ES2403804B1

ES2403804B1 - CARTRIDGE PRODUCT.

Info

Publication number: ES2403804B1
Application number: ES201131526A
Authority: ES
Inventors: Josep Escaich Ferrer; Pere DALMAU CASTA�ARES; Ana Mar�a TORRENT GIBERT; Ram�n RUH� ROURA; Carlos Ra�l AL�EZ VERS�N
Original assignee: Bioib Rica Sa; Bioiberica SA
Current assignee: Bioib Rica Sa; Bioiberica SA
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2014-07-15
Anticipated expiration: 2031-09-21
Also published as: ES2403804A1

Abstract

Producto de cartílago.#La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un producto de cartílago que comprende un hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, al menos un glicosaminoglicano y al menos un factor de crecimiento. De igual modo, la presente invención se refiere al producto de cartílago obtenible a través de dicho procedimiento. Dicho producto de cartílago es útil en el tratamiento o prevención de heridas, úlceras, quemaduras, la artrosis, la osteoporosis, enfermedades de los tendones y ligamentos, enfermedades periodontales, las señales de envejecimiento de la piel, los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta o las estr�as.Cartilage product. # The present invention relates to a process for preparing a cartilage product comprising a protein hydrolyzate with a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0%, at least one glycosaminoglycan and at least one growth factor. Similarly, the present invention relates to the cartilage product obtainable through said process. Said cartilage product is useful in the treatment or prevention of wounds, ulcers, burns, osteoarthritis, osteoporosis, tendon and ligament diseases, periodontal diseases, signs of skin aging, the harmful effects of exposure to ultraviolet radiation or stretch marks.

Description

Producto de cartílago Cartilage product

Technical sector of the invention

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un producto de cartílago. De igual modo, la presente invención se refiere al producto de cartílago obtenible a través de dicho procedimiento, as� como a los usos del mismo. The present invention relates to a process for preparing a cartilage product. Similarly, the present invention relates to the cartilage product obtainable through said process, as well as to the uses thereof.

Background of the invention

El proceso de cicatrización es un proceso complejo y dinámico que involucra la participación coordinada de distintos tipos celulares. Durante la primera fase de la cicatrización, denominada fase inflamatoria, las plaquetas, los neutr�filos, los granulocitos y los macr�fagos, por medio de la liberación de factores de crecimiento, tienen una función central en la transición entre la inflamación y la reparación. Los factores de crecimiento liberados por los monocitos y los macr�fagos son necesarios para la iniciación y propagación del nuevo tejido que recubrir� las heridas (A.J. Singer et al., N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999)). Durante esta fase, el tejido degenerado es eliminado, lo cual constituye un pre-requisito para una cicatrización óptima. La segunda fase de la cicatrización de las heridas, denominada la fase regenerativa, se caracteriza por la proliferaci�n celular y la síntesis de matriz extracelular. En este estado del proceso de cicatrización, se forma un tejido altamente vascularizado y varios tipos celulares, incluyendo macr�fagos, fibroblastos, angioblastos y miofibroblastos se desplazan al lugar de la lesión. Los macr�fagos proporcionan una fuente continua de factores de crecimiento, los fibroblastos proliferan y sintetizan una nueva matriz extracelular, lo cual conduce a la rápida formación del tejido de granulación, las células endoteliales generan un proceso de angiog�nesis The healing process is a complex and dynamic process that involves the coordinated participation of different cell types. During the first phase of healing, called the inflammatory phase, platelets, neutrophils, granulocytes and macrophages, through the release of growth factors, have a central role in the transition between inflammation and repair. Growth factors released by monocytes and macrophages are necessary for the initiation and propagation of the new tissue that will cover the wounds (AJ Singer et al., N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999 )). During this phase, degenerated tissue is removed, which is a prerequisite for optimal healing. The second phase of wound healing, called the regenerative phase, is characterized by cell proliferation and extracellular matrix synthesis. In this state of the healing process, highly vascularized tissue and several cell types are formed, including macrophages, fibroblasts, angioblasts and myofibroblasts move to the site of the lesion. Macrophages provide a continuous source of growth factors, fibroblasts proliferate and synthesize a new extracellular matrix, which leads to the rapid formation of granulation tissue, endothelial cells generate an angiogenesis process

o de formación de nuevos vasos, que es estimulada por factores de crecimiento (VEGF y FGF) liberados por los macr�fagos, pero también por los fibroblastos. Además de los factores angiog�nicos, es también necesaria la presencia de una matriz extracelular adecuada formada por fibronectina, y la presencia de receptores endoteliales que reconozcan esta matriz extracelular. Durante la última fase del proceso, denominada fase reparativa, los fenómenos celulares principales son la producción de nuevo tejido conjuntivo formado por los fibroblastos principalmente y la proliferaci�n y migración de los queratinocitos que conduce a la reepitelizaci�n de la herida. or of formation of new vessels, which is stimulated by growth factors (VEGF and FGF) released by macrophages, but also by fibroblasts. In addition to the angiogenic factors, the presence of a suitable extracellular matrix formed by fibronectin is also necessary, and the presence of endothelial receptors that recognize this extracellular matrix. During the last phase of the process, called the reparative phase, the main cellular phenomena are the production of new connective tissue formed mainly by fibroblasts and the proliferation and migration of keratinocytes that leads to the reepithelialization of the wound.

Tan pronto como los fibroblastos sintetizan las fibras de col�geno de la nueva matriz extracelular, su actividad mit�tica se reduce, al igual que la densidad celular y la vascularizaci�n del tejido. Tanto la deposición de col�geno como la orientación de los fibroblastos, est� determinada por la fibronectina, la cual constituye la más importante proteína de la matriz extracelular en esta fase del proceso (D. Greiling et al., J. Cell. Sci. 110, 861-870 (1997)). La reepitelizaci�n fisiológica es iniciada por varios estímulos: factores de crecimiento; la ausencia de células vecinas en los márgenes de la herida, lo que dispara tanto la proliferaci�n como la migración de las células epid�rmicas; la pérdida de contacto de las células epid�rmicas con la membrana basal, y el establecimiento de nuevas interacciones entre las células con los componentes de la matriz d�rmica; la producción y liberación de colagenasa o MMP1 por las células epid�rmicas y la activación de plasmina por el plasmin�geno, el cual a su vez activa la colagenasa (Fini et al., Am. J. Pathol. 149, 1287-1302 (1996)). As soon as the fibroblasts synthesize the collagen fibers of the new extracellular matrix, their mitotic activity is reduced, as is the cell density and vascularization of the tissue. Both collagen deposition and fibroblast orientation are determined by fibronectin, which is the most important extracellular matrix protein at this stage of the process (D. Greiling et al., J. Cell. Sci 110, 861-870 (1997)). Physiological re-epithelization is initiated by several stimuli: growth factors; the absence of neighboring cells in the margins of the wound, which triggers both proliferation and migration of epidermal cells; the loss of contact of the epidermal cells with the basement membrane, and the establishment of new interactions between the cells with the components of the dermal matrix; the production and release of collagenase or MMP1 by epidermal cells and plasmin activation by plasminogen, which in turn activates collagenase (Fini et al., Am. J. Pathol. 149, 1287-1302 (nineteen ninety six)).

Hay dos tipos de envejecimiento de la piel, el envejecimiento intrínseco o cronol�gico y el envejecimiento extrínseco, ligado mayoritariamente a las exposiciones solares (L. Ritti� et al., Ageing Res. Rev. 1, 705-720 (2002)). There are two types of skin aging, intrinsic or chronological aging and extrinsic aging, mostly linked to sun exposure (L. Ritti et al., Ageing Res. Rev. 1, 705-720 (2002)) .

El envejecimiento intrínseco, también conocido como el proceso natural de envejecimiento, es un proceso continuo que suele empezar a partir de los 25 años. Intrinsic aging, also known as the natural aging process, is a continuous process that usually begins after age 25.

Al proceso cronol�gico, se añade, para las mujeres, un envejecimiento debido a la disminución de la producción de estr�genos en la menopausia. To the chronological process, for women, aging is added due to the decrease in estrogen production in menopause.

La firmeza, elasticidad e hidratación de la piel son consecuencias fundamentalmente de la matriz extracelular de la dermis que es secretada por los elementos celulares de la misma, los fibroblastos, y que consiste principalmente en col�geno de tipo I y III mayoritariamente, responsables de su firmeza y estructuración, la elastina, la cual confiere las propiedades elásticas de la misma, y el ácido hialur�nico, principal glicosaminoglicano necesario para el mantenimiento de los niveles de hidratación. La densidad de la piel es consecuencia tanto de los elementos extracelulares como de los celulares. A mayor densidad de la piel, mayor número de células y mayor cantidad de elementos de la matriz extracelular (G. Jenkins, Mech. of Ageing Dev. 123, 801-810 (2002)). The firmness, elasticity and hydration of the skin are mainly consequences of the extracellular matrix of the dermis that is secreted by the cellular elements of the dermis, the fibroblasts, and which consists mainly of collagen type I and III mostly responsible for its firmness and structuring, elastin, which confers its elastic properties, and hyaluronic acid, the main glycosaminoglycan necessary for the maintenance of hydration levels. The density of the skin is a consequence of both extracellular and cellular elements. The higher the density of the skin, the greater the number of cells and the greater amount of extracellular matrix elements (G. Jenkins, Mech. Of Ageing Dev. 123, 801-810 (2002)).

Una composición cosm�tica anti-envejecimiento o anti-edad de la piel es aquella que por una parte es vigorizante, reestructurante e hidratante, y por la otra reduce los efectos que la edad provoca en la piel, modificando su aspecto tanto en la textura como en la rugosidad. A cosmetic anti-aging or anti-aging skin composition is one that is invigorating, restructuring and moisturizing on the one hand, and on the other it reduces the effects that age causes on the skin, modifying its appearance both in texture As in the roughness.

Una importante acción anti-envejecimiento se consigue cuando las células de la piel responden a la composición cosm�tica prolongando su ciclo vital, retrasando la manifestación de los síntomas de vejez celular, como son la limitación del crecimiento, la producción de proteínas extracelulares, el aumento de tamaño o la queratinizaci�n. An important anti-aging action is achieved when the skin cells respond to the cosmetic composition by prolonging their life cycle, delaying the manifestation of the symptoms of cellular aging, such as growth limitation, the production of extracellular proteins, the increase in size or keratinization.

Otra propiedad crucial de un producto anti-envejecimiento es que sea capaz de disminuir los signos de la edad cuando ya est�n presentes en la piel. Another crucial property of an anti-aging product is that it is able to reduce the signs of aging when they are already present on the skin.

As� pues, los fibroblastos est�n involucrados tanto en la acción antienvejecimiento de la piel, al ser responsables de la producción de col�geno, elastina y ácido hialur�nico, tres elementos fundamentales para mantener la piel joven, como en el proceso de cicatrización de una herida. Thus, fibroblasts are involved both in the anti-aging action of the skin, being responsible for the production of collagen, elastin and hyaluronic acid, three fundamental elements to keep the skin young, as in the process of wound healing.

Las metaloproteasas son enzimas proteol�ticas que se encargan de la remodelación de la matriz extracelular y, en su conjunto, pueden degradar todos los constituyentes de ésta. Por su funcionalidad y según el sustrato que son capaces de degradar, se pueden agrupar en subfamilias. Metalloproteases are proteolytic enzymes that are responsible for remodeling the extracellular matrix and, as a whole, can degrade all its constituents. Due to their functionality and according to the substrate they are capable of degrading, they can be grouped into subfamilies.

Las metaloproteasas intervienen en la mayoría de procesos fisiológicos que requieren la remodelación de la matriz extracelular y tienen un papel bien definido en procesos celulares diversos como la proliferaci�n, migración y la apoptosis. Además de esta función reparadora y de remodelación (reabsorci�n ósea, recambio endometrial, etc.) la presencia de niveles elevados de algunas metaloproteasas se ha asociado a la destrucción celular en una amplia variedad de procesos patológicos y del envejecimiento (K.C.N. Chang et al., Mol. Endocrinol. 22(11), 2407-2419 (2008); G.J. Fisher et al., Am. J. Pathol. 174(1), 101-114 (2009)). Metalloproteases intervene in most physiological processes that require remodeling of the extracellular matrix and have a well-defined role in diverse cellular processes such as proliferation, migration and apoptosis. In addition to this restorative and remodeling function (bone resorption, endometrial turnover, etc.), the presence of high levels of some metalloproteases has been associated with cell destruction in a wide variety of pathological and aging processes (KCN Chang et al. ., Mol. Endocrinol. 22 (11), 2407-2419 (2008); GJ Fisher et al., Am. J. Pathol. 174 (1), 101-114 (2009)).

