ES2530190T3 - Proteínas repetitivas sintéticas, su producción y su uso - Google Patents
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Abstract
Proteína repetitiva con unidades de repetición que contiene la unidad de repetición PGSSAAAAAAAASGPGQGQGQGQGQGGRPSDTYG.
Description
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maleimidas, disulfuros de pidridilo, -haloacetilos, vinilsulfonas, sulfatoalquilsulfonas (preferentemente sulfatoetilsulfonas), grupos reactivos con amina (por ejemplo, éster de succinimidilo, carbodiimidas, hidroximetilfosfina, éster de imido, éster de PFP, aldehídos, isotiocianato, etc.), grupos reactivos con carboxi (por ejemplo, aminas, etc.), grupos reactivos con hidroxilo (por ejemplo, isocianatos, etc.), grupos no selectivos (por ejemplo arilazidas etc.) y grupos fotoactivables (por ejemplo, perfluorofenilazida etc.).
Si las funciones que han de acoplarse de las proteínas repetitivas de acuerdo con la invención y los efectores poseen una reactividad demasiado reducida para un acoplamiento directo, entonces estas funciones se pueden activar con procedimientos habituales para el experto (por ejemplo, activación de funciones carboxilo con carbodiimidas).
Pero el enlazado se puede realizar también a través de un denominado engarce, es decir, una molécula al menos bifuncional que con una o varias funciones establece una unión con la molécula efectora y que se enlaza con una o varias funciones adicionales con la proteína repetitiva. El uso de tales engarces a medida permite la adaptación exacta del enlace a la molécula efectora deseada. Además, por ello es posible enlazar varias moléculas efectoras con una proteína repetitiva de forma definida.
El engarce usado se rige por la funcionalidad que debe acoplarse. Son adecuadas, por ejemplo, moléculas que se acoplan a una proteína repetitiva mediante grupos reactivos con sulfhidrilo, por ejemplo, maleimidas, disulfuros de pidridilo, -haloacetilos, vinilsulfonas, sulfatoalquilsulfonas (preferentemente sulfatoetilsulfonas), grupos reactivos con amina (por ejemplo, éster de succinimidilo, carbodiimidas, hidroximetil-fosfina, éster de imido, éster de PFP, aldehídos, isotiocianato, etc.), grupos reactivos con carboxi (por ejemplo, aminas, etc.), grupos reactivos con hidroxilo (por ejemplo, isocianatos, etc.), grupos no selectivos (por ejemplo arilazidas etc.) y grupos fotoactivables (por ejemplo, perfluorofenilazida etc.) y que se acoplan con moléculas efectoras mediante
-grupos reactivos con sulfhidrilo (por ejemplo, maleimidas, disulfuros de pidridilo, -haloacetilos, vinilsulfonas,
sulfatoalquilsulfonas (preferentemente sulfatoetilsulfonas) -grupos reactivos con amina (por ejemplo, éster de succinimidilo, carbodiimidas, hidroximetil-fosfina, éster de
imido, éster de PFP, aldehído, isotiocianato, etc.) -azúcares o grupos reactivos con azúcar oxidados (por ejemplo hidrazidas, etc.) -grupos reactivos con carboxi (por ejemplo, aminas, etc.) -grupos reactivos con hidroxilo (por ejemplo, isocianatos, etc.) -grupos reactivos con timina (por ejemplo, psoraleno, etc.) -grupos no selectivos (por ejemplo, arilazidas, etc.) -grupos fotoactivables (por ejemplo, perfluorofenilazida, etc.) -grupos complejantes de metal (por ejemplo, EDTA, hexahis, ferritina) -anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de F(ab) de
anticuerpos, anticuerpos catalíticos).
Las funciones químicas de un engarce pueden estar unidas mediante elementos espaciadores. Los elementos espaciadores pueden estar compuestos, por ejemplo, de cadenas de alquilo, etilenglicol y polietilenglicoles.
Se prefieren en particular elementos de engarce y/o espaciadores que poseen un punto de escisión potencial para una proteasa, lipasa, esterasa, fosfatasa, hidrolasa, es decir, que se pueden escindir enzimáticamente.
Los ejemplos de engarces que se pueden escindir enzimáticamente que se pueden emplear en las moléculas de acuerdo con la invención están mencionados, por ejemplo, en el documento WO 98/01406, a cuyo contenido se hace referencia por la presente en forma expresa en su totalidad.
Se prefieren en particular engarces y espaciadores que se pueden termoescindir o fotoescindir. El experto conoce estructuras químicas correspondientes y se integran entre las partes de molécula molécula efectora y proteína repetitiva.
En caso de que la molécula efectora esté compuesta de una secuencia polipeptídica, se puede realizar el enlazado de efector y proteína repetitiva como una denominada proteína de fusión, es decir, se usa una secuencia polipeptídica continua que está compuesta de secuencias parciales de proteína repetitiva y efector.
