ES2358903T3 - Procedimiento para el diagnóstico de enfermedades mediante la determinación de apolipoproteína c-i. - Google Patents
Procedimiento para el diagnóstico de enfermedades mediante la determinación de apolipoproteína c-i. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2358903T3 ES2358903T3 ES04764908T ES04764908T ES2358903T3 ES 2358903 T3 ES2358903 T3 ES 2358903T3 ES 04764908 T ES04764908 T ES 04764908T ES 04764908 T ES04764908 T ES 04764908T ES 2358903 T3 ES2358903 T3 ES 2358903T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- apolipoprotein
- sample
- patients
- diseases
- samples
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010076807 Apolipoprotein C-I Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000011772 Apolipoprotein C-I Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 claims description 57
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 claims description 57
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 8
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 238000012954 risk control Methods 0.000 claims description 3
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 abstract description 34
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 abstract 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 abstract 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 27
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 11
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 10
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 4
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 4
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 4
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 3
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 3
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 2
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102000014190 Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010011964 Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 241001316595 Acris Species 0.000 description 1
- 108010024284 Apolipoprotein C-II Proteins 0.000 description 1
- 108010056301 Apolipoprotein C-III Proteins 0.000 description 1
- 102000030169 Apolipoprotein C-III Human genes 0.000 description 1
- 102000018655 Apolipoproteins C Human genes 0.000 description 1
- 108010027070 Apolipoproteins C Proteins 0.000 description 1
- 208000012639 Balance disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010006417 Bronchial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 101000928628 Homo sapiens Apolipoprotein C-I Proteins 0.000 description 1
- 101000666934 Homo sapiens Very low-density lipoprotein receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 102000057248 Lipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 108010033266 Lipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100039066 Very low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003362 bronchogenic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000000119 electrospray ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000011141 high resolution liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000055379 human APOC1 Human genes 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000008604 lipoprotein metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008560 physiological behavior Effects 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/775—Apolipopeptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Procedimiento para el diagnóstico, la detección precoz, la valoración del riesgo y el control de la evolución de enfermedades cancerosas, caracterizado por el hecho de que - en una muestra de suero o plasma de un paciente humano se determina aquella porción de la apolipoproteína C-I total que está presente en una muestra y que (I) es detectable mediante determinación directa mediante un inmunoensayo tipo sándwich ("inmunorreactividad de apolipoproteína C-I") y (II) cuyo valor de medición no se ve reducido o no se ve significantemente reducido mediante tratamiento de la muestra con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas, y - de que se deduce la existencia de una enfermedad cancerosa cuando - la inmunorreactividad de apolipoproteína C-I en la muestra está incrementada en comparación con las personas de control sanas y la porción de apolipoproteína C-I que se une a estructuras moleculares hidrofóbicas está significantemente reducida en comparación con las personas de control sanas, de forma tal que - la concentración de apolipoproteína C-I determinada directamente en la muestra con el inmunoensayo y la concentración de apolipoproteína C-I en aquella muestra que fue tratada con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas presentan valores equiparables.
Description
La presente invención se refiere a los procedimientos para el diagnóstico, la detección precoz, la valoración del riesgo y el control de la evolución de enfermedades en los que se determina en muestras de suero o plasma de pacientes humanos como biomarcador la proteína apolipoproteína C-I.
Hay que señalar como premisa que cuando en la siguiente descripción se habla en general de “procedimientos 5 diagnósticos”, este concepto representa por regla general y para simplificar a los procedimientos para el diagnóstico, la detección precoz, la valoración del riesgo y el control de la evolución, incluyendo a un control de la evolución como acompañamiento a la terapia, de enfermedades, a no ser que se desprenda del contexto en concreto que se haga en ese sitio referencia tan sólo a mediciones que persigan específicos objetivos limitados.
Además hay que observar que en el contexto de la presente solicitud el concepto de “enfermedades” se usa para 10 enfermedades por regla general severas y crónicas y en particular agudas, y no se refiere a trastornos del lipometabolismo como los que se consideran como factores de riesgo para el desarrollo de una aterosclerosis. Son de destacar como “enfermedades” las enfermedades cancerosas.
Se califican de “apolipoproteínas” las proteínas que forman las lipoproteínas junto con lípidos (triglicéridos, colesterol, fosfolípidos). Una función importante de las apolipoproteínas es la de permitir el transporte de los lípidos hidroinsolubles 15 en el suero y el plasma. Las lipoproteínas se clasifican sobre la base de su comportamiento de migración en el gradiente de densidad de una ultracentrífuga en cuatro distintas clases de densidad: los quilomicrones, las VLDL (de: very low-density lipoproteins = lipoproteínas de muy baja densidad), las LDL (de: low-density lipoproteins = lipoproteínas de baja densidad) y las HDL (de: high-density lipoproteins = lipoproteínas de alta densidad). Adicionalmente se distingue un grupo denominado lipoproteína (a). La porción de lípidos de las lipoproteínas es tanto más baja cuanto más alta es su 20 densidad. Las lipoproteínas de las distintas clases de densidad no se diferencian sobre la base de la cantidad de la porción de lípidos total existente, sino también considerando su composición. Además pueden asignarse a las respectivas clases de densidad también típicos perfiles de apolipoproteínas.
Las apolipoproteínas son proteínas de distinta longitud y composición de aminoácidos que se asignan a grupos denominados con las letras mayúsculas A-H, distinguiéndose de nuevo dentro de los distintos grupos entre distintas 25 proteínas que se caracterizan mediante un número añadido. En lugar de la designación completa de p. ej. apolipoproteína A-I ha adquirido carta de naturaleza también hablar sencillamente tan sólo de apo A-I. Las estructuras primarias (las secuencias de aminoácidos) de las distintas apolipoproteínas son conocidas, y para una serie de las distintas apolipoproteínas existen también datos o ideas concretas sobre su estructura espacial, en particular en asociación con lípidos. Pueden sacarse datos más concretos de la correspondiente literatura científica. 30
Es conocida la técnica de determinar también selectivamente apolipoproteínas en relación con la obtención de datos de medición sobre el lipometabolismo de un paciente, en particular para la detección precoz de un riesgo de aterosclerosis o bien para el control de la terapia en el tratamiento de un paciente con medicamentos lipidorreductores. Al hacer esto se aprovecha la circunstancia de que determinadas apolipoproteínas surgen exclusivamente o al menos preponderantemente en lipoproteínas de las distintas clases de densidad de lipoproteínas anteriormente mencionadas y 35 determinan su especificidad, con lo cual mediante una determinación de la porción de apolipoproteína de las lipoproteínas también puede determinarse la porción de éstas últimas en un suero o plasma de un paciente.
