ES2470765T3 - Vacunas meningoc�cicas mucosales - Google Patents
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Abstract
Una composición inmunogénica para la administración mucosal, que comprende sacáridos capsulares de al menos dos de los serogrupos A, C, W135 e Y de la N.meningitidis, y que también comprende un adyuvante mucosal, en donde el adyuvante es quitosano tri-alquilado.
Description
La presente invención pertenece al campo de las vacunas, particularmente contra infecciones y enfermedades meningoc�cicas.
La Neisseria meningitidis es un pat�geno humano Gram-negativo [ver por ejemplo Capítulo 28 de la ref. 1] que causa meningitis bacteriana. Est� estrechamente relacionada con la N.gonorrhoeae, aunque una característica que diferencia claramente al meningococo es la presencia de una cápsula de polisac�ridos que est� presente en todos los meningococos pat�genos.
En base al polisac�rido capsular del organismo, se han identificado doce serogrupos de la N.meningitidis (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y y Z). El Grupo A es la causa más común de enfermedad epidémica en el áfrica Sub-sahariana. Los serogrupos B y C son responsables de la vasta mayoría de casos en países desarrollados, con los casos restantes siendo causados por los serogrupos W135 e Y.
Adem�s de ser usado para clasificación, el polisac�rido capsular ha sido usado para vacunación. Durante muchos años [2, 3] se ha conocido una vacuna tetravelente inyectable de polisac�ridos capsulares de los serogrupos A, C, Y & W135 y est� autorizada para uso humano. Aunque es efectiva en adolescentes y adultos, induce una respuesta inmune pobre y duración corta de la protección y no puede ser usada en bebés [por ejemplo 4]. Los polisac�ridos en esta vacuna est�n sin conjugar y est�n presente a una proporción de peso [5] 1:1:1:1. Tanto MENCEVAX ACWY™ como MENOMUNE™ contienen 50μg de cada polisac�rido purificado una vez reconstituidas de sus formas liofilizadas.
Los oligosac�ridos del serogrupo C conjugados han sido aprobados para uso humano [por ejemplo Menjugate™; ref. 6]. Permanece, sin embargo, una necesidad de mejoras en las vacunas conjugadas contra los serogrupos A, W135 e Y, y en su fabricación. Esa necesidad se aborda por los productos, procesos y usos divulgados en la referencia 8, pero sigue habiendo margen para modificaciones y mejoras adicionales, particularmente en relación con la administración y la formulación.
La WO03094834 divulga composiciones inmunog�nicas que comprenden (a) un ant�geno de sac�rido capsular del serogrupo C de la N.meningitidis, y (b) un adyuvante de quitosano.
B.C. Baudner y otros, 2003, evalúa micropart�culas de quitosano como un sistema de administración de vacunas as� como el adyuvante mucosal LTK63, un mutante de enterotoxina (LT) de Escherichia coli no tóxica para la inmunizaci�n intranasal con la vacuna conjugada meningoc�cica del grupo C (CRC-MenC).
La invención proporciona una composición inmunog�nica, que comprende (a) un ant�geno de sac�rido capsular del serogrupo C de la N.meningitidis, en donde el sac�rido capsular est� conjugado con proteína(s) portadora(s) y (b) un adyuvante mucosal, en donde el adyuvante es un quitosano tri-alquilado. La composición preferiblemente comprende (c) uno o más ant�genos adicionales y/o (d) uno o más adyuvantes adicionales.
La invención también proporciona una composición inmunog�nica para la administración mucosal, que comprende sac�ridos capsulares de al menos dos de los serogrupos A, C, W135 e Y de la N.meningitidis, y también comprende un adyuvante mucosal, en donde el adyuvante es un quitosano tri-alquilado.
Se prefiere que los sac�ridos capsulares en las composiciones de la invención est�n conjugados con proteína(s) portadora(s) y/o sean oligosac�ridos. Se prefieren particularmente los ant�genos de oligosac�ridos conjugados (Figura 1).
El sac�rido capsular del serogrupo C de la N.meningitidis ha sido ampliamente usado como un ant�geno. El ingrediente activo del Menjugate™, por ejemplo, es un fragmento de oligosac�rido del polisac�rido capsular, conjugado con la proteína portadora CRM197.
Cuando una composición de la invención incluye un ant�geno de sac�rido capsular del serogrupo C de la N.meningitidis, se prefiere por lo tanto usar un fragmento de oligosac�rido del polisac�rido capsular y/o conjugar el
ant�geno de sac�rido con una proteína portadora. Los ant�genos de sac�ridos de la MenC particularmente preferidos se describen en las referencias 6 y 9.
A continuación se dan detalles adicionales de la producción y conjugación de oligosac�ridos.
Las composiciones de la invención pueden comprender sac�ridos capsulares de al menos dos (es decir, 2, 3 � 4) de los serogrupos A, C, W135 e Y de la N.meningitidis.
Se prefieren las mezclas de sac�ridos de más de un serogrupo de la N.meningitidis, por ejemplo, composiciones que comprenden sac�ridos de los serogrupos A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, C+W135+Y, A+C+W135+Y, etc. Se prefiere que la eficacia protectora de los ant�genos de sac�ridos individuales no se elimine combin�ndolos, aunque la inmunogenicidad real (por ejemplo, títulos ELISA) puede ser reducida.
Las composiciones preferidas comprenden sac�ridos de los serogrupos C e Y. Otras composiciones preferidas comprenden sac�ridos de los serogrupos C, W135 e Y.
Cuando una mezcla comprende sac�ridos capsulares de tanto el serogrupo A como el C, la proporción (p/p) de sac�rido de MenA:sac�rido de MenC puede ser mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor).
Cuando una mezcla comprende sac�ridos capsulares de tanto el serogrupo Y como uno o ambos de los serogrupos C y W135, la proporción (p/p) de sac�rido de MenY:sac�rido de MenW135 puede ser mayor de 1( por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor), y/o la proporción (p/p) de sac�rido de MenY:sac�rido de MenC puede ser menor de 1 (por ejemplo 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, o inferior).
Las proporciones preferidas (p/p) para sac�ridos de los serogrupos A:C:W135:Y son 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1.
Los polisac�ridos capsulares meningoc�cicos se preparan típicamente por un proceso que comprende los pasos de precipitación del polisac�rido (por ejemplo usando un detergente cati�nico), fraccionamiento con etanol, extracción con fenol frio (para eliminar la proteína) y ultracentrifugaci�n (para eliminar el LPS) [por ejemplo ref. 10].
Un proceso más preferido [8], sin embargo, implica la precipitación del polisac�rido seguida por la solubilizaci�n del polisac�rido precipitado usando un alcohol inferior. La precipitación puede ser conseguida usando un detergente cati�nico como sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamonio (por ejemplo sales de bromuro) o sales de bromuro de hexadimetrina y miristiltrimetilamonio. Se prefiere particularmente el bromuro de cetiltrimetilamonio ('CTAB') [11]. LA solubilizaci�n del material precipitado se puede conseguir usando un alcohol inferior como el metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles, etc., pero el etanol es particularmente adecuado para solubilizar complejos de CTAB-polisac�rido. El etanol se añade preferiblemente al polisac�rido precipitado para dar una concentración de etanol final (basada en el contenido total de etanol y agua) de entre el 50% y el 95%.
Despu�s de la re-solubilizaci�n, el polisac�rido puede ser tratado adicionalmente para eliminar contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones cuando incluso la menor contaminación no es aceptable (por ejemplo para la producción de vacunas humanas). Esto implicar� típicamente uno o más pasos de filtración, por ejemplo se puede usar filtración en profundidad, filtración a través de carbono activo, filtración por tamaño y/o ultrafiltraci�n.
Una vez filtrado para eliminar los contaminantes, el polisac�rido puede ser precipitado para tratamiento y/o procesamiento adicional. Esto se puede conseguir convenientemente cambiando los cationes (por ejemplo por la adición de sales de calcio o sodio).
El polisac�rido puede ser modificado químicamente. Por ejemplo, puede ser modificado para reemplazar uno o más grupos hidroxilo con grupos de bloqueo. Esto es particularmente útil para el serogrupo A [12].
Los sac�ridos capsulares estarán generalmente en la forma de oligosac�ridos. Estos est�n convenientemente formados por la fragmentación de polisac�rido capsular purificado (por ejemplo por hidrólisis, en ácido suave, o por calentamiento), que ser� seguido habitualmente por la purificación de los fragmentos del tamaño deseado.
La fragmentación de polisac�ridos se realiza preferiblemente para dar un grado medio final de polimerizaci�n (DP) en el oligosac�rido de menos de 30 (por ejemplo, entre 10 y 20, preferiblemente alrededor de 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos W135 e Y, preferiblemente alrededor de 15-20; entre 12 y 22 para el serogrupo C; etc.). El DP puede ser medido convenientemente por cromatograf�a de intercambio de iones o por ensayos colorim�tricos [13].