El cartílago es un tipo de tejido conectivo flexible que reviste las articulaciones y da estructura a la nariz, los oídos, la laringe, la tráquea y otras partes del cuerpo. Es un tejido que no posee vasos sanguíneos, nervios, ni vasos linfáticos. Los peces cartilaginosos, también llamados elasmobranquios, tales como los tiburones y las rayas, tienen un esqueleto de cartílago. Cartilage is a type of flexible connective tissue that lines the joints and gives structure to the nose, ears, larynx, trachea and other parts of the body. It is a tissue that does not have blood vessels, nerves, or lymphatic vessels. Cartilaginous fish, also called elasmobranchs, such as sharks and rays, have a cartilage skeleton.

Se han descrito tres tipos de tejido cartilaginoso, el cartílago hialino, el fibroso y el elástico. El cartílago hialino es el más importante del cuerpo, encontrándose en la nariz, la laringe, la tráquea, los bronquios, los arcos costales y los extremos articulares de los huesos. Three types of cartilaginous tissue, hyaline, fibrous and elastic cartilage have been described. Hyaline cartilage is the most important in the body, being found in the nose, larynx, trachea, bronchi, costal arches and joint ends of bones.

El cartílago est� constituido por 70%-80% de agua. Las principales sustancias que forman adicionalmente el cartílago son: los condrocitos, el col�geno, los proteoglicanos y el ácido hialur�nico. Los proteoglicanos contienen, mayoritariamente, sulfato de condroitina y sulfato de queratano (D.W. Fawcett, 1995, Tratado de Histología, Ed. Interamericana McGraw-Hill, 12� Edición, Madrid; D.W. Fawcett, 1986, Textbook of Histology, Ed. Chapman and Hall, 12th Edition, New York, London; T. Aigner et al., Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1569-1593 (2003)). The cartilage consists of 70% -80% water. The main substances that additionally form cartilage are: chondrocytes, collagen, proteoglycans and hyaluronic acid. Proteoglycans contain, mostly, chondroitin sulfate and queratane sulfate (DW Fawcett, 1995, Treaty of Histology, McGraw-Hill Inter-American Ed. 12th Edition, Madrid; DW Fawcett, 1986, Textbook of Histology, Ed. Chapman and Hall , 12th Edition, New York, London; T. Aigner et al., Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1569-1593 (2003)).

El col�geno es una proteína estructural compleja. Existen varios tipos de col�geno. En el cartílago, el col�geno más abundante es el de tipo II. Todos los col�genos est�n formados por tres cadenas polipept�dicas, las cuales se enrollan y se fijan mediante enlaces transversales para formar una triple hélice. Collagen is a complex structural protein. There are several types of collagen. In cartilage, the most abundant collagen is type II. All collagens are formed by three polypeptide chains, which are wound and fixed by transverse bonds to form a triple helix.

Los glicosaminoglicanos (GAG) son biomol�culas polim�ricas de elevado peso molecular que consisten en una estructura dim�rica repetida. Se encuentran fundamentalmente en los organismos vivos, donde desarrollan diferentes funciones fisiológicas. El glicosaminoglicano mayoritario en el cartílago es el sulfato de condroitina que tiene una estructura polim�rica caracterizada por un disac�rido que se repite, constituido por N-acetil-D-galactosamina y ácido D-glucur�nico. La mayoría de los residuos de N-acetil-D-galactosamina est�n sulfatados. El sulfato de condroitina es un componente fundamental de los proteoglicanos del cartílago. Glycosaminoglycans (GAG) are polymeric biomolecules of high molecular weight that consist of a repeated dimeric structure. They are found primarily in living organisms, where they develop different physiological functions. The major glycosaminoglycan in cartilage is chondroitin sulfate, which has a polymer structure characterized by a repeating disaccharide, consisting of N-acetyl-D-galactosamine and D-glucuronic acid. Most N-acetyl-D-galactosamine residues are sulphated. Chondroitin sulfate is a fundamental component of cartilage proteoglycans.

Otro glicosaminoglicano que se encuentra en el cartílago es el ácido hialur�nico. Es un glicosaminoglicano no sulfatado, con una estructura polim�rica caracterizada por un disac�rido que se repite, constituido por los monosac�ridos N-acetilD-glucosamina y ácido D-glucur�nico. Another glycosaminoglycan found in cartilage is hyaluronic acid. It is a non-sulfated glycosaminoglycan, with a polymer structure characterized by a repeating disaccharide, consisting of the N-acetyl-D-glucosamine monosaccharides and D-glucuric acid.

Los factores de crecimiento son sustancias, la mayoría de naturaleza proteica, que desempeñan una importante función en la comunicación intercelular. Son capaces de estimular el crecimiento y diferenciación celular, regulando de esta manera una gran variedad de procesos celulares. En los líquidos corporales desempeñan su función a muy baja concentración, del orden de los picogramos. Growth factors are substances, mostly of a protein nature, that play an important role in intercellular communication. They are capable of stimulating cell growth and differentiation, thus regulating a wide variety of cellular processes. In body fluids they perform their function at a very low concentration, of the order of picograms.

Se han descrito efectos secundarios importantes en relación a la administración de factores de crecimiento exígenos. Por ejemplo, se ha descrito un incremento de riesgo de morir de cáncer en pacientes tratados con más de tres tubos de becaplermina (cada tubo de 15 g contiene 0,01% de becaplermina), que es un factor de crecimiento PDGF-BB recombinante, que se utiliza en el tratamiento de úlceras diab�ticas neurop�ticas (N. Papanas et al., Drug Saf. 33(6), 455-461 (2010)). Important side effects have been described in relation to the administration of exogenous growth factors. For example, an increased risk of dying from cancer has been described in patients treated with more than three tubes of becaplermin (each 15 g tube contains 0.01% of becaplermin), which is a recombinant PDGF-BB growth factor, which is used in the treatment of diabetic neuropathic ulcers (N. Papanas et al., Drug Saf. 33 (6), 455-461 (2010)).

Se ha descrito la utilización de preparaciones de col�geno para la liberación controlada de sustancias activas en una herida (US 6,761,908). The use of collagen preparations for the controlled release of active substances in a wound has been described (US 6,761,908).

EP 154447 describe una composición para la curación de heridas que consiste en una suspensión acuosa de col�geno y un glicosaminoglicano. Mientras que las composiciones col�geno-heparina y col�geno-alginato presentan buena actividad, el inventor resalta que las preparaciones col�geno-sulfato de condroitina y col�geno-hialuronato son menos útiles en el tratamiento de heridas. EP 154447 describes a wound healing composition consisting of an aqueous suspension of collagen and a glycosaminoglycan. While the collagen-heparin and collagen-alginate compositions have good activity, the inventor emphasizes that chondroitin-collagen sulfate and collagen-hyaluronate preparations are less useful in the treatment of wounds.

En la bibliografía encontramos descritos algunos procedimientos de obtención de preparados de cartílago, pero que difieren del procedimiento empleado en la presente invención y, por lo tanto, dan lugar a productos de cartílago también diferentes: In the literature we find described some procedures for obtaining cartilage preparations, but which differ from the procedure used in the present invention and, therefore, give rise to also different cartilage products:

En US 5,503,990 se describe un procedimiento para preparar un cartílago de tráquea bovina finamente dividido, con un tamaño uniforme. En este procedimiento se utiliza el tratamiento enzim�tico para eliminar la proteína no deseada. El cartílago que se obtiene es poco soluble en agua. In US 5,503,990 a procedure for preparing a finely divided bovine trachea cartilage with a uniform size is described. In this procedure the enzymatic treatment is used to eliminate the unwanted protein. The cartilage obtained is poorly soluble in water.

En US 3,400,199 se describe un procedimiento de preparación de un polvo de cartílago para tratar heridas, con un tamaño de partícula inferior a 40 micras y con un tamaño medio de partícula comprendido entre 5 y 10 micras. En este procedimiento se utiliza un tratamiento enzim�tico con ácido-pepsina durante sólo seis horas, con el objetivo de eliminar el tejido adherido al cartílago. El polvo de cartílago que se obtiene es poco soluble en agua. US 3,400,199 describes a process for preparing a cartilage powder for treating wounds, with a particle size of less than 40 microns and with an average particle size between 5 and 10 microns. In this procedure an enzymatic treatment with pepsin acid is used for only six hours, with the aim of removing the tissue adhered to the cartilage. The cartilage powder obtained is poorly soluble in water.

A la vista de lo anterior, es de gran interés encontrar un procedimiento de preparación de un nuevo producto de cartílago que contenga factores de crecimiento de origen natural, que sea soluble en agua y que pueda ser útil tanto en el tratamiento de heridas como en el tratamiento o prevención de las señales de envejecimiento de la piel. In view of the above, it is of great interest to find a procedure for preparing a new cartilage product that contains growth factors of natural origin, that is soluble in water and that can be useful both in the treatment of wounds and in the treatment of Treatment or prevention of signs of skin aging.

Explanation of the invention

Los presentes inventores han encontrado que, sorprendentemente, el procedimiento de la presente invención permite obtener un producto de cartílago que contiene factores de crecimiento de origen natural, que es soluble en agua, que est� libre de solventes orgánicos, que no contiene sodio inorgánico añadido y que contiene una elevada cantidad de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0% y de sulfato de condroitina. The present inventors have found that, surprisingly, the process of the present invention allows to obtain a cartilage product containing growth factors of natural origin, which is soluble in water, which is free of organic solvents, which does not contain added inorganic sodium. and containing a high amount of protein hydrolyzate with a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0% and chondroitin sulfate.

Adem�s, el producto de cartílago presenta un importante efecto inductor de la proliferaci�n de fibroblastos d�rmicos humanos, un efecto inductor de la migración de fibroblastos d�rmicos humanos, un efecto inductor de la producción de ácido hialur�nico en fibroblastos d�rmicos humanos, lo cual se traduce en una acción hidratante, un efecto inductor de la elasticidad y un efecto inhibidor de la actividad metaloproteasa 1. Además, el producto de cartílago no presenta toxicidad celular y es estable. Por ello, el producto de cartílago de la presente invención puede ser utilizado en el tratamiento de heridas y/o úlceras y para tratar, retardar o prevenir las señales de envejecimiento de la piel. In addition, the cartilage product has an important inducing effect of the proliferation of human dermal fibroblasts, an inducing effect of the migration of human dermal fibroblasts, an inducing effect of the production of hyaluronic acid in Human dermal fibroblasts, which results in a moisturizing action, an inducing effect of elasticity and an inhibitory effect of metalloprotease activity 1. In addition, the cartilage product has no cellular toxicity and is stable. Therefore, the cartilage product of the present invention can be used in the treatment of wounds and / or ulcers and to treat, retard or prevent the signs of skin aging.

As� pues, la presente invención describe un procedimiento para preparar un producto de cartílago que comprende las siguientes etapas: a) picar el cartílago; b) mezclar el cartílago picado y agua; c) calentar la mezcla de la etapa b) a una temperatura inferior a 60 �C; d) añadir una solución acuosa de H3PO4 para ajustar el pH de la mezcla de la etapa c) a un valor comprendido entre 1,5 y 4,5; e) tratar la mezcla ácida de la etapa d) con una cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) comprendida entre 0,6% y 4,6%, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 30 horas, de modo que se obtiene una solución; f) neutralizar la solución de la etapa e) con Ca(OH)2, y g) filtrar la solución de la etapa f) que contiene sales insolubles, de modo que se obtiene una solución acuosa del producto de cartílago, en el que el producto de cartílago comprende un hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, al menos un glicosaminoglicano y al menos un factor de crecimiento.Thus, the present invention describes a process for preparing a cartilage product comprising the following steps: a) chop the cartilage; b) mix chopped cartilage and water; c) heating the mixture of step b) to a temperature below 60 ° C; d) add an aqueous solution of H3PO4 to adjust the pH of the mixture of step c) to a value between 1.5 and 4.5; e) treat the acid mixture of stage d) with an amount of pepsin by weight with respect to the cartilage weight of stage a) comprised between 0.6% and 4.6%, for a period of time between 10 and 30 hours, so that a solution is obtained; f) neutralize the solution of step e) with Ca (OH) 2, and g) filter the solution of step f) containing insoluble salts, so that an aqueous solution of the cartilage product is obtained, in which the product Cartilage comprises a protein hydrolyzate with a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0%, at least one glycosaminoglycan and at least one growth factor.