Es también sabido que en determinados pacientes y debido a considerables influencias que influencian la formación de las apolipoproteínas o de las enzimas que las disocian, o que se manifiestan como defectos de los receptores, se encuentran perfiles de lipoproteínas y apolipoproteínas que se desvían de los normales. Es además sabido que también 40 como acompañamiento a otras enfermedades pueden producirse trastornos del lipometabolismo (dislipoproteinemias secundarias) que son de naturaleza temporal y tras la curación de la enfermedad desaparecen de nuevo (véase (20), páginas 186-189; las referencias a la literatura en forma de números entre paréntesis se refieren a la bibliografía adjunta). En la medida en que las modificaciones del lipometabolismo se manifiestan también como modificaciones de las composiciones de apolipoproteínas, en la literatura científica están documentadas en primera línea aquellas 45 modificaciones que afectan a las apolipoproteínas A-I y A-II y que por regla general reflejan formas y concentraciones anormales de las HDL. Las apolipoproteínas no desempeñan sin embargo papel práctico digno de mención alguno como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades para las que es sabido que van también acompañadas de trastornos del lipometabolismo.
En el marco de la presente solicitud se trata de la determinación de la apolipoproteína C-I a efectos diagnósticos. La 50 apolipoproteína C-I pertenece a un grupo de apolipoproteínas con un peso molecular comparativamente bajo, que se denominan apolipoproteínas apo C-I, apo C-II y apo C-III. Las estructuras primarias de estas tres proteínas son conocidas (véanse (1), (2) y, con respecto a la apolipoproteína C-I, en particular (3)). Sobre la función de las apolipoproteínas C-I y C-III se sabe relativamente poco, y sobre las modificaciones de las cantidades y las formas y las formas de asociación de la apolipoproteína C-I en el suero o el plasma humano en dependencia de determinados 55 estados de enfermedad no hay conocimientos documentados de tipo alguno. Son representativas de las publicaciones de la literatura científica que se refieren a las apolipoproteínas del grupo C o a la apolipoproteína C-I publicaciones según (1) a (18), proporcionando en particular el trabajo según (11) una buena visión de conjunto de lo que es sabido sobre el papel que desempeñan las apolipoproteínas C en el metabolismo de las lipoproteínas. Pertenecen a los efectos
biológicos descritos para la apolipoproteína C-I en primera línea la inhibición de la proteína transportadora de ésteres de colesterol (CETP), la amortiguación de la proteína (LRP) relacionada con el receptor de las LDL (LDLR) y del propio LDLR y del receptor de las VLDL (VLDLR), así como la activación de la lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT).
Del contenido de las publicaciones anteriormente mencionadas no son deducibles conocimientos que pudiesen permitir una determinación de apolipoproteína C-I como biomarcador para el diagnóstico de enfermedades tales como p. ej. la 5 sepsis o el cáncer, o que pudiesen sugerir la conveniencia de una determinación de apolipoproteína C-I en los contextos diagnósticos anteriormente mencionados.
La presente invención es el resultado de sistemáticos trabajos de investigación de la solicitante que tienen como objetivo investigar las modificaciones de la composición de proteínas de pacientes con sepsis y hacer selectivamente uso de los resultados obtenidos de la investigación para la diagnosis de sepsis y de inflamaciones. 10
Fue punto de partida de estas investigaciones la constatación de que en la sepsis la prohormona procalcitonina está drásticamente incrementada y de que la determinación de procalcitonina como biomarcador para sepsis para el diagnóstico y para el control evolutivo como acompañamiento a la terapia es de alto valor práctico (véase p. ej. la EP 656 121 B1). Conocimientos de mayor alcance sobre la modificación de la composición de proteínas en el suero o plasma de pacientes de sepsis, que fueron obtenidos por la solicitante partiendo de distintos planteamientos de 15 investigación, se encuentran por ejemplo en la publicación de solicitud de patente EP 1 121 600 A2, así como en adicionales publicaciones de solicitudes de patente de fecha anterior, tales como los documentos WO 02/085937, WO 03/005035, WO 03/002600, EP 1 355 158 A1, EP 1 318 406 A1, EP 1 318 407 A1 y EP 1 355 159 A1, y en adicionales solicitudes de patente aún no publicadas de la solicitante sobre este tema. Se hace referencia al contenido de las mencionadas solicitudes de patente en particular con respecto a las aclaraciones sobre la moderna comprensión del 20 concepto de sepsis y a la importancia de la determinación de biomarcadores en caso de sepsis.
Puesto que algunas de las investigaciones habían puesto de manifiesto que en caso de sepsis están también significantemente incrementados los de una serie de biomarcadores que tradicionalmente habían venido siendo considerados tan sólo como típicos marcadores de cáncer (véanse los documentos EP 1 318 402 A1, EP 1 318 403 A1, EP 1 318 404 A1 y EP 1 318 405 A1), fueron de manera creciente y paralelamente al análisis de muestras de pacientes 25 de sepsis también tomadas en consideración muestras de plasma y suero de pacientes que padecían de distintas enfermedades tumorales malignas. En muchos de los casos investigados se puso de manifiesto que distintos biomarcadores que se encuentran incrementados en caso de sepsis están también significantemente incrementados en pacientes de cáncer. En numerosos casos quedaron sin embargo también de manifiesto claras diferencias que impiden tratar según un enfoque simplista y en general como básicamente análogas a las enfermedades de sepsis y a las 30 enfermedades tumorales malignas.
