ES2431572T3

ES2431572T3 - Especies bifidobacterianas

Info

Publication number: ES2431572T3
Application number: ES08774627T
Authority: ES
Inventors: Georges Daube; Christine Franssen; Véronique DELCENSERIE; Françoise GAVINI; Bruno Pot
Original assignee: Universite de Liege; Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur
Current assignee: Universite de Liege; Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur
Priority date: 2007-10-20
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2028-07-02
Also published as: JP5327984B2; US8658153B2; US20100310513A1; EP2203551A1; WO2009049932A1; DK2203551T3; JP2011501666A; EP2203551B1

Abstract

Bifidobacterium GC61 depositada en la CNCM el 9 de enero de 2007 con número de acceso CNCMI-3712.

Description

Especies bifidobacterianas

5 La invención se refiere a una bacteria que pertenece al género Bifidobacterium, a composiciones probióticas que comprenden dicha bacteria, particularmente productos alimenticios, y al uso de dicha bacteria en el tratamiento de enfermedades, tales como enfermedades gastrointestinales.

Las bifidobacterias (o bacterias que pertenecen al género Bifidobacterium) constituyen una de las poblaciones más

10 importantes de la flora fecal humana y animal. Generalmente se considera una indicación de buena salud cuando estas bacterias están presentes en una elevada tasa en la flora fecal. Por este motivo, se conocen como bacterias probióticas (microorganismos beneficiosos que mejoran el equilibrio natural de la flora intestinal cuando se ingieren vivos). Ejemplos de bifidobacterias conocidas incluyen B. adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. catenulatum y B. longum, que han demostrado tener efectos tecnológicos, organolépticos y probióticos beneficiosos.

15 Las bifidobacterias se hallan muy habitualmente como aditivo en leches fermentadas (yogures con "Bifidus activo") y por tanto constituyen un producto económicamente importante. Las cepas elegidas por la industria láctea deben cumplir numerosos requisitos estrictos, tales como resistencia al proceso de fabricación y supervivencia dentro del producto alimenticio. Las especies más habitualmente usadas en Francia son B. animalis subsp. lactis y B. animalis

20 subsp. animalis, que es una subespecie de origen animal, nunca aislada de seres humanos. En vista de la importancia de las bifidobacterias, existe la gran necesidad de identificar nuevas especies dentro de este género que tengan propiedades que cumplan de forma óptima los requisitos de la industria alimentaria. Por ejemplo, en 2004, un grupo identificó y aisló Bifidobacterium psychraerophilum de un ciego porcino (Simpson, PJ. et al. (2004) Int J Syst Evol Microbiol 54: 401-6). La Bifidobacterium previamente conocida solamente era capaz de crecer a temperaturas

25 entre 20 ºC y 46-49,5 ºC (Biavati, B. et al., (2000), Annals of Microbiology 50: 117-131; Dong et al., (2000) Int J Syst Evol Microbiol 50 Pt 1:119-25), sin embargo, Bifidobacterium psychraerophilum mostró una ventaja sobre todas las especies previas creciendo a entre 4 y 10 ºC. Esto es beneficioso para composiciones probióticas ya que las bacterias tienen mayor probabilidad de sobrevivir a las bajas temperaturas de almacenamiento de dichos productos y por lo tanto prolongarían la vida útil del producto. Por tanto existe la gran necesidad de identificar especies

30 bifidobacterianas adicionales, que no solamente tengan ventajas únicas sino que también retengan los beneficios de las especies bifidobacterianas previamente identificadas.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona Bifidobacterium GC61 depositada en la CNCM el 9 de enero de 2007 con el número de acceso CNCMI-3712 y Bifidobacterium GC61 depositada en la CNCM el 9 de

35 enero de 2007 con el número de acceso CNCMI-3713 o un homólogo de la misma.

GC61 representa una nueva especie de Bifidobacterium. Las expresiones GC61, grupo GC61, Bifidobacterium GC61 y Bifidobacterium vercorsense se usan de forma intercambiable para hacer referencia a esta nueva especie de Bifidobacterium.

40 Ejemplos de cepas de GC61 analizadas en este documento incluyen FR41/2, FR49/f/2, FR101/h/8, MarV3/22, FR39/1, MarV4/2, MarV1/5, FR66/e/1, MarC1/13, MarF/3, PicD/1, FR70/g/2 y FR47/2. Los genes de ARNr 16S de las cepas FR41/2, FR49/f/2 y FR101/h/8 se han secuenciado y se nombran como ID de secuencia Nº 1 para el gen de ARNr 16S de FR101/h/8; ID de secuencia Nº 2 para el gen de ARNr 16S de FR41/2; e ID de secuencia Nº 3 para

45 el gen de ARNr 16S de FR49/f/2.

Se hizo un depósito de Bifidobacterium GC61 cepa FR41/2 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) en el Institut Pasteur en París el 9 de enero de 2007, a este depósito se le concedió el número de acceso CNCMI-3712.

50 Se hizo un depósito de Bifidobacterium GC61 cepa FR49/f/2 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) en el Institut Pasteur en París el 9 de enero de 2007, a este depósito se le concedió el número de acceso CNCMI-3713.

55 En la presente invención, un homólogo de GC61 puede definirse por referencia al grado de homología de secuencia en el gen 16 de ADN. Una bacteria en la que la secuencia del ADNr 16S se más del 98 % homóloga al gen del ADNr 16S de GC61 puede describirse como un homólogo de GC61. La secuencia del ADNr 16S de GC61 puede ser la secuencia consenso de ADNr 16S mencionada en la Figura 1A (ID de secuencia Nº 4) o puede tener la secuencia del ADNr 16S de cualquier cepa GC61 de la presente invención. Asimismo, o como alternativa, una bacteria que

60 tiene un gen hsp60 con más del 90 % de homología de secuencia con la secuencia del gen hsp60, o con la secuencia consenso del gen hsp60, en GC61 puede describir como un homólogo de GC61. Preferiblemente, la secuencia consenso del gen hsp60 es la secuencia identificada en la Figura 3. Preferiblemente se usa la secuencia del ADNr 16S o la secuencia de hsp60 de la cepa FR41/2 o FR49/f/2 de GC61 cuando se determina el grado de homología de secuencia.

65 Los homólogos de GC61 pueden ser de origen natural o pueden producirse de forma artificial, por ejemplo por manipulación genética.

GC61 se aisló de leche sin procesar durante el proceso de fabricación del queso "L'etoile du Vercors" que se hace

5 mediante un proceso tradicional y manual. GC61 está presente durante todo el proceso de producción del queso (es decir desde la leche sin procesar hasta el final de la maduración), con un aumento estadísticamente significativo durante el proceso. Estas bacterias pertenecen a una población microbiana natural que participa en el desarrollo de las propiedades organolépticas del producto.

GC61 tiene la ventaja de aislarse de un proceso de producción de alimentos mientras que muchas especies bifidobacterianas previamente aisladas se han extraído de los tractos digestivos de seres humanos o animales, por tanto GC61 es más fácil de integrar en el proceso de fabricación y también es más fácil de estabilizar en productos alimenticios y fermentados que muchas otras especies bifidobacterianas.

15 También se ha descubierto que GC61 es psicotrópica y es capaz de crecer a temperaturas tan bajas como aproximadamente 12 ºC. La ventaja clave de crecer a bajas temperaturas es que las bacterias GC61 tienen mayor probabilidad de sobrevivir a bajas temperaturas de almacenamiento que la mayoría de las demás composiciones bacterianas probióticas, lo que por lo tanto prolongaría su vida útil. Ventajas adicionales de las bacterias GC61 son que proporcionan una buena resistencia a la acidez del estómago, las sales biliares y a las enzimas intestinales (pepsina).

Una ventaja adicional más de las bacterias GC61 es que son resistentes al aire/oxígeno, es decir, son aerotolerantes.

25 Una ventaja adicional más de las bacterias GC61, y la cepa FR49/f/2 en particular, es que tienen un sorprendente efecto inmunomodulador, y pueden causar un elevado nivel de producción de la citoquina IL10, pero un bajo nivel de IL12. Esta proporción de IL10 a IL12 es indicativa de las propiedades anti-inflamatorias. Las propiedades antiinflamatorias también se demostraron in vivo en un modelo experimental de colitis en ratones.