Entre el efector y la proteína repetitiva se pueden incluir también todavía los denominados elementos espaciadores, por ejemplo, secuencias polipeptídicas que poseen un punto de escisión potencial para una proteasa, lipasa, esterasa, fosfatasa, hidrolasa o secuencias oligo-y polipeptídicas que permiten una ligera purificación de la proteína de fusión, por ejemplo, las denominadas etiquetas His, es decir, restos de oligohistidina.
Las moléculas efectoras acopladas a proteínas repetitivas de forma covalente o no covalente pueden ser activas en su forma unida. Pero como alternativa, las moléculas efectoras acopladas a proteínas repetitivas también se pueden liberar de las proteínas repetitivas.
La liberación de moléculas efectoras acopladas de forma covalente de las proteínas repetitivas se puede realizar mediante escisión de espaciadores escindibles introducidos específicamente o engarces de acoplamiento que, por
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Protocolo
-disolución de la R16 o S16 liofilizada en tiocianato de guanidinio 6 M con una concentración final de 15 mg/ml -diálisis frente a fosfato de potasio 5 mM pH 7,0 a 4 ºC -retirada del precipitado mediante centrifugación durante 30 min a 10000 xg -ajuste de la concentración de proteína a 10 mg/ml -adición de ¼ en volumen de sulfato de amonio 4 M o ½ en volumen de fosfato de potasio 1 M -incubación a temperatura ambiente durante 1 h -lavado con agua -liofilización
El éxito de la formación de las microperlas se comprobó con ayuda de la microscopía electrónica de barrido (Figuras 3 + 4).
Ejemplo 4
Estabilización de microperlas de S16
El procedimiento de formación de las microperlas de S16 incluye una separación de fases inducida por fosfato de potasio o sulfato de amonio y la posterior estabilización de la fase rica en proteínas mediante configuración de estructuras secundarias estables. Las gotas ricas en proteínas no endurecidas se pueden diferenciar de las microperlas estabilizadas experimentalmente gracias a su diferente estabilidad en urea 4 M. Se examinó la cinética de la estabilización.
Protocolo
-preparación de una solución acuosa 10 mg/ml de S16 en fosfato de potasio 5 mM pH 7,0 -precipitación de la proteína S16 en el momento 0 con ¼ en volumen de sulfato de amonio 4 M -extracción de una alícuota de la suspensión proteica precipitada en el momento t y mezcla con el mismo volumen
de urea 8 M -medición de la extinción de la muestra a 600 nm como medida cualitativa de la dispersión
En el intervalo de 30 min, la opacidad de la muestra causada por la precipitación se puede anular mediante ajuste de una concentración de urea 4 M. Después de 40 min se conserva la opacidad con este tratamiento. Por tanto, se puede deducir que en este periodo de tiempo en la fase rica en proteína se ha configurado una estructura que es estable en urea 4 M (Figura 5).
Ejemplo 5
Envasado de -caroteno en microperlas de R16 y S16
Para mostrar que las microperlas de R16 y S16 son adecuadas como soporte y coadyuvante de formulación para principios activos, se envasó -caroteno como ejemplo de principios activos difícilmente solubles en agua en microperlas de R16 y S16. Para esto se mezclaron 500 l de una solución de R16 o S16 10 mg/ml en fosfato de potasio 5 mM (pH 8,0) con 50 l de una solución de -caroteno 0,9 mg/ml en 10 % de tetrahidrofurano (THF) y 90 % de Nmetil-2-pirrolidona (NMP). Después se indujo la formación de microperlas mediante adición de 275 l de solución de sulfato de amonio 4 M. Durante la formación de las microperlas de R16 y S16 se retiró de la solución el -caroteno. Las microperlas retiradas mediante centrifugación aparecieron coloreadas en amarillo-naranja. Las microperlas se lavaron con agua, permaneciendo asociado el -caroteno con las microperlas y liofilizándose a continuación. Después de la liofilización, las microperlas de R16 o S16 cargadas se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido (Figuras 6 + 7). En la imagen de microscopía electrónica, las microperlas cargadas (Figuras 6 + 7) mostraron una morfología muy similar a las microperlas no cargadas (Figuras 3 + 4), por lo que es evidente que las microperlas y el -caroteno forman una fase sólida común.
Ejemplo 6
Absorción de agua por microperlas de R16
Las microperlas de proteínas repetitivas pueden absorber o ceder agua del o al aire y servir, por tanto, como sustancia reguladora de la humedad, por ejemplo, en aplicaciones cosméticas. Para demostrar esto se secaron al vacío 0,4 g de microperlas de R16 que se habían almacenado previamente a -20 ºC, durante 16 h y se determinó el peso seco. El almacenamiento posterior a temperatura ambiente y una humedad del aire del 100 % condujo a un lento aumento de peso del 44 % en el intervalo de 66 días (Figura 8). Mediante un nuevo secado al vacío se alcanzó de nuevo el peso seco original.
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