Preferentemente, el grado de hidrólisis es 1,7%. Preferably, the degree of hydrolysis is 1.7%.

En una realización preferida, el procedimiento comprende una etapa adicional después de la etapa g), en la cual se obtiene un producto de cartílago sólido a partir de la solución acuosa de la etapa g). Preferentemente, el producto de cartílago sólido se obtiene por atomizaci�n. In a preferred embodiment, the process comprises an additional stage after step g), in which a solid cartilage product is obtained from the aqueous solution of step g). Preferably, the solid cartilage product is obtained by atomization.

En otra realización igualmente preferida, en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) est� comprendida entre 0,6% y 1,0%, en la etapa d) el valor del pH est� comprendido entre 3,0 y 3,5 y en la etapa c) la temperatura est� comprendida entre 45 �C y 55 �C. Preferentemente, en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) est� comprendida entre 0,7% y 0,8%, en la etapa e) el periodo de tiempo est� comprendido entre 20 y 28 horas y en la etapa c) la temperatura es 50 �C. Más preferentemente, en la etapa e) la cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de la etapa a) es 0,75% y el tiempo es 24 horas. In another equally preferred embodiment, in step e) the amount of pepsin by weight with respect to the cartilage weight of step a) is between 0.6% and 1.0%, in step d) the pH value it is between 3.0 and 3.5 and in stage c) the temperature is between 45 ° C and 55 ° C. Preferably, in stage e) the amount of pepsin by weight with respect to the cartilage weight of stage a) is between 0.7% and 0.8%, in stage e) the period of time is between 20 and 28 hours and in stage c) the temperature is 50 �C. More preferably, in step e) the amount of pepsin by weight with respect to the cartilage weight of stage a) is 0.75% and the time is 24 hours.

En otra realización igualmente preferida, la etapa f) de neutralización se lleva a cabo después de (i) calentar la solución de la etapa e) durante una hora a una temperatura comprendida entre 75 �C y 90 �C, como por ejemplo de 80 �C; (ii) filtrar, y (iii) decolorar. In another equally preferred embodiment, the neutralization stage f) is carried out after (i) heating the solution of stage e) for one hour at a temperature between 75 ° C and 90 ° C, such as 80 �C; (ii) filter, and (iii) bleach.

La decoloración se puede llevar a cabo con carbón activo, a una temperatura de, por ejemplo 50 �C, y durante un tiempo de, por ejemplo, 30 minutos. The discoloration can be carried out with active carbon, at a temperature of, for example, 50 ° C, and for a time of, for example, 30 minutes.

En otra realización igualmente preferida, el procedimiento comprende una etapa adicional antes de la etapa a), en la cual el cartílago se somete a una limpieza mecánica para eliminar grasa y tejidos no cartilaginosos. In another equally preferred embodiment, the method comprises an additional stage before step a), in which the cartilage is subjected to mechanical cleaning to remove fat and non-cartilaginous tissues.

En otra realización igualmente preferida, en la etapa e) la pepsina se agrega de modo fraccionado, con ajustes del pH. Por ejemplo, la cantidad total de pepsina se puede dividir en dos o tres fracciones, y el pH se puede comprobar y, si es necesario, ajustar cada hora o cada 30 minutos. In another equally preferred embodiment, in step e) the pepsin is added fractionally, with pH adjustments. For example, the total amount of pepsin can be divided into two or three fractions, and the pH can be checked and, if necessary, adjusted every hour or every 30 minutes.

Preferentemente, la pepsina tiene una actividad 1:3000 FCC, siendo FCC la abreviatura de “Food Chemical Codex”. Por ejemplo, se puede emplear la pepsina de Biocatalysts, 1:3000 MDP. Preferably, pepsin has a 1: 3000 FCC activity, FCC being the abbreviation of "Food Chemical Codex". For example, the biocatalysts pepsin, 1: 3000 MDP can be used.

En otra realización igualmente preferida, el producto de cartílago además comprende al menos una proteína de la familia de las serpinas. In another equally preferred embodiment, the cartilage product further comprises at least one protein of the serpine family.

En la presente invención, el término “picar el cartílago” se refiere a reducir el tamaño de las piezas de cartílago hasta, por ejemplo, un tamaño comprendido entre 2 mm y 30 mm. In the present invention, the term "chop the cartilage" refers to reducing the size of the cartilage pieces to, for example, a size between 2 mm and 30 mm.

Preferentemente, el cartílago es cartílago de tráquea de mamífero, de esternón de ave o de pez elasmobranquio. La tráquea de mamífero se selecciona entre tráquea porcina, bovina o de camello. Más preferentemente, el cartílago es cartílago de tráquea porcina. Preferably, the cartilage is cartilage of mammalian trachea, bird sternum or elasmobranch fish. The mammalian trachea is selected from swine, bovine or camel trachea. More preferably, the cartilage is swine trachea cartilage.

En otra realización igualmente preferida, el glicosaminoglicano se selecciona de entre el grupo que consiste en sulfato de condroitina, ácido hialur�nico, sulfato de queratano y mezclas de los mismos, y el factor de crecimiento se selecciona de entre el grupo que consiste en TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB y mezclas de los mismos. In another equally preferred embodiment, the glycosaminoglycan is selected from the group consisting of chondroitin sulfate, hyaluronic acid, keratane sulfate and mixtures thereof, and the growth factor is selected from the group consisting of TGF -β1, TGF-β3, PDGF-BB and mixtures thereof.

El sulfato de condroitina tiene una estructura polim�rica caracterizada por un disac�rido que se repite, constituido por N-acetil-D-galactosamina y ácido Dglucur�nico. El sulfato de condroitina que procede del tejido cartilaginoso se encuentra principalmente en dos formas isom�ricas, que difieren en la posición del grupo sulfato presente en el residuo de N-acetilgalactosamina, el 4-sulfato de condroitina (sulfato de condroitina A) y el 6-sulfato de condroitina (sulfato de condroitina C). Chondroitin sulfate has a polymeric structure characterized by a repeating disaccharide, consisting of N-acetyl-D-galactosamine and Dglucuronic acid. Chondroitin sulfate from cartilaginous tissue is found mainly in two isomeric forms, which differ in the position of the sulfate group present in the N-acetylgalactosamine residue, chondroitin 4-sulfate (chondroitin sulfate A) and Chondroitin sulfate (chondroitin sulfate C).

El ácido hialur�nico es un glicosaminoglicano no sulfatado, de peso molecular comprendido entre 100.000 daltons y 3.000.000 daltons. Su estructura polim�rica se caracteriza por un disac�rido que se repite, constituido por N-acetil-Dglucosamina y ácido D-glucur�nico. Hyaluronic acid is a non-sulfated glycosaminoglycan, with a molecular weight between 100,000 daltons and 3,000,000 daltons. Its polymeric structure is characterized by a repeating disaccharide, consisting of N-acetyl-Dglucosamine and D-glucuric acid.

El sulfato de queratano que procede del tejido cartilaginoso tiene una estructura polim�rica caracterizada por un disac�rido repetitivo, constituido por Dgalactosa y N-acetil-D-glucosamina. Los grupos sulfato est�n incorporados principalmente en las posiciones C6 de los residuos de N-acetil-D-glucosamina y/o en las posiciones C6 de los residuos de D-galactosa. The queratano sulfate that comes from the cartilaginous tissue has a polymeric structure characterized by a repetitive disaccharide, consisting of Dgalactose and N-acetyl-D-glucosamine. Sulfate groups are incorporated mainly in the C6 positions of the N-acetyl-D-glucosamine residues and / or in the C6 positions of the D-galactose residues.

Adem�s de los factores de crecimiento TGF-β1, TGF-β3 y/o PDGF-BB, el producto de cartílago puede contener otros factores de crecimiento tales como IGF, TGF-α, bFGF, FGF, BMP, VEGF o EGF. In addition to the growth factors TGF-β1, TGF-β3 and / or PDGF-BB, the cartilage product may contain other growth factors such as IGF, TGF-α, bFGF, FGF, BMP, VEGF or EGF.

Los factores de crecimiento est�n presentes en el producto de cartílago de la presente invención a muy baja concentración, del orden de picogramos por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro. The growth factors are present in the cartilage product of the present invention at a very low concentration, of the order of picograms per 100 mg of anhydrous cartilage product.

Para la determinación de los factores de crecimiento del producto de cartílago de la presente invención, se pueden utilizar kits de ELISA (R&D Systems), siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. For the determination of the growth factors of the cartilage product of the present invention, ELISA kits (R&D Systems) can be used, following the protocols recommended by the manufacturer.

En una realización particularmente preferida, el producto de cartílago comprende: In a particularly preferred embodiment, the cartilage product comprises:

a) entre 67% y 87% en peso de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; b) entre 15% y 25% en peso de sulfato de condroitina, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; c) entre 0,1% y 1,0% en peso de ácido hialur�nico, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; d) entre 20 pg y 200 pg de TGF-β1 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; e) entre 20 pg y 200 pg de TGF-β3 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro, y f) entre 20 pg y 200 pg de PDGF-BB por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro. a) between 67% and 87% by weight of protein hydrolyzate with a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0%, based on the weight of the anhydrous cartilage product; b) between 15% and 25% by weight of chondroitin sulfate, based on the weight of the anhydrous cartilage product; c) between 0.1% and 1.0% by weight of hyaluronic acid, based on the weight of the anhydrous cartilage product; d) between 20 pg and 200 pg of TGF-β1 per 100 mg of anhydrous cartilage product; e) between 20 pg and 200 pg of TGF-β3 per 100 mg of anhydrous cartilage product, and f) between 20 pg and 200 pg of PDGF-BB per 100 mg of anhydrous cartilage product.

Por ejemplo, el producto de cartílago comprende: a) 77% en peso de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; b) 19,7% en peso de sulfato de condroitina, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; c) 0,3% en peso de ácido hialur�nico, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; d) 53,0 pg de TGF-β1 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; e) 31,3 pg de TGF-β3 por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro, y f) 50,9 pg de PDGF-BB por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro. For example, the cartilage product comprises: a) 77% by weight of protein hydrolyzate with a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0%, based on the weight of the anhydrous cartilage product; b) 19.7% by weight of chondroitin sulfate, based on the weight of the anhydrous cartilage product; c) 0.3% by weight of hyaluronic acid, based on the weight of the anhydrous cartilage product; d) 53.0 pg of TGF-β1 per 100 mg of anhydrous cartilage product; e) 31.3 pg of TGF-β3 per 100 mg of anhydrous cartilage product, and f) 50.9 pg of PDGF-BB per 100 mg of anhydrous cartilage product.

El hidrolizado de proteína est� constituido mayoritariamente por hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%. The protein hydrolyzate consists mostly of collagen hydrolyzate with a degree of hydrolysis of less than 3.0%.

En otra realización particularmente preferida, el producto de cartílago comprende entre 45% y 65% en peso de hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro. Por ejemplo, el producto de cartílago comprende 54,9% en peso de hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%, respecto al peso del producto de cartílago anhidro. Preferentemente, el col�geno hidrolizado presenta un grado de hidrólisis de, por ejemplo, 0,1%, 0,2%, 1,0% � 2,0%. También preferentemente, el hidrolizado de col�geno es hidrolizado de col�geno tipo II. In another particularly preferred embodiment, the cartilage product comprises between 45% and 65% by weight of collagen hydrolyzate with a degree of hydrolysis of less than 3.0%, based on the weight of the anhydrous cartilage product. For example, the cartilage product comprises 54.9% by weight of collagen hydrolyzate with a degree of hydrolysis of less than 3.0%, based on the weight of the anhydrous cartilage product. Preferably, the hydrolyzed collagen has a degree of hydrolysis of, for example, 0.1%, 0.2%, 1.0% 2,0 2.0%. Also preferably, the collagen hydrolyzate is type II collagen hydrolyzate.