La Bifidobacterium GC61 puede estar en forma de células viables.

Además, o como alternativa a las células viables, pueden ser útiles cultivos muertos de Bifidobacterium GC61 que contienen factores beneficiosos expresados por las células de Bifidobacterium GC61.

35 La Bifidobacterium GC61 puede estar en forma de un cultivo biológicamente puro.

Los mutantes de Bifidobacterium GC61 incluyen cepas con cambios conservativos o degenerativos en el código genético. Los mutantes pueden ser de origen natural o diseñarse por ingeniería genética.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende Bifidobacterium GC61 como se ha definido anteriormente en este documento y uno o más excipientes aceptables. Preferiblemente, la composición es una composición probiótica.

Se apreciará que un excipiente aceptable será bien conocido para los especialistas en la técnica de la preparación 45 de composiciones probióticas.

Ejemplos de excipientes aceptables incluyen: azúcares tales como sacarosa, azúcar isomerizado, glucosa, fructosa, palatinosa, trehalosa, lactosa y xilosa; alcoholes de azúcar tales como sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, palatinol, jarabe glutinoso reducido de almidón y jarabe glutinoso reducido de maltosa; emulsionantes tales como ésteres de sacarosa de ácidos grasos, ésteres de glicerina de ácidos grasos y lecitina; espesantes (estabilizantes) tales como carragenina, goma xantana, goma guar, pectina y goma garrofín; acidificantes tales como ácido cítrico, ácido láctico y ácido málico; zumos de fruta tales como zumo de limón, sumo de naranja y zumo de bayas; vitaminas tales como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D y vitamina E; y minerales tales como calcio, hierro, manganeso y zinc.

55 Las composiciones de la invención pueden prepararse por mezcla, adecuadamente a temperatura ambiente y presión atmosférica, habitualmente adaptadas para administración oral. Dichas composiciones puede estar en forma de comprimidos, cápsulas, preparaciones líquidas orales, productos alimenticios convencionales, polvos, gránulos, grageas, polvos reconstituibles o suspensiones.

Los comprimidos y cápsulas para administración oral pueden estar en forma de dosis unitaria, y pueden contener uno o más excipientes convencionales, tales como agentes aglutinantes, cargas, lubricantes de formación de comprimidos, disgregantes, y agentes humectantes aceptables. Los comprimidos pueden recubrirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica.

65 Las preparaciones líquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden estar en forma de un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), conservantes, y si se desea, aromatizantes o colorantes convencionales.

5 En una realización preferida, la composición de la invención se formula como un producto alimenticio convencional, más preferiblemente, un producto de base láctea (por ejemplo, leche fermentada, leche vegetal, leche de soja, mantequilla, queso o yogur) o sumo de frutas. La composición se formula preferiblemente como un alimento o bebida para adultos y/o infantes humanos y/o animales. En una realización alternativa, la composición se formula como un polvo liofilizado o secado por pulverización. Además de mostrar un efecto probiótico (es decir, mantener el

10 equilibrio de la flora intestinal), también se cree generalmente que las bifidobacterias son de uso potencial en el tratamiento y/o profilaxis de diversos trastornos, tales como enfermedades gastrointestinales, enfermedad de Crohn, colitis, colitis ulcerosa, trastornos inflamatorios, inmunodeficiencia, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino irritable, cáncer (particularmente de los sistemas gastrointestinal e inmune), enfermedad diarreica, diarrea asociada con antibióticos, diarrea pediátrica, apendicitis, trastornos autoinmunes, esclerosis múltiple,

15 enfermedad de Alzheimer, artritis reumatoide, enfermedad celíaca, diabetes mellitus, rechazo de un órgano transplantado, infecciones bacterianas, infecciones víricas, infecciones fúngicas, enfermedad periodontal, enfermedad urogenital, enfermedad de transmisión sexual, infección por VIH, replicación del VIH, diarrea asociada con el VIH, traumatismo asociado a cirugía, enfermedad metastásica inducida por cirugía, sepsis, pérdida de peso, anorexia, control de la fiebre, caquexia, curación de heridas, úlceras, función de barrera intestinal, alergia, asma,

20 trastornos respiratorios, trastornos circulatorios, cardiopatía coronaria, anemia, trastornos del sistema de coagulación de la sangre, enfermedad renal, trastornos del sistema nervioso central, enfermedad hepática, isquemia, trastornos nutricionales, osteoporosis, trastornos endocrinos, trastornos epidérmicos, psoriasis; acné vulgar y/o exceso de colesterol.

25 GC61 puede estar presente en la composición a más de 106 ufc por gramo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona Bifidobacterium GC61 para su uso como sustancia terapéutica o profiláctica, en particular en el tratamiento y/o profilaxis de uno cualquiera o más de los trastornos mencionados anteriormente.

30 La invención proporciona adicionalmente un uso de Bifidobacterium GC61 en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de uno cualquiera o más de los trastornos mencionados anteriormente.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona Bifidobacterium GC61 para su uso en el tratamiento 35 y/o la profilaxis de uno cualquiera o más de los trastornos mencionados anteriormente.

De acuerdo con un aspecto adicional más, la invención proporciona un método de tratamiento y/o profilaxis de uno cualquiera o más de los trastornos mencionados anteriormente, en un sujeto humano o animal, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de Bifidobacterium GC61.

40 Bifidobacterium GC61 puede usarse en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, otros medicamentos que se sabe que son útiles en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades gastrointestinales (por ejemplo, diarrea), cáncer, exceso de colesterol, alergias, infección o uno cualquiera o más de los trastornos mencionados anteriormente.

45 Por tanto, como aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición que comprende una combinación de Bifidobacterium GC61 junto con una agente o agentes terapéuticos adicionales.

Las combinaciones mencionadas anteriormente pueden presentarse convenientemente para su uso en forma de una

50 composición probiótica y por tanto composiciones probióticas que comprenden una combinación definida anteriormente junto con uno o más excipientes proporciona un aspecto adicional de la invención. Los componentes individuales de dichas combinaciones pueden administrarse secuencial o simultáneamente en composiciones probióticas diferentes o combinadas.

55 En una realización preferida, se combina Bifidobacterium GC61 y/o se usa con otras bifidobacterias u otras bacterias probióticas tales como: bacterias que pertenecen al género Lactobacillus tales como Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus

60 delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus zeae y Lactobacillus salivalius; bacterias que pertenecen al género Streptococcus tales como Streptococcus thermophilus; bacterias que pertenecen al género Lactococcus tales como Lactococcus lactis subsp. cremoris y Lactococcus lactis subsp. lactis; bacterias que pertenecen al género Bacillus tales como Bacillus subtilis; bacterias que pertenecen al género Bifidobacterium tales como Bifidobacterium crudilactis; y/o levaduras que pertenecen al género Saccharomyces, Torulaspora y/o Candida

65 tales como Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii y Candida kefyr.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona Bifidobacterium GC61 o un homólogo, descendiente o mutante de la misma, para su uso como probiótico inmunomodulador y/o anti-inflamatorio. Preferiblemente, el uso es para inducir la producción de IL-10 en un sujeto mamífero. Preferiblemente se produce IL-10 por PBMC.

5 De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de Bifidobacterium GC61 o un homólogo, descendiente o mutante de la misma, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de inflamación en un sujeto mamífero. Preferiblemente, la inflamación es del tracto gastrointestinal. Preferiblemente, el medicamento es para el tratamiento de la colitis.

De acuerdo con un aspecto adicional más de la invención, se proporciona Bifidobacterium GC61 o un homólogo, descendiente o mutante de la misma, para su uso en el tratamiento de la inflamación en un sujeto mamífero. Preferiblemente, la inflamación es del tracto gastrointestinal. Preferiblemente, la Bifidobacterium GC61 o un homólogo, descendiente o mutante de la misma es para su uso en el tratamiento de la colitis.

15 De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar la inflamación en un sujeto mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de Bifidobacterium GC61 al sujeto mamífero. Preferiblemente la inflamación es del tracto gastrointestinal. Preferiblemente, el método es para el tratamiento de la colitis.

