ES2403804B1

ES2403804B1 - Producto de cartílago.

Info

Publication number: ES2403804B1
Application number: ES201131526A
Authority: ES
Inventors: Josep Escaich Ferrer; Pere DALMAU CASTA�ARES; Ana Mar�a TORRENT GIBERT; Ram�n RUH� ROURA; Carlos Ra�l AL�EZ VERS�N
Original assignee: Bioib Rica Sa; Bioiberica SA
Current assignee: Bioib Rica Sa; Bioiberica SA
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2014-07-15
Anticipated expiration: 2031-09-21
Also published as: ES2403804A1

Abstract

Producto de cartílago.#La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un producto de cartílago que comprende un hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, al menos un glicosaminoglicano y al menos un factor de crecimiento. De igual modo, la presente invención se refiere al producto de cartílago obtenible a través de dicho procedimiento. Dicho producto de cartílago es útil en el tratamiento o prevención de heridas, úlceras, quemaduras, la artrosis, la osteoporosis, enfermedades de los tendones y ligamentos, enfermedades periodontales, las señales de envejecimiento de la piel, los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta o las estr�as.

Description

Producto de cartílago

Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un producto de cartílago. De igual modo, la presente invención se refiere al producto de cartílago obtenible a través de dicho procedimiento, as� como a los usos del mismo.

Antecedentes de la invención

El proceso de cicatrización es un proceso complejo y dinámico que involucra la participación coordinada de distintos tipos celulares. Durante la primera fase de la cicatrización, denominada fase inflamatoria, las plaquetas, los neutr�filos, los granulocitos y los macr�fagos, por medio de la liberación de factores de crecimiento, tienen una función central en la transición entre la inflamación y la reparación. Los factores de crecimiento liberados por los monocitos y los macr�fagos son necesarios para la iniciación y propagación del nuevo tejido que recubrir� las heridas (A.J. Singer et al., N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999)). Durante esta fase, el tejido degenerado es eliminado, lo cual constituye un pre-requisito para una cicatrización óptima. La segunda fase de la cicatrización de las heridas, denominada la fase regenerativa, se caracteriza por la proliferaci�n celular y la síntesis de matriz extracelular. En este estado del proceso de cicatrización, se forma un tejido altamente vascularizado y varios tipos celulares, incluyendo macr�fagos, fibroblastos, angioblastos y miofibroblastos se desplazan al lugar de la lesión. Los macr�fagos proporcionan una fuente continua de factores de crecimiento, los fibroblastos proliferan y sintetizan una nueva matriz extracelular, lo cual conduce a la rápida formación del tejido de granulación, las células endoteliales generan un proceso de angiog�nesis

o de formación de nuevos vasos, que es estimulada por factores de crecimiento (VEGF y FGF) liberados por los macr�fagos, pero también por los fibroblastos. Además de los factores angiog�nicos, es también necesaria la presencia de una matriz extracelular adecuada formada por fibronectina, y la presencia de receptores endoteliales que reconozcan esta matriz extracelular. Durante la última fase del proceso, denominada fase reparativa, los fenómenos celulares principales son la producción de nuevo tejido conjuntivo formado por los fibroblastos principalmente y la proliferaci�n y migración de los queratinocitos que conduce a la reepitelizaci�n de la herida.

Tan pronto como los fibroblastos sintetizan las fibras de col�geno de la nueva matriz extracelular, su actividad mit�tica se reduce, al igual que la densidad celular y la vascularizaci�n del tejido. Tanto la deposición de col�geno como la orientación de los fibroblastos, est� determinada por la fibronectina, la cual constituye la más importante proteína de la matriz extracelular en esta fase del proceso (D. Greiling et al., J. Cell. Sci. 110, 861-870 (1997)). La reepitelizaci�n fisiológica es iniciada por varios estímulos: factores de crecimiento; la ausencia de células vecinas en los márgenes de la herida, lo que dispara tanto la proliferaci�n como la migración de las células epid�rmicas; la pérdida de contacto de las células epid�rmicas con la membrana basal, y el establecimiento de nuevas interacciones entre las células con los componentes de la matriz d�rmica; la producción y liberación de colagenasa o MMP1 por las células epid�rmicas y la activación de plasmina por el plasmin�geno, el cual a su vez activa la colagenasa (Fini et al., Am. J. Pathol. 149, 1287-1302 (1996)).

Hay dos tipos de envejecimiento de la piel, el envejecimiento intrínseco o cronol�gico y el envejecimiento extrínseco, ligado mayoritariamente a las exposiciones solares (L. Ritti� et al., Ageing Res. Rev. 1, 705-720 (2002)).

El envejecimiento intrínseco, también conocido como el proceso natural de envejecimiento, es un proceso continuo que suele empezar a partir de los 25 años.

Al proceso cronol�gico, se añade, para las mujeres, un envejecimiento debido a la disminución de la producción de estr�genos en la menopausia.

La firmeza, elasticidad e hidratación de la piel son consecuencias fundamentalmente de la matriz extracelular de la dermis que es secretada por los elementos celulares de la misma, los fibroblastos, y que consiste principalmente en col�geno de tipo I y III mayoritariamente, responsables de su firmeza y estructuración, la elastina, la cual confiere las propiedades elásticas de la misma, y el ácido hialur�nico, principal glicosaminoglicano necesario para el mantenimiento de los niveles de hidratación. La densidad de la piel es consecuencia tanto de los elementos extracelulares como de los celulares. A mayor densidad de la piel, mayor número de células y mayor cantidad de elementos de la matriz extracelular (G. Jenkins, Mech. of Ageing Dev. 123, 801-810 (2002)).

Una composición cosm�tica anti-envejecimiento o anti-edad de la piel es aquella que por una parte es vigorizante, reestructurante e hidratante, y por la otra reduce los efectos que la edad provoca en la piel, modificando su aspecto tanto en la textura como en la rugosidad.

Una importante acción anti-envejecimiento se consigue cuando las células de la piel responden a la composición cosm�tica prolongando su ciclo vital, retrasando la manifestación de los síntomas de vejez celular, como son la limitación del crecimiento, la producción de proteínas extracelulares, el aumento de tamaño o la queratinizaci�n.

Otra propiedad crucial de un producto anti-envejecimiento es que sea capaz de disminuir los signos de la edad cuando ya est�n presentes en la piel.

As� pues, los fibroblastos est�n involucrados tanto en la acción antienvejecimiento de la piel, al ser responsables de la producción de col�geno, elastina y ácido hialur�nico, tres elementos fundamentales para mantener la piel joven, como en el proceso de cicatrización de una herida.

Las metaloproteasas son enzimas proteol�ticas que se encargan de la remodelación de la matriz extracelular y, en su conjunto, pueden degradar todos los constituyentes de ésta. Por su funcionalidad y según el sustrato que son capaces de degradar, se pueden agrupar en subfamilias.

