ES2531455T3 - Concentración y enriquecimiento de células microbianas y ácidos nucleicos microbianos a partir de fluidos corporales - Google Patents

Abstract

Un método para aislar microorganismos de una muestra sanguínea que tiene o se sospecha que tiene microorganismos y células hospedantes, comprendiendo dicho método: a. poner en contacto la muestra de sangre con una formulación de saponinas, donde la saponina es una disolución de saponina tratada en autoclave y filtrada (FATS) o una disolución de saponina tratada en autoclave, filtrada y calentada (HFATS) presente en una concentración final de 40 mg/mL a 100 mg/mL; y b. obtener microorganismos aislados; donde los microorganismos aislados comprenden ácidos nucleicos.

Description

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26-02-2015

concentración final de FATS o HFATS de 75 mg/mL. La muestra de sangre se mezcla con FATS o HFATS durante 10 segundos usando un vórtex fijado a máxima velocidad. Este primer tratamiento de FATS ó HFATS va seguido de una centrifugación a 10.000 g durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y la partícula obtenida se vuelve a suspender con el equivalente de aproximadamente 2 volúmenes de sangre de FATS ó HFATS a una concentración de 100 mg/mL. Para este segundo tratamiento, la concentración final de FATS ó HFATS es de 100 mg/mL. La muestra de sangre se mezcla con FATS o HFATS durante 10 segundos usando un vórtex fijado a máxima velocidad. Este segundo tratamiento de FATS ó HFATS va seguido de una centrifugación a 10.000 g durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y la partícula obtenida se lava como se describe a continuación.

Método de una etapa

Un método alternativo es tratar una muestra de sangre usando un tratamiento único con FATS ó HFATS. La muestra sanguínea se mezcla directamente con aproximadamente de 4 a 5 volúmenes de sangre de FATS ó HFATS a una concentración de 100 mg/mL para lisar glóbulos rojos y glóbulos blancos para una concentración final de FATS ó HFATS equivalente a 80-83,3 mg/mL. Este tratamiento de HFATS va seguido de una centrifugación a 10.000 g durante 5 minutos. El sobrenadante se desecha y la partícula obtenida se lava como se describe en el siguiente párrafo.

Lavados de la partícula obtenida

Los ejemplos de disoluciones de recolección y lavado adecuadas pueden incluir, sin limitación, agua, tampones tales como TE, tampón de fosfato, tampón Tris, salino tamponado con fosfato, salino tamponado con Tris, disoluciones acuosas que contenga etanol y/o disoluciones acidificadas, etc. El lavado y la recolección de células microbianas y de sus ácidos nucleicos puede realizarse mediante una agitación vigorosa de la disolución de lavado/recuperación con la partícula resultante de las etapas previas. Un ejemplo de disolución de lavado/recolección puede ser el tampón TE 1X ó el tampón PBS 1X. Los lavados se llevan a cabo mediante ruptura mecánica de la partícula con un pipeteo hacia arriba y hacia abajo, seguido de mezclamiento durante 10 segundos con un vórtex fijado a máxima velocidad. Posteriormente, la disolución se centrifugó a 10.000 g durante 1 minuto, y se desechó el sobrenadante. La partícula se puede lavar una vez o más, por ejemplo, la partícula se puede lavar dos veces.

Etapa de recolección

La partícula lavada contiene células microbianas y sus ácidos nucleicos (también puede contener residuos de células sanguíneas). Para recolectar las células microbianas y sus ácidos nucleicos, la partícula lavada se agita vigorosamente en una disolución de lavado/recolección adecuada tal como TE 1X durante 15 segundos usando un vórtex fijado a máxima velocidad. El volumen de TE 1X representa el 0,002-0,012X del volumen inicial de sangre. De este modo se alcanza un aumento de la concentración de las células microbianas y sus ácidos nucleicos de 80 a 500 veces el valor inicial.

La partícula final no alterada se elimina mecánicamente del tubo mediante separación mecánica usando una punta de micropipeta. La suspensión restante de células microbianas y ácidos nucleicos está preparada entonces para la extracción de ácidos nucleicos. La partícula lavada también puede seguir siendo procesada para obtener células microbianas. La disolución de lavado y de recolección liberada de la partícula puede seguir siendo procesada para extraer ácidos nucleicos microbianos. La disolución de lavado y de recolección liberada de la partícula también puede seguir siendo procesada para obtener células microbianas. En cualquier etapa tras la lisis celular de la sangre mediante disolución HFATS y/o FATS, se puede usar una muestra de las suspensiones de células microbianas y ácidos nucleicos para realizar análisis fenotípicos, de expresión antigénica, celulares y/o fisiológicos.

Según se determina a través de un clasificador celular activado por fluorescencia (EPICS XL, Beckman Coulter), se puede alcanzar una lisis de más del 90% de los glóbulos rojos y blancos usando el método de una etapa con HFATS.

