AT502227B1 - Verfahren zur diagnose von tumoren - Google Patents

Description

2 AT 502 227 B1

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors in einem Individuum.

Humanes Apolipoprotein A-IV (ApoA-IV, Swiss Prot Nr. P06727) ist ein 46 kD Plasma-Glykoprotein, das vom Dünndarm und, in viel geringerem Ausmaß, von der Leber synthetisiert wird. Die mittleren Plasma-Konzentrationen von ApoA-IV sind bei Menschen etwa 15 mg/dl (im Bereich von 10 bis 18 mg/dl). Untersuchungen an Ratten zeigten, dass ApoA-IV vom Dünndarm in die mesenteriale Lymphe freigesetzt wird und in das Plasma-Kompartiment als Struktur-Protein von Chylomikronen, very low-density-Lipoprotein (VLDL), high-density Lipoprotein (HDL) oder ohne Verbindung mit Lipoproteinen eintritt. Obwohl die meisten Glykoproteine relativ lange Halbwertszeiten in Plasma aufweisen, gehört das humane ApoA-IV zu den Apolipoprotei-nen mit den höchsten Umsatzraten. Die Berichte über die Verteilung von ApoA-IV in Humanplasma sind widersprüchlich. Je nach der verwendeten Technik beschreiben sie eine ApoA-IV-Verteilung, die von beinahe vollständig an HDL gebundenem ApoA-IV bis zu größtenteils nicht mit wesentlichen Lipoprotein-Fraktionen in Verbindung stehend reicht. Für dieses Apolipoprotein wurden verschiedene physiologische Funktionen vorgeschlagen. Zahlreiche in v/fro-Untersuchungen ließen darauf schließen, dass es an mehreren Schritten des umgekehrten Cholesterin-Transport-Weges beteiligt ist, wobei Cholesterin von peripheren Zellen entfernt und zur Leber oder zu steroidogenen Organen zwecks endgültiger Umwandlung in Gallensäuren oder Hormone transportiert wird. ApoA-IV verstärkt die Bildung kleiner HDL-Partikel durch Aktivierung des Enzyms Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT). Es moduliert bei in w'fra-Untersuchungen auch die Aktivierung von Lipoprotein-Lipase und den vom Cholesteryl-Ester-Transfer-Protein (CETP) vermittelten Transfer von Chqlesteryl-Estern von HDL zu LDL. In Übereinstimmung mit diesen in vitro-Daten führte eine Überexpression von ApoA-IV bei transgenen Mäusen zu verringerten Aorten-Läsionen und einem Schutz gegen Atherosklerose. Diese Ergebnisse wurden kürzlich durch Fall-Kontroll-Studien in drei unabhängigen humanen Populationen bestätigt: es zeigte sich, dass die ApoA-IV-Plasma-Konzent-rationen bei Patienten mit einer Erkrankung der Koronararterie im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant geringer waren (KRONENBERG F, et al., J. Am. Coli. Cardiol. 36:751-757, 2000); eine Korrelation zwischen den Plasma-ApoA-IV-Konzentrationen und Atherosklerose wurde auch bei Patienten mit Nierenversagen beobachtet (KRONENBERG F, et al. J. Am. Soc. Nephral. 13:461-469, 2002).

Mehrere Untersuchungen lassen auf eine Rolle der Niere beim Metabolismus von ApoA-IV schließen. Patienten mit chronischer Nierenkrankheit weisen deutlich erhöhte ApoA-IV-Konzentrationen auf (KRONENBERG F, et al. Kidney Int. (Suppl.): S113-S116, 2003). Das ApoA-IV beginnt schon in den frühesten Phasen einer Niereninsuffizienz anzusteigen, was ApoA-IV zu einem frühen Marker für eine Nierenschädigung macht (KRONENBERG F, et al., J. Am. Soc. Nephral. 13:461-469, 2002). Obwohl sich zeigte, dass die Leber der wichtigste Ort für den Abbau ist, trägt die Niere signifikant zum Katabolismus von ApoA-IV bei.