Las metaloproteasas intervienen en la mayoría de procesos fisiológicos que requieren la remodelación de la matriz extracelular y tienen un papel bien definido en procesos celulares diversos como la proliferaci�n, migración y la apoptosis. Además de esta función reparadora y de remodelación (reabsorci�n ósea, recambio endometrial, etc.) la presencia de niveles elevados de algunas metaloproteasas se ha asociado a la destrucción celular en una amplia variedad de procesos patológicos y del envejecimiento (K.C.N. Chang et al., Mol. Endocrinol. 22(11), 2407-2419 (2008); G.J. Fisher et al., Am. J. Pathol. 174(1), 101-114 (2009)).

El cartílago es un tipo de tejido conectivo flexible que reviste las articulaciones y da estructura a la nariz, los oídos, la laringe, la tráquea y otras partes del cuerpo. Es un tejido que no posee vasos sanguíneos, nervios, ni vasos linfáticos. Los peces cartilaginosos, también llamados elasmobranquios, tales como los tiburones y las rayas, tienen un esqueleto de cartílago.

Se han descrito tres tipos de tejido cartilaginoso, el cartílago hialino, el fibroso y el elástico. El cartílago hialino es el más importante del cuerpo, encontrándose en la nariz, la laringe, la tráquea, los bronquios, los arcos costales y los extremos articulares de los huesos.

El cartílago est� constituido por 70%-80% de agua. Las principales sustancias que forman adicionalmente el cartílago son: los condrocitos, el col�geno, los proteoglicanos y el ácido hialur�nico. Los proteoglicanos contienen, mayoritariamente, sulfato de condroitina y sulfato de queratano (D.W. Fawcett, 1995, Tratado de Histología, Ed. Interamericana McGraw-Hill, 12� Edición, Madrid; D.W. Fawcett, 1986, Textbook of Histology, Ed. Chapman and Hall, 12th Edition, New York, London; T. Aigner et al., Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1569-1593 (2003)).

El col�geno es una proteína estructural compleja. Existen varios tipos de col�geno. En el cartílago, el col�geno más abundante es el de tipo II. Todos los col�genos est�n formados por tres cadenas polipept�dicas, las cuales se enrollan y se fijan mediante enlaces transversales para formar una triple hélice.

Los glicosaminoglicanos (GAG) son biomol�culas polim�ricas de elevado peso molecular que consisten en una estructura dim�rica repetida. Se encuentran fundamentalmente en los organismos vivos, donde desarrollan diferentes funciones fisiológicas. El glicosaminoglicano mayoritario en el cartílago es el sulfato de condroitina que tiene una estructura polim�rica caracterizada por un disac�rido que se repite, constituido por N-acetil-D-galactosamina y ácido D-glucur�nico. La mayoría de los residuos de N-acetil-D-galactosamina est�n sulfatados. El sulfato de condroitina es un componente fundamental de los proteoglicanos del cartílago.

Otro glicosaminoglicano que se encuentra en el cartílago es el ácido hialur�nico. Es un glicosaminoglicano no sulfatado, con una estructura polim�rica caracterizada por un disac�rido que se repite, constituido por los monosac�ridos N-acetilD-glucosamina y ácido D-glucur�nico.

Los factores de crecimiento son sustancias, la mayoría de naturaleza proteica, que desempeñan una importante función en la comunicación intercelular. Son capaces de estimular el crecimiento y diferenciación celular, regulando de esta manera una gran variedad de procesos celulares. En los líquidos corporales desempeñan su función a muy baja concentración, del orden de los picogramos.

Se han descrito efectos secundarios importantes en relación a la administración de factores de crecimiento exígenos. Por ejemplo, se ha descrito un incremento de riesgo de morir de cáncer en pacientes tratados con más de tres tubos de becaplermina (cada tubo de 15 g contiene 0,01% de becaplermina), que es un factor de crecimiento PDGF-BB recombinante, que se utiliza en el tratamiento de úlceras diab�ticas neurop�ticas (N. Papanas et al., Drug Saf. 33(6), 455-461 (2010)).

Se ha descrito la utilización de preparaciones de col�geno para la liberación controlada de sustancias activas en una herida (US 6,761,908).

EP 154447 describe una composición para la curación de heridas que consiste en una suspensión acuosa de col�geno y un glicosaminoglicano. Mientras que las composiciones col�geno-heparina y col�geno-alginato presentan buena actividad, el inventor resalta que las preparaciones col�geno-sulfato de condroitina y col�geno-hialuronato son menos útiles en el tratamiento de heridas.

En la bibliografía encontramos descritos algunos procedimientos de obtención de preparados de cartílago, pero que difieren del procedimiento empleado en la presente invención y, por lo tanto, dan lugar a productos de cartílago también diferentes:

En US 5,503,990 se describe un procedimiento para preparar un cartílago de tráquea bovina finamente dividido, con un tamaño uniforme. En este procedimiento se utiliza el tratamiento enzim�tico para eliminar la proteína no deseada. El cartílago que se obtiene es poco soluble en agua.

En US 3,400,199 se describe un procedimiento de preparación de un polvo de cartílago para tratar heridas, con un tamaño de partícula inferior a 40 micras y con un tamaño medio de partícula comprendido entre 5 y 10 micras. En este procedimiento se utiliza un tratamiento enzim�tico con ácido-pepsina durante sólo seis horas, con el objetivo de eliminar el tejido adherido al cartílago. El polvo de cartílago que se obtiene es poco soluble en agua.

A la vista de lo anterior, es de gran interés encontrar un procedimiento de preparación de un nuevo producto de cartílago que contenga factores de crecimiento de origen natural, que sea soluble en agua y que pueda ser útil tanto en el tratamiento de heridas como en el tratamiento o prevención de las señales de envejecimiento de la piel.

Explicaci�n de la invención

Los presentes inventores han encontrado que, sorprendentemente, el procedimiento de la presente invención permite obtener un producto de cartílago que contiene factores de crecimiento de origen natural, que es soluble en agua, que est� libre de solventes orgánicos, que no contiene sodio inorgánico añadido y que contiene una elevada cantidad de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0% y de sulfato de condroitina.

Adem�s, el producto de cartílago presenta un importante efecto inductor de la proliferaci�n de fibroblastos d�rmicos humanos, un efecto inductor de la migración de fibroblastos d�rmicos humanos, un efecto inductor de la producción de ácido hialur�nico en fibroblastos d�rmicos humanos, lo cual se traduce en una acción hidratante, un efecto inductor de la elasticidad y un efecto inhibidor de la actividad metaloproteasa 1. Además, el producto de cartílago no presenta toxicidad celular y es estable. Por ello, el producto de cartílago de la presente invención puede ser utilizado en el tratamiento de heridas y/o úlceras y para tratar, retardar o prevenir las señales de envejecimiento de la piel.

As� pues, la presente invención describe un procedimiento para preparar un producto de cartílago que comprende las siguientes etapas: a) picar el cartílago; b) mezclar el cartílago picado y agua; c) calentar la mezcla de la etapa b) a una temperatura inferior a 60 �C; d) añadir una solución acuosa de H3PO4 para ajustar el pH de la mezcla de la etapa c) a un valor comprendido entre 1,5 y 4,5; e) tratar la mezcla ácida de la etapa d) con una cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) comprendida entre 0,6% y 4,6%, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 30 horas, de modo que se obtiene una solución; f) neutralizar la solución de la etapa e) con Ca(OH)2, y g) filtrar la solución de la etapa f) que contiene sales insolubles, de modo que se obtiene una solución acuosa del producto de cartílago, en el que el producto de cartílago comprende un hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, al menos un glicosaminoglicano y al menos un factor de crecimiento.

