Timina (T) (o Uracilo (U)) (se habla de unión A-T) o entre las bases complementarias Guanina (G) y Citosina (C) (se habla de unión G-C). La hibridación de dos fragmentos nucleotídicos puede ser total (se habla entonces de fragmentos nucleotídicos o de secuencias complementarias), es decir que el complejo bicatenario obtenido durante esta hibridación comprende únicamente unas uniones A-T y unas uniones C-G. Esta hibridación puede ser parcial (se habla entonces de fragmentos nucleotídicos o de secuencias suficientemente complementarias), es decir que el complejo bicatenario obtenido comprende unas uniones A-T y unas uniones C-G que permiten formar el complejo bicatenario, pero también unas bases no unidas a una base complementaria La hibridación entre dos fragmentos nucleotídicos depende de las condiciones de realización utilizadas, y en particular de la astringencia. La astringencia se define en particular en función de la composición de bases de dos fragmentos nucleotídicos, así como por el grado de emparejamiento erróneo entre dos fragmentos nucleotídicos. La astringencia puede estar también en función de los parámetros de la reacción, tales como la concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la solución de hibridación, la naturaleza y la concentración de agentes desnaturalizantes y/o la temperatura de hibridación. Todos estos datos son bien conocidos y las condiciones apropiadas pueden ser determinadas por el experto en la materia. En general, según la longitud de los fragmentos nucleotídicos que se desean hibridar, la temperatura de hibridación está comprendida entre aproximadamente 20 y 70ºC, en particular entre 35 y 65ºC en una solución salina a una concentración de aproximadamente 0,5 a 1M. Las parejas de unión específicas o no del ARNm son cualquier pareja susceptible de unirse a este ARNm. A título de ejemplo, se pueden citar las sondas nucleicas, los cebadores de amplificación, y cualquier otra molécula capaz de unirse a este ARNm.
Por sonda de hibridación, se entiende un fragmento nucleotídico que comprende de 5 a 100 unidades nucleicas, en particular de 10 a 35 unidades nucleicas, que posee una especificidad de hibridación en condiciones determinadas para formar un complejo de hibridación con el material específico del gen diana de interés. La sonda de hibridación puede comprender un marcador que permita su detección.
En el sentido de la presente invención, se entiende por cebador de amplificación, un fragmento nucleotídico que comprende de 5 a 100 unidades nucleicas, preferiblemente de 15 a 30 unidades nucleicas que permite la iniciación de una polimerización enzimática, tal como en particular una reacción de amplificación enzimática. Por reacción de amplificación enzimática, se entiende un proceso que genera múltiples copias de un fragmento nucleotídico por la
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acción de al menos una enzima. Tales reacciones de amplificación son bien conocidas por el experto en la materia y se pueden citar en particular las técnicas siguientes:
-PCR (Polymerase Chain Reaction), tal como se describe en las patentes US 4,683,195, US 4,683,202 y US 4,800,159,
-NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) con la solicitud de patente WO 91/02818, y
-TMA (Transcription Mediated Amplification) con la patente US 5,399,491.
Por detección, se entiende o bien un método físico, o bien un método químico con un agente colorante intercalante tal como SYBR® Green I o el bromuro de etidio, o bien un método de detección con la ayuda de un marcador. Existen numerosos métodos de detección para la detección de los ácidos nucleicos62. Los marcadores apropiados son tales como se han definido anteriormente.
En el sentido de la presente invención, la sonda de hibridación puede ser una sonda denominada de detección. En este caso, la sonda denominada de detección está marcada mediante un marcador tal como se ha definido anteriormente. Gracias a la presencia de este marcador, se puede detectar la presencia de una reacción de hibridación entre una sonda de detección dada y el transcrito a detectar.
La sonda de detección puede ser en particular una sonda de detección "molecular beacons"63. Estas "molecular beacons" se vuelven fluorescentes durante la hibridación. Poseen una estructura de tipo tallo-bucle y contienen un fluoróforo y un grupo "quencher" (inhibidor de la fluorescencia). La fijación de la secuencia de bucle específica con su secuencia complementaria de ácido nucleico diana provoca un desenrollado del tallo y la emisión de una señal fluorescente durante la excitación a la longitud de onda conveniente.
La sonda de hibridación puede ser también una sonda denominada de captura. En este caso, la sonda denominada de captura está inmovilizada o es inmovilizable sobre un soporte sólido, mediante cualquier medio apropiado, es decir directa o indirectamente, por ejemplo por covalencia o adsorción. Los soportes sólidos apropiados son conocidos por el experto en la materia, y se pueden citar a título de ejemplos los materiales de síntesis o los materiales naturales, los látex, las partículas magnéticas, los derivados metálicos, los geles, etc. El soporte sólido puede estar en forma de una placa de microvaloración, de una membrana como se describe en la solicitud WO-A94/12670, de una partícula. Se puede también inmovilizar sobre el soporte varias sondas de captura diferentes, siendo cada una específica de un transcrito diana. En particular, se puede utilizar como soporte un biochip en el que pueden ser inmovilizadas un gran número de sondas. La inmovilización de las sondas sobre el soporte es también conocida por el experto en la materia, y se puede citar un depósito de sondas por transferencia directa, la microdeposición, la síntesis in situ y la fotolitografía.
La puesta en evidencia, en la muestra biológica, de las modificaciones o anomalías de ADN a nivel del gen que codifica para el marcador tumoral de interés se puede realizar mediante cualquier procedimiento de determinación de las alteraciones del ADN en una muestra. A saber la detección directa de mutaciones, o bien la puesta en evidencia de alteraciones en el perfil de metilación de los locus de interés, o cualquier otro procedimiento de determinación de alteraciones del ADN en una muestra, conocido por el experto en la materia.
Las mutaciones pueden incluir unas sustituciones puntuales de un nucleótido por otro, unas deleciones de uno o varios nucleótidos y unas inserciones de uno o varios nucleótidos. Las mutaciones pueden estar situadas en la parte que codifica el gen del marcador tumoral de interés, o en las partes 5' y 3' no codificantes como la región promotora
o la región terminadora de transcripción.
Las estrategias de puesta en evidencia de mutación se apoyan en las técnicas de la biología molecular y comprenden unas etapas de extracción de ADN, de amplificación por PCR u otra técnica de amplificación, de hibridación y/o de secuenciación. En el caso del cáncer colorrectal, se ha utilizado el procedimiento siguiente con éxito para realizar la detección de mutaciones en el ADN de las heces: concentración del ADN por precipitación, enriquecimiento en diana utilizando unos oligonucleótidos de captura sobre perlas magnéticas, amplificación PCR de los genes de interés, secuenciación en fase sólida para identificar las mutaciones puntuales64. Las deleciones se identificaron con respecto a la diferencia de tamaño entre el fragmento de referencia esperado y el fragmento mutado. Imperiale et al.64 han descrito un abanico de 21 mutaciones situadas en los genes K.ras, APC, y p53 que permite detectar 16/31 de los cánceres invasivos.
Otros marcadores de ADN utilizados son la deleción BAT-26, que es un marcador de inestabilidad de los microsatélites y el ADN altamente amplificable denominado ADN largo (L-ADN), que no es un marcador específico pero que parece reflejar la apoptosis desordenada de las células tumorales exfoliadas en el lumen cólico65. Estos marcadores no son satisfactorios ni con respecto a su sensibilidad, ni con respecto a su especificidad.
Como se ha indicado anteriormente, las alteraciones del ADN pueden también corresponder a una modificación del perfil de metilación del gen que corresponde al marcador tumoral de interés. La modificación del perfil de metilación
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puede corresponder a una hipometilación (disminución del número de metilaciones) o a una hipermetilación (aumento del número de metilaciones). Las unidades alteradas pueden estar situadas en la parte codificante del gen del marcador tumoral de interés, o en las partes 5' y 3' no codificantes como la región promotora o la región terminadora de transcripción.
El análisis de la metilación del ADN se puede efectuar utilizando unas técnicas basadas en la PCR cualitativa y/o cuantitativa como la MSP (metilación-específica PCR), la secuenciación bisulfito, la digestión por una enzima de restricción sensible a las metilaciones acoplada con la PCR, COBRA (análisis de restricción combinado bisulfito) y Ms-SNuPE (extensión del cebador en un único nucleótido sensible a la metilación). El conjunto de estas técnicas se repasó en detalle y de manera comparada en un artículo de metodología66.
En la bibliografía, se han detallado varios genes hipermetilados en caso de cáncer colorrectal. A título de ejemplo, se puede citar el gen ALX4 (homeocaja-4 de tipo Aristaless)56, la región promotora del gen TPEF/HHP1 (factor de crecimiento epidérmico que contiene una proteína transmembranaria y dominio folistatina)67 o también el gen septina-968.
Cuando, en el procedimiento de la invención, se detectan al menos dos marcadores, estos pueden ser puestos en evidencia de manera separada, por ejemplo con la ayuda de kids diferentes, o bien de manera simultánea, en ensayo multiplex.
Cuando, en el procedimiento de la invención, se detectan dos marcadores de naturaleza diferente, por ejemplo un marcador proteico y un marcador ARNm, se pueden utilizar dos procedimientos de detección diferentes, seleccionados entre los descritos anteriormente. Se les puede detectar también simultáneamente, en el mismo medio de detección y en las mismas condiciones de reacción, como se describe en la solicitud de patente WO03/104490. Las etapas del procedimiento de detección descrito en esta solicitud de patente, que consiste en detectar simultáneamente unas reacciones de hibridación e inmunológicas en una muestra susceptible de contener unos analitos diana constituidos de al menos un ácido nucleico y de al menos otro ligando de naturaleza diferente, consisten en:
- (i)
- depositar una cantidad conocida en volumen de la muestra diluida en un tampón de reacción, en una superficie de captura previamente revestida de parejas de captura de dichos analitos diana, consistiendo dichas parejas de captura en al menos una sonda nucleica y al menos un anti-ligando,
- (ii)
- poner a reaccionar a una temperatura comprendida entre 15ºC y 60ºC, y
(iii) visualizar las reacciones de hibridación e inmunológicas así obtenidas.