Obwohl die ApoA-IV-Mengen bei Individuen, die an einer Nierenerkrankung leiden, bereits intensiv untersucht worden sind, gibt es keine verfügbaren Daten darüber, wie diese Mengen durch das Vorliegen anderer Erkrankungen, wie Tumoren, insbesondere solide Tumoren, in einem Individuum beeinflusst werden. Da es in der medizinischen Diagnose von großer Bedeutung ist, Tumor-Marker zu haben, die die Detektion eines Tumors in einem Individuum, insbesondere in einem frühen Stadium der Entwicklung, rasch und genau ermöglichen, ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und ein Mittel zur Diagnostizierung eines Tumors in einem Individuum und zur Überwachung der Effizienz der Behandlung dieses Tumors (z.B. nach chirurgischer Entfernung eines soliden Tumors) vorzusehen, insbesondere das Wiederauftreten eines Tumors zu überwachen.

Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors in einem Individuum vor, umfassend die folgenden Schritte: 3 AT 502 227 B1 - Messen der Menge von Apolipoprotein A-IV (ApoA-IV) in einer Körperflüssigkeits- oder Gewebeprobe eines Individuums, - Vergleichen der gemessenen Menge an ApoA-VI in dieser Probe mit einem Referenzwert, wobei der Referenzwert der ApoA-IV-Gehalt in einer Probe, die von einem Individuum ohne 5 Tumor stammt, ist, und - Diagnostizieren eines Tumors, wenn der ApoA-IV-Gehalt in der Probe im Vergleich zum Referenzwert verringert ist. Überraschenderweise konnte gezeigt werden, dass die Bestimmung der Menge an ApoA-IV in io einer Probe von einem Individuum das Diagnostizieren des Vorliegens eines soliden Tumors in diesem Individuum ermöglicht. Wenn beispielsweise der ApoA-IV-Spiegel im Serum eines Individuums geringer als die durchschnittliche Menge an ApoA-IV bei Individuen ohne einen Tumor ist, kann das Vorliegen eines Tumors diagnostiziert werden. 15 „Referenzwert“ bezieht sich auf die durchschnittliche Menge an ApoA-IV in gesunden Individuen, die nicht an einem Tumor leiden. Der Referenzwert wird vorzugsweise aus mindestens einem, vorzugsweise mindestens fünf, mehr bevorzugt, mindestens zehn, noch mehr bevorzugt, mindestens 50 Proben von, vorzugsweise verschiedenen Individuen berechnet. Es sei bemerkt, dass die ApoA-IV-Serum-Menge auch vom Vorliegen anderer Erkrankungen, wie einer Nieren-20 Schädigung, abhängt (erhöhte ApoA-IV-Menge im Vergleich zu gesunden Individuen, die keine Nierenschädigung haben), Erkrankungen der Koronararterie und atherosklerotische Komplikationen (verringerte ApoA-IV-Menge im Vergleich zu gesunden Individuen, die nicht an Erkrankungen der Koronararterie und an atherosklerotischen Komplikationen leiden) (vgl. EP 1 410 039 A). Daher wird der Referenzwert vorzugsweise von Individuen berechnet, die 25 nicht an einem Tumor, einer Nierenschädigung, Erkrankungen der Koronararterie und atherosklerotischen Komplikationen leiden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Individuum ein Mensch. 30

Natürlich kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch an Säugern, insbesondere an Haustieren (z.B. Hunden, Katzen) und Nutztieren (z.B. Pferde, Rinder, Schafe) angewendet werden. Im Falle, dass die ApoA-IV-Menge bei anderen Säugern als Menschen gemessen wird, muss die ApoA-IV-Menge in gesunden Säugern bestimmt werden, bevor das Verfah-35 ren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnostizierung eines Tumors verwendet wird.

Der zu diagnostizierende Tumor ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nierentumor, Ovarialkarzinom und Hodenkarzinom. 40 Es zeigte sich, dass insbesondere bei Patienten, die an Nierentumor, Ovarialkarzinom und Hodenkarzinom (oder an mehr als einem dieser Tumoren) leiden, die ApoA-IV-Serum-Mengen im Vergleich zu Serum-Mengen von Individuen, die nicht an diesen Erkrankungen litten, verringert war und sich bereits als verlässlicher diagnostischer Marker in der klinischen Praxis erwiesen hat. Die vorliegende Erfindung ist jedoch auch auf Tumoren, insbesondere solide Tumoren, 45 z.B. Tumoren, an denen Epithelzellen beteiligt sind, anwendbar.