Preferentemente, el grado de hidrólisis es 1,7%.

En una realización preferida, el procedimiento comprende una etapa adicional después de la etapa g), en la cual se obtiene un producto de cartílago sólido a partir de la solución acuosa de la etapa g). Preferentemente, el producto de cartílago sólido se obtiene por atomizaci�n.

En otra realización igualmente preferida, en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) est� comprendida entre 0,6% y 1,0%, en la etapa d) el valor del pH est� comprendido entre 3,0 y 3,5 y en la etapa c) la temperatura est� comprendida entre 45 �C y 55 �C. Preferentemente, en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) est� comprendida entre 0,7% y 0,8%, en la etapa e) el periodo de tiempo est� comprendido entre 20 y 28 horas y en la etapa c) la temperatura es 50 �C. Más preferentemente, en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) es 0,75% y el tiempo es 24 horas.

En otra realización igualmente preferida, la etapa f) de neutralización se lleva a cabo después de (i) calentar la solución de la etapa e) durante una hora a una temperatura comprendida entre 75 �C y 90 �C, como por ejemplo de 80 �C; (ii) filtrar, y (iii) decolorar.

La decoloración se puede llevar a cabo con carbón activo, a una temperatura de, por ejemplo 50 �C, y durante un tiempo de, por ejemplo, 30 minutos.

En otra realización igualmente preferida, el procedimiento comprende una etapa adicional antes de la etapa a), en la cual el cartílago se somete a una limpieza mecánica para eliminar grasa y tejidos no cartilaginosos.

En otra realización igualmente preferida, en la etapa e) la pepsina se agrega de modo fraccionado, con ajustes del pH. Por ejemplo, la cantidad total de pepsina se puede dividir en dos o tres fracciones, y el pH se puede comprobar y, si es necesario, ajustar cada hora o cada 30 minutos.

Preferentemente, la pepsina tiene una actividad 1:3000 FCC, siendo FCC la abreviatura de “Food Chemical Codex”. Por ejemplo, se puede emplear la pepsina de Biocatalysts, 1:3000 MDP.

En otra realización igualmente preferida, el producto de cartílago además comprende al menos una proteína de la familia de las serpinas.

En la presente invención, el término “picar el cartílago” se refiere a reducir el tamaño de las piezas de cartílago hasta, por ejemplo, un tamaño comprendido entre 2 mm y 30 mm.

Preferentemente, el cartílago es cartílago de tráquea de mamífero, de esternón de ave o de pez elasmobranquio. La tráquea de mamífero se selecciona entre tráquea porcina, bovina o de camello. Más preferentemente, el cartílago es cartílago de tráquea porcina.

En otra realización igualmente preferida, el glicosaminoglicano se selecciona de entre el grupo que consiste en sulfato de condroitina, ácido hialur�nico, sulfato de queratano y mezclas de los mismos, y el factor de crecimiento se selecciona de entre el grupo que consiste en TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB y mezclas de los mismos.

El sulfato de condroitina tiene una estructura polim�rica caracterizada por un disac�rido que se repite, constituido por N-acetil-D-galactosamina y ácido Dglucur�nico. El sulfato de condroitina que procede del tejido cartilaginoso se encuentra principalmente en dos formas isom�ricas, que difieren en la posición del grupo sulfato presente en el residuo de N-acetilgalactosamina, el 4-sulfato de condroitina (sulfato de condroitina A) y el 6-sulfato de condroitina (sulfato de condroitina C).

El ácido hialur�nico es un glicosaminoglicano no sulfatado, de peso molecular comprendido entre 100.000 daltons y 3.000.000 daltons. Su estructura polim�rica se caracteriza por un disac�rido que se repite, constituido por N-acetil-Dglucosamina y ácido D-glucur�nico.

El sulfato de queratano que procede del tejido cartilaginoso tiene una estructura polim�rica caracterizada por un disac�rido repetitivo, constituido por Dgalactosa y N-acetil-D-glucosamina. Los grupos sulfato est�n incorporados principalmente en las posiciones C6 de los residuos de N-acetil-D-glucosamina y/o en las posiciones C6 de los residuos de D-galactosa.

Adem�s de los factores de crecimiento TGF-β1, TGF-β3 y/o PDGF-BB, el producto de cartílago puede contener otros factores de crecimiento tales como IGF, TGF-α, bFGF, FGF, BMP, VEGF o EGF.

Los factores de crecimiento est�n presentes en el producto de cartílago de la presente invención a muy baja concentración, del orden de picogramos por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro.

Para la determinación de los factores de crecimiento del producto de cartílago de la presente invención, se pueden utilizar kits de ELISA (R&D Systems), siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante.

En una realización particularmente preferida, el producto de cartílago comprende:

a) entre 67% y 87% en peso de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; b) entre 15% y 25% en peso de sulfato de condroitina, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; c) entre 0,1% y 1,0% en peso de ácido hialur�nico, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; d) entre 20 pg y 200 pg de TGF-β1 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; e) entre 20 pg y 200 pg de TGF-β3 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro, y f) entre 20 pg y 200 pg de PDGF-BB por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro.

Por ejemplo, el producto de cartílago comprende: a) 77% en peso de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; b) 19,7% en peso de sulfato de condroitina, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; c) 0,3% en peso de ácido hialur�nico, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; d) 53,0 pg de TGF-β1 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; e) 31,3 pg de TGF-β3 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro, y f) 50,9 pg de PDGF-BB por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro.

El hidrolizado de proteína est� constituido mayoritariamente por hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%.

En otra realización particularmente preferida, el producto de cartílago comprende entre 45% y 65% en peso de hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro. Por ejemplo, el producto de cartílago comprende 54,9% en peso de hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro. Preferentemente, el col�geno hidrolizado presenta un grado de hidrólisis de, por ejemplo, 0,1%, 0,2%, 1,0% � 2,0%. También preferentemente, el hidrolizado de col�geno es hidrolizado de col�geno tipo II.

La presente invención también se refiere a un producto de cartílago obtenible por el procedimiento definido anteriormente.

La presente invención también se refiere a un complemento alimenticio que comprende el producto de cartílago definido anteriormente, y al menos un excipiente nutricional. Igualmente, la presente invención se refiere a un alimento funcional que comprende el producto de cartílago definido anteriormente, y al menos un excipiente nutricional.

La presente invención también se refiere a una composición cosm�tica que comprende el producto de cartílago, definido anteriormente, y al menos un excipiente cosm�ticamente aceptable.

Igualmente, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el producto de cartílago, definido anteriormente, y al menos un excipiente farmac�uticamente aceptable.

La presente invención también se refiere a un producto de cartílago, definido anteriormente, para su uso como medicamento.