La muestra biológica puede necesitar un tratamiento particular ya que puede contener el o los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención como tales, o bien puede contener unas células tumorales circulantes que contienen los marcadores buscados en el procedimiento de la invención y/o unas células tumorales circulantes que son capaces de segregar el o los marcadores buscados en el procedimiento de la invención.
Así, según un modo de realización de la invención, la muestra biológica es previamente tratada para aislar las células tumorales circulantes contenidas en dicho fluido.
Por aislar las células tumorales circulantes, se entiende obtener una fracción celular enriquecida en células tumorales circulantes.
El tratamiento de la muestra biológica para aislar las células tumorales circulantes se puede efectuar por clasificación celular en un citómetro de flujo, por enriquecimiento sobre Ficoll, por enriquecimiento por bolas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos, o por cualquier otro método de enriquecimiento específico conocido por el experto en la materia.
En el caso de la sangre como muestra biológica, las células tumorales circulantes se pueden aislar gracias a una técnica de separación celular sobre Ficoll asociada a una depleción de las células sanguíneas que utilizan unos anticuerpos anti-CD45 acoplados a perlas magnéticas (Dynal Biotech ASA, Noruega).
La detección del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención se puede efectuar entonces directamente a partir de células tumorales circulantes aisladas de la muestra biológica, por ejemplo por marcado inmunocitoquímico de estas células con un anticuerpo anti-marcador(es) tumoral(es) buscado(s) en el procedimiento de la invención, después de depositar las células tumorales circulantes en una lámina por Cytospin. La detección del o de los marcadores tumorales buscados en el procedimiento de la invención se puede efectuar asimismo directamente en las células tumorales circulantes utilizando el método de citometría de flujo, tal como se describe en Métézeau et al.69.
En estas condiciones, dichas células circulantes pueden ser tratadas en condiciones que permiten el bloqueo del o
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Ejemplo 1: Clonación de los genes que codifican para los marcadores tumorales y expresión de las proteínas recombinantes
1. Amplificación del ADNc y clonación
Se cultiva la línea de cáncer colorrectal Caco-2 en el medio DMEM que contiene 2 mM de L-Glutamina, sin SVF (suero fetal de ternera) (todos de Gibco).
Para la clonación de los genes LEI, L-FABP y Gal-3, se han extraído los ARN mensajeros a partir del residuo de 108 células Caco-2 utilizando el kit FastTrack 2.0 de Invitrogen (Cat. nº 45-0019), siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. La etapas de transcripción inversa y de PCR se realizan de una sola vez a partir de 450 ng de ARNm Caco-2, con el kit Superscript III One Step RT-PCR System (Invitrogen Cat. nº 12574-018) utilizando la enzima Platinum Taq DNA polimerasa, siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Los cebadores de PCR utilizados para la amplificación de los genes se dan en la Tabla 1.
Tabla 1
- Genes y Cebadores
- Oligonucleótidos
- LEI
- OL215 (SEQ ID 1)
- 5'-ATGGAGCAGCTGAGCTCAGCAAAC-3'
- OL216 (SEQ ID 2)
- 5'-CTAAGGGGAAGAAAATCTCCCCAA-3'
- L-FABP
- Sentido (SEQ ID 3)
- 5'-CGGAGCGTCTCCCATGAGTTTCTCCGGCAAGTA-3'
- antisentido (SEQ ID 4)
-
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- Gal-3
- OL217 (SEQ ID 5)
- 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3'
- OL218 (SEQ ID 6)
- 5'-TTATATCATGGTATATGAAGCACTGG-3'
Los fragmentos de ADN obtenidos se clonaron en el vector pCR2.1 TOPO (LEI y Gal-3) con el TA Cloning kit (Invitrogen Cat. nº K4520-01) o el vector pCMV6-XL4 de Origene (L-FABP) después de la digestión por Bsm BI y Xba I. Se secuenciaron los plásmidos a fin de verificar que el ADNc es conforme a la secuencia esperada.
Para la clonación del gen que codifica para la Aminociclasa 1, los ARN totales se extrajeron a partir de un residuo de 108 células Caco-2 utilizando el kit RNA Easy Mini de Qiagen, siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. La transcripción inversa se realiza a partir de 10 ng de ARN Caco-2, con la enzima Superscript II (Invitrogen) siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. El cebador de transcripción inversa es un oligo(dT).
El ADNc procedente de esta reacción se utilizó como matriz en una reacción de PCR que utiliza el kit AccuPrime Pfx (Invitrogen Cat. nº 12344-024) siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Los cebadores de PCR son: ACY-1 Fwd2 (SEQ ID 7: 5'-GCGAATTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGAGCAAAGG-TCCGGAAGAGGAGCACCCATCG-3') y ACY-1 Rev (SEQ ID 8: 5'-GCAAGCTTCAGCTGTCACTGGGCAGGGC-3')
En estas condiciones, se ha podido amplificar un fragmento de 1,3 kb que se ha clonado en un vector de clonación de tipo Zéro Blunt TOPO PCR Cloning kit (Invitrogen Cat. nº K2820-20). Este plásmido se ha secuenciado a fin de verificar que el ADNc es conforme a la secuencia esperada.
El fragmento de ADN siguiente (SEQ ID 9) que contiene el marco de lectura abierto I-FABP se ha obtenido por síntesis química, efectuada por la compañía Geneart.
2. Construcción de los vectores de expresión
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GST-Ezrin BL21 250 ml 0,1 mM GST ACY-1 BL21-Codón más (DE3)-RIPL 500 ml 0,1 mM Otra
Para la GST-Ezrina, la purificación se lleva a cabo a partir de los cuerpos de inclusión solubilizados en el tampón Tris 100 mM, urea 8M, DTT 10 mM por cromatografía de afinidad GST. Se utiliza una columna que contiene 5 ml de gel "Glutathione Sepharose 4 fast flow" (Amersham). El tampón de equilibración y de lavado es el PBS 2x, Tween 20 0,05%. El tampón de elución es el Tris-HCl 50 mM, glutationa reducida 20 mM, pH 8.
Para la Aminoacilasa 1, la fracción soluble del cultivo se pasa en una columna Amersham HiTrap Q FF y la proteína ACY-1 se diluye con 0,3M NaCl a pH 7,5. Como otras diversas proteínas se han co-eluido en estas condiciones, la purificación se prosiguió sobre una columna de interacción hidrófoba (HIC Phenyl HP, Amersham). La proteína ACY1 se ha eluido por 0,5M NaCl a pH 7.
La proteína recombinante GST-Plastina-I se ha proporcionado por el Institut Curie en forma purificada.
La proteína recombinante Calreticulina se ha producido por la compañía Proteus Services for Industry (Dijon, Francia). Se obtuvo la secuencia que codifica para la Calreticulina por síntesis química.
Ejemplo 2: Obtención de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los marcadores tumorales
- 1.
- Modelo animal
Los experimentos de inmunización se han realizado en unos ratones BALB/c (H-2d) hembras de 6 a 8 semanas de edad en el momento de la primera inmunización.
- 2.
- Inmunógenos e inmunizaciones
Con el fin de aumentar las respuestas inmunes obtenidas en los ratones y poder generar unos anticuerpos monoclonales, se han producido los marcadores tumorales en forma de proteínas recombinantes producidas según los modos de realización descritos en el ejemplo 1. La proteína LDH se ha obtenido de la compañía SciPac (Cat. nº 103-133). Estas proteínas se mezclaron volumen por volumen con el adyuvante de Freund (Sigma), preparado en forma de emulsión agua en aceite y del cual se sabe que presenta un buen poder inmunógeno. Para cada marcador tumoral, se han inmunizado 3 ratones. Los ratones han recibido 3 dosis sucesivas de 10 g de los inmunógenos a 0, 2 y 4 semanas. Todas las inyecciones se han realizado por vía sub-cutánea. La primera inyección se realiza en mezcla con el adyuvante de Freund completo, los dos siguientes se realizan en mezcla con el adyuvante de Freund incompleto. Entre D50 y D70 después de la primera inyección, se han re-estimulado las respuestas humorales con una inyección intravenosa de 100 g de la proteína recombinante.
- 3.
- Seguimiento de la aparición de la respuesta humoral
Con el fin de supervisar la aparición de los anticuerpos, se efectúan regularmente en los ratones unas extracciones de sangre. La presencia de los anticuerpos anti-marcador tumoral se ensaya utilizando un ELISA. La proteína de interés se utiliza en captura (1 g/pocillo), después de la saturación, se hacen reaccionar con el antígeno diferentes diluciones de sueros a ensayar (incubación a 37ºC, durante 1h). Los anticuerpos específicos presentes en el suero se revelan mediante un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón AffiniPure conjugado con la fosfatasa alcalina (H+L, Jackson Immunoresearch, Cat. no. 115-055-146), que se une a los anticuerpos buscados (0,1 g/pocillo).
- 4.