Natürlich ermöglicht es das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dem Fachmann, das Vorliegen nicht nur eines Tumors, sondern einer Vielzahl von Tumoren in einem Individuum zu diagnostizieren. Daher ist es auch möglich, einen Tumor in einem Individuum, das an mehr als so einem Tumor leidet, zu diagnostizieren, obwohl hier bei der endgültigen Diagnose diese Umstände sorgfältig erwogen werden sollten und, wie bei allen diagnostischen Entscheidungen, nur vom verantwortlichen Arzt erstellt werden kann.

Obwohl die Menge an ApoA-VI in mehreren Körperflüssigkeiten und Gewebeproben bestimmt 55 werden kann, ist es bevorzugt, dass die Körperflüssigkeit Blut, Serum oder Fraktionen davon 4 AT 502 227 B1 ist.

Es ist vorteilhaft, dass ein Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors Proben verwendet, die auf relativ einfache und rasche Art erhalten werden können, ohne so invasiv zu sein wie z.B. ein 5 chirurgischer Eingriff (z.B. eine Biopsie). Daher kann ein Tumor-Marker vorzugsweise in Blut, Serum oder Fraktionen davon detektiert werden. Auch wenn das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um den Fortschritt einer Tumorbehandlung zu überwachen, muss die Probe mit einem Verfahren erhalten werden, welches vorzugsweise nicht invasiv ist, weil es beispielsweise nicht möglich ist, Gewebeproben in einer ausreichenden Menge zu erhal-io ten, die zur Überwachung des Fortschritts der Behandlung notwendig ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Referenzwert zwischen 10 und 18 mg, vorzugsweise 13 bis 15 mg, ApoA-IV/dl Serum. 15 Der Vergleich des gemessenen Werts beim Individuum, bei welchem mit der vorliegenden Erfindung eine Diagnose erstellt werden soll, und dem Referenzwert hängt auch von der Körperflüssigkeit oder dem Gewebe ab, von welchem die Werte genommen und gemessen werden. Vorzugsweise wird natürlich Serum getestet, wobei der (gesunde) Referenzwert üblicherweise zwischen 10 und 18 mg ApoA-IV/dl Serum liegt, wenn mit ApoA-IV-ELISA getestet wird. 20 Diese absoluten Werte sind jedoch, wie oben angeführt, immer abhängig vom sehr spezifischen Weg der Messung der Menge des ApoA-IV und der Körperflüssigkeit/dem Gewebe, worin die ApoA-IV-Mengen gemessen werden. Zu anderen bevorzugten Quellen von erfindungsgemäß zu testendem Material anstatt von von Blut stammenden Körperflüssigkeiten zählen Tumorgewebe, insbesondere Biopsie-Material von Tumorgewebe. 25

Der Tumor wird diagnostiziert, wenn die Menge des ApoA-IV geringer als 10 mg, vorzugsweise geringer als 8 mg, ApoA-IV/dl Serum ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der ApoA-IV-30 Gehalt in der Probe als verringert angesehen, wenn er um mindestens 10% niedriger, vorzugsweise mindestens 30% niedriger, insbesondere mindestens 50% niedriger, als der ApoA-IV-Gehalt in einer Probe von einem Individuum ohne Tumor ist.

Eine verringerte ApoA-IV-Menge wird als eine Menge angesehen, die niedriger als in einem 35 gesunden Kontroll-Individuum ist, das nicht an einem Tumor leidet.

Die Menge des ApoA-IV in der Probe wird vorzugsweise mit einem immunochemischen Verfahren unter Verwendung von auf ApoA-IV gerichteten Antikörpern bestimmt. 40 Die Bestimmung einer Menge eines Proteins in einer Probe kann beispielsweise mittels immu-nochemischer Methoden durchgeführt werden. Diese Verfahren verwenden Antikörper, die auf das zu messende Protein oder Fragmente davon gerichtet sind.