Igualmente, la presente invención también se refiere a un producto de cartílago, definido anteriormente, para su uso en el tratamiento o prevención de una herida, de una úlcera, de una quemadura, de la artrosis, de la osteoporosis, de una enfermedad o lesión de un tendón, de una enfermedad o lesión de un ligamento, de una enfermedad periodontal, de las señales de envejecimiento de la piel o de una afección muscular.

Preferentemente, la afección muscular se selecciona entre agujetas, desgarro muscular, desgaste muscular, debilidad muscular o fatiga muscular.

La presente invención también se refiere al uso de un producto de cartílago, definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento

o prevención de una herida, de una úlcera, de una quemadura, de la artrosis, de la osteoporosis, de una enfermedad o lesión de un tendón, de una enfermedad o lesión de un ligamento, de una enfermedad periodontal o de una afección muscular, más preferentemente, de una herida, de una úlcera, de la artrosis o de la osteoporosis.

La presente invención también se refiere al uso de una composición cosm�tica, definida anteriormente, para tratar, retardar o prevenir las señales de envejecimiento de la piel, los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta o las estr�as.

La presente invención también se refiere al uso de un complemento alimenticio o de un alimento funcional en la prevención y/o reversión de una herida, de una úlcera, de una quemadura, de la artrosis, de la osteoporosis, de una lesión de un tendón, de una lesión de un ligamento, de una afección periodontal, de las señales de envejecimiento de la piel o de una afección muscular.

Debido a que el procedimiento de preparación del producto de cartílago incluye una digestión enzim�tica, y la materia prima es de origen animal, las características analíticas del producto de cartílago obtenido pueden variar ligeramente dependiendo del lote de producción.

La proteína contenida en el producto de cartílago de la presente invención presenta un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, como por ejemplo 1,7%. En procedimientos descritos en la bibliografía, se obtienen productos de cartílago con grados de hidrólisis de proteína inferiores a los de la presente invención o bien muy superiores.

El grado de hidrólisis de la proteína se puede determinar mediante un método estándar, expresándose como el porcentaje de amino�cidos libres con relación a los amino�cidos totales.

El grado de hidrólisis del hidrolizado de col�geno se puede determinar mediante un método estándar, expresándose como el porcentaje de hidroxiprolina libre con relación con la hidroxiprolina total.

En los procedimientos de preparación de productos de cartílago descritos en la bibliografía, es usual incluir una etapa en la cual el producto se trata con un solvente orgánico, tal como acetona o hexano, para eliminar la grasa (ver US 3,400,199 y US 5,503,990),

El procedimiento de la invención presenta la ventaja de no utilizar solventes orgánicos, lo cual permite obtener un producto de cartílago sin trazas de dichos solventes.

En los procedimientos de la bibliografía en los que se obtiene un producto de cartílago parcialmente soluble en agua, durante el procedimiento de lavado se pierde una parte de hidrolizado de proteína y de glicosaminoglicanos.

En el procedimiento de la presente invención, las condiciones de digestión enzim�tica de la etapa e), permiten, por un lado, obtener un producto de cartílago con factores de crecimiento, y por otro lado, obtener una solución acuosa del producto de cartílago, evitando que se produzcan pérdidas de hidrolizado de proteína, de glicosaminoglicanos y de factores de crecimiento.

Los presentes inventores han encontrado que las siguientes variables: tipo de enzima, concentración de enzima, temperatura, valor de pH, tiempo de digestión enzim�tica, tipo de solvente, tipo de ácido y tipo de base, son clave para la obtención de un determinado producto de cartílago.

En la presente invención se ha encontrado que utilizando pepsina para la digestión enzim�tica, en una cantidad en peso, respecto al peso de cartílago inicial, comprendida entre 0,6% y 4,6%, durante un tiempo comprendido entre 10 y 30 horas, a una temperatura inferior a 60 �C, y a un pH comprendido entre 1,5 y 4,5, y empleando en el procedimiento H3PO4 como ácido, Ca(OH)2 como base y agua como solvente, se obtiene un nuevo producto de cartílago que presenta las siguientes ventajas: (i) contiene factores de crecimiento de origen natural, (ii) es totalmente soluble en agua, (iii) est� libre de solventes orgánicos, (iv) no contiene sodio inorgánico añadido, (v) contiene una elevada cantidad de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, (vi) contiene una elevada cantidad de sulfato de condroitina, (vii) no es tóxico, (viii) induce la proliferaci�n de fibroblastos d�rmicos humanos, (ix) induce la migración de fibroblastos d�rmicos humanos, (x) induce la producción de ácido hialur�nico en fibroblastos d�rmicos humanos, lo cual se traduce en una acción hidratante, (xi) induce la producción de elastina y (xii) presenta un efecto inhibidor de la actividad metaloproteasa 1.

Adem�s, el producto de cartílago de la presente invención no contiene col�geno nativo.

Los inventores de la presente invención han encontrado que cuando cambian las condiciones del procedimiento de preparación, el producto de cartílago que se obtiene es distinto del obtenido según el procedimiento de la presente invención. As�, cuando se utiliza 0,35% de pepsina y se lleva a cabo la digestión durante sólo seis horas, se obtiene un producto de cartílago en el que no se detectan amino�cidos libres. Por otro lado, cuando se sigue el mismo procedimiento de la presente invención, pero se emplea 10% de pepsina, el producto de cartílago que se obtiene presenta un mayor grado de hidrólisis de la proteína, más en concreto un 5,2%, en lugar del grado de hidrólisis de entre 0,5% y 3,0% que presenta el producto de cartílago de la presente invención.

En la presente invención se han utilizado las siguientes abreviaturas para los factores de crecimiento: TGF-β1, para el factor de crecimiento transformante beta 1 (Transforming Growth Factor β1). TGF-β3, para el factor de crecimiento transformante beta 3 (Transforming Growth Factor β3). PDGF-BB, para el factor de crecimiento derivado de plaquetas tipo BB (Platelet-Derived Growth Factor BB). IGF, para el factor de crecimiento insul�nico (Insulin Growth Factor). TGF-α, para el factor de crecimiento transformante alfa (Transforming Growth Factor α). bFGF, para el factor de crecimiento de fibroblastos básicos (Basic fibroblast growth factor). FGF, para el factor de crecimiento de fibroblastos (Fibroblast Growth Factor). BMP, para la proteína morfog�nica de hueso (Bone Morphogenetic Protein). VEGF, para el factor de crecimiento endotelial vascular (Vascular Endothelial Growth Factor). EGF, para el factor de crecimiento epid�rmico (Epidermal Growth Factor).

En la presente invención, cuando se habla de señales de envejecimiento de la piel se hace referencia, principalmente, a las arrugas, las líneas de expresión, la flacidez, la sequedad de la piel y la falta de vitalidad.

