ES2560557T3 - Materiales y métodos con relación a la glicosilación de polipéptidos terapéuticos - Google Patents

Abstract

Un método para la glicosilación de un polipéptido terapéutico, en donde el método comprende formar un conjugado covalente entre un azúcar aceptor y un compuesto de ácido 3-fluorosiálico, el método comprende poner en contacto el azúcar aceptor, el compuesto de ácido 3-fluorosiálico y una enzima capaz de transferir el compuesto de ácido 3-fluorosiálico al azúcar aceptor, el paso de contacto tiene lugar en condiciones adecuadas para la transferencia y unión covalente del compuesto de ácido 3-fluorosiálico al azúcar aceptor, en donde el compuesto de ácido 3-fluorosiálico no comprende un grupo de citidina monofosfato (CMP), y en donde el azúcar aceptor está presente en, o para unirse a, el polipéptido terapéutico, y, en donde el compuesto de ácido 3-fluorosiálico está representado por la fórmula general (I):**Fórmula** en donde: Y1 se selecciona de -O-, -S-, o -NR-, en donde R se selecciona independientemente de H, alquilo C1-7, heterociclilo C3-10, o arilo C5-20; R1 es un buen grupo saliente capaz de soportar y estabilizar una carga negativa, con la condición de que no sea un grupo de citidina monofosfato (CMP); X1 es -CO2R, en donde R es como se definió anteriormente; R2 se selecciona de H, OH o haluro; R3 y R4 son cada uno seleccionados independientemente de H, -OR, -NR2 o -Z1(CH2)mZ2, donde R es como se definió anteriormente, Z1 se selecciona de -O-, -NR-, -CR2- y -S-, m es de 0 a 5 y Z2 se selecciona de -OR, -NR2 o - CN; con la condición de que R3 y R4 no pueden ambos ser H; R5 es H; R6 se selecciona de alquilo C1-7 ; hidroxialquilo C1-7, aminoalquilo C1-7 o tioalquilo C1-7; R7 es un grupo de fórmula:**Fórmula** en donde Y2 se selecciona de N, O, S, y CH; Z3 se selecciona de H, hidroxilo, haluro, alquilo C1-7 , aminoalquilo C1-7, hidroxialquilo C1-7, o tioalquilo C1-7; R9 y R10 se seleccionan independientemente de H, hidroxilo, hidroxialquilo C1-7, alquilo C1-7, arilo C5-20, C(O)Z4, en donde Z4 se selecciona de alquilo C1-7 o arilo C5-20, con la condición de que si Y2 es O o S, R10 está ausente; o donde R4 es distinto de hidroxilo, R7 puede adicionalmente ser hidroxialquilo C1-7; R8 es hidrógeno; o un oligómero de dos o más moléculas de fórmula (I); y estereoisómeros, formas tautómeras, sales, solvatos o formas químicamente protegidas de los mismos, en donde el término C1-7 pertenece a un resto monovalente obtenido por eliminación de un hidrógeno de un hidrocarburo C1-7, que puede ser alifático o alicíclico, o una combinación de los mismos, y donde el aceptor del azúcar es parte de una estructura de glicosilación, la estructura de glicosilación comprende un polisacárido sintético o que ocurre de forma natural. y que comprende la etapa de unir el conjugado al polipéptido terapéutico cuando la estructura de glicosilación no está ligada a un polipéptido terapéutico.

Description

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DESCRIPCION

Materiales y metodos con relacion a la glicosilacion de polipeptidos terapeuticos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a materiales y metodos con relacion a la glicosilacion, y mas particularmente a la produccion de estructuras de glicosilacion que son resistentes a la degradacion enzimatica, modulando de esta manera una o mas de sus propiedades biologicas o las de los restos terapeuticos que se incorporan a ellas. Mas espedficamente, la presente invencion implica hacer reaccionar sustratos de carbohidrato activados que contienen fluor, tal como compuestos del acido 3-fluorosialico, con aceptores de azucar para producir conjugados covalentes del aceptor de azucar y uno o mas de los compuestos de acido sialico.

La materia del sujeto que no esta recogida por el alcance de las reivindicaciones no forma parte de la presente invencion reivindicada.

Antecedentes de la invencion

La mayona de los polipeptidos de origen natural contienen restos de carbohidratos unidos covalentemente al polipeptido en alguno de los residuos de aminoacidos de la cadena polipeptfdica primaria. Estos polipeptidos se denominan generalmente en la tecnica como glicopeptidos o glicoprotemas. Tambien se sabe que la naturaleza del patron de glicosilacion en cualquier polipeptido dado puede afectar a sus propiedades, incluyendo la resistencia a las proteasas, el trafico intracelular, la secrecion, la orientacion al tejido, la semivida biologica y la antigenicidad cuando el polipeptido esta presente en un sistema biologico tal como una celula o un individuo.

La glicosilacion de polipeptidos es una forma natural de modificacion post-translacional que altera la estructura y funcion de los polipeptidos. En la naturaleza, la glicosilacion es introducida por procesos enzimaticos que conducen a una modificacion espedfica del sitio de diferentes tipos de polipeptidos glicosilados. En la glicosilacion unida a N, los glicanos estan unidos a un nitrogeno de amida de las cadenas laterales de asparagina y en la glicosilacion unida a O, los glicanos esta unidos al oxfgeno del hidroxi de las cadenas laterales de serina y treonina. Otras formas de glicosilacion incluyen glicosaminoglicanos que se unen al oxfgeno del hidroxi de la serina, glicolfpidos en la que los glicanos estan unidos a la ceramida, hialorunano que no esta unido ni a protemas ni a lfpidos, y anclajes GPI que unen protemas a los lfpidos a traves de enlaces de glicano.

Hay un problema en general en la tecnica consistente en que a menudo se anade la glicosilacion a polipeptidos en celulas eucariotas, pero raramente se anade a polipeptidos expresados en hospedantes procariotas a menudo usados para la expresion recombinante de polipeptidos terapeuticos. Esta ausencia de glicosilacion en polipeptidos producidos en hospedantes procariotas puede conducir a que los polipeptidos se reconozcan como extranos o significar que tengan propiedades que de otra manera difieren de sus formas nativas. Hay tambien un problema consistente en la dificultad para fabricar la glicosilacion en los polipeptidos en los lugares donde no hay glicosilacion nativa, en un intento de usar esto para modular las propiedades de los polipeptidos.

Por lo tanto, ha habido intentos en la tecnica para introducir o modificar el patron de glicosilacion de polipeptidos, por ejemplo, en situaciones en las que la expresion del polipeptido podna causar un cambio en el patron de glicosilacion natural del polipeptido (por ejemplo, expresion en hospedantes bacterianos) o donde se desea modificar el patron de glicosilacion del polipeptido con la esperanza de mejorar una o mas de las caractensticas del polipeptido, especialmente cuando el polipeptido es una protema terapeutica. Por ejemplo, vease la modificacion del interferon beta descrita en el documento de patente de los Estados Unidos N°: 7226903 o los metodos para fabricar glicoprotemas descritos en el documento de patente internacional WO 2004/035605.

Las moleculas de glicano que se unen a los polipeptidos tienen una gama de estructuras lineales y ramificadas y diferentes longitudes de cadena de glicano y las moleculas de glicano espedficas presentes en un polipeptido afectan a las caractensticas del polipeptido. Muchos tipos de moleculas de glicano incluyen acidos sialicos terminales. Se sabe que estos azucares de nueve carbonos, que llevan una carga negativa a pH fisiologico, estan implicados en las interacciones ligando-receptor que pueden afectar en gran medida las comunicaciones espedficas celula-celula, patogeno-celula, o farmaco-celula. Una caractenstica particular de las cadenas de glicano que incluyen residuos de acido sialico terminales es que aumentan la semivida de los polipeptidos glicosilados terapeuticos con ellos. Esto se conoce a partir de observaciones de que los polipeptidos que comprenden glicanos sin residuos de acido sialico terminales se eliminan rapidamente de la circulacion por el tugado, reduciendo de este modo la semivida del polipeptido terapeutico.

Azucares sustituidos con fluor han sido utilizados como sustratos no procesables para su uso en la cristalizacion de enzimas tales como CstII (Chiu et al., Nat. Struct. Mol. Biol. (2004) 11, 163-170). En este contexto, los sacaridos que contienen fluor son conocidos por ser resistentes al procesamiento enzimatico donde la glicosiltransferasa esta actuando sobre el enlace glicosfdico del carbohidrato que contiene fluor.

Un derivado del acido 2,3-difluorosialico ha sido sintetizado y usado como un inactivador de las sialidasas de los parasitos Trypanosoma cruzi (Watts et al., J. Am. Chem. Soc. (2003) 125, 7532-7533) y Trypanosoma rangeli (Watts

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et al., Can. J. Chem. (2004) 82, 1581-1588). Este trabajo inicial condujo al descubrimiento de que estas sialidasas operan a traves de la participacion de un intermedio de enzima sialosilo covalente y se establecio que los compuestos tales como este derivado actuaban como inhibidores covalentes dependientes del tiempo de las sialidasas del tripanosoma.

Posteriormente tambien se ha demostrado que un derivado del acido 2,3-difluoro neurammico que tiene un grupo hidroxi en C-5 en lugar del grupo natural de N-acetilo tambien actua como un inactivador covalente de la sialidasa de T. rangeli, pero muestra un comportamiento muy diferente cinetico (kinact y kreact) al inhibidor original (Watts et al., J. Biol. Chem. (2006) 281,4149-4155).

En resumen, la modificacion de la glicosilacion de polipeptidos, especialmente para modificar sus propiedades biologicas, sigue siendo un problema diffcil y uno que no ha sido abordado de manera satisfactoria en la tecnica anterior.

Compendio de la invencion

En terminos generales, la presente invencion se basa en el reconocimiento de que los compuestos de acido fluorosialico, tales como los compuestos de acido 3-fluorosialico, pueden usarse para formar conjugados con aceptores de azucar que modulan una o mas de las propiedades biologicas del conjugado o del resto terapeutico que incorpora el conjugado. Por lo tanto, las estructuras de glicosilacion modificadas producidas utilizando estos metodos pueden ser introducidas en o ser una parte de restos terapeuticos, tales como polipeptidos. Asf, en un aspecto, la presente invencion se refiere a metodos para hacer reaccionar un compuesto de acido 3-fluorosialico activado con un grupo aceptor de azucar, en el que el compuesto del acido 3-fluorosialico no esta unido a un grupo CMP, como se usa convencionalmente en la tecnica anterior. Los metodos pueden llevarse a cabo enzimaticamente, por ejemplo, utilizando una sialiltransferasa, una trans-sialidasa o usando tecnicas sinteticas del campo de la qmmica de los azucares.