Si se realiza la hidrólisis, el hidrolizado ser� por lo general de un tamaño para eliminar los oligosac�ridos de longitud corta. Esto se puede conseguir de varias maneras, como ultrafiltraci�n seguida por cromatograf�a de intercambio de iones. Los oligosac�ridos con un grado de polimerizaci�n menor de o igual a alrededor de 6 son preferiblemente eliminados para el serogrupo A, y aquellos menores de alrededor de 4 son preferiblemente eliminados para los serogrupos W135 e Y.
Los sac�ridos capsulares en composiciones de la invención estarán habitualmente conjugados con proteína(s) portadora(s). En general, la conjugación mejora la inmunogenicidad de los sac�ridos ya que los convierte de ant�genos T-independientes a ant�genos T-dependientes, permitiendo as� el cebado para la memoria inmunol�gica.
La conjugación es particularmente útil para las vacunas pediátricas [por ejemplo ref. 14] y es una técnica bien conocida [por ejemplo revisada en las refs. 15 a 23, etc.].
Las proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, como toxoides de la difteria o el tétano. Se prefiere particularmente el toxoide de la difteria CRM197 [24, 25, 26]. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de la membrana exterior de la N.meningitidis [27], p�ptidos sintéticos [28, 29], proteínas de choque térmico [30, 31], proteínas de pertussis [32, 33], citoquinas [34], linfoquinas [34], hormonas [34], factores de crecimiento [34], proteínas artificiales que comprenden múltiples ep�topos de células T CD4+ humanos de diversos ant�genos derivados de pat�genos [35], proteína D de la H.influenziae [36], toxina A o B de la C.difficile [37], etc.
Dentro de una composición de la invención, es posible usar más de una proteína portadora. As� se pueden usar diferentes proteínas portadoras para serogrupos diferentes, por ejemplo los sac�ridos del serogrupo A podrían ser conjugados con la CRM197 mientras que los sac�ridos del serogrupo C podrían ser conjugados con toxoide de tétano. También es posible usar más de una proteína portadora par aun ant�geno de sac�rido particular, por ejemplo los sac�ridos del serogrupo A podrían estar en dos grupos, con algunos conjugados con la CRM197 y otros conjugados con toxoide de tétano. En general, sin embargo, se prefiere usar la misma proteína portadora para todos los sac�ridos.
Una única proteína portadora podría llevar más de un ant�geno de sac�rido [38]. Por ejemplo, una única proteína portadora podría estar conjugada a sus sac�ridos de los serogrupos A y C.
Se prefieren los conjugados con una proporción (p/p) sac�rido:proteína de entre 0,5:1 (es decir exceso de proteína) y 5:1 (es decir exceso de sac�rido), y se prefieren aún más aquellos con una proporción entre 1:1,25 y 1:2,5.
Los conjugados se pueden usar en conjunción con la proteína portadora libre [39].
Se puede usar cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier conector adecuado donde sea necesario.
El sac�rido ser� típicamente activado o funcionalizado antes de la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilaci�n como el CDAP (por ejemplo 1-ciano-4-dimetilamino piridino tetrafluoroborato [40, 41, etc.]). Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborane, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; ver también la introducción a la referencia 21).
Se pueden hacer otros enlaces a través de un grupo conector usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 42 y 43. Un tipo de enlace implica aminaci�n reductora del polisac�rido, acoplar el grupo amino resultante con un extremo de un grupo conector de ácido ad�pico, y después acoplar una proteína con el otro extremo del grupo conector de ácido ad�pico [19, 44, 45]. Otros conectores incluyen B-propionamido [46], nitrofenil-etilamina [47], haluros de haloacilo [48], enlaces glicos�dicos [49], ácido 6aminocaproico [50], ADH [51], fracciones de C4 a C12 [52], etc. Como una alternativa a usar un conector, se puede usar el enlace directo. Los enlaces directos con la proteína pueden comprender la oxidación del polisac�rido seguido por aminaci�n reductora con la proteína, como se describe en, por ejemplo, las referencias 53 y 54.
Se prefiere un proceso que implica la introducción de grupos amino en el sac�rido (por ejemplo reemplazando los grupos terminales =O con -NN2) seguido por la derivatizaci�n con un di�ster ad�pico (por ejemplo di�ster de ácido ad�pico N-hidroxisuccinimido) y reacción con una proteína portadora.
despu�s de la conjugación, se pueden separar los sac�ridos libres y conjugados. Hay muchos métodos adecuados incluyendo cromatograf�a hidrof�bica, ultrafiltraci�n tangencial, diafiltraci�n, etc. [ver también las refs 55 y 56, etc.].
Cuando la composición de la invención incluye un oligosac�rido conjugado, se prefiere que la preparación del oligosac�rido preceda a la conjugación.
Cuando las composiciones de la invención incluyen más de un tipo de sac�rido capsular, son preparadas preferiblemente de forma separada (incluyendo cualquier fragmentación, conjugación, etc.) y después mezcladas para dar una composición de la invención.
Cuando la composición comprende sac�rido capsular del serogrupo A, sin embargo, se prefiere que el sac�rido del serogrupo A no se combine con los otros sac�ridos hasta poco antes del uso, para minimizar el potencial de hidrólisis. Esto se puede conseguir convenientemente teniendo el componente del serogrupo A en forma liofilizada y los otros componentes de serogrupo en forma líquida, con el componente líquido siendo usado para reconstituir el componente liofilizada cuando est� listo para el uso.
Una composición de la invención puede as� ser preparada de un kit que comprende: (a) sac�rido capsular del serogrupo A de la N.meningitidis, en forma liofilizada; y (b) sac�rido(s) capsular(es) de uno o más (por ejemplo 1, 2, 3) de los serogrupos C, W135 e Y de la N.meningitidis, en forma líquida. Un método para preparar una composición de la invención puede comprender mezclar un sac�rido capsular liofilizado del serogrupo A de la N.meningitidis con sac�rido(s) capsular(es) de uno o más (por ejemplo 1, 2, 3) de los serogrupos C, W135 e Y de la N.meningitidis, en donde los mencionados uno o más sac�ridos est�n en forma líquida.
Las composiciones de la invención pueden ser presentadas y envasadas de varias maneras.
Cuando las composiciones son para inyección, pueden ser presentadas en viales, o pueden ser presentadas en jeringuillas llenas preparadas. Las jeringuillas pueden ser suministradas con o sin agujas. Una jeringuilla incluir� una única dosis de la composición, mientras que un vial puede incluir una única dosis o múltiples dosis. Las composiciones inyectables ser�n habitualmente soluciones o suspensiones líquidas. Alternativamente, pueden ser presentadas en forma sólida para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.
Cuando una composición de la invención es para ser preparada extempor�neamente antes de su uso (por ejemplo, cuando el sac�rido del serogrupo A se presenta en forma liofilizada) y se presenta como un kit, el kit puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringuilla llena preparada y un vial, con los contenidos de la jeringuilla siendo usados para reactivar los contenidos del vial antes de la inyección.
Sin embargo, las composiciones preferidas son para la administración mucosal. De las carias opciones de administración mucosal disponibles, la vía intranasal es la más práctica ya que ofrece acceso sencillo con dispositivos relativamente simples que ya se han producido en masa. La composición de la invención est� por lo tanto preferiblemente adaptada y/o envasada para la administración intranasal, como por pulverizador nasal, gotas gel o polvo nasales [por ejemplo refs 57 & 58].
Las vías alternativas para la administración mucosal de la composición son las vías oral, intrag�strica, pulmonar, intestinal, transd�rmica, rectal, ocular y vaginal. La composición de la invención puede as� ser adaptada y/o envasada para la administración mucosal [por ejemplo ver refs. 59, 60 y 61]. Cuando la composición es para la administración oral, por ejemplo, puede estar en la forma de comprimidos o cápsulas (opcionalmente con recubrimiento ent�rico), líquido, material vegetal transg�nico, gotas, inhalador, aerosol, recubrimiento ent�rico, supositorio, pesario, etc. [ver también la ref. 62 y el capítulo 17 de la ref. 73].
Sea cual sea la vía de administración, las composiciones de la invención son envasadas preferiblemente en forma de dosis unitaria. Las dosis efectivas se pueden establecer de forma rutinaria. Una dosis humana típica de la composición para inyección o para uso intranasal tiene un volumen entre 0,1-0,5ml, por ejemplo dos pulverizadores de 100 μl, uno por fosa nasal.
Dentro de cada dosis, la cantidad de un ant�geno de sac�rido individual ser� generalmente de entre 1-50 μg (medido como masa de sac�rido), con alrededor de 10 μg de cada siendo lo preferido.
Las composiciones de la invención son preferiblemente estériles. Son preferiblemente libres de pir�geno. est�n preferiblemente tamponadas por ejemplo a entre pH 6y pH 8, generalmente alrededor de pH 7. Cuando una composición comprender una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere usar un tampón de histidina [63].