Preferiblemente, la Bifidobacterium GC61 o un homólogo, descendiente o mutante de la misma, estimula la producción de IL-10 en un sujeto mamífero. Preferiblemente la Bifidobacterium GC61 o un homólogo, descendiente

o mutante de la misma reduce la producción de IL-12 en un sujeto mamífero. Preferiblemente, la Bifidobacterium GC61 o un homólogo, descendiente o mutante de la misma no estimula la producción de IL-12 en un sujeto mamífero.

25 Preferiblemente es sujeto mamífero es un ser humano.

La Bifidobacterium GC61 usada en cualquier aspecto de la invención puede ser de cualquier cepa mencionada previamente. Por ejemplo, la cepa puede ser la cepa FR41/2 o la cepa FR49/f/2. Si la Bifidobacterium GC61 es para su uso como agente/probiótico inmunomodulador y/o anti-inflamatorio, y/o para su uso en el tratamiento de la inflamación, la cepa puede ser FR49/f/2.

Se entiende que todas las características opcionales y/o preferidas de un aspecto o realización de la invención pueden aplicarse a todos los demás aspectos o realizaciones de la invención descrita en este documento.

35 Las realizaciones de la invención se describirán ahora simplemente a modo de ejemplo con referencia a las figuras adjuntas en las que:

Figura 1A -muestra una alineación de las secuencias del gen del ARNr 16Sobtenidas de las cepas GC61 FR101/h/8 (ID de secuencia Nº 1), FR41/2 (ID de secuencia Nº 2) y FR49/f/2 (ID de secuencia Nº 3) (llamadas respectivamente 1, 2 y 3). La alineación se realizó usando los softwares ClustalW y Edtaln. La secuencia consenso (ID de secuencia Nº 4) (llamada C en la alineación) muestra un 100 % de homología entre las 3 cepas desde la base número 2 hasta la base número 1452. El consenso se muestra por una secuencia de caracteres que, de acuerdo con la situación encontrada en una posición dada, incluirán:

45 "." Si el carácter tiene una representación mayoritaria > = 20 % ":" Si el carácter tiene una representación mayoritaria > = 40 % "+" Si el carácter tiene una representación mayoritaria > = 60 % "*" Si el carácter tiene una representación mayoritaria> = 80 % El propio carácter, si es igual para todas las secuencias;

Figura 1B -muestra la secuencia consenso de ADN de 1452 pb que codifica el ARNr 16S en Bifidobacterium vercorsense basándose en las 3 secuencias parciales de las cepas FR101/h/8, FR41/2 y FR49/f/2;

55 Figura 2A - muestra una alineación que compara la secuencia consenso de GC61 para el gen del ARNr 16S (indicado como secuencia nº 1 en esta figura) con las de las otras especies conocidas de Bifidobacterium, indicando el % de homología/identidad entre ellas. Se muestra un consenso entre las diferentes especies comparadas por una secuencia de caracteres que, de acuerdo con la situación encontrada en una posición dada, incluirán:

"." Si el carácter tiene una representación mayoritaria> = 20 % ":" Si el carácter tiene una representación mayoritaria> = 40 % "+" Si el carácter tiene una representación mayoritaria> = 60 % "*" Si el carácter tiene una representación mayoritaria> = 80 %

65 El propio carácter, si es igual para todas las secuencias. Esta secuencia consenso se denomina "C" en esta figura; Figura 2B -muestra un árbol consenso de GC61 y las especies filogenéticamente más relacionadas de Bifidobacterium. Los números en las ramas indican la cantidad de veces que sucede la separación de las especies en los dos conjuntos que se separan por esa rama entre los árboles, de 1,00 árboles (los árboles tenían pesos fraccionados);

5 Figura 3 -muestra una secuencia consenso del gen hsp60 (ID de secuencia Nº 5) secuenciado a partir de GC61 cepas Fr41/2, Fr49/f/2 y Fr101/h/8. Las bases subrayadas correspondes a los cebadores de PCR (ID de secuencia Nº 6 y 7), y las bases resaltadas correspondes a la secuencia de una sonda (ID de secuencia Nº 8) específica para la especie GC61;

10 Figura 4 -muestra una alineación de una secuencia génica parcial de hsp60 a partir de la bacteria Bifidobacterium vercorsense del grupo GC61, con secuencias muy relacionadas en otras especies de Bifidobacterium halladas en Genbank (PubMed-BLAST). La secuencia parcial del gen hsp60 de Bifidobacterium vercorsense es idéntica a la secuencia consenso del gen hsp60 mencionado en la Figura 3;

15 Figura 5 - muestra el procedimiento experimental usado para estudiar el efecto sobre IFNγ, IL-10 e IL-12 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) cuando se estimulaban con diversos aislados bacterianos;

Figuras 6A-D - muestran el efecto sobre los niveles de IFNγ, IL-10 e IL-12 en células mononucleares de sangre 20 periférica cuando se estimulaban con diversos aislados bacterianos incluyendo FR49/f/2 (cepa C), FR101/H/8 (cepa F), FR39/1 (cepa 1), FR41/2 (cepa M) y FR66/E/1 (cepa N);

Figura 6A - muestra la inducción de IFNγ; Figura 6B - muestra la inducción de IL-12; Figura 6C - muestra la inducción de IL-10; Figura 6D - muestra los valores de IL-10/IL-12; Souche=cepa, Temoin=control;

25 Figura 7 - ilustra el diseño de un estudio convencional de intervención bacteriana para la inducción por TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico) de colitis aguda; y

Figuras 8A-C - muestran los resultados del estudio de inducción por TNBS de colitis aguda; Figura 8A

30 muestra los valores de Wallace para las diferentes cepas; Figura 8B - muestra la dosificación de MPO para diferentes cepas; Figura 8C - muestra la protección relativa por las cepas. TEMOIN=control, Bifide temoin=Bifidobacterium de control.

Características fenotípicas de Bifidobacterium GC61

35 Bifidobacterium GC61 se ha caracterizado fenotípicamente y se ha identificado por análisis numérico (clasificación basada en métodos de vinculación promedio no ponderada y agrupación de Hartigan). No se han identificado cepas de otro tipo o referencia que pertenezcan a otra especie del género Bifidobacterium que compartan las características del grupo GC61.

40 Las características bioquímicas que diferencian el grupo GC61 de otras especies, tales como B. crudilactis (Delcenserie V., et al. Systematic and Applied Microbiology (2007) 30, 381-389) y B. psychraerophilum que se considera que son las especies filogenéticamente más relacionadas, se presentan en la Tabla 1. La Tabla 1 muestra características fenotípicas diferenciales entre GC61 (13 cepas), B. crudilactis (10 cepas), B. crudilactis LMG 23609T,

45 y B. psychraerophilum LMG 21775T.

Tabla 1

Características: GC61 (13 cepas, % de respuestas positivas) B. crudilactis (10 cepas, % de respuestas positivas) B. crudilactis LMG 23609T B. psychraerophilum LMG 21775T (Simpson et al., 2004)

Acidificación de:

L-arabinosa: 100 0 - +

D-xilosa: 0 10 - +

a-metil-D-manósido: 0 0 - +

N-acetilglucosamina: 0 0 - +

Salicina: 85 20 - +

Lactosa: 100 100 + -

Melezitosa: 0 10 - +

glucógeno: 92 10 - -

Ensayos enzimáticos:

α-arabinosidasa: 100 0 - +

glicina arilamidasa: 38 100 + +

Intervalo de temperatura de crecimiento: 10 ºCa-41 ºCb 5 ºC-45 ºC 4 ºC-45 ºC 4 ºC-42 ºC

pH de crecimiento mínimoc: NT 4,5

Contenido de G+C en el ADN (% mol): 61,1 (6 cepas) (DT=0,67) 55,2 (9 cepas) (DT=0,83) 56,4 (4 experimentos) (DT=0,60) 59,2 (HPLC, Simpson et al., 2004) 55,7 (Tmd)

Leyenda de la Tabla 1: a, crecimiento en 14 días; b, en 8 días; c, en 48h; d, media de 2 experimentos realizados en el laboratorios; NT, no ensayado en todas las cepas

Hibridación ADN-ADN

Los niveles de reasociación ADN-ADN a través del genoma bacteriano completo de las cepas GC61 y otras

5 especies de Bifidobacterium y de Aeriscardovia aeriphila son entre el 3 y el 28 % (como se ilustra en la Tabla 2). Dentro del grupo GC61 (se compararon las cepas GC61 FR49/f/2, MarV3/22, FR39/1, MarV4/2, FR101/h/8, MarV1/5, FR66/e/1, MarC1/13, MarF/3, PicD/1, FR70/g/2 y FR47/2 con la cepa GC61 FR41/2) se observan niveles de reasociación ADN-ADN del 80 % al 100 %.

