ES2561828T3 - Anticuerpos monoclonales contra bucles extracelulares de C5aR - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que es reactivo con el segundo bucle extracelular, residuos 175 a 206, de C5aR, en el cual el anticuerpo inhibe la fijación de C5a a C5aR.

Description

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Sorprendentemente, se ha observado que los MAbs 7F3, 6C12 y 12D4 son capaces también de inhibir la activación de los neutrófilos por otros ligandos quimioatrayentes. Ejemplos de estos otros ligandos quimioatrayentes incluyen los ligandos de CXCR1 y CXCR2 IL-8, ENA-78 y GPC-2. Esta capacidad para inhibir la función de diferentes receptores quimioatrayentes proporciona una ventaja inusual e inesperada sobre otras moléculas anti-C5aR conocidas. En particular, las moléculas anti-C5aR que son capaces de inhibir la función de receptores quimioatrayentes múltiples de neutrófilos son probablemente muy eficientes como agentes terapéuticos en el tratamiento de trastornos inmunopatológicos.

En un aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos que se fijan al segundo bucle extracelular, residuos 175 a 206, de C5aR, sea solos o en conjunción con otros bucles o dominios. En un aspecto preferido, la invención proporciona anticuerpos que se fijan a C5aR y tienen especificidad de epítopo igual o similar a la de uno cualquiera de los MAbs 7F3, 6C12 o 12D4.

El término "anticuerpo", como se utiliza en esta invención incluye moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, y Fv que son capaces de fijar el determinante epitópico. Estos fragmentos de anticuerpo tienen cierta capacidad para fijarse selectivamente con su antígeno o receptor y se definen como sigue:

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Fab, el fragmento que contiene un fragmento monovalente de fijación de antígeno de una molécula de anticuerpo puede producirse por digestión del anticuerpo entero con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada;

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Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo puede obtenerse por tratamiento del anticuerpo entero con pepsina, seguido por reducción, para proporcionar una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo;

(3)

F(ab')2, el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse por tratamiento del anticuerpo entero con la enzima pepsina sin reducción subsiguiente; F(ab)2 es un dímero de dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos por dos puentes disulfuro;

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Fv, definido como un fragmento diseñado genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; y

(5)

anticuerpo monocatenario ("SCA"), definido como una molécula manipulada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unidas por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula monocatenaria fusionada genéticamente.

Métodos para producción de estos fragmentos se conocen en la técnica. (Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988)).

Como se utiliza en esta invención, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al cual se fija el paratopo de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos consisten usualmente en agrupaciones de moléculas químicamente tensioactivas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen usualmente características estructurales tridimensionales específicas, así como características específicas de carga.

Pueden prepararse anticuerpos contra C5aR utilizando células que expresan C5sR, C5aR intacto o fragmentos que contienen uno o más bucles extracelulares como el antígeno inmunizador. Un péptido utilizado para inmunizar un animal puede derivarse de cDNA traducido o síntesis química y se purifica y conjuga a una proteína portadora, en caso deseado. Tales portadores utilizados comúnmente que están acoplados químicamente al péptido incluyen hemocianina de lapa bocallave (KLH), tiroglobulina, seroalbúmina bovina (BSA), y toxoide del tétanos. El péptido acoplado puede utilizarse luego para inmunizar el animal (v.g., un ratón o un conejo).

Si se desea, los anticuerpos policlonales pueden purificarse ulteriormente, por ejemplo, por fijación a y elución de una matriz a la cual está unido el péptido para el que se generan más anticuerpos. Las personas con experiencia en la técnica conocerán diversos métodos comunes en las técnicas de inmunología para purificación y/o concentración de anticuerpos policlonales, así como anticuerpos monoclonales (véase por ejemplo, Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por linajes de células continuos en cultivo, tales como, por ejemplo, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de las células B humanas, y la técnica del hibridoma EBW (Kohler et al. Nature 256, 495-497, 1975; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030, 1983; Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984).

Métodos conocidos en la técnica permiten que anticuerpos que exhiben fijación para un bucle extracelular de C5aR sean identificados y aislados a partir de bibliotecas de expresión de anticuerpos. Por ejemplo, un método para la identificación y aislamiento de un dominio de fijación de anticuerpo que exhibe fijación a un bucle extracelular de 7 10

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C5aR es el sistema vector del bacteriófago. Este sistema vector ha sido utilizado para expresar una biblioteca combinatoria de fragmentos Fab a partir del repertorio de anticuerpos de ratón en Escherichia coli (Huse, et al., Science, 246: 1275-1281, 1989) y del repertorio de anticuerpos humanos (Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:8095-8099, 1990). Esta metodología puede aplicarse también a linajes de células de hibridoma que expresan anticuerpos monoclonales con fijación para un ligando preseleccionado. Hibridomas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado pueden producirse de diversas maneras utilizando métodos bien comprendidos por quienes poseen experiencia ordinaria en la técnica, y no se repetirán aquí. Detalles de estas técnicas se describen en referencias tales como Monoclonal Antibodies-Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, editado por Roger H. Kennett, et al., Plenum Press, 1980; y U.S. 4,172,124.

Adicionalmente, métodos de producción de películas quiméricas de anticuerpo con diversas combinaciones de anticuerpos "humanizados" se conocen en la técnica e incluyen combinar regiones variables murinas con regiones constantes humanas (Cabily, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3273, 1984), o por injerto de las regiones determinantes de la complementariedad de (CDRs) de anticuerpos murinos en el entramado humano (Riechmann, et al., Nature 332:323, 1988).

Esta invención proporciona además anticuerpos quiméricos de los anticuerpos anti-C5aR de la presente invención o fragmentos biológicamente activos de los mismos. Como se utiliza en esta memoria, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie se combinan con las regiones constantes de anticuerpos derivados de una especie diferente o, alternativamente, se refiere a anticuerpos injertados en CDR. Los anticuerpos quiméricos se construyen por tecnología de DNA recombinante, y se describen en Shaw, et al., J. Immun., 138:4534 (1987), Sun, LK., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:214-218 (1987), por ejemplo.

Cualquiera de los anticuerpos arriba descritos o fragmentos de anticuerpo biológicamente activos pueden utilizarse para generar anticuerpos injertados en CDR y quiméricos. "CDR" o "región determinante de la complementariedad"

o "región hipervariable" se define como las secuencias de aminoácidos en las cadenas ligera y pesada del anticuerpo que forman la estructura del bucle tridimensional que contribuye a la formación del sitio de fijación del antígeno.