Para utilizar el producto de cartílago de la presente invención en el tratamiento o prevención de una herida, de una úlcera, de una quemadura, de la artrosis, de la osteoporosis, de una enfermedad o lesión de un tendón, de una enfermedad o lesión de un ligamento, de una enfermedad periodontal, de las señales de envejecimiento de la piel o de una afección muscular, se formula en composiciones farmacéuticas adecuadas, recurriendo a técnicas y excipientes o vehículos convencionales, como los descritos en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 2000, edited by Lippincott Williams and Wilkins, 20th edition, Philadelphia. Las composiciones farmacéuticas comprenden el producto de cartílago y al menos un excipiente farmac�uticamente aceptable para la administración al paciente. Dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al paciente en dosis requeridas. La administración de las composiciones farmacéuticas puede efectuarse por diferentes vías, por ejemplo, típica, oral, intravenosa, intralesional, perilesional, intratendinosa, peritendinosa, subcutánea, intramuscular, sublingual, transd�rmica o intranasal. Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz del producto de cartílago, dependiendo dicha cantidad de muchos factores, como por ejemplo, el estado físico del paciente, edad, sexo, vía de administración, frecuencia de administración o gravedad de la enfermedad. Además, se entender� que dicha dosificación de producto de cartílago puede administrarse en unidades de dosis única o múltiple para proporcionar los efectos terapéuticos deseados.

Las preparaciones farmacéuticas de la invención generalmente estarán en forma sólida, líquida o como gel. Entre las preparaciones farmacéuticas en forma sólida que pueden prepararse de acuerdo con la presente invención se incluyen polvos, minigr�nulos (pellets), microesferas, nanopart�culas, comprimidos, gránulos dispersables, cápsulas, sellos y supositorios. Entre las preparaciones en forma líquida se incluyen soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires. Se contemplan también las preparaciones de formas sólidas que se desean convertir, inmediatamente antes de ser utilizadas, en preparaciones en forma líquida. Dichas formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones.

Preferentemente, las preparaciones farmacéuticas para el tratamiento de heridas o úlceras por vía típica estarán en forma de gel, polvos o en cualquier forma que presente una alta viscosidad para retener la composición farmacéutica en la herida. Una vez depositada la composición farmacéutica en la herida, ésta puede taparse con una gasa estéril y/o un vendaje. También se pueden preparar apósitos

o parches que contengan el producto de cartílago y un soporte sólido.

Para preparar tanto un complemento alimenticio como un alimento funcional, el producto de cartílago se formula con componentes y/o excipientes adecuados empleados en nutrición. El complemento alimenticio puede estar en forma de comprimidos, cápsulas, soluciones, suspensiones o sobres. El alimento funcional puede estar en forma de yogures, leche, leche fermentada, jugos de frutas, jugos de vegetales, sopas, alimentos deshidratados, galletas o alimentos infantiles.

Cuando se utiliza el producto de cartílago de la presente invención para tratar, retardar o prevenir las señales de envejecimiento de la piel, las estr�as o los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta o de la polución, se formula en composiciones cosm�ticas adecuadas, recurriendo a técnicas y a excipientes o vehículos de uso conocido en cosm�tica y dermatología. La composición cosm�tica puede contener además del producto de cartílago de la presente invención, cualquier extracto vegetal, por ejemplo, y sin ser limitativo, extracto de algas, de romero o de frutas, y uno o varios excipientes y aditivos de uso conocido en las composiciones cosm�ticas y dermatol�gicas, tales como, por ejemplo, y sin ser limitativo, perfumes, suavizantes, colorantes, tensioactivos, vitaminas, conservantes, emulsionantes, emolientes, aceites, filtros UV, glicoles, etc… Las composiciones cosm�ticas de la presente invención se pueden presentar bajo cualquier forma conocida por un experto en cosm�tica y dermatología, por ejemplo, en forma de crema, aceite, emulsión, microemulsi�n, pomada, gel, espuma, pasta, loción, cataplasma, spray o leche. Dichas composiciones cosm�ticas se pueden aplicar sobre el rostro, cuerpo o cabello.

Breve descripción de las Figuras

En la Figura 1 se representa a tres concentraciones (50 μg/ml, 500 μg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre el porcentaje de proliferaci�n de fibroblastos d�rmicos humanos a 48 horas. También se incluyen el Control Positivo (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio 10% FCS, en ausencia del producto de cartílago y en presencia de bromodeoxiuridina) y el Control Basal (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago).

En la Figura 2 se representa a tres concentraciones (250 μg/ml, 500 μg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre el porcentaje de migración de fibroblastos d�rmicos humanos a las 48 horas. También se incluyen el Control Basal (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago) y dos Controles Positivos (un cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo al 10% FCS y en ausencia del producto de cartílago y un cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en ausencia del producto de cartílago y en presencia de EGF).

En la Figura 3 se representa a tres concentraciones (250 μg/ml, 500 μg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre el porcentaje de síntesis de elastina en un cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos a las 72 horas de exposición. También se incluyen el Control Basal (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago) y el Control Positivo (culti

vo de fibroblastos d�rmicos humanos en ausencia del producto de cartílago y en presencia de TGF-β).

En la Figura 4 se representa a tres concentraciones (250 μg/ml, 500 μg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre la actividad de la metaloproteasa 1 (MMP-1) en un cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos estimulados con IL-1β. También se incluyen el Control Basal (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago y de IL-1β), el Control estimulado con IL-1β y el Control Positivo de inhibición (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en ausencia del producto de cartílago y en presencia de IL-1β yde dexametasona).

Descripci�n detallada de las realizaciones preferidas Ejemplos

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no representan una limitación del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1: Preparación de un producto de cartílago de tráquea porcina de la invención

Piezas de tráquea porcina se sometieron a una limpieza mecánica para eliminar grasa y tejidos no cartilaginosos y a continuación se picaron. En un reactor se introdujeron 3.100 ml de agua desionizada. Se añadieron 1.575 g de cartílago de tráquea porcina picado. La mezcla se calentó a 50 �C y se ajust� el pH entre 3,0 y 3,5 con H3PO4. Una vez ajustado el pH, se añadieron 5,9 g de pepsina (Biocatalysts, 1:3000 MDP) y se mantuvo la temperatura a 50 �C. Se comprob� el pH cada 30 minutos, las tres horas siguientes, y se ajust� en caso que fuese necesario. A las diez horas del inicio de la digestión se volvieron a añadir 5,9 g de pepsina (Biocatalysts, 1:3000 MDP) y se comprob� el pH cada 30 minutos, durante las tres horas siguientes. En total, la digestión se llev� a cabo durante 24 horas, empleándose en total una cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de tráquea porcina del 0,75%. Transcurridas las 24 horas, se calentó a 80 �C durante una hora. A continuación, se filtr� para clarificar el producto. Una vez filtrado, se añadieron 7,9 g de carbón activo y se calentó a 50 �C durante 30 minutos. Se neutralizó con hidróxido de calcio. A continuación, se filtr�, obteniéndose una solución acuosa de producto de cartílago. El producto final en forma sólida (polvo color crema) se obtuvo atomizando la solución acuosa de producto de cartílago.