La presente invención también se refiere a un producto de cartílago obtenible por el procedimiento definido anteriormente. The present invention also relates to a cartilage product obtainable by the procedure defined above.

La presente invención también se refiere a un complemento alimenticio que comprende el producto de cartílago definido anteriormente, y al menos un excipiente nutricional. Igualmente, la presente invención se refiere a un alimento funcional que comprende el producto de cartílago definido anteriormente, y al menos un excipiente nutricional. The present invention also relates to a food supplement comprising the cartilage product defined above, and at least one nutritional excipient. Likewise, the present invention relates to a functional food comprising the cartilage product defined above, and at least one nutritional excipient.

La presente invención también se refiere a una composición cosm�tica que comprende el producto de cartílago, definido anteriormente, y al menos un excipiente cosm�ticamente aceptable. The present invention also relates to a cosmetic composition comprising the cartilage product, defined above, and at least one cosmetically acceptable excipient.

Igualmente, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el producto de cartílago, definido anteriormente, y al menos un excipiente farmac�uticamente aceptable. Likewise, the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the cartilage product, defined above, and at least one pharmaceutically acceptable excipient.

La presente invención también se refiere a un producto de cartílago, definido anteriormente, para su uso como medicamento. The present invention also relates to a cartilage product, defined above, for use as a medicament.

Igualmente, la presente invención también se refiere a un producto de cartílago, definido anteriormente, para su uso en el tratamiento o prevención de una herida, de una úlcera, de una quemadura, de la artrosis, de la osteoporosis, de una enfermedad o lesión de un tendón, de una enfermedad o lesión de un ligamento, de una enfermedad periodontal, de las señales de envejecimiento de la piel o de una afección muscular. Likewise, the present invention also relates to a cartilage product, defined above, for use in the treatment or prevention of a wound, an ulcer, a burn, osteoarthritis, osteoporosis, a disease or injury of a tendon, of a ligament disease or injury, of a periodontal disease, of the signs of skin aging or of a muscular condition.

Preferentemente, la afección muscular se selecciona entre agujetas, desgarro muscular, desgaste muscular, debilidad muscular o fatiga muscular. Preferably, the muscular condition is selected from stiffness, muscle tear, muscle wasting, muscle weakness or muscle fatigue.

La presente invención también se refiere al uso de un producto de cartílago, definido anteriormente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento The present invention also relates to the use of a cartilage product, defined above, for the preparation of a medicament for treatment.

o prevención de una herida, de una úlcera, de una quemadura, de la artrosis, de la osteoporosis, de una enfermedad o lesión de un tendón, de una enfermedad o lesión de un ligamento, de una enfermedad periodontal o de una afección muscular, más preferentemente, de una herida, de una úlcera, de la artrosis o de la osteoporosis. or prevention of a wound, an ulcer, a burn, osteoarthritis, osteoporosis, a disease or injury to a tendon, a disease or injury to a ligament, a periodontal disease or a muscular condition, more preferably, a wound, an ulcer, osteoarthritis or osteoporosis.

La presente invención también se refiere al uso de una composición cosm�tica, definida anteriormente, para tratar, retardar o prevenir las señales de envejecimiento de la piel, los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta o las estr�as. The present invention also relates to the use of a cosmetic composition, defined above, to treat, retard or prevent the signs of skin aging, the harmful effects of exposure to ultraviolet radiation or streaks.

La presente invención también se refiere al uso de un complemento alimenticio o de un alimento funcional en la prevención y/o reversión de una herida, de una úlcera, de una quemadura, de la artrosis, de la osteoporosis, de una lesión de un tendón, de una lesión de un ligamento, de una afección periodontal, de las señales de envejecimiento de la piel o de una afección muscular. The present invention also relates to the use of a food supplement or a functional food in the prevention and / or reversal of a wound, an ulcer, a burn, osteoarthritis, osteoporosis, a tendon injury , of an injury to a ligament, a periodontal condition, signs of skin aging or a muscular condition.

Debido a que el procedimiento de preparación del producto de cartílago incluye una digestión enzim�tica, y la materia prima es de origen animal, las características analíticas del producto de cartílago obtenido pueden variar ligeramente dependiendo del lote de producción. Because the cartilage product preparation process includes enzymatic digestion, and the raw material is of animal origin, the analytical characteristics of the cartilage product obtained may vary slightly depending on the production lot.

La proteína contenida en el producto de cartílago de la presente invención presenta un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, como por ejemplo 1,7%. En procedimientos descritos en la bibliografía, se obtienen productos de cartílago con grados de hidrólisis de proteína inferiores a los de la presente invención o bien muy superiores. The protein contained in the cartilage product of the present invention has a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0%, such as 1.7%. In procedures described in the literature, cartilage products are obtained with degrees of protein hydrolysis lower than those of the present invention or much higher.

El grado de hidrólisis de la proteína se puede determinar mediante un método estándar, expresándose como el porcentaje de amino�cidos libres con relación a los amino�cidos totales. The degree of hydrolysis of the protein can be determined by a standard method, expressed as the percentage of free amino acids in relation to the total amino acids.

El grado de hidrólisis del hidrolizado de col�geno se puede determinar mediante un método estándar, expresándose como el porcentaje de hidroxiprolina libre con relación con la hidroxiprolina total. The degree of hydrolysis of the collagen hydrolyzate can be determined by a standard method, expressed as the percentage of free hydroxyproline relative to total hydroxyproline.

En los procedimientos de preparación de productos de cartílago descritos en la bibliografía, es usual incluir una etapa en la cual el producto se trata con un solvente orgánico, tal como acetona o hexano, para eliminar la grasa (ver US 3,400,199 y US 5,503,990), In the procedures for preparing cartilage products described in the literature, it is usual to include a step in which the product is treated with an organic solvent, such as acetone or hexane, to remove the fat (see US 3,400,199 and US 5,503,990),

El procedimiento de la invención presenta la ventaja de no utilizar solventes orgánicos, lo cual permite obtener un producto de cartílago sin trazas de dichos solventes. The process of the invention has the advantage of not using organic solvents, which makes it possible to obtain a cartilage product without traces of said solvents.

En los procedimientos de la bibliografía en los que se obtiene un producto de cartílago parcialmente soluble en agua, durante el procedimiento de lavado se pierde una parte de hidrolizado de proteína y de glicosaminoglicanos. In the literature procedures in which a partially water soluble cartilage product is obtained, during the washing process a part of protein hydrolyzate and glycosaminoglycans is lost.

En el procedimiento de la presente invención, las condiciones de digestión enzim�tica de la etapa e), permiten, por un lado, obtener un producto de cartílago con factores de crecimiento, y por otro lado, obtener una solución acuosa del producto de cartílago, evitando que se produzcan pérdidas de hidrolizado de proteína, de glicosaminoglicanos y de factores de crecimiento. In the process of the present invention, the enzymatic digestion conditions of step e) allow, on the one hand, to obtain a cartilage product with growth factors, and on the other hand, to obtain an aqueous solution of the cartilage product , preventing losses of protein hydrolyzate, glycosaminoglycans and growth factors.

Los presentes inventores han encontrado que las siguientes variables: tipo de enzima, concentración de enzima, temperatura, valor de pH, tiempo de digestión enzim�tica, tipo de solvente, tipo de ácido y tipo de base, son clave para la obtención de un determinado producto de cartílago. The present inventors have found that the following variables: enzyme type, enzyme concentration, temperature, pH value, enzymatic digestion time, solvent type, acid type and base type, are key to obtaining a certain cartilage product.

En la presente invención se ha encontrado que utilizando pepsina para la digestión enzim�tica, en una cantidad en peso, respecto al peso de cartílago inicial, comprendida entre 0,6% y 4,6%, durante un tiempo comprendido entre 10 y 30 horas, a una temperatura inferior a 60 �C, y a un pH comprendido entre 1,5 y 4,5, y empleando en el procedimiento H3PO4 como ácido, Ca(OH)2 como base y agua como solvente, se obtiene un nuevo producto de cartílago que presenta las siguientes ventajas: (i) contiene factores de crecimiento de origen natural, (ii) es totalmente soluble en agua, (iii) est� libre de solventes orgánicos, (iv) no contiene sodio inorgánico añadido, (v) contiene una elevada cantidad de hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%, (vi) contiene una elevada cantidad de sulfato de condroitina, (vii) no es tóxico, (viii) induce la proliferaci�n de fibroblastos d�rmicos humanos, (ix) induce la migración de fibroblastos d�rmicos humanos, (x) induce la producción de ácido hialur�nico en fibroblastos d�rmicos humanos, lo cual se traduce en una acción hidratante, (xi) induce la producción de elastina y (xii) presenta un efecto inhibidor de la actividad metaloproteasa 1. In the present invention it has been found that using pepsin for enzymatic digestion, in an amount by weight, with respect to the initial cartilage weight, comprised between 0.6% and 4.6%, for a time between 10 and 30 hours, at a temperature below 60 �C, and at a pH between 1.5 and 4.5, and using H3PO4 as acid, Ca (OH) 2 as base and water as solvent, a new product is obtained of cartilage that has the following advantages: (i) contains growth factors of natural origin, (ii) is completely soluble in water, (iii) is free of organic solvents, (iv) does not contain added inorganic sodium, (v) it contains a high amount of protein hydrolyzate with a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0%, (vi) it contains a high amount of chondroitin sulfate, (vii) it is not toxic, (viii) induces proliferation �n of human dermal fibroblasts, (ix) induces the migration of dermal fibroblasts s human, (x) induces the production of hyaluronic acid in human dermal fibroblasts, which translates into a moisturizing action, (xi) induces the production of elastin and (xii) has an inhibitory effect of metalloprotease activity one.

Adem�s, el producto de cartílago de la presente invención no contiene col�geno nativo. In addition, the cartilage product of the present invention does not contain native collagen.

Los inventores de la presente invención han encontrado que cuando cambian las condiciones del procedimiento de preparación, el producto de cartílago que se obtiene es distinto del obtenido según el procedimiento de la presente invención. As�, cuando se utiliza 0,35% de pepsina y se lleva a cabo la digestión durante sólo seis horas, se obtiene un producto de cartílago en el que no se detectan amino�cidos libres. Por otro lado, cuando se sigue el mismo procedimiento de la presente invención, pero se emplea 10% de pepsina, el producto de cartílago que se obtiene presenta un mayor grado de hidrólisis de la proteína, más en concreto un 5,2%, en lugar del grado de hidrólisis de entre 0,5% y 3,0% que presenta el producto de cartílago de la presente invención. The inventors of the present invention have found that when the conditions of the preparation process change, the cartilage product obtained is different from that obtained according to the process of the present invention. Thus, when 0.35% pepsin is used and digestion is carried out for only six hours, a cartilage product is obtained in which free amino acids are not detected. On the other hand, when the same procedure of the present invention is followed, but 10% pepsin is used, the cartilage product obtained has a higher degree of hydrolysis of the protein, more specifically 5.2%, in instead of the degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0% presented by the cartilage product of the present invention.

En la presente invención se han utilizado las siguientes abreviaturas para los factores de crecimiento: TGF-β1, para el factor de crecimiento transformante beta 1 (Transforming Growth Factor β1). TGF-β3, para el factor de crecimiento transformante beta 3 (Transforming Growth Factor β3). PDGF-BB, para el factor de crecimiento derivado de plaquetas tipo BB (Platelet-Derived Growth Factor BB). IGF, para el factor de crecimiento insul�nico (Insulin Growth Factor). TGF-α, para el factor de crecimiento transformante alfa (Transforming Growth Factor α). bFGF, para el factor de crecimiento de fibroblastos básicos (Basic fibroblast growth factor). FGF, para el factor de crecimiento de fibroblastos (Fibroblast Growth Factor). BMP, para la proteína morfog�nica de hueso (Bone Morphogenetic Protein). VEGF, para el factor de crecimiento endotelial vascular (Vascular Endothelial Growth Factor). EGF, para el factor de crecimiento epid�rmico (Epidermal Growth Factor). In the present invention the following abbreviations have been used for growth factors: TGF-β1, for the transforming growth factor beta 1 (Transforming Growth Factor β1). TGF-β3, for the transforming growth factor beta 3 (Transforming Growth Factor β3). PDGF-BB, for the growth factor derived from platelets type BB (Platelet-Derived Growth Factor BB). IGF, for insulin growth factor (Insulin Growth Factor). TGF-α, for the transforming growth factor alpha (Transforming Growth Factor α). bFGF, for the Basic fibroblast growth factor. FGF, for the fibroblast growth factor. BMP, for bone morphogenic protein (Bone Morphogenetic Protein). VEGF, for vascular endothelial growth factor. EGF, for the epidermal growth factor.