Las composiciones incluyen uno o más adyuvantes mucosales. Los adyuvantes pueden ser añadidos a sac�ridos antes y/o después de que sean mezclados para formar una composición de la invención, pero se prefiere combinar el adyuvante con un ant�geno de sac�rido antes del mezclado de sac�ridos diferentes.
Sin embargo, no es necesario que cada sac�rido deba ser adyuvado antes de dicha mezcla. El adyuvante en exceso puede ser incluido en una preparación de sac�rido de tal forma que, cuando se añade(n) ant�geno(s) de sac�rido sin adyuvar adicional(es), el exceso se diluye a una concentración final deseada. En una realización particular, cuando la composición de la invención se prepara de un ant�geno liofilizado (por ejemplo un componente del serogrupo A liofilizado) puede preferirse no incluir un adyuvante en el material liofilizado.
Los adyuvantes mucosales incluyen, pero no est�n limitados a: enterotoxina l�bil al calor de E.coli ("LT"), o mutantes desintoxicados del mismo [por ejemplo, Capítulo 5 de la ref. 64]; (B) toxina del cólera ("CT"), o mutantes desintoxicados de la misma [por ejemplo, Capítulo 5 de la ref. 64]; o (C) micropart�culas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 μm de diámetro, más preferiblemente de ~200 nm a ~30 μm de diámetro, y lo más preferible de ~500 nm a ~10 μm de diámetro) formadas de materiales que sean biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli (a-hidroxi�cido), un ácido polihidroxibut�rico, un poliorto�ster, un polianh�drido, una policaprolactona etc, como poli (lactida-co-glicolido), etc) tratados opcionalmente para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo con un detergente cati�nico, como CTAB); (D) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno [65]; (E) un surfactante de éster de sorbit�n de polioxietileno en combinación con un octoxinol [66] o un surfactante de éter o éster de alquilo de polioxietileno en combinación con al menos un surfactante no iónico adicional como un octoxinol [67]; (F) quitosano [por ejemplo 68]; (G) un oligonucle�tido inmunoestimulador (por ejemplo un oligonucle�tido CpG) y una saponina [69]; (H) liposomas [capítulos 13 y 14 de la ref. 73]; (I) imitadores del monofosforil lípido A, como derivados de aminoalquilo fosfato glucosaminida por ejemplo RC-529 [70]; (J) polifosfaceno (PCPP); (K) un bioadhesivo [71] como microesferas de ácido hialur�nico esterificado [72] o un mucoadhesivo seleccionado del grupo consistente de derivador reticulados de poli(ácido acr�lico), alcohol polivin�lico, polivinilpirrolidona, polisac�ridos y carboximetilcelulosa. También est�n disponibles otros adyuvantes mucosales [por ejemplo ver capítulo 7 de la ref. 73].
Adem�s de los adyuvantes mucosales dados anteriormente, las composiciones de la invención pueden incluir uno o más adyuvantes adicionales seleccionados del grupo siguiente: (A) sales de aluminio (alumbre), tales como hidr�xidos de aluminio (incluyendo los oxihidr�xidos), fosfatos de aluminio (incluyendo los hidroxifosfatos), sulfato de aluminio, etc [Capítulos 8 y 9 en la ref. 73]; (B) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como p�ptidos de muramilo [Los p�ptidos de muramilo incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilnormuramil-L -alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), Nacetyimuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfhoriloxi)-etilamina MTP-PE), etc.] o componentes de la pared celular bacteriana), como por ejemplo (a) MF59™ [Capítulo 10 en las ref. 73; 74, 75], que contienen un 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80, y 0.5% de Span 85 (conteniendo opcionalmente MTP-PE) formulados en partículas submicrom�tricas usando un microfluidizador, (b) SAF, que contienen un 10% de Escualeno, 0,4% de Tween 80, un 5% de pol�mero L121 bloqueado con plur�nico, y thr-MDP microfluidizado en una emulsión submicrom�trica o agitado con v�rtex para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor, y (c) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene un 2% de escualeno , un 0,2% de Tween 80, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo consistente de monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox™); (C) adyuvantes de saponina [capítulo 22 de la ref. 73], tales como QS21 o Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), bien en forma sencilla o en forma de partículas generadas de los mismos como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes;. Capítulo 23 de la ref. 73), estos ISCOMs pueden estar desprovistos de detergente adicional por ejemplo ref. 76; (D) Adyuvante Completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (E) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [77], etc), interferones (por ejemplo interfer�n gamma ), factor estimulante de colonias de macr�fagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc; (F) monofosforil lípido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) por ejemplo, refs. 78 y 79, opcionalmente en ausencia sustancial de alumbre cuando se usa con sac�ridos de neumococos por ejemplo, ref. 80; (G) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua, por ejemplo refs. 81, 82 y 83; (H) oligonucle�tidos que comprenden motivos CpG, es decir, que contienen al menos un dinucle�tido CG, con 5-metilcitosina opcionalmente usado en lugar de la citosina; (I) un inmunoestimulante y una partícula de sal por ejemplo, metal ref. 84; (J) una saponina y una emulsión de aceite en agua, por ejemplo, ref. 85; (K) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) por ejemplo, ref. 86; (L) ARN de doble cadena;
(M) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de la composición [por ejemplo, el capítulo 7 de ref. 73].
Cuando se usa un fosfato de aluminio, es posible adsorber uno o más de los sac�ridos a la sal de aluminio, pero se prefiere no hacerlo, y esto se favorece incluyendo iones de fosfato libres en la solución (por ejemplo por el uso de un tampón de fosfato). Cuando se usa hidróxido de aluminio, se prefiere adsorber los sac�ridos a la sal. Se puede preferir el uso de hidróxido de aluminio como un adyuvante para el sac�rido del serogrupo A.
Los adyuvantes mucosales preferidos son el quitosano (incluyendo trimetilquitosano) y mutantes desintoxicados de toxinas bacterianas (particularmente LT.). Estos se pueden usar solos, o pueden ser usados ventajosamente en combinación, como la co-administración permite que se usen dosis más bajas de la toxina, mejorando de esta manera la seguridad. Además, mientras que el quitosano solo da una respuesta Th2-sesgada, la adición de LTK63 puede causar un cambio hacia una respuesta Th1-sesgada.
El quitosano es conocido para su uso como un adyuvante [por ejemplo refs. 87 a 98], particularmente para el uso mucosal (por ejemplo intranasal. El quitosano (Figura 11) es un derivado N-desacetilado de la quitina pol�mero exoesquel�tica (Figura 12), aunque la N-desacetilaci�n casi nunca est� completa. La desacetilaci�n significa que, a diferencia de al quitina, el quitosano es soluble en ácidos acéticos y f�rmicos acuosos diluidos. El quitosano también ha encontrado amplia aplicación en campos farmacéuticos no de vacunas [99].
El mon�mero de glucosamina de repetición del quitosano contiene un grupo amino. Este grupo puede existir como amino libre (-NH2) o como amino cati�nico (-NH3+), con la protonaci�n afectando a la solubilidad del pol�mero. Los grupos aminos son químicamente activos y pueden ser sustituidos. De particular interés para la invención, los grupos aminos pueden ser sustituidos con uno o más grupos alquilo ('A' por ejemplo metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, etc.) por ejemplo -NHA, -NH2A+, -NA1A2, -NHA1A2+, -NA1A2A3+. Los derivados preferidos son tri-alquilados y los derivados particularmente preferidos son trimetilados (es decir, trimetilquitosano o 'TMC' - Figura 13). Estos derivados tienen solubilidad acuosa mucho más alta que el quitosano no modificado sobre un intervalo de pH más amplio.
No es necesario que cada amina en el pol�mero de quitosano sea sustituida de esta manera. El grado de sustitución a lo largo de la longitud de la cadena del quitosano puede ser determinado por 1H-NMR y puede ser controlado por medio del número y duración de los pasos de reacción [100]. Se prefiere que al menos el 10% (por ejemplo al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más) de los mon�meros tengan una amina sustituida).
Hay 2 razones principales por las que es raro que el 100% de los mon�meros en el quitosano lleven una amina alquilada. Primero, la reacción de sustitución no ser� habitualmente eficiente al 100%. Es raro encontrar quitosano en el que el 100% de las unidades de mon�mero lleven grupos amino debido a que la desacetilaci�n de al quitina no es habitualmente eficiente al 100%. Los derivados de quitosano alquilados usados en la invención pueden por lo tanto tener grupos amida y/o no alquilados en algunas unidades de mon�mero, y el quitosano puede poseer algunos grupos amida. El quitosano y derivados usados con la invención est�n preferiblemente desacetilados al menos al 75%.
Los quitosanos vienen en una variedad de pesos moleculares, por ejemplo de oligosac�ridos con peso molecular de alrededor de 5.000-10.000 a pol�meros de peso molecular alto (por ejemplo 600.000-1.000.000).
Cuando se usa un quitosano cati�nico o derivado, estar� en la forma de una sal, por ejemplo cloruro o lactato.