La invención que se describe en la presente solicitud es resultado de otro planteamiento de investigación para la determinación de proteínas que son potencialmente adecuadas como biomarcadores a efectos diagnósticos, porque sus cantidades mensurables en pacientes de sepsis y dado el caso en pacientes que padecen de otras enfermedades graves, y en particular de enfermedades inflamatorias o de enfermedades cancerosas, están significantemente 35 incrementadas en comparación con las personas sanas. Se compararon para ello perfiles de HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución) de fracciones de suero y plasma de pacientes de sepsis con los de personas normales aparentemente sanas, y las significantes modificaciones de los perfiles de cromatografía HPLC fueron sometidas a un más detenido examen. Estas investigaciones proporcionaron los resultados que pasaron a constituir la base de la presente invención, concretamente en el sentido de que son detectables significantes 40 modificaciones de los perfiles de elución por HPLC de muestras de suero o plasma de pacientes, cuando estas muestras fueron previamente fraccionadas por medio de una columna con un material cromatográfico que está en condiciones de entrar en interacción con componentes hidrofóbicos y lipofílicos de la muestra y de fijar selectivamente tales componentes (“cromatografía de interacción hidrofóbica”). Si a continuación se eluyen de manera adecuada los componentes de la muestra que se ha presentado que han quedado fijados al material cromatográfico, se obtiene una 45 subfracción de la muestra de suero o plasma original en la que hay un selectivo enriquecimiento en componentes, y en particular también en los de naturaleza proteínica, que están en condiciones de entrar en interacción con superficies hidrofóbicas. Está descrita en (19) una variante de un procedimiento de este tipo en aplicación a lipoproteínas.
En la US 2001/0005714 A1 se propone aprovechar el hecho de que las apolipoproteínas presentan en su estructura segmentos anfipáticos para inhibir la absorción de colesterol y otros lípidos desde el intestino, usando como 50 medicamentos apolipoproteínas u otras moléculas con estructuras antipáticas que se asemejan a las apolipoproteínas. Para el aislamiento de apolipoproteínas a partir de fuentes naturales se usa la cromatografía de interacción hidrofóbica.
La solicitud WO 03/076594 publica métodos para diagnosticar y tratar enfermedades cancerosas detectando y eventualmente reactivando genes (supresores tumorales) epigenéticamente desactivados. Uno de los 58 genes (supresores tumorales) epigenéticamente desactivados identificados es el de la apo C-I. La WO 03/076594 (párrafos 55-55 57) correlaciona a las de una serie de distintas enfermedades cancerosas con tales genes (supresores tumorales) epigenéticamente desactivados, entre los cuales está también el gen de la apo C-I.
La separación de tales fracciones de plasmas y sueros de pacientes con sepsis y otras enfermedades mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) proporcionó el sorprendente conocimiento en el que se basa la
presente invención y que consiste en que en los sueros de pacientes con sepsis y de otros pacientes determinados está marcadamente reducido o bien falta aparentemente del todo un componente que se encuentra de manera claramente destacada en los sueros y plasmas de personas normales sanas. Las investigaciones que a continuación se efectuaron sobre la naturaleza de este componente, que serán descritas más detalladamente a continuación, hicieron patente que en cuanto al componente significantemente reducido se trata de la apolipoproteína C-I. Las adicionales investigaciones 5 que se efectuaron a continuación y que se describen asimismo más detalladamente de aquí en adelante, condujeron entonces a la obtención del adicional y sorprendente resultado de que los hallazgos que en una primera valoración provisional hablaban a favor de un paralelismo de las modificaciones en los pacientes de sepsis y de cáncer, en realidad deben delimitarse claramente entre sí y permiten, mediante la medición de apolipoproteína C-I en el suero o plasma de pacientes humanos, distinguir claramente las enfermedades de sepsis de las enfermedades cancerosas, lo cual 10 representa como tal un conocimiento del que puede hacerse uso a efectos diagnósticos.
Puede expresarse como finalidad de la presente invención la de descubrir y utilizar a efectos diagnósticos un nuevo biomarcador proteínico adecuado para determinaciones diagnósticas para la detección de enfermedades cancerosas, cuya aparición cuantitativa en suero o plasma humano se diferencie de la manera siguiente de los valores hallados en personas normales aparentemente sanas: La inmunorreactividad de apolipoproteína C-I está incrementada en la 15 muestra en comparación con las personas de control sanas y la porción de apolipoproteína C-I que se une a estructuras moleculares hidrofóbicas está significantemente reducida en comparación con las personas de control sanas, de forma tal que la concentración de apolipoproteína C-I determinada directamente en la muestra con un inmunoensayo y la concentración de apolipoproteína C-I en la muestra que fue tratada con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas presentan valores equiparables; representando su determinación por consiguiente una valiosa herramienta 20 diagnóstica.
Esta finalidad es alcanzada mediante un procedimiento según la reivindicación 1.
Están indicados en las reivindicaciones dependientes perfeccionamientos preferidos.
Cuando en la presente solicitud o en las reivindicaciones se mencionan como especies a determinar además de la apolipoproteína C-I también “sus derivados”, deben entenderse como tales en particular fragmentos y agregados, y en 25 particular aquéllos que en el respectivo procedimiento de determinación elegido se comportan como la proteína apolipoproteína C-I libre. Los “derivados” pueden ser p. ej. moléculas de apolipoproteína C-I acortadas en distintos aminoácidos o distintas secuencias de aminoácidos, o bien también moléculas de apolipoproteína C-I completas modificadas estérica o conformacionalmente, p. ej. por agregación.