En la presente invención, cuando se habla de señales de envejecimiento de la piel se hace referencia, principalmente, a las arrugas, las líneas de expresión, la flacidez, la sequedad de la piel y la falta de vitalidad. In the present invention, when talking about signs of skin aging, reference is made mainly to wrinkles, expression lines, sagging, dry skin and lack of vitality.

Para utilizar el producto de cartílago de la presente invención en el tratamiento o prevención de una herida, de una úlcera, de una quemadura, de la artrosis, de la osteoporosis, de una enfermedad o lesión de un tendón, de una enfermedad o lesión de un ligamento, de una enfermedad periodontal, de las señales de envejecimiento de la piel o de una afección muscular, se formula en composiciones farmacéuticas adecuadas, recurriendo a técnicas y excipientes o vehículos convencionales, como los descritos en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 2000, edited by Lippincott Williams and Wilkins, 20th edition, Philadelphia. Las composiciones farmacéuticas comprenden el producto de cartílago y al menos un excipiente farmac�uticamente aceptable para la administración al paciente. Dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al paciente en dosis requeridas. La administración de las composiciones farmacéuticas puede efectuarse por diferentes vías, por ejemplo, típica, oral, intravenosa, intralesional, perilesional, intratendinosa, peritendinosa, subcutánea, intramuscular, sublingual, transd�rmica o intranasal. Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz del producto de cartílago, dependiendo dicha cantidad de muchos factores, como por ejemplo, el estado físico del paciente, edad, sexo, vía de administración, frecuencia de administración o gravedad de la enfermedad. Además, se entender� que dicha dosificación de producto de cartílago puede administrarse en unidades de dosis única o múltiple para proporcionar los efectos terapéuticos deseados. To use the cartilage product of the present invention in the treatment or prevention of a wound, of an ulcer, of a burn, of osteoarthritis, of osteoporosis, of a disease or injury of a tendon, of a disease or injury of a ligament, of a periodontal disease, of the signs of skin aging or of a muscular condition, is formulated in suitable pharmaceutical compositions, using conventional techniques and excipients or vehicles, such as those described in Remington: The Science and Practice of Pharmacy 2000, edited by Lippincott Williams and Wilkins, 20th edition, Philadelphia. The pharmaceutical compositions comprise the cartilage product and at least one pharmaceutically acceptable excipient for administration to the patient. Said pharmaceutical compositions can be administered to the patient in required doses. The administration of the pharmaceutical compositions can be carried out by different routes, for example, typical, oral, intravenous, intralesional, perilesional, intrathendinous, peritendinous, subcutaneous, intramuscular, sublingual, transdermal or intranasal. The pharmaceutical compositions of the invention include a therapeutically effective amount of the cartilage product, said amount depending on many factors, such as, for example, the physical condition of the patient, age, sex, route of administration, frequency of administration or severity of the disease. Furthermore, it will be understood that said dosage of cartilage product can be administered in single or multiple dose units to provide the desired therapeutic effects.

Las preparaciones farmacéuticas de la invención generalmente estarán en forma sólida, líquida o como gel. Entre las preparaciones farmacéuticas en forma sólida que pueden prepararse de acuerdo con la presente invención se incluyen polvos, minigr�nulos (pellets), microesferas, nanopart�culas, comprimidos, gránulos dispersables, cápsulas, sellos y supositorios. Entre las preparaciones en forma líquida se incluyen soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires. Se contemplan también las preparaciones de formas sólidas que se desean convertir, inmediatamente antes de ser utilizadas, en preparaciones en forma líquida. Dichas formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. The pharmaceutical preparations of the invention will generally be in solid, liquid or gel form. Pharmaceutical preparations in solid form that can be prepared in accordance with the present invention include powders, mini-granules (pellets), microspheres, nanoparticles, tablets, dispersible granules, capsules, seals and suppositories. Liquid form preparations include solutions, suspensions, emulsions, syrups and elixirs. Also contemplated are preparations of solid forms that are to be converted, immediately before being used, into preparations in liquid form. Such liquid forms include solutions, suspensions and emulsions.

Preferentemente, las preparaciones farmacéuticas para el tratamiento de heridas o úlceras por vía típica estarán en forma de gel, polvos o en cualquier forma que presente una alta viscosidad para retener la composición farmacéutica en la herida. Una vez depositada la composición farmacéutica en la herida, ésta puede taparse con una gasa estéril y/o un vendaje. También se pueden preparar apósitos Preferably, the pharmaceutical preparations for the treatment of wounds or ulcers by the typical route will be in the form of a gel, powders or in any form that has a high viscosity to retain the pharmaceutical composition in the wound. Once the pharmaceutical composition is deposited in the wound, it can be covered with sterile gauze and / or a bandage. Dressings can also be prepared

o parches que contengan el producto de cartílago y un soporte sólido. or patches containing the cartilage product and a solid support.

Para preparar tanto un complemento alimenticio como un alimento funcional, el producto de cartílago se formula con componentes y/o excipientes adecuados empleados en nutrición. El complemento alimenticio puede estar en forma de comprimidos, cápsulas, soluciones, suspensiones o sobres. El alimento funcional puede estar en forma de yogures, leche, leche fermentada, jugos de frutas, jugos de vegetales, sopas, alimentos deshidratados, galletas o alimentos infantiles. To prepare both a food supplement and a functional food, the cartilage product is formulated with suitable components and / or excipients used in nutrition. The food supplement may be in the form of tablets, capsules, solutions, suspensions or sachets. The functional food may be in the form of yogurts, milk, fermented milk, fruit juices, vegetable juices, soups, dehydrated foods, cookies or baby foods.

Cuando se utiliza el producto de cartílago de la presente invención para tratar, retardar o prevenir las señales de envejecimiento de la piel, las estr�as o los efectos dañinos de la exposición a la radiación ultravioleta o de la polución, se formula en composiciones cosm�ticas adecuadas, recurriendo a técnicas y a excipientes o vehículos de uso conocido en cosm�tica y dermatología. La composición cosm�tica puede contener además del producto de cartílago de la presente invención, cualquier extracto vegetal, por ejemplo, y sin ser limitativo, extracto de algas, de romero o de frutas, y uno o varios excipientes y aditivos de uso conocido en las composiciones cosm�ticas y dermatol�gicas, tales como, por ejemplo, y sin ser limitativo, perfumes, suavizantes, colorantes, tensioactivos, vitaminas, conservantes, emulsionantes, emolientes, aceites, filtros UV, glicoles, etc… Las composiciones cosm�ticas de la presente invención se pueden presentar bajo cualquier forma conocida por un experto en cosm�tica y dermatología, por ejemplo, en forma de crema, aceite, emulsión, microemulsi�n, pomada, gel, espuma, pasta, loción, cataplasma, spray o leche. Dichas composiciones cosm�ticas se pueden aplicar sobre el rostro, cuerpo o cabello. When the cartilage product of the present invention is used to treat, retard or prevent the signs of skin aging, stretch marks or the harmful effects of exposure to ultraviolet radiation or pollution, it is formulated in cosmetic compositions. Appropriate ethics, using techniques and excipients or vehicles of known use in cosmetics and dermatology. The cosmetic composition may contain in addition to the cartilage product of the present invention, any plant extract, for example, and without being limiting, seaweed, rosemary or fruit extract, and one or more excipients and additives of known use in Cosmetic and dermatological compositions, such as, for example, and without being limiting, perfumes, softeners, colorants, surfactants, vitamins, preservatives, emulsifiers, emollients, oils, UV filters, glycols, etc ... Cosmetic compositions The present invention may be presented in any form known to an expert in cosmetics and dermatology, for example, in the form of cream, oil, emulsion, microemulsion, ointment, gel, foam, paste, lotion, poultice, spray or milk Said cosmetic compositions can be applied on the face, body or hair.

Brief Description of the Figures

En la Figura 1 se representa a tres concentraciones (50 μg/ml, 500 μg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre el porcentaje de proliferaci�n de fibroblastos d�rmicos humanos a 48 horas. También se incluyen el Control Positivo (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio 10% FCS, en ausencia del producto de cartílago y en presencia de bromodeoxiuridina) y el Control Basal (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago). The effect of the cartilage product on the percentage of proliferation of human dermal fibroblasts at 48 hours is shown in three concentrations (50 μg / ml, 500 μg / ml and 2 mg / ml). Positive Control (culture of human dermal fibroblasts in 10% FCS medium, in the absence of cartilage product and in the presence of bromodeoxyuridine) and Basal Control (culture of human dermal fibroblasts in culture medium and in culture are also included. absence of cartilage product).

En la Figura 2 se representa a tres concentraciones (250 μg/ml, 500 μg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre el porcentaje de migración de fibroblastos d�rmicos humanos a las 48 horas. También se incluyen el Control Basal (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago) y dos Controles Positivos (un cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo al 10% FCS y en ausencia del producto de cartílago y un cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en ausencia del producto de cartílago y en presencia de EGF). In Figure 2 the effect of the cartilage product on the percentage of migration of human dermal fibroblasts at 48 hours is shown at three concentrations (250 μg / ml, 500 μg / ml and 2 mg / ml). Also included are the Basal Control (culture of human dermal fibroblasts in culture medium and in the absence of cartilage product) and two Positive Controls (a culture of human dermal fibroblasts in culture medium 10% FCS and in the absence of the cartilage product and a culture of human dermal fibroblasts in the absence of the cartilage product and in the presence of EGF).

En la Figura 3 se representa a tres concentraciones (250 μg/ml, 500 μg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre el porcentaje de síntesis de elastina en un cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos a las 72 horas de exposición. También se incluyen el Control Basal (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago) y el Control Positivo (cultiIn Figure 3 the effect of the cartilage product on the percentage of elastin synthesis in a culture of human dermal fibroblasts at 72 is represented at three concentrations (250 μg / ml, 500 μg / ml and 2 mg / ml) hours of exposure Also included are the Basal Control (culture of human dermal fibroblasts in culture medium and in the absence of the cartilage product) and the Positive Control (culti

vo de fibroblastos d�rmicos humanos en ausencia del producto de cartílago y en presencia de TGF-β). vo of human dermal fibroblasts in the absence of cartilage product and in the presence of TGF-β).

En la Figura 4 se representa a tres concentraciones (250 μg/ml, 500 μg/ml y 2 mg/ml) el efecto del producto de cartílago sobre la actividad de la metaloproteasa 1 (MMP-1) en un cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos estimulados con IL-1β. También se incluyen el Control Basal (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en medio de cultivo y en ausencia del producto de cartílago y de IL-1β), el Control estimulado con IL-1β y el Control Positivo de inhibición (cultivo de fibroblastos d�rmicos humanos en ausencia del producto de cartílago y en presencia de IL-1β yde dexametasona). The effect of the cartilage product on the activity of metalloprotease 1 (MMP-1) in a fibroblast culture d� is represented at three concentrations (250 μg / ml, 500 μg / ml and 2 mg / ml). human chemicals stimulated with IL-1β. Also included are the Basal Control (culture of human dermal fibroblasts in culture medium and in the absence of the cartilage product and IL-1β), the Control stimulated with IL-1β and the Positive Control of inhibition (culture of fibroblasts d Human chemicals in the absence of cartilage product and in the presence of IL-1β and dexamethasone).

Detailed description of the preferred embodiments Examples

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no representan una limitación del alcance de la presente invención. The following examples are merely illustrative and do not represent a limitation of the scope of the present invention.