Una persona especialista en la técnica conoce los medios de desplazamiento de fluidos, así como otros modos de alcanzar la separación y la recolección de fracciones solubles e insolubles. Por tanto, se contemplan medios, modos y dispositivos alternativos diseñados para mover fluidos, y/o separar y/o recuperar fracciones solubles e insolubles, tanto manuales como automatizados.

Control de inhibidores de PCR

Los inhibidores potenciales de PCR presentes en extractos de ADN se pueden monitorizar añadiendo una cantidad de control de ADN diana a la mezcla de PCR. Dicho control se puede llevar a cabo en el mismo tubo de reacción o en paralelo (Hoorfar et al., 2004, Lett. Appl. Microbiol., 38: 79-80).

EJEMPLO 2 -AISLAMIENTO EFICAZ Y DETECCIÓN DE CÉLULAS MICROBIANAS Y SUS ÁCIDOS NUCLEICOS EN MUESTRAS SANGUÍNEAS

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Sensibilidad analítica* en CFU/mL de sangre (menor carga celular evaluada)

Especies bacterianas

Método de una etapa Método de dos etapas

Escherichia coli

15 (15) 6 (6)

Haemophilus influenzae

9 (9) 5 (5)

Klebsiella oxytoca

3 (3) 19 (19)

Klebsiella pneumoniae

3 (3) 3 (3)

Proteus mirabilis

11 (11) 2 (2)

Pseudomonas aeruginosa

17 (1) 6 (6)

Serratia marcescens

10 (10) 1 (1)

Staphylococcus aureus

8 (8) 15 (8)

Staphylococcus epidermidis

9 (5) 19 (5)

Staphylococcus haemolyticus

1 (1) 1 (1)

Staphylococcus hominis

4 (4) 4 (4)

Staphylococcus warneri

14 (14) 3 (3)

Stenotrophomonas maltophilia

7 (7) 7 (7)

Streptococcus agalactiae

19 (19) 12 (12)

Streptococcus anginosus

16 (16) 7 (7)

Streptococcus dysgalactiae

14 (5) 14 (5)

Streptococcus mutans

20 (10) 10 (10)

Streptococcus pneumoniae

6 (6) 6 (6)

Streptococcus pyogenes

47 (25) 25 (25)

Streptococcus sanguinis

9 (9) 6 (6)

Candida albicans

NT 8 (8)

Candida glabrata

NT 14 (14)

Candida krusei

NT 17 (17)

Candida parapsilosis

NT 15 (15)

Candida tropicalis

NT 10 (10)

Aspergillus fumigatus

NT 10 (10)

*La detección se llevó a cabo mediante amplificación de PCR en un termociclador Rotor-Gene™ y los amplicones fueron caracterizados mediante análisis de curva de fusión SYBR Green. NT: no evaluado.

EJEMPLO 5 -CONCENTRACIÓN Y ENRIQUECIMIENTO DE CÉLULAS MICROBIANAS VIABLES PROCEDENTES DE SANGRE CON UNA BAJA CARGA DE CÉLULAS MICROBIANAS

5 Se examinó la viabilidad de las células microbianas tras su recuperación a partir de especímenes de sangre contaminados con una baja carga de células microbianas usando el método de esta invención. Se inocularon 5 mL de muestras de sangre entera con aproximadamente 2, 10 ó 20 CFU de Streptococcus pneumoniae por mL en tres réplicas. La sangre contaminada fue tratada con saponina usando el método de tratamiento sencillo descrito anteriormente y como se indica a continuación. Se añadieron 20 mL de HFATS 100 mg/mL en TE 1X a las muestras

10 de sangre contaminadas y se mezcló durante 10 segundos usando un vórtex fijado a máxima velocidad. Los residuos de sangre y de células microbianas se obtuvieron en forma de partícula mediante centrifugación a 10.000 g durante 5 minutos, y el sobrenadante fue descartado. La partícula se lavó en 1,7 mL de PBS 1X rompiendo mecánicamente la partícula mediante pipeteo arriba y abajo y se mezcló durante 10 segundos usando un vórtex a velocidad máxima. La suspensión se centrifugó a 10.000 g durante 1 minuto y se desechó el sobrenadante. Esta

15 etapa de lavado se repitió una vez. Se añadieron 60 µL de PBS 1X (disolución de lavado y de recolección) a la partícula lavada y se agitó vigorosamente durante 15 segundos usando un vórtex fijado a máxima velocidad.

La partícula se retiró mecánicamente usando una punta de micropipeta y se transfirió a 3 mL de caldo de infusión de hogar cerebral enriquecido (eBHI, del inglés "enriched brain hearth infusion broth") o a un nuevo tubo que contenía

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Claims (1)

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