El quitosano o derivado puede tomar varias formas físicas por ejemplo en solución, como un polvo, o en forma de partículas. Se prefiere las formas de partículas, incluyendo micropart�culas, que pueden estar reticuladas o no reticuladas y pueden estar formadas convenientemente por secado por pulverización [101, 102]. Otras formas físicas incluyen geles, perlas, películas, esponjas, fibras, emulsiones, etc.
Las exotoxinas bacterianas ADP-ribosilantes que catalizan la transferencia de una unidad de ADP-ribosa de NAD+ a una proteína objetivo son ampliamente conocidas. Ejemplos incluyen la toxina de difteria (Corynebacterium diphtheriae), la exotoxina A (Pseudomonas aeruginosa), la toxina del cólera (CT; Vibrio cholerae), enterotoxina l�bil al calor (LT; E. coli) y la toxina de pertussis (PT). Ejemplos adicionales est�n en las referencias 103 y 104.
Las toxinas se dividen típicamente en dos dominios funcionalmente distintos - A y B. La subunidad A es responsable de la actividad enzim�tica tóxica, mientras que la subunidad B es responsable de la unión celular. Las subunidades podrían ser dominios en la misma cadena de polip�ptido, o podrían ser cadenas de polip�ptido separadas. Las subunidades pueden ser ellas mismas olig�meros, por ejemplo, la subunidad A de CT consiste de A1 y A2 que est�n ligadas por un enlace de disulfuro, y su subunidad B es un homopent�mero. Típicamente, el contacto inicial con una célula objetivo es mediado por la subunidad B y después la subunidad A entra sola en la célula.
Las toxinas son típicamente inmunog�nicas, pero su inclusión en las vacunas est� obstaculizada por su toxicidad. Para eliminar la toxicidad sin eliminar también al inmunogenicidad, las toxinas han sido tratadas con productos químicos como glutaraldeh�do o formaldeh�do. Un enfoque más racional se basa en mutagenesis dirigida al sitio de los residuos del sitio claves para eliminar la actividad enzim�tica tóxica mientras se mantiene la inmunogenicidad [por ejemplo, refs. 105 (CT y LT), 106 (PT), 64 etc.]. Las vacunas contra la tosferina acelulares incluyen una forma de toxina de pertussis con dos sustituciones de amino�cidos (Arg9 - Lys y Glu129 - Gly; ’PT9K/129G’ [107]).
As� como sus propiedades inmunog�nicas, las toxinas han sido usadas como adyuvantes. La adyuvanticidad parenteral se observ� primero en 1975 [108] y la adyuvanticidad mucosal en 1984 [109]. Se descubrió sorprendentemente en 1993 que las formas desintoxicadas de las toxinas mantenían la adyuvanticidad [110].
Las composiciones de la invención pueden incluir una toxina ADP-ribosilante desintoxicada. La toxina puede ser toxina de difteria, exotoxina A de Pseudomonas o toxina de pertussis, pero es preferiblemente toxina de cólera (CT) o, más preferiblemente, enterotoxina l�bil al calor de E.coli (LT). Otras toxinas que pueden ser usadas son las descritas en la referencia 104 (SEQ IDs 1 a 7 de la misma, y mutantes de las mismas).
La desintoxicación de estas toxinas sin pérdida de inmunogenicidad y/o actividad adyuvante se puede conseguir por cualquier método adecuado, prefiriéndose con mutag�nesis. La mutag�nesis puede implicar una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones.
Los mutantes desintoxicados preferidos son LT que tienen una mutación en el residuo Arg-7 (por ejemplo una sustitución Lys); CT que tienen una mutación en el residuo Arg-7 (por ejemplo una sustitución Lys); CT que tienen una mutación en el residuo Arg-11 ( por ejemplo, una sustitución Lys ) ; LT que tienen una mutación en Val53; CT que tienen una mutación en Val-53; CT que tienen una mutación en el residuo Ser-61 ( por ejemplo, una sustitución de Phe); LT que tienen una mutación en el residuo Ser-63 (por ejemplo, una sustitución Lys o Tyr) [por ejemplo, Capítulo 5 de ref . 64 - K63; ref. 111 - Y63]; CT que tienen una mutación en el residuo Ser-63 (por ejemplo, una sustitución Lys o Tyr ); LT que tienen una mutación en el residuo de Ala-72 (por ejemplo, una sustitución de Arg) [112 - R72]; LT que tienen una mutación en Val -97; CT que tienen una mutación en Val-97; LT que tienen una mutación en Tyr-104; CT que tienen una mutación en Tyr-104 ; LT que tienen una mutación en el residuo Pro-106 (por ejemplo, una sustitución Ser) ; CT que tienen una mutación en el residuo Pro-106 (por ejemplo, una sustitución Ser) ; LT que tienen una mutación en el Glu-112 ( por ejemplo, una sustitución Lys ); CT que tienen una mutación en el Glu-112 (por ejemplo, una sustitución Lys) ; LT que tienen una mutación en el residuo Arg-192 (por ejemplo, una sustitución Gly) ; PT que tienen una mutación en el residuo Arg-9 (por ejemplo, una sustitución Lys); PT que tienen una mutación en el Glu-129 (por ejemplo, una sustitución Gly); y cualquiera de los mutantes descritos en la referencia 105.
Estas mutaciones pueden estar combinadas, por ejemplo Arg-9-Lys + Glu-129-Gly en PT, o LT con tanto una mutación D53 como una K63, etc.
La LT con una mutación en el residuo 63 � 72 es una toxina desintoxicada preferida. Se prefieren particularmente las toxinas LT-K63 y LT-R72 [113].
Se apreciar� que la numeración de estos residuos se basa en secuencias prototipo y que, por ejemplo, aunque la Ser-63 puede no ser realmente el 63� amino�cido en una variante de LT dada, una alineación de secuencias de amino�cidos revelar� la localización correspondiente a Ser-52.
Las toxinas desintoxicadas pueden estar en la forma de las subunidades A y/o B como sea apropiado para la actividad adyuvante.
Adem�s de los ant�genos de sac�rido meningoc�cicos, las composiciones de la invención pueden incluir ant�genos de proteínas meningoc�cicos. Se prefiere incluir proteínas del serogrupo B de la N.meningitidis [por ejemplo refs. 114 a 119] o preparaciones de OMV [por ejemplo refs. 120 a 123, etc.]. Los ant�genos no meningoc�cicos y no de neisseria, preferiblemente los que no disminuyen la respuesta inmune contra los componentes meningoc�cicos, también se pueden incluir. La Ref. 124, por ejemplo, describe combinaciones de oligosac�ridos de los serogrupos B y C de la N.meningitidis junto con el sac�rido Hib. Se prefieren los ant�genos de neumococo, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, B. pertussis, difteria, el tétanos, Helicobacter pylori, poliomielitis y/o H.influenzae. Los ant�genos no de neisseria particularmente preferidos incluyen:
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- ant�genos de Helicobacter pylori como CagA [125 a 128], VacA [129, 130], NAP [131, 132, 133], HopX [por ejemplo 134], HopY [por ejemplo 134] y/o ureasa.
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- un ant�geno de sac�rido o proteína de la Streptococcus pneumonia [por ejemplo, 135, 136, 137].
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- un ant�geno del virus de la hepatitis A, como un virus inactivado [por ejemplo 138, 139].
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- un ant�geno del virus de la hepatitis B, como los ant�genos de superficie y/o del núcleo [por ejemplo 139, 140], con el ant�geno de superficie estando preferiblemente adsorbido en un fosfato de aluminio [141].
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- Un ant�geno de sac�rido de la Haemophilus influenzae B [por ejemplo 9], preferiblemente no adsorbido o adsorbido en un fosfato de aluminio [142]
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- un ant�geno del virus de la hepatitis C [por ejemplo, 143].
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- un ant�geno de N.gonorrhoeae [por ejemplo, 114 a 117].
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- un ant�geno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, refs. 144-145, 146, 147, 148, 149, 150].
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- un ant�geno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, 151].
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- un ant�geno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo, 152].
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- ant�geno(s) de la polio [por ejemplo 153, 154] como el IPV.
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- ant�geno(s) de la rabia [por ejemplo, 155], como virus inactivado liofilizado [por ejemplo, 156, RabAvert™].
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- ant�genos del sarampión, las paperas y/o de rubéola [por ejemplo, capítulos 12, 13 y 17 de la ref. 1].
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- ant�geno(s) de la gripe [por ejemplo, capítulo 21 de la Ref. 1], como proteínas de superficie de la hemaglutinina y/o neuraminidasa.
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- un ant�geno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 157].
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- un ant�geno de Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B) [por ejemplo, 158, 159].
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- un ant�geno de Streptococcus pyogenes (estreptococos del grupo A) [por ejemplo, 159, 160, 161].
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- un ant�geno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 162].
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- ant�geno(s) de un paramixovirus como el virus respiratorio sincitial (RSV [163, 164]) y/o virus de parainfluenza (PIV3 [165]).
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- un ant�geno de Bacillus anthracis [por ejemplo, 166, 167, 168].