Las sialiltransferasas se han utilizado para transferir los derivados de acido sialico a los azucares aceptores, utilizando donantes que son sustratos naturales o sustratos naturales modificados para las enzimas (es decir, acidos sialicos de CMP o derivados de los mismos). Se ha demostrado que la sialiltransferasa de inversion PmST1 transfiere acido 3-fluoro-CMP-sialico al aceptor galactosilo, sin embargo esta reaccion usa un metodo de un solo recipiente y dos enzimas para generar el analogo de 3-fluoro del azucar donante natural, in situ (Harshal et al., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 10630-10631. Sin embargo, los acidos 3-fluorosialicos activados no naturales nunca han sido transferidos a un aceptor de azucar utilizando una sialiltransferasa, y no se ha propuesto antes de ahora incorporar las propiedades de los acidos 3-fluorosialicos en las estructuras de glicosilacion de los polipeptidos.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para glicosilar un polipeptido terapeutico que comprende formar un conjugado covalente entre un aceptor de un azucar y un compuesto de acido 3-fluorosialico, el metodo comprende poner en contacto el aceptor de azucar y el compuesto de acido 3-fluorosialico, la etapa de contacto tiene lugar bajo condiciones adecuadas para hacer reaccionar y covalentemente unir el acido 3- fluorosialico al aceptor de azucar, en donde el compuesto de acido 3-fluorosialico no comprende un grupo de citidina monofosfato (CMP)

El metodo comprende poner en contacto el aceptor de azucar, el compuesto de acido 3-fluorosialico y una enzima capaz de transferir el compuesto de acido 3-fluorosialico al aceptor de azucar, la etapa de contacto tiene lugar en condiciones adecuadas para la transferencia y union covalente del compuesto de acido 3-fluorosialico al aceptor de azucar. la enzima puede incluir una sialil transferasa o una trans-sialidasa. En una forma de realizacion alternativa, que no forma parte de la invencion, la union covalente del compuesto de acido 3-fluorosialico al aceptor de azucar se lleva a cabo por reaccion de qmmica sintetica.

Tfpicamente, la formacion del conjugado covalente con el compuesto de acido 3-fluorosialico modula una propiedad biologica del aceptor del azucar o de un resto terapeutico que comprende el aceptor de azucar, por ejemplo una propiedad biologica tal como la resistencia a la hidrolisis enzimatica (por ejemplo, por exo-sialidasas o neuraminidasas), estabilidad biologica o una propiedad farmacocinetica.

Preferiblemente, el metodo se lleva a cabo como un metodo libre de celulas in vitro. Cuando la reaccion de transferencia es enzimatica, puede tener lugar con inversion en el enlace anomerico entre el compuesto de acido 3- fluorosialico y el grupo aceptor del carbohidrato. A diferencia de los metodos basados en la tecnica anterior de CMP, los metodos de la presente invencion pueden llevarse a cabo utilizando una enzima. La presente invencion tambien ayuda a superar el problema que existfa en la tecnica anterior consistente en que los pocos ejemplos conocidos de compuestos de CMP del acido 3-fluorosialico han mostrado ser muy estables a las sialiltransferasas, y no son por tanto de uso practico en la smtesis de conjugados del acido fluorosialico.

En algunas formas de realizacion, el metodo puede comprender la etapa de modificacion de las estructuras de glicosilacion que ya estan presentes en el polipeptido, por ejemplo en virtud de la forma en que se ha expresado o que se ha hecho anteriormente sinteticamente. En una situacion tfpica, esto puede comprender la etapa adicional de eliminacion de uno o mas grupos glicosilo terminales de una estructura de glicosilacion inicialmente presente en el polipeptido para formar el grupo aceptor y/o reemplazar el grupo glicosilo terminal de la estructura de glicosilacion

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con uno o mas grupos de acido 3-fluorosialico. Convenientemente, la etapa de retirar el grupo glicosilo terminal se lleva a cabo enzimaticamente, por ejemplo mediante el uso de una sialidasa. Alternativamente, una estructura de glicosilacion existente puede ser sometido a escision adicional o alteration, por ejemplo la elimination de mas de un grupo glicosilo terminal, para proporcionar el aceptor de azucar que puede usarse segun la presente invention.

Ademas, en algunas formas de realization, los metodos de la presente invencion pueden comprender transferir varios grupos de acido 3-fluorosialico a grupos aceptores del polipeptido. Esto podria hacerse con el fin de proporcionar una protection adicional a la estructura de glicosilacion del nucleo a la degradation. A modo de ejemplo, dos, tres o mas grupos de acido 3-fluorosialico pueden estar unidos covalentemente a un grupo aceptor, ya sea repitiendo el metodo para unir grupos de acido 3-fluorosialico sucesivos, o por union covalente de un oligomero de los grupos de acido 3-fluorosialico a un aceptor. En algunas formas de realizacion, los grupos de acido 3- fluorosialico se pueden conjugar con el residuo de glicosilo terminal de una estructura de glicosilacion presente en el polipeptido.

Los metodos descritos en la presente solicitud emplean un compuesto de acido 3-fluorosialico representado por la formula general (I):

imagen1

en donde:

Y1 se selecciona de -O-, -S-, o -NR-, en donde R se selecciona independientemente de H, alquilo Ci-7, heterociclilo C3-10, o arilo C5-20;

R1 es un buen grupo saliente capaz de soportar y estabilizar una carga negativa, con la condition de que no sea un grupo de citidina monofosfato (CMP);

X1 es -CO2R, en donde R es como se definio anteriormente;

R2 se selecciona de H, haluro o OH;

R3 y R4 son cada uno independientemente seleccionado de H, -OR, -NR2 o -Z1(CH2)mZ2, donde R es como se definio anteriormente, Z1 se selecciona de -O-, -NR-, -CR2- y -S-, m es de 0 a 5 y Z2 se selecciona de -OR, -NR2 o -CN; con la condicion de que R3 y R4 no pueden ambos ser H;

R5 es H;

R6 se selecciona de alquilo C1-7; hidroxialquilo C1-7, aminoalquilo C1-7 o tioalquilo C1-7;

R7 es un grupo de formula:

imagen2

donde Y2 se selecciona de N, O, S, y CH; Z3 se selecciona de H, hidroxilo, haluro, alquilo C1-7, aminoalquilo C1-7, hidroxialquilo C1-7, o tioalquilo C1-7; R9y R10 se selecciona independientemente de H, hidroxilo, hidroxialquilo C1-7 alquilo C1-7, arilo C5-20, C(O)Z4, en donde Z4 se selecciona de alquilo C1-7 o arilo C5-20, con la condicion de que si Y2 es O o S, R10 esta ausente;

o en donde R4 es distinto de hidroxilo, R7 puede adicionalmente ser hidroxialquilo C1-7;

R8 es hidrogeno;

o un oligomero de dos o mas moleculas de formula (I);

y estereoisomeros, formas tautomeras, sales, solvatos o formas qmmicamente protegidas de los mismos, en donde el termino C1-7 pertenece a un resto monovalente obtenido por eliminacion de un atomo de hidrogeno de un hidrocarburo C1-7, que puede ser alifatico o alic^clico, o una combination de los mismos,

y en donde el aceptor del azucar es parte de una estructura de glicosilacion, la estructura de glicosilacion comprende 5 un polisacarido sintetico o que ocurre de forma natural

y que comprende la etapa de unir el conjugado al polipeptido terapeutico cuando la estructura de glicosilacion no esta ligada al polipeptido terapeutico.

En un aspecto adicional, la presente invention proporciona un conjugado de un resto terapeutico que comprende una estructura de glicosilacion, en donde la estructura de glicosilacion esta covalentemente unida a uno o mas 10 grupos del acido 3-fluorosialico, en donde los grupos de acido 3-fluorosialico forman el grupo glicosilo terminal de la estructura de glicosilacion. El resto terapeutico sera un polipeptido y la estructura de glicosilacion puede estar unida al polipeptido en un sitio de glicosilacion y/o a uno de los residuos de aminoacido, opcionalmente via un grupo de union. El uso de los grupos de union se discuten mas ampliamente a continuation.

En un aspecto adicional que no forma parte de la presente invencion, se proporciona una estructura de glicosilacion, 15 en donde la estructura de glicosilacion comprende uno o mas grupos de acido 3-fluorosialico y en donde los grupos de acido 3-fluorosialico estan covalentemente unidos a uno o mas grupos glicosilo terminales de la estructura de glicosilacion. Como se describe a continuacion, la estructura de glicosilacion generalmente comprende al menos un grupo de acido 3-fluorosialico y dos unidades de sacarido adicionales que pueden ser grupos de acido 3-fluorosialico o un tipo diferente de unidades de sacarido.

20 En un aspecto adicional que no forma parte de la presente invencion, se proporciona una estructura de glicosilacion que comprende uno o mas grupos 3-fluorosialico terminales, en donde la estructura se representa por la formula:

imagen3

en donde:

Y1 se selecciona de -O-, -S-, o -NR-, en donde R se selecciona independientemente de H, alquilo C1-7, heterociclilo 25 C3-10, o arilo C5-20;

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X es -CO2R, en donde R es como se definio anteriormente;

X2 representa la parte remanente de la estructura de glicosilacion y comprende al menos dos unidades de sacaridos; R2 se selecciona de H, haluro o OH;

R3 y R4 son cada uno independientemente seleccionado de H, -OR, -NR2 o -Z1(CH2)mZ2, donde R es como se definio 30 anteriormente, Z1 se selecciona de -O-, -NR-, -CR2- y -S-, m es de 0 a 5 y Z2 se selecciona de -OR, -NR2 o -CN; con la condition de que R3 y R4 no pueden ambos ser H;

R5 es H;

R6 se selecciona de alquilo C1-7; hidroxialquilo C1-7, aminoalquilo C1-7 o tioalquilo C1-7;

R7 es un grupo de formula:

imagen4

donde Y2 se selecciona de N, O, S, y CH; Z3 se selecciona de H, hidroxilo, haluro, alquilo C1-7, aminoalquilo C1-7, hidroxialquilo C1-7, o tioalquilo C1-7; R9y R10 se seleccionan independientemente de H, hidroxilo, hidroxialquilo C1-7, alquilo C1-7, arilo C5-20, C(O)Z4, en donde Z4 se selecciona de alquilo C1-7 o arilo C5-20, con la condicion de que si Y2 es O o S, R10 esta ausente;

o en donde R4 es distinto de hidroxilo, R7 puede adicionalmente ser hidroxialquilo C1-7;

R8 es hidrogeno;

o un oligomero de dos o mas moleculas de formula (I);

e isomeros, sales, solvatos, o formas qmmicamente protegidas de los mismos.

5 En esta formula, el grupo X2 representa dos o mas unidades de sacarido, que forman una estructura de glicosilacion o una porcion de la misma. Las unidades pueden ser uno o mas grupos de acido 3-fluorosialico adicionales, por ejemplo si varios de tales grupos estan incluidos en la estructura, o pueden ser cualquier grupo de sacarido que ocurre en la naturaleza o que ha sido modificado. Como se establece en mas detalle a continuacion, la estructura de glicosilacion puede estar basado en un glicano sintetico o que ocurre en la naturaleza y tiene una estructura 10 monoantenaria, una estructura biantenaria, una estructura triantenaria o una estructura de glicosilacion compleja.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un conjugado como se describe en el presente documento para su uso en un metodo de tratamiento medico.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un conjugado para su uso en un metodo de tratamiento como se describe en el presente documento, en donde el tratamiento es de terapia o diagnostico.