Como se utiliza en esta memoria, el término anticuerpo de "injertado en CDR" se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos en la cual al menos parte de una o más secuencias CDR del dominio ligero y/o variable han sido reemplazadas por partes análogas de secuencias CDR de un anticuerpo que tiene una especificidad de fijación diferente para un antígeno o receptor dado.

Los términos "región variable de cadena ligera" y "región variable de cadena pesada" se refieren a las regiones o dominios en la porción N-terminal de las cadenas ligera y pesada respectivamente que tienen una secuencia primaria de aminoácidos variada para cada anticuerpo. La región variable del anticuerpo está constituida por el dominio amino-terminal de las cadenas ligera y pesada tales como se pliegan las mismas unidas para formar un sitio de fijación tridimensional para un anticuerpo. Se dice que las secuencias CDR análogas están "injertadas" en el sustrato o anticuerpo receptor. El anticuerpo "donante" es el anticuerpo que proporciona la secuencia CDR, y el anticuerpo que recibe las secuencias sustituidas es el anticuerpo "sustrato". Una persona con experiencia en la técnica puede producir fácilmente estos anticuerpos injertados en CDR utilizando la doctrina proporcionada en esta memoria en combinación con métodos bien conocidos en la técnica (véase Borrebaeck, C.A., Antibody Engineering: A Practical Guide, W.H. Freeman and Company, Nueva York, 1992).

La invención proporciona también linajes de células que producen anticuerpos monoclonales de la invención. El aislamiento de linajes de células que producen anticuerpos monoclonales de la invención puede realizarse utilizando técnicas rutinarias de cribado, que permiten la determinación del patrón de reacción elemental del anticuerpo monoclonal de interés. Así, si un anticuerpo monoclonal que se ensaya se fija al segundo bucle extracelular de C5aR y bloquea la actividad biológica mediada por C5a, entonces el anticuerpo monoclonal que se ensaya y el anticuerpo monoclonal producido por los linajes de células de la invención son equivalentes.

Anticuerpos con una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de MAbs 7F3, 6C12 y 12D4 pueden identificarse por su capacidad para competir con dicho MAb particular para fijarse a C5aR (v.g., a células portadoras de C5aR, tales como transfectantes portadores de C5aR, monocitos, células dendríticas, macrófagos y basófilos). Utilizando quimeras receptoras (Rucker et al., Cell 87:437-446 (1996)) u otros métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, puede mapearse el sitio de fijación de uno cualquiera de los MAbs 7F3, 6C12 o 12D4.

Es posible también determinar, sin experimentación excesiva, si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad que un anticuerpo monoclonal de la invención averiguando si el primero evita la fijación del último a un péptido que comprende el segundo bucle extracelular de C5aR. Si el anticuerpo monoclonal que se ensaya compite con el anticuerpo monoclonal de la invención, como se muestra por una disminución en la fijación por el anticuerpo monoclonal de la invención, entonces los dos anticuerpos monoclonales se fijan al mismo epítopo, o un epítopo estrechamente afín.

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Otra vía adicional para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad de un anticuerpo monoclonal de la invención consiste en pre-incubar el anticuerpo monoclonal que se ensaya con un péptido al cual se supone que el anticuerpo es reactivo, y añadir luego el anticuerpo monoclonal de la invención para determinar si el anticuerpo monoclonal de la invención es inhibido en su capacidad para fijar el péptido. Si el anticuerpo monoclonal de la invención es inhibido entonces, con toda probabilidad, el anticuerpo monoclonal que se ensaya tiene la misma especificidad epitópica, o una especificidad funcionalmente equivalente, que el anticuerpo monoclonal de la invención. El cribado de anticuerpos monoclonales de la invención puede realizarse también utilizando péptidos adecuados y determinando si el anticuerpo monoclonal bloquea la fijación de C5a a C5aR.

Utilizando los anticuerpos monoclonales de la invención, es posible producir anticuerpos anti-idiotípicos que pueden utilizarse para cribar los anticuerpos monoclonales a fin de identificar si el anticuerpo tiene la misma especificidad de fijación que un anticuerpo monoclonal de la invención. Estos anticuerpos pueden utilizarse también para propósitos de inmunización (Herlyn, et al., Science, 232:100, 1986). Tales anticuerpos anti-idiotípicos pueden producirse utilizando técnicas de hibridoma bien conocidas (Kohler y Milstein, Nature, 256:495, 1975). Un anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo que reconoce determinantes singulares presentes en el anticuerpo monoclonal producido por el linaje de células de interés. Estos determinantes están localizados en la región hipervariable del anticuerpo. Es esta región (paratopo) la que se fija a un epítopo dado y, por tanto, es responsable de la especificidad del anticuerpo. Un anticuerpo anti-idiotípico se puede preparar por inmunización de un animal con el anticuerpo inmunizador de interés. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizador y producirá un anticuerpo para estos determinantes idiotípicos. Por utilización de los anticuerpos antiidiotípicos del animal inmunizado, que son específicos para un anticuerpo monoclonal de la invención producido por un linaje de células que se utilizó para inmunizar el segundo animal, es posible identificar otros clones con el mismo idiotipo que el anticuerpo del hibridoma utilizado para inmunización. La identidad idiotípica entre anticuerpos monoclonales de dos linajes de células demuestra que los dos anticuerpos monoclonales son iguales con respecto a su reconocimiento del mismo determinante epitópico. Así, por utilización de anticuerpos anti-idiotípicos, es posible identificar otros hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales que tienen la misma especificidad epitópica.

Es posible también utilizar la tecnología anti-idiotipo para producir anticuerpos monoclonales que mimetizan un epítopo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-idiotípico monoclonal producido a partir de un primer anticuerpo monoclonal tendrá un dominio de fijación en la región hipervariable que es la "imagen" del epítopo fijado por el primer anticuerpo monoclonal. Así, el anticuerpo anti-idiotípico monoclonal puede utilizarse para inmunización, dado que el dominio de fijación del anticuerpo anti-idiotípico monoclonal actúa de hecho como antígeno. Fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de fijación epitópicos de uno cualquiera de los MAbs de la presente invención pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, el DNA que codifica la región hipervariable puede clonarse, utilizando procedimientos estándar de DNA recombinante tales como los descritos en esta memoria, es un hospedador adecuado.