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- un ant�geno de un virus en la familia flaviviridae (género flavivirus) como el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, cuatro serotipos de virus del Dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del Nilo Occidental.
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- un ant�geno de pestivirus, como de virus de la peste porcina clásica, virus de la diarrea viral bovina, y/o virus de la enfermedad de la frontera.
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- un ant�geno de parvovirus por ejemplo del parvovirus B 19.
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- un toxoide del tétanos [por ejemplo, el capítulo 18 de la ref. 1].
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- holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutin�genos 2 y 3 [por ejemplo, refs. 169 y 170].
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- ant�geno de pertussis celular.
La mezcla puede comprender uno o más de estos ant�genos adicionales, que pueden estar desintoxicados cuando sea necesario (por ejemplo desintoxicación de la toxina de pertussis por medios químicos y/o genéticos).
Cuando se incluye un ant�geno de difteria en la mezcla se prefiere también incluir ant�geno de tétano y ant�genos de pertussis. De manera similar cuando se incluye un ant�geno de tétano se prefiere incluir también ant�genos de difteria y pertussis. de manera similar, cuando se incluye un ant�geno de pertussis se prefiere incluir también ant�genos de difteria y tétano.
Los ant�genos en la mezcla estarán típicamente presentes a una concentración de al menos 1 μg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier ant�geno dado ser� suficiente para provocar una respuesta inmune contra ese ant�geno.
Se puede preferir no incluir los tres de (1) un sac�rido meningoc�cico, (2) un ant�geno que induzca una respuesta inmune contra la Haemophilus influenzae, y (3) un ant�geno que induzca una respuesta inmune contra la Streptococcus pneumoniae juntas en la composición de la invención.
Como una alternativa a usar ant�genos de proteínas en la mezcla, se puede usar el ácido nucleico que codifica el ant�geno. Los componentes de proteína de la mezcla pueden por lo tanto ser reemplazados por ácido nucleico (preferiblemente ADN, por ejemplo, en la forma de un pl�smido) que codifica la proteína. De manera similar, las composiciones de la invención pueden comprender proteínas que imitan a ant�genos de sac�rido, por ejemplo, mimotopos [171] o anticuerpos anti-idiotipo. Estos pueden reemplazar componentes de sac�rido individuales, o pueden suplementarlos. Como un ejemplo, la vacuna puede comprender un m�mico de p�ptido del polisac�rido capsular de la MenC [172] o la MenA [173] en lugar del mismo sac�rido.
Las composiciones de la invención pueden comprender detergente (por ejemplo un Tween, como el Tween 80) a niveles bajos (por ejemplo <0,01%). Las composiciones de la invención pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo manitol) o trehalosa, por ejemplo, a alrededor de 15 mg/ml, particularmente si van a ser liofilizados o si incluyen material que ha sido reconstituido de material liofilizado.
Las composiciones de la invención son inmunog�nicas. Las composiciones inmunog�nicas preferidas son vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir para evitar la invención) o terapéuticas (es decir para tratar la enfermedad después de la infección), pero ser�n típicamente profilácticas.
Las composiciones y vacunas inmunog�nicas de la invención comprenderán, además de los sac�ridos meningoc�cicos, típicamente "portadores farmac�uticamente aceptables", que incluyen cualquier portador que no induce por s� mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente moléculas metabolizadas lentamente, grandes como proteínas, polisac�ridos, ácidos polil�cticos, ácidos poligllic�licos, amino�cidos polim�ricos, copol�meros de amino�cidos, trehalosa [174], agregados lip�dicos (tales como gotitas de aceite o liposomas), y partículas de virus inactivas. Dichos portadores son bien conocidos para los expertos en la técnica. Las vacunas pueden incluir también diluyentes como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH, y similares. Una discusión detallada de excipientes farmac�uticamente aceptables est� disponible en la ref. 175.
Las composiciones inmunog�nicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunol�gicamente efectiva de ant�geno de sac�rido, as� como cualquier otro componente anteriormente mencionado, como sea necesario. Por 'cantidad inmunol�gicamente efectiva', se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea como una única dosis o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a ser tratado, edad y grupo taxonómico del individuo a ser tratado (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo de sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del doctor tratante de la situación m�dica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerán en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas rutinarias.
La inmunogenicidad de las composiciones de la invención puede ser determinada administrándolas a sujetos de prueba (por ejemplo niños de 12-16 meses de edad, o modelos animales [176]) y determinando después los parámetros estándar incluyendo anticuerpos bactericidas s�ricos (SBA) y títulos ESLISA (GMT) del total y de alta avidez de IgG anti-cápsula. Estas respuestas inmunes ser�n determinadas generalmente alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y comparadas con valores determinados antes de la administración de la composición. Se prefiere un aumento del SBA de al menos 4 veces u 8 veces. Cuando se administra más de una dosis de la composición, se puede hacer más de una determinación post-administración.
Como se ha mencionado anteriormente, las composiciones de la invención pueden ser administradas por varias vías, incluyendo parenteral y mucosal. Una vía preferida de administración parenteral es la inyección. La inyección puede ser subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, o intramuscular. Se prefiere la administración intramuscular al muslo. se puede usar inyección libre de agujas. Una vía preferida de administración mucosal es la intranasal. También es posible la administración transd�rmica o transcut�nea (por ejemplo, ver ref. 177).
La administración puede ser un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis. Un programa de dosis primaria puede ser seguido por un programa de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre la primaria y las de refuerzo puede ser determinado de forma rutinaria.
La administración ser� generalmente a un animal y, en particular, se pueden tratar sujetos humanos. Las composiciones son particularmente útiles para vacunar niños y adolescentes.
La composición de la invención puede ser usada en un método para provocar una respuesta inmune en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición de la invención. La respuesta inmune es preferiblemente protectora contra la enfermedad meningoc�cica, y puede comprender una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune celular. La respuesta inmune y/o la administración es/son preferiblemente ambas mucosales.
El paciente es preferiblemente un niño. Una clase preferida adicional de paciente es una mujer adulta, y particularmente una mujer en edad de tener hijos o una mujer embarazada. Las composiciones de la invención son particularmente adecuadas para inmunizar de forma pasiva niños a través de la vía maternal.
El método puede provocar una respuesta de refuerzo, en un paciente que ya ha sido cebado contra la N.meningitidis.
La invención también proporciona el uso de (1) un sac�rido capsular de al menos uno de los serogrupos A, C, W135 e Y de la N.meningitidis, en donde dichos sac�ridos capsulares est�n conjugados con proteína(s) portadora(s) y/o son oligosac�ridos, y (2) un quitosano trialquilado, en la fabricación de un medicamente para la
administraci�n intranasal a un animal para provocar una respuesta inmune. El uso puede también implicar (3) una toxina ADP-ribosilante desintoxicada.
Estos medicamentos son preferiblemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por una Neisseria (por ejemplo, meningitis, septicemia, gonorrea, etc.). Son preferiblemente para la administración intranasal. Comprenden preferiblemente sac�ridos capsulares de al menos dos (es decir 2, 3 � 4) de los serogrupos A, C,W135 e Y de la N.meningitidis.
Las composiciones de vacunas que comprenden quitosano (incluyendo derivados de los mismos) y ant�genos son conocidas en la técnica. El quitosano da una respuesta inmune Th2-sesgada. Se ha descubierto que la adición de adyuvantes de toxina ADP-ribosilante desintoxicada (por ejemplo, mutantes, como LTK63) a estas vacunas puede cambiar la respuesta inmune para tener un sesgo Th1.
El término "que comprende" significa "que incluye" as� como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X+Y.
El término "alrededor" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x�10%.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que est� "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención.
La Figura 1 ilustra la preparación de un conjugado de oligosac�rido.
Las Figuras 2, 5 & 8 muestran datos de IgG s�rica de los ejemplos. Las Figuras 3, 6 & 9 muestran datos de BCA s�rico de los ejemplos. Las Figuras 4, 7 & 10 muestran datos de proliferaci�n del bazo de los ejemplos. Las Figuras 11 a 13 muestran las estructuras de repetición de (11) quitosano (12) quitina y (13)
trimetilquitosano.
La Figura 14 muestra títulos ELISA de IgG (14A) y títulos bactericidas (14B) usando TMC y/o LT-K63.
La Figura 15 muestra títulos de IgA en suero (15A) y lavados nasales (15B) para los mismos experimentos, y
La Figura16 muestra resultados de un ensayo de proliferaci�n del bazo que varía con la concentración de
CRM197 (μg/ml).
La Figura 17 muestra títulos de IgG s�rico obtenidos tras tres dosis de ant�geno de MenC con adyuvante de quitosano. La Figura 18 muestra títulos de IgA nasal para los mismos experimentos, y la Figura 19 muestra anticuerpos
bactericidas s�ricos para los mismos experimentos. Las Figuras 20 y 21 muestran títulos de anticuerpo de IgG anti-MenC (superior; título medio � SD) medidos por ELISA después de 1 (post-1, después de 2 (post-2) y después de 3 inmunizaciones (post-3) y los títulos
de anticuerpo bactericidas s�ricos (inferior) probados en muestras agrupadas obtenidas después de tres inmunizaciones. La Figura 22 muestra títulos de anticuerpos IgG1, IgG2a, e IgE MenC-específicos por ELISA después de 3
inmunizaciones. Cada valor representa el título medio � SD.