15 En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona el uso de un conjugado como se describe en el presente documento en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una condicion que responde a la administracion del polipeptido.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un conjugado como se describe en este documento y un vetuculo farmaceuticamente aceptable.

20 Las formas de realizacion de la presente invencion se describiran a continuacion a modo de ejemplo.

Descripcion detallada

Compuestos de acido fluorosialico

Como se menciono anteriormente, la presente invencion hace uso de compuestos de acido fluorosialico, y mas especialmente de acido 3-fluorosialico, para producir conjugados con propiedades biologicas utiles, tal como una 25 resistencia aumentada a la degradacion enzimatica. Los compuestos preferidos utiles segun la presente invencion estan representados por la formula general I y/o tienen los sustituyentes de los compuestos descritos en los ejemplos en sus diversas combinaciones y permutaciones. En general los compuestos difieren de aquellos descritos en la tecnica anterior puesto que incluyen un sustituyente de fluor en la posicion 3 para mejorar su resistencia a la degradacion enzimatica y la presencia de un grupo bueno saliente diferente de CMP en la posicion 2 del compuesto, 30 en el caso de la formula I, el sustituyente R1 en la posicion 2 axial. Glucosidos de acido 3-fluorosialico adecuados para su uso segun la presente invencion pueden ser generados qmmicamente como se ejemplifica en Sun et. al., Eur. J. Org. Chem (2000), 2643-2653.

El termino "grupo saliente " es bien conocido y comunmente usado en la tecnica, y se refiere a un atomo o grupo funcional que puede ser expelido de una molecula en una reaccion qmmica. Como se usa en este documento, el 35 termino "grupo saliente" se refiere a un grupo que es labil en una reaccion de substitucion nucleofila. La labilidad/habilidad del grupo saliente de un grupo funcional particular depende del pKa de su acido conjugado, generalmente hablando, cuanto mas bajo es, mejor es el grupo saliente. Preferiblemente, el grupo saliente es capaz de soportar y estabilizar una carga negativa, es decir, el grupo es capaz de salir como un anion. Muchos de tales grupos salientes son conocidos en la tecnica, incluyendo, haluros (F-, Cl", Br-, I"), hidroxido (HO-), alcoxidos (RO-, 40 donde R es un sustituyente de eter tal como se define a continuacion), carboxilatos (RC(O)O-, donde R es un sustituyente de aciloxi como se define a continuacion; por ejemplo AcO-), azida (N3-), tiocianato (SCN-), nitro (NO2-), amina (NH2-). Los expertos en la tecnica seran capaces de seleccionar un buen grupo saliente adecuado segun la practica normal en qmmica organica. Los ejemplos preferidos de grupos salientes buenos incluyen metanosulfonato, 4-toluenosulfonato, trifluorometilsulfonato, trifluorometiltoluenosulfonato, imidazoilsulfonato, o haluro (es decir, F, Cl, 45 Br, I).

Otros sustituyentes que pueden estar presentes en los compuestos descritos en este documento incluyen los siguientes.

Alquilo C1-7: El termino "alquilo C1-7", como se usa en este documento, se refiere a un resto monovalente obtenido por eliminacion de un atomo de hidrogeno de un compuesto de hidrocarburo C1-7 que tiene de 1 a 7 atomos de 50 carbono que puede ser alifatico o alidclico, o una combinacion de los mismos, y que puede ser saturado, parcialmente insaturado, o totalmente insaturado.

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Ejemplos de grupos alquilo C1-7 saturados lineales incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, y n-pentilo (amilo). Ejemplos de grupos alquilo C1.7 saturados ramificados incluyen iso-propilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, y neo- pentilo.

Ejemplos de grupos alquilo C1-7 saturados alidclicos (tambien referidos como grupos “cicloalquilo C3-7”) incluyen grupos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, y ciclohexilo, asf como grupos sustituidos (o sea grupos que comprenden tales grupos), tales como metilciclopropilo, dimetilciclopropilo, metilciclobutilo, dimetilciclobutilo, metilciclopentilo, dimetilciclopentilo, metilciclohexilo, dimetilciclohexilo, ciclopropilmetilo y ciclohexilmetilo.

Ejemplos de grupos alquilo C1-7 insaturados que tienen uno o mas enlaces dobles carbono-carbono (tambien referidos como grupos "alquenilos C2-7") incluyen etenilo (vinilo, -CH=CH2), 2-propenil o (alilo, -CH-CH=CH2), isopropenilo (-C(CH3)=CH2), butenilo, pentenilo, y hexenilo.

Ejemplos de grupos alquilo C1-7 insaturados que tienen uno o mas enlaces triples carbono-carbono (tambien referidos como grupos “alquinilo C2-7") incluyen etinilo (etinilo) y 2-propinilo (propargilo).

Ejemplos de grupos alquilo C1-7 alidclicos insaturados (carbodclicos) que tienen uno o mas dobles enlaces carbono- carbono (tambien referidos como grupos “cicloalquenilos C3-7”) incluyen grupos no sustituidos tales como ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, y ciclohexenilo, asf como grupos sustituidos (por ejemplo, grupos que comprenden dichos grupos) tales como ciclopropenilmetilo y ciclohexenilmetilo.

Heterociclilo C3-10: el termino “heterociclilo C3-10", como se usa en este documento, se refiere a un resto monovalente obtenido por eliminacion de un atomo de hidrogeno de un atomo del anillo de un compuesto heterodclico C3-10, dicho compuesto tiene un anillo, o dos o mas anillos (por ejemplo, espiro, fusionado, en puente), y tiene de 3 a 10 atomos en el anillo, de los cuales de 1 a 10 son heteroatomos del anillo y en donde al menos uno de dicho(s) anillo(s) es un anillo heterodclico. Preferiblemente, cada anillo tiene de 3 a 7 atomos en el anillo, de los que de 1 a 4 son heteroatomos del anillo. Los heteroatomos del anillo pueden preferiblemente seleccionarse del grupo que consiste en O, N, S y P. "C3-10" denota atomos del anillo, ya sean atomos de carbono o heteroatomos. Similarmente, el termino “heterociclilo C3-10" se entendera como que pertenece a un resto equivalente de 3 a 10 atomos del anillo, y asf sucesivamente.

Arilo C5-20: el termino “arilo C5-20", como se usa en este documento, pertenece a un resto monovalente obtenido por la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un atomo del anillo aromatico de un compuesto aromatico C5-20, dicho compuesto tiene un anillo, o dos o mas anillos (por ejemplo fusionados), y tiene de 5 a 20 atomos en el anillo, y en donde al menos uno de dicho(s) anillo(s) es un anillo aromatico. Preferiblemente, cada anillo tiene de 5 a 7 atomos en el anillo. Los atomos en el anillo pueden ser todos atomos de carbono, como en los “grupos carboarilos", en cuyo caso el grupo puede convenientemente ser referido como un grupo “carboarilo C5-20".

Los grupos alquilo, heterociclilo, y arilo anteriores, ya sean solos o como parte de otro sustituyente, pueden ellos mismos estar opcionalmente sustituidos con uno o mas grupos seleccionados entre ellos mismos y de sustituyentes adicionales enumerados y definidos a continuacion.

Halo: -F, -Cl, -Br, y -I.

Hidroxi: -OH.

Eter: -OR, en donde R es un sustituyente de eter, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 (tambien referido como un grupo alcoxi C1-7, comentado a continuacion), un grupo heterociclilo C3-20 (tambien referido como un grupo heterocicliloxi C3-20), o un grupo arilo C5-20 (tambien referido como un grupo ariloxi C5-20), preferiblemente un grupo alquilo C1-7.

Alcoxi C1-7: -OR, en donde R es un grupo alquilo C1-7. Ejemplos de grupos alcoxi C1-7 incluyen -OCH3 (metoxi), - OCH2CH3 (etoxi) y -OC(CH3)3 (terc-butoxi).

Oxo (ceto, -ona): =O. Ejemplos de compuestos dclicos y/o grupos que tienen, como sustituyente, un grupo oxo (=O) incluyen, carbodclicos, tales como ciclopentanona y ciclohexanona; heterociclos, tales como pirona, pirrolidona, pirazolona, pirazolinona, piperidona, piperidindiona, piperazindiona, e imidazolidona; anddridos dclicos, que incluyen anddrido maleico y anhidrido sucdnico; carbonatos dclicos, tales como carbonato de propileno; imidas, que incluyen succinimida y maleimida; lactonas (esteres dclicos, -O-C(=O)- en un anillo), que incluyen p- propiolactona, Y-butirolactona, 5-valerolactona, y £-caprolactona; y lactamas (amidas dclicas, -NH-C(=O)- en un anillo), que incluyen p-propiolactama, Y-butirolactama (2-pirrolidona), 5-valerolactama, y £-caprolactama.

Imino (imina): =NR, en donde R es un sustituyente de imino, por ejemplo, hidrogeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7 . Ejemplos de grupos ester incluyen =NH, =NMe, =NEt, y =N-fenilo.

Formilo (carbaldeddo, carboxaldeddo): -C(=O)H.

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Acilo (ceto): -C(=O)R, en donde R es un sustituyente de acilo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 (tambien referido como alquilacilo C1-7 o alcanoflo C1.7), un grupo heterociclilo C3.20 (tambien referido como heterociclilacilo C3.20), o un grupo arilo C5-20 (tambien referido como arilacilo C5-20), preferiblemente un grupo alquilo C1.7. Ejemplos de grupos acilo incluyen -c(=O)CH3 (acetilo), -C(=O)CH2CH3 (propionilo), -C(=O)C(CH3)3 (butirilo), y -C(=O)fenilo (benzoilo, fenona).

Carboxi (acido carboxflico): -COOH.

Ester (carboxilato, ester del acido carboxflico, oxicarbonilo): -C(=O)OR, en donde R es un sustituyente de ester, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo C1- 7. Ejemplos de grupos ester incluyen -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3, y -C(=O)Ofenilo.

Aciloxi (ester reverso): -OC(=O)R, en donde R es un sustituyente aciloxi, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo C1-7. Ejemplos de grupos aciloxi incluyen - OC(=O)CH3 (acetoxi), -OC(=O)CH2CH3, -OC(=O)C(CH3)3, -OC(=O)fenilo, y -OC(=O)CH2fenilo.

Amido (carbamoflo, carbamilo, aminocarbonilo, carboxamida): -C(=O)NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se definio para los grupos amino. Ejemplos de grupos de amido incluyen -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3, y -C(=O)N(CH2CH3)2, as^ como grupos amido en los que R1 y R2, junto con el atomo de nitrogeno al cual estan unidos, forman una estructura heterodclica como en, por ejemplo, piperidinocarbonilo, morfolinocarbonilo, tiomorfolinocarbonilo, y piperazinocarbonilo.

Acilamida (acilamina): -NR1C(=O)R2, en donde R1 es un sustituyente de amido, por ejemplo, hidrogeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7, y R2 es un sustituyente acilo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7. Ejemplos de grupos de acilamida incluyen -NHc(=O)CH3, - NHC(=O)CH2CH3, y -NHC(=O)fenilo. R1 y R2 pueden juntos formar una estructura dclica, como en, por ejemplo succinimidilo, maleinimidilo y ftalimidilo.