Die Antikörper sind vorzugsweise monoklonale Antikörper. 45

Die Antikörper, die beim Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können polyklonal oder monoklonal sein. Es ist jedoch bevorzugt, bei diesem Verfahren monoklonale Antikörper einzusetzen. Monoklonale Antikörper, die auf ein Antigen von ApoA-IV gerichtet sind, können mittels im Stand der Technik bekannter Methoden erhalten werden (z.B. so Köhler G. und Milstein C., Nature (1975) 256:495-457). Auch Verfahren für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind dem Fachmann wohlbekannt. Solche Antikörper können durch Verabreichen eines Antigens, gegebenenfalls in Verbindung mit mindestens einem Adjuvans, an einen Säuger, vorzugsweise ein Kaninchen, eine Maus oder ein Schaf, und Isolieren der die Antikörper aufweisenden Fraktion vom erhaltenen Serum erhalten werden. 55 5 AT 502 227 B1

Der Antikörper oder das Fragment, der/das auf ApoA-IV gerichtet ist, weist vorzugsweise einen Detektionsmarker, vorzugsweise einen chromogenen, fluorogenen oder radioaktiven Marker, auf. 5 Um einen Antikörper in einem Test nachzuweisen, ist es notwendig, z.B. den auf ApoA-IV gerichteten Antikörper mit einem geeigneten Marker zu markieren, welcher leicht von Detektionsmitteln (z.B. einem Photomultiplier) detektiert werden kann. Natürlich ist es auch möglich, dass der auf ApoA-IV gerichtete Antikörper nicht direkt markiert ist. In einem Test, der solche Antikörper umfasst, müssen jene Antikörper, die auf die ApoA-spezifischen Antikörper gerichtet io sind, markiert werden. Welche von diesen Antikörpern markiert werden müssen, hängt hauptsächlich vom Test ab, der zur Bestimmung von ApoA-IV im Serum verwendet wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das immunochemi-sche Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Western Blot, Enzyme-Linked Im-15 munosorbent Assay (ELISA) und Radio-Immuno-Assay (RIA). Der Western Blot wird zur Überwachung der Spezifität der verwendeten monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörper für das Antigen Apolipoprotein A-IV verwendet.

Unter den im Stand der Technik bekannten immunochemischen Methoden werden der Western 20 Blot, der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder der Radio-Immuno-Assay (RIA) vorzugsweise verwendet. ELISA und RIA können als kompetitive Tests und ELISA auch als Sandwich-Test verwendet werden (z.B. Rosseneu M, et al. Clin. Chem. (1988) 34:739-743).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Verfahrens ge-25 mäß der vorliegenden Erfindung zur Überwachung der Effizienz einer Tumorbehandlung.

Die verringerte Menge an ApoA-IV in einem an einem Tumor leidenden Individuum, insbesondere im Serum des Individuums, ermöglicht die Überwachung der ApoA-IV-Mengen im Laufe einer Tumorbehandlung. Da die ApoA-IV-Serum-Menge signifikant vom Vorliegen eines Tumors 30 in einem Individuum abhängt, zeigt der Anstieg von ApoA-IV-Serum-Mengen auf einen Referenzwert eine erfolgreiche Behandlung eines Krebspatienten an. Um die Veränderung der ApoA-IV-Serum-Mengen während der Behandlung zu übenwachen, werden vor der Behandlung (z.B. vor Entfernen des Tumors) und in bestimmten Abständen im Laufe der Behandlung (z.B. Chemotherapie) Proben des Individuums genommen. Natürlich kann dieses Verfahren auch bei 35 einer Langzeit-Untersuchung zur Überwachung eines Tumor-Rückfalls bei einem Individuum verwendet werden.

Der Tumor ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nierentumor, Ovarial-karzinom und Hodenkarzinom. 40

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten oder zur Überwachung der Effizienz einer Tumorbehandlung, umfassend einen oder mehrere der folgenden Komponenten: 45 - eine positive Kontrolle von einem Individuum, das an einem Tumor leidet, - Mittel zum Messen der Menge des ApoA-IV in einer Körperflüssigkeits- oder Gewebeprobe, und - eine Probe von einem Individuum, das nicht an diesem Tumor leidet, als Referenzwert-Mittel. so Die positive Kontrolle von einem Individuum, das an einem Tumor leidet, und die Probe von einem Individuum, das nicht an diesem Tumor leidet, sind vorzugsweise stabilisiert, vorzugsweise durch Lyophilisation stabilisiert.