Las Figuras 23 y 24 muestran las respuestas de IL-5e IFN-y usando (23) TMC o (24) LTK63.
MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCION
Se administro de forma intranasal un conjugado de oligosac�rido meningoc�cico C de CRM197 [6, 9] a 1 μg por dosis (medido como sac�rido) a ratones usando adyuvantes de cloruro de N-trimetil-quitosano [178] y/o LTK63. El TMC se us� a 8 μg por dosis, y se prepar� [179]del quitosano ('Chitoclear', Primex ehf, Islandia) de cáscaras de
gambas (acetiladas al 94,5%) con un 18,9% de sustitución. El LT-K63 se us� a 1 � 0,1 μg por dosis. Se inmunizaron intranasalmente BALB/c hembras sin anestesiar en los días 0, 21, 35 con las formulaciones en volúmenes de 10μl (5 μl) por fosa nasal). Las muestras de suero se tomaron antes y después de cada inmunizaci�n. Los lavados nasales se tomaron diez días después de la tercera inmunizaci�n. Los títulos de anticuerpos de IgG e IgA específicos para la MenC y para LT se determinaron por ELISA [180]. Los ratones de control recibieron un volumen de 400 μl de forma subcutánea (s.c.), incluyendo 500 μg de adyuvante de hidróxido de aluminio. Todas las formulaciones se prepararon en PBS con pH 7,4 justo antes del uso mezclando la vacuna conjugada de CRM-MenC con el adyuvante para las inmunizaciones subcutáneas, o con una suspensión en polvo de TMC, más o menos el adyuvante mucosal de LTK63.
Las muestras de suero se tomaron en los días 0, 20 (post-1), 34 (post-2), y 45 (post-3), cuando los ratones fueron sacrificados, los lavados nasales se tomaron y se retiraron los bazos. Los lavados nasales se realizaron por enjuague y aspiración repetidos de 1 ml de PBS, pH7,4 que contenía un 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF).
La titulación de los anticuerpos de IgG e IgA anti-MenC-, anti-CRM197- y anti-LTK63-específicos s�ricos y mucosales se llev� a cabo por ELISA en muestras de suero individuales como se ha detallado anteriormente [180182]. Los títulos de anticuerpos se compararon estadísticamente con un prueba de Student de dos colas. Se titul� la actividad bactericida s�rica contra la cepa C11 de los grupos C de la N.meningitidis en muestras de suero agrupadas de acuerdo con los procedimientos estándar ya descritos [119, 180] usando suero de cría de conejo como una fuente de complemento.
Las respuestas de IgG s�rico se muestran en la Figura 14: (A) ELISA y (B) bactericida (escala logarítmica). La Figura 15 muestra los títulos de IgA en (A) suero y (B) lavados nasales. La figura 16 muestra los resultados de un ensayo de proliferaci�n del bazo.
Los datos muestran que el TMC sólo mejora la inmunogenicidad y también que el TMC mejora la inmunogenicidad cuando se co-administra con adyuvante LT-K63. Los ratones que recibieron 1 μg de LT-K63 y TMC combinados alcanzaron títulos de IgG comparables a los obtenidos por inmunizaci�n subcutánea. Además, los adyuvantes combinados a ambas dosis dan iguales o mejores respuestas de anticuerpos bactericidas s�ricas que la inmunizaci�n subcutánea. La inmunizaci�n subcutánea no dio lugar a una respuesta de IgA MenC-específica en los lavados nasales.
El TMC y la LTK-63 con por lo tanto adyuvantes intranasales efectivos para el ant�geno de sac�rido de MenC, ya sea solos o en combinación. Ventajosamente, la adición de TMC a la LT-K63 permite que la dosis de LT-K63 se reduzca por el 90% sin pérdida de inmunogenicidad. El TMC permite que los componentes con toxicidad residual potencial sean reducidos sin pérdida de inmunogenicidad.
En experimentos adicionales, se compararon las siguientes nueve composiciones:
- Grupo
- 1 2 3 4 5 6 7 8 9
- Alumbre
- + - - - - - - - -
- LT-K63
- - - 1μg - - - 1μg 1μg 1μg
- TMC
- - - - 10μg 20μg 50μg 10μg 20μg 50μg
- V�a
- s.c. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n.
Como se muestra en la Figura 20, estos resultados confirman que los títulos de anticuerpos de IgG anti-MenC s�ricos más altos se obtuvieron en grupos de ratones que habían sido inmunizados i.n. con vacuna CRM-MenC junto con tanto el mutante LTK63 y el quitosano o el TMC (grupos 7 a 9). Los títulos de anticuerpos fueron comparable (P> 0,05) a los encontrados en ratones inmunizados con la misma dosis de vacuna dada s.c. (grupo 1) excepto por la respuesta después de la primera inmunizaci�n que indujo anticuerpos detectables solo en ratones inmunizados s.c. Aumentar la dosis de TMC de 10 μg a 50μg indujo una mejora significativa de la respuesta de anticuerpos anti-MenC s�ricos (P<0,01 para TMC 10 μg [grupo 4] frente a TMC 50μg [grupo 6]), a niveles comparables a los observados en ratones inmunizados i.n. con la vacuna con 1 μg del mutante LTK63 solo (grupo 3). Fue evidente una mejora significativa de la respuesta de anticuerpos anti-MenC por la adición de 1 μg de mutante LTK63 a las formulaciones de vacuna en los grupos de ratones que recibieron la dosis más baja de TMC (10 μg) (P<0,01 para el grupo 7 frente al grupo 4). Sólo los ratones inmunizados i.n. con la vacuna CRM-MenC más adyuvantes, pero no los inmunizados s.c. tuvieron anticuerpos de IgA s�ricos detectables contra la MenC, independientemente de la dosis de adyuvante/TMC utilizada. Finalmente, el uso concomitante de tanto el adyuvante mucosal LTK63 como el TMC indujo títulos bactericidas (1:16.000) más altos que los inducidos por la LTK63 sola (1:4.000), por el TMC solo (de 1:1.000 a 1:4.000) y por la vacuna dada s.c. (1:4.000).
Se realizaron experimentos similares usando quitosano 'Chitoclear' no metilado como adyuvante. Los ratones recibieron el mismo ant�geno conjugado a 2,5 μg de sac�rido por dosis, pero con LT-K63 (1 μg) y/o quitosano (10 � 20 μg), por la misma vía. Se usaron seis grupos de ratones:
- Grupo
- 1 2 3 4 5 6
- Alumbre
- + - - - - -
- LT-K63
- - + - - + +
- Quitosano
- - - 10μg 20μg 10μg 20μg
- V�a
- S.C. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n.
Como se muestra en las Figuras 17 a 19, la administración intranasal con LT-K63 y quitosano, en comparación con la administración subcutánea con alumbre, dio respuestas bactericidas s�ricas y de IgG equivalentes, y resulto en respuestas de IgA nasales.
Para evaluar si el uso del TMC como co-adyuvante permitiría una reducción en la dosis de LTK63 sin pérdida de al adyuvanticidad mucosal total, se probaron las siguientes composiciones:
- Grupo
- 1 2 3 4 5 6 7 8 9
- Alumbre
- + - - - - - - - -
- LT-K63
- - - - 0.05μg 0.1μg 1μg 0.05μg 0.1μg 1μg
- TMC
- - - 10μg - - - 10μg 10μg 10μg
- V�a
- s.c. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n.
Como se muestra en la Figura 21, la fuerte adyuvanticidad de la LTK63 a 1 μg por dosis (grupo 6) cae dramáticamente cuando el mutante se usa a dosificaciones de 0,1 � 0,05 μg (grupos 4 y 5). El uso concomitante de TMC junto con el mutante LTK63 restaur� completamente las respuestas de anticuerpos anti-MenC s�ricas (grupos 7 a 9).
Las respuestas de anticuerpos bactericidas fueron despreciables en ratones inmunizados con dosis limitativas del mutante LTK63 (grupos 4 y 5). Cuando el LTK63 se co-administr� con TMC (grupos 7 a 9), sin embargo, los títulos de anticuerpos bactericidas aumentaron a niveles comparables a o más altas que las encontradas en ratones que habían recibido la vacuna conjugada de CRM-MenC s.c. (grupo 1). Los ratones inmunizados i.n. con la vacuna CRM-MenC más LTK63 con o sin TMC, pero no los inmunizados s.c. tenían anticuerpos IgA detectables contra la MenC en los lavados nasales.