- Obtención de anticuerpos monoclonales
Tres días después de la última inyección, para cada marcador tumoral, se ha sacrificado uno de los ratones inmunizado; se han extraído la sangre y el bazo. Los esplenocitos obtenidos a partir del bazo se han puesto en cultivo con las células de mieloma Sp2/0-Ag14 para que funcionen y se inmortalicen, según el protocolo descrito por Köhler y Molstein72,73. Después de un periodo de incubación de 12-14 días, los sobrenadantes de los hibridomas obtenidos se cribaron para determinar la presencia de anticuerpos antimarcador tumoral utilizando el ensayo ELISA descrito en el punto 3 de este ejemplo. Cuando se utilizan unas proteínas de fusión GST como inmunógeno, los clones dirigidos contra la GST se eliminan efectuando un cribado ELISA con, en captura, la GST no acoplada. Las colonias de hibridoma positivas se sub-clonaron dos veces según la técnica de la dilución límite, bien conocida por el experto en la materia.
- 5.
- Caracterización de los anticuerpos monoclonales por inmunotransferencia
La lista de los anticuerpos monoclonales obtenidos contra los diferentes marcadores tumorales se presenta en la Tabla 4. Estos anticuerpos monoclonales se analizaron mediante la técnica de transferencia Western.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tabla 4
Marcadores tumorales Nombre de los anticuerpos monoclonales
Inhibidor de la elastasa de leucocitos (LEI) 21B10A5 y 10E1H1 Ezrina 4A7A6C1 y 4A9H5 Aminoacilasa 1 2A7F6 y 11H7D9 Plastina-I 3D11D10, 8C8C5, 3A3H2, 8G2D2 Calreticulina 5C10H10 y 11B6D11 L-lactato deshidrogenasa cadena B (LDH) 3F11E11 y 12F10G8 Galectina-3 12F8A12 y 14A5G1
5.1. Metodología
Los extractos de cultivo celulares de líneas Caco-2 y HT-29 se preparan lisando directamente el residuo celular por 600 l de una solución en agua de urea 8,3M, tiourea 2M, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1propano (CHAPS) 4%, DTT 100 mM, Servalyte 4-9 (Serva, Heidelberg, Alemania) 2%, Orange G 0,1g/l, y después se tratan según el protocolo de preparación de muestra de los geles NuPAGE Novex (Invitrogen). Para obtener los extractos de tejido, las biopsias tumor y mucosas de los pacientes GHBD001, GHBD004 y CLSP109 se disociaron con escalpelo, después sufrieron 10 ciclos de extracción en el sistema Medimachine (Becton Dickinson) utilizando unos Medicons 50 m con 1 ml de tampón PBS, 2,5 mM EDTA, inhibidores de proteasas (pastillas Roche). Estos 10 ml de suspensión celular se agrupan, se completan a 25 ml y después se centrifugan durante 15 min a 600g. El sobrenadante corresponde al extracto de tejido que se trata según el protocolo de preparación de muestra de los geles NuPAGE Novex. Se utilizan unas muestras reducidas, a una concentración final en proteína total de 0,4 mg/ml. El volumen de depósito es de 20 l por pocillo, en un gel NuPAGE Novex Bis-Tris 4-12%, tampón de migración MOPS. Después de la migración (bajo 200V, durante 1 hora) y transferencia sobre membrana de PVDF (bajo 400 mA, durante 45 min.), la calidad de la transferencia se aprecia por una coloración con negro amido.
Las membranas son saturadas con el 5% de leche desnatada (Régilait) en una solución de TNT (Tris 15 mM, NaCl 0,14M, Tween 20 0,5% pH8) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la saturación, las membranas se incuban durante 1 hora con los diferentes anticuerpos a ensayar diluidos a 10 µg/ml en la solución de saturación. Después del aclarado con TNT, las membranas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con un conjugado anti-ratón-peroxidasa de rábano picante diluido al 1:5000, (Cat No. 115-035-062, Jackson Immunoresearch) en la solución de saturación. Después del aclarado, se realiza la revelación con el kit Substrat Supersignal West Dura Extended (Cat No. 34076, Pierce) según los datos de utilización recomendados.
La señal de quimioluminiscencia sobre las membranas se midió con el sistema de diagnóstico de imágenes VersaDoc de Biorad. A partir de la imagen de la transferencia Western, los volúmenes de las bandas que corresponden a los diferentes marcadores tumorales se evaluaron con el programa QuantityOne (Bio-Rad). El volumen corresponde a la intensidad de la señal de quimioluminiscencia multiplicada por la superficie de la banda.
5.2. Resultados
Los resultados de la transferencia Western se recogen en la Tabla 5, que da el volumen de las bandas que corresponden al marcador tumoral de interés sobre los análisis por transferencia Western, en función de las diferentes muestras ensayadas. Estos resultados muestran que los marcadores tumorales ensayados están bien expresados por las líneas de cáncer de colon Caco-2 y HT-29, así como en los tejidos, como se muestra con los extractos de tumor y mucosa, obtenidos a partir de pacientes. La intensidad de la señal obtenida con un anticuerpo sobre una muestra se puede comparar a las señales obtenidas con las otras muestras y el mismo anticuerpo. La técnica utilizada permite confirmar la presencia o la ausencia del marcador en el tejido (muestra no distante) y la especificidad de los anticuerpos frente a marcadores. Esta técnica no se ha realizado en este ejemplo en las muestras distantes, ya que no permitiría deducir la presencia o no del marcador tumoral en las muestras distantes, ni determinar si su concentración sería aumentada o disminuida en estos. Además, el esquema experimental utilizado no permite comparar la reactividad de un anticuerpo con el otro.
Tabla 5 5
- Marcador tumoral
- Caco-2 HT-29 Tejido tumor Tejido Tejido tumor Tejido Tejido tumor
- y anticuerpo
- GHBD001 mucosa GHBD004 mucosa CLSP109
- GHBD004
- CLSP109
- LEI 21B10A5 10E1H1 Ezrina 4A9H5
- 8365 0 7066 7678 0 4742 NT NT NT 60200 13357 NT 36506 6893 NT NT NT 1588 NT NT 2446
- 20
10
15
20
25
30
35
40
45
- 4A7A6C1
- 123436 116448 42480 15303 67439 NT NT
- Amiroacilasa 1
- 2A7F6
- 10687 4787 NT NT NT 4477 7238
- 11H7D9
- 217664 232005 36093 10513 30233 NT NT
- Plastina-I
- 3D11D10
- 136725 NT NT NT NT 275477 246564
- 8C8C5
- 557 1110 4364 77 0 NT NT
- Calreticulina
- 5C10H10
- 2842 3040 NT NT NT 2503 3294
- 11B6D11
- 3261 2937 NT NT NT 2070 2764
- LDH
- 3F11E11
- 45391 NT NT NT NT 30411 13942
- 12F10G8
- 122907 154593 11841 15811 53285 NT NT
- Galectina-3
- 12F8A12
- 245712 65790 18262 12961 7307 NT NT
- 14A5G1
- 254531 120010 79833 98361 45872 NT NT
- NT: no ensayado.
5.3. Anticuerpos monoclonales dirigidos contra la Plastina-I
En el paciente GHBD004, el anticuerpo 8C8C5 no enciende, o enciende muy débilmente, la banda que corresponde a la Plastina-I. La presencia de Plastina-I en estas muestras puede ser demostrada utilizando por ejemplo el anticuerpo 8G2D2, que presenta una mejor afinidad para la Plastina-I en transferencia.
Como la Plastina-I es miembro de una familia de proteínas que comprende otras 2 isoformas (Plastinas L y T) con las que presenta más del 70% de homología, se ha ensayado el conjunto de los clones de anticuerpos monoclonales obtenidos para su reactividad frente a proteínas GST-Plastina-L y GST-Plastina-T (proporcionadas por el Institut Curie). Al final de este cribado, se han seleccionado los clones 3D11D10, 8C8C5, 3A3H2 y 8G2D2 que no presentan reactividad cruzada con los otros miembros de la familia. Estos anticuerpos son muy específicos de la isoforma Plastina-I.
Ejemplo 3: Valoraciones séricas de los marcadores tumorales
1. Pacientes y extracciones
La recogida de las muestras de sangre se realiza a nivel de una red de 8 centros clínicos repartidos en toda Francia, en el ámbito de 2 protocolos de ley Huriet.
Para la obtención del suero, la extracción sanguínea se realiza en tubo seco. Para la obtención del plasma, la extracción sanguínea se realiza en tubo EDTA. Después de la coagulación, el tubo se centrifuga durante 10 minutos a 1000 g, el suero se extrae, se alícuota y se conserva a -80ºC. El tubo de plasma es directamente centrifugado durante 10 minutos a 1000 g, el plasma se extrae, se alícuota y se conserva a -80ºC. Las muestras están perfectamente documentadas para la historia clínica de los pacientes.
2. Valoración sérica del marcador tumoral LEI
La proteína LEI se ha ensayado con la ayuda de los anticuerpos descritos en el ejemplo 2 y de un ensayo ELISA que utiliza el autómata Vidas® (bioMérieux). Para hacer esto, se ha construido el ensayo ELISA utilizando los reactivos del kit Vidas® HBs Ag Ultra (bioMérieux, Cat. nº 30315). Los reactivos se han utilizado tal como se describen en las instrucciones correspondientes (ref. 11728 D -FR -2005/05), con las siguientes modificaciones:
- 1.
- Los clones se sensibilizaron con el anticuerpo de captura 10E1H1 a una concentración de 10 µg/ml.
- 2.
- El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se sustituyó por 300 µl de anticuerpos de revelación 21B10A5, acoplado a la biotina, diluido a 1 µg/ml en el tampón del segundo pocillo del kit Vidas® HBs Ag Ultra (tampón con suero de cabra y azida de sodio a 1 g/l).
- 3.
- Las muestras de suero, de plasma o de heces (50µl) se diluyeron directamente en el segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra, puro o después de una dilución previa al 1/20 en el tampón del segundo pocillo del kit Vidas® HBs Ag Ultra (tampón con suero de cabra y azida de sodio a 1 g/l).