Proben, die ein biologisches Material aufweisen, neigen dazu, instabil zu sein. Daher müssen, 55 wenn solche Proben und positive Kontrollen in einem Set vorgesehen sind, diese Proben und 6 AT 502 227 B1 positiven Kontrollen stabilisiert sein, um die Lagerung des Sets über einen längeren Zeitraum bei Temperaturen von weniger als 6°C oder bei Raumtemperatur zu ermöglichen. Wenn das Set bei Raumtemperatur gelagert werden soll, ist es notwendig, dass das im Set enthaltene biologische Material beispielsweise lyophilisiert ist. Die Lyophilisation ist ein weit verbreitetes 5 Verfahren zur Konservierung proteinhältiger Proben. Wenn das Set bei unter 6°C, vorzugsweise unter 0°C, gelagert werden soll, muss das biologische Material in einer Lösung vorgesehen werden, was die Verschlechterung der im biologischen Material enthaltenen Proteine verhindert. Diese Lösung kann z.B. Glycerin, Mercapto-Ethanol und Konservierungsmittel enthalten. io Die Mittel zum Messen der ApoA-IV-Menge sind vorzugsweise ausgewählt aus anti-ApoA-IV-Antikörpern, insbesondere polyklonalen Antikörpern, sekundären Antikörpern, insbesondere enzymatisch oder chemisch markierten sekundären Antikörpern, ApoA-IV-spezifischen enzymatischen Tests, ApoA-IV-spezifischen ELISAs oder Kombinationen davon. 15 Die Menge des ApoA-IV in der Probe kann mit mehreren Methoden festgestellt werden, wobei Methoden, die Antikörper als Mittel zum Messen der Menge benützen, vorzugsweise verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele weiter veranschau-20 licht, ohne auf diese eingeschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt die Veränderung der ApoA-IV-Plasma-Mengen von Tumor-Patienten, deren Tumor durch Operation entfernt wurde. Nach dem chirurgischen Eingriff zeigten die ApoA-IV-Mengen solche Mengen, die normalerweise bei gesunden Individuen gemessen werden (kein Ovarial-25 karzinom; kein OC). Bei jenen Patienten, bei welchen das Ovarialkarzinom wieder auftrat, fielen die ApoA-IV-Mengen signifikant (Wiederauftreten von OC) unter die ApoA-IV-Mengen gesunder Individuen („Referenzwert“). Dies zeigt, dass mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung das Wiederauftreten eines Tumors überwacht werden kann. 30 Fig. 2A bis 2F zeigen Vergleichsergebnisse zwischen den ApoA-IV-Plasma-Mengen (gefüllte Quadrate ) und den Mengen von CA125 (gefüllte Rauten ♦), einem gut bekannten Tumor-Marker, die im Blut von Ovarialkarzinom-Patienten gefunden wurden. Bei den Patienten 1, 3, 5 und 9 sind die in dieser Figur dargestellten CA125-Mengen mit 10 und die der Patienten 6 und 10 mit 100 zu multiplizieren. 35

Fig. 3 zeigt ApoA-IV bei Patienten, die an Hodenkrebs leiden.

Beispiele: 40 Beispiel 1: ApoA-IV als Marker für Nierentumor Methoden:

Testpersonen 45

Humanblutproben von 30 Patienten (18 männlich und 12 weiblich) wurden in diesem Beispiel inkludiert. Alle Patienten wurden einer vollständigen unilateralen Nephrektomie infolge Nieren-zellen-Karzinoms unterzogen. Keiner der Patienten hatte eine schwere Proteinurie (der Messstab-Test („dipstick test“) für Proteinurie war höchstens 1+ positiv). 50

Nach dem über-Nacht-Fasten vor der Operation wurde eine Blutprobe genommen. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Plasma wurde nach Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit bei 4°C erhalten und bei -80°C vor Verwendung gefroren. Es wurde sichergestellt, dass die Patienten bis zu 1 Woche vor der Blutspende keiner Untersuchung mit Kontrastmitteln unterzogen 55 wurden, was die Nierenfunktion beeinflussen könnte. 7 AT 502 227 B1