Example 1: Preparation of a swine trachea cartilage product of the invention

Piezas de tráquea porcina se sometieron a una limpieza mecánica para eliminar grasa y tejidos no cartilaginosos y a continuación se picaron. En un reactor se introdujeron 3.100 ml de agua desionizada. Se añadieron 1.575 g de cartílago de tráquea porcina picado. La mezcla se calentó a 50 �C y se ajust� el pH entre 3,0 y 3,5 con H3PO4. Una vez ajustado el pH, se añadieron 5,9 g de pepsina (Biocatalysts, 1:3000 MDP) y se mantuvo la temperatura a 50 �C. Se comprob� el pH cada 30 minutos, las tres horas siguientes, y se ajust� en caso que fuese necesario. A las diez horas del inicio de la digestión se volvieron a añadir 5,9 g de pepsina (Biocatalysts, 1:3000 MDP) y se comprob� el pH cada 30 minutos, durante las tres horas siguientes. En total, la digestión se llev� a cabo durante 24 horas, empleándose en total una cantidad de pepsina en peso respecto al peso del cartílago de tráquea porcina del 0,75%. Transcurridas las 24 horas, se calentó a 80 �C durante una hora. A continuación, se filtr� para clarificar el producto. Una vez filtrado, se añadieron 7,9 g de carbón activo y se calentó a 50 �C durante 30 minutos. Se neutralizó con hidróxido de calcio. A continuación, se filtr�, obteniéndose una solución acuosa de producto de cartílago. El producto final en forma sólida (polvo color crema) se obtuvo atomizando la solución acuosa de producto de cartílago. Swine trachea pieces underwent mechanical cleaning to remove fat and non-cartilaginous tissues and then they were chopped. In a reactor 3,100 ml of deionized water was introduced. 1,575 g of chopped swine trachea cartilage were added. The mixture was heated to 50 ° C and the pH was adjusted between 3.0 and 3.5 with H3PO4. Once the pH was adjusted, 5.9 g of pepsin (Biocatalysts, 1: 3000 MDP) was added and the temperature was maintained at 50 ° C. The pH was checked every 30 minutes, the next three hours, and adjusted if necessary. At 10 hours after the start of digestion, 5.9 g of pepsin (Biocatalysts, 1: 3000 MDP) were added again and the pH was checked every 30 minutes, for the next three hours. In total, digestion was carried out for 24 hours, using a total amount of pepsin by weight with respect to the weight of the swine trachea cartilage of 0.75%. After 24 hours, it was heated at 80 ° C for one hour. It was then filtered to clarify the product. Once filtered, 7.9 g of activated carbon was added and heated at 50 ° C for 30 minutes. It was neutralized with calcium hydroxide. It was then filtered, obtaining an aqueous solution of cartilage product. The final product in solid form (cream-colored powder) was obtained by atomizing the aqueous solution of cartilage product.

Caracter�sticas analíticas del producto de cartílago sólido obtenido: Hidrolizado de proteína con un grado de hidrólisis comprendido entre 0,5% y 3,0%: 77% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%: 54,9% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Amino�cidos totales: 70,7% en peso, respecto al peso del producto de cartílago; Amino�cidos libres: 1,2% en peso, respecto al peso del producto de cartílago; Hidroxiprolina total: 6,9% en peso, respecto al peso del producto de cartílago; Grado de hidrólisis de la proteína: 1,7%; Grado de hidrólisis del hidrolizado de col�geno: 0,1%; Sulfato de condroitina: 19,7% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Acido hialur�nico: 0,3% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Factor de crecimiento TGF-β1: 53,0 pg por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; Factor de crecimiento TGF-β3: 31,3 pg por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; Factor de crecimiento PDGF-BB: 50,9 pg por cada 100 mg de producto de cartílago anhidro; Cenizas: 8,9% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro; Calcio: 0,4% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro, Fosfatos: 0,3% en peso, respecto al peso del producto de cartílago anhidro. Analytical characteristics of the solid cartilage product obtained: Protein hydrolyzate with a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0%: 77% by weight, based on the weight of the anhydrous cartilage product; Collagen hydrolyzate with a degree of hydrolysis of less than 3.0%: 54.9% by weight, based on the weight of the anhydrous cartilage product; Total amino acids: 70.7% by weight, based on the weight of the cartilage product; Free amino acids: 1.2% by weight, based on the weight of the cartilage product; Total hydroxyproline: 6.9% by weight, based on the weight of the cartilage product; Degree of protein hydrolysis: 1.7%; Hydrolysis degree of collagen hydrolyzate: 0.1%; Chondroitin sulfate: 19.7% by weight, based on the weight of the anhydrous cartilage product; Hyaluronic acid: 0.3% by weight, based on the weight of the anhydrous cartilage product; TGF-β1 growth factor: 53.0 pg per 100 mg of anhydrous cartilage product; TGF-β3 growth factor: 31.3 pg per 100 mg of anhydrous cartilage product; PDGF-BB growth factor: 50.9 pg per 100 mg of anhydrous cartilage product; Ashes: 8.9% by weight, based on the weight of the anhydrous cartilage product; Calcium: 0.4% by weight, based on the weight of the anhydrous cartilage product, Phosphates: 0.3% by weight, based on the weight of the anhydrous cartilage product.

En el 77% del hidrolizado de proteína se incluye el hidrolizado de col�geno con un grado de hidrólisis inferior al 3,0%. Las características analíticas del producto de cartílago pueden variar ligeramente dependiendo del lote del producto de cartílago obtenido. Collagen hydrolyzate with a degree of hydrolysis of less than 3.0% is included in 77% of the protein hydrolyzate. The analytical characteristics of the cartilage product may vary slightly depending on the batch of the cartilage product obtained.

Determinaci�n de los grados de hidrólisis: Determination of the degrees of hydrolysis:

El grado de hidrólisis de la proteína se determin� mediante un método estándar. Se expres� como el porcentaje de amino�cidos libres con relación a los amino�cidos totales. The degree of hydrolysis of the protein was determined by a standard method. It was expressed as the percentage of free amino acids in relation to total amino acids.

El grado de hidrólisis del hidrolizado de col�geno se determin� mediante un método estándar. Se expres� como el porcentaje de hidroxiprolina libre con relación con la hidroxiprolina total. The degree of hydrolysis of the collagen hydrolyzate was determined by a standard method. It was expressed as the percentage of free hydroxyproline relative to total hydroxyproline.

Determinaci�n de los factores de crecimiento: Determination of growth factors:

Para la determinación de los factores de crecimiento se utilizaron los siguientes kits de ELISA (R&D Systems), siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante: Quantikine porcine TGF-β1 (catálogo: MB100B); DuoSet Human TGF-β3 (catálogo: DY243); Quantikine Human PDGF-BB (catálogo: DBB00). The following ELISA kits (R&D Systems) were used to determine the growth factors, following the protocols recommended by the manufacturer: Quantikine porcine TGF-β1 (catalog: MB100B); DuoSet Human TGF-β3 (catalog: DY243); Quantikine Human PDGF-BB (catalog: DBB00).

Biology Example 2: Fibroblast Proliferation Stimulating Activity

El proceso de curación o cicatrización de heridas es un proceso muy ordenado y controlado caracterizado por distintas fases: inflamación, proliferaci�n y remodelación (R.F. Diegelmann and M.C. Evans, Front. Biosci. 9, 283-289 (2004)). El proceso de curación precisa de la coordinación de varias células, factores de crecimiento y citoquinas. La inflamación es la fase inicial. En el proceso de curación de heridas, la proliferaci�n de fibroblastos interviene en la restauración de la estructura y función en la herida (R.A. Clark, Ann. N. Y. Acad. Sci. 936, 355-367 (2001)). The wound healing or healing process is a very orderly and controlled process characterized by different phases: inflammation, proliferation and remodeling (R.F. Diegelmann and M.C. Evans, Front. Biosci. 9, 283-289 (2004)). The healing process requires the coordination of several cells, growth factors and cytokines. Inflammation is the initial phase. In the wound healing process, fibroblast proliferation is involved in the restoration of structure and function in the wound (R.A. Clark, Ann. N. Y. Acad. Sci. 936, 355-367 (2001)).

La estimulaci�n del grado de proliferaci�n de fibroblastos también es interesante como tratamiento anti-edad. Con el envejecimiento se ve disminuido el número de fibroblastos d�rmicos y, por tanto, se produce una pérdida progresiva de tejido d�rmico. Stimulation of the degree of fibroblast proliferation is also interesting as an anti-aging treatment. With aging, the number of dermal fibroblasts is reduced and, therefore, there is a progressive loss of dermal tissue.

Materiales y métodos Materials and methods

El grado de proliferaci�n se cuantific� midiendo la incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU) en el ADN de células en proliferaci�n, durante la fase de replicaci�n. Para la cuantificación de la BrdU incorporada se utilizó un inmunoensayo colorim�trico mediante un anticuerpo anti-BrdU específico, detección ELISA (Enzyme Linked Immunoadsorbent Assay) y posterior lectura de la absorbancia a 450 nm. La cantidad de BrdU detectada es proporcional al número de células que se han dividido y, por tanto, proporcional al crecimiento o proliferaci�n experimentada por el cultivo. The degree of proliferation was quantified by measuring the incorporation of bromodeoxyuridine (BrdU) into the DNA of proliferating cells, during the replication phase. For quantification of the incorporated BrdU, a colorimetric immunoassay was used by means of a specific anti-BrdU antibody, ELISA detection (Enzyme Linked Immunoadsorbent Assay) and subsequent absorbance reading at 450 nm. The amount of BrdU detected is proportional to the number of cells that have been divided and, therefore, proportional to the growth or proliferation experienced by the culture.

Los fibroblastos d�rmicos humanos fueron sembrados a 5.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y pasadas 24 horas se dejaron con medio de cultivo de deprivaci�n de factores de crecimiento durante toda la noche. Al día siguiente, las células fueron tratadas a tres concentraciones (2mg/ml, 500 μg/ml y 50 μg/ml) de un producto de cartílago de la presente invención, en concreto del producto de cartílago del Ejemplo 1. La cantidad de bromodeoxiuridina se determin� mediante inmunoensayo específico (técnica ELISA) después de 48 horas de exposición del cultivo al producto de cartílago. Human dermal fibroblasts were seeded at 5,000 cells / well in 96-well plates and after 24 hours they were left with growth factor deprivation culture medium overnight. The next day, the cells were treated at three concentrations (2mg / ml, 500 μg / ml and 50 μg / ml) of a cartilage product of the present invention, specifically the cartilage product of Example 1. The amount of bromodeoxyuridine it was determined by specific immunoassay (ELISA technique) after 48 hours of exposure of the culture to the cartilage product.

Como Control Basal se utilizó un cultivo de fibroblastos con medio de cultivo y como Control Positivo, los fibroblastos fueron expuestos a medio de cultivo 10% FCS (Fetal Calf Serum). As a Basal Control, a culture of fibroblasts with culture medium was used and as a Positive Control, the fibroblasts were exposed to 10% FCS (Fetal Calf Serum) culture medium.

Resultados Results

Como se puede observar en la Figura 1, el producto de cartílago a las dosis de 500 μg/ml y 2 mg/ml mostr� un efecto estimulatorio estadísticamente significativo (p<0,05) de la proliferaci�n de fibroblastos, si lo comparamos con el Control Basal. Concretamente, a la dosis intermedia se increment� la proliferaci�n en un 35,9% y a la dosis alta un 73%. As can be seen in Figure 1, the cartilage product at doses of 500 μg / ml and 2 mg / ml showed a statistically significant stimulatory effect (p <0.05) of fibroblast proliferation, if we compare with the Basal Control. Specifically, proliferation increased by 35.9% at the intermediate dose and 73% at the high dose.

Ejemplo 3: Valoración de la capacidad migratoria celular in vitro Example 3: Assessment of cell migration capacity in vitro

Este estudio permite la evaluación de la capacidad de inducción de la migración celular en cultivo primario de fibroblastos d�rmicos humanos y, por tanto, es útil para evaluar la potencial eficacia de un producto en la curación de heridas y como tratamiento anti-edad. De hecho con el envejecimiento se produce una disminución del grado de proliferaci�n y migración de los fibroblastos. This study allows the evaluation of the induction capacity of cell migration in primary culture of human dermal fibroblasts and, therefore, is useful to evaluate the potential efficacy of a product in wound healing and as an anti-aging treatment. In fact with aging there is a decrease in the degree of proliferation and migration of fibroblasts.