Acilureido: -N(R1)C(O)NR2C(O)R3 en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes ureido, por ejemplo, hidrogeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7. R3 es un grupo acilo como el definido para los grupos acilo. Ejemplos de grupos acilureido incluyen -NHCONHC(O)H, -NHCONMeC(O)H, -NHCONEtC(O)H, -NHCONMeC(O)Me, -NHCONEtC(O)Et, - NMeCONHC(O)Et, -NMeCONHC(O)Me, -NMeCONHC(O)Et, -NMeCONMeC(O)Me, -NMeCONEtC(O)Et, y - NMeCONHC(O)fenilo.

Carbamato: -NR1-C(O)-OR2 en donde R1 es un sustituyente de amino como se definio para los grupos de amino y R2 es un grupo ester como se definio para los grupos ester. Ejemplos de grupos carbamato incluyen -NH-C(O)-O-Me, - NMe-C(O)-O-Me, -NH-C(O)-O-Et, -NMe-C(O)-O-t-butilo, y -NH-C(O)-O-fenilo.

Tioamido (tiocarbamilo): -C(=S)NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se definio para grupos amino. Ejemplos de grupos amido incluyen-C(=S)NH2, -C(=S)NHCH3, -C(=S)N(CH3)2, y - C(=S)NHCH2CH3.

Tetrazolilo: un anillo aromatico de cinco miembros que tiene cuatro atomos de nitrogeno y un atomo de carbono,

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Amino: -NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, por ejemplo, hidrogeno, un grupo alquilo C1-7 (tambien referido como alquilamino C1-7 o, dialquilamino C1.7), un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente H o un grupo alquilo C1-7, o en el caso de un grupo amino "dclico", R1 y R2, tomados juntos con el atomo de nitrogeno al que ellos estan unidos, forman un anillo heterodclico que tiene de 4 a 8 atomos en el anillo. Ejemplos de grupos amino incluye -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2, y -NHfenilo. Ejemplos de grupos amino dclicos incluyen aziridino, azetidino, pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino, y tiomorfolino.

Imino: =NR, en donde R es un sustituyente de imino, por ejemplo, hidrogeno, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7.

Amidina: -C(=NR)NR2, en donde cada R es un sustituyente de amidina, por ejemplo, hidrogeno, un grupo alquilo C1- 7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente H o un grupo alquilo C1-7. Un ejemplo de un grupo de amidina es -C(=NH)NH2.

Carbazoilo (hidrazinocarbonilo): -C(O)-NN-R1 en donde R1 es un sustituyente de amino como se definio para grupos amino. Ejemplos de grupos azino incluyen -C(O)-NN-H, -C(O)-NN-Me, -C(O)-NN-Et, -C(O)-NN-fenilo, y -C(O)-NN- CH2-fenilo.

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Nitro: -NO2. Nitroso: -NO.

Azido: -N3.

Ciano (nitrilo, carbonitrilo): -CN.

Isociano: -NC.

Cianato: -OCN.

Isocianato: -NCO.

Tiociano (tiocianato): -SCN.

Isotiociano (isotiocianato): -NCS.

Tio:(sulfidrilo, tiol, mercapto): -SH.

Tioeter (sulfuro): -SR, en donde R es un sustituyente de tioeter, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7 (tambien referido como un grupo alquiltio C1.7), un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo Ci- 7. Ejemplos de grupos alquiltio C1.7 incluyen -SCH3 y -SCH2CH3.

Disulfuro: -SS-R, en donde R es un sustituyente de disulfuro, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo C1-7 (tambien referido en este documento como alquilo C1-7 disulfuro). Ejemplos de grupos alquilo C1.7 disulfuro incluyen -SSCH3 y -SSCH2CH3.

Sulfona (sulfonilo): -S(=O)2R, en donde R es un sustituyente de sulfona, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo C1-7. Ejemplos de grupos sulfona incluyen - S(=O)2CH3 (metanosulfonilo, mesilo), -S(=O)2CF3 (triflilo), -S(=O)2CH2CH3, -S(=O)2C4Fg(nonaflilo), -S(=O)2CH2CF3 (tresilo), -S(=O)2fenil (fenilsulfonilo), 4-metilfenilsulfonilo (tosilo), 4-bromofenilsulfonilo (brosilo), y 4-nitrofenilo (nosilo).

Sulfina (sulfinilo, sulfoxido): -S(=O)R, en donde R es un sustituyente de sulfina, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo C1-7. Ejemplos de grupos sulfina incluyen -S(=O)CH3 y -S(=O)CH2CH3. Sulfoniloxi: -OS(=O)2R, en donde R es un sustituyente de sulfoniloxi, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo C1- 7. Ejemplos de grupos sulfoniloxi incluyen -OS(=O)2CH3 y -OS(=O)2CH2CH3.

Sulfiniloxi: -OS(=O)R, en donde R es un sustituyente de sulfiniloxi, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo C1-7. Ejemplos de grupos sulfiniloxi incluyen -OS(=O)CH3 y -OS(=O)CH2CH3.

Sulfamino: -NR1S(=O)2OH, en donde R1 es un sustituyente de amino como se definio para grupos amino. Ejemplos de grupos sulfamino incluyen -NHS(=O)2OH y -N(CH3)S(=O)2OH.

Sulfinamino: -NR1S(=O)R, en donde R1 es un sustituyente de amino como se definio para grupos amino, y R es un sustituyente de sulfinamino, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo C1-7. Ejemplos de grupos sulfinamino incluyen -NHS(=O)CH3 y -N(CH3)S(=O)C6H5.

Sulfamilo: -S(=O)NR1R2, en donde R1 y R2 son independientemente sustituyentes de amino, como se definio para los grupos amino. Ejemplos de grupos sulfamilo incluyen -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, - S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2, y -S(=O)NHfenilo.

Sulfonamino: -NR1S(=O)2R, en donde R1 es un sustituyente de amino como se definio para grupos amino, y R es un sustituyente de sulfonamino, por ejemplo, un grupo alquilo C1-7, un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente un grupo alquilo C1-7. Ejemplos de grupos sulfonamino incluyen -NHS(=O)2CH3 y - N(CH3)S(=O)2CaH5.

Fosforamidita: -OP(OR1)-NR22, donde R1 y R2 son sustituyentes de fosforamidita, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7 (opcionalmente sustituido), un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente -H, un grupo alquilo C1-7, o un grupo arilo C5-20. Ejemplos de grupos de fosforamidita incluyen -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, - OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2, y -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2.

Fosforamidato: -OP(=O)(OR1)-NR22, donde R1 y R2 son sustituyentes de fosforamidato, por ejemplo, -H, un grupo alquilo C1-7 (opcionalmente sustituido), un grupo heterociclilo C3-20, o un grupo arilo C5-20, preferiblemente -H, un grupo alquilo C1-7, o un grupo arilo C5-20. Ejemplos de grupos fosforamidato incluyen -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, - OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2, y -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2.

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En muchos casos, los sustituyentes pueden ellos mismos estar sustituidos. Por ejemplo, un grupo alcoxi Ci-7 puede estar sustituido con, por ejemplo, un alquilo C1-7 (tambien referido como un grupo alquilo C1-7-alcoxi C1-7), por ejemplo, ciclohexilmetoxi, un grupo heterociclilo C3-2o (tambien referido como un grupo arilo C5-2o-alcoxi C1-7), por ejemplo ftalimidoetoxi, o un grupo arilo C5-20 (tambien referido como un grupo arilo C5-20-alcoxi C1-7), por ejemplo, benciloxi.

Alquileno C1-12: El termino “alquileno C1-12", como se usa en este documento, pertenece a un resto bidentado obtenido por la eliminacion de dos atomos de hidrogeno, ambos del mismo atomo de carbono, o uno de cada atomo de carbono diferente, de un compuesto de hidrocarburo lineal que tiene de 1 a 12 atomos (a menos que se especifique de otra forma), que puede ser saturado, parcialmente saturado, o totalmente insaturado. Asi, el termino "alquileno" incluye las subclases de alquenileno, alquinileno, etc., descritas a continuacion.

Ejemplos de grupos alquileno C1-12 saturados incluyen -(CH2)n- donde n es un numero entero de 1 a 12, por ejemplo, -CH2-(metileno), -CH2CH2-(etileno), -CH2CH2CH2-(propileno), -CH2CH2CH2CH2-(butileno), y -CH2CH2CH2CH2CH2- (pentileno).

Ejemplos de grupos alquileno C1-12 parcialmente insaturados incluyen -CH=CH- (vinileno), -CH=CH-CH2-, -CH2- CH=CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH=CH- y -CH=CH-CH=CH-CH2-.

Los grupos alquileno pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o mas sustituyentes incluidos aquellos listados anteriormente. La cadena de alquileno C1-12 puede estar interrumpida con uno o mas grupos de heteroatomos divalentes tales como, por ejemplo, oxigeno, nitrogeno (el cual puede estar sustituido con por ejemplo alquilo C1-7), o azufre.

Cuando una etiqueta particular o definicion (por ejemplo R) se aplica a mas de un sustituyente en uno o mas compuestos, cada incidencia de este sustituyente es independiente de los otros, y puede ser igual o diferente a cualquier otro sustituyente con esa etiqueta.

Incluye otras formas: Incluido en lo anterior estan los bien conocidos sustituyentes ionicos, sales, solvatos, y formas protegidas de estos sustituyentes. Por ejemplo, una referencia para acido carboxflico (-COOH) tambien incluye la forma anionica (carboxilato) (-COO-), una sal o solvato del mismo, asi como formas protegidas convencionales. Similarmente, una referencia a un grupo amino incluye la forma protonada (-N+HR1R2), una sal o solvato del grupo amino, por ejemplo, una sal de hidrocloruro, asi como tambien las formas protegidas convencionales del grupo amino. Similarmente, una referencia a un grupo hidroxilo tambien incluye la forma ionica (-O-), una sal o solvato del mismo, asi como tambien las formas protegidas convencionales del grupo hidroxi.

Estereoisomeros o formas tautomeras, sales, solvatos, formas protegidas, y profarmacos: Ciertos compuestos pueden existir en una o mas formas particulares geometricas, opticas, enantiomeras, diastereomeras, epimeras esteroisomeras, tautomeras, conformacionales o anomericas, incluyendo formas cis y trans; Formas E- y Z-; formas c-, t-, y r-; formas endo- y exo-; formas R-, S-, y meso-; formas D- y L-; formas d- y l-; formas (+) y (-) ; formas ceto-, enol-, y enolato; formas sin- y anti-; formas sinclinales- y anticlinales-; formas a- y P-; formas axial y equatorial; formas bote-,silla-, torcida-, sobre-, y mitad silla-; y combinaciones de las mismas, en este documento colectivamente denominadas como "formas estereoisomeras o tautomeras" (o "formas isomeras").