Messung der Plasma-ApoA-IV-Konzentration

Die Plasma-ApoA-IV-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines Doppel-Antikörper-Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt, bei welchem ein Affinitäts-gereinigter 5 polyklonaler Antihuman-ApoA-IV-Antikörper zum Beschichten und derselbe Antikörper, an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt, zur Detektion verwendet wurden. Plasma mit einem bekannten Gehalt an ApoA-IV diente als Eichungs-Standard. Die untere Nachweisgrenze dieses Tests ist 0,002 mg/dl (KRONENBERG F, et al., J. Lipid Res. 35:1318-1328, 1994). Jede Probe wurde im Duplikat analysiert. Der Affinitäts-gereinigte Antikörper wurde durch Immunoadsorptions-io Chromatographie von Kaninchen-Antihuman-ApoA-IV-Antiserum hergestellt, wobei gereinigtes Plasma-ApoA-IV, gekoppelt an mit CNBr aktivierte Sepharose Q2 4B (Amersham Pharmacia Biotech AB, Schweden) verwendet wurde. Das Anti-ApoA-IV-Serum wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit gereinigtem Plasma-ApoA-IV erhalten (DIEPLINGER H, et al., Eur. J. Clin. Invest. 22:166-74,1992). 15

Immunoblot-Analyse

Die Immunoblot-Analyse von ApoA-IV wurde an Proben durchgeführt, die durch Natriumdode-cylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS PAGE) getrennt und auf Cellulose-Nitrat-20 Mebranen transferiert worden waren. Gereinigtes ApoA-IV wurde als Standard verwendet. ApoA-IV wurde von Humanplasma durch Lipoprotein-Abreicherung isoliert, gefolgt von Inkubation mit einer Triglycerid-Phospholipid-Emulsion und Trennung hydrophober, Lipid-gebundener Proteine durch Anionenaustausch-Chromatographie (STEINMETZ A, et al., J. Chromatogr. 487:154-160, 1989). Dasselbe Affinitäts-gereinigte, mit Meerrettich-Peroxidase markierte Anti-25 human-ApoA-IV, das im ELISA-Protokoll inkludiert war, wurde auch für das Immunoblotten verwendet.

Statistische Auswertung 30 Mittlere Konzentrationen von ApoA-IV zwischen den Studiengruppen wurden unter Verwendung des Mann-Whitney U-Tests verglichen. Gepaarte Proben wurden unter Verwendung des Wilco-xon-Tests verglichen.

Ergebnisse: 35

Spezifität des ApoA-IV-Antikörpers

Um die Spezifität des für die Immunohistochemie verwendeten polyklonalen Kaninchen-Antihuman-ApoA-IV-Antikörpers zu verifizieren, wurde der Antikörper durch Immunoblot-40 Analyse von aus Geweben zweier verschiedener Patienten isoliertem humanen Nieren-Protein und korrespondierenden Plasma-Proben analysiert. ApoA-IV-Antikörper konnte nur eine Protein-Bande in Gewebe und Plasma-Proben detektieren, aber eine doppelte Bande in dem ApoA-IV-Präparat, das als Standard diente. Die Peptid-Sequenzierung bestätigte, dass beide Protein-Banden des Standard-ApoA-IV repräsentieren. Die zweite, kleinere ApoA-IV-lsoform könnte 45 daher aus der Deglykosylierung oder dem proteolytischen Abbau resultieren.

ApoA-IV-Serum-Mengen

Die Analyse von Plasma-Proben zeigte, dass die Konzentrationen von ApoA-IV im Plasma im so Allgemeinen niedriger waren bei Patienten, die an einem Nierentumor litten (6,8 ± 4,4 mg/dl) im Vergleich zu gesunden Individuen (11,9 ± 2,8 mg/dl, n=52) (EZEH B, et al., J. Lipid. Res. 44:1523-1529, 2003, KRONENBERG F, et al. J. Am. Coli. Cardiol. 36:751-757, 2000).