Caracter�sticas analíticas del producto de cartílago sólido obtenido: Hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%: 77% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%: 54,9% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Amino�cidos totales: 70,7% en peso, respecto al peso del producto de cartílago; Amino�cidos libres: 1,2% en peso, respecto al peso del producto de cartílago; Hidroxiprolina total: 6,9% en peso, respecto al peso del producto de cartílago; Grado de hidrólisis de la proteína: 1,7%; Grado de hidrólisis del hidrolizado de col�geno: 0,1%; Sulfato de condroitina: 19,7% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Acido hialur�nico: 0,3% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Factor de crecimiento TGF-β1: 53,0 pg por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; Factor de crecimiento TGF-β3: 31,3 pg por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; Factor de crecimiento PDGF-BB: 50,9 pg por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; Cenizas: 8,9% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Calcio: 0,4% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro, Fosfatos: 0,3% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro.

En el 77% del hidrolizado de proteína se incluye el hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%. Las características analíticas del producto de cartílago pueden variar ligeramente dependiendo del lote del producto de cartílago obtenido.

Determinaci�n de los grados de hidrólisis:

El grado de hidrólisis de la proteína se determin� mediante un método estándar. Se expres� como el porcentaje de amino�cidos libres con relación a los amino�cidos totales.

El grado de hidrólisis del hidrolizado de col�geno se determin� mediante un método estándar. Se expres� como el porcentaje de hidroxiprolina libre con relación con la hidroxiprolina total.

Determinaci�n de los factores de crecimiento:

Para la determinación de los factores de crecimiento se utilizaron los siguientes kits de ELISA (R&D Systems), siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante: Quantikine porcine TGF-β1 (catálogo: MB100B); DuoSet Human TGF-β3 (catálogo: DY243); Quantikine Human PDGF-BB (catálogo: DBB00).

Biolog�a Ejemplo 2: Actividad estimuladora de la proliferaci�n de fibroblastos

El proceso de curación o cicatrización de heridas es un proceso muy ordenado y controlado caracterizado por distintas fases: inflamación, proliferaci�n y remodelación (R.F. Diegelmann and M.C. Evans, Front. Biosci. 9, 283-289 (2004)). El proceso de curación precisa de la coordinación de varias células, factores de crecimiento y citoquinas. La inflamación es la fase inicial. En el proceso de curación de heridas, la proliferaci�n de fibroblastos interviene en la restauración de la estructura y función en la herida (R.A. Clark, Ann. N. Y. Acad. Sci. 936, 355-367 (2001)).

La estimulaci�n del grado de proliferaci�n de fibroblastos también es interesante como tratamiento anti-edad. Con el envejecimiento se ve disminuido el número de fibroblastos d�rmicos y, por tanto, se produce una pérdida progresiva de tejido d�rmico.

Materiales y métodos

El grado de proliferaci�n se cuantific� midiendo la incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU) en el ADN de células en proliferaci�n, durante la fase de replicaci�n. Para la cuantificación de la BrdU incorporada se utilizó un inmunoensayo colorim�trico mediante un anticuerpo anti-BrdU específico, detección ELISA (Enzyme Linked Immunoadsorbent Assay) y posterior lectura de la absorbancia a 450 nm. La cantidad de BrdU detectada es proporcional al número de células que se han dividido y, por tanto, proporcional al crecimiento o proliferaci�n experimentada por el cultivo.

Los fibroblastos d�rmicos humanos fueron sembrados a 5.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y pasadas 24 horas se dejaron con medio de cultivo de deprivaci�n de factores de crecimiento durante toda la noche. Al día siguiente, las células fueron tratadas a tres concentraciones (2mg/ml, 500 μg/ml y 50 μg/ml) de un producto de cartílago de la presente invención, en concreto del producto de cartílago del Ejemplo 1. La cantidad de bromodeoxiuridina se determin� mediante inmunoensayo específico (técnica ELISA) después de 48 horas de exposición del cultivo al producto de cartílago.

Como Control Basal se utilizó un cultivo de fibroblastos con medio de cultivo y como Control Positivo, los fibroblastos fueron expuestos a medio de cultivo 10% FCS (Fetal Calf Serum).

Resultados

Como se puede observar en la Figura 1, el producto de cartílago a las dosis de 500 μg/ml y 2 mg/ml mostr� un efecto estimulatorio estadísticamente significativo (p<0,05) de la proliferaci�n de fibroblastos, si lo comparamos con el Control Basal. Concretamente, a la dosis intermedia se increment� la proliferaci�n en un 35,9% y a la dosis alta un 73%.

Ejemplo 3: Valoración de la capacidad migratoria celular in vitro

Este estudio permite la evaluación de la capacidad de inducción de la migración celular en cultivo primario de fibroblastos d�rmicos humanos y, por tanto, es útil para evaluar la potencial eficacia de un producto en la curación de heridas y como tratamiento anti-edad. De hecho con el envejecimiento se produce una disminución del grado de proliferaci�n y migración de los fibroblastos.

Materiales y métodos

Para evaluar el potencial efecto de un producto de cartílago de la presente invención sobre la migración celular se utilizó el sistema Oris™ Cell Migration assay de Platypus. Este sistema consiste en una placa especial que permite la siembra de los fibroblastos y su crecimiento en monocapa, pero dejando un área central del pocillo libre de células gracias a los denominados Oris™ Cell Seeding Stoppers que restringen la siembra a la región anular exterior del pocillo. Posteriormente se retiran los Oris™ Cell Seeding Stoppers y esta área es ocupada posteriormente por las células durante el proceso de migración.

Los fibroblastos d�rmicos humanos fueron incubados 48 horas en presencia de un producto de cartílago de la presente invención, concretamente del producto de cartílago del Ejemplo 1 (2 mg/ml y 500 μg/ml) y a continuación se marcaron con el marcador fluorescente calce�na. La fluorescencia emitida por las células en migración se midió mediante un fluor�metro. También se tomaron fotografías por microscop�a de fluorescencia que permitieron ver el área ocupada en comparación con el Control Basal.

Como Control Basal se utilizó medio de cultivo y como Controles Positivos se incluyeron medio de cultivo al 10% en FCS (Fetal Calf Serum) y también medio de cultivo con EGF 5 ng (Epidermal Growth Factor).

Resultados

Como se puede observar en la Figura 2, el producto de cartílago produjo un importante efecto inductor de la migración celular a las 48 h de exposición para las concentraciones de 500 μg/ml y 2 mg/ml (42% y 75% de inducción, respectivamente). Además debe destacarse que el efecto de dicho producto super� al mostrado por los controles positivos (medio al 10% FCS y EGF a 5 ng/ml).

Ejemplo 4: Valoración de la acción hidratante

El ácido hialur�nico es un componente esencial de las pieles sanas y est� involucrado en la hemostasis, la hidratación y los procesos de reparación. Gracias a su capacidad de retener el agua en un porcentaje equivalente a miles de veces, desarrolla una función primordial en la piel. La piel joven es rica en ácido hialur�nico, sin embargo a medida que envejecemos, la distribución y función del ácido hialur�nico en la piel van cambiando y aparecen los signos característicos del envejecimiento como arrugas y líneas de expresión.

Materiales y métodos

Para evaluar la eficacia inductora de la hidratación de la piel por un producto de cartílago de la presente invención, en concreto por el producto de cartílago del Ejemplo 1, se llev� a cabo un estudio para la cuantificación de glicosaminoglicanos, principalmente ácido hialur�nico sintetizado por los fibroblastos d�rmicos humanos tras la incubaci�n con el producto de cartílago (2mg/ml, 500 μg/ml y 250 μg/ml) durante 24 horas. Para ello se utilizó el método de incorporación de 3H-glucosamina en los glicosaminoglicanos de nueva síntesis.