10 Los niveles de reasociación ADN-ADN se determinaron usando el método espectrofotométrico para determinar las tasas de renaturalización descrito por De Ley et al. (J Biochem (1970) 12 133-142), ligeramente modificado en la temperatura de hibridación (Gavini et al. Ecology in Health and Disease (2001) 12 40-45). Las determinaciones se realizaron a 63,7 ºC (Tm-25 ºC de acuerdo con el contenido en G+C de la cepa FR41/2), usando un espectrofotómetro Cary 100 (Varian) con un controlador de temperatura (Peltier System, Varian).

Tabla 2

Asociación ADN-ADN (%) entre los ADN de FR41/2 y cepas tipo Bifidobacterium y Aeriscardovia aeriphila.

Especie/Colección y nº de referencia: % de asociación ADN-ADN con FR41/2

FR49/f/2; MarV3/22: 100

FR39/1: 95

MarV4/2: 94

FR101/h/8; MarV1/5: 93

FR66/e/1: 92

MarCl/13: 89

MarF/3: 88

PicD/1: 86

FR70/g/2: 84

FR47/2: 80

B. adolescentis CCUGa 18363: 24

B. angulatum DSM 20098: 18

B. animalis subsp. animales NCFB 2242: 21

B. animalis subsp. animalis ATCC 27674: NT

B. asteroides DSM 20089: 23

B. bifidum DSM 20082: NT

B. bifidum BS98b: 11

B. boum DSM 20432: 14

B. breve NCFB 2257: 6

B. catenulatum CCUG 18366: 15

B. choerinum DSM 20434: 21

B. coryneforme DSM 20216: 25

B. cuniculi DSM 20435: 12

B. crudilactis LMG 23609: 10

B. crudilactis FR59/b/2: NT

B. crudilactis FR47/3: NT

B. dentium CCUG 18367: 12

B. gallicum DSM 20093: 19

B. gallinarum ATCC 33777: 19

B. gallinarum ATCC 33778: NT

B. indicum DSM 20214: 17

B. indicum ATCC 25913: NT

B. longum tipo infantis DSM 20088: NT

B. longum tipo longum NCTC 11818: 14

B. longum tipo suis SU 859: 18

B. longum tipo suis ATCC 27532: NT

B. magnum DSM 20222: 10

B. magnum ATCC 27681: NT

B. merycicum RU 915 B: 21

B. minimum DSM 20102: 8

B. pseudocatenulatum DSM 20438: 18

B. pseudolongum subsp. globosum RU 224: 23

B. pseudolongum subsp. globosum ATCC 25864: NT

B. pseudolongum subsp. pseudolongum MB7: 25

B. pseudolongum subsp. pseudolongum DSM 20094: NT

B. psychraerophilum LMG 21775: 27

B. pullorum DSM 20433: NT

B. ruminantium RU 687: 20

B. saeculare DSM 6531: 13

B. scardovii DSM 13734: 3

B. subtile DSM 20096: 15

B. subtile ATCC 27683: NT

B. thermacidophilum subsp. thermacidophilum LMG 21395: 17

B. thermacidophilum subsp. porcinum LMG 21689: 22

B. thermophilum MB1: 4

B. thermophilum DSM 20212: NT

Aeriscardovia aeriphila LMG 21773: 28

Leyenda de la Tabla 2: a, El tipo de cepa de colección internacional proviene de: ATCC, American Type Culture Collection, Rockville, Mariland, EEUU; CCUG, Culture Collection of University of Goteborg, Suecia; DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Göttingen, Alemania; LMG Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent, Bélgica, NCFB, National Collection of Food Bacteria, Shinfield, Reading, Berks, Inglaterra; NCTC, National Collection of Type Cultures, Central Public Health Laboratory, Londres, Inglaterra; RU, SU y MB, B. Biavati, Bolonia, Italia; b , cepa aislada de heces humanas que comparte una similitud de ADN del 100 % con B. bifidum DSM 20082; NT, no ensayado.

Secuenciación del gen de ARNr 16S

Se amplificó y secuenció el gen de ARNr 16S de las cepas del grupo GC61 FR41/2, FR49/f/2 y de FR101/h/8 (Figura 1A). Usando análisis BLAST, se determinó el porcentaje de identidad de secuencia entre la secuencia consenso para el gen de ARNr 16S de las cepas GC61 FR41/2, FR49/f/2 y de FR101/h/8 (véase la Figura 1B) y la secuencia del gen de ARNr 16S de otras especies de Bifidobacterium (Figura 2A). Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3

Cepas y nº de referencia: Secuencias que producen alineaciones significativas Identidades Longitud de alineación

FR41/2, FR49/f/2, FR101/h/8,: AY174108 Bifidobacterium 95,45 % 1428 pb

secuencia consenso (Figura 1B): psychroaerophilum LMG21775

AY952448 Bifidobacterium crudilactis: 95,23 % 1384 pb

FR/59/b/2

AY174103 Bifidobacterium minimum: 94,77 % 1416 pb

D89378 Bifidobacterium subtile: 94,56 % 1453 pb

DSM20096

D86196 Bifidobacterium pullorum: 94,48 % 1413 pb

JCM1214

D86188 Bifidobacterium indicum: 94,43 % 1453 pb

JCM1302

D86191.1 Bifidobacterium gallinarum: 94,3 % 1453 pb

JCM6291

Secuenciación de hsp60

5 Se amplificó y secuenció el gen de hsp60 a partir de las cepas FR41/2, FR49/f/2 y FR101/h/8 del grupo GC61. Las secuencias se compararon y se identificó la secuencia consenso mostrada en la Figura 3. Esta secuencia consenso refleja una secuencia parcial del gen hsp60. Usando la secuencia consenso se seleccionaron los cebadores de PCR específicos y una sonda específica para las cepas GC61 (Figura 3). Los cebadores y/o la sonda permiten usar PCR a tiempo real para detectar cepas GC61.

10 Se usó análisis BLAST para identificar otras especies de Bifidobacterium que producían alineación significativa con la secuencia consenso del gen hsp60 de la Figura 3.

La Tabla 4 y la Figura 4 muestra la homología/porcentaje de identidad entre una secuencia génica parcial (212 pb)

15 del gen hsp60 del grupo GC61 de la bacteria Bifidobacterium vercorsense (véase la Figura 3) y el gen correspondiente de diferentes especies de Bifidobacterium (véase la Figura 4).

Tabla 4

Especie: Referencia Identidades Longitud de alineación

Bifidobacterium adolescents: AF210319 87 % 212 b

Bifidobacterium pullorum: AY004278 86 % 212 b

Bifidobacterium gallinarum: AY004279 86 % 212 b

Bifidobacterium dentium: AF240572 86 % 212 b

Bifidobacterium choerinum: AY013247 86 % 212 b

Bifidobacterium ruminantium: AF240571 86 % 212 b

Bifidobacterium cuniculi: AY004283 86 % 212 b

Bifidobacterium minimum: AY004284 86 % 210 b

Bifidobacterium thermacidophilum: AY166558 86 % 210 b

Bifidobacterium infantis: AY166569 86 % 207 b

Bifidobacterium longum: AY835622 86 % 207 b

Bifidobacterium boum: AF240566 85 % 212 b

Bifidobacterium merycicum: AY004277 85 % 212 b

Bifidobacterium bifidum: AY004280 85 % 212 b

Bifidobacterium pseudocatenulatum: AY004274 85 % 212 b

Bifidobacterium gallicum: AF240575 85 % 212 b

Bifidobacterium suis: AY013248 85 % 207 b

Bifidobacterium breve: AF240566 85 % 207 b

Bifidobacterium psychraerophilum: AY339132 85 % 204 b

Bifidobacterium crudilactis: Fr54/e/1 (aislado de lab.) 85 % 193 b

Bifidobacterium thermophilum: AF240567 84 % 212 b

Bifidobacterium magnum: AF240569 84 % 212 b

Bifidobacterium pseudolongum globosum: AF286736 84 % 212 b

Bifidobacterium angulatum: AF240568 84 % 212 b

Bifidobacterium animalis: AY488183 84 % 212 b

Bifidobacterium catenulatum: AY166565 83 % 212 b

Bifidobacterium tsurumiense: AB244755 82 % 212 b

Bifidobacterium indicum: AF240574 82 % 207 b

Bifidobacterium asteroides: AF240570 81 % 212 b

Bifidobacterium coryneforme: AY004275 80 % 207 b

Detección específica de GC61 por PCR

Se desarrolló un ensayo de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) a tiempo real para detectar específicamente 5 el grupo GC61.