- 4.
- Se realizó la reacción ELISA con la ayuda del autómata Vidas® y del protocolo del kit HBs Ag Ultra.
15
25
35
45
55
65
5. Los resultados se obtuvieron en forma de valores brutos después de la sustracción del ruido de fondo (lectura del sustrato antes de la reacción).
Se estableció una curva patrón ensayando una gama de concentraciones del marcador tumoral en forma de proteína recombinante. La curva patrón se trazó detallando en las abscisas la concentración del marcador tumoral y en las ordenadas la señal leída por Vidas® (RFV o Valor de Fluorescencia Relativa). La concentración de marcador tumoral presente en el fluido corporal a ensayar (sangre, suero, plasma, heces) se calculó detallando la concentración que corresponde a la señal RFV leída por Vidas®.
Las dosis obtenidas para los pacientes analizados se detallan en la figura 1. Se puede señalar en esta figura que 3 sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal de fase IV y 1 suero de paciente que padece cáncer colorrectal de fase III muestran un claro aumento de su dosis de LEI sérica.
3. Valoración sérica del marcador tumoral Ezrina
La proteína ezrina se ha ensayado con la ayuda de los anticuerpos descritos en el ejemplo 2 y de un ensayo ELISA que utiliza el autómata Vidas® (bioMérieux). Para hacer esto, se ha construido el ensayo ELISA utilizando los reactivos del kit Vidas® HBs Ag Ultra (bioMérieux, Cat. nº 30315). Los reactivos se utilizaron tal como se describen en las instrucciones correspondientes (ref. 11728 D -FR -2005/05), con las siguientes modificaciones:
- 1.
- Los conos se han sensibilizado con el anticuerpo de captura 4A9H5 a una concentración de 30 g/ml.
- 2.
- El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se ha sustituido con 300 l de anticuerpo de revelación 4A7A6C1, acoplado con biotina, diluido a 1 g/ml en el tampón del segundo pocillo del kit Vidas® HBs Ag Ultra (tampón con suero de cabra y azida de sodio a 1 g/l).
- 3.
- Las muestras de suero, de plasma o de heces (50l) se diluyeron directamente en el segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra.
- 4.
- La reacción ELISA se realizó con la ayuda del autómata Vidas® y del protocolo HBS AG ULTRA, cuya etapa de incubación de la muestra con los anticuerpos de captura y de revelación fue llevada a 100 ciclos.
- 5.
- Los resultados se obtuvieron en forma de valores brutos después de la sustracción del ruido de fondo (lectura del sustrato antes de la reacción).
La concentración del marcador tumoral presente en el fluido corporal a ensayar (sangre, suero, plasma, heces) se ha calculado según el modo de realización descrito en el párrafo 2 que se refiere a la valoración del LEI.
Las dosis obtenidas para los pacientes analizados se detallan en la figura 2. Se puede señalar en esta figura que 3 sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal de fase IV muestran un claro aumento de su dosis de ezrina sérica.
4. Determinación sérica del marcador tumoral Aminociclasa 1
La proteína Aminoacilasa 1 se ha ensayado con la ayuda de los anticuerpos descritos en el ejemplo 2 y de un ensayo ELISA utilizando el autómata Vidas® (bioMérieux). Para hacer esto, se ha construido el ensayo ELISA utilizando los reactivos del kit Vidas® HBs Ag Ultra (bioMérieux, Cat. nº 30315). Los reactivos se utilizan tal como se describen en las instrucciones correspondientes (ref. 11728 D -FR -2005/05), con las siguientes modificaciones:
- 1.
- Se sensibilizaron los conos con el anticuerpo de captura 2A7F6 a una concentración de 20 g/ml.
- 2.
- El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se sustituyó por 300 l de anticuerpo de revelación 11H7D9, acoplado a la biotina, diluido a 1 g/ml en el tampón del segundo pocillo del kit Vidas® HBs Ag Ultra (tampón con suero de cabra y azida de sodio a 1 g/l).
- 3.
- Las muestras de suero, de plasma o de heces (100 l) se diluyeron directamente en el segundo pocillo del cartucho HBS Ag Ultra.
- 4.
- La reacción ELISA se realizó con la ayuda del autómata Vidas® y del protocolo HBS AG ULTRA cuya etapa de incubación de la muestra con los anticuerpos de captura y de revelación fue llevada a 100 ciclos.
- 5.
- Los resultados se obtuvieron en forma de valores brutos después de la sustracción del ruido de fondo (lectura del sustrato antes de la reacción).
- Cáncer del hígado
- HEPA 3/F0 1 1 9C Suero 741
- Cáncer del hígado
- HEPA 4/F0 1 1 9C Suero 1051
- Cáncer del hígado
- HEPA 5/F0 1 1 9C Suero 1273
- Cáncer del hígado
- HEPA 6/F0 1 1 9C Suero 1084
- Cáncer del hígado
- HEPA 7/F0 1 1 9C Suero 1851
- Cáncer del hígado
- HEPA 8/F0 1 1 9C Suero 1408
- Cáncer del hígado
- HEPA 9/F0 1 1 9C Suero 1160
- CCR +
- CBSE007/F0 GS 1 7 2C Suero I TisN0M0 957
- CCR +
- CBSE016/F0 GS 2 5 8C Suero I T1N0M0 835
- CCR +
- GHBD035/F0 GS 2 7B Suero I TisN0M0 945
- CCR +
- CLSP059/F0 GS 1 7 5C Suero I TisN0M0 787
- CCR +
- CBSE022/F0 GS 2 5 10C Suero I T1N0M0 409
- CCR +
- CLSP118/F0 GS 1 5 9C Suero I T2N0M0 639
- CCR +
- CLSP145/F0 GS 2 5 11C Suero I T1N0M0 343
- CCR +
- CBSE011/F0 GS 1 1 6C Suero I TisN0M0 354
- CCR +
- CLSP150/F0 GS 2 5 6C Suero I T2N0M0 389
- CCR +
- GHBD003/F0 GS 2 1 5C Suero I T2N0M0 508
- CCR +
- GHBD015/F0 GS 2 1 10C Suero I TisN0M0 808
- CCR +
- P38868 s1 10C Suero II T3N0M0 894
- CCR +
- GHBD039/F0 GS 1 1 4C Suero II T3N0M0 805
- CCR +
- GHBD066/F0 GS 3 7B Suero II T3N0M0 1181
- CCR +
- CLSP096/F0 GS 2 5 9C Suero II T3N0M0 538
- CCR +
- CLSP154/F0 GS 2 5 9C Suero II T3N0M0 686
- CCR +
- CBSE004/F0 GS 3 1 6C Suero II T3N0M0 731
- CCR +
- CLSP105/F0 GS 1 10 5C Suero II T3N0M0 540
- CCR +
- CLSP133/F0 GS 2 5 10C Suero II T3N0M0 507
- CCR +
- CLSP136/F0 GS 4 5 10C Suero II T3N0M0 423
- CCR +
- GHBD016/F0 GS 2 1 10C Suero II T3N0M0 751
- CCR +
- GHBD037/F0 GS 1 4 4C Suero III T3N2M0 604
- CCR +
- GHBD058/F0 GS 2 5 12C Suero III T3N1M0 1248
- CCR +
- CBSE023/F0 GS 6 5 9C Suero III T4N2M0 750
- CCR +
- GHBD005/F0 GS 1 5 9C Suero III T3N1M0 500
- CCR +
- CLSP074/F0 GS 1 5 8C Suero III T3N2M0 552
- CCR +
- CLSP144/F0 GS 4 5 9C Suero III T3N1M0 804
- CCR +
- CLSP044/F0 GS 1 4 8C Suero III T3N1M0 526
- CCR +
- CLSP097/F0 GS 1 8 2C Suero III T3N1M0 630
- CCR +
- CLSP098/F0 GS 3 9 1C Suero III T3N2M0 384
- CCR +
- CLSP121/F0 GS 2 7 1C Suero III T3N2M0 706
- CCR +
- CLSP095/F0 GS 4 1 9C Suero IV T3N1M1 540
- CCR +
- CLSP161/F0 GS 2 10 8C Suero IV T3N2M1 573
- CCR +
- GHBD056/F0 GS 4 10 9C Suero IV T3N2M1 719
- CCR +
- CBSE027/F0 GS 3 1 6C Suero IV T4N2M1 907
- CCR +
- CLSP109/F0 GS 2 5 4C Suero IV T3N1M1 460
- CCR +
- GHBD030/F0 GS 2 6B Suero IV TxN0M1 957
- CCR +
- GHBD071/F0 GS 3 7 1C Suero IV T4N2M1 760
- CCR
- N017197/F0 HS 1 1 1C Suero 639
- CCR
- N440478/F0 HS 1 3 1C Suero 774
- CCR
- N748022/F0 HS 1 3 1C Suero 476
- CCR
- N862300/F0 HS 1 3 1C Suero 930
- CCR
- N376912/F0 HS 1 1 1C Suero 962
- CCR
- N440216/F0 HS 2 1 1C Suero 1172
- CCR
- N527135/F0 HS 1 1 1C Suero 1200
- CCR
- N527450/F0 HS 1 1 1C Suero 934
- CCR
- N593116/F0 HS 1 1 1C Suero 1265
- CCR
- N593183/F0 HS 1 1 1C Suero 1086
- CCR
- N370537/F0 HS 2 1 1C Suero 1041
- CCR
- N017365/F0 HS 1 4B Suero 945
- CCR
- N484882/F0 HS 0 1 5C Suero 1016
- CCR
- N376461/F0 HS 1 4B Suero 1148
- CCR
- N009901/F0 HS 1 3B Suero 1152
- CCR
- N011147/F0 HS 1 4B Suero 1185
- CCR
- N011155/F0 HS 1 3B Suero 1156
- CCR
- N017234/F0 HS 1 4B Suero 1390
- CCR
- N017269/F0 HS 1 4B Suero 833
- CCR
- N017402/F0 HS 1 4B Suero 929
- CCR
- N017410/F0 HS 1 4B Suero 966
- CCR
- N018552/F0 HS 1 4B Suero 988
- CCR
- N045730/F0 HS 1 4B Suero 1129
- CCR
- N314164/F0 HS 1 4B Suero 1098
- CCR
- N325015/F0 HS 1 4B Suero 1129
- CCR
- N376904/F0 HS 1 4B Suero 1174
- CCR
- N376920/F0 HS 1 4B Suero 1375
a: CCR+: pacientes que padecen cáncer colorrectal / CCR-: sujeto sano
b: TNM: fase de invasión tisular (T), ganglionaria (lymph nodes, N) y a distancia (metástasis, M)
La Figura 6A presenta los resultados de este ensayo. Se ha puesto en evidencia una disminución de la 5 concentración sérica de Apo AI en los sujetos que padecen cáncer colorrectal. La concentración media en 38 sujetos que padecen CCR de fase I a IV es de 675 ± 36 g/ml mientras que es mucho más elevada en 27 sujetos sanos (controles): 1040 ± 39 g/ml. Esta diferencia es estadísticamente muy significativa (P<0,0001, t-ensayo unilateral). A título de comparación, en 13 sujetos que padecen cáncer de hígado, la concentración sérica media de Apo AI es de 1175 ± 87 g/ml con la técnica ELISA sándwich utilizada. La disminución de la concentración sérica demuestra que 10 Apo AI es por lo tanto un marcador específico del cáncer colorrectal, pudiendo esta disminución ser demostrada por una valoración por inmunoensayo no turbidimétrico.