Anticuerpos preferidos de la presente invención comprenden regiones variables de uno o más bucles CDR que son sustancialmente iguales que los de los MAbs 7F3, 6C12 o 12D4. Se comprenderá que las regiones variables o los bucles de CDR que se muestran en los listados de secuencia pueden modificarse para uso en la presente invención. Típicamente, se hacen modificaciones que mantienen la especificidad de fijación de la secuencia. Pueden hacerse sustituciones conservadoras, por ejemplo, sin afectar a la especificidad de fijación del anticuerpo. Así, en una realización, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones con tal que la secuencia codificada retenga sustancialmente la misma especificidad de fijación. No obstante, en una realización alternativa, pueden hacerse modificaciones de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la invención intencionalmente para reducir la actividad biológica del anticuerpo. Por ejemplo, anticuerpos modificados que se mantienen capaces de fijarse a C5aR pero carecen de dominios secretores funcionales pueden ser útiles como inhibidores de la actividad biológica de C5aR.

Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir también el uso de análogos no existentes naturalmente, por ejemplo para aumentar la semivida en plasma sanguíneo de un anticuerpo administrado terapéuticamente.

En general, preferiblemente menos de 20%, 10%, o 5% de los residuos de aminoácido o de una variante o derivado están alterados en comparación con las regiones variables o los bucles CDR correspondientes representados en los listados de secuencias.

En el contexto de la presente invención, una secuencia "sustancialmente igual" que una de las regiones variables representadas en el listado de secuencias puede incluir una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85% o 90% idéntica, preferiblemente al menos 95 ó 98% idéntica al nivel de aminoácidos en al menos 20, preferiblemente al menos 50 aminoácidos con dicha región variable. La homología debería considerarse típicamente con respecto a aquellas regiones de la secuencia que se sabe son esenciales para la especificidad de fijación más bien que a secuencias no esenciales vecinas.

Las comparaciones de homología pueden realizarse a simple vista, o más usualmente, con ayuda de programas de comparación de secuencia disponibles fácilmente. Estos programas de computadora disponibles comercialmente pueden calcular el porcentaje de homología entre dos o más secuencias.

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El porcentaje de homología puede calcularse con respecto a secuencias contiguas, es decir, una secuencia está alineada con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia compararse directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se conoce como un alineamiento "sin lagunas". Típicamente, tales alineaciones sin lagunas se realizan sólo a lo largo de un número relativamente corto de residuos (por ejemplo menos de 50 aminoácidos contiguos).

Aunque éste es un método muy simple y consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias idénticas por lo demás, una inserción o deleción puede hacer que los residuos de aminoácido siguientes queden desalineados, dando así potencialmente como resultado una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una alineamiento global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineaciones óptimas que tienen en consideración las posibles inserciones y deleciones sin penalización excesiva del registro de homología global. Esto se logra por inserción de "lagunas" en el alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homología local.

La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalidades por laguna. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores por defecto cuando se utiliza dicho software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete Wisconsin Bestfit de GCG (véase más adelante) la penalidad de laguna por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 por laguna y -4 por cada extensión.

El cálculo del % máximo de homología requiere por tanto en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en consideración las penalidades por laguna. Un programa de computadora adecuado para realización de un alineamiento de este tipo es el paquete Wisconsin Bestfit de GCG (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencia incluyen, pero sin carácter limitante, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibid – Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el conjunto de herramientas de comparación de GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas en línea y fuera de línea (véase Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, se prefiere utilizar el programa Bestfit de GCG.

Aunque el % final de homología puede medirse en términos de identidad, el proceso de alineamiento propiamente dicho no está basado típicamente en una comparación por pares de tipo “todo-o-nada”. En lugar de ello, se utiliza generalmente una matriz de registro de semejanza en escala que asigna registros para cada comparación por pares basados en semejanza química o distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo utilizada comúnmente es la matriz BLOSUM62 -la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. Los programas Wisconsin de GCG utilizan generalmente los valores públicos por defecto o una tabla de comparación de símbolos habitual si está suministrada (véase el manual de usuario para detalles adicionales). Se prefiere utilizar los valores públicos por defecto para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo., es posible calcular el % de homología, preferiblemente % de identidad de secuencia. El software hace esto típicamente como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Humanización de anticuerpos

Se prefiere que un anticuerpo de la presente invención esté humanizado, es decir, sea un anticuerpo producido por técnicas de modelización molecular en las cuales el contenido humano del anticuerpo se maximiza al tiempo que causa poca o ninguna pérdida de afinidad de fijación atribuible a la región variable del anticuerpo murino. Así, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo quimérico que comprende la secuencia de aminoácidos de una región de entramado humana y de una región constante de un anticuerpo humano a fin de humanizar o hacer no inmunógena la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal de ratón tal como 7F3, 6C12 o 12D4.

Los métodos descritos a continuación son aplicables a la humanización de una gran diversidad de anticuerpos animales. Puede utilizarse un enfoque de dos pasos que implica (a) seleccionar secuencias de anticuerpo humanas que se utilizan como entramados humanos para humanización, y (b) determinar qué residuos de región variable del anticuerpo monoclonal animal debería seleccionarse para inserción en el entramado humano seleccionado.

El primer paso implica selección de las secuencias de entramado humano mejores disponibles para las cuales está disponible información de secuencia. Este proceso de selección está basado en los criterios de selección siguientes.

(1) Porcentajes de Identidad

Las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal animal que debe humanizarse se alinean óptimamente y se comparan preferiblemente con todas las secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos humanos conocidas.

Una vez que las secuencias se han comparado de este modo, se anotan las identidades de residuos y se

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Generalmente, el ensayo se realiza por detección de la migración direccional de células en o a través de una membrana o filtro, en dirección hacia los niveles aumentados de un compuesto, desde una primera superficie del filtro hacia una segunda superficie opuesta del filtro, en donde el filtro contiene una capa de células endoteliales en una primera superficie. La migración direccional ocurre desde el área adyacente a la primera superficie, a o a través de la membrana, hacia un compuesto situado en el lado opuesto del filtro. La concentración de compuesto presente en el área adyacente a la segunda superficie, es mayor que la existente en el área adyacente a la primera superficie.