El ADN se preparó usando el kit de purificación de ADN genómico Wizard® de Promega™. Se centrifugó 1 ml de cultivo bacteriano durante 2 minutos a 13000xg. El sobrenadante se desechó y se resuspendió el sedimento en 480 μl de EDTA, 60 μl de lisozima, y 120 μl de solución de lisis celular y se incubó durante 45 minutos a 37 ºC. Después 10 de centrifugación, se añadieron 600 μl de solución de lisis nuclear al sedimento seguido de incubación durante 5 min. a 80 ºC. Cuando se enfrió, se añadieron 200 μl de solución de lisis proteica seguido de agitación con vórtice. La suspensión resultante entonces se incubó durante 5 min. en hielo y se centrifugó durante 5 min. a 13000xg. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio que contenía 600 μl de isopropanol y después se centrifugó el tubo. El sobrenadante se decantó y se añadieron 600 μl de etanol al 70 % y se centrifugó el tubo. Se aspiró el etanol y se

15 secó al aire el sedimento durante 10 min. Finalmente, se rehidrató el sedimento de ADN en 100 μl de solución de rehidratación durante una noche a 4 ºC.

Las mezclas de reacción de amplificación contenían de 10 a 50 ng de ADN, 12,5 μl de TaqMan universal PCR Mastermix (Applied Biosystems, EEUU), 900 nM de cada cebador, 200 nM de sonda fluorogénica en un volumen

20 total de 25 μl. Los cebadores usados fueron: 5'TCCGACGCCATCGTCAA 3' (ID de secuencia Nº 6) y 5'-CGATCTGCTCCTTGGTTTCC-3' (ID de secuencia Nº 7). La secuencia de la sonda era 5'-TCGTCGCCTCGGC-3' (ID de secuencia Nº 8). Como control, se preparó una mezcla de reacción que carecía de muestra de ADN. Las secuencias de los cebadores y la sonda se presentan en la Figura 3.

25 Para la amplificación se programó un temociclador del siguiente modo: 50 ºC durante 2 min., 95 ºC durante 10 min., y después 40 ciclos de PCR de dos temperaturas (95 ºC durante 15 s y 60 ºC durante 60 s) y se realizó la detección en un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster city, EEUU). Los resultados de PCR para las muestras se expresaron como deltaRn (sensibilidad relativa) de la señal de fluorescencia.

30 Una muestra se consideró positiva cuando el valor Ct era inferior a 35 para un valor de fluorescencia relativa (nivel Rn) de al menos 1,0.

En los experimentos de PCR realizados, todos los aislados del grupo GC61 fueron positivos y todas las demás especies de Bifidobacterium (animalis, thermophilum, choerinum, globosum, pseudolongum, merycicum, ruminatum, 35 minimum, cuniculi, adolescentis, bifidum, breve, dentium, longum, pseudocatenulatum y crudilactis) ensayadas fueron negativas en este ensayo.

Resistencia gastrointestinal de cepas GC61

40 En esta parte del estudio se ensayaron las cepas FR/49/f/2 y FR/41/2 del grupo Bifidobacterium GC61.

Los materiales usados incluyen:

MRS: medio Man Rogosa Sharpe (Oxoid GmbH, Wesel, Alemania),

45 Jugo gástrico: solución de pepsina (0,3 % p/v) (P7000 Sigma) en NaCl-agua (0,5 % p/v) ajustada a pH 2 y 3 con HCl. Jugo pancreático: solución de pancreatina USP (1 g/1) (P1500 Sigma) en NaCl-agua (0,5 % p/v) ajustada a pH 8 con NaOH. Sal biliar: medio MRS con bilis al 0,3 %, 0,5 % y 1 % (p/v) (LP0055, Oxo id).

50 Solución tampón: K2HPO4 50 mM

Estudio a pH 2 y 3 - se inocularon dos cepas de GC61, FR/49/f/2 y FR/41/2, en caldo MRS y se incubaron de forma anaeróbica a 37 ºC durante 36 horas. Después de centrifugación, las bacterias se resuspendieron en solución al 0,5 % de NaCl ajustada a pH 2 o pH 3. La suspensión se incubó de forma anaeróbica a 37 ºC y se tomaron muestras cada hora durante 5 horas. Las muestras se sembraron en placa usando un sembrador espiral en medio agar MRS (Don Whitley Scientific LTD., Shipley, West Yorkshire, RU). Las placas se incubaron durante 72 horas a 37 ºC antes de contar la cantidad de colonias. Todas las manipulaciones se realizaron en una cabina anaeróbica. Las

5 manipulaciones se hicieron por triplicado.

Estudio en jugo gástrico a pH 2 y 3 - las dos cepas (FR/49/f/2 y FR/41/2) se inocularon en caldo MRS y se incubaron de forma anaeróbica at 37 ºC durante 36 horas. Después de centrifugación, las bacterias se resuspendieron en solución de jugo gástrico ajustada a pH 2 o pH 3. La suspensión se incubó de forma anaeróbica a

10 37 ºC y se tomaron muestras cada hora durante 5 horas. Las muestras se sembraron en placa usando un sembrador espiral en medio agar MRS (Don Whitley Scientific LTD., Shipley, West Yorkshire, RU). Las placas se incubaron durante 72 horas a 37 ºC antes de contar la cantidad de colonias. Todas las manipulaciones se realizaron en una cabina anaeróbica. Las manipulaciones se hicieron por triplicado.

15 Estudio en jugo pancreático a pH 8 - las dos cepas (FR/49/f/2 y FR/41/2) se inocularon en caldo MRS y se incubaron de forma anaeróbica a 37 ºC durante 36 horas. Después de centrifugación, las bacterias se resuspendieron en solución de jugo pancreático ajustada a pH 8. La suspensión se incubó de forma anaeróbica a 37 ºC y se tomaron muestras cada hora durante 5 horas. Las muestras se sembraron en placa usando un sembrador espiral en medio agar MRS (Don Whitley Scientific LTD., Shipley, West Yorkshire, RU). Las placas se incubaron

20 durante 72 horas a 37 ºC antes de contar la cantidad de colonias. Todas las manipulaciones se realizaron en una cabina anaeróbica. Las manipulaciones se hicieron por triplicado.

Estudio en medio MRS con sales biliares - las dos cepas (FR/49/f/2 y FR/41/2) se inocularon en caldo MRS y se incubaron de forma anaeróbica a 37 ºC durante 36 horas. Después de centrifugación, las bacterias se

25 resuspendieron en medio MRS con sales biliares al 0,3 %, 0,5 % y 1 %. La suspensión se incubó de forma anaeróbica a 37 ºC y se tomaron muestras al inicio del experimento y después de 48 horas. Las muestras se sembraron en placa usando un sembrador espiral en medio agar MRS (Don Whitley Scientific LTD., Shipley, West Yorkshire, RU). Las placas se incubaron durante 72 horas a 37 ºC antes de contar la cantidad de colonias. Todas las manipulaciones se realizaron en una cabina anaeróbica. Las manipulaciones se hicieron por triplicado.