Los nuevos conocimientos, que permiten el uso de apolipoproteína C-I como biomarcador, indican que en pacientes que 30 padecen de enfermedades cancerosas la cantidad detectable de apolipoproteína C-I que se une a estructuras moleculares hidrofóbicas está fuertemente reducida en comparación con las personas normales aparentemente sanas. Puede sacarse de ello la conclusión de que en las enfermedades mencionadas la indicada apolipoproteína C-I es formada o consumida en cantidades insuficientes y/o fijada anormalmente, lo cual en comparación con las personas sanas puede interpretarse como insuficiencia de apolipoproteína C-I. 35
Todas las circunstancias y enseñanzas o proteger que se describen al comienzo y en las reivindicaciones a las que se hace referencia se aclaran más detalladamente a continuación haciendo referencia a datos experimentales y a las correspondientes figuras, aclarándose también al mismo tiempo complementariamente el significado de distintos conceptos que se usan en la presente descripción. Para la interpretación de las reivindicaciones y para precisar lo expuesto hasta aquí en general se hace por consiguiente explícitamente referencia a lo que se expone a continuación. 40
Las distintas figuras muestran lo siguiente:
La Fig. 1, los perfiles de elución de la HPLC de C18 en fase inversa de fracciones de suero y plasma que eran eluibles con ácido acético (50mM) desde columnas cromatográficas de octilsefarosa que habían sido cargadas con sueros y plasmas de (a) personas normales aparentemente sanas, (b) pacientes con distintas enfermedades tumorales malignas y (c) de pacientes de sepsis, tras un lavado intermedio de las columnas cargadas con solución salina tamponada con 45 fosfato (PBS);
la Fig. 2, las cantidades relativas de apolipoproteína C-I eluible obtenidas mediante integración de picos de perfiles de elución por HPLC del tipo que se muestra en la Fig. 1 en muestras de personas normales aparentemente sanas y de pacientes que padecían de enfermedades de distintos tipos (sepsis, tumor, infarto de miocardio, angina de pecho, enfermedades de obturación arterial, enfermedad de Crohn, enfermedad de Basedow, tiroiditis autoinmune, diabetes 50 tipo I, diabetes tipo II, artritis reumatoidea, enfermedad de Alzheimer, sueros HIV positivos; diagnósticos respectivamente asegurados clínica e independientemente);
la Fig. 3, la curva patrón de un inmunoensayo en sándwich que trabaja con dos anticuerpos anti-apolipoproteína C-I policlonales purificados por afinidad, como la que es obtenida usando apolipoproteína C-I sintética como patrón;
la Fig. 4, los resultados de la determinación directa de apolipoproteína C-I en sueros y plasmas de personas normales 55 aparentemente sanas, pacientes de sepsis y pacientes tumorales mediante el uso de un inmunoensayo en sándwich para la apolipoproteína C-I, del cual se muestra una típica curva de ajuste en la Fig. 3, y
la Fig. 5, los resultados de una repetición de las mediciones cuyos resultados se muestran en la Fig. 4, después de haber sido las respectivas muestras tratadas con octilsefarosa.
Descripción de los ensayos realizados y de los resultados obtenidos
A. ANÁLISIS CROMATOGRÁFICOS
1. Obtención de fracciones de suero o plasma que contienen los componentes de suero/plasma humano que se fijan a 5 superficies hidrofóbicas y son eluibles de las mismas.
Muestras de respectivamente 0,5 ml de sueros/plasmas de personas normales aparentemente sanas y de pacientes que padecían de una serie de enfermedades diagnosticadas clínica e independientemente fueron mezcladas con 0,5 ml de material cromatográfico de octilsefarosa (fuente de adquisición: Pharmacia; 0,25 ml de material empaquetado, lavado en PBS) en PBS e incubadas por espacio de 10 min. a temperatura ambiente y con ligera agitación. A continuación se 10 introdujo la mezcla en una columna de polipropileno (de 5 mm de diámetro), y mediante lavado con 20 ml de PBS las sustancias no fijadas fueron separadas de las sustancias fijadas al material de octilsefarosa.
La desorción de las sustancias (proteínas) fijadas al material de octilsefarosa se hizo mediante elución con ácido acético 50mM (pH 2,5).
2. HPLC de C18 en fase inversa 15
El eluido con ácido acético obtenido de las columnas de octilsefarosa fue en cada caso analizado directamente mediante HPLC de C18 en fase inversa por medio de una columna μ Bondapak C18 (3,9 x 300 mm, Millipore, Waters).
Para la cromatografía HPLC se usaron gradientes de un eluyente A (mezcla de 95 partes volumétricas de agua, 5 partes volumétricas de acetilonitrilo y 0,1 partes volumétricas de ácido trifluoroacético) y de un eluyente B (10 partes volumétricas de agua, 90 partes volumétricas de acetilonitrilo, 0,1 partes volumétricas de ácido trifluoroacético). 20
Tras la aplicación del eluido con ácido acético a la columna de HPLC se hizo el análisis en el siguiente gradiente de eluyente A/eluyente B:
t = 0-5 min. de 100/0 (A/B) a 65/35 (A/B)
t = 5-20 min. de 65/35 (A/B) a 40/60 (A/B)
t = 20-22 min. de 40/60 (A/B) a 0/100 (A/B). 25
La velocidad de paso fue de 1 ml/min. El flujo de salida de la columna fue medido continuamente con respecto a la absorción a 214 nm.
La Fig. 1 muestra tres típicos perfiles de elución para fracciones de muestras de pacientes normales aparentemente sanos (a), de pacientes con distintas enfermedades tumorales (b), y de pacientes con sepsis (c).
Se puso sorprendentemente de manifiesto que los perfiles de elución por HPLC de los grupos de personas 30 mencionados se diferencian clara y sistemáticamente entre sí. La banda decisiva para la presente solicitud es aquélla que es eluida a los 17,05 min.
Esta banda fue cuantificada relativamente mediante integración del pico para todas las muestras de suero y plasma analizadas, y las cantidades relativas de sustancia determinadas de esta manera para una pluralidad de muestras de control y de pacientes están representadas gráficamente en la Fig. 2. Se analizaron en concreto las muestras 35 siguientes:
42 muestras de pacientes tumorales (9 x cáncer intestinal, 7 x carcinoma bronquial, 13 x carcinoma de mama, 8 x carcinoma ovárico, 5 x carcinoma de páncreas), 22 muestras de pacientes con sepsis, 7 muestras de pacientes con infarto de miocardio (Hi), 4 muestras de pacientes con angina de pecho (APe), 5 muestras de pacientes con enfermedades de obturación arterial (AVK), 6 muestras de pacientes con enfermedad de Crohn (MC), 11 muestras de 40 pacientes con enfermedad de Basedow, 4 muestras de pacientes con tiroiditis autoinmune (AIT), 10 muestras de pacientes con diabetes tipo I (D-Typ 1), 6 muestras de pacientes con diabetes tipo II (D-Typ II), 3 muestras de pacientes con artritis reumatoidea (RA), 2 muestras de pacientes con Alzheimer (AD) y 6 muestras de pacientes HIV-positivos.