En una realización utilizada para ensayar un inhibidor de anticuerpo, una composición que comprende células capaces de migración y que expresan C5aR puede ponerse en la primera cámara. Una composición que comprende uno o más ligandos o promotores capaces de inducir quimiotaxis de las células en la primera cámara (que tiene función quimioatrayente) se coloca en la segunda cámara. Preferentemente, poco antes de disponer las células en la primera cámara, o simultáneamente con las células, se dispone una composición que comprende el anticuerpo a testar, preferiblemente, en la primera cámara. Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que pueden fijarse al receptor e inhibir la inducción de quimiotaxis, por un ligando o promotor, de las células que expresan C5aR en este ensayo son inhibidores de la función del receptor (v.g., inhibidores de la función estimulante). Una reducción en la extensión de la migración inducida por el ligando o promotor en presencia del anticuerpo o fragmento es indicativa de actividad inhibidora. Estudios separados de fijación podrían realizarse para determinar si la inhibición es resultado de la fijación del anticuerpo al receptor u ocurre por un mecanismo diferente.

A continuación se describen ensayos in vivo que monitorizan la infiltración de leucocitos de un tejido, en respuesta a la inyección de un compuesto (v.g., quimiocina o anticuerpo) en el tejido, (véase Modelos de Inflamación). Estos modelos de retorno in vivo miden la capacidad de las células para responden a un ligando o promotor por emigración y quimiotaxis a un sitio de inflamación y para evaluar la capacidad de un anticuerpo o fragmento del mismo para bloquear esta emigración.

Además de los métodos descritos, los efectos de un anticuerpo o fragmento sobre la función estimuladora de C5aR pueden evaluarse por monitorización de las respuestas celulares inducidas por el receptor activo, utilizando células hospedadoras adecuadas que contienen el receptor.

Identificación de Ligandos, Inhibidores y/o Promotores de C5aR Adicionales

Los ensayos arriba descritos, que pueden utilizarse para evaluar la fijación y función de los anticuerpos y fragmentos de la presente invención, pueden adaptarse para identificar ligandos u otras sustancias adicionales que fijan C5aR o variantes funcionales del mismo, así como inhibidores y/o promotores de la función de C5aR. Por ejemplo, agentes que tienen la misma o similar especificidad de fijación que la de un anticuerpo de la presente invención o porción funcional del mismo pueden identificarse por un ensayo de competición con dicho anticuerpo o porción del mismo. Así, los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en métodos de identificación de ligandos del receptor u otras sustancias que fijan C5aR, así como inhibidores (v.g., antagonistas) o promotores (v.g., agonistas) de la función del receptor. En una realización, células que llevan una proteína C5aR o variante funcional de la misma (v.g., leucocitos, líneas de células o células hospedadoras adecuadas que han sido diseñadas por ingeniería para expresar una proteína C5aR de mamífero o variante funcional codificada por un ácido nucleico introducido en dichas células) se utilizan en un ensayo para identificar y evaluar la eficacia de ligandos u otras sustancias que se fijan al receptor, con inclusión de inhibidores o promotores de la función del receptor. Tales células son útiles también en el ensayo de la función de la proteína o polipéptido receptor expresada.

Ligandos y otras sustancias que se fijan al receptor, inhibidores y promotores de la función del receptor pueden identificarse en un ensayo adecuado, y evaluarse ulteriormente en cuanto a efecto terapéutico. Pueden utilizarse antagonistas de la función del receptor para inhibir (reducir o prevenir) la actividad del receptor, y pueden utilizarse ligandos y/o agonistas para inducir (desencadenar o aumentar) la función normal del receptor en caso indicado. Así, un antagonista de la función del receptor, identificado en un método que utiliza anticuerpos de la presente invención, puede utilizarse en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, con inclusión de enfermedad autoinmune y rechazo de injertos. Adicionalmente, un nuevo ligando o agonista de la función del receptor, identificado en un método que utiliza anticuerpos de la presente invención, puede proporcionar un nuevo enfoque para la estimulación selectiva de la función de los leucocitos, lo cual es útil, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer.

Como se utiliza en esta memoria, un "ligando" de una proteína C5aR hace referencia a una clase particular de sustancias que se fijan a una proteína C5aR de mamífero, con inclusión de ligandos naturales y formas sintéticas y/o recombinantes de ligandos naturales. En una realización preferida, la fijación de ligando de una proteína C5aR ocurre con afinidad alta.

Como se utiliza en esta memoria, un "antagonista" es una sustancia que inhibe (reduce o evita) al menos una función característica de una proteína C5aR tal como una actividad de fijación (v.g., fijación de ligando, fijación de promotor, fijación de anticuerpo), una actividad de señalización (v.g., activación de una proteína G de mamífero, inducción de aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico) y/o función de respuesta

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celular (v.g., estimulación de quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por los leucocitos). El término antagonista abarca sustancias que se fijan al receptor (v.g., un anticuerpo, un mutante de ligando natural, moléculas orgánicas de bajo peso molecular, otros inhibidores competitivos de la fijación de ligandos), y sustancias que inhiben la función del receptor sin fijarse al mismo (v.g., un anticuerpo anti-idiotípico).

Como se utiliza en esta memoria, un "agonista" es una sustancia que promueve (induce, causa, mejora o aumenta) al menos una función característica de una proteína C5aR tal como una actividad de fijación (v.g., fijación de ligando, inhibidor y/o promotor), una actividad de señalización (v.g., activación de una proteína G de mamífero, inducción de aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico) y/o una función de respuesta celular (v.g., estimulación de la quimiotaxis, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por los leucocitos). El término agonista abarca sustancias que se fijan al receptor (v.g., un anticuerpo, un homólogo de un ligando natural de otra especie), y sustancias que promueven la función del receptor sin fijarse al mismo (v.g., por activación de una proteína asociada). En una realización preferida, el agonista es distinto de un homólogo de un ligando natural.