Notese que, excepto como se comenta a continuacion para las formas tautomeras, espedficamente excluidas del termino "formas estereoisomeras o formas tautomeras", como se usa en este documento, son isomeras estructurales (o constitucionales) (o sea isomeros que difieren en las conexiones entre atomos mas que meramente por la posicion de los atomos en el espacio). Por ejemplo, una referencia a un grupo metoxi, -OCH3, no es para ser construido como una referencia a su isomero estructural, un grupo hidroximetilo, -CH2OH. Similarmente, una referencia a ortoclorofenilo no es para ser construido como una referencia a su isomero estructural, meta-clorofenilo. Sin embargo, una referencia a una clase de estructuras o a una formula general incluye formas isomeras que estructuralmente caen dentro de esa clase o formula (por ejemplo, alquilo C1-7 incluye n-propilo e iso-propilo; butilo incluye n-, iso-, sec-, y terc-butilo; metoxifenilo incluye orto-, meta-, y para-metoxifenilo) y, excepto donde espedficamente se establezca o indique, todas las conformaciones posibles y configuraciones posibles del(los) compuesto(s) en este documento se intenta que sean incluidas en la(s) formula(s) general(es).

La exclusion anterior no pertenece a las formas tautomeras, por ejemplo, formas ceto-, enol-, y enolato-, como en, por ejemplo, los siguientes pares de tautomeras: ceto/enol (ilustrado a continuacion), imina/enamina, amida/imino alcohol, amidina/amidina, nitroso/oxima, tiocetona/tioenol, N-nitroso/azohidroxi, y nitro/aci-nitro.

\ OH / H+ \ O

c-c '

c=c 0=0

1 \

/ \ H+ / \

ceto

enol enolato

Notese que espedficamente incluidas en el termino "formas estereoisomeras o formas tautomeras" estan los compuestos con una o mas sustituciones de isotopos. Por ejemplo, H puede estar en cualquier forma de isotopo,

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incluyendo H, H (D), y H (T); C puede estar en cualquier forma de isotopo, incluyendo C, C, y C; O puede estar en cualquier forma de isotopo, incluyendo 16O y 18O; y similares.

A menos que se especifique de otra forma, una referencia a un compuesto particular incluye todas de tales formas isomeras, incluyendo (entera o parcialmente), mezclas racemicas y otras mezclas de las mismas. Metodos para la preparacion (por ejemplo smtesis asimetrica) y separacion (por ejemplo, cristalizacion fraccionada y medios cromatograficos) de dichas formas isomeras son o conocidos en la tecnica o son facilmente obtenibles mediante la adaptacion de los metodos mostrados en este documento, o metodos conocidos, en una forma conocida.

A menos que de otra forma se especifique, una referencia a un compuesto particular tambien incluye formas ionicas de sales, solvatos, y formas protegidas de los mismos, por ejemplo, como se comenta a continuacion.

Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar, y/o manejar la sal correspondiente del compuesto activo, por ejemplo una sal farmaceuticamente aceptable. Ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables se describen en Berge, et al., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977).

Por ejemplo, si el compuesto es anionico, o tiene un grupo funcional que puede ser anionico (por ejemplo,-COOH puede ser COO"), entonces se puede formar una sal con un cation adecuado. Ejemplos de cationes inorganicos adecuados incluyen iones de metales alcalinos tal como Na+ y K+, cationes alcalino terreos tal como Ca2+ y Mg2+, y otros cationes tales como Al3+. Ejemplos de cationes organicos adecuados incluyen el ion amonio (o sea, NH4+) e iones amonio sustituidos (por ejemplo, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Ejemplos de algunos iones amonio sustituidos adecuados son aquellos derivados de: etilamina, dietilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, bencilamina, fenilbencilamina, colina, meglumina, y trometamina, asf como de aminoacidos, tales como lisina y arginina. Un ejemplo de un ion cuaternario de amonio comun es N(CH3)4+.

Si el compuesto es cationico, o tiene un grupo funcional que puede ser cationico (por ejemplo -NH2 puede ser-NH3+), entonces se puede formar una sal con un anion adecuado. Ejemplos de aniones inorganicos adecuados incluyen aquellos derivados de los siguientes acidos inorganicos: clorhfdrico, bromhndrico, yodhndrico, sulfurico, sulfuroso, nftrico, nitroso, fosforico, y fosforoso. Ejemplos de aniones organicos adecuados incluyes aquellos derivados de los siguientes acidos organicos: acetico, propionico, succmico, glicolico, estearico, palmftico, lactico, malico, pamoico, tartarico, cftrico, gluconico, ascorbico, maleico, hidroximaleico, fenilacetico, glutamico, aspartico, benzoico, cinamico, piruvico, salidlico, sulfamlico, 2-acetoxibenzoico, fumarico, fenilsulfonico, toluenosulfonico, metanosulfonico, etanosulfonico, etanodisulfonico, oxalico, pantotenico, isetionico, valerico, lactobionico, y gluconico. Ejemplos de aniones polimericos adecuados incluyen aquellos derivados de los siguientes acidos polimericos: acido tanico, carboximetil celulosa.

Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar, y/o manejar un solvato correspondiente del compuesto activo. El termino "solvato" se usa en este documento en el sentido convencional para referirse a un complejo de soluto (por ejemplo el compuesto activo, sal del compuesto activo) y el disolvente. Si el disolvente es agua, el solvato puede ser convenientemente referido como un hidrato, por ejemplo, un monohidrato, un dihidrato, un trihidrato, etc.

Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar, y/o manejar el compuesto activo en una forma qmmicamente protegida. El termino "forma qmmicamente protegida", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto en el que uno o mas de los grupos funcionales reactivos estan protegidos de las reacciones qmmicas indeseables, esto es, estan en la forma de un grupo que protege o protegido (tambien conocido como un grupo enmascarante o enmascarado o un grupo bloqueante o bloqueado). Protegiendo un grupo funcional reactivo, las reacciones que envuelven otros grupos funcionales reactivos no protegidos pueden ser llevadas a cabo, sin afectar el grupo protegido; el grupo protegido puede eliminarse, usualmente en una etapa posterior, sin sustancialmente afectar al resto de la molecula. Vease, por ejemplo, 'Protective Groups in Organic Synthesis' (T. Green and P. Wuts, Wiley, 1999).

Por ejemplo, un grupo hidroxilo puede estar protegido como un eter (-OR) o un ester (-OC(=O)R), por ejemplo, como: un t-butil eter; un bencil, bencidril (difenilmetil), or tritil (trifenilmetil) eter; un trimetilsilil o t-butildimetilsilil eter; o un acetil ester (-OC(=O)CH3, -OAc).

Por ejemplo, un grupo aldehfdo o cetona puede ser protegido como un acetal o quetal, respectivamente, en el que el grupo carbonilo (>C=O) se convierte en un dieter (>C(OR)2), por reaccion con, por ejemplo, un alcohol primario. El grupo aldehfdo o cetona se regenera facilmente por hidrolisis usando un exceso grande de agua en presencia de un acido.

Por ejemplo, un grupo amino puede ser protegido, por ejemplo, como una amida o un uretano, por ejemplo, como: una metilamida (-NHCO-CH3); una benciloxiamida (-NHCO-OCH2C6H5, -NH-Cbz); como una t-butoxiamida (-NHCO- OC(CH3)3, -NH-Boc); una 2-bifenil-2-propoxiamida (-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5, -NH-Bpoc), como una 9- fluorenilmetoxiamida (-NH-Fmoc), como una 6-nitroveratriloxiamida (-NH-Nvoc), como una 2-trimetilsililetiloxiamida (- NH-Teoc), como una 2,2,2-tricloroetiloxiamida (-NH-Troc), como una aliloxiamida (-NH-Alloc), como una 2(- fenilsulfonil)etiloxiamida (-NH-Psec); o, en casos adecuados, como un N-oxido (>NO$).

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Por ejemplo, un grupo de acido carboxflico puede ser protegido como un ester por ejemplo, como: un ester de alquilo C1-7 (por ejemplo, un ester de metilo; un ester de t-butilo; un ester haloalquilo C1-7 (por ejemplo, un ester trihaloalquilo C1-7; un ester de trialquilsililo C^-alquilo C1-7; o un ester de arilo C5-20-alquilo C1-7 (por ejemplo un ester de bencilo; un ester de nitrobencilo); o como una amida, por ejemplo, como una metilamida.

Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar, y/o manejar el compuesto activo en la forma de un profarmaco. El termino "profarmaco", como se usa en este documento, se refiere a un compuesto que, cuando se metaboliza (es decir in vivo), proporciona el compuesto activo deseado. Tfpicamente, el profarmaco es inactivo, o menos activo que el compuesto activo, pero puede proporcionar propiedades ventajosas de manejo, administracion, o metabolicas.

Por ejemplo, algunos profarmacos son esteres del compuesto activo (por ejemplo un ester fisiologicamente aceptable metabolicamente labil). Durante el metabolismo, el grupo ester (-C(=O)OR) se escinde para proporcionar el farmaco activo. Dichos esteres pueden formarse por esterificacion, por ejemplo, de cualquiera de los grupos de acido carboxflico (-C(=O)OH) en el compuesto inicial, con, donde apropiado, proteccion anterior de otros grupos reactivos presentes en el compuesto inicial, seguido de la desproteccion si se requiere. Ejemplos de dichos esteres metabolicamente labiles incluyen aquellos en donde R es alquilo C1-7 (por ejemplo -Me, -Et); aminoalquilo C1-7 (por ejemplo aminoetilo; 2-(N,N-dietilamino)etilo; 2-(4-morfolino)etilo); y aciloxi-alquilo C1-7 (por ejemplo aciloximetilo; aciloxietilo; por ejemplo pivaloiloximetilo; acetoximetilo; 1-acetoxietilo; 1-(1-metoxi-1-metil)etil-carboniloxietilo; 1- (benzoiloxi)etilo; isopropoxicarboniloximetilo; 1-isopropoxi-carboniloxietilo; ciclohexil-carboniloximetilo; 1 -ciclohexil- carboniloxietilo; ciclohexiloxi-carboniloximetilo; 1-ciclohexiloxi-carboniloxietilo; (4-

tetrahidropiraniloxi)carboniloximetilo; 1-(4-tetrahidropiraniloxi)carboniloxietilo; (4-tetrahidropiranil)carboniloximetilo; y 1-(4-tetrahidropiranil)carboniloxietilo).

Ademas, algunos profarmacos se activan enzimaticamente para proporcionar el compuesto activo, o un compuesto que, con una reaccion qmmica adicional, proporciona el compuesto activo. Por ejemplo, el profarmaco puede ser un derivado de un azucar u otro conjugado de glicosido, o puede ser un derivado de ester de aminoacido.

Produccion de glicosil transferasas

A fin de optimizar la transferencia de compuestos de acido fluorosialico activados puede ser deseable identificar y/o optimizar las propiedades de una glicosil transferasa para uso segun los metodos divulgados en este documento. Los ejemplos en este documento muestran que una a-2,3-(O)-sialil transferasa de S. frugiperda puede usarse para formar conjugados entre un azucar aceptor y los compuestos de acido fluorosialico de la presente invencion. Sin embargo, para mejorar la eficiencia de esta reaccion, pueden desarrollarse enzimas candidatas, por ejemplo para mejorar una o mas propiedades de los enzimas tales como una constante de union mejorada (Km) y tasa de realizacion catalftica mejorada (kcat) y/o especificidad del sustrato mejorada. El desarrollo de glicosil transferasas puede implicar el uso de tecnicas tales como la evolucion dirigida como se ejemplifica en Aharoni et al, Nature Methods, 2003, 3, 609-614.