Resultados

Se evaluó in vitro la resistencia a las condiciones gastrointestinales de algunos aislados (Fr41/2 y Fr49/f/2). Los resultados (en log10 del cambio de ufc) mostrados en las Tablas 5 y 6 confirman el uso probiótico potencial de

35 GC61.

La Tabla 5 muestra la resistencia de las cepas Fr49/f/2 y Fr41/2 de GC61 a soluciones de pepsina a pH 2 y pH 3 y enzimas pancreáticas a pH 8 después de 5 horas a 37 ºC en cabina anaeróbica. Los resultados se expresan en log10 de la reducción después del periodo de incubación. Se observó una buena resistencia a pH 3 y con enzimas

40 pancreáticas (menos de 1 log10 de ufc de reducción).

Tabla 5

Agua fisiológica: Pepsina Enzimas pancreáticas

Cepas: pH 2 pH 3 pH 2 pH 3 pH 8

Fr49/f/2: > -3 0 >- 4,8 -0,2 -0,2

Fr41/2: > -3 0 -3,1 -0,4 -0,5

La Tabla 6 muestra la resistencia de las cepas Fr49/f/2 y Fr41/2 a sales biliares en medio MRS después de 48 horas a 37 ºC en cabina anaeróbica. Los resultados se expresan en log10 de la reducción o crecimiento después del 45 periodo de incubación. Se observó una baja cantidad de reducción a pH 3 y con sales biliares al 0,3 % (menos de 2 log10 de ufc de reducción).

Tabla 6

Sales biliares

Cepas: 1 % 0,5 % 0,3 % 0 %

Fr49/f/2: -3,1 -2,6 -1 +1,1

Fr41/2: -3,5 -3,1 -1,8 +2

Modulación de la inmunidad gastrointestinal

También se determinó que algunos aislados del grupo GC61 tienen interesantes efectos inmunomoduladores modulando los niveles de citoquinas.

IL-10 es una citoquina producida por células T, células B, monocitos y macrófagos. IL-10 aumenta la proliferación y diferenciación de células B en células secretoras de anticuerpos. IL-10 muestra principalmente actividades antiinflamatorias y puede ser un importante regulador negativo de la destrucción de tejido conectivo observada en enfermedades inflamatorias crónicas.

5 IL-12 es una citoquina producida principalmente por células presentadoras de antígeno, tales como macrófagos, temprana en la cascada inflamatoria. Es un potente inductor de la producción de IFNγ y es un activador de células citolíticas naturales. La inhibición de IL-12 in vivo puede tener algún valor terapéutico en el tratamiento de trastornos inflamatorios, tales como esclerosis múltiple.

10 IFNγ es principalmente un producto de linfocitos T activados y sinergiza con otras citoquinas provocando una estimulación más potente de monocitos, macrófagos, neutrófilos y células endoteliales.

Para ensayar el efecto de GC61 sobre la producción de IL-10, IL-12 e IFNγ, se aislaron células mononucleares de

15 sangre periférica (PBMC) de donantes sanos (n=5) por centrifugación en gradiente de densidad. Las células mononucleares de sangre periférica aisladas después se estimularon con aislados bacterianos, incluyendo los aislados bacterianos probióticos GC61 FR49/f/2, FR101/h/8, FR39/1, FR41/2, y FR66/e/1, durante un periodo de 72 horas a 37 ºC. Los sobrenadantes después se recogieron, centrifugaron y ensayaron para los niveles de IL-10, IL-12 e IFNγ por ELISA.

Método

Se cultivaron las cepas de Bifidobacterium, incluyendo FR49/f/2, FR101/h/8, FR39/1, FR41/2, y FR66/e/1, en medio MRS (Difco) suplementado con cisteína (Sigma a 0,5 g/) en frascos anaeróbicos con bolsas gaspack (GEN bag

25 Biomerieux). Todas las cepas resultaron ser puras.

Se usaron subcultivos de estas cepas puras en todas las experimentaciones posteriores y se conservaron en forma de cultivos en glicerol a -80 ºC a modo de reserva y control de calidad.

30 Preparación de PBMC

Como se ilustra en la Figura 5, se diluyó sangre humana fresca, obtenida de sujetos sanos, a una proporción 1:2 con PBS-Ca (GIBCO) (tubo de ensayo A en la Figura 6) y se purificó en un gradiente de Ficoll (GIBCO). Después de centrifugación a 400x g durante 30 min. a 20 ºC las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) formaron

35 una capa anular interfásica en el suero (tubo de ensayo B en la Figura 5). Las PBMC se aspiraron con cuidado, se suspendieron a un volumen final de 50 ml usando PBS-Ca y se lavaron tres veces en el mismo tampón con etapas de centrifugación a 350x g durante 10 min. a 20 ºC.

Las PBMC posteriormente se resuspendieron usando medio RPMI completo (GIBCO), suplementado con suero de

40 ternera fetal al 10 % p/v (inactivado a 56 ºC durante 30 min.), L-glutamina al 1 % p/v (GIBCO), y gentamicina (150 μg/ ml) (GIBCO). Las PBMC se contaron al microscopio y se ajustaron a una concentración de 2x106 células/ml y se distribuyeron (en alícuotas de 1 ml) en placas de cultivo tisular de 24 pocillos (Coming, Inc.).

Preparación de bacterias

45 Se cultivaron cultivos de Lactobacillus o Bifidobacterium durante una noche y después se lavaron dos veces con tampón PBS, pH 7,2, antes de resuspenderse en PBS a una concentración de 2 x 109 ufc/ml. La Tabla 7 detalla las cepas bacterianas estudiadas, que incluyen los aislados GC61 FR49/f/2 (=cepa C), FR101/h/8 (=cepa F), FR39/1 (=cepa 1), FR41/2 (=cepa M), y FR66/E/1 (=cepa N). Además de las cepas GC61 (cepas A a P), también se

50 estudiaron cepas de otras especies de Bifidobacterium (cepas Q a Z).

Tabla 7

nº IPL de cepa: nº original Grupo taxonómico

cepa A: FR62/b/3 Grupo 1

cepa B: FR56/a/3 Grupo 1

cepa C: FR49/f/2 Grupo GC61

cepa D: FR55/d/2 Grupo 1

cepa E: FR54/e/1 Grupo 1

cepa F: FR101/h/8 Grupo GC61

cepa G: FR59/b/2 Grupo 1

cepa H: FR57/h/4 Grupo 1

cepa I: FR39/1 Grupo GC61

cepa J: FR35/5 Grupo 1

cepa K: FR50/f/4 Grupo 1

cepa L: FR60/h/1 Grupo 1

cepa M: FR41/2 Grupo GC61

cepa N: FR66/e/1 Grupo GC61

cepa O: FR51/h/1 Grupo 1

cepa P: FR66/a/1 Grupo 1

cepa Q: C 4A B.adolescentis

cepa R: C 3-12 B.adolescentis

cepa S: C 5-19 B.adolescentis

cepa T: C 1-7 B.longum

cepa U: C2-2 B.pseudocatenulatum

cepa V: C 6-20 B.breve

cepa W: C 9-4 B.dentium

cepa X: C 9-5 B.adolescentis

cepa Y: C 12-19 B.dentium

cepa Z: C 11-15 B.dentium

Incubación de PBMC

Después se transfirieron 10 μl de las suspensiones bacterianas en los poquillos que contenían las PBMC. Las placas

5 se incubaron después a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5 %/aire al 95 %. Después de 24 h de incubación, se aspiró el sobrenadante, se centrifugó a 2000 rpm (modelo Eppendorf) y se retiró el sobrenadante y se almacenó a 20 ºC. Como control (Temoin), se realizó el procedimiento usando un tampón sin bacterias en lugar de la suspensión bacteriana.

10 Cuantificación de citoquinas

Se determinó el nivel de la citoquina pro-inflamatoria/Thl IFNγ, de IL-12 y de la citoquina reguladora anti-inflamatorio IL-10 en el sobrenadante retirado de las PBMC tratadas.

15 Los niveles de expresión de citoquinas se determinaron por ELISA. Se recubrieron placas ELISA con uno o más anticuerpos anti-citoquina específicos (en un procedimiento durante una noche) y se bloqueó el anticuerpo con PBS / BSA al 1 %.