Así pues, los anticuerpos de la invención pueden sutilizarse también en un método de detección o identificación de un agente que se fija a C5aR o variante de fijación de ligando del mismo, con inclusión de ligandos, antagonistas, agonistas, y otras sustancias que se fijan a C5aR o variante funcional. De acuerdo con el método, puede combinarse un agente a testar, un anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno de la presente invención (v.g., un anticuerpo que tiene una especificidad epitópica que es la misma que o similar a la de 7F3, y fragmentos de fijación de antígeno del mismo) y una composición que comprende un C5aR o una variante de fijación de ligando del mismo. Los componentes que anteceden se combinan en condiciones adecuadas para fijación del anticuerpo o fragmento de fijación de antígeno a C5aR, y la fijación del anticuerpo o fragmento a C5aR se detecta o mide, directa o indirectamente, conforme a métodos descritos en esta memoria u otros métodos adecuados. Una disminución en la cantidad de complejo formada con relación a un control adecuado (v.g., en ausencia del agente a testar) es indicativa de que el agente se fija a dicho receptor o variante. La composición que comprende C5aR puede ser una fracción de membrana de una célula portadora de la proteína C5aR recombinante o variante de fijación de ligando de la misma. El anticuerpo o fragmento del mismo puede estar marcado con un marcador tal como un radioisótopo, marcador de espín, marcador de antígeno o epítopo, marcador enzimático, grupo fluorescente y grupo quimioluminiscente.

Modelos de Inflamación

Están disponibles modelos de inflamación in vivo que pueden utilizarse para evaluar los efectos de los anticuerpos y fragmentos de la invención in vivo como agentes terapéuticos. Por ejemplo, la infiltración de leucocitos después de inyección intradérmica de una quimiocina y un anticuerpo o fragmento del mismo reactivo con C5aR en un animal adecuado, tal como conejo, ratón, rata, cobayo o macaco Rhesus puede monitorizarse (véase v.g., Van Damme, J. et al., J. Exp. Med., 176: 59-65 (1992); Zachariae, C. O. C. et al., J. Exp. Med. 171: 2177-2182 (1990); Jose, P. J. et al., J. Exp. Med. 179: 881-887 (1994)). En una realización, se evalúan histológicamente biopsias de piel respecto a infiltración de leucocitos (v.g., eosinófilos, granulocitos). En otra realización, se administran al animal células marcadas (v.g., células transfectadas de manera estable que expresan C5aR) susceptibles de quimiotaxis y extravasación. Un anticuerpo o fragmento a evaluar puede administrarse, sea antes, simultáneamente a o después de administrar las células marcadas al animal de test. Una disminución de la magnitud de infiltración en presencia de anticuerpo en comparación con la magnitud de infiltración en ausencia de inhibidor es indicativa de inhibición.

Aplicaciones Diagnósticas y Terapéuticas

Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención son útiles en una diversidad de aplicaciones, que incluyen aplicaciones de investigación, diagnósticas y terapéuticas. En una realización, los anticuerpos se marcan con un marcador adecuado (v.g. marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcador isotópico, marcador antigénico o epitópico o marcador enzimático). Por ejemplo, los mismos pueden utilizarse para aislar y/o purificar un receptor o porciones del mismo, y para estudiar la estructura (v.g. conformación) del receptor y función del receptor.

Adicionalmente, los diversos anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para detectar C5aR o para medir la expresión del receptor, por ejemplo, en células T (v.g., células CD8+, células CD45RO+), monocitos y/o en células transfectadas con un gen del receptor. Así, aquéllos tienen también utilidad en aplicaciones tales como clasificación de células (v.g., citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia), para propósitos diagnósticos o de investigación.

Los anticuerpos anti-C5aR de la presente invención tienen valor en aplicaciones diagnósticas. Típicamente, los ensayos diagnósticos implican detección de la formación de un complejo resultante de la fijación de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo a C5aR. Para propósitos diagnósticos, los anticuerpos o fragmentos de fijación de antígeno pueden estar marcados o sin marcar. Los anticuerpos o fragmentos pueden marcarse directamente. Pueden emplearse una diversidad de marcadores, que incluyen, pero sin carácter limitante, radionucleidos, agentes de fluorescencia, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos y ligandos (v.g., biotina, haptenos). Numerosos inmunoensayos apropiados son conocidos por el profesional experto (véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Núms. 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654 y 4.098.876). La inmunohistoquímica de

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(a) la fijación (v.g., de un ligando, un inhibidor o un promotor) al receptor, (b) una función de señalización de receptores, y/o (c) una función estimuladora. Los anticuerpos que actúan como inhibidores de la función de receptores pueden bloquear la fijación de ligandos o promotores directa o indirectamente (v.g. por causar un cambio de conformación). Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir la función de receptores por inhibición de la fijación de un ligando, o por desensibilización (con o sin inhibición de la fijación de un ligando). Los anticuerpos que se fijan a un receptor pueden actuar también como agonistas de la función del receptor, desencadenando o estimulando una función de receptor, tal como una señalización y/o función estimuladora de un receptor (v.g., tráfico de leucocitos) por fijación al receptor.

Así, un anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención puede utilizarse en un método de inhibición del tráfico de leucocitos en un mamífero (v.g. un paciente humano). Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse también en un método de inhibición de otros efectos asociados con la actividad de C5aR tales como migración de histamina por basófilos y liberación de gránulos por eosinófilos, basófilos y neutrófilos. La administración de un anticuerpo o fragmento de la presente invención puede dar como resultado mejora o eliminación del estado de enfermedad.

Los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse también inmunoterapéuticamente para enfermedad inmunopatológica asociada. El término "inmunoterapéuticamente" o "inmunoterapia", como se utiliza en esta memoria en asociación con los anticuerpos monoclonales de la invención denota administración tanto profiláctica como terapéutica. Así, los anticuerpos monoclonales pueden administrarse a pacientes de alto riesgo con objeto de reducir la probabilidad y/o gravedad de enfermedad inmunopatológica o ser administrados a pacientes que evidencian ya enfermedad activa, por ejemplo sepsis debida a infección por bacterias gram-negativas.

Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos pueden utilizarse para tratar alergia, aterogénesis, anafilaxis, enfermedad maligna, inflamación crónica y aguda, reacciones alérgicas mediadas por histamina e IgE, choque, y artritis reumatoide, ateroesclerosis, esclerosis múltiple, rechazo de aloinjertos, enfermedad fibrótica, asma, glomerulopatías inflamatorias o cualquier trastorno relacionado con el complejo inmune.