Beispiel 2: ApoA-IV als Marker für Ovarialkarzinom 55 8 AT 502 227 B1 a) Die erste Gruppe von Patienten umfasste 19 Patienten, die an Ovarialkarzinom litten. Das Wiederauftreten von Ovarialkarzinom wurde durch Quantifizieren der ApoA-IV-Plasma-Mengen bei diesen Patienten bestimmt. Die anfängliche ApoA-IV-Plasma-Menge wurde etwa 30 Tage nach dem chirurgischen Eingriff bestimmt und zeigte, dass die ApoA-IV-Plasma-Mengen der 5 Patienten nahe dem Referenzwert eines gesunden Individuums lagen. Nach dem Wiederauftreten von Ovarialkarzinom waren die ApoA-IV-Plasma-Mengen im Vergleich zu den anfänglichen Werten signifikant verringert (Fig. 1). b) In einem zweiten klinischen Versuch wurden die ApoA-IV-Plasma-Mengen von 10 Krebs-io Patienten über einen Zeitraum vor und nach dem chirurgischen Eingriff bestimmt und mit den

Plasma-Mengen von CA125, einem gut bekannten Tumor-Marker, verglichen. Die CA125-sowie die ApoA-IV-Plasma-Mengen wurden bei Ovarialkarzinom-Patienten vor (Zeitpunkt 0) und nach der Operation über einen Zeitraum von mindestens 30 Wochen gemessen. In Fig. 2A ist eine Korrelation zwischen beiden Tumor-Markern gezeigt. Hohe Mengen an CA125, die das 15 Vorhandensein von Ovarialkarzinom zeigen, korrelieren mit niedrigen ApoA-IV-Serum-Mengen. Ein Wiederauftreten von Ovarialkarzinom kann nach 50 bis 55 Wochen nach Operation beobachtet werden. Diese Ergebnisse wurden durch histologische Untersuchungen bestätigt. Obwohl die CA125-Mengen das Wiederauftreten von Ovarialkarzinom nicht zeigten, zeigen jedoch die ApoA-IV-Serum-Mengen bei zwei anderen Patienten das Vorhandensein von Ovarialkarzi-20 nom nach 65 bis 70 Wochen nach Operation (vgl. Fig. 2B, C). Diese Ergebnisse wurden auch durch histologische Untersuchungen bestätigt. Daher konnte deutlich gezeigt werden, dass die ApoA-IV-Plasma-Mengen eindeutig bessere Tumor- insbesondere Ovarialkarzinom-Marker sind als CA125, dessen Nicht-Detektion in diesem Fall zu einer falsch negativen Diagnose führte. In der Fig. 2D konnten das Ergebnis der CA125- und ApoA-IV-Bestimmung einer erfolgreichen 25 Behandlung eines Patienten, der an Ovarialkarzinom litt, gezeigt werden. In den Fig. 2E und 2F konnte die Korrelation von CA125- und ApoA-IV-Mengen bei Patienten, die an Ovarialkarzinom litten, bestätigt werden.

Beispiel 3: ApoA-IV als Marker für Hodenkrebs 30

Eine Gruppe von 18 Patienten, die an Hodenkrebs litt, wurde untersucht. Die Ergebnisse der ApoA-IV-Plasma-Mengen sind in der folgenden Tabelle gezeigt.

Tabelle: 35

Plasma Apo A-IV (mg/dl) aus Tumor-Marker für Hodenkrebs

Patient Diagnose Zeit der Operation 4 Wochen später 1 S 18,42 27,07 2 S 11,90 9,07 3 S 6,19 10,50 4 NS 7,69 14,42 5 S 12,70 23,98 6 MT 3,59 8,56 7 MT 8,51 15,38 8 S 6,34 8,42 9 S 11,70 31,34 10 NS 3,37 14,38 11 NS 7,68 13,26 12 MT 18,34 17,55 13 S 11,73 13,68 55

Claims (15)