Como se desprende inmediatamente de la Fig. 2, para las muestras de personas normales sanas se hallan valores claramente positivos para la sustancia que corresponde al pico medido a los 17,05 min. En las muestras de pacientes 45 enfermos, y concretamente muy en particular con claridad en las muestras de pacientes con sepsis, pacientes tumorales, pacientes con las afecciones cardíacas manifiestas/agudas (Hi, APe, AVK), así como pacientes con enfermedad de Crohn, se miden porciones muy significantemente reducidas de la misma sustancia. También para pacientes con diabetes tipo I y diabetes tipo II se hallan valores significantemente reducidos, si bien no en igual medida, en comparación con las personas sanas. Para los pacientes con enfermedad de Basedow, tiroiditis autoinmune, artritis 50 reumatoidea y enfermedad de Alzheimer, así como para los pacientes HIV-positivos, las correspondientes desviaciones
de la concentración son menores, o sea que no son estadísticamente significantes.
Están resumidos en la tabla siguiente los valores medios de las cantidades relativas halladas obtenidos para los distintos grupos de muestras:
- Clase de muestra
- Media (unidades de absorción relativas)
- Controles Sepsis Tumor Infarto de miocardio Angina de pecho Enfermedades de obturación arterial Enfermedad de Crohn Enfermedad de Basedow Tiroiditis autoinmune Diabetes tipo I Diabetes tipo II Artritis reumatoidea Alzheimer HIV-positivos
- 640 30 80 80 140 80 80 320 1130 180 200 1130 440 480
3. Identificación de las bandas usadas para la caracterización de las muestras (bandas eluidas a los 17,5 min.) 5
Para la identificación se recogió, se secó (speed vac) y se sometió a análisis de péptidos la sustancia eluida correspondiente a estas bandas. En un análisis de secuencia del terminal N fue determinada la secuencia TPDVS. El peso molecular determinado mediante espectro de masas (ESI MS) (ESI MS = espectro de masas por ionización por electronebulización) es de 6630 ± 15 D. Estos resultados estaban en inequívoca correlación con los datos conocidos para la apolipoproteína C-I humana (véase p. ej. (3)), que presenta la secuencia de péptidos según la ID SEC Nº 1 10 (véase también el Nº 3660227 de Accesión a la base de datos SWISS PROT) y presenta un peso molecular teórico de 6627 D.
Tras la digestión con tripsina de la sustancia y la subsiguiente espectroscopia de masas (ESI MS; “Trypsin-Fingerprinting”) quedó plenamente confirmada la correspondencia establecida.
A la apolipoproteína C-I determinable trabajando cromatográficamente de la manera que se ha descrito se la denomina 15 también dentro del marco de la presente solicitud “apolipoproteína C-I libre”. Dicha apolipoproteína presenta las propiedades de unirse desde una muestra de suero o plasma (en dilución en PBS) a estructuras moleculares hidrofóbicas, como p. ej. los residuos octilo de un material cromatográfico hidrofóbico de octilsefarosa, del cual puede ser eluida bajo condiciones típicas de la elución de proteínas, en particular con ácido acético diluido. El uso del concepto de “apolipoproteína C-I libre” no significa sin embargo necesariamente que el material separable mediante cromatografía 20 de interacción hidrofóbica tenga que estar en forma totalmente libre en las muestras originales. Los asociados o agregados, también con lípidos, que bajo las condiciones de ensayo se disgreguen al establecer contacto con octilsefarosa con unión de la apolipoproteína C-I al material cromatográfico, deben asimismo considerarse como “apolipoproteína C-I” en el sentido del uso de este concepto en la presente solicitud.
Con ello, las “estructuras moleculares hidrofóbicas” pueden también ser partes de la superficie de un material 25 cromatográfico hidrofóbico. Dichas estructuras moleculares hidrofóbicas pueden sin embargo también ser moléculas individuales con regiones estructurales hidrofóbicas por medio de las cuales pueda producirse una unión de una molécula de este tipo a apolipoproteína C-I, o sea que pueden ser p. ej. moléculas con estructuras hidrofóbicas que puedan ser marcadas y que p. ej. en ensayos homogéneos puedan servir para la marcación de apolipoproteína C-I en un líquido de muestra. Existe la capacidad de unión a “estructuras moleculares hidrofóbicas” cuando las regiones de la 30 apolipoproteína C-I de la muestra que están disponibles para una unión de este tipo no están bloqueadas por otras sustancias, como p. ej. los lípidos de las lipoproteínas. Incluso cuando p. ej. se habla de que se determinan aquellas porciones de apolipoproteína C-I que se unen a octilsefarosa, esto no significa que para la determinación tenga que utilizarse realmente una unión a octilsefarosa. Antes bien, una indicación de este tipo debe entenderse como caracterización de la sustancia a determinar, también cuando ésta sea determinada según procedimientos del todo 35 distintos. P. ej., la correspondiente apolipoproteína C-I puede ser la misma que también se determina mediante un inmunoensayo, como se describe a continuación.