Enfermedades o afecciones de humanos u otras especies que pueden ser tratadas con inhibidores de la función del receptor C5aR (con inclusión de anticuerpos o fragmentos adecuados de los mismos), incluyen, pero sin carácter limitante:

(a)

enfermedades y afecciones inflamatorias o alérgicas, que incluyen enfermedades alérgicas respiratorias tales como asma, rinitis alérgica, enfermedades de hipersensibilidad pulmonar, neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades intersticiales del pulmón (ILD) (v.g., fibrosis pulmonar idiopática, o ILD asociada con artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, polimiositis o dermatomiositis); anafilaxis o respuestas de hipersensibilidad, alergias a fármacos (v.g., a penicilina, cefalosporinas), alergias por picaduras de insecto; enfermedades inflamatorias intestinales, tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; espondiloartropatías; escleroderma; psoriasis y dermatosis inflamatorias tales como dermatitis, eccema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica por contacto, urticaria; vasculitis (v.g. vasculitis necrotizante, cutánea, y de hipersensibilidad);

(b)

enfermedades autoinmunes, tales como artritis (v.g., artritis reumatoide, artritis psoriásica), esclerosis múltiples, lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, diabetes de aparición juvenil, nefritis tales como glomerulonefritis, tiroiditis autoinmune, y enfermedad de Behcet;

(c)

rechazo de injertos (v.g., en los trasplantes), con inclusión de rechazo de aloinjertos o enfermedad del injerto frente al hospedador;

(d)

ateroesclerosis;

(e)

cánceres con infiltración de leucocitos de la piel u órganos;

(f)

pueden tratarse otras enfermedades o afecciones (que incluyen enfermedades o afecciones mediadas por C5aR) en las cuales deben inhibirse las respuestas inflamatorias indeseables, incluyendo, pero sin carácter limitante, lesión de reperfusión, ictus, síndrome de dificultad respiratoria de los adultos, ciertas enfermedades malignas hematológicas, toxicidad inducida por citocinas, (v.g., choque séptico, choque endotóxico), polimiositis, dermatomiositis, penfigoide, Enfermedad de Alzheimer y enfermedades granulomatosas que incluyen sarcoidosis.

Los anticuerpos anti-C5aR de la presente invención pueden bloquear la fijación de uno o más ligandos, bloqueando con ello la cascada aguas abajo de uno o más eventos que conducen a los trastornos anteriores.

Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en el tratamiento de sepsis, ictus o síndrome de fatiga respiratoria de los adultos.

Enfermedades o afecciones de humanos u otras especies que pueden tratarse con promotores de la función de C5aR (con inclusión de anticuerpos o fragmentos de los mismos), incluyen, pero sin carácter limitante, inmunosupresión, tal como la de individuos con síndromes de inmunodeficiencia tales como SIDA, individuos sometidos a terapia de radiación, quimioterapia, terapia por enfermedad autoinmune u otra terapia con fármacos (v.g., terapia con corticosteroides), que causa inmunosupresión; e inmunosupresión debida a deficiencia congénita en la función de receptores u otras causas.

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Modos de Administración

Un método inmunoterapéutico puede implicar la administración de un agente terapéutico de la invención por inyección o infusión antes de (profilaxis) o después de (terapia) del comienzo de la enfermedad inmunopatológica.

Uno o más anticuerpos o fragmentos de la presente invención pueden administrarse a un individuo por una ruta apropiada, sea solo o en combinación con (antes, simultáneamente, o después) otro fármaco o agente. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse también en combinación con otros anticuerpos monoclonales o policlonales (v.g., en combinación con anticuerpos que se fijan a receptores de quimiocinas, con inclusión, pero sin carácter limitante, de CCR2 y CCR3) o con agentes anti-TNF u otros agentes antiinflamatorios o con productos existentes en el plasma sanguíneo, tales como gamma-globulina disponible comercialmente y productos de inmunoglobulinas utilizados para tratamientos profilácticos o terapéuticos. Los anticuerpos o fragmentos de la presente invención pueden utilizarse como composiciones administradas por separado dadas en conjunción con antibióticos y/o agentes antimicrobianos.

Se administra una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento (es decir, uno o más anticuerpos o fragmentos). Una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para alcanzar el efecto terapéutico deseado (con inclusión del efecto profiláctico), en las condiciones de administración, tal como una cantidad suficiente para inhibición de una función de C5aR, y por tanto, la inhibición de una respuesta inflamatoria.

Son posibles una diversidad de rutas de administración que incluyen, pero sin carácter necesariamente limitante, la administración oral, dietética, tópica, parenteral (v.g., intravenosa, intraarterial, intramuscular, inyección subcutánea), inhalación (v.g., inhalación intrabronquial, intraocular, intranasal u oral, gotas intranasales), dependiendo de la enfermedad o afección a tratar. Otros métodos adecuados de administración pueden incluir también dispositivos recargables o biodegradables y dispositivos polímeros de liberación lenta. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse también como parte de una terapia de combinación con otros agentes. La formulación de un anticuerpo o fragmento a administrar variará conforme a la ruta de administración y la formulación (v.g., solución, emulsión, cápsula) seleccionada. Una composición farmacéutica apropiada que comprende un anticuerpo o fragmento funcional del mismo a administrar puede prepararse en un vehículo o portador fisiológicamente aceptable. Puede utilizarse también una mixtura de anticuerpos y/o fragmentos. Para soluciones o emulsiones, portadores adecuados incluyen, por ejemplo, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólico/acuosas, con inclusión de solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer's lactados o aceites fijos. Una diversidad de portadores acuosos apropiados son conocidos por el profesional experto, que incluyen agua, agua tamponada, solución salina tamponada, polioles (v.g., glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido), solución de dextrosa y glicina. Vehículos intravenosos pueden incluir diversos aditivos, conservantes, o restablecedores de fluidos, nutrientes o electrólitos (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Science, Edición 16ª, Mack editores, 1980). Las composiciones pueden contener opcionalmente sustancias adyuvantes farmacéuticamente aceptables en caso requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste del pH y agentes tampón así como agentes de ajuste de la toxicidad, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y lactato de sodio. Los anticuerpos y fragmentos de esta invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su utilización conforme a métodos de liofilización y reconstitución conocidos en la técnica. La concentración óptima del o los ingredientes activos en el medio seleccionado puede determinarse empíricamente, conforme a procedimientos bien conocidos por el profesional experto, y dependerá de la formulación farmacéutica final deseada. Para inhalación, el anticuerpo o fragmento puede solubilizarse y cargarse en un dosificador adecuado para administración (v.g., un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosoles presurizados).