Glicosilacion

La habilidad para controlar la glicosilacion en sitios definidos usando la presente invencion representa una herramienta util para la fabricacion de estructuras de glicosilacion. Esto se puede hacer haciendo al azucar aceptor parte de una estructura de glicosilacion que despues reacciona con el compuesto de acido fluorosialico activado. La estructura de glicosilacion es generalmente un sacarido y puede comprender una estructura monoantenaria, una estructura biantenaria, una estructura triantenaria o una estructura compleja de glicosilacion. La qmmica divulgada en este documento se puede emplear con monosacaridos, oligosacaridos o polisacaridos de origen natural o sintetico, y puede usarse para modificar estructuras de glicosilacion unidas a N o unidas a O.

Los metodos de la presente invencion pueden incluir uno o mas pasos adicionales llevados a cabo como parte de la srntesis de las estructuras de glicosilacion o de su introduccion dentro de un resto terapeutico tal como un polipeptido terapeutico. Estos pasos pueden llevarse a cabo en el resto terapeutico que comprende la estructura de glicosilacion o en una estructura de glicosilacion antes de su union al resto terapeutico. Estos pasos incluyen la eliminacion de un grupo glicosilo terminal de una estructura de glicosilacion para formar el grupo aceptor del azucar, por ejemplo en una reaccion enzimatica usando una sialidasa. En formas de realizacion en las que la estructura de glicosilacion no esta unida al resto terapeutico cuando la reaccion de conjugacion se lleva a cabo, los metodos incluyen el paso adicional de unir el conjugado al resto terapeutico. Los metodos tambien pueden incluir un paso inicial de introducir una estructura de glicosilacion en un lugar de un polipeptido.

Alternativamente o adicionalmente, los metodos de la presente invencion pueden usarse para transferir una variedad de compuestos de acido 3-fluorosialico a un azucar aceptor. Esto puede hacerse por la transferencia de un oligomero que comprende una variedad de compuestos de acido 3-fluorosialico o por la repeticion de la reaccion de conjugacion.

Alternativamente o adicionalmente, la estructura de glicosilacion puede comprender un grupo de union y/o otros restos tales como una o mas moleculas de poli(alquilenglicol). En un ejemplo preferido, el polipeptido esta representado por la formula esquematica:

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Polipeptido-AA-L1-Gly

en donde:

AA es un resto de aminoacido terminal o interno del polipeptido;

L1 es un grupo de union opcional unido covalentemente al aminoacido AA;

Gly representa el grupo aceptor de azucar que es opcionalmente parte de una estructura de glicosilacion.

El resto terapeutico sera un polipeptido, aunque la presente invencion es generalmente aplicable a cualquier tipo de resto terapeutico que incluye la glicosilacion o en el que se desea introducir glicosilacion. Los polipeptidos incluyen las protemas y anticuerpos terapeuticos, y fragmentos de los mismos, por ejemplo para controlar su inmunogenicidad y propiedades farmacologicas tales como la semivida. Actualmente, la fabricacion de protemas terapeuticas recombinantes es cara y lenta ya que se usan a menudo lmeas celulares de mairnfero para la fabricacion a fin de asegurarse de que las protemas estan glicosiladas. Los metodos divulgados en este documento pueden usarse para anadir glicosilacion a un polipeptido despues de su produccion en lmeas celulares bacterianas, en las que la expresion es generalmente mas eficiente, por lo tanto ayudando a mejorar la velocidad y/o la economfa de la produccion de protemas, mientras que se mantiene la glicosilacion. Alternativamente, para los polipeptidos expresados en lmeas celulares que glicosilan los productos de expresion, la presente invencion puede usarse para modificar o anadir glicosilacion.

En formas de realizacion preferidas, los carbohidratos empleados pueden comprender derivados modificados qmmicamente de oligosacaridos ramificados de origen natural comunmente mostrados en glicoprotemas N- o O- unidos o productos de degradacion de los mismos. Los grupos de carbohidrato que pueden usarse en la presente invencion son bien conocidos en la tecnica e incluyen grupos de carbohidrato encontrados en la glicosilacio unida en N- y O- de protemas eucarioticas y grupos de carbohidrato hechos por el hombre, por ejemplo vease los grupos de carbohidrato y metodos de produccion e identificacion divulgados en los documentos de patente internacional WO 2003/025133 y WO 2004/083807.

Glicanos unidos por N se encuentran unidos al nitrogeno (N) del grupo R de la asparagina en el sequon. El sequon es una secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, donde X es cualquier aminoacido excepto prolina y puede estar compuesto de N-acetil galactosamina, galactosa, acido neurammico, N-acetilglucosamina, fructosa, manosa, fucosa y otros monosacaridos.

En eucariotas, los glicanos unidos a N se derivan de una unidad nucleo de 14 azucares ensamblada en el citoplasma y el retmulo endoplasmatico. Primero, dos restos de N-acetil glucosamina se unen al fosfato de dolicol, un ifpido, en el lado externo de la membrana del retmulo endoplasmatico. Entonces se anaden cinco restos de manosa a esta estructura. En este punto, el nucleo de glicano parcialmente acabado se voltea a traves de la membrana del retmulo endoplasmatico, de manera que ahora esta situado dentro del lumen reticular. El ensamblaje continua entonces dentro del retmulo endoplasmatico, con la adicion de cuatro mas restos de manosa. Finalmente, se anaden tres restos de glucosa a esta estructura. Despues del ensamblaje total, el glicano es transferido en bloque por la glicosiltransferasa oligosacariltransferasa a una cadena peptida naciente, dentro del lumen reticular. Esta estructura de nucleo de glicanos unidos a N consiste asf de 14 restos (3 de glucosa, 9 de manosa, y 2 de N- acetilglucosamina).

En eucariotas, glicanos unidos a O, son ensamblados de azucar en azucar en un resto de serina o treonina de una cadena peptfdica en el aparato de Golgi. Al contrario que con los glicanos unidos a N, todavfa no hay una secuencia de consenso conocida. Sin embargo, la colocacion de un resto de prolina tanto a -1 como a +3 en relacion a la serina o treonina es favorable a la glicosilacion unida a O.

El primer monosacarido unido en la smtesis de glicanos unidos a O es la N-acetil-galactosamina. Despues de esto, varias vfas diferentes son posibles. Una estructura de nucleo 1 se genera por la adicion de galactosa. Una estructura de nucleo 2 se genera por la adicion de N-acetil-glucosamina a la N-acetil-galactosamina de la estructura de nucleo 1. Las estructuras de nucleo 3 se generan por la adicion de una N-acetil-glucosamina unica a la N-acetil- galactosamina original. Las estructuras de nucleo 4 se generan por la adicion de una segunda N-acetil-glucosamina a la estructura de nucleo 3. Otras estructuras de nucleo son posibles, aunque son menos corrientes. Un tema estructural comun en los glicanos unidos por O es la adicion de unidades de polilactosamina a las varias estructuras de nucleo. Estas se forman por la adicion repetitiva de unidades de galactosa y N-acetil-glucosamina. Las cadenas de polilactosamina en glicanos unidos por O estan a menudo tapadas con la adicion de un resto de acido sialico (similar al acido neurammico). Si tambien se anade un resto de fucosa, al resto anterior al penultimo, se forma una estructura sialil-lewis-X (SLex)).

Ejemplos de estructuras de glicosilacion incluyen las siguientes estructuras unidas por O y por N:

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NeuNAc-------Gal-------GIcNAc

/

Man----------X--------Y

NeuNAc--------Gal-------GIcNAc

en donde X es una union como se describe en este documento e Y es hidrogeno o una protema o polipeptido.

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en donde X es un grupo glicano o una union como se describe en este documento e Y es hidrogeno o una protema o polipeptido.

Polipeptidos

10 Los metodos de la presente invencion son generalmente aplicables a un rango de aplicaciones basado en que la reaccion es capaz de modificar la glicosilacion de, y en particular anadir grupos de acido sialico a, restos terapeuticos tales como polipeptidos. Los polipeptidos como se usa en este documento incluyen polfmeros en los que los monomeros son aminoacidos y estan unidos entre sf a traves de enlaces amida. Los aminoacidos que forman polipeptidos pueden incluir aminoacidos no naturales, tales como p-alanina, fenilglicina y homoarginina, o

15 aminoacidos que no son codificados por acidos nucleicos, y/o aminoacidos que han sido modificados para incluir grupos reactivos, lugares de glicosilacion, polfmeros, restos terapeuticos, biomoleculas y similares tambien pueden usarse en la invencion. Todos los aminoacidos usados en la presente invencion pueden ser de la forma D- o L-. En general se prefiere el uso del isomero L que es el que ocurre naturalmente. Los polipeptidos que se pueden usar en la presente invencion pueden inicialmente ser polipeptidos glicosilados o no glicosilados, y esto incluye polipeptidos

20 que estan glicosilados de forma incompleta por un sistema que los expresa.

Los metodos descritos son aplicables a cualquier tamano y tipo de polipeptido desde aminoacidos individuales y peptidos a polipeptidos y protemas que tienen pesos moleculares de hasta o mas de 100 kDa. En consecuencia, aunque por conveniencia, los metodos en este documento se describen generalmente por la referencia a

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"polipeptidos", esto debe ser tornado como que se incluyen secuencias mas cortas de aminoacidos (por ejemplo, de 2, 3, 4, 5 o 10 aminoacidos de longitud a 30, 40 o 50 aminoacidos de longitud), a veces referidos en la tecnica como peptidos. El termino tambien debena tomarse como que incluye polipeptidos que tienen una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria generalmente referidos como protemas, asf como protemas multidominio.

Los metodos y reactivos divulgados en este documento son particularmente utiles para funcionalizar polipeptidos terapeuticos, por ejemplo para modificar sus propiedades farmacologicas tales como la estabilidad, semivida biologica o solubilidad en agua, o las caractensticas inmunologicas del polipeptido.

Ejemplos de clases adecuadas de polipeptidos que pueden ser modificados segun la presente invencion incluyen erithropoyetinas (EPO), interferones, interleuquinas, quimioquinas, linfoquinas, citoquinas, insulina, anticuerpos monoclonales y fragmentos, anticuerpos recombinantes y fragmentos, factores de coagulacion sangumea, factores de estimulacion de colonias (CSFs), hormonas de crecimiento, activadores del plasminogeno, peptidos derivados de virus, hormonas de la reproduccion y enzimas terapeuticas. Ejemplos espedficos de polipeptidos que se pueden emplear incluyen factores de estimulacion de colonias (CSFs), factores de estimulacion de colonias de granulocitos (G-CSFs), factores de estimulacion de colonias de granulocitos macrofagos (GM-CSFs), Factor Vila, Factor VIII, Factor IX, hormona de crecimiento humana (hGH), DNasa, insulina, glucagon, VEGF, receptor de VEGF, TNF, receptor de TNF, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), activador del plasminogeno tisular (tPA), erithropoyetina (EPO), enfurvirtida, factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), IL- 1, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-24, interferon beta-1a, interferon beta-1b, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon alfa, o interferon gamma.