Materiales y métodos Materials and methods

Para evaluar el potencial efecto de un producto de cartílago de la presente invención sobre la migración celular se utilizó el sistema Oris™ Cell Migration assay de Platypus. Este sistema consiste en una placa especial que permite la siembra de los fibroblastos y su crecimiento en monocapa, pero dejando un área central del pocillo libre de células gracias a los denominados Oris™ Cell Seeding Stoppers que restringen la siembra a la región anular exterior del pocillo. Posteriormente se retiran los Oris™ Cell Seeding Stoppers y esta área es ocupada posteriormente por las células durante el proceso de migración. To evaluate the potential effect of a cartilage product of the present invention on cell migration, the Oris ™ Cell Migration assay system from Platypus was used. This system consists of a special plate that allows the sowing of the fibroblasts and their growth in monolayer, but leaving a central area of the well free of cells thanks to the so-called Oris ™ Cell Seeding Stoppers that restrict sowing to the outer annular region of the well . The Oris ™ Cell Seeding Stoppers are subsequently removed and this area is subsequently occupied by the cells during the migration process.

Los fibroblastos d�rmicos humanos fueron incubados 48 horas en presencia de un producto de cartílago de la presente invención, concretamente del producto de cartílago del Ejemplo 1 (2 mg/ml y 500 μg/ml) y a continuación se marcaron con el marcador fluorescente calce�na. La fluorescencia emitida por las células en migración se midió mediante un fluor�metro. También se tomaron fotografías por microscop�a de fluorescencia que permitieron ver el área ocupada en comparación con el Control Basal. The human dermal fibroblasts were incubated 48 hours in the presence of a cartilage product of the present invention, specifically the cartilage product of Example 1 (2 mg / ml and 500 μg / ml) and then labeled with the fluorescent marker fit �na. The fluorescence emitted by the migrating cells was measured by a fluorometer. Photographs were also taken by fluorescence microscopy that allowed us to see the area occupied compared to the Baseline Control.

Como Control Basal se utilizó medio de cultivo y como Controles Positivos se incluyeron medio de cultivo al 10% en FCS (Fetal Calf Serum) y también medio de cultivo con EGF 5 ng (Epidermal Growth Factor). As a Baseline Control, culture medium was used and as Positive Controls 10% culture medium in FCS (Fetal Calf Serum) and also culture medium with 5 ng EGF (Epidermal Growth Factor) were included.

Resultados Results

Como se puede observar en la Figura 2, el producto de cartílago produjo un importante efecto inductor de la migración celular a las 48 h de exposición para las concentraciones de 500 μg/ml y 2 mg/ml (42% y 75% de inducción, respectivamente). Además debe destacarse que el efecto de dicho producto super� al mostrado por los controles positivos (medio al 10% FCS y EGF a 5 ng/ml). As can be seen in Figure 2, the cartilage product produced an important inducing effect of cell migration at 48 hours of exposure for concentrations of 500 μg / ml and 2 mg / ml (42% and 75% induction, respectively). It should also be noted that the effect of this product exceeds that shown by the positive controls (10% FCS medium and EGF at 5 ng / ml).

Ejemplo 4: Valoración de la acción hidratante Example 4: Assessment of the moisturizing action

El ácido hialur�nico es un componente esencial de las pieles sanas y est� involucrado en la hemostasis, la hidratación y los procesos de reparación. Gracias a su capacidad de retener el agua en un porcentaje equivalente a miles de veces, desarrolla una función primordial en la piel. La piel joven es rica en ácido hialur�nico, sin embargo a medida que envejecemos, la distribución y función del ácido hialur�nico en la piel van cambiando y aparecen los signos característicos del envejecimiento como arrugas y líneas de expresión. Hyaluronic acid is an essential component of healthy skin and is involved in hemostasis, hydration and repair processes. Thanks to its ability to retain water in a percentage equivalent to thousands of times, it develops a primary function in the skin. Young skin is rich in hyaluronic acid, however, as we age, the distribution and function of hyaluronic acid in the skin changes and the characteristic signs of aging appear as wrinkles and expression lines.

Materiales y métodos Materials and methods

Para evaluar la eficacia inductora de la hidratación de la piel por un producto de cartílago de la presente invención, en concreto por el producto de cartílago del Ejemplo 1, se llev� a cabo un estudio para la cuantificación de glicosaminoglicanos, principalmente ácido hialur�nico sintetizado por los fibroblastos d�rmicos humanos tras la incubaci�n con el producto de cartílago (2mg/ml, 500 μg/ml y 250 μg/ml) durante 24 horas. Para ello se utilizó el método de incorporación de 3H-glucosamina en los glicosaminoglicanos de nueva síntesis. To evaluate the inductive efficacy of skin hydration by a cartilage product of the present invention, in particular by the cartilage product of Example 1, a study was carried out for the quantification of glycosaminoglycans, mainly hyaluronic acid synthesized by human dermal fibroblasts after incubation with the cartilage product (2mg / ml, 500 μg / ml and 250 μg / ml) for 24 hours. For this, the method of incorporation of 3H-glucosamine in the newly synthesized glycosaminoglycans was used.

La radioactividad unida se analizó en un contador de centelleo líquido. Los valores de CPMs (cuentas por minuto) obtenidos son proporcionales a la cantidad de ácido hialur�nico sintetizado en un 90%. The bound radioactivity was analyzed in a liquid scintillation counter. The CPM values (counts per minute) obtained are proportional to the amount of hyaluronic acid synthesized by 90%.

Como Control Positivo los fibroblastos se expusieron a TGF-β1 (Transforming growth factor beta 1), conocido como inductor de la producción de proteína de la matriz extracelular. El Control Basal consistió únicamente en fibroblastos en medio de cultivo. As a Positive Control, fibroblasts were exposed to TGF-β1 (Transforming growth factor beta 1), known as an inducer of extracellular matrix protein production. The Basal Control consisted solely of fibroblasts in culture medium.

Resultados Results

El producto de cartílago mostr� un leve efecto hidratante a las 24 horas de exposición a la concentración de 500 μg/ml. Concretamente, estimul� la síntesis de ácido hialur�nico en un 12% si se compara con el Control Basal. The cartilage product showed a mild moisturizing effect at 24 hours of exposure to the concentration of 500 μg / ml. Specifically, it stimulated the synthesis of hyaluronic acid by 12% when compared to the Baseline Control.

Example 5: Assessment of the inducing capacity of elastin production

En la piel humana, el envejecimiento intrínseco est� caracterizado por atrofia de la dermis debida a la pérdida de col�geno, a la degeneración de la malla de fibras de elastina y a la pérdida de hidratación. La elastina es la proteína que confiere las propiedades elásticas a la piel. In human skin, intrinsic aging is characterized by atrophy of the dermis due to loss of collagen, degeneration of the elastin fiber mesh and loss of hydration. Elastin is the protein that confers elastic properties to the skin.

Materiales y métodos Materials and methods

La capacidad inductora de la elasticidad de la piel por parte de un producto de cartílago de la presente invención, concretamente del producto de cartílago del Ejemplo 1, fue evaluada a partir de la cuantificación de la producción de elastina en los fibroblastos. The skin elasticity inducing ability of a cartilage product of the present invention, specifically the cartilage product of Example 1, was evaluated from the quantification of elastin production in fibroblasts.

Los fibroblastos d�rmicos humanos fueron sembrados en placas de cultivo de 96 pocillos y se mantuvieron en crecimiento hasta llegar a confluencia. Seguidamente, se expusieron durante 72 horas a las concentraciones de 2 mg/ml, 500 μg/ml y 250 μg/ml. Finalizado este período de tratamiento, las células fueron lavadas y fijadas para su procesamiento ELISA. En este proceso se utilizó un anticuerpo primario contra la elastina (Monoclonal Anti-Elastin antibody produced in mouse, Sigma), seguido de anticuerpo secundario conjugado a la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y revelado con o-fenilendiamina (sustrato de la HRP) y urea-H2O2. La lectura de la absorbancia se realizó en lector de ELISA a 492 nm. Human dermal fibroblasts were seeded in 96-well culture plates and kept growing until they reached confluence. Then, they were exposed for 72 hours at the concentrations of 2 mg / ml, 500 μg / ml and 250 μg / ml. After this period of treatment, the cells were washed and fixed for ELISA processing. In this process a primary antibody against elastin (Monoclonal Anti-Elastin antibody produced in mouse, Sigma) was used, followed by secondary antibody conjugated to the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and developed with o-phenylenediamine (HRP substrate) and urea-H2O2. The absorbance reading was performed in an ELISA reader at 492 nm.

El valor de elastina producida fue ponderado con el de proteína total en cada condición experimental, resultando en los valores del índice de producción de elastina/proteína total. The elastin value produced was weighted with that of total protein in each experimental condition, resulting in the values of the total elastin / protein production index.

Como Control Positivo los fibroblastos fueron expuestos a TGF-β1 (Transforming Growth Factor Beta 1). Como Control Basal los fibroblastos se cultivaron en medio de cultivo. As a Positive Control the fibroblasts were exposed to TGF-β1 (Transforming Growth Factor Beta 1). As Basal Control the fibroblasts were grown in culture medium.

Resultados Results

Como se puede observar en la Figura 3, el producto de cartílago mostr� un importante efecto inductor de la producción de elastina a la concentración superior estudiada (2 mg/ml). Debe remarcarse que se consiguió cerca del 50% del valor mostrado por el control TGF-β, un potente inductor de la síntesis de elastina y proteínas de matriz extracelular. As can be seen in Figure 3, the cartilage product showed an important inducing effect of elastin production at the highest concentration studied (2 mg / ml). It should be noted that about 50% of the value shown by the TGF-β control, a potent inducer of elastin synthesis and extracellular matrix proteins, was achieved.

Ejemplo 6: Determinación del potencial inhibidor de la actividad MMP-1 Example 6: Determination of the potential inhibitor of MMP-1 activity

Con el envejecimiento se produce una pérdida de matriz extracelular, un aumento de las metaloproteasas (MMPs) que degradan el col�geno tipo I responsable de la firmeza de la piel, as� como también una pérdida de fibroblastos y de la red vascular. Se estima que el col�geno de la dermis disminuye un 1% por año en toda la vida adulta y a medida que aumenta la edad también se incrementan los niveles de metaloproteasas, lo que hace que aumente la pérdida de col�geno en forma progresiva. With aging there is a loss of extracellular matrix, an increase in metalloproteases (MMPs) that degrade type I collagen responsible for skin firmness, as well as a loss of fibroblasts and vascular network. It is estimated that the collagen in the dermis decreases 1% per year throughout adult life, and as the age increases, the levels of metalloproteases also increase, which increases the loss of collagen progressively.

Materiales y métodos Materials and methods

Para la evaluación del efecto de un producto de cartílago de la presente invención, en concreto del producto de cartílago del Ejemplo 1, sobre la regulaci�n de metaloproteasas, se determin� la actividad MMP-1 en un cultivo primario de fibroblastos d�rmicos humanos expuestos al producto de cartílago e inducidos con IL1-β durante 48 horas. For the evaluation of the effect of a cartilage product of the present invention, in particular the cartilage product of Example 1, on the regulation of metalloproteases, MMP-1 activity was determined in a primary culture of dermal fibroblasts humans exposed to cartilage product and induced with IL1-β for 48 hours.

Se sembraron los fibroblastos d�rmicos humanos en placas de cultivo de 24 pocillos. Tras su llegada a confluencia y deprivaci�n con medio sin suero durante 16 horas, se aplicó el producto de cartílago (2 mg/ml, 500 μg/ml y 250 μg/ml). Tras 24 horas, se aplicó IL-1β como estimulador de la producción de MMPs y el cultivo se mantuvo 24 horas más. Al finalizar el tratamiento, el sobrenadante se recogió y se cuantific� la metaloproteasa activa mediante ensayo inmuno-fluorim�trico específico tras la activación enzim�tica con APMA (p-AminoPhenylMercuric Acetate). Human dermal fibroblasts were seeded in 24-well culture plates. After arrival at confluence and deprivation with serum-free medium for 16 hours, the cartilage product (2 mg / ml, 500 μg / ml and 250 μg / ml) was applied. After 24 hours, IL-1β was applied as a stimulator of MMP production and the culture was maintained for an additional 24 hours. At the end of the treatment, the supernatant was collected and the active metalloprotease was quantified by specific immuno-fluorometric assay after enzymatic activation with APMA (p-AminoPhenylMercuric Acetate).