B. DETERMINACIONES INMUNODIAGNÓSTICAS DIRECTAS DE APOLIPOPROTEÍNA C-I EN SUEROS/PLASMAS
1. Inmunoensayo de la apolipoproteína C-I
Para la determinación inmunodiagnóstica directa de apolipoproteína C-I en suero se construyó un inmunoensayo del tipo sándwich a partir de los componentes que se describen a continuación:
a) Tubos recubiertos: Tubitos de poliestireno (Greiner) fueron recubiertos con un anticuerpo policlonal purificado por 5 afinidad contra la apolipoproteína C-I de los que están disponibles comercialmente (fuente de adquisición: Acris Antibody, de Bad Neuheim, Alemania). El anticuerpo había sido obtenido según las indicaciones del fabricante mediante inmunización de conejos con apo C-I humana y había sido purificado por medio de una columna de afinidad de sefarosa con apolipoproteína C-I humana. Para el recubrimiento fueron unidos 0,2 μg de anticuerpo en 300 μl de PBS a tubitos de poliestireno (Greiner, Alemania) que estaban recubiertos con anticuerpos IgG de cordero anti-conejo (Sigma). La 10 unión quedó concluida tras 18 horas a temperatura ambiente. Los tubitos fueron a continuación lavados 2 veces con 3 ml de albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5% en PBS cada vez. Tras su secado en vacío los tubitos fueron usados como fase estacionaria para el inmunoensayo de la apolipoproteína C-I.
b) Anticuerpo marcado con éster de acridinio: 100 μg de otro anticuerpo contra la apolipoproteína C-I humana (de conejo; fuente de adquisición: Academie Bio-Medical Company, de Texas, EE.UU.) en 100 μl de PBS fueron 15 transformados con 10 μg de HNS-éster de acridinio (en 10μl de acetonitrilo). Tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente se hizo la purificación del anticuerpo marcado separando los componentes no transformados de la mezcla de reacción mediante HPLC en SW 300 (Waters). Para su uso en el inmunoensayo, el anticuerpo marcado fue ajustado a aprox. 1 millones de RLU/300 μl (RLU = unidades relativas de luz) en PBS con un 0,5% de BSA y 1 mg/ml de IgG de conejo para la saturación de las paredes de los tubitos. 20
2. Realización de la determinación inmunodiagnóstica de apolipoproteína C-I en muestras de suero y plasma
Muestras de suero y plasma fueron diluidas a 1:10.000 con PBS y BSA al 0,5%. En cada caso 300 μl de ello fueron pipetados al interior de los tubitos anteriormente mencionados recubiertos con el anticuerpo inmovilizado, y fueron a continuación incubados por espacio de 4 horas a temperatura ambiente bajo agitación (300 rpm en un agitador orbital Heidolph). El contenido de los tubitos fue a continuación lavado con PBS (efectuando 4 veces llenado y decantación con 25 1 ml de PBS cada vez), y la apolipoproteína C-I fijada a la pared del tubito fue transformada por espacio de 20 horas a temperatura ambiente y a 300 rpm con 300 μl por tubito del anticuerpo anti-apolipoproteína C-I marcado con éster de acridinio. A continuación fue retirado el anticuerpo marcado no fijado mediante 5 lavados con 1 ml de PBS cada vez, y la quimioluminiscencia restante fue medida de manera conocida en un luminómetro Berthold 952 T.
Para la calibración del ensayo se usó una apolipoproteína C-I sintética. Se muestra en la Fig. 3 una típica curva patrón 30 como la que es obtenida para el ensayo anteriormente descrito.
3. Resultados
Con ayuda del inmunoensayo tipo sándwich que se ha descrito se procedió a la medición de sueros de control de personas normales aparentemente sanas como los que fueron también utilizados para los análisis cromatográficos, así como de muestras de pacientes con sepsis y de pacientes tumorales. La medición de las muestras de pacientes con 35 sepsis confirmaron en esencia los resultados de los análisis por HPLC, habiéndose obtenido para la apolipoproteína C-I unos valores de medición significantemente reducidos en comparación con las personas normales. En la medición de muestras de pacientes tumorales, para las que en los análisis cromatográficos fueron asimismo determinadas unas concentraciones reducidas, fueron sin embargo obtenidos valores de medición tendencialmente incrementados. Los resultados están representados gráficamente en la Fig. 4. 40
Para verificar la cuestión de si los distintos resultados obtenidos para los pacientes tumorales en las determinaciones cromatográficas por un lado y en las determinaciones inmunodiagnósticas por otro lado se debían al precedente paso de selección mediante cromatográfica de interacción hidrofóbica, las muestras medidas en el inmunoensayo fueron antes de una adicional determinación tratadas con octilsefarosa para la fijación de las porciones de apolipoproteína C-I “libres”. 45
4. Tratamiento de las muestras con octilsefarosa
150 μl de las mismas muestras de suero y plasma que habían sido medidas en el inmunoensayo como se ha descrito fueron mezclados con 200 μl de octilsefarosa (Pharmacia, 50 μl de gel en PBS) e incubados por espacio de 1 hora a temperatura ambiente bajo ligera agitación, después de lo cual la octilsefarosa con las porciones de apolipoproteína C-I fijadas a la misma fue separada mediante centrifugación (15 min. a 2.000 g). El supernatante obtenido fue diluido a 50 1:5.000 en PBS/BSA al 0,5%, y fue a continuación medido en el inmunoensayo como se ha descrito anteriormente.
Se muestran en la Fig. 5 los resultados obtenidos. Puede apreciarse que mediante el tratamiento con octilsefarosa toda la apolipoproteína C-I “libre” que es detectable en la medición con el inmunoensayo tipo sándwich que se ha descrito fue fijada a la octilsefarosa, con lo cual ya no era detectable apolipoproteína C-I alguna en el supernatante. Se hicieron similares observaciones para las muestras de pacientes con sepsis tratadas, ya que la mayor parte de las cantidades de 55
apolipoproteína C-I determinable, ya fuertemente reducidas en comparación con las muestras normales, fue eliminada de la muestra mediante el tratamiento con la octilsefarosa.
Sorprendentemente, la apolipoproteína C-I determinable en un inmunoensayo de la clase que se ha descrito no fue sin embargo eliminada de las muestras de los enfermos tumorales mediante el tratamiento con octilsefarosa.