Los intervalos de dosificación para la administración de los anticuerpos monoclonales de la invención son aquéllos que son suficientemente amplios para producir el efecto deseado en el cual se mejoran los síntomas de la enfermedad inmunopatológica o se reduce la posibilidad de infección o sobre-estimulación del sistema inmunitario. La dosificación no debería ser tan grande que cause efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardiaca congestiva, y análogos. Generalmente, la dosificación variará con la edad, la afección, el sexo y la extensión de la enfermedad en el paciente y puede ser determinada por una persona con experiencia en la técnica. La dosificación puede ser ajustada por el médico individual en el supuesto de cualquier complicación. La dosificación puede variar desde aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, con preferencia desde aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, con gran preferencia desde aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones diarias, durante uno o varios días.

Será apreciado por los expertos en la técnica que los anticuerpos de la presente invención pueden introducirse en un individuo por administración de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el anticuerpo. La molécula de ácido nucleico puede encontrarse en la forma de DNA o RNA o una molécula quimérica que comprende a la vez DNA o RNA. Una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo puede clonarse en un vector de expresión en el que la secuencia de codifica el agente está ligado operativamente a elementos de control de la expresión. Los elementos de control de la expresión son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo,

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Los resultados presentados en la Figura 7 demuestran que los 3 MAbs exhibían inhibición de la migración de neutrófilos hacia C5a comparados con los dos controles negativos. En particular, el MAb 7F3 exhibía la inhibición más eficaz, dando como resultado una reducción de 140 veces en los números de migración de neutrófilos respecto

5 a los niveles de ruido de fondo.

EJEMPLO 6: Inhibición de la migración de neutrófilos dirigida por IL-8 humano por los MAbs 7F3, 12D4 y 6C12

Los tres 3MABS anti-C5aR, 7F3, 12D4 y 6C12; y la muestra dializada de 7F3 se añadieron a neutrófilos purificados

10 (1 × 107/ml) a 5 µg/ml y se cargaron en la cámara superior de inserciones de 24 pocillos. Se incluyeron nuevamente controles negativos (sin adición alguna de Ab, y con adición de 1x PBS). Después de 10 minutos de incubación a la temperatura ambiente, se pusieron luego las inserciones en cámaras inferiores que contenían IL-8 (1,12 a 1120 ng/ml), un quimioatrayente de neutrófilos humanos que fija los receptores CXCR1 y CXCR2 expresados en la superficie de los neutrófilos. Los neutrófilos se incubaron luego durante 30 minutos a 37° de. El número de

15 neutrófilos que migraban a través de la membrana a la cámara inferior se cuantificó por citometría de flujo (FACSCalibur; BD Biosciences).

La Figura 8 (a) muestra que los tres MAbs exhibían inhibición de la migración de neutrófilos hacia IL-8. MAb 7F3 (tanto dializado como no dializado) era el inhibidor más eficaz, dando como resultado una reducción de 5 veces en

20 los números de migración de neutrófilos.

Se testó también MAb 7F3 respecto a su capacidad para inhibir otros quimioatrayentes de neutrófilos, particularmente los ligandos CXCR1 y CXCR2. La Tabla 1 muestra la inhibición sustancial de la migración de neutrófilos a varios quimioatrayentes de neutrófilos, en particular los ligandos CXCR1 y CXCR2, en ensayos de

25 quimiotaxis de neutrófilos.

Tabla 1

Quimioatrayente (112 ng/ml)

% Inhibición

C5a

98

IL-8

81

GCP-2

91

ENA-78

83

EJEMPLO 7: inhibición competitiva de la fijación de los MAbs 7F3, 12D4 y 6C12 a transfectantes de C5aR 30 por un péptido C5aR (9-29) N-terminal

La fijación de los MAbs 7F3, 12D4 y 6C12 a células transfectadas con C5aR se midió por tinción con IgG anti-ratón de oveja conjugado con fluoresceína (FITC). La capacidad de un péptido N terminal C5aR (residuos 9-29) para inhibir la fijación se evaluó luego conforme a la metodología arriba descrita. Este péptido N-terminal C5aR tiene la

35 secuencia PDYGHYDDKDTLDLNTPVDKT y se hace referencia al mismo en esta memoria como “PEPI”.

La Figura 9(a) muestra que las concentraciones crecientes de PEPI no inhibían la tinción por fluorescencia de los 3MAbs anti-C5aR. La tinción por fluorescencia se mantenía estable, incluso a concentraciones de PEPI de 100 TM.

40 La Figura 9(b) muestra que PEPI (a una concentración de 50 TM) no lograba inhibir la tinción por FACS de los neutrófilos purificados con MAb 7F3.

EJEMPLO 8: Reactividad de MAbs 7F3, 12D4 y 6C12 con el péptido N terminal 9-29 de C5aR (“PEPI”) y OPG

45 Se realizaron ensayos ELISA como se ha descrito arriba para medir la reactividad de los MAbs 6C12, 12D4, y 7F3 con PEPI y OPG. OPG es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF que se fijan específicamente a su ligando TNFSF11/OPG. Más específicamente, OPG es un receptor de reclamo secretado por los osteoblastos que funciona como regulador negativo de la resorción ósea.

50 Se utilizaron los MAbs 6C12, 12D4 y 7F3 en el ELISA como proteínas purificadas a una concentración de 1 Tg/ml. Como controles positivos se utilizaron MAb 9C1 (que es específico para OPG) y MAb 11B9 (que reconoce PEPI). Estos MAbs de control se utilizaron en la forma de sobrenadantes de cultivo de tejidos sin diluir.

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La Figura 10 muestra que MAbs 6C12, 12D4 y 7F3 no eran reactivos con PEPI. MAb 7F3 exhibía un pequeño grado de reactividad cruzada con OPG.

EJEMPLO 9: Determinación de la secuencia de los MAbs anti-C5aR 7F3, 12D4 y 6C12

La secuencia de nucleótidos de los anticuerpos anti-C5aR 7F3, 12D4 y 6C12 se determinó a partir de RNA extraído de células de hibridoma que expresaban los anticuerpos. Para determinar los cebadores utilizados para amplificar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, la secuencia de proteínas de la región variable de los 3 anticuerpos fue determinada por Biogen Inc. y se determinó el isotipo de los anticuerpos utilizando el kit de determinación del isotipo Mouse Monoclonal Antibody -IsoStrip (Roche Cat. No. 1493027). Para ello, se derivó el cebador 5’ Framework 1 de la secuencia de proteínas de Biogen Inc. y se basó el cebador 3’ en el isotipo de los anticuerpos.