Los valores de MMP-1 activa fueron ponderados por los de proteína total, previamente determinada por el método del ácido bicincon�nico, BCA (Pierce BCA Protein Assay Kit). The active MMP-1 values were weighted by those of total protein, previously determined by the method of bicinconic acid, BCA (Pierce BCA Protein Assay Kit).

El Control Basal consistió en medio de cultivo. En el estudio también se incluyó un grupo Control estimulado con IL-1β. Como Control Positivo de inhibición se utilizó dexametasona a 5 μM (Control Dexa), glucocorticoide potente de acción antiinflamatoria. The Basal Control consisted of culture medium. The study also included a Control group stimulated with IL-1β. As a Positive Control of inhibition, dexamethasone was used at 5 μM (Control Dexa), a potent glucocorticoid with an anti-inflammatory action.

Resultados Results

El producto de cartílago mostr� un potente efecto inhibidor (p<0,05) de la actividad metaloproteasa 1 inducida por IL-1β, en todas las dosis estudiadas y de manera dosis-dependiente, con una reducción del 61%-70% respecto al Control estimulado con IL-1β. The cartilage product showed a potent inhibitory effect (p <0.05) of IL-1β-induced metalloprotease 1 activity, in all doses studied and in a dose-dependent manner, with a reduction of 61% -70% compared to Control stimulated with IL-1β.

Claims

R E I V I N D I C A C IO N E S

1. A process for preparing a cartilage product comprising

the following stages: a) chop the cartilage; b) mix chopped cartilage and water; c) heating the mixture of step b) to a temperature below 60 ° C; d) add an aqueous solution of H3PO4 to adjust the pH of the mixture of step c) to a value between 1.5 and 4.5; e) treat the acid mixture of stage d) with an amount of pepsin by weight with respect to the cartilage weight of stage a) comprised between 0.6% and 4.6%, for a period of time between 10 and 30 hours, so that a solution is obtained; f) neutralize the solution of step e) with Ca (OH) 2, and g) filter the solution of step f) containing insoluble salts, so that an aqueous solution of the cartilage product is obtained, in which the product Cartilage comprises a protein hydrolyzate with a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0%, at least one glycosaminoglycan and at least one growth factor.

2. The method according to claim 1, comprising an additional stage after step g), in which a solid cartilage product is obtained from the aqueous solution of step g).

3. The method according to claim 2, wherein a solid cartilage product is obtained by atomization.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein in step e) the amount of pepsin by weight with respect to the cartilage weight of stage a) is comprised between 0.6% and 1, 0%, in stage d) the pH value is between 3.0 and 3.5 and in stage c) the temperature is between 45 ° C and 55 ° C.

5. The method according to claim 4, wherein in step e) the amount of pepsin by weight with respect to the cartilage weight of stage a) is comprised between 0.7% and 0.8%, in the stage e) the period of time is between 20 and 28 hours and in stage c) the temperature is 50 ° C.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the neutralization step f) is carried out after (i) heating the solution of step e) for one hour at a temperature between 75 �C and 90 �C; (ii) filter, and (iii) bleach.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, comprising an additional stage before stage a), in which the cartilage is subjected to mechanical cleaning to remove fat and non-cartilaginous tissues.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the cartilage is mammalian trachea cartilage.

9. The method according to claim 8, wherein the mammalian trachea cartilage is swine trachea cartilage.

10. The process according to any one of claims 1 to 9, wherein the glycosaminoglycan is selected from the group consisting of chondroitin sulfate, hyaluronic acid, keratane sulfate and mixtures thereof, and the factor Growth is selected from the group consisting of TGF-β1, TGF-β3, PDGF-BB and mixtures thereof.

11. A cartilage product obtainable by the process according to any one of claims 1 to 10.

12. The cartilage product according to claim 11, characterized in that it comprises: a) between 67% and 87% by weight of protein hydrolyzate with a degree of hydrolysis between 0.5% and 3.0%, based on weight of the anhydrous cartilage product; b) between 15% and 25% by weight of chondroitin sulfate, based on the weight of the anhydrous cartilage product; c) between 0.1% and 1.0% by weight of hyaluronic acid, based on the weight of the anhydrous cartilage product; d) between 20 pg and 200 pg of TGF-β1 per 100 mg of anhydrous cartilage product; e) between 20 pg and 200 pg of TGF-β3 per 100 mg of anhydrous cartilage product, and f) between 20 pg and 200 pg of PDGF-BB per 100 mg of anhydrous cartilage product.

13. 13.: Un complemento alimenticio o un alimento funcional que comprende el producto de cartílago según la reivindicación 11 � 12, y al menos un excipiente nutricional. A food supplement or a functional food comprising the cartilage product according to claim 11-12, and at least one nutritional excipient.

14. 14.: Una composición cosm�tica que comprende el producto de cartílago según la reivindicación 11 � 12, y al menos un excipiente cosm�ticamente aceptable. A cosmetic composition comprising the cartilage product according to claim 11-12, and at least one cosmetically acceptable excipient.

15. A pharmaceutical composition comprising the cartilage product according to claim 11-12, and at least one pharmaceutically acceptable excipient.

16.- A cartilage product according to claim 11-12, for use as a medicament.

17. Use of a cartilage product according to claim 11-12, for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a wound and / or an ulcer.

18. Use of a cosmetic composition according to claim 14, to treat, delay or prevent the signs of skin aging, the harmful effects of exposure to ultraviolet radiation or stretch marks.

'c.0: 0! Q.I 00s

300 250 200 150 100 50 0

Figure 1

Control Basal Basal Control: Control Positivo 50 �g/ml 500 �g/ml Producto de cartilago 2 mg/ml Positive Control 50 g / ml 500 �g / ml Cartilage product 2 mg / ml

Figure 2

'V! S.Qi0i Q: Ii.0sI.c.0.Q! SI

140 120 100 80 60 40 20 0

Figure 3

Control Basal Basal Control: TGF-� 10 ng/ml 250� g/ml 500� g/ml Producto de cartilago 2mg/ml TGF-� 10 ng / ml 250� g / ml 500� g / ml Cartilage product 2mg / ml

Figure 4

SPANISH OFFICE OF THE PATENTS AND BRAND

Application No.: 201131526

SPAIN

Date of submission of the application: 09.21.2011

Priority Date:

REPORT ON THE STATE OF THE TECHNIQUE

51 Int. Cl.: A61K35 / 32 (2006.01)

RELEVANT DOCUMENTS

Categor�a Category: 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas 56 Documents cited Claims Affected

X X: GB 1041172 A (BALASSA LESLIE L) 01.09.1966, ejemplo 14; reivindicaciones. 1-18 GB 1041172 A (BALASSA LESLIE L) 01.09.1966, example 14; claims. 1-18

X X: US 3400199 A (BALASSA LESLIE L) 03.09.1968, ejemplos 5,6; reivindicaciones. 1-18 US 3400199 A (BALASSA LESLIE L) 03.09.1968, examples 5.6; claims. 1-18

X X: WO 9716197 A1 (AETERNA LAB INC) 09.05.1997, páginas 16,69,77,87. 1-18 WO 9716197 A1 (AETERNA LAB INC) 09.05.1997, pages 16.69.77.87. 1-18

X X: US 2007293427 A1 (VOULAND ERIC et al.) 20.12.2007, reivindicaciones. 1-18 US 2007293427 A1 (VOULAND ERIC et al.) 20.12.2007, claims. 1-18

X X: WO 2007122179 A1 (DIANA NATURALS et al.) 01.11.2007, página 12; reivindicaciones. 1-18 WO 2007122179 A1 (DIANA NATURALS et al.) 01.11.2007, page 12; claims. 1-18

X X: US 20030091652 A1 (BIOCELL TECHNOLOGY LLC) 15.05.2003, reivindicaciones. 1-18 US 20030091652 A1 (BIOCELL TECHNOLOGY LLC) 05.15.2003, claims. 1-18

Categor�a de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones n�: This report has been prepared • for all claims • for claims no:

Fecha de realización del informe 25.01.2013 Date of realization of the report 25.01.2013: Examinador J. Manso Tomico Página 1/4 Examiner J. Manso Tomico Page 1/4

REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE

Application number: 201131526

Minimum documentation sought (classification system followed by classification symbols) A61K Electronic databases consulted during the search (name of the database and, if possible, terms of

search used) INVENES, EPODOC, wpi, embase, biosis, npl

State of the Art Report Page 2/4

WRITTEN OPINION

Application number: 201131526

Date of Completion of Written Opinion: 01.25.2013

Statement

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986): Reivindicaciones 1-18 Reivindicaciones SI NO Claims 1-18 Claims IF NOT

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986): Reivindicaciones Reivindicaciones 1-18 SI NO Claims Claims 1-18 IF NOT

The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was evaluated during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986).

Opinion Base.-

This opinion has been made on the basis of the patent application as published.

State of the Art Report Page 3/4

WRITTEN OPINION

Application number: 201131526

1. Documents considered.-

The documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion are listed below.

Documento Document: Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date

D01 D01: GB 1041172 A (BALASSA LESLIE L) 01.09.1966 GB 1041172 A (BALASSA LESLIE L) 01.09.1966

D02 D02: US 3400199 A (BALASSA LESLIE L) 03.09.1968 US 3400199 A (BALASSA LESLIE L) 03.09.1968

D03 D03: WO 9716197 A1 (AETERNA LAB INC) 09.05.1997 WO 9716197 A1 (AETERNA LAB INC) 05.09.1997

D04 D04: US 2007293427 A1 (VOULAND ERIC et al.) 20.12.2007 US 2007293427 A1 (VOULAND ERIC et al.) 20.12.2007

D05 D05: WO 2007122179 A1 (DIANA NATURALS et al.) 01.11.2007 WO 2007122179 A1 (DIANA NATURALS et al.) 01.11.2007

D06 D06: US 20030091652 A1 (BIOCELL TECHNOLOGY LLC) 15.05.2003 US 20030091652 A1 (BIOCELL TECHNOLOGY LLC) 05.15.2003

2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulations for the execution of Law 11/1986, of March 20, on Patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement

The present application discloses a cartilage product, its method of obtaining and its use for the treatment or prevention of skin conditions. Claims 1-10 characterize the process of obtaining the product by comprising steps of: grinding, deproteinization and hydrolysis of cartilage. Claims 11-16 characterize the cartilage product obtained by the percentages of the components thereof. Claims 17 and 18 characterize the use of the cartilage product for different skin conditions. D01 discloses the preparation of cartilage through a process of proteolysis and grinding thereof. Thus, the product obtained is used in wound healing, among others of the skin. D02 discloses obtaining a cartilage product from bovine tracheal tissue for the treatment of wounds. D03 discloses a procedure for obtaining a soluble cartilage extract containing water-soluble active components present in the original shark cartilage. The product obtained is used for the treatment of skin diseases. D04 to D06 characterize different cartilage products according to their different composition. None of the documents of the prior art disclose a procedure for obtaining cartilage identical to that of the object of the invention, nor a cartilage product with the same components and their percentages as it appears in the present invention. Thus, the present application would meet the requirement of novelty as mentioned in art. 6 of Law 11/1986. Taking D01 as the state of the art document closest to the object of the invention, the difference between this document and the object of the invention would be the particular conditions used in the milling, deproteinization and hydrolysis, filtering and drying stages. to get a cartilage product. The technical effect of this difference would be to obtain a cartilage product suitable for use as a functional composition in the treatment of wounds and skin conditions. However, this technical effect of cartilage is already well known in the state of the art as there are several documents that disclose the use of cartilage for wound healing, specifically cutaneous. The healing effects of cartilage, due to its content in collagen, hyaluronic acid and other components, are known in the state of the art, so that the provision of different procedures for obtaining cartilage products is considered as obvious alternatives for The subject matter expert. Nowhere in this application is the greater therapeutic or preventive capacity of this cartilage product compared to other existing cartilage products demonstrated, nor that such capacity is due, in particular to one of the cartilage components obtained by the claimed process . For all the foregoing, the present invention lacks inventive activity as mentioned in art. 8 of Law 11/1986.

State of the Art Report Page 4/4