C. DISCUSIÓN 5
Los resultados que se han descrito demuestran que al menos una gran parte de la apolipoproteína C-I en los sueros y plasmas de pacientes tumorales está en una forma en la que ha perdido su capacidad de fijación a superficies hidrofóbicas, pero sigue siendo determinable como inmunorreactividad en un inmunoensayo. Una posible aclaración para estas observaciones sería la de que en la apolipoproteína C-I que se presenta en los sueros de pacientes tumorales las regiones moleculares que están disponibles para interacciones hidrofóbicas están saturadas o 10 bloqueadas, y concretamente mediante contrapartes de unión que no pueden ser desplazadas por la octilsefarosa. La naturaleza de estas contrapartes de unión es actualmente aún desconocida. No puede sin embargo excluirse la posibilidad de que se trate de sustancias tumor-específicas que como tales o bien debido a la inactivación de contrapartes de unión hidrofóbicas, como p. ej. la apolipoproteína C-I, desempeñan un papel importante para el desarrollo tumoral, p. ej. influenciando negativamente a la respuesta inmune natural o bien promoviendo activamente el 15 crecimiento tumoral. A pesar de que en las muestras analizadas por vía inmunodiagnóstica no es constatable una significante reducción de la porción de apolipoproteína C-I, los análisis cromatográficos paralelos demuestran que la misma no está “libre” en el sentido que se ha expuesto anteriormente, sino que está en otra forma con una reducida capacidad de unión a contrapartes de unión hidrofóbicas. Por el contrario, la apolipoproteína C-I “libre”, es decir la que se une a contrapartes de unión hidrofóbicas, está reducida en los sueros de pacientes tumorales, como en las otras 20 enfermedades, como p. ej. la sepsis.
Sobre la base de los resultados que se han descrito puede presumirse que para pacientes tumorales es ventajoso compensar el trastorno del equilibrio que en los mismos se produce en el sentido de una reducción de la porción de lipoproteína C-I “libre” mediante una aportación externa de apolipoproteína C-I, y que con ello podrá influenciarse positivamente el suceso de enfermedad, p. ej. saturando las contrapartes de unión típicas de tumor mediante 25 apolipoproteína C-I externa y poniendo en disponibilidad apolipoproteína C-I libre adicional.
Una suposición similar, y concretamente la de que una aportación externa de apolipoproteína C-I es ventajosa para compensar la perturbación del nivel de apolipoproteína C-I “libre”, es también válida para las otras enfermedades, como p. ej. es el caso de una sepsis. Si en una sepsis está trastornada la producción de apolipoproteína C-I, una aportación externa puede compensar una insuficiencia debida a ello. Si la reducción de apolipoproteína C-I “libre” en el 30 suero/plasma de un paciente con sepsis es debida a que debido a su unión a estructuras tisulares patológicas o dado el caso a estructuras bacterianas insolubles la apolipoproteína C-I es eliminada de la circulación, una aportación externa de apolipoproteína C-I puede compensar la insuficiencia que se produce, o bien puede ocasionar una saturación de los sitios de unión en el tejido patológico o en las estructuras bacterianas. Mediante una supervisión de la concentración de apolipoproteína libre incrementada mediante la aportación externa o de la apolipoproteína determinable como 35 inmunorreactividad en muestras de sangre del paciente tratado puede supervisarse de manera sencilla la cantidad necesaria en cada caso.
La presente invención hace con ello que sea posible también una nueva clase de utilización terapéutica de la apolipoproteína C-I o de adecuados derivados de la misma o de compuestos que simulen su comportamiento fisiológico para el tratamiento de cáncer, sepsis y otras enfermedades que van ligadas a una reducción de la apolipoproteína C-I 40 libre determinable en comparación con las personas sanas.
Bibliografía:
LISTADO DE SECUENCIAS
Claims (3)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento para el diagnóstico, la detección precoz, la valoración del riesgo y el control de la evolución de enfermedades cancerosas, caracterizado por el hecho de que- en una muestra de suero o plasma de un paciente humano se determina aquella porción de la apolipoproteína C-I total que está presente en una muestra y que (I) es detectable mediante determinación directa 5 mediante un inmunoensayo tipo sándwich (“inmunorreactividad de apolipoproteína C-I”) y (II) cuyo valor de medición no se ve reducido o no se ve significantemente reducido mediante tratamiento de la muestra con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas, y- de que se deduce la existencia de una enfermedad cancerosa cuando- la inmunorreactividad de apolipoproteína C-I en la muestra está incrementada en comparación con las 10 personas de control sanas y la porción de apolipoproteína C-I que se une a estructuras moleculares hidrofóbicas está significantemente reducida en comparación con las personas de control sanas, de forma tal que- la concentración de apolipoproteína C-I determinada directamente en la muestra con el inmunoensayo y la concentración de apolipoproteína C-I en aquella muestra que fue tratada con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas presentan valores equiparables. 15
- 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que para el tratamiento de la muestra con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas se somete a una muestra de suero o plasma a una cromatografía de interacción hidrofóbica en la que se fija al material cromatográfico apolipoproteína C-I libre.