El isotipo de cada uno de los anticuerpos anti-C5aR es como sigue:

6C12: Kappa de cadena ligera 6C12: IgG3 de cadena pesada 7F3: Kappa de cadena ligera 7F3: IgG2a de cadena pesada 12D4: Kappa de cadena ligera 12D4: IgG3 de cadena pesada

Se aisló el RNA total de las células de hibridoma utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Cat. No. 15.596-018). Se aisló el RNA como se describe por el fabricante. De manera resumida, se lisaron aproximadamente 5 × 106 células en 1 ml de reactivo Trizol. Los residuos celulares se aclararon con 200 T1 de cloroformo y centrifugación. La capa acuosa que contenía RNA se separó y el RNA se precipitó con 250 T1 de isopropanol. Se utilizó el RNA total (2Tg) para producir cDNA utilizando la transcriptasa inversa AMV (Promega Cat. No. M5101). El cDNA se utilizó luego como molde para amplificar la secuencia codificante de la región variable utilizando los cebadores siguientes:

Cebadores para la cadena ligera variable de 6C12:

mIgkapFR15': GATGTTTTGATGACCCAAACTCC (SEQ ID NO:2)

mIgkapcon3': ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG (SEQ ID NO:3)

Cebadores para la cadena pesada variable de 6C12:

mIgVh2 5' SAGGTCCAGCTGCARCAGTC (SEQ ID NO:4) Familia FR1 VhIIA mIgG3con3' TGGGCATGAAGAACCTGG (SEQ ID NO:5) Región bisagra

Cebadores para la cadena ligera variable de 7F3:

mIgkapFR15': GATGTTTTGATGACCCAAACTCC (SEQ ID NO:6)

mIgkapcon3': ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG (SEQ ID NO:7)

Cebadores para la cadena pesada variable de 7F3:

mIgVh2 5': SAGGTCCAGCTGCARCAGTC (SEQ ID NO:8) Familia FR1 VhIIA mIgG2acon3': TTTGCATGGAGGACAGGG (SEQ ID NO:9)

Cebadores para la cadena ligera variable de 12D4:

mIgkapFR15': GATGTTTTGATGACCCAAACTCC (SEQ ID NO:10)

mIgkapcon3': ACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG (SEQ ID NO 11)

Cebadores para 12D4 la cadena pesada variable de 12D4 :

mIgVh1 5': CAGGTGCAGCTGAAGSAGTC (SEQ ID NO:12) Familia FR1 VhIB mIgG3con3': TGGGCATGAAGAACCTGG (SEQ ID NO:13) Región bisagra

Se llevó a cabo la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando la polimerasa Pfu de alta fidelidad (Promega Cat. No. M7741) con una temperatura de reasociación de 60 ºC y una extensión de cebadores a 72 ºC durante 3 minutos. El fragmento PCR de aproximadamente 700 pares de bases resultante se clonó en pGEM-Teasy (Promega Cat. No. A1360). Las colonias simples se aislaron y se secuenciaron por medio de un equipo comercial de secuenciación ((SUPAMAC). Las secuencias resultantes se proporcionan a continuación como sigue:

Secuencia variable de cadena ligera (DNA) de 6C12: SEQ ID NO:14 Secuencia variable de cadena ligera (proteína) de 6C12: SEQ ID NO:15 Secuencia variable de cadena pesada (DNA) de 6C12: SEQ ID NO: 16

5 Secuencia variable de cadena pesada (proteína) de 6C12: SEQ ID NO:17 Secuencia variable de cadena ligera (DNA) de 7F3: SEQ ID NO:18 Secuencia variable de cadena ligera (proteína) de 7F3: SEQ ID NO:19 Secuencia variable de cadena pesada (DNA) de 7F3: SEQ ID NO:20 Secuencia variable de cadena pesada (proteína) de 7F3: SEQ ID NO:21 Secuencia variable de cadena ligera (DNA) de 12D4: SEQ ID NO:22 Secuencia variable de cadena ligera (proteína) de 12D4: SEQ ID NO:23 Secuencia variable de cadena pesada (DNA) de 12D4: SEQ ID NO:24 Secuencia variable de cadena pesada (proteína) de 12D4: SEQ ID NO:25

15 EJEMPLO 10: Análisis de la identidad y semejanza de secuencias de DNA y proteínas para los MAbs 7F3, 12D4 y 6C12

Las secuencias de DNA y proteínas de los 3 anticuerpos anti-C5aR (7F3, 12D4 y 6C12) se compararon utilizando MacVector 6.5.3. Para este análisis se utilizó el programa de alineamiento múltiple ClustalW (1.4).

(i) Análisis de las secuencias de DNA variable de cadena ligera :

El alineamiento de las secuencias de DNA variables de cadena ligera para 7F3, 12D4 y 6C12 se muestra en la Figura 11.

25 El análisis de alineamiento de secuencia múltiple ClustalW (1.4) proporcionó los resultados siguientes:

3 Secuencias Alineadas Registro de Alineamiento = 6612

Lagunas Insertadas = 0 Identidades Conservadas = 315

Modo de Alineamiento por Pares: Lento

Parámetros de Alineamiento por Pares:

Penalidad por Laguna Abierta = 10,0 Penalidad por Extensión de Laguna = 5,0 35 Parámetros de alineamiento múltiple:

Penalidad por Laguna Abierta = 10,0 Penalidad por Extensión de Laguna = 5,0

Divergencia de Demora = 40% Transiciones: Ponderadas

Tiempo de procesamiento: 0,4 segundos

1. 7F3 Vk frente a 6c12 Vk

45 Longitud Alineada = 336 Lagunas = 0 Identidades = 320 (95%)

2. 7F3 Vk frente a 12d4 Vk Longitud Alineada = 336 Lagunas = 0 Identidades = 320 (95%)

55 3. 6c12 Vk frente a 12d4 Vk Longitud Alineada = 336 Lagunas = 0 Identidades = 326 (97%)

(ii) Análisis de la secuencia de DNA variable de cadena pesada:

El alineamiento de las secuencias de DNA variable de cadena pesada para 7F3, 12D4 y 6C12 se muestra en la 65 Figura 12.

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Claims (1)

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