En la presente invencion, las referencias a polipeptidos que son anticuerpos incluyen las inmunoglobulinas ya sean naturales o producidas parcial o totalmente de forma sintetica. El termino tambien cubre cualquier polipeptido o protema que comprende un dominio de union al antigeno. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un dominio de union al antfgeno incluyen Fab, scFv, Fv, dAb, fragmentos de Fd, diacuerpos, triacuerpos o nanocuerpos. Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usando tecnicas de tecnologfa de ADN recombinante producir otros anticuerpos o moleculas quimericas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Dichas tecnicas pueden implicar la introduccion del ADN que codifica la region variable de la inmunoglobulina, o las regiones determinantes de la complementaridad (CDRs), de un anticuerpo a las regiones constantes, o regiones constantes mas regiones de marco, de una inmunoglobulina diferente. Vease, por ejemplo, el documento de patente europea EP 0 184 187 A, el documento de patente del Reino Unido GB 2.188.638 A o el documento de patente europea EP 0 239 400 A. Los anticuerpos pueden ser modificados en un numero de formas y el termino debe interpretarse como que cubre cualquier miembro o sustancia de union espedfica que tiene un dominio de union de anticuerpo antfgeno con la especificidad requerida. Por lo tanto, este termino cubre fragmentos de anticuerpos y derivados, incluyendo cualquier polipeptido que comprende un dominio de union a la inmunoglobulina, ya sea natural o total o parcialmente sintetico. Moleculas quimericas que comprenden un dominio de union a la inmunoglobulina, o equivalente, fusionadas a otro polipeptido estan por lo tanto incluidas. La clonacion y expresion de anticuerpos quimericos se describe en los documentos de patente europea EP 0 120 694 A y EP 0 125 023 A.

Se ha mostrado que fragmentos de un anticuerpo pueden realizar la funcion de union con los antfgenos. Ejemplos de fragmentos de union son (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios de VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios de VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios de VL y VH de un unico anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio de VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos; (vii) moleculas Fv de cadena sencilla (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL estan unidos por un peptido de union que permite a los dos dominios asociarse para formar un lugar de union al antfgeno (Bird et al, Science, 242; 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85: 5879-5883, 1988); (viii) dfmeros Fv biespedficos de cadena unica (documento de patente PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespedficos construidos por fusion genica (documento de patente internacional WO 94/13804; Holliger et al, P.N.A.S. USA, 90: 6444-6448, 1993). Fv, scFv o moleculas diacuerpo pueden estabilizarse por la incorporacion de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter et al., Nature Biotech., 14: 1239-1245, 1996). Tambien pueden hacerse minicuerpos que comprenden un dominio scFv unido a un dominio CH3 (Hu et al, Cancer Res., 56: 3055-3061, 1996).

Pegilacion

Los metodos divulgados en este documento alternativamente o en adicion a la presente invencion que los emplea para modificar la glicosilacion de polipeptidos, pueden usarse como parte de un procedimiento para pegilar un polipeptido dado. La pegilacion es un enfoque que tambien se puede emplear para disenar protemas terapeuticas de manera que contengan otros restos utiles para la modificacion de sus propiedades farmacologicas. Un ejemplo preferido es la conjugacion de polipeptidos a moleculas de poli(alquilenglicol), en particular moleculas de polietilenglicol (PEG), que puede usarse para mejorar la semivida u otras propiedades farmacologicas de los polipeptidos terapeuticos. Los metodos presentes proporcionan la oportunidad de pegilar protemas de interes de una forma selectiva dependiendo de donde esten presentes los grupos de tiol en la protema. Las moleculas de poli(alquilenglicol) se denominan de forma intercambiable en la tecnica como moleculas de poli(oxido de alquileno) y

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son polieteres. Las moleculas de poli(alquilenglicol) pueden tener estructuras lineales, ramificadas, de peine o en estrella y en general son muy solubles en agua.

Segun la presente invention, la estructura de glicosilacion puede comprender o estar unida a uno o mas grupos de poli(alquilenglicol). Estos grupos pueden servir como una union entre el resto terapeutico y la estructura de glicosilacion.

Ademas, la estructura basica de poli(alquilenglicol) puede ser proporcionada con uno o mas grupos funcionales reactivos tales como grupos hidroxi, amino, de acido carboxilico, de haluro de alquilo o de tiol para facilitar la reaction de la molecula de poli(alquilenglicol) con otras especies tales como polipeptidos. Moleculas de poli(alquilenglicol) preferidas incluyen aquellas sustituidas en una o mas posiciones de hidroxilo con un grupo qmmico, tal como un grupo alquilo que tiene entre uno y cuatro atomos de carbono. Las mas preferidas para uso segun la presente invencion son moleculas de polietilenglicol ("PEG"), aunque la persona experta en la tecnica sera capaz de usar las tecnicas divulgadas en este documento en combination con otras moleculas de poli(alquilen glicol), tal como polipropilenglicol o copolimeros de polietilen-polipropilenglicol. Las moleculas de poli(alquilenglicol), incluyendo PEGs, tfpicamente tienen pesos moleculares entre aproximadamente 400 kDa y aproximadamente 80 kDa, mas preferiblemente entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 60 kDa, y mas preferiblemente entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, es decir pesos moleculares de l0 kDa, 20 kDa, 30 kDa o 40 kDa. Las moleculas de poli(alquilenglicol que pueden usarse segun la presente invencion son bien conocidas en la tecnica y disponibles publicamente, por ejemplo a partir de fuentes disponibles comercialmente tales como SigmaAldrich.

La pegilacion es una estrategia conocida para la modificacion de las propiedades de los polipeptidos terapeuticos, tales como los peptidos, proteinas y anticuerpos. En general, la union de moleculas de PEG a los polipeptidos se usa para alterar su conformation, propiedades electrostaticas o hidrofobas, y conducir a mejoras en sus propiedades biologicas y farmacologicas, tales como un aumento de la solubilidad del farmaco, reduction de la frecuencia de dosificacion, modulation (especialmente en aumento) de la semivida de circulation, aumento de la estabilidad del farmaco y aumento de la resistencia a la degradation proteolftica. La pegilacion funciona aumentando el peso molecular del polipeptido terapeutico conjugando el polipeptido a una o mas moleculas de polimero de PEG. Los metodos de la presente invencion tienen la ventaja de que el sitio de introduction de las moleculas de PEG en el polipeptido esta definido por la presencia de grupos de tiol.

Uniones y su uso

En algunas formas de realization de la presente invencion, la glicosilacion del polipeptido puede estar ligada a un resto de aminoacido terminal o interno del polipeptido por medio de un grupo de union. En un aspecto preferido de la presente invencion, este grupo de union puede comprender un anillo aromatico heterociclico que contiene nitrogeno que tiene un sustituyente de vinilo para la reaccion con uno o mas grupos de tiol que estan presentes de forma natural, o que han sido introducidos en el polipeptido, por ejemplo, un grupo de tiol con uno o mas restos de cistema. Estos grupos de union tienen posiciones que pueden estar adicionalmente unidas a un espacio de acoplamiento que es capaz de alterar las propiedades del polipeptido tales como una molecula de poli(alquilenglicol) o un grupo de glicano. Ejemplos de este tipo de grupo de union y los metodos para acoplarlos a los aminoacidos en los polipeptidos donde se desea introducir la glicosilacion se describen en el documento de patente del Reino Unido GB- A-0823309.0, que se incorpora expresamente como referencia en su totalidad.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a aquellos expertos en la tecnica una exposition y descripcion completas de como poner en practica la invencion.

Experimental

Smtesis de un donante de acido 3-fluorosialico activado.

o=s=o

OAc OH AcO 1 OAc

OAc AcO 1 OAc o

X"^cHNT^^^O'^\ -----------

C02Me

/ C02Me

AcO [

AcO/

F Formula quimica: C2oH28FNOi3

F Formula quimica: C2iH30FNOi5S

Masa exacta: 509,1545

Masa exacta: 587,1320

Peso molecular: 509,4336

Peso molecular: 587,5240

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Se disolvio el hemiacetal (173 mg) en 5 ml de CH2Cl2 y se mantuvo bajo N2 gas. Se anadio a la solution piridina (164,8 pl, 6 equivalentes) y cloruro de mesilo (79,2 pl, 3 equivalentes). Se dejo la reaction con agitation a temperatura ambiente durante 5 horas. La reaccion se concentro y se purifico por cromatografia en gel de sflice (10% EtOAc/eter de petroleo ^ 10% MeOH/EtOAc) para dar un producto blanco (152 mg, 76 % de rendimiento). 1H RMN, 400 MHz (CDCls): 5,66 (s ancho, 1H), 5,47 (dd, 1H, J = 1,6 y 4,7 Hz), 5,40-5,21 (m, 2H), 4,92 (dd, 1H, H-3, J = 2,3, y 48,9 Hz), 4,66 (dd, 1H, J= 2,3 y 12,5 Hz), 4,49-4,43 (m, 2H), 4,17 (dd, 1H, J = 6,7 y 12,5 Hz), 3,91 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,90 (s, 3H). 19F RMN 400 MHz (CDCls): -206,00 (dd, J = 28,8 y 48,9 Hz). EsI-MS: Esperado para el ion molecular C2iH3oFn2Oi5S = 587,1320. Encontrado M+Na+ = 610,1235.

o=s=o o=s=o

imagen10

imagen11

Formula quimica: C12H20FNO11S Masa exacta: 405,0741 Peso molecular: 403,3507

El acido mesil-sialico de mesilo totalmente protegido (72 mg, 0,123 mmoles) se disomu en mr (4 ml). A esto se anadio NaOH 1 M (7,5 equivalentes, 0,92 ml). La reaccion se sonico durante 30 segundos y se dejo con agitacion a 4° C durante la noche. La reaccion se neutralizo con amberlita IR 120+, se filtro y se redujo el volumen in vacuo. La solucion restante se liofilizo para dar el mesilato desprotegido como un polvo blanco (30 mg), que se uso sin purification adicional. ESI-MS: Esperado para el ion molecular Ci2H20FNOhS = 405,0741. Encontrado M-H+ = 404,0683.