Las citoquinas se detectaron y cuantificaron usando una reacción de estreptavidina. Se usaron los kits comerciales 20 de Pharmingen que contienen TMB (tetrametilbenzidina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados

Los resultados del análisis de citoquinas se presentan en las Figuras 6A a 6D. Cada punto de datos es la media del 25 análisis de 5 muestras sanguíneas, cada una de diferentes donantes.

Como puede observarse a partir de la Figura 6C, las cepas FR49/f/2 (cepa C), FR39/1 (cepa I), FR41/2 (cepa M) y FR66/E/1 (cepa N) indujeron todas significativamente la producción de IL-10 después de co-incubación con células mononucleares de sangre periférica. La cepa FR101/H/8 (cepa F) no alteró significativamente los niveles de IL-10 en

30 comparación con los controles.

Como puede observarse a partir de la Figura 6B, la cepa FR49/f/2 (cepa C) ni indujo estimulación de producción de IL-12 y mostró un interesante efecto anti-inflamatorio indicado por el elevado nivel del coeficiente IL-10/IL-12 (Figura 6D). El nivel observado para FR49/f/2 es tan elevado como la mejor especie de Bifidobacterium previamente

35 ensayada.

Todas las cepas ensayadas excepto la cepa FR49/f/2 indujeron producción de IFNγ.

En conclusión, la cepa FR49/f/2 tiene un buen perfil para su uso en aplicaciones probióticas anti-inflamatorias. 40

Evaluación de las cepas FR49/f/2 (cepa C) y FR66/a/1 (cepa P) para su potencial inmunomodulador en un modelo de colitis

La cepa C (FR49/f/2) del grupo GC61 y la cepa P (FR66/a/1) del grupo 1 no GC61 mostraron propiedades opuestas 5 en ensayos de PBMC (Figura 6) y se estudiaron adicionalmente para evaluar su potencial inmunomodulador en un modelo animal de colitis.

Se usaron las cepas V (C 6-20) y X (C 9-5) como controles positivos, ya que tienen una elevada proporción IL-10/IL12 en estudios in vitro.

10 Reactivos químicos

Los agentes químicos y reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical, Francia salvo que se indique otra cosa.

15 Animales

Los experimentos en animales se realizaron en un establecimiento acreditado (número A59107; instalación animal del Institut Pasteur de Lille, Francia) de acuerdo con las directrices del gobierno francés (número 86/609/CEE).

20 Se adquirieron ratones adultos hembra BALB/C convencionales (7/8 semanas de edad), con flora homogénea, amamantados (Felasa, 1994 - (Federation of European Laboratory Animal Science Associations). Laboratory Animals. 28: 1-12) y mantenidos en condiciones sin patógenos específicos (SPF), de Iffa Credo (Saint-Germain sur l'Arbresle, Francia). Los ratones se alojaron en grupos (8-10/jaula) y se mantuvieron en campanas de filtro superior detrás de una barrera en condiciones SPF. Los ratones tuvieron acceso libre a agua corriente y pienso para

25 roedores y experimentaron al menos una semana de aclimatación antes de cualquier intervención. Se usaron grupos de 10 ratones para cada grupo experimental.

Preparación de cultivos bacterianos y administración a ratones

30 Las cepas investigadas se cultivaron como se ha descrito anteriormente en el método de PBMC. Se usaron 108 bacterias por administración diaria.

Inducción con TNBS de colitis aguda y diseño del estudio

35 El diseño del estudio de intervención bacteriana convencional se representa en la Figura 7. En resumen, se administraron suspensiones bacterianas a los ratones desde el día -5 antes de la inducción de colitis hasta el +1 después de la inducción de colitis el día 0. Se evaluaron la tasa de mortalidad, los valores macroscópicos de inflamación, el peso corporal y la MPO (actividad mieloperoxidasa) 48 h después de la inducción de colitis. Se anestesió a los ratones con 3 mg de ketamina (Imalgene 1000; Merial Lyon, Francia), 46,7 μg de diazepam (Valium,

40 Roche Diagnostics) y 15 μg de atropina (Aguettant Laboratory, Lyon, Francia) disueltos en NaCl al 0,9 %. Se disolvió TNBS (Fluka, Francia) a una dosis de 120 mg/kg de peso corporal en NaCl al 0,9 %/etanol (50/50 v/v) y se administraron 50 μl por vía intra-rectal a 4 cm proximal al ano, usando un catéter 3,5 F (EO 3416-1; Biotrol, Chelles, Francia). Los ratones de "control negativo" recibieron solamente etanol al 50 % ("ratones de etanol"). Los ratones de "control positivo" (también mencionados como ratones "de TNBS-control" o "tratados con TNBS") se alimentaron

45 solamente con tampón NaHCO3, en comparación con los ratones "tratados", a los que se administró adicionalmente una cantidad de bifidobacterias. Los animales se sacrificaron por dislocación cervical 2 días después de la administración de TNBS. Los ratones se pesaron antes de la administración de TNBS y después del sacrificio.

Evaluación macroscópica de colitis

50 El colon se diseccionó dejándolo libre de la grasa y el mesenterio, antes de retirarlo y abrirlo con cuidado y limpiarlo con PBS. Se evaluó el daño al colon y la inflamación de acuerdo con los criterios de Wallace (Wallace et al. 1989, Gastroenterology. 96(1):29-36 - resumido en la Tabla 9). Estos criterios para valoración macroscópica (valores que varían entre 0 y 10) se han establecido bien en estudios tanto de ratas como de ratones, y reflejan (i) la intensidad

55 de la inflamación, (ii) el engrosamiento de la mucosa del colon y (iii) el grado de la ulceración (Tabla 9).

Tabla 9

Valor de Wallace: Descripción de los síntomas

0: Aspecto normal del colon

1: Hiperemia focal, ligero engrosamiento, sin úlceras

2: Hiperemia, engrosamiento prominente, sin úlceras

3: Ulceración con inflamación en un sitio

4: Ulceración con inflamación en dos o más sitios

5: Los sitios principales de daño se extienden > 1cm

6-10: Cuando el área de daño se extiende > 2cm, el valor se aumenta en 1 por cada cm adicional de implicación.

Actividad mieloperoxidasa (MPO)

Se determinó la actividad de la enzima MPO, un marcador de gránulos primarios de neutrófilos polimorfonucleares,

5 en el tejido del colon proximal de acuerdo con Bradley et al. (1982, J Invest Dermatol. 78(3):206-9). Inmediatamente después del sacrificio, se tomó una muestra de colon (1 cm de longitud) a 3 cm de la unión ceco-colónica. Las muestras se suspendieron en un tampón fosfato potásico (50 mmol/l, pH 6,0) y se homogeneizaron en hielo usando un politrón. Se emprendieron tres ciclos de congelación y descongelación. Las suspensiones se centrifugaron a

10.000 x g durante 15 min. a 4 ºC. Se desecharon los sobrenadantes y los sedimentos se resuspendieron en tampón

10 bromuro de hexadecil trimetilamonio (HTAB al 0,5 %, p/v, en 50 mmol/l de tampón fosfato potásico, pH 6,0), un detergente que induce la liberación de MPO desde los gránulos primarios de neutrófilos polimorfonucleares. Estas suspensiones se sonicaron en hielo, y se centrifugaron de nuevo durante 15 min. a 4 ºC. Los sobrenadantes obtenidos se diluyeron en tampón fosfato potásico (pH 6,0) que contenía 0,167 mg/ml de diclorhidrato de Odianisidina y un 0,0005 % de peróxido de hidrógeno (H2O2). Se usó MPO de neutrófilos humanos (0,1 U/100 ml,

15 Sigma) como patrón. Se registraron los cambios en la absorbancia a 450 nm, durante 5 y 10 min., con un espectrofotómetro de microplaca (ELX808, Bio-Tek Instrument, CA). Una unidad de actividad MPO se define como la cantidad de MPO que degrada 1 mmol de peróxido de hidrógeno/min/ml a 25 ºC. Los resultados se dan como la media +/- ETM.