La radioactividad unida se analizó en un contador de centelleo líquido. Los valores de CPMs (cuentas por minuto) obtenidos son proporcionales a la cantidad de ácido hialur�nico sintetizado en un 90%.

Como Control Positivo los fibroblastos se expusieron a TGF-β1 (Transforming growth factor beta 1), conocido como inductor de la producción de proteína de la matriz extracelular. El Control Basal consistió únicamente en fibroblastos en medio de cultivo.

Resultados

El producto de cartílago mostr� un leve efecto hidratante a las 24 horas de exposición a la concentración de 500 μg/ml. Concretamente, estimul� la síntesis de ácido hialur�nico en un 12% si se compara con el Control Basal.

Ejemplo 5: Valoración de la capacidad inductora de la producción de elastina

En la piel humana, el envejecimiento intrínseco est� caracterizado por atrofia de la dermis debida a la pérdida de col�geno, a la degeneración de la malla de fibras de elastina y a la pérdida de hidratación. La elastina es la proteína que confiere las propiedades elásticas a la piel.

Materiales y métodos

La capacidad inductora de la elasticidad de la piel por parte de un producto de cartílago de la presente invención, concretamente del producto de cartílago del Ejemplo 1, fue evaluada a partir de la cuantificación de la producción de elastina en los fibroblastos.

Los fibroblastos d�rmicos humanos fueron sembrados en placas de cultivo de 96 pocillos y se mantuvieron en crecimiento hasta llegar a confluencia. Seguidamente, se expusieron durante 72 horas a las concentraciones de 2 mg/ml, 500 μg/ml y 250 μg/ml. Finalizado este período de tratamiento, las células fueron lavadas y fijadas para su procesamiento ELISA. En este proceso se utilizó un anticuerpo primario contra la elastina (Monoclonal Anti-Elastin antibody produced in mouse, Sigma), seguido de anticuerpo secundario conjugado a la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y revelado con o-fenilendiamina (sustrato de la HRP) y urea-H2O2. La lectura de la absorbancia se realizó en lector de ELISA a 492 nm.

El valor de elastina producida fue ponderado con el de proteína total en cada condición experimental, resultando en los valores del índice de producción de elastina/proteína total.

Como Control Positivo los fibroblastos fueron expuestos a TGF-β1 (Transforming Growth Factor Beta 1). Como Control Basal los fibroblastos se cultivaron en medio de cultivo.

Resultados

Como se puede observar en la Figura 3, el producto de cartílago mostr� un importante efecto inductor de la producción de elastina a la concentración superior estudiada (2 mg/ml). Debe remarcarse que se consiguió cerca del 50% del valor mostrado por el control TGF-β, un potente inductor de la síntesis de elastina y proteínas de matriz extracelular.

Ejemplo 6: Determinación del potencial inhibidor de la actividad MMP-1

Con el envejecimiento se produce una pérdida de matriz extracelular, un aumento de las metaloproteasas (MMPs) que degradan el col�geno tipo I responsable de la firmeza de la piel, as� como también una pérdida de fibroblastos y de la red vascular. Se estima que el col�geno de la dermis disminuye un 1% por año en toda la vida adulta y a medida que aumenta la edad también se incrementan los niveles de metaloproteasas, lo que hace que aumente la pérdida de col�geno en forma progresiva.

Materiales y métodos

Para la evaluación del efecto de un producto de cartílago de la presente invención, en concreto del producto de cartílago del Ejemplo 1, sobre la regulaci�n de metaloproteasas, se determin� la actividad MMP-1 en un cultivo primario de fibroblastos d�rmicos humanos expuestos al producto de cartílago e inducidos con IL1-β durante 48 horas.

Se sembraron los fibroblastos d�rmicos humanos en placas de cultivo de 24 pocillos. Tras su llegada a confluencia y deprivaci�n con medio sin suero durante 16 horas, se aplicó el producto de cartílago (2 mg/ml, 500 μg/ml y 250 μg/ml). Tras 24 horas, se aplicó IL-1β como estimulador de la producción de MMPs y el cultivo se mantuvo 24 horas más. Al finalizar el tratamiento, el sobrenadante se recogió y se cuantific� la metaloproteasa activa mediante ensayo inmuno-fluorim�trico específico tras la activación enzim�tica con APMA (p-AminoPhenylMercuric Acetate).

Los valores de MMP-1 activa fueron ponderados por los de proteína total, previamente determinada por el método del ácido bicincon�nico, BCA (Pierce BCA Protein Assay Kit).

El Control Basal consistió en medio de cultivo. En el estudio también se incluyó un grupo Control estimulado con IL-1β. Como Control Positivo de inhibición se utilizó dexametasona a 5 μM (Control Dexa), glucocorticoide potente de acción antiinflamatoria.

Resultados

El producto de cartílago mostr� un potente efecto inhibidor (p<0,05) de la actividad metaloproteasa 1 inducida por IL-1β, en todas las dosis estudiadas y de manera dosis-dependiente, con una reducción del 61%-70% respecto al Control estimulado con IL-1β.

Claims

R E I V I N D I C A C IO N E S

1.- Un procedimiento para preparar un producto de cartílago que comprende

las siguientes etapas: a) picar el cartílago; b) mezclar el cartílago picado y agua; c) calentar la mezcla de la etapa b) a una temperatura inferior a 60 �C; d) añadir una solución acuosa de H3PO4 para ajustar el pH de la mezcla de la etapa c) a un valor comprendido entre 1,5 y 4,5; e) tratar la mezcla ácida de la etapa d) con una cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) comprendida entre 0,6% y 4,6%, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 30 horas, de modo que se obtiene una solución; f) neutralizar la solución de la etapa e) con Ca(OH)2, y g) filtrar la solución de la etapa f) que contiene sales insolubles, de modo que se obtiene una solución acuosa del producto de cartílago, en el que el producto de cartílago comprende un hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, al menos un glicosaminoglicano y al menos un factor de crecimiento.
2.- El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende una etapa adicional después de la etapa g), en la cual se obtiene un producto de cartílago sólido a partir de la solución acuosa de la etapa g).
3.- El procedimiento según la reivindicación 2, en el que se obtiene un producto de cartílago sólido por atomizaci�n.
4.- El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) est� comprendida entre 0,6% y 1,0%, en la etapa d) el valor del pH est� comprendido entre 3,0 y 3,5 y en la etapa c) la temperatura est� comprendida entre 45 �C y 55 �C.
5.- El procedimiento según la reivindicación 4, en el que en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) est� comprendida entre 0,7% y 0,8%, en la etapa e) el periodo de tiempo est� comprendido entre 20 y 28 horas y en la etapa c) la temperatura es 50 �C.
6.- El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa f) de neutralización se lleva a cabo después de (i) calentar la solución de la etapa e) durante una hora a una temperatura comprendida entre 75 �C y 90 �C; (ii) filtrar, y (iii) decolorar.
7.- El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una etapa adicional antes de la etapa a), en la cual el cartílago se somete a una limpieza mecánica para eliminar grasa y tejidos no cartilaginosos.
8.- El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cartílago es cartílago de tráquea de mamífero.
9.- El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el cartílago de tráquea de mamífero es cartílago de tráquea porcina.
10.- El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el glicosaminoglicano se selecciona de entre el grupo que consiste en sulfato de condroitina, ácido hialur�nico, sulfato de queratano y mezclas de los mismos, y el factor de crecimiento se selecciona de entre el grupo que consiste en TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB y mezclas de los mismos.
11.- Un producto de cartílago obtenible por el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12.- El producto de cartílago según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende: a) entre 67% y 87% en peso de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; b) entre 15% y 25% en peso de sulfato de condroitina, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; c) entre 0,1% y 1,0% en peso de ácido hialur�nico, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; d) entre 20 pg y 200 pg de TGF-β1 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; e) entre 20 pg y 200 pg de TGF-β3 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro, y f) entre 20 pg y 200 pg de PDGF-BB por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro.
13.