Por lo tanto el efecto aditivo del TMC y el del mutante LTK63 est� muy bien ejercido a dosis limitativas de cada uno, de tal forma que el uso de dosis completar del mutante LTK63 reducirían los requisitos para el TMC, y el uso de dosis completas de TMC limitaría las cantidades del mutante LTK63 necesario para la inducción de respuestas de anticuerpos fuertes y protectoras contra la MenC. De hecho, a dosis muy bajas de adyuvante de LTK63 (es decir 0,1 � 0,05 μg) se indujeron títulos de anticuerpos bactericidas altos si la vacuna conjugada de CRM-MenC se co-administr� junto con TMC, pero no en su ausencia. Esto era también cierto para la mejora de la respuesta inmune para el portador de CRM y para la misma LTK63 (no mostrado).
Estos datos muestran claramente que la adyuvanticidad mucosal intrínseca de esta moléculas puede ser mejorada eficientemente por formulación junto con los materiales bioadhesivos apropiados. Se espera, por lo tanto, que el perfil de seguridad de vacunas administradas i.n. ser� mejorado adicionalmente por el uso concomitante del mutante LT no tóxico y del TMC. Los datos muestran que las respuestas inmunes protectoras a las vacunas conjugadas meningoc�cicas pueden ser mejorada por inmunizaci�n mucosal usando la asociación de dos adyuvantes mucosales apropiados. En particular, la calidad de esta respuesta inmune protectora se puede modular, dependiendo de la dosificación apropiada de los adyuvantes mucosales.
Es conocido que la inmunizaci�n i.n. usando CRM197 formulado con quitosano conduce la respuesta inmune preferiblemente hacia un fenotipo del tipo Th2 funcional [183, 184], mientras que los mutantes LT, y el mutante LYK63 no tóxico en particular, polarizan preferentemente la respuesta inmune específica del ant�geno después de la
inmunizaci�n i.n. hacia un fenotipo funcional Th1/Th0 [185-187]. Se estudi� el equilibrio de Th1/Th2 de las composiciones de la invención, y se descubrió que el uso de adyuvantes de LTK63 o TMC modulaba finamente la propensión de estos dos componentes a inducir respuestas del tipo Th1- o Th2- dependiendo de las dosis usadas.
Los ratones se inmunizaron como se ha descrito anteriormente. Los grupos recibieron lo siguiente:
- Grupo
- 1 2 3 4 5 6 7 8 9
- Alumbre
- + - - - - - - - -
- LT-K63
- - - - 0.05μg 0.1μg 1μg 0.05μg 0.1μg 1μg
- TMC
- - - 10μg - - - 10μg 10μg 10μg
- V�a
- S.C. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n. i.n.
Se diseccionaron los bazos de ratones individuales, las células de cada grupo de ratones se agruparon juntas y se resuspendieron en DMEM que contenía un 10% de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 25 mM de Hepes, 100 U de penicilina y estreptomicina, y 5 mM de 2-mercapto-etanol. Se sembraron 2 x 105 células en 200 μl de cultivos en placas de 96 pocillos con fondo en U y se estimularon durante 5 días con conjugado de CRM-MenC a diferentes concentraciones, como se ha indicado. La proliferaci�n celular se determin� por la adición de 1μCi de 3[H]timidina por pocillo 16 horas antes de finalizar el cultivo. Las células fueron entonces recolectadas en papel de filtro, y se midió la radioactividad incorporada en un contador de centelleo.
Sea agruparon los sobrenadantes de cultivos celulares triplicados con la concentración más alta de ant�geno y se probaron por ELISA para evaluar los niveles de IFN-y y de IL-5 usando anticuerpos monoclonales específicos de citoquinas anti-murinos de rata. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con las cantidades apropiadas de anticuerpos de IFN-y y de IL-5 anti-ratón diluidos en 0,1 M de tampón de bicarbonato. Después de incubaci�n durante la noche a 4� C, lavado, y saturación de los sitios sin cubrir con 1% de BSA durante 2 horas a temperatura ambiente, se añadieron los sobrenadantes a los pocillos y se incubaron durante la noche a 4� C. Se determinaron las citoquinas enlazadas usando anticuerpos anti-IFN-y o anti-IL-5 biotinilados seguido por la adición de estreptavidina etiquetada con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a 37� C. Los anticuerpos enlazados se revelaron con el sustrato de o-fenilendiamina seguido por la lectura de las placas a 450 nm usando un lector ELISA de microplacas. Las concentraciones de citoquina se determinaron a través de la generación de una curva estándar hecha con cantidades conocidas de IFN-y y de IL-5 murina recombinante.
Como se muestra en la Figura 11, la inmunizaci�n i.n. con la vacuna de CRM-MenC más el lLTK63 solo indujo anticuerpos de IgG anti-MenC en tanto el isotipo IgG1 como el IgG2a cuando se dio a la dosis más alta (1 μg, grupo 6). Sin embargo, a dosis más bajas (es decir 0,1 u 0,05 μg) los IgG1 anti-MenC eran detectables, aunque a títulos bajos, mientras que los IgG2a eran indetectables. Con sólo el TMC, solo eran detectables anticuerpos de IgG1 anti-MenC. La administración concomitante del mutante LTK63 y del TMC con la vacuna de CRM-MenC no sólo mejor� los títulos de anticuerpos de IgG1 anti-MenC (p<0,05 para los grupos 7, 8 y 9 frente al grupo 3), sino que también indujo anticuerpos de IgG2a, especialmente a dosis más bajas de LTK63 (grupos 7 y 8). Como se esperaba, la inmunizaci�n s.c. en presencia de hidróxido de aluminio indujo títulos más altos de IgG1 a MenC en comparación con el IgG2a, y de forma importante también de IgE, que no eran nunca detectables en ratones que recibieron la vacuna i.n. Todos estos datos confirman fuertemente la propensión del LTK63 a inducir isotipos de IgG específicos de ant�genos dependientes de Th1 (IgG2a), incluso en presencia de compuestos como el TMC capaz de cebar respuestas de Th2.
La inmunizaci�n intranasal con la vacuna de CRM-MenC en presencia de LTK63 o de TMC indujo un cebado de células T que proliferaron específicamente en el momento de la re-estimulaci�n in vitro con ant�geno. Además, la respuesta proliferativa fue mejorada cuando los ratones hubieron recibido la vacuna con tanto el LTK63 como el TMC a niveles similares o más altos que los observados en ratones que recibieron la vacuna conjugada s.c.
Como se muestra en la Figura 23, la inmunizaci�n i.n. con la vacuna más sólo TMC indujo la producción de tanto IL-5 como IFN-y. El aumento de la cantidad de TMC usado para la inmunizaci�n suprimió fuertemente la cantidad de IFN-y, pero no todo el IL-5 producido. La adición del mutante LTK63 (1 μg por dosis) a la formulación de la vacuna con TMC suprimió dramáticamente la capacidad de las células para producir IL-5 y al mismo tiempo indujo niveles altos de IFN-y similares a los detectables en sobrenadantes de cultivo de ratones inmunizados con la vacuna más sólo el LTK63. La capacidad del LTK63 de inducir la producción de IFN-y se redujo significativamente cuando se us� a dosis más bajas (0,1 � 0,05 μg) para la inmunizaci�n i.n. (Figura 24). La adición de TMC a la formulación de la vacuna no cambi� el patrón de producción de IFN-y a la dosis más alta de LTK63 (1 μg); a la inversa, favoreció la producción de IL-5 cuando el LTK63 se dio a dosis más bajas. Tomados juntos, estos datos muestran (i) la propensión del LTK63 a polarizar la respuesta inmune hacia un fenotipo del tipo Th1 funcional (principalmente a dosis más altas), (ii) la propensión del TMC a favorecer una respuesta inmune del tipo Th2 funcional, (iii) la posibilidad de modular el equilibrio entre las respuestas del tipo Th1- y Th2- con una dosificación apropiada y la "mezcla" de los dos componentes.
Estudios anteriores del equilibrio de Th1/Th2 para el quitosano y LTK36 han usado dosis altas, fijadas de
5 LTK63 (1 μg o más altas) o de quitosano. Usando dosis decrecientes de ambos componentes, sin embargo, las respuestas del tipo Th2 y el tipo Th1 cebadas por TMC y por LTK63 pueden ser vistas más fácilmente. A las dosis más bajas de TMC y de LTK63, la polarización de la respuesta inmune fue mucho menos evidente. Cuando se a�adi� 1 μg de LTK63 a las formulaciones de vacuna que contenían cualquier dosis de TMC, la respuesta inmune fie sesgada consistentemente hacia una respuestas del tipo Th1, con producción de IFN-y y con la supresión total de producción de IL-5. Estos datos sugieren fuertemente el papel inductor del Th1 preeminente del LTK63 para arrinconar la respuesta de Th2-sesgada (productora de IL-5) del TMC. De hecho, la producción de IL-5 se mantuvo sólo en aquellos grupos que habían recibido las dosis más altas de TMC junto con las dosis más bajas de LTK63. La inclusión de un mutante LTK63 favorece una respuesta inmune del tipo Th1 que de otra forma habría sido dirigida hacia un fenotipo funcional del Th2 por TMC i.n. usado solo o por alumbre s.c.