1. 9 AT 502 227 B1 Patient Diagnose Zeit der Operation 4 Wochen später 14 S 12,30 19,60 15 S 11,70 15,41 16 MT 4,93 10,76 17 NS 8,20 14,12 18 NS 7,60 10,60 Mittelwert 9,61 15,45 SA 4,36 6,42 S = Seminom NS = Nicht-Seminom MT = Misch-Tumor Literaturstellen: KRONENBERG F, et al. J AmColl Cardiol 36:751-757, 2000 KRONENBERG F, et al. J Am Soc Nephrol 13:461-469, 2002 KRONENBERG F, et al. Kidney Int (Suppl):S113-S116, 2003 DIEPLINGER H, et al. Eur J Clin Invest 22:166-174, 1992 KRONENBERG F, et al. J AmSoc Nephrol 6:110-120, 1995 KRONENBERG F, et al. J Lipid Res 35:1318-1328, 1994 STEINMETZ A, et al. J Chromatogr 487:154-160, 1989 EZEH B, et al. J Lipid Res 44:1523-1529, 2003. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors in einem Individuum, umfassend die folgenden Schritte: - Messen der Menge von Apolipoprotein A-IV (ApoA-IV) in einer Körperflüssigkeits- oder Gewebeprobe eines Individuums, - Vergleichen der gemessenen Menge an ApoA-VI in dieser Probe mit einem Referenzwert, wobei der Referenzwert der ApoA-IV-Gehalt in einer Probe, die von einem Individuum ohne Tumor stammt, ist, und - Diagnostizieren eines Tumors, wenn der ApoA-IV-Gehalt in der Probe im Vergleich zum Referenzwert verringert ist.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Individuum ein Mensch ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nierentumor, Ovarialkarzinom und Hodenkarzinom.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kör-perflüssigkeits-Probe eine Blutprobe eine Plasmaprobe oder eine Probe einer Plasma-Fraktion ist.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Referenzwert zwischen 10 und 18 mg, vorzugsweise 13 bis 15 mg, ApoA-IV/dl Serum ist.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor diagnostiziert wird, wenn die ApoA-IV-Menge niedriger als 10, vorzugsweise niedriger als 8 mg, ApoA-IV/dl Serum ist. 10 AT 502 227 B1
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der ApoA-IV-Gehalt in der Probe verringert ist, wenn er um mindestens 10% niedriger, vorzugsweise mindestens 30% niedriger, insbesondere mindestens 50% niedriger, als der ApoA-IV-Gehalt in einer Probe von einem Individuum ohne Tumor ist. 5
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des ApoA-IV in der Probe mit einem immunochemischen Verfahren unter Verwendung von auf ApoA-IV gerichteten Antikörpern bestimmt wird. io 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper monoklonale Antikörper sind.
9. 10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper einen Detektions-Marker, vorzugsweise einen chromogenen, fluorogenen oder radioaktiven Maris ker, umfasst.
10. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das immu-nochemische Verfahren ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Western Blot, En-zyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Radio-Immuno-Assay (RIA). 20
11. 12. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Überwachung der Effizienz einer Tumorbehandlung.
12. 13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe beste- 25 hend aus Nierentumor, Ovarialkarzinom und Hodenkarzinom.
13. 14. Set zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten oder zur Überwachung der Effizienz einer Tumorbehandlung, umfassend einen oder mehrere der folgenden Komponenten: 30 - eine positive Kontrolle von einem Individuum, das an einem Tumor leidet, - Mittel zum Messen der Menge des ApoA-IV in einer Körperflüssigkeits- oder Gewebeprobe, und - eine Probe von einem Individuum, das nicht an diesem Tumor leidet, als Referenzwert-Mittel. 35
14. 15. Set nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die positive Kontrolle und die Probe von einem Individuum, das nicht an diesem Tumor leidet, stabilisiert sind, vorzugsweise durch Lyophilisation stabilisiert sind.
15. 16. Set nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Messen der ApoA-IV- Menge ausgewählt sind aus anti-ApoA-IV-Antikörpern, insbesondere polyklonalen Antikörpern, sekundären Antikörpern, insbesondere enzymatisch oder chemisch markierten sekundären Antikörpern, ApoA-IV-spezifischen enzymatischen Tests, ApoA-IV-spezifischen ELISAs oder Kombinationen davon. 45 Hiezu 4 Blatt Zeichnungen 50 55