Formula quimica: C21H30FNO15S Masa exacta: 587,1320 Peso molecular: 587,5240

o=s=o

imagen12

Formula quimica: C29H41FN2O21 Masa exacta: 772,2186 Peso molecular: 772,6350

El acido mesil-sialico (3 mg, 7,4 pmoles) se anadio a una solucion que contema cloruro de manganeso 1 mM, pNP- lactosa 10 mM, tampon de citrato de sodio 50 mM [pH = 6,0, con 5% (v/v) de Triton-X y 0,5% (p/v) de albumina de suero bovino], citosina 5 mM, citidina 5 mM y 20 pl de a-2,3-(O)-sialil transferasa (recombinante de rata, S. frugiperda, 0,8 mg/ml). La reaccion se incubo a 37° C durante 18 horas y despues se analizo por espectrometna de masas. Esperado para el ion molecular C29H41F1N2O21 = 772,2186. Encontrado M-H+ = 771,2123.

imagen13

Se anadio el acido difluoro-sialico (3 mg, 9,1 pmoles) a una solucion que contema pNP-lactosa 10 mM, cloruro sodico 30 mM, tampon Tris-HCl 20 mM [pH = 7,6] y 40 pl de trans-sialidasa de T. cruzi (1,0 mg/ml). La reaccion se incubo a 37° C durante 18 horas y despues se analizo por espectrometna de masas confirmando la production del producto 3-fluorosialil lactosa. Esperado para el ion molecular C29H4iFiN202i = 772,2186. Encontrado M-H+ = 771,2117.

Referencias:

Documento de patente de Estados Unidos N° 7226903 Chiu et al., Nat. Struct. Mol. Biol. (2004) 11, 163-170 Watts et al., J. Am. Chem. Soc. (2003) 125, 7532-7533 Watts et al., Can. J. Chem. (2004) 82, 1581-1588

Watts et al., J. Biol. Chem. (2006) 281,4149-4155 Harshal et al., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 10630-10631 Aharoni et al., Nature Methods, 2003, 3, 609-614 Sun et al., Eur. J. Org. Chem (2000), 2643-2653 5

Claims (17)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para la glicosilacion de un polipeptido terapeutico, en donde el metodo comprende formar un conjugado covalente entre un azucar aceptor y un compuesto de acido 3-fluorosialico, el metodo comprende poner en contacto el azucar aceptor, el compuesto de acido 3-fluorosialico y una enzima capaz de transferir el compuesto de acido 3-fluorosialico al azucar aceptor, el paso de contacto tiene lugar en condiciones adecuadas para la transferencia y union covalente del compuesto de acido 3-fluorosialico al azucar aceptor, en donde el compuesto de acido 3-fluorosialico no comprende un grupo de citidina monofosfato (CMP), y en donde el azucar aceptor esta presente en, o para unirse a, el polipeptido terapeutico, y, en donde el compuesto de acido 3-fluorosialico esta representado por la formula general (I):

   imagen1

   en donde:

   Y1 se selecciona de -O-, -S-, o -NR-, en donde R se selecciona independientemente de H, alquilo C1-7, heterociclilo C3-10, o arilo C5-20;

   1

   R es un buen grupo saliente capaz de soportar y estabilizar una carga negativa, con la condicion de que no sea un grupo de citidina monofosfato (CMP);

   X1 es -CO2R, en donde R es como se definio anteriormente;

   R2 se selecciona de H, OH o haluro;

   R3 y R4 son cada uno seleccionados independientemente de H, -OR, -NR2 o -Z1(CH2)mZ2, donde R es como se definio anteriormente, Z1 se selecciona de -O-, -NR-, -CR2- y -S-, m es de 0 a 5 y Z2 se selecciona de -OR, -NR2 o - CN; con la condicion de que R3 y R4 no pueden ambos ser H;

   R5 es H;

   R6 se selecciona de alquilo C1-7; hidroxialquilo C1-7, aminoalquilo C1-7 o tioalquilo C1-7;

   R7 es un grupo de formula:

   imagen2

   en donde Y2 se selecciona de N, O, S, y CH; Z3 se selecciona de H, hidroxilo, haluro, alquilo C1-7, aminoalquilo C1-7, hidroxialquilo C1-7, o tioalquilo C1-7; R9y R10 se seleccionan independientemente de H, hidroxilo, hidroxialquilo C1-7 alquilo C1-7, arilo C5-20, C(O)Z4, en donde Z4 se selecciona de alquilo C1-7 o arilo C5-20, con la condicion de que si Y2 es O o S, R10 esta ausente;

   o donde R4 es distinto de hidroxilo, R7 puede adicionalmente ser hidroxialquilo C1-7;

   R8 es hidrogeno;

   o un oligomero de dos o mas moleculas de formula (I);

   y estereoisomeros, formas tautomeras, sales, solvatos o formas qmmicamente protegidas de los mismos, en donde el termino C1-7 pertenece a un resto monovalente obtenido por eliminacion de un hidrogeno de un hidrocarburo C1-7, que puede ser alifatico o alidclico, o una combinacion de los mismos,

   y donde el aceptor del azucar es parte de una estructura de glicosilacion, la estructura de glicosilacion comprende un polisacarido sintetico o que ocurre de forma natural.

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   y que comprende la etapa de unir el conjugado al polipeptido terapeutico cuando la estructura de glicosilacion no esta ligada a un polipeptido terapeutico.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la formacion del conjugado covalente con el compuesto de acido 3-fluorosialico modula una propiedad biologica del azucar aceptor o de un resto terapeutico que comprende el azucar aceptor, opcionalmente en donde la propiedad biologica es la resistencia a la hidrolisis enzimatica, estabilidad biologica o una propiedad farmacocinetica.
3. 3. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el metodo es un metodo libre de celulas in vitro.
4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde R1 es metanosulfonato, 4- toluenosulfonato, trifluorometilsulfonato, trifluorometiltoluenosulfonato, imidazolsulfonato, o un haluro (F, Cl, Br, I).
5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la reaccion de transferencia es enzimatica con inversion en el enlace anomerico entre el compuesto de acido 3-fluorosialico y el aceptor de azucar.
6. 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el metodo comprende ademas la eliminacion de un grupo glicosilo terminal desde una estructura de glicosilacion para formar el grupo de aceptor de azucar, y opcionalmente en donde la eliminacion del grupo glicosilo terminal se lleva a cabo enzimaticamente usando una sialidasa.
7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el metodo comprende la transferencia de varios compuestos de acido 3-fluorosialico al aceptor de azucar y opcionalmente en donde los varios compuestos de acido 3-fluorosialico se transfieren como un oligomero o mediante la repeticion de la reaccion de conjugacion .
8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el metodo comprende la transferencia de varios grupos de acido 3-fluorosialico a uno o mas restos de glicosilo terminales de una estructura de glicosilacion presente en un polipeptido.
9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la enzima para transferir el grupo de acido 3-fluorosialico es una sialiltransferasa o una trans-sialidasa, y opcionalmente en donde la enzima es una sialiltransferasa o una trans-sialidasa que ha sido manipulada geneticamente para mejorar la velocidad de la reaccion de transferencia y/o mejorar la union de la molecula donante de acido 3-fluoro sialico.
10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la etapa inicial de introducir una estructura de glicosilacion en un lugar de un polipeptido.
11. 11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la estructura de glicosilacion comprende una molecula de poli(alquilenglicol).
12. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipeptido esta representado por la formula esquematica:

    Polipeptido-AA-L1-Gly

    en donde:

    AA es un resto de aminoacido terminal o interno del polipeptido;

    L1 es un grupo de union opcional unido covalentemente al aminoacido AA;

    Gly representa el grupo aceptor de azucar que es parte de una estructura de glicosilacion.
13. 13. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

    (a) la conjugacion del compuesto de acido 3-fluorosialico al aceptor de azucar presente en el polipeptido modifica la estabilidad, semivida biologica, propiedades de aclaramiento, solubilidad en agua y/o caractensticas immunologicas del polipeptido; y/o

    (b) el metodo es para mejorar la resistencia de la estructura de glicosilacion del polipeptido a la hidrolisis por sialidasas; y/o

    (c) el polipeptido es una eritropoyetina, un interferon, una interleuquina, una quimioquina, una linfoquina, una citoquina, insulina, un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, un anticuerpo recombinante o fragmento del mismo, un factor de coagulacion de la sangre, un factor de estimulacion de colonias, una hormona de crecimiento, un activador del plasminogeno, un peptido derivado de virus, una hormona de reproduccion o una enzima terapeutica.

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14. 14. Un conjugado de un polipeptido terapeutico como se obtiene por el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
15. 15. Un conjugado de una estructura de glicosilacion y un polipeptido terapeutico, la estructura de glicosilacion comprende uno o mas grupos terminales de acido 3-fluorosialico, en donde la estructura esta representada por la formula:

    imagen3

    en donde:

    Y1 se selecciona de -O-, -S-, o -NR-, en donde R se selecciona independientemente de H, alquilo C1-7, heterociclilo C3-10, o arilo C5-20;

    X1 es -CO2R, en donde R es como se definio anteriormente;

    X2 representa la parte remanente de la estructura de glicosilacion y comprende al menos dos unidades de sacaridos; R2 se selecciona de H, OH o haluro;

    R3 y R4 son cada uno independientemente seleccionados de H, -OR, -NR2 o -Z1(CH2)mZ2, donde R es como se definio anteriormente, Z1 se selecciona de -O-, -NR-, -CR2- y -S-, m es de 0 a 5 y Z2 se selecciona de -OR, -NR2 o - CN; con la condicion de que R3 y R4 no pueden ambos ser H;

    R5 es H;

    R6 se selecciona de alquilo C1-7; hidroxialquilo C1-7, aminoalquilo C1-7 o tioalquilo C1-7;

    R7 es un grupo de formula:

    imagen4

    en donde Y2 se selecciona de N, O, S, y CH; Z3 se selecciona de H, hidroxilo, haluro, alquilo C1-7, aminoalquilo C1-7, hidroxialquilo C1-7, o tioalquilo C1-7; y R9 y R10 son independientemente seleccionados de H, hidroxilo, hidroxialquilo C1-7, alquilo C1-7, arilo C5-20, C(O)Z4, en donde -Z4 se selecciona de alquilo C1-7 o arilo C5-20, con la condicion que si Y2 es O o S, R10 esta ausente;

    o en donde R4 es distinto de hidroxilo, R7 puede adicionalmente ser hidroxialquilo C1-7;

    R8 es hidrogeno;

    o un oligomero de dos o mas moleculas de formula (I);

    y los estereoisomeros, formas tautomeras, sales, solvatos, o formas de los mismos protegidas qmmicamente,

    en donde el termino C1-7 se refiere a un resto monovalente obtenido por la elimination de un atomo de hidrogeno de un hidrocarburo C1-7, que puede ser alifatico o aliticlico, o una combination de los mismos y,

    la estructura de glicosilacion comprende un polisacarido de origen natural o sintetico,

    en donde la estructura de glicosilacion esta unida de forma covalente a uno o mas de los grupos de acido 3- fluorosialico, en donde los grupos de acido 3-fluorosialico forman el grupo de glicosilo terminal de la estructura de glicosilacion.
16. 16. El conjugado de la reivindicacion 15, en donde la estructura de glicosilacion esta unida al polipeptido en un lugar de glicosilacion y/o por medio de un resto de aminoacido del polipeptido, opcionalmente por medio de un grupo de union.
17. 17. Un conjugado segun una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para uso en terapia.

    5 18. Una composicion farmaceutica que comprende un conjugado segun una cualquiera de las reivindicaciones

    14 a 16 y un vehuculo farmaceuticamente aceptable.