La segunda técnica de ensayo utilizada es un ensayo multiplex comercializado por la compañía Linco que permite ensayar varias Apolipoproteínas, incluyendo AI y AII, simultáneamente en la misma muestra (Cat. nº APO-62K). Se
15 ha aplicado el modo de realización recomendado por el fabricante.
Los resultados de la valoración de Apo AI sérica en los pacientes por esta valoración multiplex se dan en la Tabla 6B.
20 Tabla 6B
- Patologíaa
- Identificador de la muestra Naturaleza Fase TNMb Apo A1 µg/ml
- CCR +
- CBSE011/F0 GS 1 1 2C Suero I TisN0M0 970
- CCR +
- CBSE016/F0 GS 2 2B Suero I T1N0M0 1146
- CCR +
- CBSE022/F0 GS 2 2B Suero I T1N0M0 551
- CCR +
- CLSP118/F0 GS 1 2B Suero I T2N0M0 729
- CCR +
- CLSP145/F0 GS 1 2B Suero I T1N0M0 897
- CCR +
- CLSP150/F0 GS 2 5 2C Suero I T2N0M0 580
- CCR +
- GHBD003/F0 AS 2 1 2C Suero I T2N0M0 852
- CCR +
- GHBD015/F0 GS 2 1 2C Suero I TisN0M0 747
- CCR +
- CBSE004/F0 GS 3 1 2C Suero II T3N0M0 784
- CCR +
- CLSP076/F0 GS 1 3 2C Suero II T3N0M0 886
- CCR +
- CLSP096/F0 GS 2 2B Suero II T3N0M0 626
- CCR +
- CLSP105/F0 GS 1 10 2C Suero II T3N0M0 630
- CCR +
- CLSP133/F0 GS 2 5 2C Suero II T3N0M0 718
- CCR +
- CLSP136/F0 GS 4 5 2C Suero II T3N0M0 679
- CCR +
- CLSP154/F0 GS 2 2B Suero II T3N0M0 926
- CCR +
- GHBD016/F0 GS 2 1 2C Suero II T3N0M0 1225
- CCR +
- GHBD020/F0 GS 1 5 2C Suero II T3N0M0 916
- CCR +
- CBSE023/F0 GS 6 2B Suero III T4N2M0 804
- CCR +
- CLSP044/F0 GS 1 4 2C Suero III T3N1M0 871
- CCR +
- CLSP074/F0 GS 1 8 2C Suero III T3N2M0 815
- CCR +
- CLSP078/F0 GS 1 7 3C Suero III T3N1M0 863
- CCR +
- CLSP097/F0 GS 1 2B Suero III T3N1M0 803
- CCR +
- CLSP098/F0 GS 3 2B Suero III T3N2M0 351
- CCR +
- CLSP121/F0 GS 2 2B Suero III T3N2M0 780
- CCR +
- CLSP144/F0 GS 1 2B Suero III T3N1M0 702
- CCR +
- GHBD005/F0 GS 1 2B Suero III T3N1M0 587
- CCR +
- CBSE021/F0 GS 2 2 4C Suero IV T4N2M1 703
- CCR +
- CBSE026/F0 GS 4 2B Suero IV T4N1M1 610
- CCR +
- CBSE027/F0 GS 3 1 2C Suero IV T4N2M1 746
- CCR +
- CLSP095/F0 GS 4 5 2C Suero IV T3N1M1 957
- CCR +
- CLSP109/F0 GS 2 5 2C Suero IV T3N1M1 502
- CCR +
- CLSP161/F0 GS 2 2B Suero IV T3N2M1 683
- CCR +
- GHBD056/F0 GS 1 2B Suero IV T3N2M1 757
- CCR +
- GHBD071/F0 GS 2 2B Suero IV T4N2M1 703
- CCR
- N017197/F0 HS 1 2 1C Suero 1303
- CCR
- N017218/F0 HS 1 1 7C Suero 1360
- CCR
- N017365/F0 HS 2 1 3C Suero 1413
- CCR
- N018544/F0 HS 1 3 9C Suero 1190
- CCR
- N314199/F0 HS 1 3 9C Suero 1060
- CCR
- N370510/F0 HS 1 3 2C Suero 769
- CCR
- N440478/F0 HS 1 3 7C Suero 1334
- CCR
- N748022/F0 HS 1 3 7C Suero 1675
- CCR
- N862300/F0 HS 1 3 8C Suero 959
- CCR
- N376912/F0 HS 1 1 9C Suero 1089
- CCR
- N440216/F0 HS 2 1 9C Suero 973
- CCR
- N527135/F0 HS 1 1 9C Suero 1271
- CCR
- N527450/F0 HS 1 1 9C Suero 1037
- CCR
- N593116/F0 HS 1 1 9C Suero 1333
- CCR
- N593183/F0 HS 1 1 9C Suero 1111
- CCR
- N744056/F0 HS 1 1 9C Suero 1220
- CCR
- N370537/F0 HS 2 1 3C Suero 1199
La Figura 6B presenta los resultados de este ensayo. Se confirma mediante esta segunda técnica la disminución de la concentración sérica de Apo AI en los pacientes que padecen CCR. La concentración media de Apo AI en 34 sujetos que padecen CCR de fase I a IV es de 768 ± 30 g/ml mientras que es mucho más elevada en 17 sujetos
5 sanos (controles): 1194 ± 51 g/ml. Esta diferencia es estadísticamente muy significativa (P<0,0001, t-ensayo unilateral).
8. Valoración sérica del marcador tumoral Apolipoproteína AII
10 La valoración de la Apolipoproteína AII sérico se ha realizado con el kit multiplex de Linco. La Figura 7 presenta los resultados de este ensayo. Se ha demostrado una disminución de la concentración sérica de Apo AII en los sujetos que padecen cáncer colorrectal. La concentración media de Apo AII en 34 sujetos que padecen CCR de fase I a IV es de 170 ± 11 g/ml mientras que es mucho más elevada en 17 sujetos sanos (controles): 277 ± 16 g/ml. Esta diferencia es estadísticamente muy significativa (P<0,0001, t-ensayo unilateral).
15
9. Valoración sérica del marcador tumoral Plastina-I
La proteína Plastina-I se ha ensayado con la ayuda de los anticuerpos descritos en el ejemplo 2 y de un ensayo ELISA utilizando el autómata Vidas® (bioMérieux). Para hacer esto, se ha construido el ensayo ELISA utilizando los
20 reactivos del kit Vidas® HBs Ag Ultra (bioMérieux, Cat. nº 30315). Los reactivos se han utilizado tal como se describen en las instrucciones correspondientes (ref. 11728 D -FR -2005/05), con las siguientes modificaciones:
1. Los conos se han sensibilizado con el anticuerpo de captura 3D11D10 a una concentración de 15 g/ml.
25 2. El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se ha sustituido con 300 l de anticuerpo de revelación 8C8C5, acoplado a la biotina, diluido a 1 g/ml en el tampón del segundo pocillo del kit Vidas® HBs Ag Ultra (tampón con suero de cabra y azida de sodio a 1 g/l).
- 3.
- Las muestras de suero, de plasma o de heces (100 l) se diluyeron directamente en el segundo pocillo del 30 cartucho HBs Ag Ultra.
4. La reacción ELISA se ha realizado con la ayuda del autómata Vidas® y del protocolo HBS AG ULTRA.
- 5.
- Los resultados se han obtenido en forma de valores brutos después de la sustracción del ruido de fondo (lectura 35 del sustrato antes de la reacción).
La concentración del marcador tumoral presente en el fluido corporal a ensayar (sangre, suero, plasma, heces) se ha calculado según el modo de realización descrito en el párrafo 2, que se refiere a la valoración del LEI.