- 3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que como material cromatográfico se usa octilsefarosa. 20
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10343815A DE10343815A1 (de) | 2003-09-22 | 2003-09-22 | Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen unter Bestimmung von Apolipoprotein C-I, und dessen Verwendung in der Therapie von Erkrankungen |
| DE10343815 | 2003-09-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2358903T3 true ES2358903T3 (es) | 2011-05-16 |
Family
ID=34306015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04764908T Expired - Lifetime ES2358903T3 (es) | 2003-09-22 | 2004-09-07 | Procedimiento para el diagnóstico de enfermedades mediante la determinación de apolipoproteína c-i. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20100159492A1 (es) |
| EP (1) | EP1664789B1 (es) |
| JP (1) | JP2007506075A (es) |
| CN (1) | CN1856707A (es) |
| AT (1) | ATE499611T1 (es) |
| DE (2) | DE10343815A1 (es) |
| ES (1) | ES2358903T3 (es) |
| WO (1) | WO2005038461A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT502227B1 (de) * | 2005-08-08 | 2007-08-15 | Vitateq Biotechnology Gmbh | Verfahren zur diagnose von tumoren |
| DE102006056337A1 (de) | 2006-11-29 | 2008-06-05 | B.R.A.H.M.S Ag | In vitro Verfahren zur Diagnose und Frühdiagnose von neurodegenerativen Erkrankungen |
| JP5366234B2 (ja) * | 2007-08-24 | 2013-12-11 | 学校法人関西医科大学 | 扁平上皮がんに対する放射線治療後における予後の予測方法および予後予測用キット |
| KR101431062B1 (ko) * | 2012-03-08 | 2014-08-21 | (주)바이오메디앙 | 유방암 진단용 다중 바이오마커 세트, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트 |
| KR101431063B1 (ko) * | 2012-03-08 | 2014-08-21 | (주)바이오메디앙 | 유방암 진단용 단백질 마커 아포리포단백질 ｃ-1, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트 |
| CN105652019B (zh) * | 2016-02-22 | 2017-10-20 | 西安交通大学 | 一种孤独症血清多肽标志物apoc1‑a及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08178923A (ja) * | 1994-12-21 | 1996-07-12 | Cosmo Sogo Kenkyusho:Kk | リポタンパク質又はアポリポタンパク質の免疫学的測定方法 |
| CN1109047C (zh) * | 1996-03-29 | 2003-05-21 | D·博菲利 | 作为胆固醇和其它脂类摄取抑制剂的两亲分子 |
| CA2366309C (en) * | 1999-03-16 | 2004-11-23 | Serex, Inc. | Method and device for detection of apo a, apo b and the ratio thereof in saliva |
| JP2005532041A (ja) * | 2002-03-07 | 2005-10-27 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー | 後生的に沈黙化された腫瘍抑制遺伝子のゲノムスクリーニング |
| NL1020962C2 (nl) * | 2002-06-28 | 2003-12-30 | Tno | Therapie en prognose/monitoring bij sepsis en septische shock. |
-
2003
- 2003-09-22 DE DE10343815A patent/DE10343815A1/de not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-09-07 WO PCT/EP2004/009965 patent/WO2005038461A1/de active Application Filing
- 2004-09-07 ES ES04764908T patent/ES2358903T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-09-07 JP JP2006526553A patent/JP2007506075A/ja active Pending
- 2004-09-07 CN CNA2004800274133A patent/CN1856707A/zh active Pending
- 2004-09-07 US US10/572,522 patent/US20100159492A1/en not_active Abandoned
- 2004-09-07 AT AT04764908T patent/ATE499611T1/de active
- 2004-09-07 DE DE502004012230T patent/DE502004012230D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-09-07 EP EP04764908A patent/EP1664789B1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE502004012230D1 (de) | 2011-04-07 |
| EP1664789A1 (de) | 2006-06-07 |
| JP2007506075A (ja) | 2007-03-15 |
| WO2005038461A1 (de) | 2005-04-28 |
| ATE499611T1 (de) | 2011-03-15 |
| EP1664789B1 (de) | 2011-02-23 |
| DE10343815A1 (de) | 2005-04-14 |
| CN1856707A (zh) | 2006-11-01 |
| US20100159492A1 (en) | 2010-06-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2250959T3 (es) | Determinacion en un liquido biologico de un peptido parcial de proadrenomedulina de la region media con fines diagnosticos e imnunoensayos para la realizacion de una determinacion de este tipo. | |
| Chi et al. | Assessment of candidate biomarkers in paired saliva and plasma samples from oral cancer patients by targeted mass spectrometry | |
| US7754436B2 (en) | Diagnostic assay for stroke | |
| US20070099242A1 (en) | Lipoprotein-associated markers for cardiovascular disease | |
| ES2271674T3 (es) | Inmunoensayo tipo sandwich para la determinacion de peptidos parciales proanp. | |
| ES2358903T3 (es) | Procedimiento para el diagnóstico de enfermedades mediante la determinación de apolipoproteína c-i. | |
| US5187068A (en) | Method for determination of lipid moiety and apolipoprotein expressed epitope immunoreactivity on intact lipoprotein | |
| Sharma et al. | A comprehensive proteomic profiling of urinary exosomes and the identification of early non-invasive biomarker in patients with coronary artery disease | |
| JP5194000B2 (ja) | 薬剤誘導肝臓損傷及び中毒性物質誘導肝臓損傷の同定及び早期同定並びに治療の同時観察のためのｉｎｖｉｔｒｏ方法 | |
| Rozek et al. | Sera proteomic biomarker profiling in HIV‐1 infected subjects with cognitive impairment | |
| US20100210816A1 (en) | NMDAR Biomarkers for Diagnosing and Treating Cerebral Ischemia | |
| EP3477303A1 (en) | Method and means for diagnosing autoimmune hepatitis using autoantibody markers | |
| EP2859354B1 (en) | Nitrated cardiac troponin i as a biomarker of cardiac ischemia | |
| EP1913396B1 (en) | Method for diagnosing tumors by measuring the level of apolipoprotein a-iv | |
| MXPA06003173A (es) | Metodo para la diagnosis de enfermedades mediante la determinacion de apolipoproteina c-i | |
| WO2015058158A1 (en) | METHOD FOR DETECTION OF LIPOPROTEIN-SPECIFIC Lp-PLA2 ASSOCIATION | |
| US8883428B2 (en) | Methods to determine atherosclerosis regression, plaque stabilization and cardiovascular risk | |
| Harel et al. | MEASUREMENT OF ELASTIN DEGRADATION IN VIVO BY DESMOSINE RADIOIMMUNOASSAY: MESURE DE LA DÉGRADATION DE L'ÉLASTINE IN VIVO PAR DOSAGE RADIO-IMMUNOLOGIQUE DE LA DESMOSINE | |
| JP4795353B2 (ja) | 腫瘍疾患および慢性炎症性腸疾患の診断のための液性バイオマーカーとしてのカルバモイルリン酸合成酵素１（ｃｐｓ１）の使用 | |
| EP2006682B1 (en) | Diagnosis of acute enteritis by determination of intestinal fatty acid-binding protein in the blood | |
| Dayon et al. | Detection of gluten peptides in human duodenal fluids with immuno-liquid chromatography-mass spectrometry | |
| WO2021245413A1 (en) | Methods of determining cancer | |
| CN116263457A (zh) | 与非小细胞肺癌相关的外泌体内蛋白标志物及其应用 | |
| WO2024163454A1 (en) | A duplex electrochemiluminescence immunoassay for total α-synuclein and ps129-α-synuclein | |
| US8012694B2 (en) | Assay for the detection of phosphorylated PTH |