Un complemento alimenticio o un alimento funcional que comprende el producto de cartílago según la reivindicación 11 � 12, y al menos un excipiente nutricional.
14.

Una composición cosm�tica que comprende el producto de cartílago según la reivindicación 11 � 12, y al menos un excipiente cosm�ticamente aceptable.
15.- Una composición farmacéutica que comprende el producto de cartílago según la reivindicación 11 � 12, y al menos un excipiente farmac�uticamente aceptable.
16.- Un producto de cartílago según la reivindicación 11 � 12, para su uso como medicamento.
17. Uso de un producto de cartílago según la reivindicación 11 � 12, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una herida y/o de una úlcera.
18.- Uso de una composición cosm�tica según la reivindicación 14, para tratar, retardar o prevenir las señales de envejecimiento de la piel, los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta o las estr�as.

' c.0:0!Q.I 00s

300 250 200 150 100 50 0

Figura 1

Control Basal

Control Positivo 50 �g/ml 500 �g/ml Producto de cartilago 2 mg/ml

Figura 2

' V!s.Qi0i Q:Ii.0sI.c.0.Q!sI

140 120 100 80 60 40 20 0

Figura 3

Control Basal

TGF-� 10 ng/ml 250� g/ml 500� g/ml Producto de cartilago 2mg/ml

Figura 4

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.� solicitud: 201131526

ESPA�A

Fecha de presentación de la solicitud: 21.09.2011

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : A61K35/32 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categor�a

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

GB 1041172 A (BALASSA LESLIE L) 01.09.1966, ejemplo 14; reivindicaciones. 1-18

X

US 3400199 A (BALASSA LESLIE L) 03.09.1968, ejemplos 5,6; reivindicaciones. 1-18

X

WO 9716197 A1 (AETERNA LAB INC) 09.05.1997, páginas 16,69,77,87. 1-18

X

US 2007293427 A1 (VOULAND ERIC et al.) 20.12.2007, reivindicaciones. 1-18

X

WO 2007122179 A1 (DIANA NATURALS et al.) 01.11.2007, página 12; reivindicaciones. 1-18

X

US 20030091652 A1 (BIOCELL TECHNOLOGY LLC) 15.05.2003, reivindicaciones. 1-18

Categor�a de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones n�:

Fecha de realización del informe 25.01.2013

Examinador J. Manso Tomico Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

N� de solicitud: 201131526

Documentaci�n mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) A61K Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

b�squeda utilizados) INVENES, EPODOC, wpi, embase, biosis, npl

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINI�N ESCRITA

N� de solicitud: 201131526

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 25.01.2013

Declaraci�n

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones 1-18 Reivindicaciones SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-18 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

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OPINI�N ESCRITA

N� de solicitud: 201131526

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

GB 1041172 A (BALASSA LESLIE L) 01.09.1966

D02

US 3400199 A (BALASSA LESLIE L) 03.09.1968

D03

WO 9716197 A1 (AETERNA LAB INC) 09.05.1997

D04

US 2007293427 A1 (VOULAND ERIC et al.) 20.12.2007

D05

WO 2007122179 A1 (DIANA NATURALS et al.) 01.11.2007

D06

US 20030091652 A1 (BIOCELL TECHNOLOGY LLC) 15.05.2003
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La presente solicitud divulga un producto de cartílago, su procedimiento de obtención y su uso para el tratamiento o prevención de afecciones de la piel. Las reivindicaciones 1-10 caracterizan el procedimiento de obtención del producto por comprender etapas de: molienda, desproteinizaci�n e hidrólisis del cartílago. Las reivindicaciones 11-16 caracterizan el producto de cartílago obtenido por los porcentajes de los componentes del mismo. Las reivindicaciones 17 y 18 caracterizan el uso del producto de cartílago para distintas afecciones de la piel. D01 divulga la preparación de cartílago mediante un proceso de prote�lisis y molienda del mismo. As�, el producto obtenido se utiliza en la curación de heridas, entre otras de la piel. D02 divulga la obtención de un producto de cartílago a partir de tejido traqueal bovino para el tratamiento de heridas. D03 divulga un procedimiento de obtención de un extracto soluble de cartílago conteniendo componentes activos hidrosolubles presentes en el cartílago original procedente de tiburón. El producto obtenido se utiliza para el tratamiento de enfermedades de la piel. D04 a D06 caracterizan diferentes productos de cartílago según su diferente composición. Ninguno de los documentos del estado de la técnica divulga un procedimiento de obtención de cartílago idéntico al del objeto de la invención, ni un producto de cartílago con los mismos componentes y sus porcentajes al que aparece en la presente invención. As� pues, la presente solicitud cumpliría con el requisito de novedad tal y como se menciona en el art. 6 de la Ley 11/1986. Tomando D01 como el documento del estado de la técnica más cercano al objeto de la invención, la diferencia entre este documento y el objeto de la invención serían las condiciones particulares que se emplean en las etapas de molienda, desproteinizaci�n e hidrólisis, filtrado y secado para obtener un producto de cartílago. El efecto técnico producto de esa diferencia sería la obtención de un producto de cartílago apto para ser utilizado como composición funcional en el tratamiento de heridas y afecciones de la piel. Sin embargo este efecto técnico del cartílago ya es de sobra conocido en el estado de la técnica pues existen varios documentos que divulgan el uso de cartílago para la curación de heridas, en concreto cut�neas. Los efectos sanantes del cartílago, por su contenido en col�geno, acido hialur�nico y otros componentes es conocido en el estado de la técnica por lo que la provisión de distintos procedimientos de obtención de productos de cartílago se consideran alternativas de realización obvia para el experto en la materia. En ningún apartado de la presente solicitud se demuestra la mayor capacidad terapéutica o preventiva de este producto de cartílago frente a otros productos de cartílago ya existentes, ni que esa capacidad sea debida, en concreto a uno de los componentes del cartílago obtenido por el procedimiento reivindicado. Por todo lo anterior, la presente invención carece de actividad inventiva tal y como se menciona en el art. 8 de la Ley 11/1986.

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