40 Las dosis obtenidas para los pacientes analizados se detallan en la figura 8. Los 2 sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal ensayados muestran un claro aumento de su dosis de Plastina-I sérica.
10. Valoración sérica de los marcadores tumorales del Grupo B
Los marcadores tumorales Beta2 Microglobulina, ACE, CA19-9 y Testosterona se han ensayado con la ayuda de los equipamientos de ensayo de la solicitante, respectivamente Vidas® β2 Microglobulina, Vidas® ACE, Vidas® CA19-9™ y Vidas® Testosterona, siguiendo el protocolo de realización propio a cada equipamiento.
5 La proteína E-Cadherina se ha ensayado con la ayuda del kit E-Cadherina EIA kit (Takara Biochemicals, Tokyo, Japon) siguiendo el protocolo de realización del kit.
La proteína 3 alfa derivada del islote regenerador, denominada de otra forma Proteína Asociada a la Pancreatitis (PAP1), se ha ensayado con la ayuda del kit ELISA PANCREPAP (DynaBio, Marsella, Francia) siguiendo el
10 protocolo de realización del kit.
Las proteínas Galectina-3 y LDH se han ensayado con la ayuda de los anticuerpos descritos en el ejemplo 2. El Proteasoma 20 S se ha ensayado con la ayuda de los anticuerpos descritos en la patente EP0434670. Para hacer esto, los ensayos ELISA se han construido utilizando el autómata Vidas® (bioMérieux) y los reactivos del kit Vidas®
15 HBs Ag Ultra (bioMérieux, Cat. nº 30315). Los reactivos se han utilizado tal como se describen en las instrucciones correspondientes (ref. 11728 D -FR -2005/05), con las siguientes modificaciones:
1. Los conos se han sensibilizados con el anticuerpo de captura a una concentración de entre 5 y 30 g/ml.
20 2. El contenido del segundo pocillo del cartucho HBs Ag Ultra se ha sustituido por 300 l de anticuerpos de revelación, acoplado a la biotina, diluido a 1 g/ml en un tampón con suero de cabra y azida de sodio a 1 g/l.
3. Las muestras de suero, de plasma o de heces se diluyeron directamente en el segundo pocillo del cartucho HBs
Ag Ultra después, si es necesario, una dilución en tampón del segundo pocillo. 25
4. La reacción ELISA se ha realizado con la ayuda del autómata Vidas® y del protocolo HBS Ag Ultra. La etapa de incubación de la muestra con los anticuerpos de captura y de revelación estaba comprendida entre 14 y 100 ciclos.
5. Los resultados se han obtenido en forma de valores brutos después de la sustracción del ruido de fondo (lectura 30 del sustrato antes de la reacción).
La concentración del marcador tumoral presente en el fluido corporal a ensayar (sangre, suero, plasma, heces) se ha calculado según el modo de realización descrito en el párrafo 2, que se refiere a la valoración de LEI. Las condiciones de ensayo para diferentes marcadores tumorales se han recogido en la Tabla 7.
35 Tabla 7
- Proteína
- Galectina-3 LDH-B Proteasoma 20 S
- Anticuerpo de captura
- 12F8A12 a 15 g/ml 3F11E11 a 10 g/ml GD6 a 30 g/ml
- Anticuerpo de revelación
- 14A5G1 12F10G8 7A11
- Suero de cabra en el tampón de dilución
- Con Con Sin
- Volumen de heces
- 50 l 50 l 200l
- Volumen de suero
- 50 l 50 l 100 l
- Depósito de muestra
- 2º pocillo 2º pocillo 1º pocillo
- Duración de la incubación
- 100 ciclos 14 ciclos 14 ciclos
Las dosis obtenidas para los pacientes analizados con los marcadores tumorales Beta2 Microglobulina, ACE, CA199, Testosterona, E-Cadherina, proteína 3 alfa derivada del islote regenerador, Galectina-3, LDH y Proteasoma 20S
40 se han detallado respectivamente en las figuras 9 a 17.
Tres sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal muestran un aumento de su dosis de 2-Microglobulina sérica.
45 Diez sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal muestran un aumento de su dosis de ACE sérica. Más claramente, 1 suero de paciente que padece cáncer colorrectal de fase III y 7 sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal de fase IV muestran una elevación importante de su dosis de ACE sérica.
Nueve sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal muestran un aumento de su dosis de CA 19-9 sérica.
50 Más claramente, 1 suero de paciente que padece cáncer colorrectal de fase III y 7 sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal de fase IV muestran una elevación importante de su dosis de CA 19-9 sérica.
Diez sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal muestran una disminución de su dosis de Testosterona sérica. Más claramente, 1 suero de paciente que padece cáncer colorrectal de fase II, 1 suero de paciente que
15
25
35
45
55
65
padece cáncer colorrectal de fase III y 2 sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal de fase IV muestran una caída de su dosis de Testosterona sérica.
Dos sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal muestran un aumento de su dosis de proteína 3 alfa derivada del islote regenerador sérico.
Cuatro sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal de fase IV, 2 sueros de pacientes que padecen cáncer colorrectal de fase III y 1 suero de paciente que padecen cáncer colorrectal de fase II muestran un claro aumento de su dosis de Galectina-3 sérica.
Ejemplo 4: Utilización de las valoraciones séricas de los marcadores tumorales en combinación
La solicitante ha mostrado en el ejemplo 3 que unas dosis anormalmente elevadas o anormalmente bajas de marcadores tumorales se podían observar en la circulación sanguínea de algunos pacientes que padecen cáncer colorrectal. De manera sorprendente, el aumento o la disminución de la dosis sanguínea de dos marcadores dados no es observado sistemáticamente en los mismos pacientes. Así, la combinación de varios marcadores tumorales permite aumentar el número de pacientes identificados como que padecen cáncer colorrectal. Es así que un paciente A puede presentar un aumento o una disminución de uno o más marcadores tumorales (grupo X), pudiendo dichos marcadores del grupo X ser normales en un paciente B; en este mismo paciente B uno u otros diversos marcadores tumorales (grupo Y) pueden ser elevados o disminuidos, pudiendo dichos marcadores del grupo Y ser normales en el paciente A.
Los diferentes marcadores tumorales ensayados por la solicitante pueden así ser combinados mediante diversos algoritmos matemáticos bien conocidos por el experto en la materia. A título de ilustración y sin que este ejemplo tenga un carácter exhaustivo, se ha realizado el procedimiento siguiente:
- 1.
- Se ha fijado un valor límite para cada marcador tumoral.
- 2.
- Cuando la prueba sanguínea del marcador tumoral aumentaba en caso de cáncer colorrectal, la dosis sanguínea obtenida para un paciente dado se dividía por su valor límite. Cuando la dosis sanguínea del marcador tumoral disminuía en caso de cáncer colorrectal, la dosis sanguínea obtenida para un paciente dado se invertía y después se multiplicaba por su valor límite.
- 3.
- Cuando la relación dosis sanguínea dividida por valor límite era superior a 1, la relación se multiplicaba por un coeficiente, por ejemplo 10. El valor así obtenido se bautizó "resultado" para el paciente estudiado del marcador tumoral considerado.
- 4.
- Los resultados obtenidos para diferentes marcadores tumorales se añadieron ponderándolos de un factor propio a cada marcador. En el caso del ejemplo siguiente, todos los factores de ponderación se han fijado en 1.
- 5.
- La suma de los resultados se ha dividido por el número total de resultados sumados y el valor así obtenido se ha bautizado "resultado total".
- 6.
- El paciente se diagnostica como que padece un cáncer colorrectal cuando su resultado total aumentaba con respecto a un resultado límite.
Los resultados totales para una selección de 2, 4, y 8 marcadores que comprenden apolipoproteína AI se dan en la tabla 8.
La asociación de los marcadores tumorales apolipoproteína AI y galectina-3 permite así obtener para el mismo grupo de 13 pacientes unos resultados totales «2» aumentados en 9 pacientes que padecen cáncer colorrectal, mientras que la valoración sólo de apolipoproteína AI o galectina-3 se disminuía o aumentada respectivamente en 6 y 5 pacientes solamente. Conforme a las enseñanzas del ejemplo 3, el marcador apolipoproteína AI se disminuía en el caso de cáncer colorrectal y el marcador galectina-3 se aumentaba en caso de cáncer colorrectal.
La asociación de los marcadores tumorales apolipoproteína AI, apolipoproteína AII, E-cadherina y galectina-3 permite así obtener para el mismo grupo de 13 pacientes unos resultados totales de «4» aumentos en 10 pacientes que padecen cáncer colorrectal, mientras que la valoración sólo de apolipoproteína AI, apolipoproteína AII, Ecadherina o galectina-3 se disminuía o aumentada respectivamente en 6, 7, 1 y 5 pacientes solamente. Conforme a las enseñanzas del ejemplo 3, los marcadores apolipoproteína AI y apolipoproteína AII se disminuían en caso de cáncer colorrectal y los marcadores E-cadherina y galectina-3 se aumentaban en caso de cáncer colorrectal.
La asociación de los marcadores tumorales apolipoproteína AI, apolipoproteína AI, testosterona, LEI, LDH-B, L-FABP E-cadherina y galectina-3 permite así obtener, para el mismo grupo de 13 pacientes que padecen cáncer colorrectal, unos resultados totales de «8» aumentos en 11 pacientes mientras que la valoración sólo de apolipoproteína AI, apolipoproteína AII, testosterona, LEI, LDH-B, L-FABP, E-cadherina o galectina-3 era disminuída
o aumentada respectivamente en 6, 7, 4, 3, 1, 6, 1 y 5 pacientes solamente. Conforme a las enseñanzas del ejemplo 3, los marcadores apolipoproteína AI, testosterona y apolipoproteína AII se disminuían en caso de cáncer colorrectal y los marcadores LEI, LDH-B, L-FABP, E-cadherina o galectina-3 se aumentaban en caso de cáncer colorrectal.