20 Resultados

El grado de protección conferido por una cepa bacteriana se expresa en este documento como el "% de protección relativa" que se refiere al % de reducción de la inflamación macroscópica media de ratones tratados en relación con el valor medio de ratones no tratados (grupo de TNBS-control). El % de protección relativa se calcula como se

25 detalla a continuación.

% de protección relativa = 100 x (valor promedio de Wallace del grupo de "control positivo" - valor promedio de Wallace del grupo de "tratamiento") / valor promedio de Wallace del grupo de "control positivo”

Este cálculo permite la comparación de grupos de ratones dentro y entre experimentos.

30 La aplicación de esta 'protección relativa' al nivel promedio de colitis de cada grupo de "control positivo", también permite la eliminación de las inevitables variaciones del valor de Wallace entre experimentos independientes.

La Figura 8A-C y la Tabla 10 muestran los resultados obtenidos cuando se analizaron 6 grupos diferentes de 10 ratones.

35 grupo 1: 10 ratones tratados con TNBS (sin bacterias) grupo 2: 10 ratones tratados con TNBS (+ cepa Fr 49/f/2) grupo 3: 10 ratones tratados con TNBS (+ cepa Fr 66/a/1) grupo 4: 10 ratones tratados con TNBS (+ cepa C6-20)

40 grupo 5: 10 ratones tratados con TNBS (+ cepa C9-5) grupo 6: 10 ratones tratados con TNBS (- cepa de control de Bifidobacterium)

Tabla 10

Valor de Walace: etm student Protección

Grupo 1 - TNBS: 4,75 0,037 0,00

Grupo 2 - C FR49/f/2: 1,9 0,056 1,38 10exp-11 60,00 ****

Grupo 3 - P FR66/a/1: 2,8 0,161 0,000346 41,05 ***

Grupo 4 - V B.breve C6-20: 2 0,163 8,67 10exp-6 57,89 ****

Grupo 5 - X B.adolescentis C9-5: 1,8 0,147 1,01 10exp-6 62,11 ****

Grupo 6 - Bifido ctrl: 2,7 0,211 0,0018 43,16 **

Como se esperaba debido a la proporción IL-10/IL-12, la cepa C (FR49/f/2) protegió bien en el modelo de colitis. La cepa P (FR66/a/1), otra Bifidobacterium no del grupo GC61, también mostró alguna protección. Los datos presentados demuestran que algunos aislados del grupo GC61, y la cepa FR49/f/2 en particular, tienen

propiedades anti-inflamatorias, inmunomoduladores.: lo que apoya la afirmación de que pueden usarse como agentes

5: Lista de secuencias <110> UNIVERSITE DE LIEGE

<120> ESPECIES BIFIDOBACTERIANAS

10: <130> 2007-08

<140> EP07118938.5 <141>

15: <160> 8

<170> PatentIn versión 3.3

20: <210> 1 <211> 1470 <212> ADN <213> Bifidobacterium sp. <400> 1

<210> 2

<211> 1453

<212> ADN

<213> Bifidobacterium sp.

<400> 2

<210> 3

<211> 1467

<212> ADN

<213> Bifidobacterium sp.

<400> 3

<210> 4

<211> 1452 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia consenso 10

<400> 4

<210> 5

<211> 212

<212> ADN

<213> Bifidobacterium sp.

<400> 5

<210> 6

<211> 17

<212> ADN <213> Artificial

5: <220> <223> Cebador

<400> 6 tccgacgcca tcgtcaa: 17

10: <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

15: <220> <223> Cebador

20 25: <400> 7 cgatctgctc cttggtttcc <210> 8 <211> 13 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Secuencia sonda 20

30: <400> 8 tcgtcgcctc ggc 13

Claims

REIVINDICACIONES

1. Bifidobacterium GC61 depositada en la CNCM el 9 de enero de 2007 con número de acceso CNCMI-3712.

5 2. Bifidobacterium GC61 depositada en la CNCM el 9 de enero de 2007 con número de acceso CNCMI-3713.
3. Una cepa de Bifidobacterium que tiene un gen de ARNr 16S con más de un 98 % de homología de secuencia de ADN con el gen de ARNr 16S (SEC ID Nº 4) de Bifidobacterium GC61 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
4. Una cepa de Bifidobacterium que tiene un gen hsp60 con más del 90 % de homología de secuencia de ADN con el gen hsp60 (SEC ID Nº 5) de Bifidobacterium GC61 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Una composición probiótica que comprende Bifidobacterium GC61 de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o una 15 cepa de Bifidobacterium de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 y uno o más excipientes aceptables.
6. Una composición probiótica como se ha definido en la reivindicación 5 en donde dicha composición es un producto alimenticio.

20 7. Una composición probiótica como se ha definido en la reivindicación 6 en donde dicho producto alimenticio es un producto de base láctea seleccionado entre leche fermentada, leche vegetal, leche de soja, mantequilla, queso y yogur.
8. Bifidobacterium de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o una cepa de Bifidobacterium de acuerdo con la

25 reivindicación 3 o 4 para su uso como sustancia terapéutica o profiláctica, en particular en el tratamiento y/o la profilaxis de una o más de enfermedades gastrointestinales, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, trastornos inflamatorios, inmunodeficiencia, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino irritable, cáncer (particularmente de los sistemas gastrointestinal e inmune), enfermedad diarreica, diarrea asociada con antibióticos, diarrea pediátrica, apendicitis, trastornos autoinmunes, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, artritis

30 reumatoide, enfermedad celíaca, diabetes mellitus, rechazo de un órgano transplantado, infecciones bacterianas, infecciones víricas, infecciones fúngicas, enfermedad periodontal, enfermedad urogenital, enfermedad de transmisión sexual, infección por VIH, replicación del VIH, diarrea asociada con el VIH, traumatismo asociado a cirugía, enfermedad metastásica inducida por cirugía, sepsis, pérdida de peso, anorexia, control de la fiebre, caquexia, curación de heridas, úlceras, función de barrera intestinal, alergia, asma, trastornos respiratorios,

35 trastornos circulatorios, cardiopatía coronaria, anemia, trastornos del sistema de coagulación de la sangre, enfermedad renal, trastornos del sistema nervioso central, enfermedad hepática, isquemia, trastornos nutricionales, osteoporosis, trastornos endocrinos, trastornos epidérmicos, psoriasis; acné vulgar y/o exceso de colesterol.
9. Uso de Bifidobacterium de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o una cepa de Bifidobacterium de acuerdo con la

40 reivindicación 3 o 4 en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una o más de enfermedades gastrointestinales, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, trastornos inflamatorios, inmunodeficiencia, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino irritable, cáncer (particularmente de los sistemas gastrointestinal e inmune), enfermedad diarreica, diarrea asociada con antibióticos, diarrea pediátrica, apendicitis, trastornos autoinmunes, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, artritis reumatoide, enfermedad celíaca,

45 diabetes mellitus, rechazo de un órgano transplantado, infecciones bacterianas, infecciones víricas, infecciones fúngicas, enfermedad periodontal, enfermedad urogenital, enfermedad de transmisión sexual, infección por VIH, replicación del VIH, diarrea asociada con el VIH, traumatismo asociado a cirugía, enfermedad metastásica inducida por cirugía, sepsis, pérdida de peso, anorexia, control de la fiebre, caquexia, curación de heridas, úlceras, función de barrera intestinal, alergia, asma, trastornos respiratorios, trastornos circulatorios, cardiopatía coronaria, anemia,

50 trastornos del sistema de coagulación de la sangre, enfermedad renal, trastornos del sistema nervioso central, enfermedad hepática, isquemia, trastornos nutricionales, osteoporosis, trastornos endocrinos, trastornos epidérmicos, psoriasis; acné vulgar y/o exceso de colesterol.
10. Una composición que comprende Bifidobacterium GC61 de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o una cepa de 55 Bifidobacterium de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 junto con un agente o agentes terapéuticos adicionales.
11. Bifidobacterium GC61 de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o una cepa de Bifidobacterium de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, para su uso como, o en la preparación de, un probiótico o un medicamento inmunomoduladores y/o anti-inflamatorios.
12. Uso de Bifidobacterium GC61 de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o una cepa de Bifidobacterium de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la inflamación en un sujeto mamífero.

Glóbulos rojos

Glóbulos blancos