15 Tomados juntos, los datos muestran que la polarización de la respuesta inmune hacia un fenotipo funcional de Th1 o Th2 no es solo dirigida por el adyuvante mucosal particular presente en la formulación de la vacuna, pero de forma importante también por la cantidad relativa de cada uno de los componentes presentes en la formulación de la vacuna administrada i.n.. As�, la calidad de la respuesta inmune protectora puede ser adaptada finamente, dependiendo de las funciones efectoras requeridas para la protección, por dosificación apropiada de los adyuvantes mucosales y sistemas de administración.
25 Se prepar� una composición de ACWY combinada de conjugados de oligosac�ridos usando los materiales descritos en la referencia 8. La composición se tampon� a pH 7,4 con PBS. La concentración de cada conjugado fue:
- Concentraci�n de sac�rido (μg/ml)
- Concentración de CRM197 (μg/ml)
- A
- 487.50 1073.4
- C
- 656.00 968.5
- W
- 939.70 918.0
- Y
- 583.70 837.1
La composición se administr� intranasalmente a ratones en volúmenes de 10 μl (5 μl por fosa nasal) sin adyuvante o con uno de los siguientes adyuvantes mucosales:
- Adyuvante
- Concentración (μg/dosis)
- LT-K63
- 1
- Quitosano
- 25
- Trimetilquitosano (TMC)
- 25
- LT-K63 + TMC
- como anteriormente (1 + 25)
Para la comparación, la misma composición de ant�geno se administr� subcut�neamente con un adyuvante de hidróxido de aluminio.
Como un control, se administr� el conjugado de MenC solo con los mismos adyuvantes por las mismas vías a una concentración equivalente que el MenC en la composición de combinación.
Diez grupos de ratones recibieron por lo tanto las siguientes composiciones:
- #
- Ant�geno Ant�geno (μg) Adyuvante Adyuvante (ng)
- 1
- ACWY 4 Alumbre (s.c.) 500
- 2
- C 1 Alumbre (s.c.) 500
- 3
- ACWY 4 - -
- 4
- C 1 - -
- 5
- ACWY 4 LTK63 1
- 6
- C 1 LTK63 1
- 7
- ACWY 4 TMC 25
- 8
- C 1 TMC 25
- 9
- ACWY 4 TMC+LTK63 25 + 1
- 10
- C 1 TMC+LTK63 25 + 1
En un primer conjunto de experimentos, los niveles de IgG s�ricos después de 3 dosis intranasales (subcutáneas para el alumbre) fueron como sigue, expresado como GMT (MEU/ml) � desviación estándar (Figura 2):
- #
- Anti-MenA Anti-MenC Anti-MenW Anti-MenY
- 1
- 356�2.5 310�2 176�4 479�1
- 2
- 2 996�1 2 2
- 3
- 10�8 11�4 4�5 34�2
- 4
- 2 3�3 2 2
- 5
- 81�3 54�3 22�2 162�2
- 6
- 10 246�2 7 8
- 7
- 21�2 42�2 11�3 79�1
- 8
- 2 94�4 2 2
- 9
- 140�4 103�4 118�2 285�2
- 10
- 2 205�1 2 2
Los mismos animales se probaron para anticuerpos bactericidas s�ricos en presencia de complemento de 45 cría de conejo. Las cepas usadas fueron A-F6124, C-C11, W135-5554 e Y-240539.
Los resultados fueron los siguientes (Figura 3):
- #
- Anti-MenA Anti-MenC Anti-MenW Anti-MenY
- 1
- 512 1024 2048 8192
- 2
- - 8192 - -
- 3
- 64 128 96 8192
- 4
- - 64 - -
- 5
- 256 1024 1024 8192
- 6
- - 4096 - -
- 7
- 128 256 48 8192
- 8
- - 512 - -
- 9
- 2048 4096 1024 8192
- 10
- - 2048 - -
Tambi�n se prob� la proliferaci�n de células en el bazo para los mismos 10 grupos. Los resultados de los
grupos numerados impares, que recibieron ant�genos de MenACWY, se muestran en la Figura 4A; los grupos
numerados pares, que recibieron sólo MenC, est�n en la Figura 4B.
En un segundo conjunto de experimentos, los ratones recibieron 20 μl de las siguientes composiciones
ACWY (cada ant�geno como 2 μg de sac�rido) intranasalmente, excepto para el grupo 1 que lo recibió
subcut�neamente.
- #
- Adyuvante Adyuvante (μg)
- 1
- Alumbre (s.c.) 500
- 2
- Alumbre (i.n.) 500
- 3
- LTK63 1
- 4
- TMC 61
- 5
- TMC 122
- 6
- LTK63 + TMC 1+61
- 7
- LTK63 + TMC 1+122
- 8
- Quitosano 61
- 9
- Quitosano 122
- 10
- LTK63 + quitosano 1 + 61
- 11
- LTK63 + quitosano 1+122
Las IgG s�ricas después de tres inmunizaciones se muestran en la Figura 5, las BCA s�ricas se muestran en la Figura 6, y la proliferaci�n celular se muestra en las Figuras 7A & 7B.
En un tercer conjunto de experimentos similares, los ratones recibieron 20 μl de las siguientes 55 composiciones de ACWY (cada ant�geno como 2 μg de sac�rido)) intranasalmente, excepto para el grupo 1 que lo recibió subcut�neamente.
- #
- Adyuvante Adyuvante (μg)
- 1
- Alumbre (s.c.) 500
- 2
- - -
- 3
- LTK63 1
- 4
- LTK63 0.1
- 5
- TMC 61
- 6
- LTK63 + TMC 1 + 61
- 7
- LTK63 + TMC 0.1 + 61
- 8
- Quitosano 61
- 9
- LTK63 + Quitosano 1 + 61
- 10
- LTK63 + Quitosano 0.1 + 61
Las IgG s�ricas después de tres inmunizaciones se muestran en la Figura 8, las BCA s�ricas se muestran en la Figura 9, y la proliferaci�n celular se muestra en las Figuras 10A & 10B.
Por lo tanto, tanto el LTK63 como el TMC, y particularmente el emparejamiento de los mismos, son adyuvantes altamente efectivos para la administración intranasal de una vacuna combinada contra los serogrupos A, C, W135 e Y meningoc�cicos.
Se entender� que la invención se ha descrito a modo de ejemplo solamente y se pueden hacer modificaciones mientras se permanece dentro del alcance de la invención.
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Claims (14)
- Reivindicaciones
- 1.
- Una composición inmunog�nica para la administración mucosal, que comprende sac�ridos capsulares de al menos dos de los serogrupos A, C, W135 e Y de la N.meningitidis, y que también comprende un adyuvante mucosal, en donde el adyuvante es quitosano tri-alquilado.
-
- 2.
- Una composición inmunog�nica, que comprende (a) un ant�geno de sac�rido capsular del serogrupo C de la N.meningitidis, en donde el sac�rido capsular est� conjugado con proteína(s) portadora(s) y (b) un adyuvante mucosal, en donde el adyuvante es quitosano tri-alquilado.
-
- 3.
- La composición de la reivindicación 2, que comprende (c) uno o más ant�genos adicionales y/o (d) uno o más adyuvantes adicionales.
-
- 4.
- La composición de la reivindicación 1, en donde los sac�ridos capsulares est�n conjugados con proteínas portadoras y/o son oligosac�ridos.
-
- 5.
- La composición de la reivindicación 2, en donde los sac�ridos capsulares son oligosac�ridos.
-
- 6.
- La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que est� adaptada y/o envasada para la administración intranasal.
-
- 7.
- La composición de la reivindicación 6, en la forma de un pulverizador nasal o gotas nasales.
-
- 8.
- La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un mutante desintoxicado de la toxina l�bil al calor de E.coli.
-
- 9.
- La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el quitosano tri-alquilado es trimetilquitosano.
-
- 10.
- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en donde el mutante desintoxicado de la toxina l�bil al calor de E.coli tiene una sustitución serina a lisina en el residuo 63.
-
- 11.
- La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición no incluye ambos de
(1) un ant�geno que induce una respuesta inmune contra la Haemophilus influenzae, y (2) un ant�geno que induce una respuesta inmune contra la Streptococcus pneumoniae. -
- 12.
- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende los tres de (1) un sac�rido meningoc�cico, (2) un ant�geno que induce una respuesta inmune contra la Haemophilus influenzae, y (2) un ant�geno que induzca una respuesta inmune contra la Streptococcus pneumoniae.
-
- 13.
- El uso de (a) sac�ridos capsulares de al menos dos de los serogrupos A, C, W135 e Y de la N.meningitidis, en donde los mencionados sac�ridos capsulares est�n conjugados con proteína(s) portadora(s) y/o son oligosac�ridos, y (b) un quitosano tri-alquilado, en la fabricación de un medicamento para la administración mucosal a un animal para provocar una respuesta inmune.
-
- 14.
- El uso de la reivindicación 13, en donde el medicamento es para la administración intranasal.
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