Tabla 8
- Patología
- Identificador de la muestra Fase TNM Apo AI µg/ml Resultado total 2a Resultado total 4b Resultado total 8c
- CCR+
- CLSP076/F0 II T3N0M0 886,00 0,51 0,51 16,09
- CCR+
- CBSE021/F0 IV T4N2M1 703 10,63 9,07 14,20
- CCR+
- CBSE026/F0 IV T4N1M1 610 12,93 15,66 66,80
- CCR+
- CLSP074/F0 III T3N2M0 815 0,47 2,97 3,96
- CCR+
- CLSP076/F0 II T3N0M0 886 5,60 3,09 12,24
- CCR+
- CLSP078/F0 III T3N1M0 863 7,62 6,75 39,48
- CCR+
- CLSP095/F0 IV T3N1M1 957 0,40 0,45 0,60
- CCR+
- CLSP133/F0 II T3N0M0 718 5,36 2,88 3,84
- CCR+
- CLSP136/F0 II T3N0M0 679 5,66 7,01 9,34
- CCR+
- CLSP161/F0 IV T3N2M1 683 5,63 7,35 9,80
- CCR+
- GHBD015/F0 I TisN0M0 747 5,15 5,28 7,03
- CCR+
- GHBD016/F0 II T3N0M0 1225 0,31 0,32 0,43
- CCR+
- GHBD020/F0 II T3N0M0 916 9,63 5,15 12,60
- CCR
- N017197/F0 1303 0,68 0,45 0,61
- CCR
- N017218/F0 1360 0,28 0,28 0,38
- CCR
- N017365/F0 1413 0,27 0,30 0,39
- CCR
- N018544/F0 1190 0,32 0,36 0,48
- CCR
- N314199/F0 1060 0,58 0,72 0,59
- CCR
- N370510/F0 769 1,00 0,92 0,79
- CCR
- N370537/F0 1199 0,32 0,37 0,49
- CCR
- N376912/F0 1089 0,35 0,39 0,53
- CCR
- N440216/F0 973 0,40 0,45 0,60
- CCR
- N440478/F0 1334 0,29 0,30 0,40
- CCR
- N527135/F0 1271 0,30 0,33 0,44
- CCR
- N527450/F0 1037 0,37 0,35 0,46
- CCR
- N593116/F0 1333 0,29 0,32 0,43
- CCR
- N593183/F0 1111 0,35 0,38 0,50
- CCR
- N744056/F0 1220 0,32 0,47 0,47
- CCR
- N748022/F0 1675 0,23 0,23 0,31
- CCR
- N862300/F0 959 0,40 0,40 0,53
- Límite
- 769,00 1,00 0,92 0,79
a: asociación apolipoproteína AI y galectina-3
b: asociación apolipoproteína AI, apolipoproteína AII, E-cadherina y galectina-3 10
c: asociación apolipoproteína AI, apolipoproteína AII, testosterona, LEI, LDH-B, L-FABP, E-caderina y galectina-3
Ejemplo 5: Valoración de los marcadores tumorales en las heces
15 La extracción de las heces se realiza a partir de un trozo que pesa aproximadamente 1g, al que se añade 10 ml de tampón fosfato de sodio 100 mM, pH 7,2 que contiene 1 g/l de azida. Se homogeniza en un Vortex durante 1 min. La muestra sufre después 4 ciclos de ultrasonidos de 7s en hielo. La fracción no solubilizada se elimina por centrifugación a 2000 g, durante 10 minutos, a 4ºC. El sobrenadante se conserva a -30ºC hasta la valoración.
20 Los ensayos ELISA descritos en el ejemplo 3 se han utilizado para buscar los marcadores tumorales en las heces
después, si es necesario, de una dilución adaptada de las heces en el tampón del primer pocillo del cartucho HBs Ag
Ultra.
Las valoraciones obtenidas con los ensayos, Aminoacilasa 1, Galectina-3 y Proteasoma 20S se han representado 25 respectivamente en las figuras 18 a 20. Un aumento de la dosis de Aminoacilasa 1, de Galectina-3 y de Proteasoma
20S se observa respectivamente para 10, 14 y 8 heces de pacientes que padecen cáncer colorrectal.
Ejemplo 6: Detección mediante la técnica de ELISPOT de los marcadores tumorales
30 1. Cultivo celular
10
15
20
25
30
1/400 en la solución de saturación. Las láminas se lavan 3 veces durante 10 minutos en TBS-T, después de nuevo 3 veces durante 10 minutos en PBS. La revelación se realiza con el sustrato Sigma Fast (Cat. nº D-4168, Sigma-Aldrich) durante 5 min. La coloración se detiene por lavado en PBS. Se efectúa una contra-coloración con hematoxilina de Harris (Cat. nº MHS16, Sigma-Aldrich) durante 30 s. Después del lavado con agua y PBS, se montan las láminas para la observación en microscopio.
Los anticuerpos utilizados para el marcado por inmunohistoquímica se han seleccionado específicamente para esta aplicación, independientemente de su actividad en ELISA o en transferencia Western.
2. Detección del Inhibidor de la Elastasa de los leucocitos por inmunohistoquímica
Se han utilizado unas láminas de microarray de tejido para cribar un gran número de muestras. Se trata de tejidos cólicos punteados sobre láminas. Las características de los pacientes (características de los puntos de tejido cólico presentes en el array de tejido de cancer colorrectal), así como los resultados de los inmunomarcados por el anticuerpo anti-Inhibidor de la Elastasa de los leucocitos se recogen en la Tabla 10.
Tabla 10
- Diagnóstico
- Histología y caracterización Marcado en las células Marcado en el
- genética
- epiteliales estroma
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma conservado Positivo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma conservado Positivo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
- Tumor benigno
- Adenoma Negativo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma conservado Positivo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma LOH Positivo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma LOH Positivo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma LOH Negativo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma LOH Positivo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma MSI alta Positivo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma MSI alta Positivo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma Coloide Negativo Negativo
- Tumor maligno
- Adenocarnicoma Coloide Negativo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
- Normal
- Mucosa normal Negativo Negativo
Los resultados en la tabla ponen en evidencia que, en las biopsias de mucosas cólicas sanas, no hay marcado (10 negativos). El marcado es asimismo negativo en el adenoma (1/1). El marcado es positivo en las células epiteliales de las adenocarnicomas cólicas (+ en 8/11 pacientes). No hay marcado en el estroma.
3. Detección de Ezrina por inmunohistoquímica
Se han utilizado unas láminas de microarray de tejido para cribar un gran número de muestras. Se trata de tejidos cólicos punteados sobre láminas. Para cada paciente con un adenocarnicoma cólico, se han efectuado 3 extracciones en el centro del tumor, 3 extracciones a nivel del frente de invasión y 3 extracciones en el tejido sano. La Tabla 11 presenta los resultados de los inmunomarcados por el anticuerpo anti-Ezrina, el nivel de marcado indicado es el máximo de intensidad sobre las 3 muestras analizadas.
Tabla 11
- Identificador del paciente 55 127 329 475
- Centro del tumor + + + + Frente de invasión tumoral ++ + ++ ++ Tejido sano 0 0 + +
- 31
544 + +++ 726+ ++ 1203++ ++ + 1310 ++ +++ + 2003+ 0 + 2296++ ++ 0 2301+ +++ 2377+ + 0 3095+ + 0 3430+ + 0 3636+ + 0 3748+ + 0 3839+ ++0 38910 0 0 4054+ + 0 4322+ ++0 445 0 +++ 4474++ ++ 0 4792+ + + 4958++ ++ + 5101+ +++ 5318 ++ +++ 0 5374 + + 0 5472+ 0 + 6340++ + 0 6353++ + 0
En un muestreo de 30 pacientes, 25 tienen una sobreexpresión de Ezrina a nivel tumoral (centro del tumor o frente de invasión) con respecto al tejido sano adyacente.
5 4. Detección de la Aminoacilasa-1 por inmunohistoquímica
Se han utilizado unas láminas de microarray de tejido para cribar un gran número de muestras. Se trata de tejidos cólicos punteados sobre láminas. Para cada paciente con una adenocarnicoma cólico se han efectuado 3 extracciones en el centro del tumor, 3 extracciones a nivel del frente de invasión y 3 extracciones en el tejido sano.
10 La Tabla 12 presenta los resultados de los inmunomarcados por el anticuerpo anti-Aminociclasa, el nivel de marcado indicado es el máximo de intensidad sobre las 3 muestras analizadas.
Tabla 12
Identificador del paciente Centro del tumor Frente de la invasión tumoral Tejido sano
55++ ++ 0 1270 00 329++ ++ 0 475++ ++ + 544+ 00 7260 00 12030 + 0 13100 + + 2003++ 0 0 2296+ + 0 2301+ + + 2377 + + + 3095+ + 0 3430+ + + 3636++ + + 3748++ ++ 0 3839++ ++ +
- Identificador del paciente
- Centro del tumor Frente de la invasión tumoral Tejido sano
- 3891
- ++ ++ 0
- 4054
- + ++ 0
- 4322
- +++ +++ +
- 445
- + ++ +
- 4474
- + ++ +
- 4792
- ++ ++ +
- 4958
- + + +
- 5101
- + + ++
- 5318
- +++ ++ 0
- 5374
- + + 0
- 5472
- ++ ++ +
- 6340
- ++ ++ +
- 6353
- ++ ++ ++
En un muestreo de 30 pacientes, 21 tienen una sobreexpresión de la Aminoacilasa a nivel tumoral (centro del tumor
o frente de invasión) con respecto al tejido sano adyacente.
5 5. Detección de la Plastina-I por inmunohistoquímica
Se han utilizado unas láminas de microarray de tejido para cribar un gran número de muestras. Se trata de tejidos cólicos y rectales punteados sobre las láminas. Las características de los pacientes (características de los puntos del tejido cólico presentes en el microarray de tejido de cáncer colorrectal), así como los resultados de los
10 inmunomarcados por el anticuerpo anti-Plastina-I se recogen en la Tabla 13.
Tabla 13
Diagnóstico Histología y caracterización genética Marcado en las Marcado en el células epiteliales estroma Tumor maligno de colon Adenocarnicoma conservado ++ Negativo
Tumor maligno de colon Adenocarnicoma conservado ++ Negativo
Colon normal Mucosa normal + Negativo
Colon normal Mucosa normal + Negativo
Colon normal Mucosa normal + Negativo
Tumor benigno de colon Adenoma + Negativo
Tumor maligno de colon Adenocarnicoma conservado + Negativo
Tumor maligno de colon Adenocarnicoma LOH ++ Negativo
Tumor maligno de colon Adenocarnicoma LOH ++ Negativo
Colon normal Mucosa normal + Negativo
Colon normal Mucosa normal + Negativo
Colon normal Mucosa normal + Negativo
Tumor maligno de colon Adenocarnicoma LOH ++ Negativo
Tumor maligno de colon Adenocarnicoma LOH ++ Negativo
Tumor maligno de colon Adenocarnicoma MSI alto + Negativo
Colon normal Mucosa normal + Despegado
Colon normal Mucosa normal + Despegado
Tumor maligno de colon Adenocarnicoma coloide + Negativo
Colon normal Mucosa normal ++ Negativo
Colon normal Mucosa normal ++ Negativo
Recto normal Mucosa recto normal ++ Negativo
Recto normal Mucosa recto normal No específico Negativo
Recto normal Mucosa recto normal No específico Negativo
Recto normal Mucosa recto normal No específico Negativo
Tumor maligno del recto Adenocarnicoma LOH + Negativo
Tumor maligno del recto Adenocarnicoma LOH ++ Negativo
Tumor maligno del recto Adenocarnicoma LOH ++ Negativo
Tumor maligno del recto Adenocarnicoma LOH ++ Negativo
espectrómetro de masas, o bien un Sciex API 2000 de tripo cuadrupolo, o bien un Sciex API 4000 Qtrap (MS híbrido de triple cuadrupolo -trampilla iónica) (MDS Sciex) para una mejor sensibilidad. La separación LC se ha efectuado en una columna C18 Symmetry (Waters), a un caudal de elución de 300 l/min. (Eluyente A = 0,1% de ácido fórmico en agua, eluyente B = 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo, gradiente lineal de 5%B a 50%B en 25 minutos, 5 después 50%B a 100%B en 3 minutos). El análisis MS se realiza en modo de ionización positiva a una tensión de 5500 V aplicada con aguja que permite la ionización en la fuente. El control del instrumento y la adquisición de los datos se realizan con el programa Analyst 1.4.1. Los caudales del gas de nebulización (aire) y del gas cortina (nitrógeno) son de 30 y 20 psi, respectivamente. La fuente iónica Turbo VTM se ajusta a 400ºC, el flujo de nitrógeno auxiliar a 40 psi. Las transiciones MRM registradas para cada péptido se resumen en la tabla 14. La energía de 10 colisión (CE), la tensión de orificio (DP, declustering potential) y la tensión en la salida de la célula de colisión (CXP, collision cell exit potential) son optimizadas para cada una de las transiciones MRM seleccionadas.
2. Resultados
15 Para cada marcador tumoral (proteínas de la tabla 14), la lista de las transiciones MRM teórica se ha generado utilizando el programa MIDAS (MRM-initiated Detection and Sequencing). Esta lista comprende todos los iones parentales di-o tri-cargados de los péptidos trípticos teóricos en un intervalo de masa que va de 800 a 3000 Da y todos los iones fragmentos posibles de tipo y o b. Para cada proteína, cada transición posible se ha ensayo a fin de determinar las transiciones más sensibles y más específicas. El resultado de esta selección se resume en la tabla
20 14. Utilizando un péptido pesado de tipo AQUA (Sigma) o también una proteína recombinante pesada que servirán de patrón de ensayo, es posible cuantificar de manera absoluta el marcador tumoral de interés en un medio biológico complejo.
Tabla 14 25
- ApolipoproteínaA1
- Secuencia (SEQ ID N°)
- pI Q1 Q3 DP CE CXP
- AKPALEDLR (SEQ ID N° 16)
- 6,38 338,2 288,2 14 20 5
- 403,2
- 14 15 10
- 532,3
- 14 15 25
- ATEHLSTLSEK (SEQ ID N°17)
- 5,53 405,9 173,1 20 20 10
- 363,2
- 20 25 20
- LSPLGEEMR (SEQ ID N°18)
- 4,54 516,3 201,1 20 20 5
- 831,4
- 20 20 40
- 621,3
- 30 30 15
- QGLLPVLESFK (SEQ ID N°19)
- 6,11 615,9 299,2 20 30 15
- 819,5
- 20 35 40
- 186,1
- 20 35 5
- THLAPYSDELR (SEQ ID N°20)
- 5,39 651,3 239,1 20 30 5
- 352,2
- 20 35 15
- 879,4
- 20 35 25
- VQPYLDDFQK (SEQ ID N°21)
- 3,71 626,8 228,1 15 25 5
- 1025,5
- 15 20 30
- 513,2
- 15 25 25
- DYVSQFEGSALGK (SEQ ID N°22) \
- 4,13 700,8 279,1 15 35 5
- 378,2
- 15 20 10
- 1023,5
- 15 20 25
- 204,1
- 15 25 5
- Apolipoproteína A2
- EQLTPLIK (SEQ ID N°23)
- 6,4 471,3 260,2 20 30 15
- 147,1
- 20 30 25
- 684,5
- 20 20 35
- Aminoacilasa
- Secuencia
- pI Q1 Q3 DP CE CXP
- AVGVPALGFSPMNR (SEQ ID N°24)
- 10,35 708,4 517,3 20 30 23
- 808,4
- 20 35 28
- 228,1
- 20 32 7
- 1089,6
- 20 32 32
- VVNSILAFR (SEQ ID N°25)
- 10,35 509,8 199,1 15 25 5
- 820,5
- 15 25 28
- 506,3
- 15 25 20
- 393,2
- 15 25 15
- EGSVTSVNLTK (SEQ ID N°26)
- 6,99 567,8 248,2 15 28 7
- 661,4
- 15 28 25
- 762,4
- 15 28 32
- GPEEEHPSVTLFR (SEQ ID N°27)
- 4,58 749,3 819,5 20 38 35
- 956,5
- 20 38 30
- Ezrina
- Secuencia
- pI Q1 Q3 DP CE CXP
- IGFPWSEIR (SEQ ID N°28)
- 7,04 552,8 787,2 20 27 25
- 288
- 20 27 10
- 690,1
- 20 27 22
- 504,1
- 20 27 20
- ELSEQIQR (SEQ ID N°29)
- 4,31 501,8 303,0 20 25 15
- 416,2
- 20 25 18
- 760,2
- 20 25 25
- SGYLSSER (SEQ ID N°30)
- 10,1 449,7 478,2 20 25 20
- 591,4
- 20 22 20
- 391,0
- 20 22 15
- APDFVFYAPR (SEQ ID N°31)
- 6,76 591,8 272,2 20 28 10
- 1111,6
- 20 28 35
- L-FABP
- Secuencia
- pI Q1 Q3 DP CE CXP
- AIGLPEELIQK (SEQ ID N°32)
- 4,54 605,8 856,5 32 29 22
- 1026,58
- 32 30 27
- 185,1
- 32 30 5
- 242,2
- 32 33 5
- GVSEIVQNGK (SEQ ID N°33)
- 6,36 515,8 658,4 28 30 35
- 545,3
- 28 30 30
- 157,1
- 28 30 10
- 446,2
- 28 30 25
- TVVQLEGDNK (SEQ ID N°34)
- 4,13 551,8 261,2 35 28 10
- 675,33
- 35 28 34
- 201,1
- 35 28 10
- FTITAGSK (SEQ ID N°35)
- 9,0 412,7 576,3 23 27 30
- 463,3
- 23 27 30
- 249,1
- 23 27 10
- PDI
- Secuencia
- pI Q1 Q3 DP CE CXP
- EADDIVNWLK (SEQ ID N°36)
- 3,74 601,8 560,3 20 27 18
- 659,4
- 20 27 22
- DHENIVIAK (SEQ ID N°37)
- 5,24 519,8 253,1 20 25 10
- 331,2
- 20 25 13
- 786,4
- 20 25 30
- 657,4
- 20 25 25
- LITLEEEMTK (SEQ ID N°38)
- 4,01 603,8 328,2 20 30 11
- 766,3
- 20 30 25
- 980,5
- 20 30 32
- ENLLDFIK
- 4,11 496,3 407,3 20 25 16
- (SEQ ID N°39)
- 522,3 20 25 21
- 635,4
- 20 25 26
- Plastina I
- Secuencia
- pI Q1 Q3 DP CE CXP
- QFTPADVVSGNPK (SEQ ID N°40)
- 6,96 729,8 983,4 20 27 30
- 1183,6
- 20 27 35
- SLADGILLCK (SEQ ID N°41)
- 6,08 545,3 889,4 20 25 28
- 533,4
- 20 25 20
- 703,4
- 20 25 25
- 818,4
- 20 25 28
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